CN118459581A

CN118459581A - 抗人氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN118459581A
Application number: CN202410650630.7A
Authority: CN
Inventors: 车志远; 张贺秋; 冯晓燕; 危利; 张钰婷; 张玲; 杨娅林
Original assignee: Avioq Biology Technology Co ltd; Oriental Ocean Beijing Medical Research Institute Co ltd
Current assignee: Avioq Biology Technology Co ltd; Oriental Ocean Beijing Medical Research Institute Co ltd
Priority date: 2024-05-24
Filing date: 2024-05-24
Publication date: 2024-08-09

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种抗人氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体，其具有SEQ ID NO.2、3和4所示序列的重链CDR1‑3，以及SEQ ID NO.6、LVS、SEQ ID NO.7所示序列的轻链CDR1‑3。该单克隆抗体对oxLDL具有高度特异性，而不与LDL、VLDL和HDL发生交叉反应，并且检测灵敏度为2ng/ml，明显高于现有商品化抗体，可以应用于制备检测抗人氧化低密度脂蛋白的产品。

Description

抗人氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗人氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的单克隆抗体及其应用。

背景技术

氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是低密度脂蛋白(LDL)在体内经过一系列氧化反应修饰后形成的产物。LDL内大量多不饱和脂肪酸在过量自由基及其它氧化剂作用下发生过氧化反应生成丙二醛，丙二醛氧化修饰载脂蛋白B上的赖氨酸残基，当赖氨酸氧化修饰量超过一定量后将形成新的抗原表位，即形成氧化低密度脂蛋白。oxLDL不能被LDL受体识别，导致通过受体途径降解缓慢，而是主要由巨噬细胞和血管内皮表面表达的清道夫受体识别和摄取，以数倍于天然LDL的速度进入巨噬细胞内，并且oxLDL还能抵抗溶酶体酶和蛋白酶对它的降解，导致细胞内胆固醇的积蓄，促使巨噬细胞形成泡沫细胞，而泡沫细胞是形成动脉粥样硬化的早期形式，是导致动脉粥样硬化的关键因素，其中氧化低密度脂蛋白是导致动脉粥样硬化的关键性蛋白。因此，oxLDL是心脑血管疾病早期诊断的重要生物标志物，oxLDL含量水平的检测对于心脑血管疾病预防、监测、治疗及早期诊断具有重要意义。

目前oxLDL的检测方法包括基于化学原理的共轭双烯法和硫代巴比妥酸反应物化学测定法，此类方法存在反应时间长、操作复杂、检测结果准确度低的缺点；基于物理性质改变的相对电泳迁移速率法，同样存在上述不足；还有基于抗原抗体反应的免疫学检测方法，包括酶联免疫法、化学发光法等，即利用特异性抗体实现oxLDL含量测定。临床上可用的检测方法只有免疫学检测方法。但是，目前oxLDL的临床检测面临困境，存在可用检测试剂少，不同方法检测结果差异大，含量测定不准确的难题，主要原因在于氧化低密度脂蛋白的稳定性低，氧化程度不一，交叉反应物质多，不易制备获得高特异性高亲和力的单克隆抗体，因此现有免疫测定试剂多使用多克隆抗体或者针对载脂蛋白apoB的单克隆抗体，而载脂蛋白apoB是LDL和oxLDL的共有成分，以抗载脂蛋白apoB的单克隆抗体用于oxLDL成分的定量测定造成检测结果不准确。因此，亟需制备高特异性高亲和力的抗oxLDL单克隆抗体，以便实现oxLDL的精准定量，为心脑血管疾病早期诊断、预防、治疗监测等提供技术支持。

为了弥补以上不足，本发明设计首先对商品化的oxLDL抗原进行检测筛选，获得两种活性高的oxLDL抗原分别作为制备抗体的免疫原和筛选抗体的抗原，然后采用多种结构组成与oxLDL相似，易发生交叉反应脂蛋白成分对通过免疫小鼠制备的单克隆抗体进行筛选，获得仅识别oxLDL抗原的高特异性和高亲和力的单克隆抗体，为oxLDL特异性定量测定提供关键抗体原料。

发明内容

为此，本发明的目的在于通过筛选两种高活性oxLDL分别作为免疫抗原和筛选抗原，免疫小鼠制备单克隆抗体，然后采用多种易发生交叉反应脂蛋白成分对单克隆抗体进行特异性筛选，提供利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗oxLDL单克隆抗体，并且经过实验获得的单克隆抗体能够识别天然oxLDL，且不与其他脂蛋白发生交叉反应，具有很好的特异性和亲和力，可以用于检测oxLDL，以及用于制备检测oxLDL的产品。

因此，本发明一个方面涉及一种抗oxLDL的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，

所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列或与SEQ ID NO.4所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述轻链CDR2的氨基酸序列为LVS或与序列LVS相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列。

在进一步的方面中，本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列。

本发明还涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、单链抗体或人源化抗体，这些抗体或抗原结合片段由于保留了重链和轻链的可变区，因此能够识别和结合人oxLDL。

此外，本发明还涉及包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的一种核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。另一方面，本发明涉及一种抗人oxLDL的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地，本发明涉及抗人oxLDL的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株DF868，保藏号为CGMCC No.45832。

再一方面，本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测oxLDL的产品中的应用。进一步地，本发明涉及一种检测人oxLDL的试剂盒，所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段，用于识别和结合人oxLDL。

生物材料保藏说明

本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株：小鼠杂交瘤细胞株DF868，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.45832，保藏日期为：2024年3月27日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

附图说明

图1是兔抗oxLDL多克隆抗体效价检测结果图。

图2是抗oxLDL单克隆抗体特异性评价结果图。

图3是抗oxLDL单克隆抗体DF868亚型鉴定结果图。

具体实施方式

本发明的目的在于通过筛选的两种高活性oxLDL分别作为免疫抗原和筛选抗原，免疫小鼠制备单克隆抗体，然后采用多种易发生交叉反应脂蛋白成分对单克隆抗体进行特异性筛选，提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗oxLDL单克隆抗体，该株抗oxLDL单克隆抗体可以识别人oxLDL。具体的制备过程为(详见实施例1)，采用oxLDL测定试剂盒检测商品化oxLDL抗原，选取其中活性高的两种oxLDL抗原，以其中一种作为免疫原，另一种作为单克隆抗体筛选抗原，同时采用多种易发生交叉反应脂蛋白成分对单克隆抗体进行特异性筛选，获得一株表达高亲和力高特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，命名为DF868，以其作为包被抗体的双抗体夹心检测方法的最低检测限为2ng/mL，显著高于商品化试剂盒，表明本发明高亲和力高特异性的抗人oxLDL单克隆抗体DF868可以用于人血液样本中oxLDL含量的测定，具有非常高的灵敏度和特异性。本发明人于2024年3月27日将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45832。

随后本发明人对小鼠杂交瘤细胞株CGMCC No.45832分泌的单克隆抗体进行测序和免疫球蛋白结构域序列分析，发现其重链可变区氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAN NHATFYAESVKGRFTISRDDSKSSVFLQMHSLRAEGTGIYYCTRRRNYFDYWGQGTT LTVS(SEQ ID NO.1)，其中CDR1氨基酸序列为GFTFSDAW(SEQ ID NO.2)，CDR2氨基酸序列为IRNKANNHAT(SEQ ID NO.3)，CDR3氨基酸序列为TRRRNYFDY(SEQ IDNO.4)。轻链可变区氨基酸序列为：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLE SGVPARFSGSGSGTHFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGAPSWKS(SEQ ID NO.5)，其中CDR1氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.6)，CDR2氨基酸序列为LVS，CDR3氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.7)。

本发明人通过酶联免疫法和荧光免疫层析法针对上述单克隆抗体对人oxLDL检测的亲和力和特异性进行测定，发现其最低检测限为2ng/mL，显著高于商品化试剂盒的16ng/mL，对oxLDL检测具有高灵敏度和特异性。

本领域众所周知，抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要氨基酸序列区，并且上述CDR区氨基酸序列中1个保守氨基酸替换一般不会改变蛋白质的结构，因此上述区域内单个保守氨基酸替换仍有可能具备结合相应抗原的特性。因此，对重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3和/或轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3进行1个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合人oxLDL。在本发明专利申请中，保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一化学上相似的氨基酸所替换，例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间的相互替换，脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间的相互替换，极性氨基酸Gln、Asn之间的相互替换，碱性氨基酸Lys、Arg、His之间的相互替换，酸性氨基酸Asp、Glu之间的相互替换，以及羟基氨基酸Ser、Thr之间的相互替换等。

本领域技术人员还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备各种能够与人oxLDL结合的各种抗体片段，即抗原结合片段，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，由一条完整的重链与轻链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成，重链与轻链均存在一个恒定区与一个可变区，轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备，例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后，抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段。在胃蛋白酶的作用下，抗体IgG被降解为一个F(ab')₂片段和一个pFc'片段，F(ab')₂片段进一步被还原形成两个Fab'片段。因为上述抗原结合片段仍然能够结合相应的抗原，因此可以应用于制备检测人oxLDL的产品。

本领域技术人员还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备单链抗体(scFv)。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体，其只有一条链，是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的，并且通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。如此制备的本发明的单链抗体具有结合人oxLDL的特性，可以应用于人oxLDL的检测中。

本领域技术人员能够基于上述的抗人oxLDL的单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子，也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中，构建得到表达载体，该载体能够表达出抗人oxLDL的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体，并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段，如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别人oxLDL，因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术，本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。

如上所述，本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合人oxLDL，因此可以用于制备用于检测人oxLDL的试剂盒，所述试剂盒可以是利用了本发明抗体或其抗原结合片段与人oxLDL发生结合反应的任何类型的试剂盒，例如但不限于酶联免疫吸附测定、荧光免疫层析、胶体金免疫层析、化学发光、免疫印迹、免疫组化方法的试剂盒。

为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例进行说明。

实施例1：免疫用和筛选用oxLDL抗原的筛选

首先，从不同厂家购买氧化低密度脂蛋白(oxLDL)抗原，分别购自北京索莱宝生物科技有限公司(货号H7950)、北京百奥莱博科技有限公司(货号QN0279)、美国Cell Biolabs公司(货号STA-369)和翌圣生物科技(上海)股份有限公司(货号20605ES05)。同时购买瑞典Mercodia AB公司生产的氧化低密度脂蛋白测定试剂盒(酶联免疫法)(国械注进20162402874)，严格按照试剂盒说明书的检测步骤对所购买的四种oxLDL抗原的系列稀释抗原进行检测。结果如表1所示。四种oxLDL抗原中货号H7950的oxLDL抗原(以下称H7950或H7950 oxLDL抗原)和货号20605ES05的oxLDL抗原(以下称20605ES05或20605ES05 oxLDL抗原)在0.2μg/ml浓度时的测定值显著高于相同浓度的QN0279的oxLDL抗原(以下称QN0279或QN0279 oxLDL抗原)和货号STA-369的oxLDL抗原(以下称STA-369或STA-369oxLDL抗原)的测定值，表明H7950和20605ES05的抗原活性显著高于QN0279和STA-369。因此，选择H7950作为免疫用抗原，选择20605ES05作为单克隆抗体筛选抗原，以便易于诱导产生单克隆抗体且尽量避免单克隆抗体制备过程中的交叉反应。

表1oxLDL抗原筛选鉴定结果

实施例2：兔抗oxLDL多克隆抗体的制备

选取健康的雄性大耳白兔，取1mg H7950 oxLDL抗原与1ml弗氏完全佐剂混合，搅拌器彻底乳化后，在大白兔脊柱两旁进行多点皮下注射，每点注射0.2ml；4周后取1mg抗原与1ml弗氏不完全佐剂，搅拌器彻底乳化后于上述部位选不同点进行第二次免疫；于4周后进行第三次加强免疫，用于制备多克隆抗体血清。1周后心脏取血，5000rpm离心15分钟收集血清，分装后置-20℃冰箱中保存备用。使用20605ES05 oxLDL抗原作为检测抗原包被酶联板，采用间接ELISA法检测兔抗oxLDL多克隆抗体的效价。具体方法为：碳酸盐包被缓冲液稀释20605ES05 oxLDL抗原，浓度为2.0μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次；加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次。每孔加入100μl经系列稀释的兔血清或免疫前对照血清，室温孵育45min，弃液。洗版5次，将洗好的酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以去除多余的洗液。加入100μl/孔HRP标记的羊抗兔IgG抗体，室温孵育45min。洗板5次。每孔加TMB显色液A(醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500mL)和B液(乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，取0.15g TMB溶于3ml DMSO中，蒸馏水加至500mL)各50μL，室温避光显色15min。加入2M H₂SO₄终止液50μL/孔，终止反应。设定酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。结果如图1所示，所制备的兔抗oxLDL多克隆抗体的效价为1:512000。兔抗oxLDL多克隆抗体经纯化后备用。

实施例3：兔抗oxLDL多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

采用改良过碘酸钠法将实施例2中获得的抗oxLDL多克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，具体操作为：取5mg HRP溶于0.5mL去离子水，加入1mL 0.06mol/L NaIO₄室温避光轻轻搅拌30min，液体呈黄绿色；加入1mL 0.16mol/L乙二醇，室温轻轻搅拌1小时，终止氧化反应；装入透析袋，用0.01mol/L，pH9.5碳酸盐缓冲液1000mL，4℃透析过夜，换液3次；于3mL醛化HRP溶液中加入含5mg多克隆抗体的碳酸盐缓冲液1mL，室温避光轻轻搅拌结合2～3小时；加入5mg NaHB₄，4℃过夜；装入透析袋，用0.01mol/L，pH7.2磷酸盐缓冲液1000mL，4℃透析24小时，换液3次；3000r/min离心30min，除去沉淀物，上清加入等量甘油，小量分装，低温保存备用。

实施例4：抗oxLDL单克隆抗体的制备

使用H7950 oxLDL抗原作为免疫原，采用8周龄BALB/c雌性小鼠，120μg/只抗原加等量弗氏完全佐剂，搅拌器彻底乳化后，背部皮下及腹腔注射免疫小鼠。间隔4周和8周后分别进行第二次和第三次免疫，80μg/只抗原加不完全弗氏佐剂，搅拌器彻底乳化后，背部皮下及腹腔注射免疫小鼠。第三次免疫7天后，小鼠尾静脉采血检测免疫血清效价，选择效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫(60μg/只)，3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞，培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，充分吸取上清，轻轻震荡离心管底部，振散细胞，在1分钟内加入1mL预热过的50％ PEG融合细胞，边加边轻轻摇匀，加完后静置90秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合，37℃静置10min，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底40％-60％时，取细胞培养上清，分别用PBS进行系列稀释，稀释倍数分别为400、800、1600、3200、6400和12800。采用间接ELISA法筛选阳性克隆。具体方法为：碳酸盐包被缓冲液稀释20605ES05 oxLDL抗原，浓度为2.0μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次；加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次。每孔加入100μl样品稀释液后，分别加入10μl细胞培养上清，室温孵育60min，弃液。洗版5次，将洗好的酶标板倒置于吸水纸上拍干，加入100μl/孔HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温孵育45min。洗板5次。每孔加TMB显色液A和B液各50μL，室温避光显色15min。每孔加入2MH₂SO₄终止液50μL终止反应。设定酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。

共获得19个阳性克隆，所有单克隆细胞培养上清效价均超过1：3200，其中2个单克隆细胞培养上清效价达到1：12800，分别为小鼠多克隆细胞株DF868和AB334，其中小鼠多克隆细胞株DF868已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.45832，保藏日期为2024年3月27日。

实施例5：抗oxLDL单克隆抗体亲和力的测定

利用BIACORE3000生物分子相互作用分析仪进行Biocore动力学实验分析实施例4得到的2株抗oxLDL单克隆抗体DF868和AB334与20605ES05 oxLDL抗原和人源低密度脂蛋白LDL(货号20613ES05，购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，以下称20613ES05)的亲和力。将2株单克隆抗体杂交瘤细胞株，用含10％胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集细胞，用10mL生理盐水重悬细胞，每只小鼠腹腔注射0.5mL(细胞密度大约为1×10⁷个/mL)。2周后，收集腹水。以Thermo公司Melon GelMonoclonal IgG Purification Kit试剂盒进行抗体纯化，紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度，用磷酸盐抗体稀释液调整抗体浓度为1.0mg/mL。将浓度相同的2株单克隆抗体均用磷酸盐缓冲液进行1：100稀释，以5μL/min速率通入抗体进行抗体绑定，通入时间为1.5min。随后将1.0mg/mL的20605ES05oxLDL抗原和20613ES05人源低密度脂蛋白LDL以30μl/min速率通入进行结合，通入时间均为8min。结合时间与解离时间相同。Biocore结合动力学实验数据如表2所示，其中ka表示结合速率常数，反应分子间作用结合速度；kd表示解离速率常数，反应分子复合物解离速度；KD表示解离平衡常数(KD＝kd/ka)，一般KD值越小代表两者的亲和力越高。

表2Biocore动力学实验分析单克隆抗体亲和力

表2结果显示，单克隆抗体DF868对oxLDL抗原的结合速率常数显著高于对非氧化型的LDL抗原的结合速率常数，对oxLDL抗原的解离平衡常数显著大于对非氧化性的LDL抗原的解离平衡常数，表明单克隆抗体DF868可以特异性结合oxLDL抗原；而单克隆抗体AB334对oxLDL抗原和非氧化型的LDL抗原的结合速率常数相似，解离平衡常数也相似，表明单克隆抗体AB334不能区别oxLDL抗原和非氧化型的LDL抗原。

实施例6：抗oxLDL单克隆抗体特异性的测定

分别以本发明的小鼠抗oxLDL单克隆抗体DF868和AB334作为包被抗体，以兔抗oxLDL多克隆抗体作为检测抗体，建立人oxLDL抗原双抗体夹心法检测方法。具体步骤为分别用小鼠抗oxLDL单克隆抗体包被酶联板，浓度为2.0μg/mL，每孔包被100μL，4℃过夜；用洗液洗板2次，200μL/孔；加入110μL/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，200μL/孔。每孔分别加入100μL浓度为2.0μg/mL的人oxLDL抗原(货号20605ES05)、LDL抗原(货号20613ES05)、人极低密度脂蛋白(VLDL，来自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号20617ES05)或人源高密度脂蛋白(HDL，来自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号20610ES05)，每种抗原重复检测5孔。室温孵育1.5小时，弃液。用洗液洗板5次，每孔200μL。每孔加入100μL HRP-兔抗oxLDL多克隆抗体酶结合物，室温孵育45min。洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液A和B液各50μL，室温避光显色15min。每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液终止反应。10分钟内酶标仪测定每孔OD450 nm值。结果如图2所示，本发明单克隆抗体DF868对oxLDL具有高度特异性，不与LDL、VLDL和HDL发生交叉反应；而单克隆抗体AB334则与LDL、VLDL和HDL存在交叉反应。

实施例7：酶联免疫法检测oxLDL的灵敏度

以本发明的小鼠抗oxLDL单克隆抗体DF868作为包被抗体，以兔抗oxLDL多克隆抗体作为检测抗体，建立双抗体夹心法检测人oxLDL抗原，评价检测灵敏度。具体步骤为用小鼠抗oxLDL单克隆抗体包被酶联板，浓度为2.0μg/mL，每孔包被100μL，4℃过夜；用洗液洗板2次，200μL/孔；加入110μL/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，200μL/孔。每孔加入100μL系列稀释的人oxLDL抗原，室温孵育2小时，弃液。用洗液洗板5次，每孔200μL。每孔加入100μL HRP-兔抗oxLDL多克隆抗体酶结合物，室温孵育45min。洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液A和B液各50μL，室温避光显色15min。每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液终止反应。10分钟内酶标仪测定每孔OD450nm值。同时采用Mercodia AB公司生产的氧化低密度脂蛋白测定试剂盒(酶联免疫法)(国械注进20162402874)对稀释的人oxLDL抗原进行平行检测。结果如表3所示，以0.15为Cutoff值，本发明DF868单克隆抗体作为包被抗体，兔抗oxLDL多克隆抗体作为检测抗体，双抗体夹心法检测人oxLDL抗原最低可检测浓度为8.0ng/mL，MercodiaAB酶联免疫试剂盒的最低可检测浓度为16ng/mL。利用本发明DF868单克隆抗体所建立的人oxLDL双抗体夹心检测方法的检测灵敏度明显高于现有商品化试剂盒。

表3oxLDL酶联免疫检测方法检测灵敏度(OD450nm)

实施例8：荧光免疫层析法检测oxLDL的灵敏度

基于双抗体夹心原理，以本发明的小鼠抗oxLDL单克隆抗体DF868标记荧光微球，以本发明制备的兔抗oxLDL多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上，采用荧光免疫层析法定量测定样本中oxLDL的含量，评价检测灵敏度。具体操作为：取100μL系列稀释的人oxLDL抗原，垂直滴加至检测卡加样处，在室温下放置反应15min。样本中的oxLDL抗原和荧光微球标记的抗oxLDL单克隆抗体结合形成oxLDL抗原-oxLDL抗体免疫复合物，免疫复合物与荧光微球标记的鸡IgY抗体(购自北京百奥莱博科技有限公司，货号F050315)随层析作用沿着硝酸纤维素膜前移，至检测区(T线)时反应复合物被硝酸纤维素膜检测线上的兔抗oxLDL多克隆抗体捕获，荧光微球标记的鸡IgY抗体则在质控区(C线)被包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鸡IgY抗体(购自北京百奥莱博科技有限公司，货号F020229)捕获。计算T线荧光值与C线荧光值的比值(T/C)，样本中的oxLDL捕获量与荧光抗体的信号强度正相关。以样本稀释液T/C值的三倍为Cutoff值。以本发明DF868单克隆抗体作为包被抗体所建立的荧光免疫层析双抗体夹心法测定人oxLDL抗原的最低可检测浓度为2ng/mL，检测灵敏度显著高于现有商品化Mercodia AB酶联免疫试剂盒。结果如表4所示。

表4oxLDL荧光免疫层析检测方法检测灵敏度(T/C值)

实施例9：抗oxLDL单克隆抗体DF868亚型分析

采用安泰吉(北京)生物技术有限公司的小鼠抗体亚型快速检测卡(货号ATG-ISO-M8a)鉴定小鼠抗体的重链和轻链亚型。首先用PBS将抗体稀释为1μg/mL，然后每孔加入100μl稀释好的抗体，静置5-10min后观察记录结果。结果如图3所示，抗oxLDL单克隆抗体DF868为小鼠IgG1亚型，抗体轻链为Igκ亚型。

实施例10：抗oxLDL单克隆抗体DF868可变区序列测定

取抗oxLDL单克隆抗体DF868杂交瘤细胞株，Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，Thermo Fisher公司High Capacity cDNA Rever Transcription Kit试剂盒逆转录cDNA后，根据《现代免疫学实验技术》(湖北科学技术出版社，第2版)中小鼠单抗引物序列，设计并由北京擎科生物科技有限公司合成该抗体的重轻链引物，PCR扩增(扩增程序为：95℃预热1min，进行30个循环(95℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)，最后72℃延伸5min)，连接pMD18-T载体，大肠杆菌JM109表达，挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。

经序列分析后发现，重链可变区氨基酸序列为117个氨基酸，其序列如下：EVQLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAN NHATFYAESVKGRFTISRDDSKSSVFLQMHSLRAEGTGIYYCTRRRNYFDYWGQGTT LTVS(SEQ ID NO.1)，其中CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GFTFSDAW(SEQ ID NO.2)，CDR2位于51-60aa，氨基酸序列为IRNKANNHAT(SEQ IDNO.3)，CDR3位于99-107aa，氨基酸序列为TRRRNYFDY(SEQ ID NO.4)。

轻链可变区氨基酸序列为108个氨基酸，其序列如下：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLE SGVPARFSGSGSGTHFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGAPSWKS(SEQ ID NO.5，其中CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ IDNO.6)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.7)。

Claims

1.一种抗人氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，

所述轻链CDR2的氨基酸序列为序列LVS或与序列LVS相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏号为CGMCC No.45832的小鼠杂交瘤细胞株DF868分泌。

4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、单链抗体或人源化抗体。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1至4任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种重组体，其特征在于，所述重组体包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。

8.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株DF868，保藏号为CGMCC No.45832。

9.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测人氧化低密度脂蛋白的产品中的应用。

10.一种检测人氧化低密度脂蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。