CN1606569A - 具有mn结合和细胞粘附中和活性的人类抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明包括靶定蛋白聚糖结构域内的GEEDLP重复的单克隆人类MN抗体或MN抗体片段。所述MN细胞表面蛋白的蛋白聚糖结构域包括四个所述相同的GEEDLP重复。与需要的表位的结合是通过竞争ELISA证实的，其中，ELISA信号可以通过与含有该重复的肽(PGEEDLPGEEDLP)一起温育而减弱ELISA信号。这种结合抑制作用还可以通过Biacore分析证实，其中，通过所述肽重复，可以抑制需要的抗体与固定化MN或蛋白聚糖肽的结合。除了与所述肽重复结合之外，人类抗－MN抗体可以抑制CGL－1细胞与MN包被的塑料平板的细胞粘附。业已将人类抗MN抗体用于通过FACS和免疫组织化学方法诊断并且定量MN在癌细胞和肿瘤中的表达。还提供了一种例子，其中，人类抗MN IgG1通过抗体依赖型细胞介导的细胞毒性，介导肿瘤细胞裂解。因此，所述抗体可用于治疗MN被上调的癌症，或者可用于诊断MN被上调的癌症。

Description

具有MN结合和细胞粘附中和活性的人类抗体
本发明要求申请日为2001年10月18目的共同未决临时申请流水号60/343657和申请日为2002年5月3日的共同未决临时申请流水号60/377716的优先权，并且将它们收作参考。
本申请包括记录在CD上的序列表，它是本申请的一部分。所述序列表是1.44MB ASCII文件，名称为“具有MN结合和细胞粘附中和活性的人类抗体”，是2002年10月建立的。
                        发明领域
本发明涉及MN结合人类抗体。
                        发明背景
MN是一种细胞表面蛋白，它可以在多种临床癌样品中检测到，但是在相关器官的正常组织中缺乏。业已克隆了MN cDNA(Pastorek，J.等，Oncogene(1994)，9，2877-2888)，并且推测的蛋白由信号肽，蛋白聚糖相关序列，碳酸酐酶结构域，跨膜片段，和短的细胞内尾组成。MN通常是在胃和胆管粘膜中表达的(Liao，S.Y.，等，Am J Pathol(1994)，145，598-609)，并且在位于小肠中的高度增殖性正常细胞中表达(Saarnio，J.等，J Histochem Cytochem(1998)46，497-504)。不过，MN是在100％肾细胞癌(Liao，S.Y.，Cancer Res(1997)57，2827-2831)，100％的食道癌(Turner，J.R.Hum Pathol，(1997)28，740-744)，超过90％的宫颈癌(Liao，S.Y.，等，Am J Pathol(1994)，145，598-609)，76％的恶性结肠癌(Saarnio，J.等，Am J Pathol(1998)153，279-285)，80％的非小细胞肺癌(Vermylen，P.等，Eur Respir J(1999)，14，806-811)，以及在48％的乳腺癌(Chia，S.K.等，J.Clin.Oncol.(2001)19，3660-3668)中异位表达的。
业已披露了针对MN的抗体。在小鼠模型中，小鼠单克隆抗体G250能有效降低肾细胞癌肿瘤的尺寸(van Dijk，J.等，1nt J.Cancer(1994)56，262-268)。然后，将这种抗体制备成包括人类Fc区和小鼠可变区的嵌合抗体。嵌合G250抗体仅有66％是人类的，导致了与相当的完全人抗体相比，在人体中具有更大的免疫原性几率。因此，用33％的小鼠抗体治疗，可能导致人类抗小鼠免疫原性反应，使得抗癌治疗无效。由嵌合抗体产生的这些问题，明显产生了对针对MN的完全人类抗体的需要。
                      发明概述
本发明包括靶定蛋白聚糖结构域内的GEEDLP重复的单克隆人类MN抗体或MN抗体片段。所述MN细胞表面蛋白的蛋白聚糖结构域包括四个所述相同的GEEDLP重复。与需要的表位的结合是通过竞争ELISA证实的，其中，ELISA信号可以通过与含有该重复的肽(PGEEDLPGEEDLP)一起温育而减弱ELISA信号。这种结合抑制作用还可以通过Biacore分析证实，其中，通过所述肽重复，可以抑制需要的抗体与固定化MN或蛋白聚糖肽的结合。除了与所述肽重复结合之外，人类抗-MN抗体可以抑制CGL-1细胞与MN包被的塑料平板的细胞粘附。业已将人类抗MN抗体用于通过FACS和免疫组织化学方法诊断并且定量MN在癌细胞和肿瘤中的表达。还提供了一种例子，其中，人类抗MN IgGl通过抗体依赖型细胞介导的细胞毒性，介导肿瘤细胞裂解。因此，所述抗体可用于治疗MN被上调的癌症，或者可用于诊断MN被上调的癌症。
附图简述
图1 通过FACS分析的表达MN的PC3mm2人类前列腺癌细胞
图2 SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：83的序列识别
图3 Fab展示载体pMORPH18 Fab 1
图4 pMORPHx9-Fab1-FS的载体图
图5 用抗MN抗体MN-3阻断细胞粘附作用的图象
图6 MN抗体1-39的抗体结合对。展示了BlAcore结合亲和力。
发明详述
本发明提供了与MN结合的人类抗体。所述抗体被用于多种诊断和治疗目的。所述目的包括：
人类MN抗体的特征
本文所说的“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子(例如IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM，IgD，IgE，IgA)，以及它们的片段，如Fab，F(ab′)2，scFv，和Fv，它们能与人类MN蛋白的表位特异性结合。能特异性结合MN的抗体所提供的检测信号，至少比由在免疫化学测定中使用的其他蛋白所提供的检测信号强5，10，或20倍。特异性结合人类MN的抗体，优选不能在免疫化学测定中检测其他蛋白，并且能够使MN从溶液中免疫沉淀。
在本说明书中对VL2和/或VL3的引用，是为了说明轻链的λ类型。
与MN结合的人类抗体的Kd，可以用本领域已知的任何方法分析，包括诸如实时双分子相互作用分析(BIA)的技术(Sjolander&Urbaniczky，Anal.Chem.63，2338-2345，1991，和Szabo等，Curr.Opin.Struct.Biol.5，699-705，1995)。BIA是一种用于实时研究生物特异性相互作用的技术，而不用对任何相互作用剂进行标记(例如BlAcoreTM)。可以将光学现象表面细胞质等离子共振(SPR)的改变用作生物分子之间实时反应的指标。
在BIAcoreTM分析中，本发明的人类抗体能特异性地结合人类MN，Kd为大约0.6nM(6×10-10nM)-大约1800nM(1.8×10-6nM)，参见图6。本发明的更优选的人类抗体，能够以大约0.6nM-大约90nM的Kd特异性地结合人类MN，本发明最优选的抗体能够以大约4nM的Kd结合人类蛋白。
正如所预想的，本发明的抗体优选能与所述蛋白聚糖结构域内的GEEDLP重复结合，所述结构域包括四个这样的相同的重复。与需要的表位的结合，可以用本领域已知的任何方法证实，包括诸如竞争ELISA的技术(Zavada等，Br.J.of Cancer 82，1808-1813，2000)，其中，通过与含有这种重复的肽(PGEEDLPGEEDLP)共同温育，可以减弱ELISA信号，不过，不会受到类似肽(PSEEDSPREEDP)的抑制，这种肽同样存在于所述蛋白聚糖结构域内。这种形式的结合抑制，还可以通过BlAcoreTM技术证实，其中，需要的抗体与固定化的MN或蛋白聚糖肽的结合，可以通过与所述肽重复温育而抑制。本发明的抗体优选还能够抑制MN表达细胞与MN包被的塑料平板ELISA的细胞粘附(Zavada等，Br.J.of Cancer 82，1808-1813，2000)。
本发明利用Morphosys噬菌体-抗体技术制备抗MN蛋白的完全的人类抗体。所述Morphosys文库是基于人类主链的，大大降低了免疫原性的可能性。
通过筛选MorphoSys HuCAL Fab文库，业已鉴定了具有MN结合和细胞粘附中和特征的多种人类抗体。将为了HuCAL文库而组装的CDR盒，设计成获得5个到28个氨基酸残基的长度分布，覆盖了从95号位置到102号位置的片段。Knappik等，J.Mol.Biol.296，57-86，2000。业已通过筛选MorphoSys HuCAL Fab文库，鉴定了具有上述MN结合和细胞粘附中和特征的多种人类抗体。将为了HuCAL文库而组装的CDR盒，设计成获得5个到28个氨基酸残基的长度分布，覆盖了从95号位置到102号位置的片段。Knappik等，J.Mol.Biol.296，57-86，2000。在本发明的某些实施方案中，人类抗体的VH3-CDR3区具有如图2中的SEQ ID NOS：61-80所示出的氨基酸序列。在本发明的其他实施方案中，人类MN抗体的VLλ1-CDR3，VLλ2-CDR3，和VLλ2-CDR1区具有如图2中的SEQ ID NOS：81-89所示出的氨基酸序列，其中具有如SEQ ID NOS：48-60所示的优化VH3-CDR1序列，这两种序列都在图2中示出。具有MN结合和细胞粘附中和活性的人类抗体如表1和2所示；在所述抗体内的可变区(CDR3环)如表1和2所示。
获得人类抗体
可以按以下方法从MorphoSys HuCAL文库中鉴定上述具有MN结合和细胞粘附中和活性的人类抗体。将人类MN包被在微量滴定板上，并且与MorphoSys HuCAL-Fab噬菌体文库温育(参见实施例1)。没有与MN结合的所述噬菌体连接的Fabs，可以从所述平板上洗掉，仅留下与MN紧密结合的噬菌体。可以通过改变pH，洗脱结合的噬菌体，并且通过感染大肠杆菌宿主而扩增。可以重复该淘选过程一次或两次，以便富集与MN紧密结合的噬菌体连接的抗体群。然后表达来自富集的合并物的Fabs，纯化，并且通过ELISA分析筛选。然后利用BiAcoreTM分析检测所鉴定的命中物(hit)的结合，并且通过上述细胞粘附分析进一步筛选这些命中物。
HuCAL-Fab文库的初步淘选还可以用MN作抗原在第一轮中进行，随后在第二轮中用与诸如BSA或运铁蛋白的载体蛋白融合的MN肽进行，而在第三轮中，再次用MN抗原进行。可用于淘选的人类MN肽包括人类MN SEQ I.D.45-47。所述肽序列源于MN蛋白聚糖序列，该序列被认为与细胞粘附相关。
另外，淘选可以用MN表达细胞作抗原进行。例如，可以用生物素标记用MN抗原转染过的细胞。然后将所述转染过的细胞与未标记过的非MN转染的细胞混合，标记过的细胞∶未标记过的细胞的比例为1∶10。将噬菌体文库添加到所述细胞中，并且所述生物素化的，携带MN的细胞用与磁铁结合的链亲和素结合的磁珠固定。非特异性噬菌体被洗掉，并且通过消除所述磁场，特异性地洗脱携带MN的细胞。可以对所述特异性结合的噬菌体进行扩增，以便进行其他轮次的细胞淘选，或交替进行肽和/或蛋白淘选。
所述筛选方法的细节披露于下面的具体实施例中。本领域技术人员可以想到用于筛选高活性特异性抗体或抗体片段的其他选择方法，并且用于鉴定人类MN抗体。
具有上述特征的人类抗体，还可以从任何能表达所述抗体的细胞中纯化，包括用编码抗体的表达构建体转染过的宿主细胞。在能表达所述人类抗体的条件下培养所述宿主细胞。用本领域所熟知的方法，从正常情况下与所述细胞中的抗体缔合的其他化合物中分离纯化的人类抗体，所述化合物如某些蛋白，碳水化合物，或脂类。所述方法包括，但不局限于大小排阻层析，硫酸铵分级分离，离子交换层析，亲和层析，和制备型凝胶电泳。纯化的人类抗体的制剂纯度为至少为80％；优选所述制剂的纯度为90％，95％，或99％。可以通过本领域已知的任何方法评估所述制剂的纯度，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明纯化的人类抗体制剂可以包括具有上述MN结合和中和特征的一种以上类型的人类抗体。
另外，可以用化学方法生产人类抗体，以便合成它的氨基酸序列，如利用固相技术进行直接肽合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154，1963；Roberge等，Science 269，202-204，1995)。蛋白合成可以用人工技术或通过自动化方法进行。例如，自动化合成可以用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)进行。人类抗体片段可任选地分别合成，并且用化学方法组合，以便产生完整长度的分子。
可以通过制备型高效液相层析，基本纯化新合成的分子(例如Creighton，PROTEINS：STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES，WH Freeman and Co.，New York，N.Y.，1983)。可以通过氨基酸分析或测序，证实合成多肽的组成(例如，使用Edman降解方法)。
人类抗体治疗用途的评估
为了评估将特定抗体治疗性地用于治疗癌症的能力，例如，可以在小鼠异种移植肿瘤模型中体内测试所述抗体。如果需要，在治疗评估之前，可以将人类Fab MN抗体转化成IgG1抗体。这种转化披露于实施例5中，并且，治疗模型的一种例子详细披露于实施例9中。还可以利用实施例13中所披露的抗体依赖型细胞介导的细胞毒性分析测试用途。
编码人类MN抗体的多核苷酸
本发明提供了编码人类MN抗体的多核苷酸。例如，可以将所述多核苷酸用于生产多种用于治疗或诊断目的的抗体。
在SEQ ID NOS：14-33中示出了可用于编码VH-CDR3区的多核苷酸。在SEQ ID NOS：34-44中示出了可用于编码VL-CDR3区的多核苷酸。在图2中示出了从MorphoSys HuCAL文库中分离的编码本发明人类抗体重链和轻链的多核苷酸。在SEQ ID NOS：1-13中示出了其他优化的VH3-CDR1序列。
存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸可以与其他细胞成分，如膜成分，蛋白，和脂类分离。多核苷酸可以由细胞产生，并且用标准核酸纯化技术分离，或者用诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术合成，或使用自动化合成仪合成。用于分离多核苷酸的方法是常规方法，并且为本领域所公知。用于获得多核苷酸的任何这样的技术都可用于获得编码本发明抗体的分离的多核苷酸。例如，可以用限制酶和探针分离编码所述抗体的多核苷酸。制剂中的分离的多核苷酸没有或至少70，80或90％不含其他分子。
本发明的人类抗体编码cDNA分子，可以通过标准分子生物学技术，用mRNA作模板制备。然后，可以用分子生物学技术领域所公知的，并且披露于诸如Sambrook等(1989)的手册中的分子生物学技术复制cDNA分子。诸如PCR的扩增技术，可用于获得所述多核苷酸的其他拷贝。
另外，可以用合成化学技术合成本发明的多核苷酸编码抗体。遗传密码的简并性，使得能够合成其他核苷酸序列，该序列编码的抗体具有诸如分别在SEQ ID NOS：48-89中所示出的VH-CDR3，VH-CDR1或VL-CDR3，轻链或重链氨基酸序列中的一个。
多核苷酸的表达
为了表达编码本发明人类抗体的多核苷酸，可以将所述多核苷酸插入包括转录和翻译所插入的编码序列所必需的元件的表达载体。可以将本领域技术人员所熟知的方法用于构建包括编码人类抗体的序列，和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。所述方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内遗传重组。例如，所述技术披露于以下文献中：Sambrook等(1989)，和Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley & Sons，New York，N.Y.，1995。还可参见下面的实施例1-3。
可以采用多种表达载体/宿主系统，以便包括并且表达编码本发明人类抗体的序列。所述表达载体/宿主包括，但不局限于微生物，如用重组噬菌体转化过的细菌，质粒或粘粒DNA表达载体；用酵母表达载体转化过的酵母，用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统，用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化过的植物细胞系统，或动物细胞系统。
所述控制元件或调控序列是载体的以下非翻译区——增强子，启动子，5’和3’非翻译区——它们与宿主细胞蛋白相互作用，以便完成转录和翻译。所述元件的强度和特异性可以改变。根据所采用的载体系统和宿主，可以使用任意数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，LaJolla，Calif.)或pSPORT1质粒(Life Technologies)的杂合lacZ启动子等。可以将杆状病毒多角体蛋白启动子用于昆虫细胞。可以将源于植物细胞基因组的启动子或增强子(例如，热激，RUBISCO，和储存蛋白基因)或源于植物病毒的启动子(例如，病毒启动子或前导序列)克隆到所述载体上。在所述哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子是优选的。如果必须制备包括多拷贝的编码人类抗体的核苷酸序列的细胞系，基于SV40或EBV的载体，可以与合适的选择标记一起使用。
药物组合物
可以将上述任意人类MN抗体添加到含有可以药用的载体的药物组合物中。所述可以药用的载体优选是非致热性的。所述组合物单独施用或者与诸如稳定化合物的至少一种其他试剂组合施用，它可以在任何无菌的，生物相容性药物载体中使用，所述载体包括，但不局限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖和水。可以采用多种含水载体，例如，0.4％的盐水，和0.3％的甘油等。所述溶液是无菌的，并且通常不含颗粒状物质。所述溶液可以通过常规的、众所周知的消毒技术(例如，过滤)消毒。根据需要，所述组合物可以含有可以药用的辅助性物质，如pH调节和缓冲剂等，以便接近生理学条件。所述药物组合物中本发明抗体的浓度可以有很大的变化，即从低于大约0.5重量％，通常为或至少为1重量％到高达15重量％或20重量％，并且可以主要根据所选择的特定施用模式，根据流体体积，粘度等进行选择。参见美国专利5,851,525。如果必要的话，在药物组合物中可以添加一种以上类型的人类抗体，例如，对MN结合具有不同Kd的抗体。
所述组合物可以单独给患者施用，或者与其他试剂，药物或激素组合施用。除了所述活性成分之外，上述药物组合物可以包括合适的可以药用的载体，包括赋形剂和有助于将所述活性化合物加工成可以药用的制剂的助剂。本发明的药物组合物可以通过多种途径中的任意一种施用，包括，但不局限于口服，静脉内，肌内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，经真皮，皮下，腹膜内，鼻内，肠胃外，局部，舌下，或直肠方式。
在制备药物组合物之后，可以将它们放入合适的容器中，并且注明用于治疗适用的状况。所述标记包括施用量，频率和方法。
诊断方法
本发明还提供了诊断方法，通过该方法可以检测测试制剂中的人类MN，包括，但不局限于血清，肺，肝，心脏，乳腺，肾，结肠，细胞培养系统，或无细胞系统(例如，组织匀浆物)的样品。例如，可以将所述诊断方法，用于诊断MN升高了的疾病。所述疾病包括，但不局限于肾癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌和肺癌。在用于诊断时，当检测到来自患者的检测样品中的抗体-MN复合体量大于正常样品中的该复合体的量时，可以确定该患者可能患有所述疾病。在实施例12中披露了用于检测癌组织中MN的免疫组织化学方法。
让所述检测制剂与本发明的人类抗体接触，并且，然后分析所述检测制剂中抗体-MN复合体的存在。如果必要的话，所述人类抗体可以包括可检测的标记，如荧光，放射性同位素，化学发光，或酶标记，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶或荧光素酶。在实施例11中示出用于检测MN表达肿瘤细胞的基于荧光素的分析方法。
所述抗体可任选地与固体支持物结合，由此可以适应实现该分析的自动化。合适的固体支持物包括，但不局限于玻璃或塑料载玻片，组织培养平板，微量滴定板孔，试管，硅芯片，或诸如珠子的颗粒(包括，但不局限于乳胶，聚苯乙烯或玻璃珠)。本领域公知的任何方法都可用于将所述抗体结合在所述固体支持物上，包括使用共价和非共价键，被动吸附，或与所述抗体和固体支持物连接的成对的结合部分。MN和抗体结合，可以在任何适合容纳所述反应剂的容器中进行。所述容器的例子包括微量滴定板，试管和微量离心试管。
治疗方法
本发明还提供了缓解MN升高了的疾病的症状的方法。所述方法包括，但不局限于肾癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌和肺癌。例如，参见(Liao，S.Y.，Cancer Res(1997)57，2827-2831)，(Turner，J.R.Hum Pathol，(1997)28，740-744)，(Liao，S.Y.等，Am J Pathol(1994)，145，598-609)，(Saarnio，J.等，Am J Pathol(1998)153，279-285)，和(Vermylen，P.等，Eur Respir J(1999)，14，806-811)。
在本发明的一种实施方案中，将治疗有效量的本发明的人类抗体给患有MN升高的疾病的患者施用，如患有上述癌症的患者。
治疗有效剂量的确定
治疗有效剂量的确定，在本领域技术人员的能力范围内。治疗有效剂量，表示与缺乏所述治疗有效剂量场合下的效力相比，用于有效治疗癌症的人类抗体的用量。
最初，治疗有效剂量可以用动物模型估计，所述动物模型通常是大鼠，小鼠，兔，狗或猪。还可以将所述动物模型用于确定施用的合适的浓度范围和途径。然后可以利用所述信息确定给人类施用的有用的剂量和途径。在实施例9中披露了皮下小鼠异种移植模型。
人类抗体的治疗效力和毒性，例如，ED50(能在50％的群体中有效治疗的剂量)和LD50(使所述群体的50％死亡的剂量)，可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药理学方法确定。毒性与治疗作用的剂量比例是治疗指数，并且可以表达为LD50/ED50比值。
具有较大治疗指数的药物组合物是优选的。将从动物研究中获得的数据，用于配制供人类使用的多种剂量。在所述组合物中所包含的剂量优选在循环浓度范围内，其中包括少有或没有毒性的ED50。在该范围内变化的剂量取决于所采用的剂型，患者的敏感性，以及施用途径。
确切剂量是由实施者根据与需要治疗的患者相关的因素决定的。对剂量和施用进行调整，以便提供足够水平的人类抗体或保持需要的作用。可以考虑的因素包括疾病状态的严重性，对象的一般健康状态，对象的年龄，体重和性别，饮食，施用的时间和频率，药物联合，反应敏感性，以及对治疗的耐受性/反应。长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除速度，每3-4日施用一次，每周施用一次，或每2周施用一次。
可以构建编码本发明的人抗体的多核苷酸，并且用业已完善的技术导入来自体内的细胞或体内细胞。所述技术包括，但不局限于运铁蛋白-聚阳离子-介导的DNA转移，用裸露的或包被的核酸转染，脂质体介导的细胞融合，DNA-包被的乳胶珠的细胞内转运，原生质体融合，病毒感染，电穿孔，“基因枪”，和DEAE或磷酸钙介导的转染。
抗体的有效体内剂量为大约5μg-大约50μg/kg患者体重，大约50μg-大约5mg/kg患者体重，大约100μg-大约500μg/kg患者体重，以及大约200-大约250μg/kg患者体重。为了施用编码所述抗体的多核苷酸，有效的体内剂量为大约100ng-大约200ng，500ng-大约50mg，大约1μg-大约2mg，大约5μg-大约500μg，以及大约20μg-大约100μg的DNA。
含有人类抗体的本发明药物组合物的施用模式，可以是能向所述宿主体内输送所述抗体的任何合适的途径。本发明的药物组合物特别适用于肠胃外施用，即皮下，肌内，静脉内，或鼻内施用。
在本说明书中所引用的所有专利和专利申请，被专门收作本文参考。以上公开内容对本发明进行了一般性披露。通过参考以下具体实施方案，可以获得更完整的理解，提供这些实施例仅仅是用于说明目的，而不是要限定本发明的范围。
实施例1
人类组合抗体文库(HuCAL-Fab1)的构建
HuCAL-Fab1的克隆。HuCAL-Fab1是Fab抗体片段形式的、完全合成的、组件形式的人类抗体文库。HuCAL-Fab1是由单链形式的抗体文库组装而成的(HuCAL-scFv；Knappik等，J.Mol.Biol.296(2000)55)。将HuCAL-Fab1克隆到噬菌粒表达载体pMORPH18 Fab1中(图3)。该载体包括Fd片段，它具有一个在C-末端与丝状噬菌体的截短的基因III蛋白融合的phoA信号序列，并且还包括具有ompA信号序列的轻链VL-CL。这两条链都受lac操纵子的控制。恒定结构域Cλ，Cκ，和CH是与HuCAL的组件系统完全相容的合成基因(Knappik等，2000)。
首先，通过分别用EcoRV/DraIII和EcoRV/BsiWI限制性消化，从HuCAL-scFv中分离Vλ和Vκ文库。将这些Vλ和Vκ文库克隆到分别用EcoRV/DraIII和EcoRV/BsiWI切割过的pMORPH18 Fab1中。在连接，并且转化到大肠杆菌TG-1中之后，分别获得了4.14×108和1.6×108的文库大小，在这两种情况下，都超过了HuCAL-scFv的VL多样性。
类似地，通过用Styl/MunI进行限制消化，从HuCAL-scFv中分离VH文库。将VH文库克隆到用Styl/MunI切割过的pMORPH18-Vλ和Vκ文库中。在连接并且转化到大肠杆菌TG-1中之后，获得了2.09×1010的总的文库大小，具有67％的正确克隆(通过对207个克隆进行测序而确定的)。
噬菌粒挽救，噬菌体扩增和纯化。在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的2×TY培养基(2×TY-CG)中扩增HuCAL-Fab。在37℃下，以大约0.5的OD600进行辅助噬菌体感染(VCSM13)之后，进行离心，并且重新悬浮在2×TY/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素中，在30℃下，让细胞生长过夜。噬菌体是从上清液中通过PEG-沉淀的(Ausubel等，1998)，重新悬浮在PBS/20％甘油中，并且在-80℃中保存。两个淘选轮次之间的噬菌体扩增，是按以下方法进行的：用洗脱的噬菌体感染中对数期TG1-细胞，并且铺板到补充了1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB-琼脂上。在30℃下温育过夜之后，将克隆刮掉，并且将OD600调整到0.5。按上述方法添加辅助噬菌体。
实施例2
固相淘选
在PBS中用人类MN蛋白对MaxiSorpTM微量滴定板(Nunc)的孔进行包被(2μg/孔)。在用溶解在PBS中的5％的脱脂奶粉封闭之后，在20℃下添加按上述方法纯化的1-5×1012 HuCAL-Fab噬菌体1小时。在进行若干洗涤步骤之后，通过用100mM三乙胺进行pH洗脱，洗脱结合的噬菌体，然后用1M TRIS-Cl pH7.0中和。按上述方法，在各轮之间通过噬菌体扩增进行三轮淘选。
实施例3
亚克隆选择的用于表达的Fab片段
将选择的HuCAL Fab片段的Fab-编码插入片段，亚克隆到表达载体pMORPHx7_FS中，以便促进可溶性Fab的快速表达。用XbaI/EcoRI消化选择的HuCAL Fab克隆的DNA制剂，由此切除Fab编码插入片段(ompA-VL和phoA-Fd)。将纯化的插入片段亚克隆到XbaI/EcoRI切割的以前携带有scFv插入片段的载体pMORPHx7中，得到了被称为pMORPHx9_Fab1_FS的Fab表达载体中(图4)。在该载体中表达的Fabs具有两个用于检测和纯化的C-末端标记(FLAG和Strep)。
实施例4
通过ELISA鉴定MN-结合Fab片段
用100μl/孔的人类MN溶液对Maxisorp ELISA平板的孔进行包被，所述溶液以5μg/ml的浓度稀释在包被缓冲液中。在30℃下，用0.5mM的IPTG诱导各个Fab表达12小时。通过渗透压休克，从周质中提取可溶性Fab(Ausubel等，1998)，并且用于ELISA中。用抗-Fab抗体检测Fab片段(Dianova)。在添加辣根过氧化化物酶-偶联的抗小鼠IgG抗体和POD可溶性底物(Roche Diagnostics)之后，读出在370nm波长下的值。
实施例5
HuCAL免疫球蛋白表达载体的构建
重链克隆。去除了pcDNA3.1+(Invitrogen)的多克隆位点(NheI/ApaI)，并且插入用于HuCAL设计的与所述限制位点相容的填充片段，以便连接前导序列(NheI/EcoRI)，VH-结构域(EcoRI/BlpI)，和免疫球蛋白恒定区(BlpI/ApaI)。所述前导序列(EMBL M83133)具有Kozak序列(Kozak，1987)。将人类IgG1(PIR J00228)，IgG4(EMBLK01316)，和血清IgA1(EMBL J00220)的恒定区，分解成长度为大约70个碱基的重叠的寡核苷酸。导入沉默突变，以便去除与HuCAL设计不相容的限制位点。通过重叠延伸-PCR剪接所述寡核苷酸。
轻链克隆。用两个不同的填充片段取代pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的多克隆位点。κ填充片段提供了用于插入κ-前导序列(Nhel/EcoRV)，HuCAL-scFv Vκ-结构域(EcoRV/BsiWI)和κ-链恒定区(BsiWI/ApaI)的限制位点。κ-填充片段中的相应的限制位点是Nhel/EcoRV(I-前导序列)，EcoRV/HpaI(VI-结构域)，和HpaI/ApaI(λ-链恒定区)。κ-前导序列(EMBL Z00022)以及λ前导序列(EMBL L27692)都具有Kozak序列。通过按上述方法重叠延伸-PCR组装人类κ-(EMBL J00241)和λ-链(EMBL M18645)的恒定区。
IgG-表达CHO-细胞的制备。用IgG重链和轻链表达载体的等摩尔的混合物共转染CHO-K1细胞。通过限制稀释，用600μg/ml G418和300μg/ml Zeocin(Invitrogen)选择双抗性转染体。通过捕获-ELISA评估单克隆上清液的IgG表达(参见下文)。在补充了10％超低IgG-FCS(Life Technologies)的RPMI-1640培养基中扩增阳性克隆。在将上清液的pH调节到8.0并且进行消毒过滤之后，对该溶液进行标准蛋白A柱层析(Poros 20 A，PE Biosystems)。
实施例6
CDR3文库的设计
Vλ位置1和2。构建具有它们的真实N-末端的原始HuCAL主基因：VLλ1：QS(CAGAGC)，VLλ2：QS(CAGAGC)，和VLλ3：SY(AGCTAT)。在WO97/08320中披露了包括所述氨基酸的序列。在HuCAL文库构建期间，将前两个氨基酸换成了DI，以便有利于文库克隆(EcoRI位点)。所有HuCAL文库在5’末端都包括具有EcoRV位点GATATC(DI)的VLλ基因。所有HuCALκ基因(所述文库中的主基因和所有基因)都包括位于5′-末端的DI。
VH位置1。构建具有它们的真实N-末端的原始HuCAL主基因：用Q(＝CAG)作为第一个氨基酸的VH1A，VH1B，VH2，VH4，和VH6，和用E(＝GAA)作为第一个氨基酸的VH3和VH5。在WO97/08320中披露了包括所述氨基酸的序列。在HuCALFab1文库中，所有VH链包括位于所述一号位置上的Q(＝CAG)。
Vκ1/Vκ3位置85。由于用于导入CDR3文库的盒诱变方法(Knappik等，J.Mol.Biol.296，57-86，2000)，Vκ1和Vκ3的85号位置可以是T或V。因此，在HuCAL scFv1文库构建期间，Vκ1和Vκ3的85号位置可以作以下变化：Vκ1原始的，85T(密码子ACC)；Vκ1文库，85T或85V(TRIM密码子ACT或GTT)；Vκ3原始的，85V(密码子GTG)；Vκ3文库，85T或85V(TRIM密码子ACT或GTT)；将相同的变化应用于HuCAL Fab1。
CDR3设计。在表1和2中示出了保持恒定的所有CDR3残基。
CDR3长度。所设计的CDR3长度分布如下。在图2中所示出的序列表中，示出了改变了的残基。VκCDR3，8个氨基酸残基(89-96号位置)(偶然有7个残基)，具有固定的Q90；Vλ CDR3，8-10个氨基酸残基(89-96号位置)(偶然有7-10个残基)，具有固定的Q89，S90，和D92；和VH CDR3，5-28个氨基酸残基(95-102号位置)(偶然有4-28个残基)，具有固定的D101。
实施例7
用于表位作图的竞争ELISA
在4℃下，用100μL浓度为5μg/mL的溶解在PBS中的MN或MN-肽偶联的BSA，对Nunc Maxisorb微量滴定板进行包被过夜。在室温下，在微量滴定板振荡器上，用2小时时间，用溶解在5％PBS中的5％脱脂乳封闭每一个孔。用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤所述平板。向每一个孔中添加200μL抗体或抗体+蛋白聚糖肽A，B，或C(SEQ ID20-22)。优化抗体和蛋白聚糖肽的浓度，以便能够最容易地确定50％的终点。在室温下，在微量滴定板振荡器上，用1.5小时时间温育所述抗体/肽混合物。用含有0.05％ Tween-20的TBS快速洗涤ELISA平板5次。用过氧化物酶偶联的山羊抗-FabIgG(Sigma)测试结合的抗体。在用TBS-Tween进一步洗涤之后，添加100μL的BM Blue POD底物(Roche)。在温育30分钟之后，在370nm下读出吸收值。
实施例8
细胞粘附分析
以30μL的液滴，用1.5小时时间，将溶解在pH9.2的50mM碳酸氢盐缓冲液中的1μg/mL纯化的MN吸附在细菌学5cm Petri培养皿的底部。去掉所述液滴，并且用PBS漂洗3次。然后用溶解在DMEM中的50％的胎牛血清封闭所述液滴。用30mL的20-100μg/mL抗-MN IgGs或用PBS和不相关的抗体作对照进一步处理所述液滴。在用PBS洗涤所述液滴之后，用30μL的CGL-1细胞悬浮液(105细胞/mL)温育斑点，并且温育过夜。在用PBS洗涤所述液滴之后，评估抗MN抗体阻断CGL-1细胞与MN包被的平板粘附的能力。在图5中示出了本实验的一种例子，其中，与对照γ球蛋白(图5B)和无抗体处理(图5C)相比，20μg/ml的抗-MN抗体MN-3(图5A)能抑制细胞粘附。
实施例9
皮下异种移植癌症模型
用免疫缺陷小鼠的皮下异种移植模型评估抗MN抗体的抗肿瘤作用。在补充了10％ FBS的DMEM中，以粘附培养物形式维持HT-29细胞。用存在于0.1mL培养基中的1×107细胞在右胁腹对6-7周龄的SCID小鼠进行皮下接种。每天以500μg的剂量通过腹膜内方式施用单克隆抗体。用PBS或不相关的单克隆抗体处理对照小鼠。用滑动卡尺每周2次测定肿瘤。通过比较抗MN抗体治疗和对照治疗的肿瘤的尺寸，评估抗肿瘤效力。
实施例10
具有免疫偶联物的皮下异种移植癌症模型
用本领域已知的方法将抗MN抗体偶联在细胞毒性小分子上(例如，C.Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)，93，8618-8623)。将HT-29细胞以贴壁培养物形式维持在补充了10％ FBS的DMEM中。用存在于0.1mL培养基中的1×10e7肿瘤细胞，在右胁腹皮下接种6-7周龄的CB-17 SCID小鼠。当肿瘤尺寸达到65立方毫米之后，连续5天，每天给动物注射0.5mg的抗体偶联物。用PBS，不相关的单克隆抗体或游离的未偶联的药物处理对照小鼠。用滑动卡尺每周2次测定肿瘤。通过比较抗MN抗体治疗和对照治疗的肿瘤的尺寸，评估抗肿瘤效力。
实施例11
荧光激活的细胞分选分析(FACS分析)
作为诊断工具，可以分析细胞的MN表达。对于贴壁细胞系来说，首先通过除去它们的培养基，使细胞与它们的培养烧瓶分离，用冰冷的PBS漂洗一次，并且根据细胞系用溶于PBS的1mM EDTA处理所述细胞5-10分钟(通过定期敲击所述烧瓶刺激)。通过离心使所述细胞沉降(1500rpm，5分钟)，并且用冰冷的染色缓冲液(10％ FBS，0.1％叠氮化钠，PBS)洗涤所述细胞一次。以200μl中1百万个细胞的浓度将所述细胞重新悬浮在冰冷的染色缓冲液中。以3.2E-11至3.2E-8M的比例添加第一抗体，并且在冰上温育1小时。用冰冷的染色缓冲液洗涤未结合的抗体。将细胞沉淀物重新悬浮在200μl冰冷的染色缓冲液中，并且在每200μl细胞中添加20μl FITC-偶联的抗-人类第二抗体(Pharmingen)。在冰上温育1小时。洗涤未结合的抗体，并且将所述细胞重新悬浮在200μl溶解在染色缓冲液中的2.5μg/ml的碘化丙锭(PI)(Sigma)中(以便控制死亡细胞)。通过FACS分析处理，以便排除摄取PI的细胞。如图7所示，通过FACS分析发现，PC3mm2人类前列腺癌细胞能表达MN。红线表示用人类抗MN抗体染色，而黑线表示对照，即同种型匹配的人类抗体。
实施例12
肿瘤样品的免疫组织化学分析
可以将肿瘤切片用于检测MN表达。由于MN在癌中是高度表达的，并且在正常组织中存在低的表达水平，分析MN表达，可用于诊断和检测患者样品中的癌。为了分析组织切片，可以使用标准免疫组织化学技术。将含有PC-3前列腺癌的组织切片移植到SCID小鼠体内。将20μg/mL的抗MN抗体与脱蜡的石蜡切片一起温育，并且用过氧化物酶偶联的第二抗体对载玻片进行显影，并且用DAB生色剂进行显影。可以方便地观察到强的膜相关信号，并且是在前列腺癌细胞中MN高表达的特征。
实施例13
抗体依赖型细胞介导的细胞毒性分析(ADCC分析)
抗MN IgGgs的抗肿瘤活性，可以通过ADCC活性介导。用250ng/mL，1000ng/mL或2000ng/mL人抗-MNIgG1或对照人IgG1抗-地高辛抗体温育表达MN的PC-3mm2细胞和不表达MN的HCT-116细胞。以50∶1，25∶1和5∶1的效应细胞∶靶细胞比例，将人类PBMCs添加到所述细胞中。进行铬-51释放分析，以便测定靶细胞裂解的水平。在温育对照抗体，或没有抗体时在存在HCT-116或PC-3mm2细胞的条件下观察到了少量的裂解。对于50∶1，25∶1和5∶1的靶细胞∶效应细胞比例来说，这种裂解的自发水平分别为10-15％，5-10％，或2-3％。类似地，在用抗MN抗体温育时，不表达MN的HCT-116细胞的裂解为0-10％。不过，在用人抗MN IgGs温育时，PC-3mm2细胞的裂解显著高于对照。在以50∶1靶细胞∶效应细胞的比例使用250ng/mL，1000ng/mL和2000ng/mL时，观察到了40，50和60％的裂解。类似地，在25∶1的比例下，观察到了30，33和38％的裂解，最后，在5∶1的靶细胞∶效应细胞比例下，观察到了8，10和15％的裂解。以上实验表明，人类抗MN抗体能介导抗肿瘤ADCC活性，并且可用于癌症的治疗性处理。
表1和2
说明
有关HuCAL序列概述的说明(HuCAL文库scFv1，scFv2，scFv3和Fab1)
1.编号： 编号是根据VBASE，除了Vλ位置9中的缺口。在VBASE中，将所述缺口设定为位置10。还可参见Chothia等(1992)J.mol.Biol.，227，776-798，Tomlinson等(1995)EMBO J.，14，4628-4638和Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264，220-232)。
2.限制位点： 在所述蛋白序列概述中，所提供的位点的位置只是近似的。对于详细的位置来说，使用所述DNA序列概述或载体NTI主基因序列文件(可以参见共享的数据库)。
3.Vλ1&2： 业已构建了具有它们的真实N-末端的原始HuCAL主基因：VLλ1：QS(CAGAGC)VLλ2：QS(CAGAGC)VLλ3：SY(AGCTAT)可以发现包括该氨基酸的序列，即在专利申请和PDB结构模型文件中发现。在HuCAL文库构建期间，业已将前两个氨基酸换成了DI，以便有利于文库克隆(EvoRV位点)所有HuCAL文库都包括VLλ基因，在它的5’末端具有EcoRV位点GATATC(DI)所有HuCALκ基因(该文库中的主基因和所有基因)在它的5’末端包括DI。
4.VH位置1： 业已构建了具有它们的真实N-末端的原始HuCAL主基因：VH1A，VH1B，VH2，VH4和VH6具有作为第一个氨基酸的Q(＝CAG)VH3和VH5具有作为第一个氨基酸的B(＝GAA)所有与短的FLAG序列(DYKD)融合的HuCAL VH链在一号位置上都包括E(＝GAA)(HuCAL文库scFv1，2和3)在HuCAL Fab1文库中，所有VH链在一号位置上都包括Q(＝CAG)
5.Vx1/VK3位置85： 在HuCAL scFv1文库构建期间，改变了Vκ1和Vκ3的85号位置：Vκ1原始：85T(密码子ACC)Vκ1文库：85T或85V(TRIM密码子ACT或GTT)Vκ3原始：85V(密码子GTG)Vκ3文库：S5T或85V(TRIM密码子ACT或GTT)HuCAL scFv2和3以及HuCAL Fab1在该位置上与HuCALscFv1相同
6.CDR3设计： 在本序列概述中，标明了保持恒定的所有CDR3残基
7.CDR3长度： 以下是设计的CDR3长度分布。在本序列概述中，改变了的残基在括弧中提供(x)VκCDR3：8个氨基酸残基(89-96号位置)(偶尔7个残基)；固定的Q90Q90 VλCDR3：8-10个氨基酸残基(89-96号位置)(偶尔7-10个残基)；固定的Q89，S90，D92VH CDR3：5-28个氨基酸残基(95-102号位置)(偶尔4-28个残基)；固定的D101
表1
序列概述HuCAL文库scFv1，scFv2，scFv3和Fab1
表1
表1
表2
序列概述HuCAL文库scFv1，scFv2，scFv3和Fab1
Figure A0282548800311
表2
表2
Figure A0282548800331
序列表
<110>Toshihiko Takeuchi
     Nathalie Dubois-Stringfellow
     John E.Murphy
     Julie Rinkenberger
<120>具有MN结合和细胞粘附中和活性的人类抗体
<130>MSB-7289
<140>10/273,541
<141>2002-10-18
<150>60/434,657
<151>2001-10-18
<150>60/377,716
<151>2002-05-02
<160>89
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
ggatttacct ttagcgagag ggccatgacc                                  30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>2
ggatttacct ttagcgcggc catgatgacg                                  30
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>3
ggatttacct ttagcgggag catgatggcc                                  30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>4
ggatttacct ttagcgactg ggcgatgacg                                  30
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>5
ggatttacct ttgtgaagag catggtggtg                                  30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>6
ggatttacct ttagcaggaa cctgatgacc                                  30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>7
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<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>8
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<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>9
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<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>10
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<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>11
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<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>12
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<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>13
ggatttacct ttagcgggag catgattacg                                  30
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>14
tctgctactc gttttgatta t                                           21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>15
aatggtactc gtatggatgt t                                           21
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人
<400>16
ggtattgttc gtggtatgga tcat                                        24
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>17
ggtggttctc gttatgatgt t                                           21
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人
<400>18
aatattacta agtctgattg tt                                          22
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>19
ggtggtactc gttttgatta t                                           21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>20
aatggtcgta atcttgatta t                                           21
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>21
actgctactc gttttgatta t                                           21
<210>22
<211>45
<212>DNA
<213>人
<400>22
aagcctttta ctggtaagta ttggggtcat actggttttg atatt                 45
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>人
<400>23
aaacctttta ctggtaagta ttggggtcat actggttttg atatt                 45
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>24
aatggcctgc gtatggatgt t                                           21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>25
aatctgctgc gtatggatgt t                                           21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>26
aatgcggtgc gtatggatgt t                                           21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>27
aatgcgatgc gtatggatgt t                                           21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>28
aatgccctcc gtatggatgt t                                           21
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>29
aatgtgctgc gtatggatgt t                                           21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>30
ggggggacgc gtatggatgt t                                           21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>31
cagggcaccc gtatggatgt t                                           21
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>32
aatggcgtgc gtatggatgt t                                           21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>33
aatggcatcc gtatggatgt t                                           21
<210>34
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>34
cagagccgtg actatgagaa gcctatgatt                                  30
<210>35
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>35
cagagccgag actatgagaa gcctatgatt                                  30
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>36
cagagccgcg actatgagaa gcctatgatt                                  30
<210>37
<211>42
<212>DNA
<213>人
<400>37
acgggtacta gcagcgatag gacgcgcccg ccgaagtacg cc                    42
<210>38
<211>42
<212>DNA
<213>人
<400>38
acgggtacta gcagcgatgt gtccggcctc aacatcgtgt cc                    42
<210>39
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>39
cagagctatg accgtgcttt taagtctgtt                                  30
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>40
cagagctatg accataagaa gactgag                                     27
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>41
cagagctatg acatgtttgc tcgtgttatt                                  30
<210>42
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>42
cagagctatg accgtcttta taagaagctt                                  30
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>43
cagagctatg accgggctta tcgacttctt                                  30
<210>44
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>44
cagagctatg accgttctcg ttatgct                                     27
<210>45
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>45
Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp
 1               5                  10                  15
Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
            20                  25                  30
<210>46
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>46
Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
 1               5                  10
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>47
Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro
 1               5                  10
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>48
Gly Phe Thr Phe Ser Glu Arg Ala Met Thr
 1               5                  10
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>49
Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ala Met Met Thr
 1               5                  10
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>50
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Met Met Ala
 1               5                  10
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>51
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Trp Ala Met Thr
 1               5                  10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>52
Gly Phe Thr Phe Val Lys Ser Met Val Val
 1               5                  10
<210>53
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>53
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn Leu Met Thr
 1               5                  10
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>54
Gly Phe Thr Phe Glu Arg Trp Met Gly Ala
 1               5                  10
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>55
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Arg Met Met Val
 1               5                  10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>56
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Trp Met Met Val
 1               5                  10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>57
Gly Phe Thr Phe Ser Glu Ser Met Met Thr
 1               5                  10
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>58
Gly Phe Thr Phe Ser Trp His Met Met Thr
 1               5                  10
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>59
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Val Met Met Thr
 1               5                  10
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>60
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Met Met Thr
 1               5                  10
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>61
Ser Ala Thr Arg Phe Asp Tyr
 1               5
<210>62
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>62
Asn Gly Thr Arg Met Asp Val
 1               5
<210>63
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>63
Gly Ile Val Arg Gly Met Asp His
 1               5
<210>64
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>64
Gly Gly Ser Arg Tyr Asp Val
 1               5
<210>65
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>65
Asn Ile Thr Lys Ser Asp Val
 1               5
<210>66
<21l>7
<212>PRT
<213>人
<400>66
Gly Gly Thr Arg Phe Asp Tyr
 1               5
<210>67
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>67
Asn Gly Arg Asn Leu Asp Tyr
 1               5
<210>68
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>68
Thr Ala Thr Arg Phe Asp Tyr
 l               5
<210>69
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>69
Lys Pro Phe Thr Gly Lys Tyr Trp Gly His Thr Gly Phe Asp Ile
 1               5                  10                  15
<210>70
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>70
Lys Pro Phe Thr Gly Lys Tyr Trp Gly His Thr Gly Phe Asp Ile
 1               5                  10                  15
<210>71
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>71
Asn Gly Leu Arg Met Asp Val
 1               5
<210>72
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>72
Asn Leu Leu Arg Met Asp Val
 1               5
<210>73
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>73
Asn Ala Val Arg Met Asp Val
 1               5
<210>74
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>74
Asn Ala Met Arg Met Asp Val
 1               5
<210>75
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>75
Asn Ala Leu Arg Met Asp Val
 1               5
<210>76
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>76
Asn Val Leu Arg Met Asp Val
 1               5
<210>77
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>77
Gly Gly Thr Arg Met Asp Val
 1               5
<210>78
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>78
Gln Gly Thr Arg Met Asp Val
 1               5
<210>79
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>79
Asn Gly Val Arg Met Asp Val
 1               5
<210>80
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>80
Asn Gly Ile Arg Met Asp Val
 1               5
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>81
Gln Ser Arg Asp Tyr Glu Lys Pro Met Ile
 1               5                  10
<210>82
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>82
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Arg Thr Arg Pro Pro Lys Tyr Ala
 1               5                  10
<210>83
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>83
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Ser Gly Leu Asn Ile Val Ser
 1               5                  10
<210>84
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>84
Gln Ser Tyr Asp Arg Ala Phe Lys Ser Val
 1               5                  10
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>85
Gln Ser Tyr Gly His Lys Lys Thr Glu
 1               5
<210>86
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>86
Gln Ser Tyr Asp Met Phe Ala Arg Val Ile
 1               5                  10
<210>87
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>87
Gln Ser Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Lys Leu
 1               5                  10
<210>88
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>88
Gln Ser Tyr Asp Arg Ala Tyr Arg Leu Leu
 1               5                  10
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>89
Gln Ser Tyr Asp Arg Ser Arg Tyr Ala
 1               5

Claims (87)

1.一种纯化的人类抗体制剂，其中，所述抗体与MN蛋白结合。
2.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述抗体与MN蛋白的蛋白聚糖结构域结合。
3.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述抗体与MN蛋白的蛋白聚糖结构域内的GEEDLP重复区结合。
4.如权利要求3的纯化制剂，其中，所述抗体以大约0.6nM-大约1800nM的Kd与所述人类MN蛋白结合。
5.如权利要求3的纯化制剂，其中，所述抗体以大约0.6nM-大约90nM的Kd与所述人类MN蛋白结合。
6.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括VH3-CDR3区，它包括选自SEQ ID NOS：61-80的氨基酸序列。
7.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括VH3-CDR1区，它包括选自SEQ ID NOS：48-60的氨基酸序列。
8.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括VH3-CDR3区，它包括SEQ ID NO：64的氨基酸。
9.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括VLλ1-CDR3区，它包括SEQ ID NO：81的氨基酸序列。
10.如权利要求1的纯化制剂，包括VLλ2-CDR1区，它包括选自SEQ ID NOS：82-83的氨基酸序列。
11.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括VLλ2-CDR3区，它包括选自SEQ ID NOS：84-89的氨基酸序列。
12.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括选自SEQID NOS：61和84，SEQ ID NOS：62和87，SEQ ID NOS：63和89，SEQ ID NOS：64和84，SEQ ID NOS：65和84，SEQ ID NOS：66和85，SEQ ID NOS：67和88的VH3-CDR3和VL2-CDR3氨基酸序列对。
13.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括选自SEQID NOS：61和86，SEQ ID NOS：61和85，SEQ ID NOS：61和87，SEQ ID NOS：61和88，SEQ ID NOS：61和89，SEQ ID NOS：63和86，SEQ ID NOS：63和85，SEQ ID NOS：63和87，SEQ ID NOS：63和88，以及SEQ ID NOS：63和84的VH3-CDR3和VL2-CDR3氨基酸序列对。
14.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括选自SEQID NOS：71和87，SEQ ID NOS：61和87，SEQ ID NOS：72和87，SEQ ID NOS：73和87，SEQ ID NOS：74和87，SEQ ID NOS：75和87，SEQ ID NOS：76和87，SEQ ID NOS：77和87，SEQ ID NOS：78和87，SEQ ID NOS：79和87以及SEQ ID NOS：80和87的VH3-CDR3和VL2-CDR3氨基酸序列。
15.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括选自SEQID NOS：61和81，SEQ ID NOS：69和81，以及SEQ ID NOS：70和81的VH3-CDR3和VL1-CDR3氨基酸序列。
16.如权利要求1的纯化制剂，其中，所述人类抗体包括选自SEQID NOS：61和86和48，SEQ ID NOS：61和86和49，SEQ ID NOS：61和86和50，SEQ ID NOS：61和86和51，SEQ ID NOS：61和86和52，SEQ ID NOS：61和86和53，SEQ ID NOS：61和86和54，SEQ IDNOS：61和86和55，SEQ ID NOS：61和86和56，以及SEQ ID NOS：61和86和57的VH3-CDR3，VL2-CDR3，和VH3-CDR1氨基酸序列。
17.一种编码人类抗体的纯化制剂的核苷酸序列，其中，所述抗体与MN蛋白结合。
18.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：1-13的VH3-CDR1区。
19.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括VH3-CDR3区，它包括选自SEQ ID NOS：14-33的核苷酸序列。
20.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括VLλ1-CDR3区，它包括选自SEQ ID NOS：34-36的核苷酸序列。
21.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括VL2-CDR1区，它包括选自SEQ ID NOS：37-38的核苷酸序列。
22.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括VLλ2-CDR3区，它包括选自SEQ ID NOS：39-44的核苷酸序列。
23.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：1和14和41，SEQ ID NOS：2和14和41，SEQ ID NOS：3和14和41，以及SEQ ID NOS：4和14和41的VH3-CDR1，VH3-CDR3和VL2-CDR3核苷酸序列。
24.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：14和37和41，以及SEQ ID NOS：14和38和41的VH3-CDR3，VL2-CDR1，和VL2-CDR3核苷酸序列。
25.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：14和41和1，SEQ ID NOS：14和41和2，SEQ ID NOS：14和41和3，SEQ ID NOS：14和41和4，SEQ ID NOS：14和41和5，SEQ ID NOS：14和41和6，SEQ ID NOS：14和41和7，SEQ ID NOS：14和41和8，SEQ ID NOS：14和41和9，SEQ ID NOS：14和41和10的VH3-CDR3，VL2-CDR3和VH3-CDR1核苷酸序列。
26.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：14和39，SEQ ID NOS：15和42，SEQ ID NOS：16和44，SEQ ID NOS：17和39，SEQ ID NOS：18和39，SEQ ID NOS：19和40，以及SEQ ID NOS：20和43的VH3-CDR3，VL2-CDR3核苷酸序列。
27.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：14和34，SEQ ID NOS：22和34，SEQ ID NOS：22和35，SEQ ID NOS：22和36，以及SEQ ID NOS：23和34的VH3-CDR3，VL1-CDR3核苷酸序列。
28.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NOS：14和41，SEQ ID NOS：14和40，SEQ ID NOS：14和42，SEQ ID NOS：14和43，SEQ ID NOS：14和44，SEQ ID NOS：16和41，SEQ ID NOS：16和40，SEQ ID NOS：16和42，SEQ ID NOS：16和43以及SEQ ID NOS：16和39的VH3-CDR3，VL2-CDR3核苷酸序列。
29.如权利要求17的纯化制剂，其中，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID：24和42，SEQ ID：14和42，SEQ ID：25和42，SEQ ID：26和42，SEQ ID：27和42，SEQ ID：28和42，SEQ ID：29和42，SEQID：30和42，SEQ ID：31和42，SEQ ID：32和42，以及SEQ ID：33和42的VH3-CDR3，VL2-CDR3核苷酸序列。
30.一种包括权利要求17的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
31.一种包括权利要求18的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
32.一种包括权利要求19的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
33.一种包括权利要求20的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
34.一种包括权利要求21的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
35.一种包括权利要求22的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
36.一种包括权利要求23的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
37.一种包括权利要求24的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
38.一种包括权利要求25的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
39.一种包括权利要求26的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
40.一种包括权利要求27的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
41.一种包括权利要求28的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
42.一种包括权利要求29的多核苷酸的表达载体，其中，所述载体编码MN结合抗体。
43.一种包括权利要求30的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
44.一种包括权利要求31的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
45.一种包括权利要求32的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
46.一种包括权利要求33的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
47.一种包括权利要求34的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
48.一种包括权利要求35的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
49.一种包括权利要求36的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
50.一种包括权利要求37的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
51.一种包括权利要求38的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
52.一种包括权利要求39的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
53.一种包括权利要求40的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
54.一种包括权利要求41的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
55.一种包括权利要求42的表达载体的宿主细胞，其中，所述宿主细胞能表达MN结合抗体。
56.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求31的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
57.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求32的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
58.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求33的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
59.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求34的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
60.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求35的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
61.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求36的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
62.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求37的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
63.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求38的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
64.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求39的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
65.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求40的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
66.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求41的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
67.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求42的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
68.一种制备人类抗体的方法，包括以下步骤：
在能表达所述抗体的条件下培养权利要求43的宿主细胞；并且从所述宿主细胞培养物中纯化所述人类抗体。
69.一种用于治疗MN蛋白在某些细胞中表达的人类疾病的方法，包括以下步骤：
a)提供具有MN蛋白在某些细胞中表达的状况的人类；和
b)给所述人类施用有效量的人MN抗体化合物，所述化合物包括MN抗体和细胞毒性剂，其中，所述细胞毒性剂能够在所述MN表达细胞中诱导细胞死亡。
70.如权利要求69的方法，其中，所述疾病选自下组：肾细胞癌，食道癌，宫颈癌，恶性结肠癌，和非小细胞肺癌。
71.如权利要求69的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：61-80的VH3-CDR3区。
72.如权利要求69的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：48-60的VH3-CDR1区。
73.如权利要求69的方法，其中，所述抗体包括由SEQ ID NO：81组成的VL1-CDR3区。
74.如权利要求69的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ IDNOS：82-83的VL2-CDR1区。
75.如权利要求69的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：84-89的VL2-CDR3区。
76.一种检测测试制剂中MN抗原的方法，包括以下步骤：
a)让所述测试制剂与特异性结合MN抗原的抗体接触，和
b)分析所述测试制剂中抗体-MN抗原复合物的存在。
77.如权利要求76的方法，其中，所述抗体包括可检测的标记。
78.如权利要求76的方法，其中，所述抗体与固体支持物结合。
79.一种辅助诊断MN蛋白水平升高的疾病的方法，包括以下步骤：
a)让来自被怀疑患有所述疾病的患者的样品与结合MN的人类抗体接触；和
b)分析抗体-MN复合物的存在，检测出大于正常样品中复合物量的复合物量，可确定所述患者有可能患有所述疾病。
80.如权利要求79的方法，其中，所述抗体包括可检测的标记。
81.如权利要求79的方法，其中，所述抗体与固体支持物结合。
82.如权利要求79的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：61-80的VH3-CDR3区。
83.如权利要求79的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：48-60的VH3-CDR1区。
84.如权利要求79的方法，其中，所述抗体包括由SEQ ID NO：81组成的VL1-CDR3区。
85.如权利要求79的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：82-83的VL2-CDR1区。
86.如权利要求79的方法，其中，所述抗体包括选自SEQ ID NOS：84-89的VL2-CDR3区。
87.一种药物组合物，包括与MN蛋白结合的人类抗体和可以药用的载体。
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