CN1607959A - 导致或引起包括淋巴瘤细胞在内的细胞杀伤的人多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与细胞表面表位结合，和以多价形式导致或引起细胞(包括淋巴瘤细胞)杀伤的多肽组合物，和在单价形式下，导致免疫抑制或移植淋巴细胞活化的多肽组合物。本发明还涉及编码该多肽的核酸，产生多肽的方法，杀伤细胞的方法，免疫抑制病人的方法，含有多肽的药物、诊断和多价组合物和试剂盒以及多肽的用途。

Description

导致或引起包括淋巴瘤细胞在内的细胞杀伤的人多肽
发明背景
每一种迄今研究的哺乳动物携带一簇基因，编码所谓的主要组织相容性复合物(MHC)。该紧密连锁的基因簇编码表面抗原，它在体液和细胞介导的免疫应答中起到了中心作用。在人类中MHC编码的产物称作人淋巴细胞抗原或HLA。MHC-基因组织在编码三类分子(I-III类)的区域。
I型MHC分子是45kD跨膜糖蛋白，与另一种糖蛋白，12kDβ-2微球蛋白非共价结合(Brown等，1993)。后者不插入细胞膜，编码在MHC外侧。人I型分子是三种不同的同型抗原，称为HLA-A、-B和-C，在独立的基因座编码。I型分子的组织表达是普遍存在并且是共显性的。MHC I型分子递呈激活细胞毒性T细胞必需的肽抗原。
II型MHC分子与两种跨膜糖蛋白，35kDα链和28kDβ链的异二聚体非共价结合(Brown等，1993)。在人类中，II型分子作为三种不同的同型出现，称为人淋巴细胞抗原DR(HLA-DR)、HLA-DP和HLA-DQ。DR的多态性限于β链，而两条链在DP和DQ同型中都具有多态性。II型分子共显性表达，但与I型相反，显示有限的组织分布：它们仅存在于免疫系统(例如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和活化的T淋巴细胞)的细胞表面。它们还在正常肾上腺的网状带的人皮质细胞上表达，并在正常卵巢黄体的粒层细胞中表达(Kahoury等，1990)。它们的主要生物学作用是结合抗原肽并将其递呈到抗原递呈细胞(APC)表面，让CD4辅助T(Th)淋巴细胞识别(Babbitt等，1985)。MHC II型分子还可在非免疫系统细胞表面表达。例如在淋巴样细胞外的器官中的细胞可在病原性炎症反应中表达MHC II型分子。这些细胞可包括滑膜细胞、内皮细胞、甲状腺基质细胞和神经胶质细胞。
III型MHC分子也与免疫应答有关，但编码某种程度上不同的产物。这些包括许多可溶性血清蛋白、酶和蛋白质，例如肿瘤坏死因子或类固醇-21羟化酶。在人中，III型分子有三种不同同型，称为Ca、C2和Bf(Kuby，1994)。
由于Th细胞活化是几乎所有免疫应答引发的关键事件，并通过II类分子介导，II型MHC本身作为免疫调节的目标(Baxevanis等，1980；Rosenbaum等，1981；Adorini等，1988)。除了肽递呈，II型分子可转导各种影响APC生理性质的信号。这些信号是由于多个II型分子与抗体或Th细胞的抗原受体相互作用产生的(Vidovic等，1995a；Vidovic等，1995b)，并且能够诱导B细胞活化和免疫球蛋白分泌(Cambier等，1991；Palacios等，1983)，单核细胞的细胞因子产生(Palacios，1985)以及上调共刺激(Nabavi等，1992)和细胞粘着分子(Mourad等，1990)。
还有一组观察结果提示在某些条件下II型连接可导致细胞生长停止或可以是细胞毒性的。在这些条件下的连接是多肽与II型MHC分子相互作用。对于后一种作用和它们可能的机制有很多矛盾。一些作者声称B细胞上II型分子复合物的形成导致生长抑制(Vaickus等，1989；Kabelitz等，1989)，而根据其它的报道，II型复合物形成导致细胞死亡(Vidovic等，1995a；Newell等，1993；Truman等，1994；Truman等，1997；Drenou等，1999)。在一些实验系统中，仅休眠的B细胞观察到现象(Newell等，1993)，或在其它系统中仅用活化的B细胞(Vidovic等，1995a；Truman等，1994)。
基于这些观察结果，许多年来已设想用抗-II型单克隆抗体(mAb)作为候选治疗剂。事实上，在一系列动物疾病模型中小鼠衍生抗II型mAb的益处支持了该提议(Waldor等，1983；Jonker等，1988；Stevens等，1990；Smith等，1994；Vidovic&Torral，1998；Vidovic & Laus，2000)。
尽管有这些早期的支持性的数据，迄今未描述显示所需细胞毒性和其它生物性质(可能包括亲和力、增殖抑制或细胞因子分泌的减少)的人组合物的抗-MAb II类组合物。事实上，尽管可相对简单的衍生出小鼠衍生的mAb，但用小鼠衍生mAb的工作证明了获得具有所需生物性质的抗体的困难。例如，在不同小鼠抗-II型mAb的T细胞抑制能力中观察到显著和不能充分理解的差异(Naquet等，1983)。另外，体内使用某些小鼠衍生的mAb与未预期的副作用相联系，有时引起实验灵长类的死亡(Billing等，1983；Jonker等，1991)。
普遍认为小鼠衍生的mAb(包括嵌合和所谓的“人源化”mAb)与人mAb(例如Vose等，2000；Kashmiri等，2001)相比，伴有在病人体内产生不良免疫应答的增长的危险(人抗-小鼠抗体HAMA)。当用任何小鼠衍生的mAb治疗慢性病，如类风湿性关节炎或多发性硬化时，或需要常规治疗，例如当治疗一些癌症时，该危险可能增加；人免疫系统持续接触非人分子常常导致不良免疫反应。另外，已证明获得具有对所需抗原具有所需特异性或亲和性的小鼠衍生抗体非常难(Pichla等，1997)。这些观察结果可对小鼠衍生的mAb的疗效和优点具有显著影响，或降低疗效和优点。小鼠衍生的mAb的缺点的例子包括下列：第一，小鼠衍生的mAb可能受到医药条件，或治疗它们适合的病况的治疗长短的限制。第二，小鼠衍生的mAb的剂量水平可能需要较高，以补偿较低的亲和力或疗效(低亲和力或疗效与小鼠来源无关，然而人体内的半衰期可能有关，因为小鼠mAb可能更容易从血液中被快速清除，这可能还需要更高的剂量)，因此，使得剂量不仅更重，而且可能免疫原性更强，可能更危险。第三，合适的治疗方案和需要高产量的高剂量比中的限制可能更加显著增加了治疗成本，意味着这些小鼠衍生的mAb对于开发作为商品治疗剂是不经济的。最后，即使能鉴定出显示所需特异性或亲和性的小鼠mAb，通常这些理想特征在减少免疫原性的“人源化”或“嵌合”过程中受到有害影响(Slavin-Chiorini等，1997)。一旦小鼠衍生的mAb被人源化或嵌合化，就非常难于优化其特异性或亲和性。
许多年来，本领域一直在寻找具有适用于治疗人类的药物组合物的生物性质的人抗-MHC II型mAb复合物。该领域的工作人员已实践了步骤：首先鉴定一种小鼠衍生的mAb，然后在改善该用于人类病人的非人分子的免疫耐受的帮助下修饰该mAb的结构(对于进一步的细节，见Jones等，1986；Riechmann等，1988；Presta，1992)。通常用所谓的“人源化”过程或通过构建人-小鼠嵌合mAb实现该修饰。其它工作人员尝试了鉴定在人抗体多样性天然库中与人抗原结合的人抗体。例如，通过探索孕妇中的胎儿耐受机制(Bonegura等，1987)或通过筛选抗体天然多样性文库(Stausbl-Grn等，1996；Winter等，1994)。然而，迄今未描述过显示所需细胞毒性、特异性、低免疫原性和亲和性的生物性质的人复合物MHCII型mAb。
为了治疗目的，与许多或至少大部分人II型MHC分子的等位基因形式反应的多肽是理想的-例如能用于多样化的病人人群中。另外，候选多肽可以对各式各样的淋巴瘤是细胞毒性的，并且优选是通过对这些肿瘤细胞共有的机制起到细胞毒性作用。为了能用于许多可能的应用，所需的多肽应介导其细胞毒性作用，而不需要免疫系统的其它成分。为了治疗目的，许多病人接受例如癌症标准化疗或放疗的治疗。这些治疗大部分使得病人免疫妥协。任何依赖于完整免疫系统的其它的治疗因而会失败。患破坏免疫系统的疾病，例如HIV的人中进一步证实了存在的问题。机会性感染和恶性转化能逃脱免疫监视，导致进一步的综合征。
发明简述
本发明一方面提供了一种组合物，包括含有基于人组合物的至少一种抗体的抗原结合域的多肽，所述结合域具有对细胞表面表达的一种抗原的结合特异性，其中用具有两个或多个所述抗原结合域的多价多肽处理表达抗原的细胞导致或引起非细胞毒性机制或免疫学机制的细胞杀伤。在优选例中，抗原是MHC抗原，优选MHC II型抗原，例如DR/DP/DQ或DR。例如，在一些优选例中，主题组合物包括含有至少一个与人HLA DR以1μM、100nN或甚至1nM或以下的Kd结合的基于抗体的抗原结合域的多肽。
本发明的另一个方面提供了一种组合物，它含有多肽，该多肽含有多个人组合物的基于抗体的抗原结合域，与人HLA DR具有结合特异性。用多价多肽处理表达HLA DR的细胞导致或引起不需要细胞毒性或免疫学机制的细胞杀伤。在一些优选例中，主题组合物包括含有至少一个与人HLA DR以1μM、100nN或甚至1nM或以下的Kd结合的基于抗体的抗原结合域的多肽。在一些优选例中，多价多肽具有100nM、10nm或甚至1nM或以下的EC50，用于杀伤激活的淋巴细胞、转化的细胞和/或淋巴瘤细胞。
本发明的另一个方面提供了一种含有多肽的组合物，所述多肽含有至少一个基于抗体的抗原结合域，它与人HLA DR以1μM、100nM、10nM或甚至更小的Kd结合，可通过一种方法分离抗原结合域，该方法包括从重组抗体文库用与人HLA DR至少一个表位结合的能力分离人组合物的VL和VH结构域。用具有两个或多个抗原结合域的多价多肽处理表达HLA DR的细胞导致或引起以不需要细胞毒性或免疫学机制的方式杀伤细胞。在一些实施例中，分离抗原结合域的方法还包括下列步骤：
a.产生VL和VH结构域之一或两者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一个的变体文库，和
b.用与人MHC II型家族抗原以1μM或以下的Kd结合的能力从变体文库中分离出VL和VH结构域。
在一些优选例中，本发明的组合物可以确定特征为杀伤转化的细胞的EC50至少比杀伤正常的细胞的EC50低5倍，甚至比杀伤正常细胞低更优选10倍、100倍，甚至1000倍的多价多肽。
在一些优选例中，本发明的组合物可以确定特征为杀伤活化的细胞的EC50至少比杀伤正常的细胞的EC50低5倍，甚至比杀伤未活化的细胞低更优选10倍、100倍，甚至1000倍的多价多肽。
在一些优选例中，本发明的组合物可以确定特征为杀伤转化细胞的EC50为50nm或以下，甚至更优选是小于10nM、1nM和甚至0.1nM的EC50。在一些实施例中，主题多价多肽具有杀伤活化的淋巴细胞、转化的细胞和/或淋巴瘤细胞的100nM、10nM或甚至1nM或以下的EC50。
在一些实施例中，含有多价多肽的主题组合物选择性杀伤淋巴细胞。例如，可用组合物的一些多价形式杀伤活化的淋巴细胞，这些淋巴细胞是淋巴瘤细胞，代表选自B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多发性骨髓性白血病。可被杀伤的活化的淋巴瘤细胞的例子包括Priess、GRANTA-519、KARPAS-422、KARPAS-299、DOHH-2、SR-786、MHH-CALL-4、MN-60、BJAB、RAJI、L-428、HDLM-2、HD-MY-Z、KM-H2、L1236、BONNA-12、HC-1、NALM-1、L-363、EOL-1、LP-1、RPMI-8226和MHH-PREB-1细胞系。在一些优选例中，组合物具有100nm或以下，优选小于10nM或甚至1nM的杀伤选自KARPAS-422、DOHH-2、SR-7、MHH-CALL-4、MN-60、HD-MY-Z、NALM-1和LP-1的至少一种B细胞淋巴瘤细胞和T细胞淋巴瘤细胞的EC50。在一些情况下，为了有效杀伤细胞，靶细胞可能需要进一步活化或预先活化，例如通过与脂多糖(LPS，10微克/ml)、干扰素-γ(IFN-γ，Roche，40ng/ml)和/或植物凝血素(PHA，5微克/ml)等一起培养。
在一些实施例中，该组合物的多价形式可用于杀死表达MHC II型分子的非淋巴细胞。
在一些实施例中，该组合物的一个或多个抗原结合域与HLA-DR的β-链结合，例如抗原结合域与HLA-DRβ链的第一结构域结合。
在一些优选例中，该组合物的抗原结合域与一种或多种选自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型结合。在优选例中，本组合物的抗原结合域提供了广泛的DR反应性，即给定组合物的抗原结合域与至少5个不同的所述HLA-DR型上的表位结合。在一些实施例中，本组合物的多肽的抗原结合域与多个HLA-DR型结合，例如与至少人群60％，更优选75％，和甚至更优选85％人群的表达HLA DR的细胞结合。
在一些实施例中，本组合物的抗原结合域包括VH结构域与VL结构域的组合，其中所述组合在选自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中发现。
在一些实施例中，本组合物的抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3在MS-GPC-1、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中发现。
在另一个优选例中，与本发明的亲本抗原结合域相比，抗原结合域通过添加、缺失和/或取代氨基酸残基修饰，同时维持所述亲本抗原结合域的本发明的性质，或改进一种或多种所述性质。这可以包括但不限于修饰编码亲本抗原结合域的核酸序列用于克隆，修饰CDR区从而改进或改变抗原结合亲和力和/或特异性，包括用来自一种或多种不同抗原结合域的相应的CDR序列交换一种或多种亲本抗原结合域的CDR序列，添加肽序列以检测和/或纯化。鉴定给定的抗原结合域中的可能发生添加、缺失和/或取代的位置，以设计和追踪实现所述添加、缺失和/或取代的方法，并测试或分析是否修饰的抗原结合域维持了亲本抗原结合域的性质或显示一种或多种改进的性质，在本领域普通技术人员的能力范围内。另外，普通技术人员能设计方法，来设计、构建和筛选修饰的抗原结合域的集合或文库，来鉴定一种或多种修饰的抗原结合域，它维持亲本抗原结合域的性质或显示更改进的性质。在一个实施例中，本发明的任何抗原结合域中所含的HuCAL Vh结构域的第一个氨基酸残基(E或Q，视表达构建物而定)分别被Q或E替换。根据本发明，通过设计、构建和筛选修饰的抗原结合域的集合或文库的优选区域包括CDR区，最优选是Vh和VL的CDR3，VL的CDR1和VH结构域的CDR2。
在某些优选例中，抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VHCDR3序列取自共有CDR3序列
nnnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。优选VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在某些实施例中，本抗原结合域与包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1组合的抗体竞争抗原结合，其中VH CDR3序列取自共有CDR3序列
nnnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。例如VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在一些优选例中，抗原结合域包括用下列通式代表的VL CDR1序列：
SGSnnNIGnNYVn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。例如，CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
在优选例中，本组合物的多价形式的杀伤机制涉及杀伤细胞的天生预编程过程。例如杀伤优选是非凋亡性的。本组合物的杀伤不依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的作用，和/或被zVAD-fmk或zDEVD-fmk抑制的杀伤。
在某些优选例中，基于抗体的抗原结合域是多价多肽的一部分，含有至少一个F(ab′)2抗体片段或小抗体片段。
在某些优选例中，基于抗体的抗原结合域是多价多肽的一部分，含有至少两个选自Fv、scFv、dsFv和Fab片段的抗体片段，还含有一个或多个交联部分。
在一些优选例中，基于抗体的抗原结合域是多价多肽的一部分，它含有选自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM家族的至少一个完整抗体。
在一些优选例中，基于抗体的抗原结合域是在与所述细胞结合后形成的多价多肽的一部分。
在一些优选例中，抗原结合位点与聚合物交联。
本发明的另一个方面提供了一种含有抗原结合域，例如上述抗原结合域，或其多价多肽的核酸。例如在一些实施例中，核酸包括多肽的编码序列，含有人组合物的至少一种基于抗体的抗原结合域，其与人细胞表面表达的抗原具有结合特异性，其中用该多肽的多价形式处理表达抗原的细胞导致或引起所述细胞不需要细胞毒性或免疫学机制的杀伤。在一些实施例中，核酸含有多肽的编码序列，该多肽含有至少一个与人HLA DR的至少一个表位以1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd结合的基于抗体的抗原结合域。
在一些实施例中，核酸含有多肽的编码序列，该多肽含有多个人组合物的基于抗体的抗原结合域，与人HLA DR具有结合特异性，其中用该多肽的多价形式处理表达HLA DR的细胞导致或引起所述细胞不需要细胞毒性或免疫学机制的杀伤。在优选例中，抗原结合域单独与人HLA DR上的表位以1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd结合。
在一些实施例中，核酸含有多价多肽的编码序列，该多肽含有多种人组合物的基于抗体的抗原结合域，与人HLA DR具有结合特异性，其中用所述多价多肽处理表达HLA DR的细胞导致或引起所述细胞不需要细胞毒性或免疫学机制的杀伤。优选，多价多肽具有100nM、10nM或甚至1nM或以下的EC50，来杀伤活化的淋巴细胞、转化的细胞和/或活化的淋巴瘤细胞。
本发明的另一个方面提供了一种载体，它含有任何一种上述核酸的编码序列，和与其可操纵性连接的转录调控序列。
本发明的另一个方面提供了携带至少一种该核酸或该载体的宿主细胞。本发明的另一个方面提供了产生导致或引起细胞杀伤(不需要细胞毒性或免疫学机制来导致或引起所述杀伤)的多价组合物的方法，其条件是其中核酸表达成含有多个抗原结合域的多肽或含有至少一个充分处理形成多价组合物的抗原结合域的多肽。
本发明的另一个方面提供了配制在药物学上可接受的载体和/或稀释剂中的该多肽或核酸组合物的形式。本发明特别考虑使用这些组合物制备用于处理动物，尤其是人的药物制剂。
可用这些药物组合物治疗涉及不需要的细胞增殖，特别是治疗涉及表达MHCII型抗原的转化细胞。例如，制剂可用于治疗选自B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多发性骨髓性白血病的疾病。
可用这些药物制剂用于治疗不需要的免疫细胞活化的疾病，例如治疗选自类风湿性关节炎、幼年期关节炎、多发性硬化、Grave氏病、胰岛素依赖性糖尿病、发作性睡病、牛皮癣、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重症肌无力、慢性天疱疮、肾小球肾炎、甲状腺炎、胰腺炎、胰岛炎、原发性胆汁性肝硬化、刺激性肠病和Sjogren综合征的疾病。
本发明的另一个方面提供了一种含有本发明的多肽或核酸组合物的诊断组合物。在一些实施例中，该诊断组合物含有多肽组合物和一个或多个交联部分。
本发明的还有一个方面提供了一种杀伤在所述细胞表面表达抗原的细胞的方法，包括步骤：使细胞与本发明的多价多肽组合物接触。
本发明的另一个方面提供了一种鉴定能用配制在药物学上可接受的载体和/或稀释剂中的多价多肽的组合物治疗的病人的方法，包括步骤：
a.从病人分离细胞；
b.使所述细胞与组合物接触；和
c.测定所述细胞杀伤或免疫抑制的程度。
本发明还提供了一种试剂盒，用于鉴定能用配制在药物学上可接受的载体和/或稀释剂中的多价多肽的组合物治疗的病人，试剂盒含有：
a.多价多肽组合物；和
b.用于测定所述细胞杀伤或免疫抑制程度的工具。
在一些实施例中，该试剂盒包括多价多肽组合物和交联部分。在其它实施例中，该试剂盒含有：
a.多价多肽组合物，和
b.一个或多个可检测基团，和
c.影响和/或检测(i)与抗原结合的试剂和/或溶液。
本发明的另一个方面提供了一种含有与细胞毒性剂可操纵性连结的多价多肽组合物的细胞毒性组合物。
本发明的另一个方面提供了含有与免疫原性剂可操纵性连结的多价多肽组合物的免疫原性组合物。
本发明的另一个方面提供了一种杀伤细胞的方法，包括使细胞与可操纵性连接的细胞毒性或免疫原性剂的多价多肽组合物接触。
本发明的另一个方面提供了一种治疗人类以降低与表达人HLA DRβ链的细胞不良增殖/活化有关的疾病的严重程度的方法，包括对病人施用本发明的多价多肽。在一些实施例中，疾病涉及淋巴细胞的不良增殖/活化，例如选自B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、T细胞淋巴瘤、T-细胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多发性骨髓性白血病。
本发明的另一个方面提供了用与细胞毒性或免疫原性剂可操纵性连接的多价多肽组合物制备治疗动物的药物组合物。
根据优选例，多肽针对表达MHC II型分子的淋巴细胞或非淋巴细胞。后一种类型的细胞存在于例如炎症和/或自身免疫疾病的病理性位点，例如滑膜细胞、内皮细胞、甲状腺基质细胞和神经胶质细胞，或还可以含有能表达MHC II型分子的基因改变的细胞。
优选多肽针对淋巴瘤细胞。更优选是存在于选自B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、和B细胞前体白血病的疾病的淋巴瘤细胞。最优选是选自GRANTA-519、PRIESS、KARPAS-422、DOHH-2、MHH-CALL-4、MN-60、BJAB、L-428、BONNA-12、EOL-1、MHH-PREB-1和MHH-CALL-2细胞系的淋巴瘤细胞。
在一些实施例中，多肽与HLA-DR分子的α链中至少一个表位结合。在一些实施例中，多肽优选与HLA-DR的α-链的第一结构域的至少一个表位结合。第一结构域是链的N-末端结构域。例如，可选择多肽与HLA-DR的α链的Glu55-Tyr79的α螺旋内的至少一个表位结合。
在其它实施例中，多肽与HLA-DR分子的β链内的至少一个表位结合。优选的多肽与HLA-DR的β链的第一结构域的至少一个表位结合，第一结构域是链的N-末端结构域。
在一些实施例中，多肽诱导杀死靶细胞的基质涉及所述细胞的天然预编程的过程。优选多肽诱导不是凋亡细胞死亡过程的杀伤机制。
在一个优选例中，多肽诱导依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶以外的蛋白酶的作用的杀伤机制，例如不依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的杀伤机制。
在另一个实施例中，多价组合物含有至少一种选自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM类的完整抗体。
在另一个实施例中，多价组合物含有至少一种F(ab′)2抗体片段或小抗体片段。
在优选例中，多价组合物含有至少两种单价抗体片段，选自Fv、scFv、dsFv和Fab片段，还含有一种或多种交联部分。
本发明还提供了含有多肽的组合物，含有至少一种基于抗体的抗原结合域，其具有对人HLA DR的结合特异性，其中所述多肽与所述表位的结合导致或引起免疫应答抑制，其中所述抗原结合域诱导VH结构域和VL结构域的联合，其中所述联合在选自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中发现。
本发明的另一种免疫抑制组合物诱导含有至少一种基于抗体的抗原结合域的多肽，该多肽与与人MLC II型抗原具有1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd的结合特异性，其中用多肽处理表达MHC II型抗原的细胞导致或引起免疫应答抑制，例如优选1μM、100nM、10nM或甚至1nM或以下的IC50。
本发明的其它免疫抑制组合物含有多肽，该多肽含有与人MHC II型抗原具有1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd的结合特异性的人组合物的至少一种基于抗体的抗原结合域，抗原结合域通过一种方法分离，该方法包括从重组抗体显示文库中通过与人MHC II型抗原结合的能力分离出人VL和VH结构域，其中用所述多肽处理表达MHC II型抗原的细胞导致或引起免疫应答的抑制。
可用分离的抗原结合域用下列步骤产生本免疫抑制组合物：
a.产生VL和VH结构域的一种或两种至少一种CDR1、CDR2和CDR3结构域的突变文库，和
b.从变体文库中通过与人MHC II抗原以1μM或以下的Kd结合的能力分离VL和CH结构域。
在优选例中，免疫抑制组合物的抗原结合域与HLA-DR结合，优选与HLA-DR的β链结合，甚至更优选与HLA-DR的β链的第一结构域结合。
在一些优选例中，免疫抑制组合物具有1μM、100nM、10nM或甚至1nM或更小的抑制免疫应答的IC50。
在一些优选例中，免疫抑制组合物具有1μM、100nM、10nM或甚至1nM或更小的抑制IL-2分泌的IC50。
在一些优选例中，免疫抑制组合物具有1μM、100nM、10nM或甚至1nM或更小的抑制T细胞增殖的IC50。
在一些优选例中，免疫抑制组合物具有与一种或多种选自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型表位结合的抗原结合域，在优选例中，抗原结合域与至少5个不同的所述HLa-DR类型结合(例如是pan-DR)。
在某些实施例中，免疫抑制组合物具有包括VH结构域和VL结构域的组合的抗原结合域，其中在选自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中发现。
在一些实施例中，抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VHCDR3序列取自共有CDR3序列
nnnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。优选VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在某些实施例中，免疫抑制组合物具有抗原结合域，包括HuCAL VH2和HuCALVλ1的组合，其中VH CDR3序列取自共有CDR3序列
nnnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。
例如VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在一些实施例中，免疫抑制组合物的抗原结合域与具有下列通式代表的VHCDR3序列的抗体竞争抗原结合：
nnnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。
在一些实施例中，免疫抑制组合物的抗原结合域包括用下列通式代表的VLCDR1序列：
SGSnnNIGnNYVn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。例如，CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
在一些实施例中，该免疫抑制组合物通过一种或多种(a)下调与多肽结合的抗原的表达；或(b)抑制所述细胞和其它细胞之间的相互作用，其中所述相互作用应正常导致免疫应答，来抑制免疫应答。
本发明的另一个方面提供了含有本发明的免疫抑制多肽的编码序列的核酸。在一些实施例中，可提供作为载体的一部分的核酸，例如含有编码序列和与其可操纵性连接的转录调控序列。本发明的核酸和载体可作为宿主细胞提供，例如可用于产生免疫抑制组合物。
本发明的另一个方面提供了一种抑制淋巴细胞活化和/或增殖的方法，包括使细胞与本发明的免疫抑制多肽接触。
本发明还提供了药物制剂，它含有足量的与人MHC II型抗原具有1μM或以下的Kd的结合特异性的基于抗体的抗原结合域，以抑制动物中的免疫应答，动物中的IL-2分泌和/或抑制动物中的T细胞增殖。
本发明的另一个方面涉及用含有与人MHC II型抗原具有1μM或以下的Kd的结合特异性的基于抗体的抗原结合域的多肽制备治疗动物的药物组合物，其中所述动物是人。
本免疫抑制药物制剂可用于抑制免疫系统的细胞的IL-2分泌。例如，这些制剂可以足量施给病人，来减少病人中的免疫应答。
本发明的其它方面提供了一种方法，用于抑制淋巴细胞的IL-2分泌，包括使细胞与本发明的免疫抑制多肽接触。
本方法跨膜用于免疫抑制人类，例如通过施给病人足量的本发明的免疫抑制多肽，来减少免疫应答。
本发明还涉及含有至少一种本发明的多肽和/或核酸，可任选的其它试剂，例如缓冲剂的诊断组合物，来进行诊断。
在一个优选例中，诊断组合物含有与至少一个基团交联的本发明的多肽。这些基团可以是例如识别存在于多肽上的表位，例如FLAG表位(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)或与例如存在于半胱氨酸或赖氨酸(King等，1994)中的亲核核酸侧链的双功能化合物反应。交联的多肽的方法对于本领域普通技术人员是熟知的。
还考虑了含有至少一种核酸和/或其变体的诊断组合物。
另外，本发明涉及含有本发明的至少一种多肽和交联部分的试剂盒。
另外，本发明涉及一种试剂盒，含有(i)本发明的多肽，(ii)一个或多个可检测的基团，和(iii)影响和/或检测(i)与抗原的结合的试剂和/或溶液。
本发明还涉及多价组合物，含有至少一条多肽和含有至少两个抗原结合域。
本发明的另一个方面提供了一种进行一种进行药物商业活动的方法，包括：
(i)分离一种或多种与在人细胞表面表达的抗原结合的抗原结合域；
(ii)产生含有多个所述抗原结合域的多价组合物，该多价组合物以50nM或以下的EC50杀死转化或活化的细胞，其中不需要细胞毒性或免疫学机制来导致或引起所述杀伤；
(iii)进行多价组合物在动物中效力和毒性的治疗测量；
(iv)制备描述多价组合物治疗增殖疾病的包装插页；和
(v)出售所述组合物用于治疗增殖疾病。
本发明还提供了一种进行一种进行生命科学商业活动的方法，包括：
(i)分离一种或多种抗原结合域，这些抗原结合域与人细胞表面表达的抗原结合；
(ii)产生含有多种所述抗原结合域的多价组合物，该多价组合物以50nM或以下的EC50杀死转化或活化的细胞，其中不需要细胞毒性或免疫学机制来导致或引起所述杀伤；
(iii)对第三方授权，与第三方共同开发或出售给第三方出售所述多价组合物的权利。
在这些实施例中，可用一种方法分离抗原结合域，其包括：
a.从重组抗体显示文库中用与HLA DR表位结合的能力分离人组合物的VL和VH结构域，
b.产生VL和VH结构域之一或两者的CDR1、CDR2和CDR3序列至少一个的变体文库，和
c.从变体文库用与HLA DR表位以1μM或以下的Kd结合的能力分离VL和VH结构域。
本发明的另一种商业活动的方法，包括：
(i)分离一种或多种与在人细胞表面表达的MHC II型以1μM或以下的Kd结合的抗原结合域；
(ii)产生含有所述抗原结合域的组合物，该组合物以1000nM或以下的IC50免疫抑制；
(iii)进行多价组合物在动物中效力和毒性的治疗测量；
(iv)制备描述多价组合物用于免疫抑制治疗的包装插页；和
(v)出售所述组合物用作免疫抑制剂。
本发明还提供了一种进行一种进行生命科学商业活动的方法，包括：
(i)分离一种或多种抗原结合域，这些抗原结合域与人细胞表面表达的MHC II型以1μM或以下的Kd结合；
(ii)产生含有所述抗原结合域的组合物，该组合物以100nM或以下的IC50免疫抑制；
(iii)对第三方授权，与第三方共同开发或出售给第三方出售所述多价组合物的权利。
本文所用的术语“肽”涉及含有多个，即两个或多个通过肽键连结的氨基酸的一条或多条链。
术语“蛋白质”指肽，其中至少一部分肽具有或能够通过在肽链内和/或在肽链之间形成二级、三级或四级结构，获得确定的立体排列。该定义包括天然存在或至少部分人工的蛋白质，以及全蛋白的片段或结构域，只要这些片段或结构域能获得如上所述的确定立体排列。
术语“多肽”互换的指肽和/或蛋白质。另外，术语“多肽”和“蛋白质”只要上下文允许，包括多链蛋白质复合物，例如具有重链和轻链的免疫球蛋白多肽。
在此，“含有至少一个基于抗体的抗原结合域的多肽”指免疫球蛋白(或抗体)或其功能性片段。关于抗体结构域等的术语“片段”指免疫球蛋白的片段，其维持免疫球蛋白的抗原结合部分。本发明的功能性免疫球蛋白片段可以是Fv(Skerra和Plückthun，1988)、scFv(Bird等，1988；Huston等，1988)、二硫键连结的Fv(Glockshuber等，1992；Blinkmann等，1993)、Fab、F(ab′)2片段或其它本领域实践者熟知的片段，其包含免疫球蛋白的可变结构域或功能性免疫球蛋白片段。
含有一条链的多肽的例子是单链Fv抗体片段，含有多条链的多肽的例子是Fab抗体片段。
本文所用的术语“抗体”，除非另外说明，广泛用于同时指抗体分子和各种抗体衍生分子。该抗体衍生分子含有至少一个可变区(重链或轻链可变区)并含有上述片段，以及独立的抗体轻链、独立的抗体重链、抗体链和其它分子之间的嵌合融合蛋白等。
免疫球蛋白分子的“抗原结合位点”指与抗原特异性结合必需的分子部分。抗原结合位点优选以1μM或以下，优选小于100nM、10nM或甚至在某些情况下1nM的Kd与抗原结合。与抗原特异性结合应包括与抗原的结合比与任何其它抗原的结合具有显著高的亲和力。
重(“H”)和轻(“L”)链N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成抗原结合位点。在重链和轻链的V区内的高度多样的三段称为“超变区”，位于更保守的称作“框架区”或“FR”的旁侧区之间。因此术语“FR”指天然存在于免疫球蛋白的超变区之间和附近的氨基酸序列。在一个抗体分子中，轻链的三个超变区和重链的三个超变区在立体空间相对排列，形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的立体表面互补，各重链和轻链的三个超变区称为“互补决定区”或“CDR”。
为了本申请的目的，“价”指本多肽拥有的抗原结合位点数。因此，二价多肽指具有两个结合位点的多肽。术语“多价多肽”包含多肽的二价、三价、四价等形式。
本文所用的“多价组合物”意味着一种组合物，其含有具有至少两个所述抗原结合域的多肽，例如多价多肽。优选所述至少两个抗原结合域紧密相邻，构成完整的免疫球蛋白分子。多价组合物的例子是完整的免疫球蛋白分子(例如IgG、IgA或IgM分子)或其多价片段(例如F(ab′)2)。另外可从两种或多种多价组合物(例如两种或多种完整的免疫球蛋白分子)通过例如交联形成更高价的多价组合物。然而多价组合物可以从两种或多种单价免疫球蛋白片段通过作为小抗体自连接，或通过交联形成。
因此，“基于抗体的抗原结合域”指一种或多种多肽，其形成保留抗体的至少一些结构特征，例如至少一个CDR序列的抗原结合位点。在某些优选例中，基于抗体的抗原结合域包括足够视为可变区的结构，例如三个CDR区和间隔的框架区。基于抗体的抗原结合域可由一条对应于VH或VL序列的多肽链，或由VH和VL序列的分子间或分子间联系形成。
术语“重组抗体文库”描述了抗原结合域的混合文库。例如术语包括展示包装，如生物学颗粒的集合，它们各具有(a)在颗粒表面上的至少一个抗原结合域表达的遗传信息，和(b)提供使颗粒能复制的遗传信息。例如，包装能显示含有抗原结合域的融合蛋白。融合蛋白的抗原结合域由显示包装代表，条件是允许抗原结合域与显示包装接触的靶表位结合。显示包装通常衍生自能够采集非常多样的抗体文库的系统。显示包装可以衍生自例如植物细菌细胞、细菌孢子和细菌病毒。
在本发明的一个示范性实施例中，显示包装是噬菌体颗粒，其含有含测试抗原结合域的氨基酸序列的肽融合包裹蛋白。因此，产生了编码肽融合包裹蛋白文库的可复制噬菌体载体，尤其是噬菌粒(如本文定义)的文库，用于转化合适的宿主细胞。根据与特定噬菌体颗粒结合的抗原结合位点特异性结合靶表位的能力，通过亲和筛选分离嵌合蛋白形成的噬菌体颗粒。在一个优选例中，文库的各独立噬菌体颗粒包括显示在包装表面的编码肽融合包裹蛋白的拷贝。产生本多样化肽文库的示范性噬菌体包括M13、f1、fd、lf1、lke、Xf、Pf1、Pf3、λ、T4、P2、P4、φX-174、MS2和f2。
术语“产生CDR1、CDR2和CDR3至少一种的变体文库”指产生变体抗原结合位点文库的方法，其中文库成员的差异是CDR序列，例如非FR序列中的一个或多个改变。这些文库可通过从所选的抗原结合位点的一个或多个CDR序列随机或半随机诱变产生。
本文所用的“人组合物的基于抗体的抗原结合域”优选意味着含有至少一个抗体VH结构域和抗体VL结构域的肽，其中在含有免疫球蛋白序列的蛋白质序列数据库中的同源性检索得到人起源的免疫球蛋白结构域中VH和VL结构域都以最高的序列相同性程度命中。这样的同源性检索可以是BLAST检索，例如通过登录国家生物信息中心的序列数据库，用“blastp”例行程序进行“BasicBLAST”检索。另见Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-410。优选当施给人受体时，这样的组合物不导致对其的不良免疫应答。在某些优选例中，本人组合物的抗原结合域包括天然人免疫球蛋白的框架区，并可从激活的人B细胞克隆，虽然不需要天然人抗体的所有CDR。
本文所用的术语“小抗体片段”指含有至少两个通过与所述结构域分别自我结合的抗原结合域的多价抗体(Pack等，1994)，例如，含有两条scFv片段的二聚体，分别与自我结合的二聚结构域融合。特别优选的二聚结构域包括衍生自亮氨酸拉链(Pack和Plückthun，1992)或螺旋-转弯-螺旋基序(Pack等，1993)。
本文所用的“活化的细胞”指一群感兴趣的细胞，它们不在休眠。活化可以由抗原、有丝分裂原(例如脂多糖、植物血凝素)或细胞因子(如干扰素γ)引起。优选所述活化在肿瘤转化(例如通过EB病毒或“自发”)中发生。优选活化的细胞的特征是在细胞表面表达MHC II型分子和一种或多种其它特征，包括细胞尺寸变大，细胞分化，DNA复制，CD45或CD11表达和产生/分泌免疫球蛋白。
本文所用的“非活化细胞”意味着一群感兴趣的细胞，处于休眠和不分化状态。所述非活化的细胞可包括从健康人血液纯化的休眠B细胞。这些细胞优选的特征是在细胞表面表达的MHC II型分子缺乏或水平低，和一种或多种其它特征，包括细胞尺寸变大，细胞分化，DNA复制，CD45或CD11表达和产生/分泌免疫球蛋白的缺乏或水平减弱。
本文所用的术语“EC50”意味着产生其最大应答或效果，例如细胞杀伤的50％的本组合物的多价形式浓度。
“至少低5倍的EC50”意味着杀死50％的活化细胞所需的由本发明的至少一种多肽组成的多价组合物的浓度比杀死未活化细胞所需的多价组合物的浓度低5倍。优选杀死50％未活化细胞的浓度不能用多价组合物的治疗合适的浓度实现。最优选EC50指是在下面补充实施例中所述的试验中确定的。
术语“免疫抑制”指通过干扰或施用抗代谢药物、抗淋巴细胞血清或特异性抗体防止或减弱免疫应答。
术语“免疫应答”指任何免疫系统或形成免疫系统部分的细胞(淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞等)对抗原性刺激的反应，包括但不限于抗体产生，细胞介导的免疫力和免疫耐受。
本文所用的关于免疫抑制的术语“IC50”指产生50％最大应答或效果，例如抑制免疫应答，如可由T细胞活化(细胞应答)或B-细胞活化(体液应答)体现的该组合物的浓度。
词组“细胞毒性机制”指一种细胞杀伤方式，指补体依赖性机制。类似的词组“免疫学机制”指细胞杀伤方式，指巨噬细胞依赖性和/或嗜中性粒细胞依赖性的细胞杀伤。
当用于细胞系或细胞时，“淋巴细胞”意味着该细胞系或细胞衍生自淋巴品系。“淋巴细胞”包括B和T淋巴细胞品系和巨噬细胞品系。
“非淋巴细胞和表达MHC II型”细胞意味着除了淋巴细胞以外的例如在病理性炎症反应中表达MHC II型分子的细胞。例如所述细胞包括滑膜细胞、内皮细胞、甲状腺细胞和神经胶质细胞，还可以含有基因改变的能表达MHC II型分子的细胞。
术语“凋亡”和“凋亡活性”指哺乳动物中的细胞死亡形式，其特征是伴有一种或多种形态和生物化学特征，包括核与胞质缩合，染色质聚集，细胞膜微绒毛丧失，胞质和核分解到含有核糖体、形态完整的线粒体和核物质的膜结合小泡(凋亡体)中，染色体DNA的降解或丧失线粒体功能。凋亡遵循非常严格的时间过程，并由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶执行，它是非常专一的一组蛋白酶。可通过细胞存活率试验，膜联蛋白V染色或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制试验确定或测定凋亡活性。可用交联抗体，例如抗CD95如实施例H中所述诱导凋亡。
本文所用的术语“HLA-DRα链的第一结构域”意味着α-链的N-末端结构域。
本文所用的术语“HLA-DRβ链的第一结构域”意味着β-链的N-末端结构域。
术语“天然预编程过程”指一个一旦开始就沿自动的级联机制在细胞内进行的过程，它不需要从所述细胞的环境中获得任何其它辅助支持来完成该过程。
本文所用的术语“HuCAL”指Knappik等(2000)所述的完全合成的人组合抗体文库。
本文所用的关于免疫球蛋白分子的术语“可变区”具有本来由免疫学领域的普通技术人员对术语确定的普通意义。抗体的重链和抗体轻链都分成“可变区”和“恒定区”。可变区和重链区之间的分界点可轻易的由本领域普通技术人员根据描述抗体结构的标准文献确定，例如Kabat等“免疫学感兴趣的蛋白质序列：第五版”，美国健康和人类服务部，美国政府出版署(1991)。
本文所用的术语“CDR3”指抗体的VH和VL结构域的第三互补决定区或其片段，其中VH CDR3覆盖位置95-102(可能在位置100后的插入列为100a-100z)，VLCDR3位置89-96(可能在Vλ中95位后的插入列为95a-95c)(见Knappik等，2000)。
本文所用的术语“在严格条件下杂交”要描述杂交和洗涤条件，在该条件下至少60％彼此同源的核苷酸通常维持彼此杂交。优选条件是至少65％，更优选至少70％，甚至更优选75％彼此同源的序列维持彼此杂交。这种严格条件是本领域技术人员已知的，可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1999)，6.3.1-6.3.6中发现。优选的严格杂交条件的非限制性例子是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后用0.2x SSC、0.1％SDS在50-65℃洗涤一次或多次。
“蛋白质编码序列”或“编码”特定多肽或肽的序列是一种在体外或体内当置于合适调控序列控制下时转录(就DNA而言)并翻译(就mRNA而言)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA，来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3’。
类似的，不论从其上下文是否明显，“编码”将意味着包括编码多肽的DNA序列，如该术语通常使用的，也包括转录成抑制性反义分子的DNA序列。
本文所用的术语“转染”意味着在受体细胞中通过核酸介导的基因转移引入异源核酸，例如表达载体。“瞬时转染”指外源DNA不整合入转染细胞的基因组的情况，例如附加体DNA转录成mRNA，翻译成蛋白质。当核酸构建体能由子代细胞继承时，细胞被核酸构建物“稳定转染”。
“表达载体”指用于表达DNA的可复制DNA构建物，该DNA表达所需蛋白质并含有转录单元，该单元含有集合，包括(1)具有基因表达调控作用的因子，例如启动子、操纵子或增强子，可操纵性连结到(2)编码所需蛋白质(例如本发明的多肽)的DNA序列，其转录成mRNA并翻译成蛋白质，和(3)合适的转录和翻译元件起始和终止序列。启动子和其它调控元件的选择通常根据所需的宿主细胞变化。一般在重组DNA技术中所用的表达载体常常是“质粒”形式，指环状双链DNA环，它们在载体形式下不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明应包括其它起到相等功能，并在下文中提到的本领域已知的表达载体形式。
在表达载体中，控制转录或翻译的调控元件通常可衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。可另外掺入在宿主中复制的能力，例如由复制起始点赋予的，和促使转化子识别的选择基因。可以使用衍生自病毒，例如反转录病毒、腺病毒等的载体。
“转录调控序列”是整篇文献中使用的术语，指DNA序列，例如起始信号、增强子和启动子等，其诱导或控制与其可操纵连结的蛋白质编码序列的转录。应理解重组基因可以在转录调控元件的控制下，该元件可以与与控制基因天然存在形式的转录的序列(如存在)相同或不同。
当描述两个DNA区域之间的关系时，“可操纵性连接”简单意味着它们在功能上彼此相关。例如，如果启动子或其它转录调控序列控制编码序列的转录，它与编码序列可操纵性连接。
本文所用的术语“融合蛋白”是领域内已知的，指一种嵌合蛋白，其至少最初表达成含有衍生自两种或多种不同蛋白质的氨基酸序列，例如融合蛋白是融合基因的基因产物。
本文所用的“增殖”指经历有丝分裂的细胞。
细胞的“生长速率”指细胞增殖的速率和细胞分化的状态。
术语“细胞增殖性疾病”是指恶性和非恶性的转化的细胞群，其中形态通常与周围组织不同。
术语“转化的细胞”指自发转化成不受限制的生长的细胞，即它们获得了能在培养物中通过无限数量的分裂生长的能力。转化的细胞的特征可以是术语肿瘤的、退化发育的和/或增生的，以及丧失生长控制。
本文所用的术语“不死化的细胞”指通过化学和/或重组方法改变的细胞，从而该细胞具有在培养物中通过无限次数的分裂生长的能力。
本文所用的术语“动物”指哺乳动物，优选人等哺乳动物。类似的，要用本发明的方法治疗的“病人”或“个体”可以意味着人或非人动物。
根据本发明的方法，可以药物学可接受的组合物施用肽。一般单克隆抗体、抗体片段和肽的药物学可接受的载体是本领域一般技术人员熟知的。本文所用的术语“药物学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、糖衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。在优选例中，施用不影响活性成分的生物活性作用和在给药浓度下对宿主没有过度毒性的载体介质。给药可以用任何合适技术进行，包括皮下和胃肠外给药，优选胃肠外。胃肠外包括静脉内、动脉内、肌肉内和腹膜内，其中静脉内是优选的。
适合注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂和用于当场制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。就所有情况而言，形式必须是无菌的，而且必须是达到能够方便用镇痛注射的液体。它必须在制造和储藏条件下稳定，必须保护免受微生物，例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、聚醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物和植物油。可通过使用糖衣，例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需粒径并使用表面活性剂来维持合适的流动性。可用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在许多情况下，优选含有等渗剂，例如糖或氯化钠。延长注射组合物的吸收可通过混合吸收剂组合物，例如一硬脂酸铝和明胶实现。
通过在合适溶剂中掺入所需量的活性化合物，例如主题多肽以及各种其它如需要的上述成分过滤消毒制备无菌注射溶液。一般通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体，其含有基础分散介质和所需的其它上述成分，制备分散剂。就制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备的优选方法是真空干燥和冻干技术，得到活性成分加上任何其它所需的来自先前无菌过滤的溶液的成分的粉末。
为了口腔给药，本发明的多肽可与赋形剂一起掺入，并以非吞服的漱口液和牙粉形式使用。漱口液可以通过将活性成分以所需量掺入合适的溶剂，如硼酸钠溶液(Dobell溶液)制备。活性成分还可以分散在牙粉中，包括：凝胶、软膏、粉末和浆液。活性成分可以以治疗有效量加到膏状牙粉中，它可以含有水、粘合剂、摩擦剂、调味剂、发泡剂和湿润剂。
本发明的组合物可以配制成中性或盐形式。药物学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)和无机酸，例如盐酸或磷酸形成的，或有机酸，例如乙酸、草酸形成的，从无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁衍生的，和有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等衍生的。
对于在水溶液中胃肠外给药，例如该溶液如需要必须是合适缓冲的，而液态稀释剂首先用足量盐水或葡萄糖变成等渗。这些特定水溶液尤其适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。因此，可以使用的无菌水相介质是本领域技术人员根据本公开已知的。例如，一剂量能够溶于1毫升等渗NaCl溶液，并加到1000ml皮下灌注液中或注射到指定的输液位点(见例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”15版，1035-1038页和1570-1580)。剂量中的一些变化必须根据要治疗的个体的病况而定。负责给药的人将在任何事件中确定对于各病人的合适剂量。另外，对于人类给药，制备必须符合无菌、致热性、FDA局生物学标准的一般安全和纯度标准。
配制后，溶液可以用与制剂相容的方式施用，其量是治疗有效的。制剂可轻易的以各种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。
本文所用的术语“预防性或治疗性”处理指施给医学情况的宿主。如果在接触该条件前施用，处理是预防性的(即它保护宿主抵抗肿瘤形成)，而如果在感染或疾病开始后给药，处理是治疗性的(即它与存在的肿瘤战斗)。
本发明的至少一种多肽的多价组合物能导致活化的细胞，优选淋巴瘤细胞死亡，而不需要任何其它手段，例如化疗，并对治疗的病人具有有限的免疫学副作用。另外，含有本发明的多肽的多价组合物具有与靶抗原上的至少一种表位结合的能力，然而几种表位结合位点可以合并在一个分子中。优选含有本发明的多肽的多价组合物显示与非活化细胞相比，针对活化细胞高至少5倍，或更优选10倍的杀伤作用。活化的细胞上该更高的活性可表示成对活化的细胞相对与非活化细胞至少低5倍的EC50值，或表示成当用相同浓度的蛋白质时，活化的细胞对未活化的细胞杀伤百分数更高。在后一种情况下，含有本发明的多肽的多价组合物在给定的多肽浓度下杀死至少50％，优选至少80％活化的细胞，而相同浓度的含本发明多肽的多价组合物在同样的孵育条件下杀死15％以下，优选10％以下的非活化细胞。该确定EC50和杀伤活性百分数的试验条件如下所述。
附图简述
图1
a.抗-HLA-DR抗体片段的特异性：MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6与HLA-DR蛋白、阴性对照蛋白(BSA、睾丸酮-BSA、溶菌酶和人脱辅转铁蛋白)，和空微量滴定板孔(塑料)的结合。用标准ELISA法评估特异性。
b.抗-HLA-DR抗体片段的特异性：从HuCAL文库分离到的MS-GPC-1、6、8和10与HLA-DR蛋白、小鼠-人嵌合HLA蛋白和阴性对照蛋白(溶菌酶、转铁蛋白、BSA和人β-珠蛋白)的结合。用标准ELISA法评估特异性。用非相关抗体片段(irr.scFv)作为对照。
图2
抗-HLA-DR抗体片段(MS-GPC-1、6、8和10)，以及MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-6-17的IgG形式与各种表达MHC II型分子的细胞系的反应性。“+”代表用标准免疫荧光法检测的强反应性。“+/-”代表弱反应性，“-”代表抗-HLA-DR抗体片段或IgG与特定细胞系无检测到的反应性。
图3
肿瘤细胞在单价和交联抗-HLA-DR抗体片段存在下用台盼蓝染色评估的存活率。在与抗-HLA-DR抗体片段(MS-GPC-1、6、8和10)与和不与抗-FLAG M2 mAb作为交联剂培养4小时后评估的GRANTA-519细胞是存活率。
图4
表5数据的分散绘图和拟合对数曲线，显示本发明人抗体片段的IgG形式的50nM溶液与200nM小鼠抗体溶液治疗相比，杀伤效力提高。空心圆代表用小鼠抗体L243和8D1治疗的细胞系，实心圆代表人抗体MS-GPC-8、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-6-13。人(实线)和小鼠(虚线)mAb杀伤数据的拟合对数曲线显示用50nM人mAb治疗比小鼠mAb总体上要好，尽管后者最终治疗浓度是200nM。
图5
活化对非活化细胞的杀伤。用脂多糖。干扰素-γ和植物血凝素活化MHH-PREB-1细胞，然后与0.07-3300nM抗HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式一起保温。在对照的非活化MHH-PREB-1细胞中未见存活率下降。
图6
对照(无抗体、非反应性小鼠IgG；淡灰色)和抗-HLA-DR抗体片段的人(MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41；暗灰色)IgG形式针对从病人分离出的CLL细胞的杀伤效力。左侧，培养4小时(h4)和24小时(h24)后10个病人的休眠细胞培养物针对抗体的存活率数据的条状图表示。右侧，培养4小时(h4)和24小时(h24)后6个病人的活化细胞培养物针对抗体的存活率数据的条状图表示。
图7
本发明某些抗-HLA-DR抗体的浓度依赖性细胞存活率。竖线表示对各抗体片段获得的重复数据对数非线性回归估计的EC50值。a)交联二价抗-HLA-DR抗体F(ab)片段二聚物MS-GPC-10(圆圈和实线)、MS-GPC-8(三角和虚线)和MS-GPC-1(十字和点划线)的杀伤曲线。b)交联二价抗-HLA-DR抗体(Fab)片段二聚物MS-GPC-8-17(圆圈和实线)、小鼠IgGs 8D1(三角和虚线)和L243(十字和点划线)的杀伤曲线。c)交联二价抗-HLA-DR抗体(Fab)片段二聚物GPC-8-6-2(三角和划线)、小鼠IgGs8D1(圆圈和实线)和L243(十字和虚线)的杀伤曲线。d)人抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-10-57(十字和虚线)、MS-GPC-8-27-41(大叉和点划线)、小鼠IgGs 8D1(圆圈和实线)和L243(三角和划线)的杀伤曲线。所有浓度以二价制剂(IgG或交联(Fab)二聚物)的nM给出。
图8
a.Priess细胞与抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8(用抗-FLAG M2 mAb交联)一起培养，显示比用抗-CD95 mAb诱导的Priess细胞凋亡培养物更迅速的杀伤。Annexin V/PI染色技术用Annexin V阳性和PI阳性染色鉴定出坏死细胞。
b.Priess细胞与抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8(用抗-FLAG M2 mAb交联)一起培养，与用抗-CD95 mAb诱导的Priess细胞凋亡培养物相比显示几乎没有凋亡机制的证据。Annexin V/PI染色技术用Annexin V阳性和PI阴性染色鉴定出凋亡细胞。
图9
a.用实验确定抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-6-13的IgG形式抑制T-杂交瘤细胞的IL-2分泌的免疫抑制性质。
b.用实验确定抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-27-41、MS-和MS-GPC-8-6-19的单价Fab形式抑制T-杂交瘤细胞的IL-2分泌的免疫抑制性质。
图10
在确定T细胞增殖抑制的实验中抗HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式的免疫抑制性质。
图11
scFv的载体作图和序列显示载体pMORPH13 scFv
载体pMORPH13_scFv是噬菌粒载体，含有编码丝状噬菌体的基因III蛋白C-末端结构域和HuCAL scFV的融合蛋白的基因。在图11中，显示了含有模式scFv基因(VH1A和Vλ3(Knappik等，2000))的载体。
原始HuCAL主宰基因(Knappik等(2000)：见其中的图3)是用其真实N-末端：VH1A、VH1B、VH2、VH4和VH6构建的，其中Q(＝CAG)是第一个氨基酸。VH3和VH5，其中E(＝GAA)是第一个氨基酸。载体pMORPH13-scFv含有与VH链融合的短FLAG肽序列(DYKD)，因此该载体中的，和所有衍生自该载体的HuCAL VH链在第一个位置具有E(＝GAA)(例如在pMx7_FS载体中，见图12)。
图12
scFv表达载体pMx7_FS_5D2的载体图和序列
当VH-CH1与FLAG标记(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)和STREP标记II(WSHPQFEK)(IBA GmbH，Gttingen，Germany；见：Schmidt和Skerra，1993；Schmidt和Skerra，1994；Schmidt等，1996；Voss和Skerra，1997)融合时，表达载体pMx7_FS_5D2导致HuCAL scFv片段的表达(在图12中，载体含有称为“5D2”的编码“哑”抗体片段的基因)。
图13
Fab表达载体pMx9_Fab_GPC8
当VH-CH1与FLAG标记(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)和STREP标记II(WSHPQFEK)(IBA GmbH，Gttingen，Germany；见：Schmidt和Skerra，1993；Schmidt和Skerra，1994；Schmidt等，1996；Voss和Skerra，1997)的组合融合时，表达载体pMx9_FS_GPC8导致HuCAL Fab片段的表达(在图13中，载体含有Fab片段MS-FPC8)。
在pMx9_Fab载体中，克隆自scFv片段的HuCAL Fab片段(见图11的图片捕获)不具有与VH链融合的短FLAG肽序列，该载体中的和直接衍生自该载体的HuCALVH链在第一个位置具有Q(＝CAG)。
图14
Fab噬菌体的载体图和序列显示载体pMORPH18_Fab_GPC8
载体pMORPH18的衍生物是噬菌粒载体，含有编码丝状噬菌体的基因III蛋白C-末端结构域和HuCAL VH-CH1链之间的融合蛋白的基因。另外，载体含有单独编码的VL-CL链。在图14中，显示了含有Fab片段MS-GPC-8的载体。
在pMORPH18载体中，克隆自scFv片段的HuCAL Fab片段(见图11的图片捕获)不具有与VH链融合的短FLAG肽序列(DYKD)，该载体中的和直接衍生自该载体的HuCAL VH链在第一个位置具有Q(＝CAG)。
图15
MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的VH和VL结构域的氨基酸序列。
图15中的序列显示原始HuCAL主宰基因中的VH的氨基酸1(Knappik等(2000)；见其中的图3)。在scFv构建物中，如该申请中所述，VH的氨基酸1总是E(见图11的图像捕获)，在本申请的Fab构建物中，VH的氨基酸1总是Q(见图13的图像捕获)。
发明详述
下列实施例说明了本发明。
实施例
所有不另外指出的缓冲液、溶液或方法可以在标准教科书，例如CurrentProtocols of Immunology(1997和1999)或Sambrook等，1989。除非另外说明，所有材料购自sigma，Deisenhofen，DE或Merck，Darmstadt，DE或引用的文献中给出了来源。从LGC参考材料，Middlesex，UK中获得杂交瘤细胞系LB3.1和L243；抗体8D1的数据由Dr.Matyas Sandor，University of Michigan，Madison，WI，USA慷慨提供。
1.人抗原的制备
为了证明我们能鉴定人组合物的细胞毒性抗原结合域，我们首先如下制备了人抗原的纯化形式，来自PRIESS细胞(Gorga等，1984；Gorga等，1986；Gorga等，1987；Stern等，1992)的人MHC II型DR蛋白(DRA*0101/DRB*0401)。
首先，在RPMI和10％胎牛血清(FCS)中用标准条件培养PRIESS细胞(ECACC，Salisbury UK)，在含有1％ NP-40(BDH，Poole，UK)、25mM碘代乙酰胺、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和10mg/l的各种蛋白质抑制剂胰凝乳蛋白酶抑制剂、antipain、胃蛋白酶抑制剂A、大豆胰蛋白酶抑制剂和亮抑肽酶的200毫升磷酸缓冲盐(PBS)(pH7.5)中裂解1010细胞。10.000g(30分钟，4℃)离心裂解物10分钟，在得到的上清液中补充含有5％脱氧胆酸钠、5mM碘代乙酰胺和10mg/l的各种蛋白质抑制剂胰凝乳蛋白酶抑制剂的40毫升水溶液，100,000g离心2小时(4℃)。为了除去非特异性结合和内源的抗体，用PMSF将上清液稀释成0.2mM，并过夜(4℃)通过家兔血清affigel-10柱(5毫升；为了制备，家兔血清(Charles River，Wilmington，MA，USA)与Affigel 10(BioRad，Munich，DE)以3∶1的体积比培养，根据厂商指示洗涤)，然后用0.2ml/min的流速通过Protein G Sepharose Fast Flow柱(2毫升；Pharmacia)。
第二，用温和混合，将预处理的裂解液与5毫升Protein G Sepharose FastFlow珠一起4℃保温过夜，该珠与小鼠抗-HLA-DR抗体LB3.1(Protein G-Sepharose FF(Pharmacia)亲核层析杂交瘤细胞系LB3.1的上清液)偶联，然后转移到小柱中，再用三种溶液充分洗涤：(1)100毫升溶液，含有50mMTris/HCl(pH8.0)，150mM NaCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，10％甘油和0.03％叠氮化钠，流速为0.6ml/min。(2)25毫升溶液，含有50mM Tris/HCl(pH9.0)、0.5MNaCl、0.5％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、10％甘油和0.03％叠氮化钠，流速为0.9ml/min；(3)25毫升溶液，含有2mM Tris/HCl(pH8.0)、1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷、10％甘油和0.03％叠氮化钠，流速为0.9ml/min。
第三，用15毫升含有50mM二乙胺/HCl(pH11.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷(Alexis Corp.，Lausen，CH)、10％甘油、10mM碘代乙酰胺和0.03％叠氮化钠的溶液洗脱MHC II型DR蛋白(DRA*0101/DRB*0401)，流速为0.4ml/min。立即用100微升Tris/HCl(pH6.8)、150mMNaCl和1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷中和800微升组分。重复孵育裂解液和LB3.1Protein G Sepharose Fast Flow珠，直到裂解液中没有MHC蛋白。合并MHCII型DR蛋白的纯化洗脱组分(如SDS-PAGE分析)，用Vivaspin浓缩机浓缩到1.0-1.3g/l(Greiner，Solingen，DE)和30kDa分子量截留。用相同的Vivaspin浓缩机含有1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷的PBS重新缓冲约1毫克MHC II型DR制剂，使得蛋白质与BIAcore CM5芯片直接偶联。
2.HuCAL的筛选
2.1.介绍
我们鉴定了某些来自基于最新产生的概念(Knappik等，2000)的人抗体文库中针对人抗原(DRA*0101/DRB1*0401)的人组合物(MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、和MS-GPC-10)的抗原结合性抗体片段。在此得到总共49个不同框架的共有共有框架代表用于人免疫应答的VH-和VL-亚类。设计这些主宰基因考虑并估计促使蛋白质聚集的不良残基和建立导致基因分子逐乘的独特限制性位点。在HuCAL-scFv中，随机排列编码49个主宰基因区域的VH-和CL-CDR3。
2.2.噬菌粒拯救，噬菌体扩增和纯化
大肠杆菌TG-1中克隆入基于噬菌粒噬菌体显示载体pMORPH13_scFv的HuCAL-scFv(Knappik等，2000)在含有34微克/毫升氯霉素和1％葡萄糖的2x TY培养基(2xTV-CG)中扩增。在约0.5 OD60037℃辅助噬菌体感染(VCSM13)，离心并重悬浮在2x TY/34微克/毫升氯霉素/50微克/毫升卡那霉素/0.1mM IPTG中后，细胞在30℃生长过夜。从上清液中PEG-沉淀噬菌体(Ausubel等，1998)，重新悬浮在PBS/20％甘油中，储藏在-80℃。两次淘洗循环之间的噬菌体扩增如下进行：用洗脱噬菌体感染对数期中期的噬菌体TG1-细胞，接种到补充了1％葡萄糖和34微克/毫升的氯霉素的LB-琼脂糖中。30℃过夜培养后，刮下菌落，调节到0.5的OD600，如上加入噬菌体辅助噬菌体。
2.3.手工固相淘洗
用溶于PBS的MHC II型DRA*0101/DRB1*0401(如上制备)包裹MaxiSorpTM微量滴定板(Nunc，Roskikde，DK)的孔(2微克/孔)。用5％脱脂干燥牛奶在PBS中封闭后，在1小时内，20℃下加入1-5×1012如上纯化的HuCAL-scFv噬菌体。几次洗涤步骤后，用100mM三乙胺pH-洗脱结合的噬菌体，随后用1M TRIS-Cl，pH7.0中和。如上所述在各轮之间通过噬菌体扩增进行三轮淘洗。
2.4.混合的固相/全细胞淘洗
如2.3和2.2中所述进行三轮淘洗和噬菌体扩增，除了在第二轮，10毫升Falcon管中使用1毫升PBS/10％FCS的1×107到5×107pRIESS细胞，以进行全细胞淘洗。20℃与噬菌体制备物培养1小时后，离心细胞悬液(2000rpm3分钟)除去非结合的噬菌体，用10毫升PBS洗涤细胞三次，每次后如所述进行离心。用100mMHCl通过pH-洗脱洗脱出与细胞特异性结合的噬菌体。另外，可以直接在三乙胺处理(100mM)和随后中和后在悬液中加入大肠杆菌扩增结合的噬菌体。
2.5.HLA-DR结合性scFv片段的鉴定
用FACS分析在PRIWSS细胞上筛选在三轮固相淘洗(2.3)或混合固相/全细胞淘洗(2.4)后获得的克隆与细胞表面HLA-DR的结合。为了表达，通过XbaI/EcoRI将scFv克隆到作为表达载体的pMX7_FS中(见图12)。在下文实施例3.2中显示了表达条件。
在4℃将106Priess细胞等分转移到96孔微量滴定板中。60分钟加入scFv的封闭缓冲液(PBS/5％FCS)溶液，用抗-FLAG M2抗体(Kodak)(1∶5000稀释)，然后用多克隆山羊抗小鼠IgG抗体-R-藻红素复合物(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA，USA，目录号115-116-146，F(ab′)2片段)(1∶200稀释液)检测。将细胞固定在聚甲醛中，4℃储藏。每个试验在FACS-Calibur(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，CA，USA)上收集104个事件。超过500个推定结合物中仅15个被鉴定为与PRiess细胞特定结合。如下所述进一步分析这些克隆的免疫调节能力及其杀伤能力。表1包含由此鉴定的克隆MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10。列出的VH和VL家族以及CDR3指所述的基于HuCAL共有的抗体基因(Knappik等，2000)；VH和VL CDR的序列如表1所示，VH和VL结构域的全序列如图15所示。
3.Fab片段的产生
3.1.scFv转化为Fab
从相应的scFv片段如下产生了Fab-片段抗原结合多肽MS-GPC-1-Fab、MS-GPC-6-Fab、MS-GPC-10-Fab。将scFv片段的重链和轻链可变区克隆入pMx9_Fab(图13)，重链可变区作为 MfeI/StyI片段，κ轻链的可变区作为EcoRV/BsiWI片段。λ链首先从相应的作为模板的pMORPH13-scFv载体用PCR引物CRT(5’引物)和CRT6(3’引物)扩增出来，其中CRT6引入独特的DraIII限制性内切酶位点。
CRT5：5’GTGGTGGTTCCGATATC3’
CRT6：5’AGCGTCACATCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGGTTA3’
用EcoRV/DraIII切割PCR产物，克隆入pMx9_Fab(见图13)。可用多克隆山羊抗人IgG抗体-R-藻红素复合物(Jackson ImmnoResearch，West Grove，PA，USA，目录号109-116-088，F(ab′)2片段)(1∶2000稀释)检测Fab轻链。
3.2.HuCAL-抗体片段在大肠杆菌中的表达和纯化
在补充有34微克/毫升氯霉素的1升2x TY-培养基中分别在大肠杆菌细胞(JM83)中从pMX7_FS或pMx9_Fab表达scFv和Fab片段。用0.5mM IPTG(scFv)或0.1mM IPTG(Fab)诱导后，在22℃培养细胞12小时。在弗式压碎器(ThermoSpectronic，Rochester，NY，USA)中在20mM磷酸钠、0.5M NaCl和10mM咪唑(pH7.4)中裂解细胞沉淀。离心除去细胞碎片，用Streptactin基质进行STREP标记纯化前，使澄清上清液通过0.2微米孔，纯化条件根据供应商(IBA GmbH，Gttingen，Germany)。尺寸排阻层析(SEC)纯化如Rheinnecker等进行(1996)。通过SEC用校准用标准确定表观分子量，在某些情况下用偶联液相层析-质谱肯定(TopLab GmbH.Matinsried，Germany)。
4.抗体片段的优化
为了优化HLA-DR结合性抗体片段的某些生物学特征，用MS-GPC-8-Fab通过用来自HuCAL文库的CDR3中随机氮化所有λ链替换亲本VLλ1，构建Fab抗体文库(Knippak等，2000)。
通过XbaI/EcoRI从pMx9_Fab_GPC-8将Fab片段MS-GPC-8-Fab克隆入pMORPH18_Fab，Fab片段噬菌体显示的基于噬菌粒的载体，来产生pMORPH18_Fab_GPC-8(见图14)。含有独特DraIII限制性内切酶位点(Knappik等，2000)的λ链库被克隆入用NsiI和DraIII切割的pMORPH18_fab_GPC-8(见图14中pMORPH18_Fab_GPC-8的载体图)。
用两轮针对MHC II型DRA*0101/DRB1*0401(如上制备)如2.3中所述的的淘洗筛选得到的Fab优化文库，除了在第二轮中包裹的抗原浓度降到12纳克/孔。FACS如2.5中所述鉴定出优化的克隆。这些克隆中7个MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18和MS-GPC-8-27进一步确定特征，并显示如起始片段MS-GPC-8发现的细胞杀伤作用。表1含有GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18和MS-GPC-8-27的序列特征。列出的VH和VL家族和CDR3指所述的HuCAL基于共有的抗体基因(Knappik等，2000)，图15显示了MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17和MS-GPC-8-27的VH和VL结构域的全序列。
抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-6和MS-GPC-8-17的优化Fab形式显示对于起始MS-GPC-8改善的特征。例如，优化抗体的EC50是15-20和5-20nM(与MS-GPC-8的20-40nM比较，其中浓度以二价交联Fab二聚物的浓度给出)，对于MS-GPC-8-6和MS-GPC-8-17杀死MHH-Call 4细胞的最大能力确定分别为76％和78％(与MS-GPC-8的65％比较)。
为了进一步优化，通过盒式诱变用三核苷酸定向的诱变(Virnek等，1994)优化衍生自MS-GPC-8(包括MS-GPC-8-10和MS-GPC-8-27)的一组抗-HLA-DR抗体片段的VL CDR1区域。简单说，合成了一个VI1 CDR1文库盒，它含有个随机的位点(总可变性：7.43×106)，克隆入VI1框架。用EcoRV和BbsI消化CDR1文库，含有CDR1文库的片段连接入pMORPH18_Fab中MS-GPC-8衍生的Fab抗体的λ轻链中(如上所述)，用EcoRV和BbsI消化。如上所述筛选得到的文库。通过与HLADR(MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41)特异性结合鉴定了10个克隆，显示起始片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-10和MS-GPC-8-27所发现的细胞杀伤活性。表1包含MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的序列特征。列出的VH和VL家族和CDR3指所述的HuCAL基于共有的抗体基因(Knappik等，2000)，图15显示了MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57、和MS-GPC-8-27-41的VH和VL结构域的全序列。
从10个克隆中，如实施例10中所述的显著提高的细胞杀伤EC50所证明的，选出4个Fab片段(MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41)。表1显示在CDR1区域优化的克隆的序列。
优化过程不仅提高了优化过程产生的抗-HLA-DR抗体片段的生物效力，还显著改善了物理特征-MS-GPC-8及其优化子代的Fab形式的亲和力。例如，用表面等离子共振仪器(Biacore，Upsala Sweden)根据实施例7测量了MS-GPC-8的Fab形式及其优化的子代的亲和力。MS-GPC-8亲本Fab的亲和力在VLCDR3优化后提高了100倍，从346nM到约60nM，VLCDR3+1优化后进一步改进成一位纳摩尔亲和力(范围3-9nM)(表2)。
5.IgG的产生
5.1 HuCAL-免疫球蛋白表达载体的构建
如下克隆重链。除去pcDNA3.1+(Invitrogen)的多克隆位点，插入用于HuCAL设计的与限制性位点相容的填充片段，用于连接前导序列(NheI/EcpRI)、VH-结构域(EcoRI/BlpI)和免疫球蛋白恒定区(BlpI/ApaI)。前导序列(EMBL M83133)具有Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG1恒定区(PIR J00228)、IgG4(EMBL K01316)和血清IgA1(EMBL J00220)分隔成长约70个碱基的重叠寡核苷酸。引入沉默突变除去与HuCAL设计不相容的限制性位点。用重叠延伸-PCR剪接寡核苷酸。
如下克隆轻链。用两种不同的填充片段替换pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的多重克隆位点。κ-填充片段提供插入κ-前导(NheI/EcoRV)、HuCAL-scFv Vκ-结构域(EcoRY/BsiWI)和κ-链恒定区(BsiWI/ApaI)的限制性位点。λ-填充片段中的相应限制性位点是NheI/EcoRV(λ-前导)、EcoRV/HpaI(Vλ-结构域)和HpaI/ApaI(λ链恒定区)。κ-前导(EMBL Z00022)和λ-前导(EMBL L27692)都具有Kozak序列。人κ-(EMBL J00241)和λ-链(EMBL M18645)中的恒定区通过上述重叠延伸-PCR装配。
5.2表达IgG的CHO细胞的产生
所有细胞维持在37℃，含有5％CO2的湿润大气中供应商推荐的培养基中。CHO-K1(CRL-9618)来自ATCC，用等摩尔的IgG重链和轻链表达载体混合物共转染。用600微克/毫升G418和300微克/毫升Zeocin(Invitrogen)选择双抗性的转染子，然后极限稀释。用捕获-ELISA评估单克隆上清液的IgG表达。阳性克隆在补充有10％超低IgG-FCS的RPMI-1640培养基(Life Technologies)中扩大。将上清液pH调节到8.0和无菌过滤后，溶液进行标准蛋白质A柱层析(Poros 20A，PEBiosystems)。
抗-HLA-DR结合域的IgG形式显示对抗体片段改进的特征，这些改进的特征包括亲和力(实施例7)和杀伤效力(实施例9、10和14)。
6.HLA-DR特异性实验和表位作图
为了证明选自HuCAL文库的抗原结合性结构域的与人MHC II受体N-末端结构域的结合位点特异性结合，该受体在等位基因之间是大部分保守的，迄今在细胞杀伤领域中通过受体交联是未知的，我们对其结合特异性进行了评估，尝试确定结合表位的特征。
Fab抗体片段MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6显示与HLA-DR蛋白质的结合特异性，但没有与非HLA-DR蛋白的特异性。用下列抗原测试了选自HuCAL文库的Fab片段的反应性：HLA-DR蛋白(DRA*0101/DRB1*0401：实施例1中制备，和一组无关的非-HLA-DR蛋白质，包括BSA、睾丸酮-BSA、溶菌酶和人转铁蛋白)。用空孔(塑料的)作为阴性对照。以1微克/孔PBS(Nunc-MaxiSorpTM)包裹抗原MHCII过夜，而对于其它抗原(BSA、睾丸酮-BSA、溶菌酶、转铁蛋白)用10微克/孔。翌日用5％脱脂牛奶封闭孔1小时，然后与各抗体以100纳克/孔孵育(抗-MHCII-Fab和无关Fab(Mac1-8A))1小时。在PBS中洗涤后，在各孔中加入抗人-IgG F(ab′)2-过氧化物酶-偶联物(1∶10000在TBS(补充了5％w/v脱脂干燥牛奶/0.05％v/v Tween 20)中的稀释度)。加入底物POD(Roche)后，最终洗涤在PBS中进行。用ELISA阅读仪在370nM阅读显色。
所有抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6显示对HLA-DR的高度特异性，如同将这些抗体片段与HLA-DR衍生的抗原与对照比较得到更高的平均荧光强度证明的(图1a)。在类似的实验中，发现Fab片段MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10同时与DRA*0101/DRB1*0401(如上制备)和含有DRA*0101和DRB1*0401的N-末端，剩余的分子衍生自小鼠II型同源物IEd(Ito等，1996)的嵌合DR-IE结合(图1b)。
为了证明抗-HLA-DR抗体片段和本发明的IgG的广泛DR反应性，测试了MS-GPC-1、6、8和10的scFv形式，测试了MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-51和MS-GPC-8-6-13的IgG形式的针对从ECACC获得的一类爱泼斯坦-巴尔病毒转化的B细胞系(Salisbury UK)的反应性，各同源物是人群中最常见的DR等位基因之一(图2显示了细胞系和等位基因的表)还测试了抗体片段针对一系列转染表达人MHC II型同型抗原(除了分别表达分子DRB3*0101、DRB4*0101、DP0103/0402、DP0202/0201和DQ0201、0602的DRB1：L105.1、L257.6、L25.4、L256.12和L21.3(Klohe等，1988))的L细胞的反应性。
用例如Otten等(1997)所述的免疫荧光法证明了抗原结合片段与一类表达各种MHC-II型分子的细胞系的反应性。染色在2×105个细胞上用抗-FLAG M2抗体作为针对各抗-HLA-DR抗体片段携带的M2标记的第二试剂和荧光素标记的山羊抗小鼠Ig(BD Pharmingen，Torrey Pine，CA，USA)作为染色剂进行染色。细胞在4℃与200nM抗-HLA-DR抗体片段孵育60分钟，然后与厂商确定浓度的二抗和三抗一起孵育。对于IgG形式，省略二抗，用FITC标记的小鼠抗人IgG4(Serotec，Oxford，UK)检测IgG。在孵育步骤之间洗涤细胞。最后洗涤细胞并用FACS Calibur(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)分析。
图2显示scFv片段MS-GPC-1、6、8和10，以及MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-51和MS-GPC-8-6-13的IgG形式与所有测试的DRB1同型抗原反应，而MS-GPC-3和4与3种DRB1同型抗原反应。该观察结果以及所有HLA-DR抗体片段与嵌合DR-IE反应的观察结果合起来，提示所有所选的抗-HLA-DR抗体片段识别单形DRα链的胞外第一个结构域或DRβ链胞外第一个结构域上的单形表位。
然后我们尝试进一步通过检测与小鼠抗体的竞争性结合定位MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的结合域，其中HLA-DR上的结构域是已知的。已知小鼠抗体L243和LB3.1与α1结构域结合，1-1C4和8D1与β1结构域结合，10F12与β2结构域结合(Vidovic等，1995b)。为此，开发了一种实验，其中首先将表达DT的细胞系(LG-2)与MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的IgG4形式，MS-GPC-8-10-57的Fab形式或GPC 8的Fab形式以及不相关的对照抗体一起孵育。如果MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的结合位点与小鼠抗体的结合重叠，那么预期小鼠抗体的检测结果下降。
GPC-8-27-41和MS-GPC-8-10-57的IgG4形式和MS-GPC-8-10-57的Fab形式的结合基本上抑制(平均荧光强度降低＞90％)1-1C4和8D1的结合，而L243、LB3.1和10F12和对照仅稍有影响。MS-GPC-8的Fab形式减少了1-1C4约50％的结合(平均荧光从244降到118)，终止8D1结合，仅稍微影响L243、LB3.1和10F12或对照的结合。无关的对照抗体不影响结合。因此，MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41看来识别等位HLA-DR分子中高度保守的β1结构域表位。
在冰上进行全染色过程。预先在含有2％ FCS和35微克/毫升豚鼠IgG的PBS(“FACS-缓冲液”)中预封闭1×107个人B-淋巴幼细胞系LG-2。这些细胞分成3等份A、B和C，各约3.3×106个细胞，其中加入A)35微克MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41 IgG4，B)35微克MS-GPC-8-10-57Fab或MS-GPC-8Fab，C)35微克不相关的IgG4作为阴性对照，孵育90分钟。然后将A、B、C各分成6等份，每份含有5.5×106个细胞，将下列各2微克小鼠抗体加到指管中，孵育30分钟：1.)纯化的mIgG；2.)L243；3.)LB3.1；4.)1-1 C4；5.)8D1；6.)10F12。然后，在各指管中加入4毫升PBS，指管300g离心8分钟，细胞沉淀重悬浮在50微升含有稀释25倍的山羊-抗-小鼠Ig-FITC复合物(最终浓度20微克/毫升)(BDPharmingen，Torrey Pines，CA，USA)的FACS缓冲液中。然后，用4毫升PBS洗涤细胞，如上离心，重新悬浮在500微升PBS中，用于流式细胞计数分析(FACSCalibur，BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)。
用PepSpot技术(US 6040423；Heiskanen等，1999)进一步鉴定MS-GPC 8-10-57的结合表位。简单说，在纤维素膜上用固相肽合成点样法(WO 00/12757)合成73条重叠15聚肽阵列。这些肽序列分别衍生自HLA-DR4Dw14、HLA-DRA1*0101(残基1-81)和HLA-DRB1*0401(残基2-92)的α1和β1结构域，有2个氨基酸的重叠。第二，将该阵列浸没在0.1％ Tween-20/PBS(PBS-T)中，用5％BSA在PBS-T中室温封闭3小时，然后用PBS-T洗涤3次。第三，制备的阵列在室温下和50毫升5mg/lGPC-8-10-57的IgG形式的1％BSA/PBS-T溶液孵育90分钟。第四，结合后，用PBS-T洗涤膜三次，随后在室温下与偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗人轻链抗体(在1％BSA/PBS-T中稀释5000倍)孵育1小时。最后，用PBS-T洗涤膜3次，用化学荧光检测在X光胶片上确定任何结合。对于山羊抗人轻链抗体非特异性结合的对照，用下列独立洗涤步骤剥离肽阵列，各在室温下进行30分钟：PBS-T(2次)，水，DMF，水，含有8M脲的水溶液，1％SDS，0.5％DTT，50％乙醇，10％乙酸的水溶液(各3次)，最后甲醇(2次)。再次封闭膜，洗涤，与偶联有辣根过氧化物酶的山羊抗人轻链抗体一起孵育，如上所述显色。
7.抗HLA-DR抗体和抗体片段的亲和力
为了证明本发明抗HLA抗体片段的卓越结合性能，我们用标准设备，使用等离子体共振原理测量了它们与人MHC II形DR蛋白(DRA*0101/DRB1*0401)的亲和力。令人惊奇的是，我们在本发明一些抗HLA-DR抗体片段IgG形式亚纳摩尔水平实现了亲和力。例如。分别对于0.3、0.5和0.6nM测量MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-13和MS-GPC-8-10-57的IgG形式的亲和力(表3a)。另外，我们观察到Fab片段亲和力在2-8nM范围内的高亲和力在CDR1和CDR3轻链区成熟(表3b)。仅在CDR3轻链区成熟的Fab片段亲和力显示40-100nM范围内的亲和力(表3c)，甚至未优化的HuCAL抗原结合域的Fab片段也显示在亚微摩尔范围内的亲和力(表3d)。观察到CDR3优化后Kon仅略微增加(2倍)(Kon在抗体优化过程中在1×105M-1s-1的数量级中是恒定的)，而Koff的显著下降是优化过程的特征-对于未优化的Fab，CDR3优化的Fab，CDR3/CDR1优化的Fab和抗HLA-DR抗体的IgG形式是亚100s-1、亚10s-1、亚1s-1和亚0.1s-1。
如下测量本发明抗HLA抗体片段的亲和力。所有测量在HBS缓冲液(20mMHEPES、150mM NaCl，pH7.4)中进行。MHC II型DR蛋白(在实施例1中制备)稀释在100mMpH4.5的乙酸钠中，至浓度50-100mg/ml，与CM5芯片(Biacore AB)用标准EDC-NHS偶联化学偶联，然后如厂商指示用乙醇胺处理。MHCII的包裹密度调节到500-4000RU之间。注射5个不同浓度的不同抗体，用Biacore Instrument的标准软件测量亲和力。用10mM甘氨酸pH2.3和7.5mM NaOH再生偶联的表面。
8.抗HLA-DR抗体和抗体片段的多价杀伤作用
为了证明价对细胞杀伤的效果，用单价、二价和多价的本发明针对GRANTA-519细胞的抗HLA-DR抗体片段组合物进行细胞杀伤试验。来自HuCAL文库的抗-HLA-DR抗体片段当与抗-FLAG M2 mAb共同孵育，交联形成二价组合物时，与单价形式(抗体片段浓度200nM时5-30％杀伤)比较，显示更高的细胞杀伤活性(抗体片段浓度200nM时60-90％杀伤)(图3)。单独或仅在抗-FLAG M2 mAb存在下，不和抗-HLA-DR抗体片段共同孵育细胞，不引起用细胞存活率测量的细胞毒性。如上处理细胞，但使用50nM抗体片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG4形式(天然二价)，而不加入抗FLAG M2 mAb，在孵育4小时后显示76％、78％、78％和73％的杀伤效力。
另外，我们观察到抗-HLA-DR抗体片段的更高价进一步显著降低细胞存活率。在含有抗-HLA-DR抗体片段的IgG形式的孵育复合物中加入蛋白质G后，形成的多价复合物与抗HLA-DR抗体片段仅与二价IgG形式孵育后形成的二价组合物比较，进一步降低细胞存活率。
在HLA-DR阳性肿瘤细胞系GRANTA-519(DSMZ，Germany)上测试选自HuCAL文库的抗HLA-DR抗体片段的杀伤效力。37℃在6％CO2下，2×105个细胞与200nM抗HLA-DR抗体片段在补充有2.5％热灭活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，Germany)中孵育4小时。测试各抗HLA-DR抗体片段作为单价抗HLA-DR抗体片段或通过加入100nM二价交联抗-FLAG M2 mAb，作为二价组合物杀伤活化肿瘤细胞的作用。37℃在6％CO2下孵育4小时后，用台盼蓝染色，随后对剩余存活细胞进行计数(Current Protocols in Immunology，1997)，确定细胞存活率。
用针对与系列稀释的细菌蛋白质蛋白G预先孵育，制备的MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-4的IgG形式的多价形式的KARPAS-422细胞重复上述实验。蛋白G具有IgG抗体的高亲和力和两个结合位点，有效将其交联得到高结合价4。在单独使用IgG，而没有与蛋白质G的预孵育的对照中，约杀死了55％的细胞，而用与蛋白质G预孵育的IgG的细胞杀伤在IgG抗体/蛋白质G摩尔比为约6(基于蛋白质G分子量28.5kD)时达到最大的75％左右。更高或更低的IgG抗体/蛋白质G摩尔比达到纯IgG抗体的细胞杀伤效力。
9.抗-HLA-DR抗体片段的杀伤效力。
类似实施例8进行抗HLA-DR交联抗体片段针对其它表达HLA-DR分子的肿瘤细胞系的杀伤效力的实验。在4小时孵育后，肿瘤细胞显示细胞杀伤比MS-GPC-8的交联Fab形式大50％的细胞杀伤，这些肿瘤细胞包括MHH-CALL4、MN60、BJAB、BONNA-12，共分别代表疾病：B细胞急性淋巴细胞性白血病、Burkitt淋巴瘤和毛发细胞淋巴瘤。当用交联抗-FLAG M2 mAb如下形成了用抗HLA-DR抗体片段MS-GPC-1、6和10的交联Fab形式还显示对于上述肿瘤细胞系类似的细胞毒性。
用实施例8中的方法确定针对Priess细胞的各交联二价抗HLA-DR抗体片段的最大杀伤能力。测定MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10的最大杀伤能力分别是83％、88％、84％和88％。根据实施例4产生的抗体片段当用上述抗FLAGM2交联时，也显示针对GRANTA和Priess细胞的杀伤作用改善(表4)。
10.人组合物抗HLa-DR IgG抗体的杀伤效力
与对应的小鼠抗体(Vidovic等，1995b；Nagy和Vidovic，1996；Vidovic和Toral，1998)比较，我们惊奇的发现观察到本发明的某些抗-HLa-DR抗体片段的IgG形式的杀伤效力显著改善(表5)。根据实施例8和9所述的方法，但用50nM，重复测定本发明某些抗体片段的IgG形式(3-5次重复实验，其中细胞数每次实验一式两份计数)。当以最终浓度仅50nM提供时，MS-GPC-8、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41杀死了来自24个人肿瘤细胞系的16、22、19和20个。这些细胞系以高于实施例11所测定的10个荧光单位的水平表达HLA-DR抗原。用两种小鼠抗-HLA-DR抗体L243(Vidovic等，1995b)和8D1(Vidovic和Toral；1988)以显著高的mAb最终浓度(200nM)处理细胞，分别在24个表达HLA-DR的细胞系中仅13和12个中将细胞存活率降低到50％存活细胞以下。单独挑出细胞系MHH-PREB-1，不算作24个细胞系组内，尽管它以高于10个荧光单位的水平表达HLA-DR抗原，但是任何上述抗体都不能诱导任何细胞存活率的显著下降。在实施例12中进一步解释了该现象。
事实上，即使在显著提高的浓度下，200nM处理的两种小鼠抗体与本发明的抗-HLA-DR抗体片段比较，显示显著有效的杀伤。不仅本发明人抗-HLA-DR抗体片段的IgG形式与小鼠抗体比较，显示细胞杀伤在较低浓度下整体提高，而且它们显示在不同的细胞系之间杀伤效率少有变动。该实施例中杀伤人抗体的变动系数是32％(指％杀伤＝68+/-22％(SD))，与小鼠抗体的62％(指％杀伤＝49+/-31％(SD))相比。通过将平均杀伤百分数对log(平均HLA DR表达)拟合成对数回归模型，统计学控制HLA表达对杀伤效力的影响，支持该观察结果(图4)。不仅小鼠抗体的拟合曲线比人通常低，而且与人抗体数据(16％)的残数相比，在小鼠抗体数据(SD＝28％)的残数中有更大的变动。
11.活化对非活化细胞针对人抗原的抗原结合域的杀伤选择性
用人周围B细胞证明人抗-HLA-DR mAb-介导的细胞杀伤依赖于细胞活化。从HLA-DR型健康捐献者取出50毫升肝素化的静脉血，用Ficoll-Hypaque梯度离心(Histopaque-1077；Sigma)如Current Protocols in Immunology(John Wiley &Sons，Inc.，1999)中所述分离新鲜外周血单核细胞(PBMC)。用B-细胞分离试剂盒和MACS LS+/VS+柱(Miltenyi Biotec，Germany)根据厂商说明书从约5×107PBMC中获得纯化的B细胞(约5％外周血淋巴细胞)。用FACS分析等份的分离的B细胞(HLA-DR阳性和CD19阳性)证实了非B细胞的成功耗竭。用市售的抗体(DBImmunocytometry Systems，San jose，CA，USA)用在Current Protocols inImmunology(John Wiley & Sons，Inc.，1999)中所举例的标准方法进行双染色和分析。用在补充了10％FCS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，Germany)中1∶25稀释的商陆分裂原(Gibco BRL，目录号15360-019)，在6％ CO2下孵育3天，测试等份的分离的B细胞通过刺激活化细胞的能力。通过FACS分析细胞表面上的HLA-DR表达证实了成功活化(Current Protocols in Immunology(John Wiley &Sons，Inc.，1999))。
通过在上述培养液，除了补充2.5％热灭活的FCS，而不是10％或单独与培养液，分别孵育如上所述活化的1×106/毫升B细胞，未活化细胞和50nM MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41或小鼠IgG 10F12，作比较，证实了活化的细胞对未活化细胞杀伤的选择性(Vidovic等，1995b)。在6％CO2下，37℃孵育1或4小时后，用二乙酸荧光素染色(FDA)活细胞和碘化丙锭染色(PI)死细胞，随后用荧光显微镜(Leica，Germany)用标准程序(Current Protocols in Immunology，1997)计数绿色(FDA)和红色(PI)荧光细胞，确定细胞存活率。
显示B细胞活化是细胞杀伤必需的。在未活化细胞中，与抗HLA-DR抗体孵育1小时后，对于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和单独用培养液，培养液中的活细胞数分别对应于预孵育细胞密度的81％、117％、126％和96％。相反对于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和单独用培养液，培养液中的活的活化的B细胞数在孵育1小时后分别对应于预孵育细胞密度的23％、42％、83％和66％。在孵育4小时后，对于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和单独用培养液，发现在未活化细胞中有预孵育细胞密度的78％、83％、95％和97％是活的，而在活化细胞中对于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和单独用培养液，细胞密度下降到了23％、24％、53％和67％。
12.抗-HLA抗体片段针对细胞系MHH PreB1的杀伤活性
如表5证明的，我们观察到我们的交联抗-HLA-DR抗体片段或igG不轻易在显著水平杀伤表达HLA-DR的特定肿瘤细胞系。我们猜想虽然已建立成稳定的细胞系，该培养物中的细胞未充分活化。因此，我进行了实验，如下用HLA-DR分子作为活化标记提高的细胞表面表达来刺激MHH preB1细胞系的活性。
非附着生长的MHH preB1细胞在含有下列添加剂的RPMI培养液中培养(全部来自Gibco BRL和Bio Whittaker)：10％FCs、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和1×卡那霉素。通过与脂多糖(LPS，10微克/ml)、干扰素-γ(IFN-γ，Roche，40ng/ml)和植物凝血素(PHA，5微克/ml)孵育1天活化等份，来提高HLA-DR分子的表达。通过流式细胞计数，用FITC偶联的mAb L243(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，CA，USA)监测HLA-DR分子的细胞表面表达。在LPS、IFN-γ和PHA的存在下孵育MHH preB1 1天，导致HLA-DR表面密度2倍增加(平均荧光漂移从190-390)。在上述培养基(但含有降低的FCS浓度(2.5％))中进行细胞杀伤4小时。使用MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-10-57的IgG形式的浓度系列，各等份的非活化和活化的细胞上含有最终抗体浓度为3300、550、92、15、2.5、0.42和0.07nm。用显微镜镜检活细胞排除台盼蓝。虽然未活化的细胞存活率在达到最大抗体浓度下也保持不受抗体影响，但在活化的MHH preB1细胞中，细胞存活率随着抗体浓度显著下降(图5)。
13.人组合物的抗-HLA-DR对体外慢性淋巴细胞性白血病细胞的杀伤效率
用从10个患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的病人分离和纯化的B细胞，我们用体外试验证明了本发明的抗-HLA-DR抗体片段的IgG形式显示临床相关细胞的杀伤效率。从10个无关的患CLL的病人中根据标准方法(Buhmann等(1999))分离和纯化B-细胞(样品由Prof Hallek，Ludwig maximillian university，Munich慷慨提供)。用100nM抗HLA-DR抗体片段MS-GPC-8、MS-GPc-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的IgG形式处理2×105个细胞，类似实施例8和9孵育4或24小时。建立了复制的细胞培养物组，通过在用抗体处理3天前与在其表面表达CD40配体的HeLa细胞一起孵育活化(Buhmann等，1999)。作为对照，使用小鼠IgG10F12(Vidovic等，1995b)或不用抗体。如实施例12中所述测定各实验的细胞存活率。
惊人的是，本发明抗-HLA-DR抗体片段的IgG形式显示了高度有效和单一的杀伤-甚至跨越病人材料的多样组。在处理仅4小时后，所有三种人IgG使得细胞存活率与对照相比显著下降，在24小时后仅有33％细胞仍然活着(图6)。我们发现在根据Buhmann等(1999)进一步刺激体外细胞时，杀伤速率加快，因此仅在与人抗体培养4小时后，在本发明的所有人样品和抗体片段中仅剩余24％细胞存活。
14.测定抗-HLA-DR抗体片段的EC50
我们证明细胞杀伤试验中选自HuCAL库的一些抗-HLA-DR抗体片段形式，与细胞毒性小鼠抗-HLA-DR抗体相比，有很高的的50％有效的有效浓度(EC50)(表6)。
用HLA-DR阳性细胞系PRIESS或LG2(ECACC，Salisbury，UK)估计选自HuCAL的抗-HLA-DR抗体的EC50。2×105个细胞在6％ CO2下37℃，在补充了2.5％热灭活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1mg/ml卡那霉素和系列稀释的抗-HLA-DR抗体片段的RPMI 1640(PAA，Germany)中孵育4小时。对于Fab抗体片段的稀释系列，预先混合，来产生抗-HLA-DR抗体片段的二价组合物。陈述的浓度指二价组合物的浓度，因此可比较IgG和FabEC50值。
在与二价抗体片段37％在6％ CO2下保温4小时后，用二乙酸荧光素染色，随后计算剩余活细胞数测定细胞存活率(Current Protocols in Immunology，1997)。用标准统计学软件、非线性对数回归曲线拟合重复数据点，对于各抗体估计EC50。
当用抗-FLAG-M2抗体交联时，选自HuCAL文库(实施例4)的Fab片段MS-GPC-1、MS-GPC-8和MS-GPC-10显示小于120nM的EC50，如用单价片段的浓度表达的，对应于二价交联的(Fab)二聚-抗-Flag M2偶联物的60nM EC50(图7a)。当用抗-FLAG M2抗体的交联抗体时，优化了CDR3区域内的亲和力(实施例4)的抗-HLA-DR抗体片段显示进一步改进的EC50小于50nM，或对于二价交联抗体为25nM(图7b)，在CDR1区中额外优化亲和力的那些抗体片段显示小于30nM的EC50(对于二价片段是15nM)。在比较中，同一试验内细胞毒性小鼠抗-HLa-DR抗体8D1(Vidovic&Toral；1988)和L243(Vidovic等，1995b)的EC50显示分别大于30和40nM的EC50(图7c)。
令人惊奇的是，本发明的一些抗体片段的IgG形式显示与小鼠抗体相比，EC50约增加了1.5个数量级(图7d)。例如，MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式显示分别为1.2和1.2nM的EC50。另外，尽管未对于亲和力优化，MS-GPC-8的IgG形式显示小于10nM的EC50。
如实施例11和12所示，杀死未活化细胞(分别是正常外周B和MHH PreB细胞)的效力很小。在用50nM MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式处理时，分别在4小时后有78％和83％正常的外周B细胞存活。另外，在仅50nM浓度或IgG，见到几乎100％的MHH PreB1细胞存活率。事实上，用这些未活化的细胞，使用合理的浓度范围(0.1-300nm)的本发明的抗-HLA DR抗体片段的IgG或二价交联的Fab形式，不能实现存活率水平下降到50％以下。因此，这些未活化细胞类型的EC50可以估计成至少比对于未优化的Fab形式所示的高5倍(对于交联的二价片段EC50约60nM)，比VHCDR3优化的Fab和MS-GPC-8-10-57(约1.2nM)与MS-GPC-8-27-41(约1.2nM)的IgG形式的EC50高分别高至少10倍和100倍(对于交联的二价片段高约25nM)。
15.细胞杀伤机制
上述实施例显示细胞死亡发生-仅需要一些多价抗-HLA-DR抗体片段导致杀死活化的细胞。不需要进一步的细胞毒性或免疫学机制来导致细胞死亡，因此证明细胞死亡是通过活化细胞的天然的程序化机制介导的。坏死的机制是预先程序化死亡的受到广泛理解的过程。令我们惊奇的是我们观察到一些细胞杀伤的特征提示，当与我们的人抗-HLA-DR抗体片段接触时，活化细胞杀伤的机制不是本领域通常理解的“凋亡”。例如，观察到的细胞杀伤的速率似乎比凋亡报道的明显高得多(约10-15小时；Truman等，1994)。进行了两根实验，来证明细胞杀伤机制不是凋亡机制。
首先，我们用膜联蛋白-V-FITC和碘化丙锭(PI)染色技术来辨别凋亡和非凋亡细胞死亡-经历凋亡的细胞“凋亡细胞”(膜联蛋白-V阳性/PI阴性)可以与坏死的(“死亡的”)细胞(膜联蛋白-V阳性/PI阳性)和完全功能性的细胞(膜联蛋白-V阴性/PI阴性)区分开。用膜联蛋白V和PI试验的厂商推荐的方法，在6％ CO2下37℃用或不用200nM抗-HLa-DR抗体片段MS-GPC-8，以及100nM交联抗-FLAG M2 mAb在补充了2.5％热灭活的FCS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，DE)中培养1×106/ml Priess细胞。为了提供作为对照的凋亡细胞，通过在上述培养液中在6％CO2下，37℃，用50微克/ml的与10微克/ml蛋白质-G交联的凋亡诱导性抗-CD95mAb DX2(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)诱导1×106/ml Priess细胞进入凋亡。在各孵育时间(1，15和60分钟，3和5小时)，收集200微升样品，洗涤2次并用膜联蛋白-V-FITC(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)和PI，用膜联蛋白-V结合缓冲液根据厂商的方法染色。用FACS Calibur(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，Ca，USA)分析膜联蛋白-V-FITC和PI对于每组细胞染色的量。
通过交联的抗-HLA-DR抗体片段诱导的细胞死亡显示，与抗-CD95凋亡诱导性抗体或单独与抗-FLAG M2 mAb孵育的细胞培养物显著不同的细胞死亡模式。抗-HLA-DR抗体片段/抗-FLAG M2 mAb处理过的细胞的死亡细胞(用膜联蛋白-V阳性/PI阳性染色测定的)的百分数比抗-CD95或对照细胞增加迅速得多(图8a)。相反，凋亡细胞(用膜联蛋白-V阳性/PI阴性染色测定的)百分数对于抗-CD95处理的细胞比交联抗-HLA-DR片段或对照细胞增加快速得多(图8b)。
第二，我们用zDEVD-fmk，一种不可逆Caspase-3抑制剂和zVAD-fmk，一种广谱天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂(都来自BioRad，Munich，DE)抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性。凋亡的机制的特征是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活性，我们假设如果天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶不是抗-HLA-DR介导的细胞死亡必需的，我们在这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂存在下应该观察不到与不存在比较，经历细胞死亡的细胞存活率的改变。将2×105Priess细胞在37℃，6％ CO2下与系列稀释的两种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂(范围是180μM-10μM)在补充有2.5％热灭活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI1640(PAA，DE)中预培养3小时。通过加入200nM人抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8和100nm交联的抗-M2 mAb诱导HLA-DR介导的细胞死亡。抗-CD95诱导的凋亡细胞培养物作为抑制剂活性的对照(Drenou等，1999)。在进一步在37℃，6％CO2下孵育后，4和24小时后用台盼蓝染色随后对未染色细胞进行计数测定细胞存活率。如我们所料，抗-HLA-DR处理的细胞培养物不受天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂存在的显著影响，而通过抗CD-95处理诱导的细胞死亡由于细胞培养物与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂预培养显著下降。该观察结果支持我们的猜想，即HLA-DR介导的细胞死亡通过非凋亡机制作用，不依赖于可被zDEVD-fm或zVAD-fmk抑制的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。
16.用HLA-DR特异性抗体体内治疗癌症
我们证明人组合物的抗原结合域可成功的用作癌症治疗的治疗剂。用感兴趣的DR+人淋巴瘤或白血病细胞系接种免疫妥协的小鼠，例如scid、裸鼠或Rag-1敲除的小鼠。对于各肿瘤建立肿瘤细胞剂量通常是1×106-1×107/小鼠，测试和皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)给药。用抗-HLA-DR抗体片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41的IgG形式或其它本发明如上制备的，用1-25mg/kg的剂量经5天静脉内或皮下处理小鼠。在持续处理后监测抗-HLa-DR处理或对照未处理的小鼠存活达8周。另外通过测量肿瘤表面积定量测定在皮下接种的小鼠中的肿瘤进程。在实验中观察到抗-HLa-DR处理的小鼠的存活率达80％，显著延长，在实验终点有达50％的小鼠存活。在皮下接种和未处理的小鼠中，肿瘤达到表面积2-3平方厘米，而抗-HLa-DR处理的动物肿瘤表面积明显小得多。
17.用在IL-2分泌中减少的抗-HLA-DR抗体片段免疫抑制
我们惊奇的观察到本发明的抗-HLa-DR抗体片段在测量不死化的T-细胞IL-2分泌的试验中显示充分的免疫调节性质。该抗体片段MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPc-8-27-41的IgG形式在该试验中显示非常强的免疫抑制性质，和亚纳摩尔的IC50值，和事实上100％最大抑制(图9a)。特别令人惊奇的是，甚至本发明的抗体片段单价组合物能强烈抑制该相同试验中的IL-2分泌。例如VHCDR3选择的和VLCDR3/VLCDR1优化的抗体片段的Fab形式显示低一位的nM的IC50，和几乎100％最大抑制(图9b)。本发明的其它单价抗-HLA DR抗体片段在该试验中与对照IgG和Fab片段相比显示显著的免疫抑制性(表7)。
通过在半-最大抗原刺激条件下，测定用DR-转基因抗原递呈细胞(APC)刺激的杂交瘤细胞系T-Hyb 1的Il-2分泌，调查抗-HLA DR抗体片段的免疫调节性质。用Pharmingen(Torre Pine，CA，USA)的OptiEIA小鼠IL-2试剂盒提供的标准ELISA方法监测和测定IL-2分泌。从未免疫的嵌合0401-IE转基因小鼠的脾脏中根据标准方法分离APC(Ito等，1996)。在96孔板的含有下列添加剂(全部来自Gibco BRL和PAA)：10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1g/l卡那霉素的RPMI培养基中加入0.2ml/孔的1.5×105APC。加入最终体积为100微升上述培养液中的200微克/ml最终浓度的鸡蛋卵清蛋白，细胞与该抗原在6％ CO2下在37℃培育30分钟。在各孔中以各种浓度(通常为0.1-200nM)加入抗-HLA DR抗体片段，平板在37℃/6％ CO2下孵育1小时，加入2×105 T-Hyb 1细胞，在上述培养基中最终体积为200微升。在孵育24小时后，将100微升上清液转移到先前用IL-2捕获抗体(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)包裹的ELISA平板(Nunc-Immuno Plate MaxiSorp表面，Nunc，Roskilde，DK)上，根据厂商指示，用OptiEIA小鼠IL-2试剂盒定量IL-2量，并用Victor V读数仪(Wallac，Finland)阅读平板。用试剂盒提供的IL-2标准将分泌的IL-2标定为pg/ml。
通过将胸腺瘤BW 5147(ATCC)的T-细胞受体阴性变体和来自先前用鸡蛋卵清蛋白(Ito等，1996)接种的嵌合体0401-IL转基因小鼠的淋巴结细胞融合，建立T-细胞杂交瘤系T-Hyb1。选择克隆T-Hyb1进行试验，因为它响应抗原特异性刺激，具有高IL-2分泌。
18.用T-细胞增殖测定的HLA-DR特异性抗体免疫抑制
在测定T-细胞增殖的第二个试验中也见到抗-HLA DR抗体片段的免疫调节性质。MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式抑制T细胞增殖的IC50值分别是11和20nM(图10)。如下测试抗-HLA-DR抗体片段，来抑制增殖的T细胞对携带嵌合的小鼠-人II类转基因和RA-结合肽结合位点，并缺乏小鼠II型分子的小鼠的抗原引发的淋巴结细胞(Muller等，1990；Woods等，1994；Current Protocolsin Immunology，卷2，7.21；Ito等，1996)。在此，免疫在体内发生，但是抑制和读数在体外进行。先前产生了表达MHC II型分子和RA联合分子结合位点的转基因小鼠，DRB1*0401(Ito等，1996)。这些小鼠缺乏小鼠MHC II型，因此所有Th应答通过一个人RA-关联的MHC II型分子沟通(Ito等，1996)。这些转基因小鼠代表了测试人II型拮抗剂的模型。
用嵌合T-细胞和从用标准方法先前接种了鸡蛋卵清蛋白(Ito等，1996)嵌合的0401-IE转基因小鼠(Taconic，USA)的淋巴结分离的抗原递呈细胞测量的T-细胞增殖，测试抗-HLA-DR抗体片段及其IgG形式的抑制效果。在卵清蛋白(30微克/孔-半最大刺激浓度)和系列稀释的抗-HLA-DR抗体片段或IgG形式存在下，在含有2mM L-谷氨酰胺和0.1g/l卡那霉素的无血清HL-1培养液中测试，在96孔组织培养板的0.2毫升孔中培养1.5×105细胞3天。在培养的最后16个小时，用3H-甲基-胸腺嘧啶(1μCi/孔)掺入测定抗原特异性增殖(Falcioni等，1999)。收集细胞，用闪烁计数器(TopCount，Wallac，Finland)测定3H掺入。比较含有抗原的对照孔，可以观察用抗-HLA-DR抗体片段及其IgG形式处理T-细胞的增殖。
19.选择有用的多肽用于治疗癌症
为了选择最合适的蛋白质/多肽，以进入其它实验，并评估其用于治疗癌症的治疗组合物的适用性，收集其它数据。这些针对抗-HLA抗原抗体片段的IgG形式的数据可以包括结合亲和力，用EC50测定的体外杀伤效力，和跨越一套肿瘤细胞系的细胞毒性，体外估计的最大细胞杀伤百分数，和来自体内动物模型的肿瘤减少的数据和小鼠存活数据。
可选择显示最高亲和力和最低杀伤的EC50，最大百分数细胞杀伤和跨越各种肿瘤细胞系最广泛，最佳肿瘤减少数据和/或最佳小鼠存活数据的抗HLA-抗原抗体片段的IgG形式进入进一步的实验。这些实验可包括例如动物中的治疗方案和毒物学和对人的I期临床试验。
20.选择有用的多肽用于治疗免疫系统疾病
为了选择最合适的蛋白/多肽进而进一步实验，和评估其用于治疗免疫系统疾病的治疗组合物的适合性，收集了其它数据。对于抗-HLA抗原抗体片段的各种单价抗体片段或IgG形式的这些数据可包括亲和力、反应性、特异性、IC50-值，用于抑制IL-2分泌和T-细胞增殖，或体外杀伤效力，如体外用EC50和最大百分数细胞杀伤估计的，和移植排斥和移植物抗宿主疾病的DR-转基因模型。
可选择显示最低EC50，最高亲和力，最佳特异性和/或最大抑制T-细胞增殖或IL-2分泌，和在合适模型中的抑制移植排斥和/或移植物对宿主疾病的高效力的抗HLA-抗原抗体片段的IgG形式进入进一步的实验。这些实验可包括例如动物中的治疗方案和毒物学和对人的I期临床试验。
                          表1
                          HLA-DR-特异性多肽的VH和VL家族、VL CDR1和VH/VL CDR3序列
 克隆 VH CDR3长度 VH-CDR3-序列 VL VL-CDR1-序列 CDR3长度 VL-CDR3-序列 家族
 MS-GPC-1 H2 10 QYGHRGGFDH λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDFNES H2λ1
 MS-GPC-6 H3 9 GYGRYSPDL K3 RASQSVSSSYLA 8 QQYSNLPF H3K3
 MS-GPC-8 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDMPQA H2λ1
 MS-GPC-10 H2 10 QLHYRGGFDL λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDLTMG H2λ1
 MS-GPC-8-1 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDFSHY H2λ1
 MS-GPC-8-6 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-9 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDIQLH H2λ1
 MS-GPC-8-10 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDLIRH H2λ1
 MS-GPC-8-17 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDFSVY H2λ1
 MS-GPC-8-18 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDFSIY H2λ1
 M S-GPC-8-27 H2 10 SPRYRGAFDY λ1 SGSSSNIGSNYVS 8 QSYDMNVH H2λ1
 MS-GPC-8-6-2 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGSNYVH 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-6-19 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGSNYVA 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-6-27 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSDSNIGANYVT 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-6-45 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSEPNIGSNYVF 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-6-13 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGANYVT 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-6-47 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGSNYVS 8 QSYDYDHY H2λ1
 MS-GPC-8-10-57 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGNNYVQ 8 QSYDLIRH H2λ1
 MS-GPC-8-27-7 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGNNYVG 8 QSYDMNVH H2λ1
 MS-GPC-8-27-10 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGANYVN 8 QSYDMNVH H2λ1
 MS-GPC-8-27-41 H2  10 SPRYRGAFDY λ1 SGSESNIGNNYVQ 8 QSYDMNVH H2λ1
                                                                    表2
抗体优化步骤 Fab  kon[s-1M-1]×105+/-SD   koff[s-1]×10-3+/-SD        KD[nM]+/-SD    L-CDR3     L-CDR1
亲本Fab MS-GPC-8     0.99±0.40     29.0±8.40     346.1±140.5a)   QSYDMPQA  SGSSSNIGSNYVS
L-CDR3-优化 -8-1     1.93     20.9     108e)
L-CDR3-优化 -8-6     0.96±0.14     5.48±0.73     58.6±11.7b)
L-CDR3-优化 -8-9     1.85     16.6     90.1e)
L-CDR3-优化 -8-10     nd     7.0e)     nd
L-CDR3-优化 -8-17     1.0     5.48     54.7e)
L-CDR3-优化 -8-18     1.06     8.3     78.3e)
L-CDR3-优化 -8-27     nd     6.6e)     nd
L-CDR3-优化 -8-6     0.96±0.14     5.48±0.73     58.6±11.7b)   QSYDYDHY  SGSSSNIGSNYVS
L-CDR3+1-优化 -8-6-2     1.23±0.11     0.94±0.07     7.61±0.25c)   QSYDYDHY  SGSESNIGSNYVH
L-CDR3+1-优化 -8-6-19     1.10±0.08     0.96±0.15     8.74±1.33c)   QSYDYDHY  SGSESNIGSNYVA
L-CDF3+1-优化 -8-6-27     1.80±0.24     1.10±0.15     6.30±0.63d)   QSYDYDHY  SGSDSNIGANYVT
L-CDR3+1-优化 -8-6-45     1.20±0.07     1.03±0.04     8.63±0.61c)   QSYDYDHY  SGSEPNIGSNYVF
L-CDR3+1-优化 -8-6-13     1.90±0.26     0.55±0.05     2.96±0.46c)   QSYDYDHY  SGSESNIGANYVT
L-CDR3+1-优化 -8-6-47     1.97±0.29     0.62±0.04     3.18±0.33c)   QSYDYDHY  SGSESNIGSNYVS
L-CDR3+1-优化 -8-10-57     1.65±0.21     0.44±0.06     2.67±0.25c)   QSYDLIRH  SGSESNIGNNYVQ
L-CDR3+1-优化 -8-27-7     1.74±0.21     0.57±0.07     3.30±0.34d)   QSYDMNVH  SGSESNIGNNYVG
L-CDR3+1-优化 -8-27-10     1.76±0.21     0.53±0.05     3.01±0.21c)   QSYDMNVH  SGSESNIGANYVN
L-CDR3+1-优化 -8-27-41     1.67±0.16     0.49±0.03     2.93±0.27d)   QSYDMNVH  SGSESNIGNNYVQ
a)MS-GPC-8的亲和力数据是基于8种不同的Fab制备物，在4种不同的芯片上测定(2×500，1000，4000RU)
b)显示了对于MS-GPC-8-6，3种不同芯片上3种不同制备物的平均和标准偏差(500，4000，3000RU)。
c)将3000RU MHCII固定在CM5芯片上。对于每次测定，在表面注射1μM-16nM的7种不同浓度。分离时间：15秒、用6微升10mM的甘氨酸，pH2.3，然后用8微升7.5mM NaOH实现再生。显示4种对于MS-GPC-8-6-19平均和标准偏差，而对于其它显示3种不同的制备物的平均和标准偏差。
d)在3种不同芯片上测定了一种蛋白制备物(3000，2800和6500RU)。
e)成熟的MHCII结合物在4000RU密度的芯片上的亲和力测定；一次测定。
分子量在尺寸排阻层析后测定，发现100％单体具有45-48kDa之间的正确分子量。
                                  表3a
从Fab选择的IgG4单克隆抗体的亲和力。误差代表标准偏差。
 结合物(IgG4)  kon[M-1s-1]×105   kon[s-1]×10-5      KD[nM]
 MS-GPC-8-27-41      1.1±0.2     3,1±0.4     0,31±0.06
 MS-GPC-8-6-13      0,7±0.1     3±1     0,5±0.2
 MS-GPC-8-10-57      0,7±0.2     4±1     0,6±0.2
                                  表3b
CDR3重链优化后通过CDR1轻链优化的亲和力成熟获得的结合物亲和力。误差代表标准偏差。
 结合物(Fab)  kon[M-1s-1]×105   koff[s-1]×10-3      KD[nM]
 MS-GPC-8-6-2     1.2±0.1   0.94±0.07     7.6±0.3
 MS-GPC-8-6-19     1.1±0.1   1.0±0.2     9±1
 MS-GPC-8-6-27     1.8±0.2   1.1±0.2     6.3±0.6
 MS-GPC-8-6-45     1.20±0.07   1.03±0.04     8.6±0.6
 MS-GPC-8-6-13     1.9±0.3   0.55±0.05     3.0±0.5
 MS-GPC-8-6-47     2.0±0.3   0.62±0.04     3.2±0.3
 MS-GPC-8-10-57     1.7±0.2   0.44±0.06     2.7±0.3
 MS-GPC-8-27-7     1.7±0.2   0.57±0.07     3.3±0.3
 MS-GPC-8-27-10     1.8±0.2   0.53±0.05     3.0±0.2
 MS-GPC-8-27-41     1.7±0.2   0,49±0.03     2.9±0.3
                                表3c
GPC8通过CDR3轻链优化亲和力成熟获得的结合物
 结合物(Fab) kon[M-1s-1]×105   koff[s-1]×10-3    KD[nM]
 MS-GPC8-18     1.06     8.3     78.3
 MS-GPC8-9     1.85     16.6     90.1
 MS-GPC8-1     1.93     20.9     108
 MS-GPC8-17     1.0     5.48     54.7
 MS-GPC-8-6a)     1.2+/-0.1     5.5+/-0.7     8+/-12
芯片密度4000RU MHCII
a)对于MS-GPC-8，显示了3种不同芯片(500，4000，3000RU)上3种不同制备物的平均和标准偏差。
                                               表3d
在scFv形式及其转化的Fab中HuCAL获得的结合物。
  结合物                      scFv                        Fab
 kon[M-1s-1]×105   koff[s-1]×10-3    KD[nM]   kon[M-1s-1]×105   koff[s-1]×10-3     KD[nM]
 MS-GPC1     0.413     61     1500     0.639     53      820
 MS-GPC6     0.435     200     4600     0.135     114   8470(1曲线)
 MS-GPC8     0.114     76     560     0.99+/-0.40     29.0+/-8.4      346a)+/-141
 MS-GPC10     0.187     180     9625     0.22     63      2860
芯片密度500RU MHCII
a)MS-GPC-8的亲和力数据基于8种不同Fab制备物，它们在4种不同芯片(2×500，4000，3000RU)上测定，与标准偏差一起显示。
                     表4
细胞与交联抗-HLA-DR抗体片段孵育4小时后的杀伤效力，以及孵育24小时后的最大杀伤。
   交联Fab片段   针对GRANTA的杀伤效率   针对Priess的最大杀伤效率
    MS-GPC-1        +        +
    MS-GPC-6        +        +
    MS-GPC-8        +        +
    MS-GPC-10     +     +
    MS-GPC-8-6     ++     ++
    MS-GPC-8-17     ++     ++
    MS-GPC-8-6-13     +++     +++
    MS-GPC-8-10-57     +++     +++
    MS-GPC-8-27-41     +++     +++
                                                                 表5
人组合物的抗-HLA-DR IgG抗体与小鼠抗-HLA-DR抗体针对一组淋巴瘤肿瘤细胞系的杀伤效率。
            细胞系    HLA-DR表达平均-FL mAb杀伤％
      小鼠mAbs                        人mAbs
    名称   DR型       类型     L243    L243  8D1  MS-GPC-8  8-27-41  8-10-57   8-6-13
LG-2PriessARH-77GRANTA-519KARPAS-422KARPAS-299DOHH-2SR-786MHH-CALL-4MN-60BJABRAJIL-428HDLM-2   1.14.4122.112.41.21.21.21.210.1312.1310，1712   B-淋巴母细胞B-淋巴母细胞B-淋巴母细胞B细胞-非霍奇金氏B细胞-非霍奇金氏T细胞-非霍奇金氏B细胞淋巴瘤T细胞淋巴瘤B-ALLB-ALLBurkitt淋巴瘤Burkitt淋巴瘤霍奇金氏淋巴瘤霍奇金氏淋巴瘤     45862130114651869194441423481120338617244326     798788832578293354653698277   858373563225238412259648173     868584765181581437149818289     8788857866825953636971849188     8893887868796044466667869184     8274877371765326436764839290
HD-MY-ZKM-H2L1236BONNA-12HC-1NALM-1L-363EOL-1LP-1RPMI-8226 1.4   霍奇金氏淋巴瘤霍奇金氏淋巴瘤霍奇金氏淋巴瘤毛细胞白血病毛细胞白血病CML浆细胞性白血病嗜伊红粒细胞多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤     7961941243137210784953631519     358152928844622126   3956629189451300     49754491898326366114     69866392938226697329     57886691867824497026     72876686936519537319
MHH-PREB-1   B细胞-非霍奇金氏     175     3   3     2     4     8     11
MHH-CALL-2OPM-2KASUMI-1HL-60LAMA-84   B细胞前体白血病多发性骨髓瘤AMLAMLCML     +3537     5130187   50009 8835 1101511 41095 56227
％杀伤：用200nM小鼠或50nM人mAb37℃处理4小时后的100-％存活细胞。
                               表6
本发明的一些抗-HLA-DR抗体片段在针对淋巴瘤细胞的细胞杀伤试验中的EC50值。所有EC50指交联的Fab和IgG形式可比较的二价因子(IgG或交联Fab)的纳摩尔浓度。
    抗体片段  形式   测试的细胞系     二价因子的细胞杀伤的EC50(nM)+/-SE
 MS-GPC-1  Fab  PRIESS  54±14
 MS-GPC-8  Fab  PRIESS  31±9
 MS-GPC-10  Fab  PRIESS  33±5
 MS-GPC-8-17  Fab  PRIESS  16±4
 MS-GPC-8-6-2  Fab  PRIESS  8±2
 MS-GPC-8-10-57  Fab  LG2  7.2
 MS-GPC-8-27-41  Fab  LG2  7.2
 MS-GPC-8-27-41  Fab  PRIESS  7.7
 MS-GPC-8  IgG4  PRIESS  8.3
 MS-GPC-8-27-41  IgG4  PRIESS  1.1±0.1
 MS-GPC-8-10-57  IgG4  PRIESS  1.1±0.2
 MS-GPC-8-27-41  IgG4  LG2  1.23±0.2
 MS-GPC-8-10-57  IgG4  LG2  1.0±0.1
 8D1  mIgG  PRIESS  33
 L243  mIgG  PRIESS  47
                                  表7
在测定T-Hyb1细胞的抗原特异性刺激后IL-2分泌的试验中，本发明的一些抗-HLA-DR抗体片段的IC50值。IgG形式(二价)的IC50表示成摩尔浓度，而为了提供方便的比较，Fab形式(单价)的IC50表示成Fab浓度的一半，使得能直接与IgG形式比较。
抗HLA-DR抗体片段   形式         IC50(IgG/nM)((Fab)/2/nM) 最大抑制(％)
    平均    SE
MS-GPC-8-10-57MS-GPC-8-27-41MS-GPC-8-6-13MS-GPC-8-6-2MS-GPC-8-6MS-GPC-8MS-GPC-8-6-2MS-GPC-8-6-13MS-GPC-8-6-19MS-GPC-8-10-57MS-GPC-8-6-27MS-GPC-8-6-47MS-GPC-8-27-7MS-GPC-8-27-10MS-GPC-8-27-41MS-GPC-8-6MS-GPC-8   IgGIgGIgGIgGIgGIgGFabFabFabFabFabFabFabFabFabFabFab     0.310.280.423.66.711.04.72.15.32.93.02.65.97.33.620110   0.010.070.061.12.00.81.90.80.21.01.20.62.21.90.7     100100100100100100100100100100100100100100100100100
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Claims (115)

1.一种含有多肽的组合物，其特征在于，该多肽含有基于抗体的人组合物的抗原结合域，具有对细胞表面上表达的一种抗原的结合特异性，其中用具有两种或多种所述抗原结合域的多价多肽处理表达所述抗原的细胞，导致或引起所述细胞杀伤，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制。
2.一种含有多肽的组合物，其特征在于，该多肽含有基于抗体的与人HLA DR抗原以1μM或以下的Kd结合的抗原结合域，其中用具有两种或多种所述抗原结合域的多价多肽处理表达所述抗原的细胞，导致或引起所述细胞杀伤，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制。
3.一种含有多价多肽的组合物，其特征在于，该多价多肽含有多个基于抗体的对人HLA DR具有结合特异性的抗原结合域，其中用所述多价多肽处理表达HLA DR的细胞，导致或引起所述细胞杀伤，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制，其中所述抗原结合域单独以1μM或以下的Kd与人HLA DR结合。
4.一种含有多肽的组合物，其特征在于，该多肽含有多个基于抗体的对人HLADR具有结合特异性的抗原结合域，其中用所述多价多肽处理表达HLA DR的细胞，导致或引起所述细胞杀伤，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制，其中所述多价多肽以100nm或以下的EC50杀伤活化的淋巴细胞。
5.一种含有多价多肽的组合物，其特征在于，该多肽含有至少一个基于抗体的与人HLA DR抗原以1μM或以下的Kd结合的抗原结合域，所述抗原结合域是通过包括从重组抗体文库用与人HLA DR至少一个表位结合的能力分离出VL和VH结构域的方法分离的，其中用具有两个或多个所述抗原结合域的多价多肽处理表达HLA DR的细胞，导致或引起所述细胞杀伤，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，分离抗原结合域的方法还包括步骤：
a.产生VL和VH结构域之一或两者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一个的变体文库，和
b.用与人HLA DR以1μM或以下的Kd结合的能力从变体文库中分离出VL和VH结构域。
7.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽杀伤转化细胞的EC50比杀伤正常细胞的EC50低至少5倍。
8.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽杀伤活化的细胞的EC50比杀伤未活化的细胞的EC50低至少5倍。
9.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽以50nM或以下的EC50杀伤转化的细胞。
10.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽以10nM或以下的EC50杀伤淋巴瘤细胞。
11.如权利要求1-6或8任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽杀伤活化的淋巴细胞。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述活化的淋巴细胞是淋巴瘤细胞，代表选自B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多发性骨髓性白血病的疾病。
13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述活化的淋巴细胞是选自Priess、GRANTA-519、KARPAS-422、KARPAS-299、DOHH-2、SR-786、MHH-CALL-4、MN-60、BJAB、RAJI、L-428、HDLM-2、HD-MY-Z、KM-H2、L1236、BONNA-12、HC-1、NALM-1、L-363、EOL-1、LP-1、RPMI-8226和MHH-PREB-1细胞系的细胞系。
14.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽以100nM或以下的EC50杀死选自KARPAS-422、DOHH-2、SR-7、MHH-CALL-4、MN-60、HD-MY-Z、NALM-1和LP-1的至少一种淋巴瘤细胞系的细胞。
15.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽以50nM或以下的EC50杀死选自KARPAS-422、DOHH-2、MN-60、NALM-1和LP-1的至少一种淋巴瘤细胞系的细胞。
16.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述多价多肽以50nM或以下的EC50杀死选自LG2和PRIESS的至少一种B细胞淋巴母细胞细胞系的细胞。
17.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述细胞是表达MHC II型分子的非淋巴细胞。
18.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与HLA-DR的β链结合。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与HLA-DR的β链的第一个结构域结合。
20.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与一种或多种选自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型结合。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与至少5种不同的所述HLA DR类型结合。
22.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括VH和VL结构域的组合，其中所述组合可在MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
23.如权利要求1-6任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VH CR3、VL CDR1和VL CDR3在MS-GPC-1、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
24.如权利要求1-23任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VH CDR3序列选自共有CDR3序列
                         nnnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
                         QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。
25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
26.如权利要求1-23任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1组合的抗体竞争抗原结合，其中VH CDR3序列选自共有CDR3序列
                         nnnnRGnFDn
每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
VL CDR3选自共有CDR3序列
                         QSYDnnnn
每个n分别代表任何氨基酸残基。
27.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
28.如权利要求1-27任一所述的组合物，其特征在于，所述基于抗体的抗原结合域包括用下列通式代表的VL CDR1序列：
                         SGSnnNIGnNYVn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。
29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
30.如权利要求1-29任一所述的组合物，其特征在于，所述杀伤是由所述细胞的天然的预编程的过程介导的。
31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述杀伤是非凋亡性的。
32.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述杀伤依赖于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，和/或其中所述杀伤不被zVAD-fmk或zDEVD-fmk抑制。
33.如权利要求1-32任一所述的组合物，其特征在于，所述基于抗体的抗原结合域是含有至少一个F(ab′)2抗体片段或小抗体片段的多价多肽的部分。
34.如权利要求1-32任一所述的组合物，其特征在于，所述基于抗体的抗原结合域是含有选自Fv、scFv、dsFv、Fab片段的至少两个单价抗体片段的多价多肽的部分，还含有一个或多个交联部分。
35.如权利要求1-32任一所述的组合物，其特征在于，所述基于抗体的抗原结合域是含有选自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM家族的抗体的至少一种完整抗体的多价多肽的部分。
36.如权利要求1-32任一所述的组合物，其特征在于，所述基于抗体的抗原结合域是在与细胞结合前形成的多价多肽的部分。
37.如权利要求1-32任一所述的组合物，其特征在于，所述基于抗体的抗原结合域是在与细胞结合后形成的多价多肽的部分。
38.如权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合位点与聚合物交联。
39.一种核酸，其特征在于，该核酸是权利要求1-32中任一所包含的抗原结合域或其多价多肽的蛋白质编码序列。
40.一种载体，其含有权利要求39所述的核酸和与其可操纵性连接的转录调节序列。
41.一种携带权利要求39所述的核酸或权利要求40所述的载体中的至少一个的宿主细胞。
42.一种产生含有导致或引起细胞杀伤，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制的组合物的方法，其特征在于，该方法包括在核酸表达成多价多肽或含有至少一个抗原结合域，所述抗原结合域随后被加工形成多价多肽组合物的多肽的条件下，培养权利要求41所述的细胞。
43.如权利要求1-38任一所述的组合物，其特征在于，该组合物配制在药物可接受的载体和/或稀释剂中。
44.权利要求1-38任一所述的组合物用于制备治疗动物的药物制剂的用途。
45.权利要求39所述的核酸用于制备治疗动物的药物制剂的用途。
46.权利要求41所述的宿主细胞用于制备治疗动物的药物制剂的用途。
47.权利要求42所述方法用于制备治疗动物的药物制剂的用途。
48.如权利要求44-47所述的用途，其特征在于，所述动物是人。
49.如权利要求44-48所述的用途，其特征在于，用于治疗细胞增殖性疾病，其中所述基于抗体的抗原结合域是多价多肽的部分。
50.如权利要求49所述的用途，其特征在于，所述治疗是治疗与表达MHC II型抗原的转化的细胞有关的疾病。
51.如权利要求49或50所述的用途，其特征在于，所述治疗是治疗选自B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多发性骨髓性白血病的疾病。
52.如权利要求44-48任一所述的用途，其特征在于，所述治疗是治疗与不良活化免疫系统的细胞，例如表达MHC II型的淋巴细胞有关的疾病。
53.如权利要求44-48任一所述的用途，其特征在于，所述治疗是治疗选自类风湿性关节炎、幼年期关节炎、多发性硬化、Grave氏病、胰岛素依赖性糖尿病、发作性睡病、牛皮癣、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重症肌无力、慢性天疱疮、肾小球肾炎、甲状腺炎、胰腺炎、胰岛炎、原发性胆汁性肝硬化、刺激性肠病和Sjogren综合征的疾病。
54.如权利要求44-48任一所述的用途，其特征在于，所述疾病选自重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化、移植排斥和移植物抗宿主病。
55.一种含有权利要求1-38任一所述的组合物的诊断组合物。
56.一种含有权利要求1-38任一所述的组合物和一种或多种交联部分的诊断组合物。
57.一种杀死在所述细胞表面表达抗原的细胞的方法，其特征在于，该方法包括步骤：用多个权利要求1-38任一所述的抗原结合域处理细胞，其中所述基于抗体的抗原结合域是多价多肽的部分，其中不需要细胞毒性或免疫学机制导致或引起所述杀伤。
58.一种鉴定能用配制在药物学上可接受的载体和/或稀释剂中的权利要求1-38任一所述的组合物治疗的病人的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
a.从病人分离细胞；
b.使所述细胞与权利要求1-38任一所述的组合物接触；和
c.测定所述细胞杀伤或免疫抑制的程度。
59.一种鉴定可用配制在药物学上可接受的载体和/或稀释剂的权利要求1-38任一所述的组合物治疗的病人的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有
a.权利要求1-38任一所述的组合物；和
b.测定所述细胞杀伤或免疫抑制的程度的工具。
60.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有
a.权利要求1-38任一所述的组合物，和
b.一种交联部分。
61.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有
a.权利要求1-38任一所述的组合物，和
b.一种或多种可检测分子，和
c.影响和/或检测(i)与抗原的结合的试剂和/或溶液。
62.一种细胞毒性组合物，其特征在于，该组合物含有与细胞毒性剂可操纵性连接的权利要求1-38任一所述的组合物。
63.一种免疫学组合物，其特征在于，该组合物含有与免疫原性剂可操纵性连接的权利要求1-38任一所述的组合物。
64.一种杀伤细胞的方法，其特征在于，该方法包括使所述细胞接触与细胞毒性或免疫原性剂可操纵性连接的权利要求1-38任一所述的组合物。
65.与细胞毒性或免疫原性剂可操纵性连接的权利要求1-38任一所述的组合物用于制备治疗动物的药物制剂的用途。
66.一种含有多肽的组合物，其特征在于，该多肽含有至少一个基于抗体的的抗原结合域，所述抗原结合域具有与人MHC II型抗原1μM或以下的Kd结合的结合特异性，其中用所述多肽处理表达所述抗原的细胞，导致或引起免疫应答的抑制。
67.一种组合物，其含有多肽，该多肽是基于至少一种抗体的对人HLA DR抗原具有结合特异性的抗原结合域，其中用所述多肽处理表达HLA DR的细胞导致或引起免疫应答的抑制，其中所述抗原结合域包括VH结构域和VL结构域的组合，其中所述组合可在选自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
68.一种含有多肽的组合物，其特征在于，该多肽含有至少一个基于抗体的抗原结合域，所述抗原结合域具有与人MHC II型抗原以1μM或以下的Kd结合的结合特异性，所述抗原结合域是通过包括从重组抗体文库用与人MHC II型抗原的至少一个表位结合的能力分离出VL和VH结构域的方法分离的，其中用所述多肽处理表达MHC II型抗原的细胞，导致或引起免疫应答的抑制。
69.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，分离抗原结合域的方法还包括步骤：
a.产生VL和VH结合域之一或两者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一个的变体文库，和
b.用与人MHC II型家族抗原以1μM或以下的Kd结合的能力从变体文库中分离出VL和VH结构域；
c.可任选的，用至少一种另外的CDR1、CDR2和CDR3序列重复步骤(a)和(b)。
70.如权利要求67、68和69任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与HLA-DR结合。
71.如权利要求66或70任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与HLA-DR的β链结合。
72.如权利要求71所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与HLA-DR的β链的第一个结构域的表位结合。
73.如权利要求66-72任一所述的组合物，其特征在于，所述细胞是淋巴细胞。
74.如权利要求66-72任一所述的组合物，其特征在于，所述细胞是非淋巴细胞，并表达MHCII型抗原。
75.如权利要求66-74任一所述的组合物，其特征在于，该组合物具有1μM或以下的抑制免疫应答的IC50。
76.如权利要求66-74任一所述的组合物，其特征在于，该组合物具有1μM或以下的抑制IL-2分泌的IC50。
77.如权利要求66-74任一所述的组合物，其特征在于，该组合物具有1μM或以下的抑制免T细胞增殖的IC50。
78.如权利要求66-77任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与一种或多种选自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型结合。
79.如权利要求78所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与至少5种不同的所述HLA-DR类型结合。
80.如权利要求66-79任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括VH结构域和VL结构域的组合，其中所述组合可在MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
81.如权利要求66-77任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3在选自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
82.如权利要求66-77任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的组合，其中VH CDR3序列选自共有CDR3序列
n                        nnnRGnFDn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
其中VL CDR3选自共有CDR3序列
                         QSYDnnnn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。
83.如权利要求82所述的组合物，其特征在于，所述VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
84.如权利要求66-77任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域与包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1组合的抗体竞争抗原结合，其中VH CDR3序列选自共有CDR3序列
                         nnnnRGnFDn
每个n分别代表任何氨基酸残基；和/或
VL CDR3选自共有CDR3序列
                         QSYDnnnn
每个n分别代表任何氨基酸残基。
85.如权利要求84所述的组合物，其特征在于，VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
86.如权利要求66-85任一所述的组合物，其特征在于，所述抗原结合域包括用下列通式代表的VL CDR1序列：
                        SGSnnNIGnNYVn
其中每个n分别代表任何氨基酸残基。
87.如权利要求86所述的组合物，其特征在于，所述CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
88.如权利要求66-85任一所述的组合物，其特征在于，所述免疫应答的抑制是由在所述细胞表面表达的所述抗原表达的下调引起或表现的。
89.如权利要求66-85任一所述的组合物，其特征在于，所述免疫应答的抑制是由抑制所述细胞和其它细胞之间的作用引起或表现，其中所述作用通常导致免疫应答。
90.如权利要求66-85任一所述的组合物，其特征在于，所述免疫应答的抑制是由杀伤所述细胞引起或表现的。
91.如权利要求90所述的组合物，其特征在于，所述杀伤是通过多种抗原结合域的结合介导的，其中所述基于抗体的抗原结合域是多价多肽的部分，其中，不需要细胞毒性物质或免疫学机制来导致或引起所述杀伤。
92.如权利要求66-91任一所述的组合物，其特征在于，该组合物配制在药物可接受的载体和/或稀释剂中。
93.一种药物制剂，其含有量足够抑制动物中的免疫应答的权利要求75所述的组合物。
94.一种药物制剂，其含有量足够抑制动物中IL-2分泌的权利要求76所述的组合物。
95.一种药物制剂，其含有量足够抑制动物中T细胞增殖的权利要求76所述的组合物。
96.权利要求66-91任一所述的组合物用于制备治疗动物的药物制剂的用途，其中所述动物是人。
97.一种核酸，其含有权利要求66-91任一所述的组合物的多肽的蛋白质编码序列。
98.一种载体，其含有权利要求97所述的核酸和与其可操纵性连接的转录调节序列。
99.一种携带权利要求97所述的核酸或权利要求98所述的载体的宿主细胞。
100.一种产生免疫抑制组合物的方法，该方法包括在表达核酸的条件下培养权利要求99所述的细胞。
101.一种抑制例如表达HLA DR的免疫系统的细胞活化的方法，其包括用权利要求66-92任一所述的组合物处理细胞。
102.一种抑制例如表达HLA DR的免疫系统的细胞增殖的方法，其包括用权利要求66-92任一所述的组合物处理细胞。
103.一种抑制例如表达HLA DR的免疫系统的细胞分泌IL-2的方法，其包括用权利要求66-92任一所述的组合物处理细胞。
104.一种免疫抑制病人的方法，其包括对病人施用权利要求66-92任一所述的有效量的组合物，来降低病人的免疫应答水平。
105.一种杀死在所述细胞表面表达抗原的细胞的方法，其包括步骤：用权利要求66-87任一所述的多种抗原结合域处理细胞，其中所述基于抗体的抗原结合域是多价多肽的部分，其中不需要细胞毒性物质或免疫学机制导致或引起所述杀伤，所述抗原是HLA DR。
106.如权利要求96所述的用途，其特征在于，所述治疗是治疗选自类风湿性关节炎、幼年期关节炎、多发性硬化、Grave氏病、胰岛素依赖性糖尿病、发作性睡病、牛皮癣、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重症肌无力、慢性天疱疮、肾小球肾炎、甲状腺炎、胰腺炎、胰岛炎、原发性胆汁性肝硬化、刺激性肠病和Sjogren综合征的疾病。
107.如权利要求96所述的用途，其特征在于，所述治疗是治疗选自重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化、移植排斥和移植物抗宿主病的疾病。
108.一种抑制免疫系统的细胞和另一种细胞相互作用的方法，其包括使细胞接触权利要求66-92任一所述的组合物。
109.一种进行药物商业活动的方法，其特征在于，该方法包括：
(i)分离一种或多种抗原结合域，这些抗原结合域与人细胞表面表达的抗原结合；
(ii)产生多价组合物，例如多价多肽，它含有多个所述抗原结合域，其中多价组合物以50nM或以下的EC50杀伤表达所述抗原的转化或活化的细胞，其中不需要细胞毒性或免疫学机制来导致或引起所述杀伤；
(iii)进行多价组合物在动物中效力和毒性的测量；
(iv)制备描述所述组合物免疫抑制治疗用途的包装插页；和
(v)出售所述多价组合物用于治疗增殖疾病。
110.一种进行生命科学商业活动的方法，其包括：
(i)分离一种或多种抗原结合域，这些抗原结合域与人细胞表面的抗原结合；
(ii)产生含有多种所述抗原结合域的多价组合物，例如多价多肽，产生多价组合物，例如多价多肽，它含有多种所述多价多肽，其中多价组合物以50nM或以下的EC50杀伤表达所述抗原的转化或活化的细胞，所述杀伤不需要细胞毒性或免疫学机制；
(iii)对第三方授权，与第三方共同开发或出售给第三方出售所述组合物的权利。
111.如权利要求109或110所述的方法，其特征在于，用一种方法分离抗原结合域，包括
a.从重组抗体文库用与HLA DR结合的能力分离人组合物的VL和VH结构域，
b.产生VL和VH结构域之一或两者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一个的变体文库，和
c.从变体文库用与HLA DR以1μM或以下的Kd结合的能力分离VL和VH结构域。
112.一种进行药物商业活动的方法，其特征在于：
(i)分离一种或多种抗原结合域，这些抗原结合域与人细胞表面表达的MHC II型以1μM或以下的Kd结合；
(ii)产生含有所述抗原结合域的组合物，该组合物是具有100nM或以下的IC50的免疫抑制剂；
(iii)进行所述组合物在动物中效力和毒性的测量；
(iv)制备描述所述组合物免疫抑制治疗用途的包装插页；和
(v)出售所述组合物用作免疫调节剂。
113.一种进行生命科学商业活动的方法，其包括：
(i)分离一种或多种抗原结合域，这些抗原结合域以1μM或以下的Kd与人细胞表面的MHC II型结合；
(ii)产生含有所述抗原结合域的组合物，组合物是具有100nM或以下的IC50的免疫抑制剂；
(iii)对第三方授权，与第三方共同开发或出售给第三方出售所述组合物的权利。
114.如权利要求112或113所述的方法，其特征在于，用一种方法分离基于抗体的抗原结合域，包括
a.从重组抗体文库用与HLA DR结合的能力分离人组合物的VL和VH结构域，
b.产生VL和VH结构域之一或两者的CDR1、CDR2和CDR3序列至少一个的变体文库，和
c.从变体文库用与HLA DR以1μM或以下的Kd结合的能力分离VL和VH结构域。
115.如权利要求109-114任一所述的方法，其特征在于，所述抗原结合域包括VH和VL结构域的组合，其中所述组合可在MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
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