JP2003514831A - 抗原ＩＯＲＣ２を認識する抗体およびＦｖフラグメント - Google Patents
抗原ＩＯＲＣ２を認識する抗体およびＦｖフラグメントInfo
- Publication number
- JP2003514831A JP2003514831A JP2001538974A JP2001538974A JP2003514831A JP 2003514831 A JP2003514831 A JP 2003514831A JP 2001538974 A JP2001538974 A JP 2001538974A JP 2001538974 A JP2001538974 A JP 2001538974A JP 2003514831 A JP2003514831 A JP 2003514831A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- chain
- ior
- heavy
- light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、ブタペスト条約に基づきECCC 97061101の番号で預託されたハイブリドーマにより造られるネズミＩＯＲ Ｃ５抗体から、新規組換え抗体を得る方法に関するものである。当該組換え抗体は、組換えＤＮＡ技術を使用することにより得られ、抗原ｉｏｒ Ｃ２を認識することにより特徴付けられる。当該組換え抗体は、特にキメラ抗体，ヒト化抗体，および単一鎖Ｆｖフラグメントである。当該キメラ抗体は、ネズミ免疫グロブリンの可変ドメインおよびヒト免疫グロブリンの定常部領域を含んでいる。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常部領域を含み、特にＴ細胞の抗原サイトとなり得るネズミのフレームワーク領域（ＦＲ）に修飾が加えられている。Ｆｖフラグメントはネズミ免疫グロブリンの可変ドメインを含んでいる。本発明は、ネズミのｉｏｒ Ｃ５抗体から誘導された組換え抗体を、直結腸腫瘍，その転移および再発の診断および治療に使用する方法に関するものでもある。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、バイオテクノロジーの分野，特に遺伝子工学技術，詳しくはネズミ
のIOR C5抗体から得られるior C2抗原（正常直結腸細胞および悪性直結腸細胞の
中に発現する糖タンパク質錯体として特徴付けられる）中に発現したエピトープ
を認識するキメラ抗体，ヒト化抗体および単一鎖Ｆvフラグメントを使用して得
られる、新しい組換え抗体を使用するバイオテクノロジー分野に関するものであ
る。
のIOR C5抗体から得られるior C2抗原（正常直結腸細胞および悪性直結腸細胞の
中に発現する糖タンパク質錯体として特徴付けられる）中に発現したエピトープ
を認識するキメラ抗体，ヒト化抗体および単一鎖Ｆvフラグメントを使用して得
られる、新しい組換え抗体を使用するバイオテクノロジー分野に関するものであ
る。
【０００２】
（発明の背景）
これらの組換え抗体は、種々の直結腸癌腫の治療にテストされてきた。しかし
、今日に至るまで、これらの癌腫を直す方法は手術を置いて他には無いのが現状
である。当該腫瘍が早期に発見された場合、手術を行うことにより患者の生存率
を延ばすことができる。しかし不幸にして、診断されたときには既に転移してし
まっている場合が多い。
、今日に至るまで、これらの癌腫を直す方法は手術を置いて他には無いのが現状
である。当該腫瘍が早期に発見された場合、手術を行うことにより患者の生存率
を延ばすことができる。しかし不幸にして、診断されたときには既に転移してし
まっている場合が多い。
【０００３】
この病気が内蔵の外層まで広がっておらず、まだ手術により直せる段階におい
ては、診断，治療および疫学的方法により、患者の生存率を高めることができる
。従って、疫学的要因に関する知識および新しい治療方法を開発することにより
、患者の生存率を高めることができる。
ては、診断，治療および疫学的方法により、患者の生存率を高めることができる
。従って、疫学的要因に関する知識および新しい治療方法を開発することにより
、患者の生存率を高めることができる。
【０００４】
近年において、モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）又はそのフラグメントを放射
性同位元素で標識化し、免疫ガンマグラフ法による癌の検出に使用する方法が用
いられてきた。Ｍａｂｓは、放射性同位元素の担体としてこれを使用することが
でき、腫瘍抗原を狙ってこれと結合させることができることが明らかになってい
る。
性同位元素で標識化し、免疫ガンマグラフ法による癌の検出に使用する方法が用
いられてきた。Ｍａｂｓは、放射性同位元素の担体としてこれを使用することが
でき、腫瘍抗原を狙ってこれと結合させることができることが明らかになってい
る。
【０００５】
放射能で標識化した抗体のあるものは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と結合した腫
瘍を検出する目的で使用された。ＣＥＡをつくり出す腫瘍又はこの標識と結合し
た腫瘍を検出するには、Ｉ-131又はＩ-125で標識化した抗ＣＥＡ抗体が使用され
る（米国特許第3,663,684号, 米国特許第3,867,363号, および米国特許第3,927,
193号）。又、ＭａｂをTc-99mで標識化して、「生体内」診断用の分子を得るこ
ともできる。
瘍を検出する目的で使用された。ＣＥＡをつくり出す腫瘍又はこの標識と結合し
た腫瘍を検出するには、Ｉ-131又はＩ-125で標識化した抗ＣＥＡ抗体が使用され
る（米国特許第3,663,684号, 米国特許第3,867,363号, および米国特許第3,927,
193号）。又、ＭａｂをTc-99mで標識化して、「生体内」診断用の分子を得るこ
ともできる。
【０００６】
ケーラーおよびミルスタインによるハイブリドーマ抗体技術の開発は、免疫化
学の法則に革命をもたらし、病気の研究および臨床診断に使用し得る一連の新し
い試薬を提供した（Kohler G., Milstein C.; Nature 256, 495-497, 1975）。
これらの抗体は治療には余り有効ではなかったが、基礎研究および臨床診断に使
用されるマウスのモノクローナル抗体（ｍＡｂs）の製造に日常的に使用される
ようになった。しかし、ヒトの体内ではこれらの半減期が短縮され、マウス抗体
エフェクタードメインがヒトの免疫系に認識されにくく、又異質な免疫グロブリ
ンでも治療を妨害する可能性のある抗グロブリン反応（ＨＡＭＡ反応）を引き出
すことができるために、これらを「生体内」の免疫治療に使用するのは困難であ
った。
学の法則に革命をもたらし、病気の研究および臨床診断に使用し得る一連の新し
い試薬を提供した（Kohler G., Milstein C.; Nature 256, 495-497, 1975）。
これらの抗体は治療には余り有効ではなかったが、基礎研究および臨床診断に使
用されるマウスのモノクローナル抗体（ｍＡｂs）の製造に日常的に使用される
ようになった。しかし、ヒトの体内ではこれらの半減期が短縮され、マウス抗体
エフェクタードメインがヒトの免疫系に認識されにくく、又異質な免疫グロブリ
ンでも治療を妨害する可能性のある抗グロブリン反応（ＨＡＭＡ反応）を引き出
すことができるために、これらを「生体内」の免疫治療に使用するのは困難であ
った。
【０００７】
遺伝子工学が開発されて抗体遺伝子を遺伝子操作し，ｍＡｂｓを造る能力が革
命的な進歩を遂げた。そのために抗原性を低下させ又は完全これを除去すること
ができるようになった。従って病変の種類によっては、その治療又は診断にこれ
らの抗体を使用することにより、希望するエフェクター機能を高めることができ
たのである。これらの操作は、ネズミのｍＡｂを同じ抗原結合性を有する主にヒ
ト型のｍＡｂに変換できる場合には、ヒトのｍＡｂに代わる治療又は診断の方法
を提供できるようになった（Morrison S.L.ら, P.N.A.S. USA 81, 6851-6855, 1
984）。
命的な進歩を遂げた。そのために抗原性を低下させ又は完全これを除去すること
ができるようになった。従って病変の種類によっては、その治療又は診断にこれ
らの抗体を使用することにより、希望するエフェクター機能を高めることができ
たのである。これらの操作は、ネズミのｍＡｂを同じ抗原結合性を有する主にヒ
ト型のｍＡｂに変換できる場合には、ヒトのｍＡｂに代わる治療又は診断の方法
を提供できるようになった（Morrison S.L.ら, P.N.A.S. USA 81, 6851-6855, 1
984）。
【０００８】
最近、ネズミ又はラットの抗体をヒト型に変換させてヒトに使用した場合、異
種タンパク質の拒絶反応を抑える方法が幾つか開発された。
種タンパク質の拒絶反応を抑える方法が幾つか開発された。
【０００９】
抗原性を弱める最初の試みの一つは、「キメラ」抗体を造ることであった。こ
れらの分子はヒト型に変換されているので、ヒトの免疫系がこれを認識すること
ができる。従って、ヒトのフレームワークの中へその可変ドメインを挿入するこ
とにより、ヒトの免疫力を弱めるだけでなく、そのエフェクター機能も改善する
ことができたのである（Morrison S.L.ら, P.N.A.S USA 81, 6851-6855, 1984）
。これらのキメラ分子は元の抗原の認識力を維持しており、その定常部領域に免
疫性は無い。しかし、ネズミの可変部領域に対する免疫性は維持されている。
れらの分子はヒト型に変換されているので、ヒトの免疫系がこれを認識すること
ができる。従って、ヒトのフレームワークの中へその可変ドメインを挿入するこ
とにより、ヒトの免疫力を弱めるだけでなく、そのエフェクター機能も改善する
ことができたのである（Morrison S.L.ら, P.N.A.S USA 81, 6851-6855, 1984）
。これらのキメラ分子は元の抗原の認識力を維持しており、その定常部領域に免
疫性は無い。しかし、ネズミの可変部領域に対する免疫性は維持されている。
【００１０】
他の報告者らは、可変ドメイン全体ではなく抗原結合サイトだけをネズミの抗
体から移植することにより、齧歯動物の抗原結合サイトをヒトの抗体の中へ直接
構築することを試みた（Jones P.T.ら, Nature 321, 522-524, 1986; Verhoeyen
M.ら, Science 239, 1534-1536, 1988）。これらの方法は、Rietchmannの方法
（Rietchmann L.ら, Nature 332, 323-327, 1988; Quee C.ら, P.N.A.S. USA 86
, 10029-10033, 1989）に修飾を加えることにより開発されたものであった。し
かし、他の報告者らは抗体を変形させることを研究した。これらの変形抗体には
、ヒトのＦＲにネズミの残基を植えて元の抗原に対する親和力を回復させたもの
などが含まれていた（Tempest, P.R., Biotechnology 9, 266-272, 1991）。
体から移植することにより、齧歯動物の抗原結合サイトをヒトの抗体の中へ直接
構築することを試みた（Jones P.T.ら, Nature 321, 522-524, 1986; Verhoeyen
M.ら, Science 239, 1534-1536, 1988）。これらの方法は、Rietchmannの方法
（Rietchmann L.ら, Nature 332, 323-327, 1988; Quee C.ら, P.N.A.S. USA 86
, 10029-10033, 1989）に修飾を加えることにより開発されたものであった。し
かし、他の報告者らは抗体を変形させることを研究した。これらの変形抗体には
、ヒトのＦＲにネズミの残基を植えて元の抗原に対する親和力を回復させたもの
などが含まれていた（Tempest, P.R., Biotechnology 9, 266-272, 1991）。
【００１１】
Mateoら（米国特許第5,712,120号）は、ネズミの抗体について、その免疫性を
低下させる手順について述べている。この手順においては、その修飾を可変ドメ
イン，特にネズミのキメラ抗体フレームワークに限定した。さらに、これらの修
飾は両親媒性のラセン構造を有するＦＲ領域においてのみ実施されたので、潜在
的なエピトープがＴ細胞により認識され得た。この方法は、両親媒性領域内のネ
ズミ残基をヒト免疫グロブリンの同じ位置のアミノ酸，即ちこの結合サイトの三
次元構造に含まれるアミノ酸により代替できることは勿論である。このことは、
ベミール領域，ＣＤＲsのカノン（canonical）構造および軽鎖と重鎖の相間に存
在するアミノ酸が排除されることを意味している。
低下させる手順について述べている。この手順においては、その修飾を可変ドメ
イン，特にネズミのキメラ抗体フレームワークに限定した。さらに、これらの修
飾は両親媒性のラセン構造を有するＦＲ領域においてのみ実施されたので、潜在
的なエピトープがＴ細胞により認識され得た。この方法は、両親媒性領域内のネ
ズミ残基をヒト免疫グロブリンの同じ位置のアミノ酸，即ちこの結合サイトの三
次元構造に含まれるアミノ酸により代替できることは勿論である。このことは、
ベミール領域，ＣＤＲsのカノン（canonical）構造および軽鎖と重鎖の相間に存
在するアミノ酸が排除されることを意味している。
【００１２】
Mateoらによる方法で修飾された抗体は、元の抗体を認識する認識能力および
抗原に対する結合力を維持しているので免疫性が弱まっており、そのために治療
効果が高まっている。この手順を使用すれば、ほんの２−３の突然変異を行わせ
るだけで、キメラ抗体に比べて免疫性の低い修飾抗体を得ることができる。
抗原に対する結合力を維持しているので免疫性が弱まっており、そのために治療
効果が高まっている。この手順を使用すれば、ほんの２−３の突然変異を行わせ
るだけで、キメラ抗体に比べて免疫性の低い修飾抗体を得ることができる。
【００１３】
IOR C5ネズミ モノクローナル抗体（特許出願番号 WO 97/33916）は、Balb/c
をSW1116細胞（直結腸腺癌）で免疫化することにより得られ、悪性および正常直
結腸細胞の表面および細胞質に優先的に発現した抗体により認識されるＩｇＧ１
イソタイプである。この抗体はＣＥＡ，ルイスａ，ルイスｂ，アシアリル化ルイ
ス，正常な単核細胞抗体膜，赤血球のいずれも認識しない（Vazquez A.M.ら, Hy
bridoma 11, 245-256, 1992）。
をSW1116細胞（直結腸腺癌）で免疫化することにより得られ、悪性および正常直
結腸細胞の表面および細胞質に優先的に発現した抗体により認識されるＩｇＧ１
イソタイプである。この抗体はＣＥＡ，ルイスａ，ルイスｂ，アシアリル化ルイ
ス，正常な単核細胞抗体膜，赤血球のいずれも認識しない（Vazquez A.M.ら, Hy
bridoma 11, 245-256, 1992）。
【００１４】
SW1116膜のエキスを使用してウェスタンブロット試験を行ったところ、この抗
体はior C2と呼ばれる２つの分子量型（145および190 Kda）を有する糖タンパク
質錯体を認識することが明らかになった（Vazquez A.M.ら, Year Immunol. Base
l Karger, vol.7, 137-145, 1993）。
体はior C2と呼ばれる２つの分子量型（145および190 Kda）を有する糖タンパク
質錯体を認識することが明らかになった（Vazquez A.M.ら, Year Immunol. Base
l Karger, vol.7, 137-145, 1993）。
【００１５】
遺伝子工学の手法を使用して、組換えフラグメントをモノクローナル抗体から
構築できることも当分野では良く知られている。「生体内」における病気の診断
および治療で、異なる抗体フラグメントを使用することの正当性を認める報告が
数多く発表されている。
構築できることも当分野では良く知られている。「生体内」における病気の診断
および治療で、異なる抗体フラグメントを使用することの正当性を認める報告が
数多く発表されている。
【００１６】
Ira Pastanら（EP 0796334 A1）は、特にルイスＹ抗原関連炭水化物を認識す
る抗体の可変領域を使用して、単一鎖Ｆvフラグメントを構築する方法について
述べている。これらのフラグメントを使用して、彼はこの抗原を持つ細胞を検出
する方法を開発した。又彼は、これらのフラグメントが、当該抗体を持つ細胞に
対して抑制効果を有することを示している。
る抗体の可変領域を使用して、単一鎖Ｆvフラグメントを構築する方法について
述べている。これらのフラグメントを使用して、彼はこの抗原を持つ細胞を検出
する方法を開発した。又彼は、これらのフラグメントが、当該抗体を持つ細胞に
対して抑制効果を有することを示している。
【００１７】
（発明の開示）
本発明は、遺伝子工学技術，特にキメラ抗体，ヒト化抗体およびネズミの抗体
であるIOR C5抗体から得られる単一鎖Ｆvフラグメントを使用して得られ、ブタ
ペスト条約に基づいてECCC97061101のアクセス番号で、1997年６月11日に細胞培
養組織ヨーロッパコレクションに預託された、これと同じ名称のハイブリドーマ
により製造される組換え抗体に関するものである。この抗体はior C2抗体（正常
および悪性直結腸細胞に発現する糖タンパク質錯体）の中に発現したエピトープ
を認識する。
であるIOR C5抗体から得られる単一鎖Ｆvフラグメントを使用して得られ、ブタ
ペスト条約に基づいてECCC97061101のアクセス番号で、1997年６月11日に細胞培
養組織ヨーロッパコレクションに預託された、これと同じ名称のハイブリドーマ
により製造される組換え抗体に関するものである。この抗体はior C2抗体（正常
および悪性直結腸細胞に発現する糖タンパク質錯体）の中に発現したエピトープ
を認識する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
ネズミＣ５可変領域のｃＤＮＡ合成および遺伝子増幅
モノクローナル抗体Ｃ５のハイブリドーマ細胞約106個から細胞質ＲＮＡを抽
出した（Vazquez A.M.ら, Year Immunol. Basel, Karger vol.7, 137-145, 1993
）。ＲＮＡの抽出に使用したのは、Faloroら（Faloro, J. Treisman, R.およびK
emen R, Methods in Enzymology 65: 718-749, 1989）による方法であった。ｃ
ＤＮＡの合成反応には、合計容積50 μlに対してＲＮＡ ５ μg，デオキシヌク
レオチド抑制剤（ｄＮＴＰs）各 2.5 mM，トリスＨＣｌ（ｐＨ＝7.5）50 mM，Ｋ
Ｃｌ 75 mM，ＤＴＴ 10 mM，ＭｇＣl2 ８ mMおよびリボヌクレアーゼ抑制剤（Ｒ
ＮＡガード，Pharmacia社）15 uを使用した。当該ＲＮＡは、ネズミＩｇＧ１定
常部領域開始部分およびネズミ軽鎖定常カッパ領域にハイブリッド化させるため
に設計したプライマー 25 pmolを使用して得たものである。サンプルを70 ℃で1
0分間加熱し、30分かけてゆっくりと37 ℃に冷却した。次に、逆トランスクリプ
ターゼ100単位を添加し、42 ℃で１分間インキュベートした。
出した（Vazquez A.M.ら, Year Immunol. Basel, Karger vol.7, 137-145, 1993
）。ＲＮＡの抽出に使用したのは、Faloroら（Faloro, J. Treisman, R.およびK
emen R, Methods in Enzymology 65: 718-749, 1989）による方法であった。ｃ
ＤＮＡの合成反応には、合計容積50 μlに対してＲＮＡ ５ μg，デオキシヌク
レオチド抑制剤（ｄＮＴＰs）各 2.5 mM，トリスＨＣｌ（ｐＨ＝7.5）50 mM，Ｋ
Ｃｌ 75 mM，ＤＴＴ 10 mM，ＭｇＣl2 ８ mMおよびリボヌクレアーゼ抑制剤（Ｒ
ＮＡガード，Pharmacia社）15 uを使用した。当該ＲＮＡは、ネズミＩｇＧ１定
常部領域開始部分およびネズミ軽鎖定常カッパ領域にハイブリッド化させるため
に設計したプライマー 25 pmolを使用して得たものである。サンプルを70 ℃で1
0分間加熱し、30分かけてゆっくりと37 ℃に冷却した。次に、逆トランスクリプ
ターゼ100単位を添加し、42 ℃で１分間インキュベートした。
【００１９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して軽鎖（ＶＫ）および重鎖（ＶＨ）
の可変領域を増幅した。これについて簡単に説明する。即ち、ＶＨ又はＶＫのｃ
ＤＮＡ ５ μlを特定プライマー25 pmol，ｄＮＴＰ各2.5 mM，ＤＮＡポリメラー
ゼ酵素に対して10倍量の緩衝液５ μlおよびＤＮＡポリメラーゼ酵素１単位と混
合した。当該サンプルに94 ℃−30秒，50 ℃−30秒，72 ℃−１分の熱サイクル
を25回与え、最後に72 ℃で５分間インキュベートした。
の可変領域を増幅した。これについて簡単に説明する。即ち、ＶＨ又はＶＫのｃ
ＤＮＡ ５ μlを特定プライマー25 pmol，ｄＮＴＰ各2.5 mM，ＤＮＡポリメラー
ゼ酵素に対して10倍量の緩衝液５ μlおよびＤＮＡポリメラーゼ酵素１単位と混
合した。当該サンプルに94 ℃−30秒，50 ℃−30秒，72 ℃−１分の熱サイクル
を25回与え、最後に72 ℃で５分間インキュベートした。
【００２０】
（増幅ｃＤＮＡのクローン化および配列の決定）
精製したＶＨおよびＶＫ ｃＤＮＡをＴＡベクターの中へクローン化した（Ｔ
Ａクローン化用キット；Promega社, 米国）。ジデオキシ法により、T7 DNA Pol
（Pharmacia社, スウェーデン）を使用して、得られたクローンの配列決定を行
った。
Ａクローン化用キット；Promega社, 米国）。ジデオキシ法により、T7 DNA Pol
（Pharmacia社, スウェーデン）を使用して、得られたクローンの配列決定を行
った。
【００２１】
（キメラ遺伝子の構築）
酵素抑制法により、ＴＡベクターから軽鎖および重鎖の可変領域を得て、これ
を発現ベクターの中にクローン化した（Coloma M.J.ら, Journal of Immunologi
cal Methods 152, 89-104, 1992）。
を発現ベクターの中にクローン化した（Coloma M.J.ら, Journal of Immunologi
cal Methods 152, 89-104, 1992）。
【００２２】
ＥｃｏＲＶおよびネール消化法によりＶＨ遺伝子をＴＡベクターから切り取り
、これをPAH 4604発現ベクターの中にクローン化し、ヒト定常ＩｇＧ１およびヒ
スチジノール抵抗遺伝子をその中に含めた。
、これをPAH 4604発現ベクターの中にクローン化し、ヒト定常ＩｇＧ１およびヒ
スチジノール抵抗遺伝子をその中に含めた。
【００２３】
この反応により得られる構造はC5VH-PAH4604である。当該ＶＫ遺伝子をＴＡの
ＥｃｏＲＶから切り取り、Ｓａｌｌ消化を行い、PAG4622の中にクローン化した
。このベクターはｇｐｔへの抵抗部分および使用済のヒト カッパ定常部領域を
含んでいる。得られる構造はC5VK-PAG4622である。
ＥｃｏＲＶから切り取り、Ｓａｌｌ消化を行い、PAG4622の中にクローン化した
。このベクターはｇｐｔへの抵抗部分および使用済のヒト カッパ定常部領域を
含んでいる。得られる構造はC5VK-PAG4622である。
【００２４】
（キメラ抗体の発現）
ＮＳＯ細胞をC5VH-PAH4604 10 μgおよびC5VK-PAG4622 10 μgとともに電気泳
動にかけ、Ｐｖｕｌ消化により線状化した。当該ＤＮＡを混ぜ合わせ、エタノー
ルを加えて沈殿させ、水 25 μl中に溶解させた。ＮＳＯ細胞約107個を半集合状
態になるまで生育し、遠心分離して収穫し、電気泳動キュベットの中でＤＭＥＮ
0.5 ml中に消化ＤＮＡとともに再懸濁させた。氷の上で５分間冷却した後、当
該細胞に170ボルト，960 μFのパルスを加え、氷の上でさらに30分間放冷した。
次に、当該細胞をＤＭＥＮ＋10％胎児子牛血清に加え、48時間後に回収した。こ
の時点で、当該細胞を96ウェル（well）のプレート中に配分し、選択媒体をこれ
に加えた（ＤＭＥＮ，10％胎児子牛血清，マイコフェノール酸 0.8 μg/ml，キ
サンチン 250 μg/ml）。10日後に、トランスフェクトしたクローンを裸眼で見
ることができた。
動にかけ、Ｐｖｕｌ消化により線状化した。当該ＤＮＡを混ぜ合わせ、エタノー
ルを加えて沈殿させ、水 25 μl中に溶解させた。ＮＳＯ細胞約107個を半集合状
態になるまで生育し、遠心分離して収穫し、電気泳動キュベットの中でＤＭＥＮ
0.5 ml中に消化ＤＮＡとともに再懸濁させた。氷の上で５分間冷却した後、当
該細胞に170ボルト，960 μFのパルスを加え、氷の上でさらに30分間放冷した。
次に、当該細胞をＤＭＥＮ＋10％胎児子牛血清に加え、48時間後に回収した。こ
の時点で、当該細胞を96ウェル（well）のプレート中に配分し、選択媒体をこれ
に加えた（ＤＭＥＮ，10％胎児子牛血清，マイコフェノール酸 0.8 μg/ml，キ
サンチン 250 μg/ml）。10日後に、トランスフェクトしたクローンを裸眼で見
ることができた。
【００２５】
プレートウェルの媒体中に存在するトランスフェクト クローンを含むヒト抗
体を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。マイクロタイタープレートウェルを、〔ＰＢＳ
Ｔ（Tween 20, ｐＨ＝7.5, 0.02％を含む燐酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄した後
で〕ヤギの抗ヒト抗体（ガンマ鎖固有抗体）で被覆した後、37 ℃で１時間かけ
、プレートウェルからトランスフェクト物を含む培養媒体 100 μlを各マイクロ
タイターウェルに加えた。当該マイクロタイターウェルをＰＢＳＴで洗浄し、軽
鎖固有共役ヤギ抗ヒト カッパを添加し、室温で１時間インキュベートした。次
に当該マイクロタイターウェルをＰＢＳＴおよびジエタノールアミンを添加した
基質緩衝液で洗浄した。30分後、波長 405 nmにおける吸光度を測定した。
体を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。マイクロタイタープレートウェルを、〔ＰＢＳ
Ｔ（Tween 20, ｐＨ＝7.5, 0.02％を含む燐酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄した後
で〕ヤギの抗ヒト抗体（ガンマ鎖固有抗体）で被覆した後、37 ℃で１時間かけ
、プレートウェルからトランスフェクト物を含む培養媒体 100 μlを各マイクロ
タイターウェルに加えた。当該マイクロタイターウェルをＰＢＳＴで洗浄し、軽
鎖固有共役ヤギ抗ヒト カッパを添加し、室温で１時間インキュベートした。次
に当該マイクロタイターウェルをＰＢＳＴおよびジエタノールアミンを添加した
基質緩衝液で洗浄した。30分後、波長 405 nmにおける吸光度を測定した。
【００２６】
（Ｔエピトープのヒト化によるヒト化ＩＯＲ Ｃ５ｈの構築）
Ｔエピトープの予測
ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、ＩＯＲ Ｃ５の可変領域配列を分析した。
このプログラムでは、長さがアミノ酸数７個又は11個の両親媒性ラセン構造を有
する配列セグメントを予測することができる。当該両親媒性ラセン構造は、Ｔ免
疫性に関連する構造である。ＳＯＨＨＡプログラムも使用したが、このプログラ
ムでは、疎水性ラセン構造を予測することができる（Elliotら, J. Immunol. 13
8, 2949-2952, 1987）。これらのアルゴリズムはＩＯＲＣ５の軽可変領域および
重可変領域におけるＴエピトープの発現に関連するフラグメントの予測を行うこ
とができる。
このプログラムでは、長さがアミノ酸数７個又は11個の両親媒性ラセン構造を有
する配列セグメントを予測することができる。当該両親媒性ラセン構造は、Ｔ免
疫性に関連する構造である。ＳＯＨＨＡプログラムも使用したが、このプログラ
ムでは、疎水性ラセン構造を予測することができる（Elliotら, J. Immunol. 13
8, 2949-2952, 1987）。これらのアルゴリズムはＩＯＲＣ５の軽可変領域および
重可変領域におけるＴエピトープの発現に関連するフラグメントの予測を行うこ
とができる。
【００２７】
可変領域の相同性分析
ＩＯＲＣ５の可変ドメインをヒトの対応可変ドメインと比較し、ヒトの分子で
ネズミの分子と最も相同性の高い分子が何であるかを突き止める。ここで使用し
たヒトの配列データベースは、Ｇｅｎｅ ＢａｎｋおよびＥＭＢＬに報告された
ものであり、これら両機関における登録は、インターネットで閲覧することがで
きる。比較は、自動コンピュータ法，PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00（日立）を使
用して行った。
ネズミの分子と最も相同性の高い分子が何であるかを突き止める。ここで使用し
たヒトの配列データベースは、Ｇｅｎｅ ＢａｎｋおよびＥＭＢＬに報告された
ものであり、これら両機関における登録は、インターネットで閲覧することがで
きる。比較は、自動コンピュータ法，PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00（日立）を使
用して行った。
【００２８】
免疫性低下分析
この方法の本質は、可能なＴ細胞エピトープを、ＦＲ，特に架橋サイトの三次
元構造に関与する位置を除く両親媒性のラセン構造中のＦＲにほんの少量の突然
変異を導入することによりこれをヒト化させ、その免疫性を低下させることにあ
る。
元構造に関与する位置を除く両親媒性のラセン構造中のＦＲにほんの少量の突然
変異を導入することによりこれをヒト化させ、その免疫性を低下させることにあ
る。
【００２９】
この方法では、ネズミ免疫グロブリンのＶＨ領域およびＶＫ領域を、これと最
も相同性の高いヒト免疫グロブリン配列と比較する。この方法により、ＦＲゾー
ン内の両親媒性領域内のみにおいて、ネズミの配列とヒトの配列の間で異なる残
基が何であるかを確かめることができる〔Kabat E., 免疫性関連タンパク質の配
列（第５版）, 国立衛生協会（Sequences of proteins of immunological inter
est, Fifth Edition, National Institute of Health）, 1991〕。これらのネズ
ミ残基のみが、同位置におけるヒトの配列により免疫化されるものと考えられる
。
も相同性の高いヒト免疫グロブリン配列と比較する。この方法により、ＦＲゾー
ン内の両親媒性領域内のみにおいて、ネズミの配列とヒトの配列の間で異なる残
基が何であるかを確かめることができる〔Kabat E., 免疫性関連タンパク質の配
列（第５版）, 国立衛生協会（Sequences of proteins of immunological inter
est, Fifth Edition, National Institute of Health）, 1991〕。これらのネズ
ミ残基のみが、同位置におけるヒトの配列により免疫化されるものと考えられる
。
【００３０】
マウスのフレームワーク構造内に存在し，カノン性構造に関係のあるこれらの
残基、又はヴェルニエ ゾーンに含まれるこれらの残基は、三次構造および結合
サイトに対して著しい影響を及ぼす可能性が高いので、これらの残基を突然変異
させることはできない。当該三次構造の置換に関する詳細な情報は、可変領域の
三次元分子モデルを実行することにより得られるものと考えられる。
残基、又はヴェルニエ ゾーンに含まれるこれらの残基は、三次構造および結合
サイトに対して著しい影響を及ぼす可能性が高いので、これらの残基を突然変異
させることはできない。当該三次構造の置換に関する詳細な情報は、可変領域の
三次元分子モデルを実行することにより得られるものと考えられる。
【００３１】
ヒト化ＩＯＲ Ｃ５抗体のＮＳＯ細胞内へのクローン化およびその発現
突然変異およびヒト化ＶＨおよびヒト化ＶＫを得るためにＰＣＲ重複を行い、
Ｔ細胞エピトープをヒト化することにより得られたＩＯＲ Ｃ５に対応する遺伝
子構造を、キメラ抗体の発現に使用した方法と類似の方法で発現ベクターの中へ
クローン化し、プラスミドＣ５Ｖｋｈｕ−ＰＡＧ４６２２およびＣ５Ｖｈｈｕ−
ＰＡＨ４６０４を生成させた。これら遺伝子のＮＳＯ細胞中へのトランスフェク
ションは、我々が前にキメラ抗体に関して述べた条件と全く同じ条件で実施した
。
Ｔ細胞エピトープをヒト化することにより得られたＩＯＲ Ｃ５に対応する遺伝
子構造を、キメラ抗体の発現に使用した方法と類似の方法で発現ベクターの中へ
クローン化し、プラスミドＣ５Ｖｋｈｕ−ＰＡＧ４６２２およびＣ５Ｖｈｈｕ−
ＰＡＨ４６０４を生成させた。これら遺伝子のＮＳＯ細胞中へのトランスフェク
ションは、我々が前にキメラ抗体に関して述べた条件と全く同じ条件で実施した
。
【００３２】
単一鎖Ｆvフラグメントの調製およびｓｃＦｖの構築およびその発現
この戦略には、ＰＣＲを使用してエンドヌクレアーゼ制限サイトを含むＶＨお
よびＶＬ配列を発現ベクターの中にクローン化するために修飾する第一増幅が含
まれる。当該増幅には、正確な配列上で設計したオリゴヌクレオチドを使用する
。増幅を行った後、可変領域を対応する制限酵素で精製して消化する。当該ＤＮ
Ａフラグメントを精製し、発現ベクターに結紮する。その後、これらの遺伝子構
造を従来法によりＥ．ｃｏｌｉ中で発現させる。
よびＶＬ配列を発現ベクターの中にクローン化するために修飾する第一増幅が含
まれる。当該増幅には、正確な配列上で設計したオリゴヌクレオチドを使用する
。増幅を行った後、可変領域を対応する制限酵素で精製して消化する。当該ＤＮ
Ａフラグメントを精製し、発現ベクターに結紮する。その後、これらの遺伝子構
造を従来法によりＥ．ｃｏｌｉ中で発現させる。
【００３３】
生産細胞由来のタンパク質を抽出する過程において超音波による開裂を実施し
、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル，ニトロセルロース移行物およびウェ
スタンブロットを結合している可溶性および不溶性の分画を分離することができ
る。
、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル，ニトロセルロース移行物およびウェ
スタンブロットを結合している可溶性および不溶性の分画を分離することができ
る。
【００３４】
（１）可溶性および不溶性物質を超音波および遠心分離により分離して当該タ
ンパク質の部分精製を行い；（２）低モル濃度の尿素中で洗浄して高濃度の尿素
中で可溶化することにより、当該タンパク質の部分精製を行う。アフィニティー
クロマトグラフィーにより、可溶化物質からタンパク質を金属イオンに精製する
。その後、当該タンパク質を緩衝液に対して再馴化する。
ンパク質の部分精製を行い；（２）低モル濃度の尿素中で洗浄して高濃度の尿素
中で可溶化することにより、当該タンパク質の部分精製を行う。アフィニティー
クロマトグラフィーにより、可溶化物質からタンパク質を金属イオンに精製する
。その後、当該タンパク質を緩衝液に対して再馴化する。
【００３５】
（例）
例１：キメラ モノクローナル抗体の取得
ハイブリドーマから抽出したＲＮＡからＶＨおよびＶＫ ｃＤＮＡを得て、逆
トランスクリプターゼ酵素を使用してモノクローナル抗体ＩＯＲ Ｃ５を製造し
た。下記の固有プライマーを使用した。 ＶＨに対して： 5'ＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡ（ＣＴ）ＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧ(ＡＧ)(ＡＧ) ＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ3' ＶＫに対して： 5'ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ3' Ｔａｑポリメラーゼ酵素によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、ＶＨ
用固有プライマーＥＣＯＲＶ／ＮＨＥＩ制限サイトおよびＶＫ用ＥＣＯＲＶ／Ｓ
ＡＬＩを使用して、ＶＨ鎖およびＶＫ鎖のＡＤＮｃを増幅した。当該固有プライ
マーの配列は下記の通りであった。 ＶＨに対して： オリゴヌクレオチド１： 5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴ ＣＴＴＣＴ3' オリゴヌクレオチド２： 5'ＴＧＧＧＴＣＧＡＣ(ＡＴ)ＧＡＴＧＧＧＧ(ＧＣ)ＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧ ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ3' ＶＫに対して： オリゴヌクレオチド１： 5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧ(ＧＴ)ＣＣＣＣ(ＡＴ)(ＧＡ)Ｃ ＴＣＡＧ(ＣＴ)Ｔ(ＣＴ)3' オリゴヌクレオチド２： 5'ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴ(ＴＧ)ＡＴＴＴＣＣＡ(ＧＡ)ＣＴＴ (ＧＴ)ＧＴＣＣＣ3'
トランスクリプターゼ酵素を使用してモノクローナル抗体ＩＯＲ Ｃ５を製造し
た。下記の固有プライマーを使用した。 ＶＨに対して： 5'ＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡ（ＣＴ）ＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧ(ＡＧ)(ＡＧ) ＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ3' ＶＫに対して： 5'ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ3' Ｔａｑポリメラーゼ酵素によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、ＶＨ
用固有プライマーＥＣＯＲＶ／ＮＨＥＩ制限サイトおよびＶＫ用ＥＣＯＲＶ／Ｓ
ＡＬＩを使用して、ＶＨ鎖およびＶＫ鎖のＡＤＮｃを増幅した。当該固有プライ
マーの配列は下記の通りであった。 ＶＨに対して： オリゴヌクレオチド１： 5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴ ＣＴＴＣＴ3' オリゴヌクレオチド２： 5'ＴＧＧＧＴＣＧＡＣ(ＡＴ)ＧＡＴＧＧＧＧ(ＧＣ)ＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧ ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ3' ＶＫに対して： オリゴヌクレオチド１： 5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧ(ＧＴ)ＣＣＣＣ(ＡＴ)(ＧＡ)Ｃ ＴＣＡＧ(ＣＴ)Ｔ(ＣＴ)3' オリゴヌクレオチド２： 5'ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴ(ＴＧ)ＡＴＴＴＣＣＡ(ＧＡ)ＣＴＴ (ＧＴ)ＧＴＣＣＣ3'
【００３６】
当該ＰＣＲ産物をＴＡベクター中にクローン化した（ＴＡクローン化キット，
Invitrogen社）。12個の独立クローンについて、ジデオキシ法により、Ｔ７ Ｄ
ＮＡ Ｐｏｌ（Pharmacia社）を使用してその配列を決定した。ＶＨおよびＶＫの
配列は、Ｋａｂａｔの下位グループ２と高度の関係を有している。
Invitrogen社）。12個の独立クローンについて、ジデオキシ法により、Ｔ７ Ｄ
ＮＡ Ｐｏｌ（Pharmacia社）を使用してその配列を決定した。ＶＨおよびＶＫの
配列は、Ｋａｂａｔの下位グループ２と高度の関係を有している。
【００３７】
次に、ＶＨ鎖をＥＣＯＲＶ／ＮＨＥＩに、又ＶＫ鎖をＥＣＯＲＶ／ＳＡＬＩに
消化させ、それぞれＰＡＨ４６０４およびＰＡＧ４６２２中にクローン化した。
これらのベクターは、Sherie Morrison（ＵＣＬＡ，米国カリホルニア州）が寄
付してくれた。これらのベクターは、免疫グロブリンを哺乳動物の細胞に発現さ
せるために使用される。ＰＡＨ４６０４ベクターには、ヒトの定常部領域ＩｇＧ
１を含み、ＰＡＧ４６２２はヒトＣｋ（ポリメラーゼ連鎖反応により発生する可
変領域を使用して抗体分子の発現に使用される新規ベクター；M. Josefina Colo
maら, Journal of Immunological Methods 152, 89-104, 1992）を含んでいた。
ＩＯＲ Ｃ５領域のクローン化後に得られた構造は、ＶＨＣ５−ＰＡＨ４６０４
およびＶＫＣ５−ＰＡＧ４６２２であった。
消化させ、それぞれＰＡＨ４６０４およびＰＡＧ４６２２中にクローン化した。
これらのベクターは、Sherie Morrison（ＵＣＬＡ，米国カリホルニア州）が寄
付してくれた。これらのベクターは、免疫グロブリンを哺乳動物の細胞に発現さ
せるために使用される。ＰＡＨ４６０４ベクターには、ヒトの定常部領域ＩｇＧ
１を含み、ＰＡＧ４６２２はヒトＣｋ（ポリメラーゼ連鎖反応により発生する可
変領域を使用して抗体分子の発現に使用される新規ベクター；M. Josefina Colo
maら, Journal of Immunological Methods 152, 89-104, 1992）を含んでいた。
ＩＯＲ Ｃ５領域のクローン化後に得られた構造は、ＶＨＣ５−ＰＡＨ４６０４
およびＶＫＣ５−ＰＡＧ４６２２であった。
【００３８】
ＮＳＯ細胞を、キメラ ベクターＣ５ＶＨ−ＰＡＨ４６０４ 10 μgおよびＣ５
ＶＫ−ＰＡＧ４６２２ 10 μgとともにエレクトロポレートし、Ｐｖｕｌで消化
することにより線状に伸ばした。当該ＤＮＡを混ぜ合わせて、メタノールを加え
て沈殿させ、水 25 μl中に溶解させた。ＮＳＯ細胞約107個を半集合状態になる
まで育成し、遠心分離して収穫し、消化ＤＮＡとともにエレクトロポレーション
用キュベットの中でＤＭＥＮ 0.5 ml中に再懸濁させた。氷で５分間冷却した後
、当該細胞に170ボルト，960 uFのパルスを加え、氷の中にさらに30分間放置し
た。次に当該細胞をＤＭＥＮ 20 ml＋10％胎児子牛血清の中に入れ、48時間回復
させた。この時点において、当該細胞を96ウェルのプレート上に分配し、これに
選択性溶媒（ＤＭＥＮ，10％胎児子牛血清，10 mMヒスチジノール）を添加した
。トランスフェクトしたクローンは、10日後に裸眼でこれを見ることができた。
ＶＫ−ＰＡＧ４６２２ 10 μgとともにエレクトロポレートし、Ｐｖｕｌで消化
することにより線状に伸ばした。当該ＤＮＡを混ぜ合わせて、メタノールを加え
て沈殿させ、水 25 μl中に溶解させた。ＮＳＯ細胞約107個を半集合状態になる
まで育成し、遠心分離して収穫し、消化ＤＮＡとともにエレクトロポレーション
用キュベットの中でＤＭＥＮ 0.5 ml中に再懸濁させた。氷で５分間冷却した後
、当該細胞に170ボルト，960 uFのパルスを加え、氷の中にさらに30分間放置し
た。次に当該細胞をＤＭＥＮ 20 ml＋10％胎児子牛血清の中に入れ、48時間回復
させた。この時点において、当該細胞を96ウェルのプレート上に分配し、これに
選択性溶媒（ＤＭＥＮ，10％胎児子牛血清，10 mMヒスチジノール）を添加した
。トランスフェクトしたクローンは、10日後に裸眼でこれを見ることができた。
【００３９】
トランスフェクトしたクローンを含むプレートウェルの媒体中におけるキメラ
抗体の存在量をＥＬＩＳＡにより測定した。マイクロタイター プレートウェル
をヤギの抗ヒト抗体（ガンマ鎖固有抗体，Sara Lab社）で被覆した。ＰＢＳＴ〔
0.02％のTween 20（ｐＨ＝7.5）を含む燐酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄した後、
プレートウェルから採ったトランスフェクト物を含む培養媒体 20 μlを、37 ℃
，１時間で各マイクロタイターウェルに加えた。当該マイクロタイターウェルを
ＰＢＳＴで洗浄し、アルカリ ホスファターゼ共役ヤギ抗ヒト カッパ（軽鎖固有
）を加え、室温で１時間インキュベートした。次に当該マイクロタイターウェル
をＰＢＳＴで洗浄し、ジエタノールアミンを含む基質緩衝液をこれに添加した。
30分後に、405 nmにおける吸光度を測定した。
抗体の存在量をＥＬＩＳＡにより測定した。マイクロタイター プレートウェル
をヤギの抗ヒト抗体（ガンマ鎖固有抗体，Sara Lab社）で被覆した。ＰＢＳＴ〔
0.02％のTween 20（ｐＨ＝7.5）を含む燐酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄した後、
プレートウェルから採ったトランスフェクト物を含む培養媒体 20 μlを、37 ℃
，１時間で各マイクロタイターウェルに加えた。当該マイクロタイターウェルを
ＰＢＳＴで洗浄し、アルカリ ホスファターゼ共役ヤギ抗ヒト カッパ（軽鎖固有
）を加え、室温で１時間インキュベートした。次に当該マイクロタイターウェル
をＰＢＳＴで洗浄し、ジエタノールアミンを含む基質緩衝液をこれに添加した。
30分後に、405 nmにおける吸光度を測定した。
【００４０】
例２：別種ヒト化抗体の獲得
ＶＨおよびＶＫのＩＯＲ Ｃ５配列をヒトの配列データベースと比較し、ＩＯ
Ｒ Ｃ５を有する最もヒトに近い配列を得た。次に、両親媒性領域又は可能なＴ
細胞エピトープを、ＶＨおよびＶＫ領域で決定した。
Ｒ Ｃ５を有する最もヒトに近い配列を得た。次に、両親媒性領域又は可能なＴ
細胞エピトープを、ＶＨおよびＶＫ領域で決定した。
【００４１】
ＶＨに対して、位置10および17に突然変異を導入し、アミノ酸ＡＳＰおよびＳ
ＥＲをＧＬＹおよびＴＨＲでそれぞれ置換した。これらの突然変異は、最初のＰ
ＣＲにおいてプライマー１並びに２，３および４を使用してＰＣＲ重複法により
実施し、２および４のプライマーを使用して、これらＰＣＲ重複法の結果を第二
のＰＣＲに重複させた。これらプライマーの配列は下記の通りである〔Kamman M
., Laufs J., Schell J., Gronemborg B.,ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
るＤＮＡの急速挿入突然変異生成（Rapid insertional mutagenesis of DNA by
polymerase chain reaction(PCR)）；Nucleic Acids Research 17, 5404, 1989
〕：
ＥＲをＧＬＹおよびＴＨＲでそれぞれ置換した。これらの突然変異は、最初のＰ
ＣＲにおいてプライマー１並びに２，３および４を使用してＰＣＲ重複法により
実施し、２および４のプライマーを使用して、これらＰＣＲ重複法の結果を第二
のＰＣＲに重複させた。これらプライマーの配列は下記の通りである〔Kamman M
., Laufs J., Schell J., Gronemborg B.,ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
るＤＮＡの急速挿入突然変異生成（Rapid insertional mutagenesis of DNA by
polymerase chain reaction(PCR)）；Nucleic Acids Research 17, 5404, 1989
〕：
【００４２】
重鎖の突然変異10および17に対するプライマーは下記の通りである。
プライマー１：
5'ＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧ
ＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＣＣ3'
プライマー２：
5'ＴＧＧＧＴＣＧＡＣ(ＡＴ)ＧＡＴＧＧＧＧ(ＧＣ)ＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧ
ＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣ3'
プライマー３：
5'ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＧ
ＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＴＣ3'
プライマー４：
5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴ
ＣＴＴＣＴ3'
【００４３】
前者の突然変異を配列決定を行って確認した後、この突然変異ＤＮＡに新しい
突然変異を導入した。即ち、位置43および44のＡＳＮおよびＬＹＳを、それぞれ
ＬＳＹおよびＧＬＹで置換して新しい突然変異を導入した。重複手順は、前に行
った手順と同じである。この突然変異を、配列決定を行うことにより確認した。
この新しい構造をＣ５ＶＨｈｕと命名した。
突然変異を導入した。即ち、位置43および44のＡＳＮおよびＬＹＳを、それぞれ
ＬＳＹおよびＧＬＹで置換して新しい突然変異を導入した。重複手順は、前に行
った手順と同じである。この突然変異を、配列決定を行うことにより確認した。
この新しい構造をＣ５ＶＨｈｕと命名した。
【００４４】
これらの突然変異に使用したプライマーは下記の通りであった。
重鎖中の突然変異43および44に対するプライマー
プライマー１：
5'ＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧ3'
プライマー２：
5'ＴＧＧＧＴＣＧＡＣ(ＡＴ)ＧＡＴＧＧＧＧ(ＧＣ)ＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧ
ＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣ3'
プライマー３：
5'ＣＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧ3'
プライマー４：
5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴ
ＣＴＴＣＴ3'
【００４５】
ＶＫに対しては、位置15, 45および63の位置で、ＩＬＥ，ＬＹＳおよびＴＨＲ
をそれぞれＬＥＵ，ＡＲＧおよびＳＥＲで置換することにより突然変異させた。
をそれぞれＬＥＵ，ＡＲＧおよびＳＥＲで置換することにより突然変異させた。
【００４６】
当該突然変異は、前に述べた方法でＰＣＲを重複させることによりこれを導入
した。使用したプライマーの配列を下記に示す。新しい遺伝子構造は、これをＣ
５Ｖｋｈｕと命名した。
した。使用したプライマーの配列を下記に示す。新しい遺伝子構造は、これをＣ
５Ｖｋｈｕと命名した。
【００４７】
軽鎖の突然変異15に対するプライマー
プライマー１：
5'ＴＴＧＴＣＧＧＴＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＣ3'
プライマー２
5'ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴ(ＴＧ)ＡＴＴＴＣＣＡ(ＧＡ)ＣＴＴ
(ＧＴ)ＧＴＣＣＣ3'
プライマー３：
5'ＧＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＡＣＣＧＡＣＡＡ3'
プライマー４：
5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧ(ＧＴ)ＣＣＣＣ(ＡＴ)(ＧＡ)Ｃ
ＴＣＡＧ(ＣＴ)Ｔ(ＣＴ)ＣＴ(ＴＧ)ＧＴ
【００４８】
軽鎖の突然変異45に対するプライマー
プライマー１：
5'ＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴ3'
プライマー２：
5'ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴ(ＴＧ)ＡＴＴＴＣＣＡ(ＧＡ)ＣＴＴ
(ＧＴ)ＧＴＣＣＣ3'
プライマー３：
5'ＡＴＡＧＡＴＴＡＧＧＣＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＣＣ3'
プライマー４：
5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧ(ＧＴ)ＣＣＣＣ(ＡＴ)(ＧＡ)Ｃ
ＴＣＡＧ(ＣＴ)Ｔ(ＣＴ)ＣＴ(ＴＧ)ＧＴ
【００４９】
軽鎖の突然変異63に対するプライマー
プライマー１
5'ＣＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡ3'
プライマー２
5'ＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴ(ＴＧ)ＡＴＴＴＣＣＡ(ＧＡ)ＣＴＴ
(ＧＴ)ＧＴＣＣＣ3'
プライマー３
5'ＴＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＧ3'
プライマー４
5'ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧ(ＧＴ)ＣＣＣＣ(ＡＴ)(ＧＡ)Ｃ
ＴＣＡＧ(ＣＴ)Ｔ(ＣＴ)ＣＴ(ＴＧ)ＧＴ
【００５０】
全ての突然変異は、その配列を決定して確認した。
ヒト化ＶＫおよびＶＨをベクターＰＡＧ４６２２およびＰＡＨ４６０４の中へ
クローン化し、構造Ｃ５Ｖｋｈｕ−ＰＡＧ４６２２およびＣ５ＶＨｈｕ−ＰＡＨ
４６０４を得た。
クローン化し、構造Ｃ５Ｖｋｈｕ−ＰＡＧ４６２２およびＣ５ＶＨｈｕ−ＰＡＨ
４６０４を得た。
【００５１】
ＮＳＯ細胞をヒト化Ｃ５ＶＨｈｕ−ＰＡＨ４６０４ 10 μgおよびＣ５ＶＫｈ
ｕ−ＰＡＧ４６２２ 10 μgとともにエレクトロポレートした。これらのベクタ
ーをＰＶＵ１消化により線状化した。
ｕ−ＰＡＧ４６２２ 10 μgとともにエレクトロポレートした。これらのベクタ
ーをＰＶＵ１消化により線状化した。
【００５２】
当該エレクトロポレーションおよびヒト化抗体ＩＯＲＣ５ｈ発現クローンの検
出の方法には、前にキメラ抗体に関して述べた方法と同じ方法を使用した。
出の方法には、前にキメラ抗体に関して述べた方法と同じ方法を使用した。
【００５３】
例３：単一鎖Ｆｖフラグメントの構築
ＩＯＲＣ５ｍＡｂ可変ドメイン（ＶＨｙＶＬ）由来のｓｃＦｖフラグメント（
ＶＨ−リンカー−ＶＬ）の構築 Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現させるための発現ベクター中へのクローン化 手順（ａ）ｓｃＦｖの構築 この戦略は、配列決定を行ったＶＨおよびＶＬ領域を修飾するＰＣＲによる増
幅の第１ラウンドであり、発現ベクターｐＰＡＣＩＢ．７ｐｌｕｓおよびｐＰＡ
ＣＩＢ．９ｐｌｕｓの中へクローン化するための制限エンドヌクレアーゼ サイ
トを含んでいる。当該増幅においては、正確な配列に基づいて設計したオリグヌ
クレアーゼを使用した。 重鎖： ４０６６：ＥｃｏＲＶ−ＦＲ１−ＶＨ 5'.ＧＧＧＡＴＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡ ..3' ４２５５：ＥｃｏＲＶ−ＦＲ４−ＶＨ 5'..ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣ Ｃ..3' 軽鎖： ２９３８：Ｓａｌ１−ＦＲ１−ＶＬ 5'.ＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣ(ＡＣ)ＣＡ(ＧＡ)ＡＣＴ (ＡＣ)Ｃ..3' ２９３５：Ａｐａ１−ＦＲ４−ＶＬ 5'.ＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴ(ＴＣ)Ａ(ＴＧ)(ＴＣ)ＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ Ｔ..3'
ＶＨ−リンカー−ＶＬ）の構築 Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現させるための発現ベクター中へのクローン化 手順（ａ）ｓｃＦｖの構築 この戦略は、配列決定を行ったＶＨおよびＶＬ領域を修飾するＰＣＲによる増
幅の第１ラウンドであり、発現ベクターｐＰＡＣＩＢ．７ｐｌｕｓおよびｐＰＡ
ＣＩＢ．９ｐｌｕｓの中へクローン化するための制限エンドヌクレアーゼ サイ
トを含んでいる。当該増幅においては、正確な配列に基づいて設計したオリグヌ
クレアーゼを使用した。 重鎖： ４０６６：ＥｃｏＲＶ−ＦＲ１−ＶＨ 5'.ＧＧＧＡＴＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡ ..3' ４２５５：ＥｃｏＲＶ−ＦＲ４−ＶＨ 5'..ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣ Ｃ..3' 軽鎖： ２９３８：Ｓａｌ１−ＦＲ１−ＶＬ 5'.ＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣ(ＡＣ)ＣＡ(ＧＡ)ＡＣＴ (ＡＣ)Ｃ..3' ２９３５：Ａｐａ１−ＦＲ４−ＶＬ 5'.ＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴ(ＴＣ)Ａ(ＴＧ)(ＴＣ)ＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ Ｔ..3'
【００５４】
当該領域を増幅した後、ＶＨ（ＥｃｏＲＶ）およびＶＬ（Ｓａｌ１−Ａｐａｌ
）を精製，消化した。当該ＤＮＡフラグメントを精製し、予め制限酵素で消化し
ておいたｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓおよびｐＰＡＣＩＢ．７ｐｌｕｓベクターに
結紮した。
）を精製，消化した。当該ＤＮＡフラグメントを精製し、予め制限酵素で消化し
ておいたｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓおよびｐＰＡＣＩＢ．７ｐｌｕｓベクターに
結紮した。
【００５５】
プラスミドｐＰＡＣＩＢ．７ｐｌｕｓを修飾して、その遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ
に発現させた周辺質の異種起源タンパク質中へ移出する。このプラスミドは、プ
ロモーター（トリプトファン）配列，信号ペプチド（ＯＭＰＡ）配列，リンカー
ペプチド配列（Chaudharyら, 1990），およびヒスチジン（当該タンパク質の精
製を助けるために成熟タンパク質のＣ末端にコード化したもの）６個で構成され
るドメイン機能を有する調節配列を含んでいる〔Gavilondo J.V.ら, 抗体工学に
関する第４回年次会議議事録（Proceedings of the IV Annual Conference on A
ntibody Engineering）（IBC Conference Inc., カリホルニア州コランド，1993
年12月８−10日）。
に発現させた周辺質の異種起源タンパク質中へ移出する。このプラスミドは、プ
ロモーター（トリプトファン）配列，信号ペプチド（ＯＭＰＡ）配列，リンカー
ペプチド配列（Chaudharyら, 1990），およびヒスチジン（当該タンパク質の精
製を助けるために成熟タンパク質のＣ末端にコード化したもの）６個で構成され
るドメイン機能を有する調節配列を含んでいる〔Gavilondo J.V.ら, 抗体工学に
関する第４回年次会議議事録（Proceedings of the IV Annual Conference on A
ntibody Engineering）（IBC Conference Inc., カリホルニア州コランド，1993
年12月８−10日）。
【００５６】
プラスミドｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓ（図１）は、これを修飾して、その遺伝
子をＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた細胞質の異種起源タンパク質中に発現させる。
このプラスミドは、プロモーター（トリプトファン）配列，当該タンパク質を高
効率で発現させるためにＩＬ−２ｈから誘導された２７ａａフラグメント，およ
びヒスチジン（当該タンパク質の精製を助けるために成熟タンパク質のＣ末端に
コード化したもの）６個で構成されるドメインの機能を有する調節配列を含んで
いる〔Gavilondo J.V.ら, 抗体工学に関する第４回年次会議議事録（IBC Confer
ence Inc., カリホルニア州コランド，1993年12月８−10日）。
子をＥ．ｃｏｌｉ中に発現させた細胞質の異種起源タンパク質中に発現させる。
このプラスミドは、プロモーター（トリプトファン）配列，当該タンパク質を高
効率で発現させるためにＩＬ−２ｈから誘導された２７ａａフラグメント，およ
びヒスチジン（当該タンパク質の精製を助けるために成熟タンパク質のＣ末端に
コード化したもの）６個で構成されるドメインの機能を有する調節配列を含んで
いる〔Gavilondo J.V.ら, 抗体工学に関する第４回年次会議議事録（IBC Confer
ence Inc., カリホルニア州コランド，1993年12月８−10日）。
【００５７】
ＰＣＲ反応の当該産物を使用して、強力なＥ．ｃｏｌｉ細胞（菌株ＭＣ１０６
１）を形質変換し、固形選択性媒体の中でこれをプレート培養し、37 ℃で生育
させた。組換えベクターを選ぶために、細菌コロニーを液媒体中でインキュベー
トし、この培養液からプラスミドＤＮＡを抽出した〔分子クローン化試験室マニ
ュアル，第２版（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition）
〕，1989，Sambrook，FritshおよびManiatis編）。クローン化手順の記述に従っ
て当該プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶ，Ｓａｌ１／Ａｐａｌ，Ｘｈｏｌ／Ａｐａ
ｌで消化させ、これを寒天ゲル上に塗布した後ＵＶ光線で可視化させ、２本バン
ドの消化パターンを有するクローンの中から組換えクローンを選んだ。これらの
中の１本はｐＰＡＣＩＢ．７および９plus（約2.9 kb）に対応し、第２のバンド
は期待ドメインに対応する（ＶＨ又はＶＬ：約320 pb；ｓｃＦｖ：720pb ）。Ｖ
Ｈドメインに対しては、ＤＮＡ配列決定により挿入の向きをチェックした。
１）を形質変換し、固形選択性媒体の中でこれをプレート培養し、37 ℃で生育
させた。組換えベクターを選ぶために、細菌コロニーを液媒体中でインキュベー
トし、この培養液からプラスミドＤＮＡを抽出した〔分子クローン化試験室マニ
ュアル，第２版（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition）
〕，1989，Sambrook，FritshおよびManiatis編）。クローン化手順の記述に従っ
て当該プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶ，Ｓａｌ１／Ａｐａｌ，Ｘｈｏｌ／Ａｐａ
ｌで消化させ、これを寒天ゲル上に塗布した後ＵＶ光線で可視化させ、２本バン
ドの消化パターンを有するクローンの中から組換えクローンを選んだ。これらの
中の１本はｐＰＡＣＩＢ．７および９plus（約2.9 kb）に対応し、第２のバンド
は期待ドメインに対応する（ＶＨ又はＶＬ：約320 pb；ｓｃＦｖ：720pb ）。Ｖ
Ｈドメインに対しては、ＤＮＡ配列決定により挿入の向きをチェックした。
【００５８】
手順（ｂ）：Ｅ．ｃｏｉ中におけるＩＯＲ Ｃ５ Ｍａｂの可変ドメイン遺伝子
から得られたｓｃＦｖの発現 クローン化遺伝子の発現を調べる目的で、上記（ａ）で選んだ２種類の組換え
プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉの４菌株を形質変換した。基本的に、当該組
換え細菌は、液状媒体（ＬＢ）中，37 ℃で一晩、アンピシリンとともにこれを
生育させた。これらの培養液からアンピシリンを含む新鮮な培養組織を接種し、
37 ℃で３時間インキュベートした。次に培養液にβインドールアクリル酸（ト
リプトファン プロモーターの誘発剤）を添加して、当該タンパク質の発現を誘
発させた。ＳＤＳポリアクリルアミド ゲル中において、濃度12％で当該サンプ
ルを分析した結果、これらの条件下において約28 kDaのタンパク質が、ｐＰＡＣ
ＩＢ．７ｐｌｕｓ構築用周辺質分画，およびｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓ中の組換
えクローン用30 kDaバンド中に発現することが明らかになった。ここに、全細菌
タンパク質の６−11％がＴＧ１中に発現する。ウサギから得られたＩＯＲ Ｃ５
ＭａｂのＦａｂフラグメントに対する抗血清を用いるウェスタンブロット法〔分
子クローン化試験室マニュアル，第２版（1989）, Sambrook, FritschおよびMan
iatis編），および免疫精製法により、このタンパク質がＩＯＲ Ｃ５ Ｍａｂの
ｓｃＦｖに対応することが明らかになった。
から得られたｓｃＦｖの発現 クローン化遺伝子の発現を調べる目的で、上記（ａ）で選んだ２種類の組換え
プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉの４菌株を形質変換した。基本的に、当該組
換え細菌は、液状媒体（ＬＢ）中，37 ℃で一晩、アンピシリンとともにこれを
生育させた。これらの培養液からアンピシリンを含む新鮮な培養組織を接種し、
37 ℃で３時間インキュベートした。次に培養液にβインドールアクリル酸（ト
リプトファン プロモーターの誘発剤）を添加して、当該タンパク質の発現を誘
発させた。ＳＤＳポリアクリルアミド ゲル中において、濃度12％で当該サンプ
ルを分析した結果、これらの条件下において約28 kDaのタンパク質が、ｐＰＡＣ
ＩＢ．７ｐｌｕｓ構築用周辺質分画，およびｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓ中の組換
えクローン用30 kDaバンド中に発現することが明らかになった。ここに、全細菌
タンパク質の６−11％がＴＧ１中に発現する。ウサギから得られたＩＯＲ Ｃ５
ＭａｂのＦａｂフラグメントに対する抗血清を用いるウェスタンブロット法〔分
子クローン化試験室マニュアル，第２版（1989）, Sambrook, FritschおよびMan
iatis編），および免疫精製法により、このタンパク質がＩＯＲ Ｃ５ Ｍａｂの
ｓｃＦｖに対応することが明らかになった。
【００５９】
例４：細菌培養液からのｓｃＦｖの取得，その再馴化および抗原に対する認識
検定 手順（ａ）：ｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓ中の組換えクローンからのＩＯＲ Ｃ
５のｓｃＦｖの抽出および再馴化 超音波開裂法を使用して当該タンパク質を生産細胞から抽出する過程において
、可溶性分画と不溶性分画を分離し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル
と結合させ、ニトロセルロースおよびウェスタンブロットへ移行させることが可
能である。この方法において、当該タンパク質は不溶性細菌分画の中に残留する
ことが明らかになった。
検定 手順（ａ）：ｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓ中の組換えクローンからのＩＯＲ Ｃ
５のｓｃＦｖの抽出および再馴化 超音波開裂法を使用して当該タンパク質を生産細胞から抽出する過程において
、可溶性分画と不溶性分画を分離し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル
と結合させ、ニトロセルロースおよびウェスタンブロットへ移行させることが可
能である。この方法において、当該タンパク質は不溶性細菌分画の中に残留する
ことが明らかになった。
【００６０】
このような状況下において、下記の諸段階を含む方法により、当該タンパク質
を部分的に精製した。即ち： （１）超音波および遠心分離により可溶性物質と不溶性物質を分離し； （２）低モル濃度尿素（２ M）の中で洗浄し； （３）高モル濃度尿素（６ M）の中で可溶化する。 可溶化物質から、アフィニティクロマトグラフ法により当該タンパク質を金属
イオンに精製し、緩衝液に対して再馴化した。
を部分的に精製した。即ち： （１）超音波および遠心分離により可溶性物質と不溶性物質を分離し； （２）低モル濃度尿素（２ M）の中で洗浄し； （３）高モル濃度尿素（６ M）の中で可溶化する。 可溶化物質から、アフィニティクロマトグラフ法により当該タンパク質を金属
イオンに精製し、緩衝液に対して再馴化した。
【００６１】
手順（ｂ）：ｓｃＦｖ−ＩＯＲ Ｃ５フラグメントの腫瘍細胞への結合検定
細胞系：
免疫細胞センターから当該細胞系を入手した。ＳＷ９４８腺癌細胞系を、ウシ
胎児血清を補充したＬ−１５媒体中，６％ＣＯ2雰囲気下，37 ℃で生育させた。
ラジ細胞系（バーキット ヒト リンホーム）およびＨｕｔ７８（Ｔヒト細胞系）
を負の比較対照として使用した。
胎児血清を補充したＬ−１５媒体中，６％ＣＯ2雰囲気下，37 ℃で生育させた。
ラジ細胞系（バーキット ヒト リンホーム）およびＨｕｔ７８（Ｔヒト細胞系）
を負の比較対照として使用した。
【００６２】
ウシ胎児血清10％を補充したＲＰＭＩ １６２９中，37 ℃でこれらの細胞系を
生育させた。
生育させた。
【００６３】
当該細胞懸濁液を、ウシ血清アルブミン１％を含むＰＢＳ中で106個（細胞）/
mlに固定した。各プレートウェルに細胞懸濁液 10 μlを添加した。当該スライ
ドを埃っぽい開放空気(dusty free air)の中で３時間乾燥し、アセトン−メタノ
ール（１：１）溶液の中で５分間固定し、ＴＢＳ中で10分間水和させた。最後に
、当該細胞を免疫細胞化学検定法により分析した。
mlに固定した。各プレートウェルに細胞懸濁液 10 μlを添加した。当該スライ
ドを埃っぽい開放空気(dusty free air)の中で３時間乾燥し、アセトン−メタノ
ール（１：１）溶液の中で５分間固定し、ＴＢＳ中で10分間水和させた。最後に
、当該細胞を免疫細胞化学検定法により分析した。
【００６４】
免疫ペルオキシダーゼによる免疫細胞化学検定法を使用して、ｓｃＦｖ ＩＯ
Ｒ Ｃ５フラグメントの活性を測定した。当該細胞を、単一鎖Ｆｖ ＩＯＲ Ｃ５
とともに37 ℃で２時間インキュベートし、次に抗Ｆａｂ血清および共役（ＨＲ
ＰＯ）抗マウス ペルオキシダーゼとともに、それぞれ室温で30分間インキュベ
ートした。当該ペルオキシダーゼの局在化サイトを、3-3ジアミノベンシジン５
mg，ＴＢＳ５ mlおよび30％Ｈ2Ｏ2 ５ μlを含む溶液で可視化させた。インキュ
ベーションの合間に、冷たいＴＢＳでスライドを洗浄した。
Ｒ Ｃ５フラグメントの活性を測定した。当該細胞を、単一鎖Ｆｖ ＩＯＲ Ｃ５
とともに37 ℃で２時間インキュベートし、次に抗Ｆａｂ血清および共役（ＨＲ
ＰＯ）抗マウス ペルオキシダーゼとともに、それぞれ室温で30分間インキュベ
ートした。当該ペルオキシダーゼの局在化サイトを、3-3ジアミノベンシジン５
mg，ＴＢＳ５ mlおよび30％Ｈ2Ｏ2 ５ μlを含む溶液で可視化させた。インキュ
ベーションの合間に、冷たいＴＢＳでスライドを洗浄した。
【００６５】
当該スライドを水の中に漬け、マイヤーのヘマトキシリンと比較し、カナディ
アン バルサムを添加した。各実験には、正および負の比較対照を含めた。
アン バルサムを添加した。各実験には、正および負の比較対照を含めた。
【００６６】
当該免疫細胞化学試験の結果は、このフラグメントがＳＷ９４８細胞系に対し
て唯一陽性であることを示している。このことは、完全Ｍａｂと比較して適度に
標識化されており、且つｓｃＦｖ ＩＯＲ ｃ５がこの細胞系を固有認識したこと
を示している。当該標識は、悪性結腸細胞膜および細胞質分画にこれを結合させ
た。
て唯一陽性であることを示している。このことは、完全Ｍａｂと比較して適度に
標識化されており、且つｓｃＦｖ ＩＯＲ ｃ５がこの細胞系を固有認識したこと
を示している。当該標識は、悪性結腸細胞膜および細胞質分画にこれを結合させ
た。
【００６７】
【配列表】
【図１】
この図は、プスミドｐＰＡＣＩＢ．９ｐｌｕｓの遺伝子構造を示している。当
該プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中に融合タンパク質を発現させるための
修飾プラスミドである。このプラスミドは、プロモーター（トリプトファン）配
列，当該タンパク質を高効率で発現させるためにＩＬ−２ｈから誘導された２７
ａａフラグメント，および当該タンパク質の精製中に使用する成熟タンパク質Ｃ
末端中でコード化された６個のヒスチジンから成るドメインの諸機能を得るため
の調節配列を含んでいる。
該プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中に融合タンパク質を発現させるための
修飾プラスミドである。このプラスミドは、プロモーター（トリプトファン）配
列，当該タンパク質を高効率で発現させるためにＩＬ−２ｈから誘導された２７
ａａフラグメント，および当該タンパク質の精製中に使用する成熟タンパク質Ｃ
末端中でコード化された６個のヒスチジンから成るドメインの諸機能を得るため
の調節配列を含んでいる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21
1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08
5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
// Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ
Ｃ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＥＡ(ＡＭ
，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)
，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＺ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＺ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，Ｇ
Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ
，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ
Ｘ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ
，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ロケ ナバロ、ロウレデス タティアナ
キューバ国 シュダード デ ラ ハバ
ナ、プラヤ、 カレ 13 ナンバー 4211
エントレ 42 イ 44
(72)発明者 モラレス モラレス、アレジョ
キューバ国 シュダード ハバナ、10 デ
オクテュブレ、 サンタ フォリシア
ナンバー 426 エントレ メロネス イ
ー アール、エンリケ
(72)発明者 ペレス ロドリゲス、ロランド
キューバ国 シュダード デ ラ ハバ
ナ、10 デ オクテュブレ、 ジュアン
デルガド ナンバー 567 エントレ ア
コスタ イ オファラリル
(72)発明者 アヤラ アビラ、マルタ
キューバ国 シュダード ハバナ、プラ
ヤ、カレ 186 ナンバー 3117 エント
レ 31 イ 33
(72)発明者 ガビロンド コウレイ、ジョージ ビィク
ター
キューバ国 シュダード ハバナ、プラ
ザ、 カレ ジー 460 アプト、11
(72)発明者 デュエナス プルト、マルタ
キューバ国 シュダード ハバナ、プラ
ヤ、カレ 186 ナンバー 3117 エント
レ 31 イ 33
(72)発明者 ベル ガルシア、ハンセル
キューバ国 シュダード デ ラ ハバ
ナ、プラヤ、カレ 62 ナンバー 906
アプト、16 エントレ ９ イ 11
(72)発明者 レンジホ カルザド、エンリケ
キューバ国 シュダード デ ラ ハバ
ナ、プラヤ、カレ 170 ナンバー ビー
シーイー２ アプト、16
(72)発明者 イズナガ エスコバル、ノルマンド
キューバ国 シュダード デ ラ ハバ
ナ、ラ リサ、アベニダ 31 ナンバー
32005 エントレ 320 イ 322
(72)発明者 ラモス ズザルテ、メイラ
キューバ国 シュダード デ ラ ハバ
ナ、プラヤ、カレ 184 ナンバー ビー
イーイー１ アプト、12 エントレ １ラ
イ ５タ
Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24
DA01 DA14
4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y
AB01 AB02 BA01 BA08 CA25
CA44 CA46
4C085 AA13 AA14 BB01 DD63 DD88
HH03 KA03 KA04 KA29 KB09
KB10 LL18
4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 DA76
EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (15)
- 【請求項１】 当該組換え抗体が、抗体 IOR C5の相補性決定領域（ＣＤＲs
）並びに軽鎖および重鎖のヒト定常部領域を有するECCC 97061101の番号で預託
されたハイブリドーマにより造られるネズミのモノクローナル抗体 IOR C5から
誘導された、組換え抗体および単一鎖Fvフラグメント。 - 【請求項２】 当該軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列が、 重鎖 ＣＤＲ１：ＳＤＹＮＷＨ ＣＤＲ２：ＹＩＳＹＮＧＴＴＳＹＮＰＳＬＫＳ ＣＤＲ３：ＮＤＥＫＡＷＦＡＹ 軽鎖 ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ ＣＤＲ２：ＬＶＳＫＬＤＳ ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＨＴ の配列である、請求項１記載の組換え抗体。
- 【請求項３】 当該重鎖および軽鎖のフレームワークアミノ酸配列が、 重鎖 ＦＲ１：ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳ ＩＴ ＦＲ２：ＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＭＧ ＦＲ３：ＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹ ＹＣＡＲ ＦＲ４：ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ 軽鎖 ＦＲ１：ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣ ＦＲ２：ＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹ ＦＲ３：ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＡＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＬＧ ＶＹＹＣ ＦＲ４：ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＫＳＴＬＴＧ である、IOR C5並びに軽鎖および重鎖のヒト定常部領域のＣＤＲおよびフレーム
ワーク領域（ＦＲs）を含むネズミのモノクローナル抗体 IOR C5から誘導される
キメラ抗体である、請求項１および２記載の組換え抗体。 - 【請求項４】 重鎖および軽鎖のフレームワーク領域における点突然変異を
含む、ネズミのモノクローナル抗体 IOR C5由来のヒト化抗体であり、その免疫
発生性を低下させるための請求項１および２記載の組換え抗体。 - 【請求項５】 重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中に、 重鎖 位置10のＡＳＰ por ＧＬＹの点突然変異 位置17のＳＥＲ por ＴＨＲの点突然変異 位置43のＡＳＮ por ＬＹＳの点突然変異 位置44のＬＹＳ por ＧＬＹの点突然変異 軽鎖 位置15のＩＬＥ por ＬＥＵの点突然変異 位置45のＬＹＳ por ＡＲＧの点突然変異 位置63のＴＨＲ por ＳＥＲの点突然変異 の中いずれかの点突然変異を有する、請求項４記載のヒト化抗体。
- 【請求項６】 軽鎖および重鎖の可変領域に対する 重鎖 ＦＲ１：ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳ ＩＴ ＦＲ２：ＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＭＧ ＦＲ３：ＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹ ＹＣＡＲ ＦＲ４：ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ ＣＤＲ２：ＬＶＳＫＬＤＳ ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＨＴ 軽鎖 ＦＲ１：ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣ ＦＲ２：ＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹ ＦＲ３：ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＡＬＫＩＲＲＶＥＡＥＤＬＧ ＶＹＹＣ ＦＲ４：ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＫＳＴＬＴＧ ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ ＣＤＲ２：ＬＶＳＫＬＤＳ ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＨＴ のフレームワーク配列およびＣＤＲ配列で構成される、請求項１記載の単一鎖Fv
フラグメント。 - 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗体を発現する
細胞系。 - 【請求項８】 請求項１および６に記載の単一鎖Fvフラグンメントを発現す
る宿主細胞。 - 【請求項９】 直腸および結腸の悪性腫瘍，その転移および再発の治療を目
的とする、請求項１〜５のいずれか一項の組換え抗体および適切な賦形剤で構成
される医薬品組成物。 - 【請求項１０】直腸および結腸の悪性腫瘍，その転移および再発の治療を目
的とする、請求項１および６記載の単一鎖Ｆvフラグメント，および適切な賦形
剤で構成される医薬品組成物。 - 【請求項１１】「生体内」における直腸および結腸の悪性腫瘍，その転移お
よび再発に関してその位置を定め且つこれを同定することを目的とする、請求項
１〜５のいずれか一項に記載の組換え抗体で構成される医薬品組成物。 - 【請求項１２】「生体内」における直腸および結腸の悪性腫瘍，その転移お
よび再発に関してその位置を定め且つこれを同定することを目的とする、請求項
１および６記載の単一鎖Ｆvフラグメントで構成される医薬品組成物。 - 【請求項１３】これらの抗体０フラグメントを放射能標識化する化合物も含
み、且つこれを混合して投与可能な水溶液を造る、請求項９〜１２に記載の医薬
品組成物。 - 【請求項１４】テクネシアン（tecneciun）99，レニオ（rhenio）186, レニ
オ188又はこれらの同族体を放射能標識として使用することより成る請求項１３
記載の医薬品組成物。 - 【請求項１５】予めＴｃ−９９ｍ又はその同族体で標識化し，この組成物の
生物分布を免疫ガンマグラフ法により監視する、請求項１〜５のいずれか一項に
記載の抗体又は請求項１および６記載のフラグメントを含む、生理的に受入れ可
能な組成物で構成される直腸および結腸の悪性腫瘍，その転移および再発を「生
体内」で同定するための診断法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU196/99 | 1999-11-16 | ||
| CU1999196A CU22921A1 (es) | 1999-11-16 | 1999-11-16 | Anticuerpos quimérico, humanizado y el fragmento de tipo fv de cadena sencilla que reconoce el antígeno c2. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores colorrectales |
| PCT/CU2000/000004 WO2001036485A2 (es) | 1999-11-16 | 2000-11-16 | Anticuerpo monocolonal recombinante que reconoce el antigeno ior c2 su uso para el diagnostico y tratamiento de tumores colorectales |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003514831A true JP2003514831A (ja) | 2003-04-22 |
Family
ID=5459527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001538974A Pending JP2003514831A (ja) | 1999-11-16 | 2000-11-16 | 抗原ＩＯＲＣ２を認識する抗体およびＦｖフラグメント |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6891023B1 (ja) |
| EP (1) | EP1174441A2 (ja) |
| JP (1) | JP2003514831A (ja) |
| KR (1) | KR100827627B1 (ja) |
| CN (1) | CN1230446C (ja) |
| AR (1) | AR026463A1 (ja) |
| AU (1) | AU783622B2 (ja) |
| BR (1) | BR0007827A (ja) |
| CA (1) | CA2359577A1 (ja) |
| CO (1) | CO5280154A1 (ja) |
| CU (1) | CU22921A1 (ja) |
| EA (1) | EA005169B1 (ja) |
| MX (1) | MXPA01007261A (ja) |
| TW (1) | TWI233440B (ja) |
| WO (1) | WO2001036485A2 (ja) |
| ZA (1) | ZA200105803B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012147965A1 (ja) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 生物材料を透明化する方法、及びその利用 |
| US20160266016A1 (en) | 2013-08-14 | 2016-09-15 | Riken | Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof |
| US10444124B2 (en) | 2011-05-20 | 2019-10-15 | Riken | Clarifying reagent for biological materials and use thereof |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0228832D0 (en) * | 2002-12-10 | 2003-01-15 | Novartis Ag | Organic compound |
| ES2400920T3 (es) * | 2006-02-28 | 2013-04-15 | Nymox Corporation | Péptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otras afecciones que requieren la eliminación o la destrucción de células |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997033916A1 (es) * | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Centro De Inmunologia Molecular (Cim) | Anticuerpos monoclonales ior c5 para el diagnostico y tratamiento de tumores colorrectales |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| CU22615A1 (es) * | 1994-06-30 | 2000-02-10 | Centro Inmunologia Molecular | Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos |
| US6071020A (en) | 1996-03-07 | 2000-06-06 | Agfa-Gevaert | Apparatus for the processing of photographic sheet material |
-
1999
- 1999-11-16 CU CU1999196A patent/CU22921A1/es unknown
-
2000
- 2000-11-14 AR ARP000105994A patent/AR026463A1/es active IP Right Grant
- 2000-11-16 JP JP2001538974A patent/JP2003514831A/ja active Pending
- 2000-11-16 AU AU15130/01A patent/AU783622B2/en not_active Ceased
- 2000-11-16 KR KR1020017008965A patent/KR100827627B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-11-16 CA CA002359577A patent/CA2359577A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-16 EP EP00977398A patent/EP1174441A2/en not_active Ceased
- 2000-11-16 CN CNB008039542A patent/CN1230446C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-16 US US09/889,480 patent/US6891023B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-16 BR BR0007827-1A patent/BR0007827A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-11-16 WO PCT/CU2000/000004 patent/WO2001036485A2/es active Application Filing
- 2000-11-16 EA EA200100782A patent/EA005169B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-11-16 MX MXPA01007261A patent/MXPA01007261A/es active IP Right Grant
- 2000-11-16 CO CO00087150A patent/CO5280154A1/es active IP Right Grant
-
2001
- 2001-01-30 TW TW089126622A patent/TWI233440B/zh not_active IP Right Cessation
- 2001-07-13 ZA ZA200105803A patent/ZA200105803B/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997033916A1 (es) * | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Centro De Inmunologia Molecular (Cim) | Anticuerpos monoclonales ior c5 para el diagnostico y tratamiento de tumores colorrectales |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012147965A1 (ja) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 生物材料を透明化する方法、及びその利用 |
| JP5924624B2 (ja) * | 2011-04-28 | 2016-05-25 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 生物材料を透明化する方法、及びその利用 |
| US10444124B2 (en) | 2011-05-20 | 2019-10-15 | Riken | Clarifying reagent for biological materials and use thereof |
| US20160266016A1 (en) | 2013-08-14 | 2016-09-15 | Riken | Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof |
| US10267714B2 (en) | 2013-08-14 | 2019-04-23 | Riken | Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TWI233440B (en) | 2005-06-01 |
| US6891023B1 (en) | 2005-05-10 |
| ZA200105803B (en) | 2003-01-06 |
| CA2359577A1 (en) | 2001-05-25 |
| WO2001036485A3 (es) | 2001-11-08 |
| AR026463A1 (es) | 2003-02-12 |
| WO2001036485A2 (es) | 2001-05-25 |
| EA200100782A1 (ru) | 2002-02-28 |
| EP1174441A2 (en) | 2002-01-23 |
| CN1230446C (zh) | 2005-12-07 |
| CO5280154A1 (es) | 2003-05-30 |
| AU1513001A (en) | 2001-05-30 |
| MXPA01007261A (es) | 2002-06-04 |
| KR20020008113A (ko) | 2002-01-29 |
| CN1344276A (zh) | 2002-04-10 |
| BR0007827A (pt) | 2001-10-30 |
| KR100827627B1 (ko) | 2008-05-07 |
| AU783622B2 (en) | 2005-11-17 |
| CU22921A1 (es) | 2004-02-20 |
| EA005169B1 (ru) | 2004-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7189816B1 (en) | Compounds | |
| EP0521842B1 (en) | Tumor antigen specific antibody | |
| JPH10505749A (ja) | ヒトの結腸がん腫結合抗原に対するモノクローナル抗体とその用法 | |
| CN111133006A (zh) | 抗cd166抗体及其用途 | |
| CN108997499B (zh) | 一种抗人pd-l1抗体及其应用 | |
| US10208125B2 (en) | Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof | |
| CN110028582B (zh) | 抗人d-二聚体抗体及其应用 | |
| TW202128765A (zh) | 一種雙特異性抗體 | |
| KR102486507B1 (ko) | 플렉틴-1 결합 항체 및 그의 용도 | |
| CN108997500B (zh) | 一种抗人pd-l1抗体及其应用 | |
| JP2003527334A (ja) | Ａ３３抗原特異的免疫グロブリン産物を用いるａ３３抗原を発現する癌の影響を低減する方法 | |
| CN115803054A (zh) | 针对错误折叠的tdp-43的单链抗体和胞内抗体及其使用方法 | |
| KR100827627B1 (ko) | 항원 아이오알 시2를 인식하는 항체 및 에프브이 단편 | |
| CN113880948B (zh) | 抗ca724抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用 | |
| JP3081208B2 (ja) | Ｍｃａ１６‐８８によって認識される抗原 | |
| JP3996649B2 (ja) | 腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用 | |
| CN110007094B (zh) | 人d-二聚体定量检测卡及其临床应用 | |
| CN111434686B (zh) | 一种抗人pbx1单克隆抗体，其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途 | |
| CN115838424A (zh) | 靶向tigit的单克隆抗体 | |
| CN113801231A (zh) | 抗dog-1抗体或其抗原结合片段及其用途 | |
| CA2374587A1 (en) | Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof | |
| JPH06172219A (ja) | 癌関連医薬品組成物 | |
| CN116410305A (zh) | 一种用于检测宫颈癌病理组织中hpv16 e6蛋白的单克隆抗体 | |
| MXPA00008391A (en) | High affinity humanized anti-cea monoclonal antibodies | |
| KR20000048691A (ko) | 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071004 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100723 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101022 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20101022 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110809 |