CN1303438A

CN1303438A - 应用嵌合毒素诊断癌症的方法

Info

Publication number: CN1303438A
Application number: CN99806580A
Authority: CN
Inventors: H·罗尔伯布姆－加尔斯基; A·本-耶胡达; A·内楚施坦; S·雅科尼; I·马里尔诺夫斯基
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2001-07-11
Also published as: ATE412756T1; EP1066390B1; WO1999049059A2; NZ507294A; WO1999049059A3; AU758839B2; AU2955199A; DE69939819D1; US6140066A; CA2323786A1; IL138655A0; EP1066390A2

Abstract

本发明涉及应用一种嵌合毒素进行癌症诊断的方法。具体地说,本发明涉及应用由促性腺激素释放激素(GnRH)和假单胞菌外毒素A(PE)组成的嵌合毒素检测人腺癌表达的肿瘤相关表位。以与肿瘤细胞结合而不杀死肿瘤细胞的突变GnRH－PE分子为例证明。

Description

应用嵌合毒素诊断癌症的方法

1．简介

本发明涉及运用一种嵌合毒素进行癌症诊断的方法，特别是，本发明涉及运用由促性腺激素释放激素(GnRH)和假单胞菌外毒素A(PE)组成的嵌合毒素检测人腺瘤表达的肿瘤相关表位。以能够结合但不杀死肿瘤细胞的突变GnRH-PE分子例示。

2．发明背景

GnRH是下丘脑神经元产生的十肽，经过门血管分泌到垂体血管循环。首先它作为较大的前体蛋白合成，经过蛋白酶剪切并在其C末端甘氨酸处酰胺化。GnRH刺激垂体前叶腺的促性腺激素细胞释放黄体生成素和促卵泡激素，从而对控制人生殖的下丘脑-垂体生殖腺进行调控。

GnRH牵连到某些癌症中，GnRH类似物用于对乳腺，前列腺，胰腺、子宫内膜及卵巢癌的治疗(Kadar等.，1988，前列腺12:229-307)。这些类似物在体外和体内均可抑制肿瘤细胞生长。此外，在某些实体瘤和建树的细胞系中报道了GnRH结合位点(Emons等.，1993，临床内分泌学代谢，77:1458-1464)，但初步结果暗示参与的GnRH受体(GnRHR)可能区别于以往引证的受体(Kadar等.，1992，《生物化学生物物理研究信息》Biochem.Biophs.Rex.Comm.189:289-295)。

尽管已在肿瘤中证明GnRH结合位点，这些肿瘤主要从激素依赖组织衍生。最近，Nechushtan等报道某些激素非应答肿瘤如结肠癌，肾细胞癌和肝细胞癌易被一种嵌合毒素GnRH-PE致死，(生物化学杂志，1997,272:11597)。GnRH使嵌合毒素结合至GnRHR表达的肿瘤细胞，而PE通过抑制蛋白合成调节细胞杀伤。但是，在本发明之前，并不了解观察到的作用是缘于激素非应答肿瘤的天然GnRHR表达或是由于GnRH-PE识别与GnRH结合的表位不同的新表位。

3．发明概述

本发明涉及用GnRH-RE嵌合毒素检测肿瘤细胞的方法，且GnRH-PE嵌合毒素结合但不杀死肿瘤细胞。特别是，它涉及运用GnRH-PE嵌合毒素检测腺癌表达的表位。本发明的实行中，优选使用经过修饰降低了细胞毒性活性但未改变其对肿瘤细胞结合特异性的GnRH-PE。这样的分子对于在生物样品和患有癌症的被试人中肿瘤细胞的检测尤其有用。

本发明部分基于申请人的如下发现：由GnRH和PE组成的两种突变重组嵌合毒素，称为LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，它们结合但不杀死肿瘤细胞。因为这些嵌合毒素不结合表达可被GnRH识别的天然GnRHR的颗粒肿瘤细胞，所以本发明的嵌合毒素能够识别腺癌表达的新的肿瘤相关表位。

4．附图简述

图1ALGnRH-PE66的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和图1B氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。在突变的嵌合毒素，LGnRH-PE66M中，方框内指定的氨基酸残基#575缺失。

图2LGnRH-PE40的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。方框内指定的氨基酸残基#336在突变的嵌合毒素LGnRH-PE40M中缺失。

图3突变的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，不表现ADP-核糖基化活性。

图4突变的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，在293肾癌细胞中不抑制蛋白合成，而未突变的嵌合毒素表现了细胞毒性活性对蛋白合成的抑制用作细胞毒性的指征。

图5GnRH-PE嵌合毒素不抑制表达天然GnRHR的粒膜肿瘤细胞的原始培养物的蛋白合成。

5．发明详述

5.1GnRH-PE嵌合毒素的制备

本发明的GnRH-PE嵌合毒素可通过化学合成方法或在两部分之间化学连接制备，优选通过如下方法制备：在合适的宿主细胞中，在指导事例多核苷酸表达的调节序列控制下，将GnRH的编码序列和PE的编码序列融合(Nechushstan等.，1997，生物化学杂志，272:11597)。两个编码序列的融合可通过分子生物学领域熟知的方法进行。适合在本发明应用的PE编码序列，包括但不仅限于，全长PE，PE的部分片断如PE的结构域Ⅱ和/或Ⅲ，突变的PE，其中结构域Ⅰ的氨基酸残基发生改变降低了非特异的细胞毒性，和具有最小细胞毒活性的突变PE(美国专利号4,892,827,Lorberboum-Galski等，1990，生物化学杂志，265:16311)。

优选仅在第一编码序列5’端含AUG翻译起始密码子而无第二编码序列的起始密码子的融合多核苷酸，以避产生两个编码产物。此外，可在多核苷酸的5’端设置一前导序列，以使表达产物靶向宿主细胞的特异位点或区室，加速分泌或基因表达后的纯化。两个编码序列可无接头直接融合，或通过运用包括重复1到3次的五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:5)的可变多接头融合。这样的接头已经通过到VH和VL之间插入应用于单链抗体(scFv)的构建(Bird等，1988，科学242:423-426；Huston等，1988。美国国家科学院学报85:5979-5883)。接头经设计能在两个β折叠间正确相互作用形成单链抗体的可变区。其它可采用的接头包括Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-G1y-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(SEQ ID NO:6)(Chaudhary等，1990，美国国家科学院学报。87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu--Ala-G1n-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO:7)(Bird等，1988，科学242:423-426)。

5.2GnRH-PE嵌合毒素的表达

一种编码GnRH-PE嵌合毒素，突变多肽，嵌合蛋白生物活性片断，或其功能等同物的多核苷酸，可用于在适当宿主细胞中产生指导嵌合毒素，突变多肽，肽片断或其功能等同物表达的重组DNA分子。由于遗传密码的固有简并性，其它编码基本相同或功能相当氨基酸序列的DNA序列，也可用于本发明嵌合毒素的克隆和表达。

依照本发明可应用的改变后的DNA序列包括不同核苷酸残基的缺失、添加或取代，这些改变导致生成的序列可以编出相同或功能相当的融合基因产物。基因产物本身可包括嵌合序列中导致沉默变化的氨基酸残基缺失、添加或取代，因而产生功能相当的嵌合蛋白。这样的氨基酸取代建立在参与的残基的极性，电荷，溶解度，疏水性，亲水性和/或两亲性的相似性基础上。例如负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸，组氨酸和精氨酸；具有相似亲水性带有不带电极性头基团的氨基酸包括：甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸；带非极性头基团的氨基酸包括丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。

本发明的DNA序列可经过基因工程改变嵌合编码序列得到多种末端，包括而不限于，改述基因产物的加工和表达的替代。例如，可运用本领域熟知的技术引入突变，例如定点诱变，从而插入新的限制性位点，降低细胞毒性，等。

在本发明可替代的实施例中，可运用本领域熟知的化学方法合成编码GnRH-PE嵌合毒素的全长或部分序列，见，例：Caruther等，1980，核酸研究论文集连载(Nuc.Acids Res.Symp.Ser.)7:215-233；Crea和Horn,180，核酸研究9(10):2331；Matteucei和Caruthers,1980，四面体通讯(Tetrahedron Letter)21:719，和Cow和Kempe,1981，核酸研究，9(12):2807-2817。此外，GnRH十肽和PE的特异结构域可通过固相技术合成，从树脂上解离，并通过制备型高性能液相层析纯化，随后化学连接形成一种嵌合毒素(例，见Creighton,1983，蛋白结构和分子原理，W.H.Freeman和Co.,N.Y.pp.50-60)。合成肽的组成可通过氨基酸分析或测序确定(例：蛋白结构和分子准则，W.H.Freeman和Co.,N.Y.,pp.34-49)。通过合成或重组方式产生的GnRH和PE也可依照本领域熟知的方法通过化学接头结合(Brinkmann和Pastan,1994，Biochemica et Biophysica Acta生物化学和生物物理进展1198:27-45) 。

为表达生物活性GnRH-PE嵌合毒素，将编码嵌合毒素，或功能相等物的核苷酸序列插入适当表达载体，即，包含有插入的编码序列转录和翻译的必需元件的载体。除嵌合毒素之外，用重组嵌合表达载体转染或转化的宿主细胞或细胞系也可用于多种目的。它们包括但不仅限于制备抗体(即单克隆或多克隆)，该抗体可与蛋白表位结合从而促进蛋白的纯化。

本领域技术人员熟知的方法可用于构建包括GnRH-PE嵌合毒素编码序列和适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。见，例，Sambrook等，1989，分子克隆实验指南(冷泉港实验室，纽约)和Ausubel等，1989；分子生物学通用方法(Greene出版联合及Wiley InterScience，纽约)中描述的技术。

多种宿主表达载体系统可用于表达GnRH-PE嵌合蛋白编码序列。它们包括但不限于微生物如以包含嵌合毒素编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；以包含嵌合毒素编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；包含嵌合毒素编码序列的重组病毒表达载体(例杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；由包含嵌合毒素编码序列的重组质粒表达载体(例Ti质粒)转化或包含嵌合毒素编码序列的重组病毒表达载体(例，花椰菜花叶病毒，CaMV，烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞系统；或动物细胞系统。必须提到一点：由于PE通常杀死哺乳动物细胞，因此优选本发明的嵌合毒素在原核或低等真核细胞中表达。第6部分举例说明GnRH-PE嵌合毒素可在大肠杆菌中高效表达。但是，因后述的第6部份中突变的GnRH-PE嵌合毒素，不表现针对人细胞的细胞毒性活性，它们也可在真核细胞中表达。

每个系统的表达元件其强度和特异性有所不同。依据运用的宿主/载体系统，许多适当的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子，都可用于表达载体。例如，当克隆在细菌系统中进行时，可应用诱导型启动子例如λ噬菌体的PL,Plac,ptrp,ptac(ptrp-lac杂交启动子；巨细胞病毒启动子)等；当克隆在昆虫细胞系统中克隆时，可应用杆状病毒多角体启动子；当在植物细胞系统中进行克隆时，可应用从植物细胞基团组衍生的、启动子(例，热休克启动子；RUBISCO核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亚基的启动子；叶绿素α/β结合蛋白的启动子)或从植物病毒衍生的启动子(例，CaMV的35S RNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)；当克隆在哺乳动物细胞系统中进行时，可运用从哺乳动物细胞的基因组衍生的启动子(例，金属硫蛋白启动子)或从哺乳动物病毒衍生的启动子(例，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)；当制备含嵌合DNA多挎贝的细胞系时，可应用带适当选择标记的SV40-BPV-和EBV载体。

在细菌系统中，根据表达的嵌合毒素的运用目的，可选择许多表达载体。例如，当生产大量嵌合毒素时，选择指导易纯化的蛋白产物高水平表达的载体。这些载体包括但不限于pHL906载体(Fishman等，1994，生物化学，33:6235-6243)，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983,EMBOJ欧洲分子生物学杂志2:1791)，其中嵌合蛋白编码序列可连接到载体中，与lacZ编码区同处一个阅读框，则可制备出杂合lacZ蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985，核酸研究13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989，生物化学杂志，264:5503-5509)；及其它。

能用于表达嵌合毒素的可替代表达系统是昆虫系统。在此类系统中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体表达外源基因。此病毒在草地夜蛾细胞中生长。嵌合毒素编码序列可克隆至病毒的非基本区(例，多角体蛋白基因)，置于一个AcNPV启动子(例多角体蛋白启动子)的控制下。嵌合蛋白编码序列的成功插入会导致多角体蛋白基因的钝化及非包含体的重组病毒(即缺乏多角体蛋白基因编码的蛋白质表膜外壳的病毒)的制备。这些重组病毒随后用于感染草地夜蛾细胞，插入基因在其中得以表达。(例见Smith等，1983，病毒学杂志，46:584,Smith，美国专利号4,215,051)。

插入的嵌合毒素编码序列的有效翻译还需要特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。当将包括其自身的起始密码子和邻近序列的完整嵌合基因插入到适当的表达载体时，无需额外的翻译控制信号。但是，当嵌合毒素编码序列不包括其自己的起始密码子时，则必须提供外源翻译控制信号；包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与嵌合蛋白编码序列的阅读框同相以保证对整个插入片段的翻译。这些外源性的翻译控制信号和起始密码子可为多种来源，天然的或合成的。表达的效率可通过包含适当转录增强子元件。转录终止子等而提高(见Bittner等，1987酶学方法，153:516-544)。

此外，可选择调节插入序列的表达，或以特定的预期方式修饰处理基因产物的宿主细胞株。这些蛋白产物的修饰(例糖基化)和加工(例切割)可能对蛋白功能非常重要。不同宿主细胞的蛋白翻译后加工修饰机制特征鲜明，各不相同。可选择适当细胞系或宿主系统确保嵌合毒素的正确修饰和加工。为此目的，可使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞：嵌合蛋白初级转录物的正确处理、糖基化以及磷酸化。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO.VERO,BHK.HeLa,COS，MDCK，293,WI38等。

进行重组嵌合毒素的长期，大产量生产时，优选稳定的表达。例如，人工构建稳定表达嵌合毒素的细菌宿主细胞或真核细胞，宿主细胞可用由适当表达控制元件(例，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点，等)和选择性标记控制的嵌合编码序列转化，而不用包含病毒复制起始点的表达载体。引入外源DNA后，人工改造的细胞可在滋养培养基中生长1-2天，然后转到选择培养基。重组质粒中的选择标记可赋予细胞选择抗性并使细胞能稳定地将质粒整合到它们的染色体中，并且生长形成依次能克隆并展开到细胞系的转化灶。

可运用许多选择系统，包括但不仅限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，细胞11:223)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,1962,美国国家科学院学报48:2026)，和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy等，1980，细胞22:817)。基因可分别用于tk^-,hgprt-或aprt^-细胞。还可将抗代谢物抗性用作dhfr、gpt、neo以及hygro选择的基础，dhfr可赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等.，1980，美国国家科学院学报77:3567；0’Hare等，1981，美国国家科学院学报78:1527)；gpt可赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,1981，美国国家科学院学报78:2072)；neo可赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物学杂志，150:1)；和hygro可赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因30:147)。其他选择基因也已有描述，例如trpB，可使细胞用吲哚替代色氨酸；hisD细胞利用组氨醇替代组氨酸(Hartman和Mulligan,1988，美国国家科学院学报85:8047；和ODC(多氨酸脱羧酶)，赋予对多苷酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO的抗性(McConlogueL.,1987，现代分子生物学通讯，冷泉港实验室编)。

5.3蛋白纯化

本发明的GnRH-PE嵌合毒素能通过本领域已知技术纯化，如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析。每种蛋白纯化的实际条件部分决定于这样一些因素如净电荷，疏水性、亲水性等，对本领域技术人员而言是显而易见的。

任何与GnRH,PE或通过GnRH和PE融合产生的构象性表位特异结合的抗体都可用于亲和层析纯化。制备抗体时，可用GnRH-PE嵌合毒素或其部分注射免疫多种宿主动物，包括而不限于兔，小鼠，大鼠等。蛋白可连结于适当载体，如牛血清清蛋白(BSA)，通过侧链功能基团或连于侧链功能基团的连接子。各种佐剂都可用于增强免疫应答，决定于宿主种类，包括但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇类，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基苯酚，和潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Coryhebacteriumparvum)。

抗GnRH-PE单克隆抗体的制备可采用通过连续细胞培养制备抗体分子时提供的任一项技术。这些包括但不限于由Kothler和Milstein最初描述的杂交瘤技术(1975，自然256:495-497)。此外，可运用为制备“嵌合抗体”而发展起来的技术(Morrison等，1984，美国国家科学院学报81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然312:604-608；Takeda等，1985，自然314:452-454)，该技术将具有适当抗原特异性的鼠抗体分子基因与具有适当生物活性的人抗体分子基因剪接在一起。替代地，还可使用用于单链抗体制备的技术(U.S.专利号4,946,778)制备用于蛋白纯化和检测的GnRH-PE特异的单链抗体。

5.4运用GnRH-PE嵌合毒素诊断癌症

本发明的GnRH-PE嵌合毒素可用于在体内和体外检测人肿瘤。优选这些毒素经过突变去除它们的细胞毒性而不影响它们对肿瘤细胞的结合特异性。这样的GnRH-PE的两个实例在后述的第6部分举例论证。本发明的GnRH-PE嵌合毒素可用于检测许多种人腺癌表达的表位，包括但不仅限于，结肠腺癌，胸腺癌，肺腺癌，卵巢腺癌，子宫内膜腺癌、肾腺癌，肝腺癌，前列腺癌，胃腺癌，子宫颈腺癌，胆囊腺癌和胰腺癌。本发明的嵌合毒素在区分腺癌与表达有天然GnRHR的非腺癌及正常细胞方面的作用尤为突出。

5.4.1体外诊断应用

本发明的GnRH-PE嵌合毒素可用于检测生物样本如组织和细胞样本中的癌细胞，和，特别是从正常组织和非恶性肿瘤中分辨恶性肿瘤，从而确定外科手术的边缘和微弱分化肿瘤的改良的组织特征。组织样本可通过嵌合毒素及它们由对嵌合毒素部分特异的二级抗体结合而染色。二级抗体与可检测的标记结合，如放射性同位素，酶如过氧化物酶和碱性磷酸酶，超声探针，核磁共振(NMR)探针等。

此外，免疫荧光技术也可用GnRH-PE检测人组织，细胞和体液样本。在典型方法中，将冻存的未固定的组织活体解剖样品的载片或细胞涂片在空气中干燥，福尔马林或丙酮固定，用GnRH-PE在调湿器室中室温温育。

载片经过冲洗并用抗GnRH-PE的二级抗体制备物温育。二级抗体用特定波长的荧光化合物标记，如若丹明，藻红蛋白或异硫氰酸荧光素。样品的染色图案和强度随后用荧光显微镜确认并记录下最佳图象。

在另一个实施方案中，可使用GnRH-PE通过电脑增强的荧光影像分析或流式细胞仪来检测组织样本或片状剥落细胞，即来自肿瘤组织活检吸取样本单细胞制备物。本发明的GnRH-PE嵌合毒素在通过电脑增强的荧光影像分析或流式细胞仪检测对活肿瘤细胞，即来自腺癌组织活检吸取样本的单细胞培养物定量中特别有用。部分的GnRH-PE结合的细胞群体，单独的或与测定这些细胞的DNA倍性染色体相结合，作为病程进展的早期指示物从而提供非常有用的前兆信息。

GnRH-PE的运用可扩展到筛选人生物体液中是否存在被识别的特异性抗原决定簇。因而，患者生物体液的体外免疫血清评估可以提供非侵害性的癌断方法。举例而言，人体液如全血，胸膜渗出液，大脑脊髓液，滑液，前列腺液，精液或尿可采自患者，并进行特异性表位分析，这些表位可以是样品液中释放的抗原也可以定细胞上的膜结合表位。在标准放射免疫分析或酶联免疫分析，竞争性结合酶联免疫分析；点印迹或Western印迹或其本领域已知的其它分析中运用GnRH-PE。

可以制备含有GnRH-PE的试剂盒，通过上述的免疫组织学，免疫细胞学和免疫血清学方法对腺癌进行体外诊断、预后和/或监测。试剂盒的组分可包装在含水培养基中或以冻干形式包装。当GnRH-PE以与标记部分结合的形式在试剂盒中运用时，如与酶或放射活性金属离子结合时，这些结合物的组分可以采用完全结合形式、中间物形式或留待用户去结合的独立单元。

试剂盒可包括一种可分隔的容器，从而可以完全封闭的形式容纳一个或多个或者一系列或多系列的器皿，如试管，玻璃瓶，长颈瓶，瓶，注射器等。第一个或第一系列所述容器可装入GnRH-PE。第2个或第二系列所述容器可装入标记物或能够与GnRH-PE结合的连接子标记过的中间物。

5.4.2体内诊断应用

GnRH-PE嵌合毒素对体内靶向腺癌细胞也有用。它们可用于在原始肿瘤及转移肿瘤，尤其是淋巴结肿瘤的检测和监测中肿瘤定位。对肿瘤扩散的范围的初级估计会影响到对治疗模式的选择。对残留肿瘤的连续监测还有利于挽救治疗的更好监视和早期开始。也可内操作运用标记后的GnRH-PE，以便更好暴露肿瘤，并将对正常组织(如淋巴结)的破坏减至最小。对体内应用而言，优选运用高度纯化的GnRH-PE。

体内探测和/或监测腺癌时，纯化的GnRH-PE可直接或通过连接子，共价连接到一种化合物上，此化合物作为报告基团在共轭物或复合体的引入和定位后可使特异性组织或器官成像。许多不同类型的物质可作为报告基团，包括如不透X线染料，放射性金属和非金属同位素，荧光化合物，正电子发射同位素，非顺磁金属等。

可制备出含有与任一类型上述底物结合的GnRH-PE的试剂盒，用于所述的体内肿瘤定位方法。试剂盒的组分可溶于含水培养基中或为冻干形式。当嵌合毒素以与标记物结合的共轭物形式在试剂盒中使用时，这些共轭物的组分可以完全共轭形式，中间物形式或留待用户结合的独立单元的形式提供。

6．实施例突变的GnRH-PE嵌合毒素结合但不杀死肿瘤细胞

6.1材料和方法

6.1.1GnRH-PE嵌合毒素的构建

用NdeⅠ和Hind Ⅲ切割携带全长PE基团的质粒载体(pJY3A1136-1,3)(Chaudnary等，1990，生物化学杂志，265:16306-16310；Neshushtan等，1997，生物化学杂志，272:11597)。侧面为NdeⅠ(5’端)和Hind Ⅲ(3’端)限制性位点的36碱基对合成寡聚体与载体连接。此寡聚体插入片段包括GnRH编码序列，其中残基#6的编码氨基酸为色氨酸而非甘氨酸。此外，编码连接子Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:5)的序列重复两次置于GnRH编码序列和PE编码序列之间。合成的质粒编码嵌合毒素，LGnRH-PE66’，由限制性核酸内切酶消化和DNA序列分析确认(图1A和1B)。

为制备第2种嵌合毒素LGnRH-PE40，用NdeI和BamHI消化编码LGnRH-PE66的质粒载体，并将其连接到从质粒pHL-906获得的Nde I-Bam HI 750bp片段上(Fishman等，1994，生物化学33:6235-6243)，并与包含GnRH编码序列的36bp合成寡聚物相连，其中第6位氨基酸由色氨酸代替甘氨酸。编码以上连接子的序列再次置于GnRH编码序列和PE编码序列之间。合成的质粒编码一种嵌合毒素，LGnRH-PE40；限制性核酸内切酶消化和DNA序列分析确认(图2)。此质粒编码的毒素包括全长PE的结构域Ⅱ和Ⅲ。

6.1.2突变的GnRH-PE嵌合毒素的产生

为构建对人细胞无细胞毒性的GnRH-PE嵌合毒素，用Bam HI和ECORⅠ切去上述质粒中的下述区域，即编码LGnRH-PE66和LGnRH-PE40C末端122个氨基酸的区域，并用包括缺失了编码天然PE分子第553位氨基酸的单个密码子的相应片段替换(图1A,1B和2)(Fishman等，1997，欧洲免疫学杂志，27:486；Lukoo等，1988，传染免疫学56:3095)。突变的嵌合毒素分别称为LGnRH-PE66M和LGnRH-PE40M。

6.1.3GnRH-PE嵌合毒素的表达

将分别编码突变的GnRH-PE嵌合毒素LGnRH-PE66M和LGnRH-PE40M的质粒pVM1和pVM2，在大肠杆菌BL21(λDE3)进行表达。编码LGnRH-PE40和LGnRH-PE66的质粒也在相同细菌中表达。质粒转移到大肠杆菌中，细胞在含安比西林的培养基中生长。A₆₀₀值到达1.5-1.7时，培养物在37℃以1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导。离心收集细胞，沉淀在-70℃贮存若干小时。

将表达细胞的沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，含0.2mg/ml溶菌酶的1mM EDTA)，超声处理(3次30秒脉冲)，30000g离心30min。转移上清(可溶部分)供分析用。将沉淀(不可溶部分)置于抽提缓冲液(6M盐酸胍，0.1M Tris-HCl,pH8.6,1mM EDTA,0.05M NaCl，和10mM二硫苏糖醇)中变性，4℃搅拌30分钟。悬浮液30000g离心15分钟，弃去沉淀。上清透析，0.1MTris-HCl pH8.0,1mM EDTA,0.25mM NaCl和0.25mM L-精氨酸16小时。透析液15000g离心15分钟，所获上清(重折叠部分)作为GnRH-PE嵌合毒素的来源。

SDS/PAGE对该部分分析显色相应于嵌合毒素的主带。抗PE的多克隆抗体免疫印迹确认GnRH PE嵌合毒素的产生。

6.1.4重组GnRH-PE嵌合毒素的纯化

重折叠的蛋白部分用TE20缓冲液(20mM Tris.pH8.0,1mMEDTA)稀释。加入DEAE琼脂糖(Pharmacia瑞典)，4℃搅拌半小时，装入柱中。含80mM或50mM NaCl的TE20缓冲液洗柱。用2×200ml含0.08-0.35m NaCl的TE20(20mM Tris pH8.0,1mM EDTA)缓冲液以线性梯度洗脱蛋白。收集峰部分，磷酸盐透析，分装，-20℃保存。

6.2结果

重组的GnRH-嵌合毒素，LGnRH-PE66，通过GnRH编码序列和PE编码序列与两部分之间的连接子插入片段融合产生。另一种GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40，以相似方式制备，不同之处为只有PE的结构域Ⅱ和Ⅲ是由毒素编码序列编码。此外，这两种嵌合毒素的编码序列经过突变导致在PE部分的单个氨基酸缺失。突变的嵌合毒素也作为重组蛋白表达。

从大肠杆菌裂解物中纯化并重折叠4种GnRH-PE嵌合毒素。因为PE通过在蛋白合成中ADP-核糖基化钝化延伸因子2从而杀死真核细胞，所以将GnRH-PE嵌合毒素的4种形式在无细胞分析中检测它们在ADP-核糖基化中的酶活性(Chung和Collier,1977，传染免疫学杂志，16:832-841)。两种未突变的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40和LGnRH-PE66表现ADP-核糖基化活性，而突变的嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，在相同分析中完全失活(图3)。所以，PE中的单个氨基酸取代去除了嵌合毒素的酶活性。

额外的，对所有4种GnRH-PE嵌合毒素均检测它们杀死293肾腺癌细胞的能力。结果表明仅非突变的嵌合毒素显现对靶细胞中蛋白合成的剂量依赖抑制(图4)。但是，当嵌合毒素与相同靶细胞温育而它们的结合由标记的抗PE抗体及FACS分析检测时，所有4种毒素都能结合肾腺癌细胞而不结合对照T24A膀胱腺癌细胞。因此，当突变的GnRH-PE嵌合毒素不能杀死靶细胞时，它们仍具有与肿瘤细胞结合的能力。这样的非细胞毒性嵌合毒素对体外和体内的癌症诊断尤为有用。

获取初级颗粒肿瘤细胞，使用相应于GnRHR特异部分的引物PCR显示表达GnRHR。颗粒细胞中的PCR产物与从表达天然GnRHR的垂体细胞中得到的量相同。与之对照，GnRHR阴性细胞如正常人淋巴细胞不产生可检测的PCR产物。尽管表达天然GnRHR，颗粒细胞对4种GnRH-PE嵌合毒素杀伤并不敏感，说明嵌合毒素与腺癌细胞表达的新表位结合，该表位能够将所述的细胞自身GnRH的结合识别开来(图5)。

本发明的范围不仅限于那些为说明本发明单一方面而列举的实施方案，任何功能相同的序列都在本发明范围内。事实上，除本发明已显示和描述之外对发明所作的各种修改对本领域技术人员而言可明显从前面的描述及附图中得知。这样的修改都在附加的权利要求范围内。

本发明引述的所有出版物在此引入仅作参考。

序列表

(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：耶路撒冷希伯莱大学，伊森姆研究发展公司

(ⅱ)发明题目：一种应用嵌合毒素诊断癌症的方法

(ⅲ)序列数：7

(ⅳ)联系地址：

(A)联系人：Pennie和Edmonds,LLP

(B)街道：the Americas 1155大道

(C)城市：纽约

(D)州：纽约

(E)国家：USA

(F)邮编：10036-2811

(ⅴ)机读形式：

(A)介质类型：磁盘

(B)电脑：IBM兼容

(C)操作系统：Windows

(D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0b

(ⅵ)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：

(ⅶ)优先申请数据：

(A)申请号：09/046,992

(B)提交日期：1998年3月24日

(ⅷ)代理人信息：

(A)名字：Poissant,Brian M

(B)登记号：28,462

(C)参考/文档：9457-0013-228

(Ⅸ)电信信息：

(A)电话：650-493-4935

(B)传真：650-493-5556

(C)电报：66141 PENNIE

(2)SEQ ID NO:1信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1908碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：编码序列

(B)位置：1...1905

(D)其它信息：

(Ⅺ)序列描述：SEQ ID NO:1:ATG GAG CAC TGG TCC TAT TGG CTG CGC CCT GGA GAA GCT GGA GGA GGA 48Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15GGA TCC GGA GGA GGA GGA TCC GGT CAA GCT TTC GAC CTC TGG AAC GAA 96Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu

20 25 30TGC GCC AAA GCC TGC GTG CTC GAC CTC AAG GAC GGC GTG CGT TCC AGC 144Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser

35 40 45CGC ATG AGC GTC GAC CCG GCC ATC GCC GAC ACC AAC GGC CAG GGC GTG 192Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val

50 55 60CTG CAC TAC TCC ATG GTC CTG GAG GGC GGC AAC GAC GCG CTC GAG CTG 240Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Glu Leu65 70 75 80GCC ATC GAC AAC GCC CTC AGC ATC ACC AGC GAC GGC CTG ACC ATC CGC 288Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg

85 90 95CTC GAA GGC GGC GTC GAG CCG AAC AAG CCG CTG CGC TAC AGC TAC ACG 336Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Leu Arg Tyr Ser Tyr Thr

100 105 110CGC CAG GCG CGC GGC AGG TGG TCG CTG AAC TGG CTG GTA CCG ATC GGC 384Arg Gln Ala Arg Gly Arg Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly

115 120 125CAC GAG AAG CCC TCG AAC ATC AAG GTG TTC ATC CAC GAA CTG AAC GCC 432His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala

130 135 140GGC AAC CAG CTC AGC CAC ATG TCG CCG ATC TAC ACC ATC GAG ATG GGC 480Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly145 150 155 160GAC GAG TTG CTG GCG AAG CTG GCG CGC GAT GCC ACC TTC TTC GTC AGG 528Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg

165 170 175GCG CAC GAG AGC AAC GAG ATG CAG CCG ACG CTC GCC ATC AGC CAT GCC 576Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala

180 185 190GGG GTC AGC GTG GTC ATG GCC CAG AAC CAG CCG CGC CGG GAA AAG CGC 624Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Asn Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg

195 200 205TGG AGC GAA TGG GCC AGC GGC AAG GTG TTG TGC CTG CTC GAC CCG CTG 672Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu

210 215 220GAC GGG GTC TAC AAC TAC CTC GCC CAG CAA CGC TGC AAC CTC GAC GAT 720Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp225 230 235 240ACC TGG GAA GGC AAG ATC TAC CGG GTG CTC GCC GGC AAC CCG GCG AAG 768Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys

245 250 255CAT GAC CTG GAC ATC AAA CCC ACG GTC ATC AGT GAA GAG CTG GAG TTT 816His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser Glu Glu Leu Glu Phe

260 265 270CCC GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC CAG GCT TGC CAC 864Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His

275 280 285CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG GAA 912Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu

290 295 300CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC 960Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr305 310 315 320CTG GCG GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC GAC CAG GTG ATC CGC AAC 1008Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn

325 330 335GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC CGC 1056Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg

340 345 350GAG CAG CCG GAG CAG GCC CGT CTG GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG 1104Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu

355 360 365AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG 1152Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala

370 375 380GCC AAC GCC GAC GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA 1200Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu385 390 395 400TGC GCG GGC CCG GCG GAC AGC GCC GAC GCC CTG CTG GAG GCG AAC TAT 1248Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Ala Asn Tyr

405 410 415CCC ACT GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC 1296Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

420 425 430ACC CGC GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC 1344Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

435 440 445CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC ACC 1392Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

450 455 460TTC CTC GAA GCG GCC CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC 1440Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg465 470 475 460AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC GAT 1488Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ila Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

485 490 495CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA CGC 1536Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg

500 505 510GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC TCG 1584Gly Ars Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

515 520 525AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC GCG CCG GAG 1632Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

530 535 540GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG CTG CGC 1680Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ila Gly His Pro Leu Pro Leu Arg545 550 555 560CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA CGC GGG CGC CTG GAG ACC 1728Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr

565 570 575ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG 1776Ile Leu Gly Trp Pro Teu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

580 585 590ATC CCC ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC 1824Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

595 600 605ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC 1872Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

610 615 620CAG CCC GGC AAA CCG CCG CGC GAG GAC CTG AAG TAA 1908Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys625 630 635

(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：635氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅴ)片段类型：内部的

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Asp Len Trp Asn Glu

20 25 30Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser

35 40 45Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val

50 55 60Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Glu Leu65 70 75 80Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg

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100 105 110Arg Gln Ala Arg Gly Arg Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly

115 120 125His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Geu Asn Ala

130 135 140Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly145 150 155 160Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg

165 170 175Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala

180 185 190Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Asn Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg

195 200 205Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu

210 215 220Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Len Asp Asp225 230 235 240Thr Trp Gln Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys

245 250 255His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser Glu Glu Leu Glu Phe

260 265 270Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His

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290 295 300Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr305 310 315 320Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn

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370 375 380Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu385 390 395 400Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Ala Asn Tyr

405 410 415Pro Thr Gly Ala Glu Phr Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

420 425 430Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

435 440 445Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

450 455 460Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg465 470 475 480Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

485 490 495Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg

500 505 5l0Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

515 520 525Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

530 535 540Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg545 550 555 560Leu Asp ALa Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr

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580 585 590Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

595 600 605Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ila Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

610 615 620Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys625 630 635

(2) SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1191碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：编码序列

(B)位置：1...1188

(D)其它信息：

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATG GAG CAC TGG TCC TAT TGG CTG CGC CCT GGA GAA GCT GGA GGA GGA 48Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15GGA TCC GGA GGA GGA GGA TCC GGT CAA GCT TTT GTT AAC GCC CAT ATG 96Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Val Asn Ala His Met

20 25 30GCC GAA GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC CAG GCT TGC 144Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys

35 40 45CAC CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG 192His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp

50 55 60GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC 240Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu65 70 75 80TAC CTG GCG GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC GAC CAG GTG ATC CGC 288Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg

85 90 95AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC 336Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile

100 105 110CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC CGT CTG GCC CTG ACC CTG CCC GCC GCC 384Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala

115 120 125GAG AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC 432Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly

130 135 140GCG GCC AAC GCC GAC GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT 480Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Glyl45 150 155 160GAA TGC GCG GGC CCG GCG GAC AGC CCC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC 528Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn

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195 200 205CAC CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC 672His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly

210 215 220ACC TTC CTC GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG 720Thr Phe Leu Glu ALa Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly GIy Val Arg Ala225 230 235 240CGC AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC 768Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly

245 250 255GAT CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA 816Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala

260 265 270CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC 864Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg

275 280 285TCG AGC CTG CCG GGC TTG TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC GCG CCG 912Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro

290 295 300GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG CTG 960Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu305 310 315 320CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG 1008Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu

325 330 335ACC ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG 1056Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser

340 345 350GCG ATC CCC ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC 1104Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser

355 360 365AGC ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC 1152Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala

370 375 380AGC CAG CCC GGC AAA CCG CCG CGC GAG GAC CTG AAG TAA 1191Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys385 390 395

(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：396氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅴ)片段类型：内部的

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Val Asn Ala His Met

20 25 30Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys

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130 135 140Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly145 150 155 160Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn

165 170 175Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe

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195 200 205His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly

210 215 220Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala225 230 235 240Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly

245 250 255Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala

260 265 270Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg

275 280 285Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Asg Thr Ser Leu Thr leu Ala Ala Pro

290 295 300Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu305 310 315 320Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu

325 330 335Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser

340 345 350Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Vel Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser

355 360 365Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala

370 375 380Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys385 390 395

(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(Ⅺ)序列描述：SEQ ID NO:5:Gly Gly Gly Gly Ser1 5

(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

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(2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)序列特征：

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(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

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Claims

1．一种在生物样本中检测肿瘤细胞的方法，包括将生物样本与嵌合毒素接触，并在样本中检测嵌合毒素结合细胞，所述嵌合毒素包括促性腺激素释放激素和假单胞菌外毒素A。

2．权利要求1的方法，其中所述的生物样本中包含腺癌细胞。

3．权利要求2的方法，其中所述腺癌细胞选自结肠腺癌，胸腺癌，肺腺癌，卵巢腺癌，子宫内膜腺癌，紧腺癌，肝腺癌，前列腺腺癌，胃腺癌；子宫颈腺癌，胆囊腺癌和胰腺腺癌。

4．权利要求1的方法，其中所述假单胞菌外毒素是全长毒素。

5．权利要求1的方法，其中所述的假单胞菌外毒素仅包括全长毒素中的结构域Ⅱ和Ⅲ。

6．权利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

7．权利要求6的方法，其中嵌合毒素由包括如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的多核苷酸编码。

8．权利要求1的方法，其中所述的嵌合毒素包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

9．权利要求8的方法，其中所述的嵌合毒素由包括如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸编码。

10．权利要求1的方法，其中所述的假单胞菌外毒素处理成为非细胞毒性的。

11．权利要求10的方法，其中通过缺失一个氨基酸残基使假单胞菌外毒素成为非细胞毒性的。

12．权利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:2所示但其中氨基酸残基#575缺失的氨基酸序列。

13．权利要求12的方法，其中嵌合毒素由一种多核苷酸编码，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:1所示的而核苷酸#1822-1824缺失的核苷酸序列。

14．权利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:4所示而其中氨基酸残基#336缺失的氨基酸序列。

15．权利要求14的方法，其中嵌合毒素由一种多核苷酸编码，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:3所示而核苷酸#1105-1107缺失的核苷酸序列。

16．权利要求1的方法，其中所述的嵌合毒素与一种可检测的标记物结合。

17．权利要求16的方法，其中所述的可检测标记物为放射性同位素，荧光染料，酶，超声探针或NMR探针。

18．权利要求1的方法，其中所述的生物样本为活检样本。

19．权利要求1的方法，其中所述的生物样本为体液。

20．权利要求19的方法，其中所述的体液为全血。

21．权利要求19的方法，其中所述的体液为胸膜渗出液。

22．权利要求19的方法，其中所述的体液为尿。

23．一种在人类受试者中检测肿瘤细胞的方法，包括向受试者施加一种包括促性腺激素释放激素和假单胞菌外毒素A的嵌合毒素，并在受试者中检测嵌合毒素结合细胞。

24．权利要求23的方法，其中所述的受试者为腺癌。

25．权利要求24的方法，其中所述腺癌选自结肠腺癌，胸腺癌，肺腺癌，卵巢腺癌，子宫内膜腺癌，肾腺癌，肝腺癌，前列腺腺癌，胃腺癌，子宫颈腺癌，胆囊腺癌和胰腺癌．

26．权利要求1的方法，其中假单胞菌外毒素处理为非细胞毒性的。

27．权利要求26的方法，其中通过缺失一个氨基酸残基使假单胞菌外毒素为非细胞毒性。

28．权利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:2的氨基酸序列，而其中氨基酸残基#575缺失。

29．权利要求28的方法，其中嵌合毒素由一种多核苷酸编码，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，而其中核苷酸#1822-1824缺失。

30．权利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，而其中氨基酸残基#336缺失。

31．权利要求30的方法，其中嵌合毒素由一种多核苷酸编码，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，而其中核苷酸#1105-1107缺失。

32．权利要求23的方法，其中嵌合毒素与一种可探测的标记物结合。

33．权利要求32的方法，其中可探测的标记物为放射性同位素，荧光染料，酶，超声探针或NMR探针。

34．一种包括促性腺激素释放激素和假单胞菌外毒素A的嵌合毒素，此毒素结合但不杀死肿瘤细胞。

35．权利要求34的嵌合毒素，它包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列但其中氨基酸残基#575缺失。

36．权利要求35的嵌合毒素，它由包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸编码，但此多核苷酸中核苷酸#1822-1824缺失。

37．权利要求34的嵌合毒素，它包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，但此氨基酸序列中氨基酸残基#336缺失。

38．权利要求37的嵌合毒素，它由包括如SEQ ID NO:3所示但序列中核苷酸#1105-1107缺失的多核苷酸编码。