CN1216076C

CN1216076C - 抗人小细胞肺癌单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN1216076C
Application number: CN011263946A
Authority: CN
Inventors: 林琳; 张毅; 杨瑶琴; 莫忠根; 朱明洁; 胡晶莹; 赵新泰
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2005-08-24
Anticipated expiration: 2021-08-03
Also published as: CN1400222A

Abstract

本发明提供了一种抗人小细胞肺癌的特异性单克隆抗体2F7。该单克隆抗体具有稳定性好和与小细胞肺癌抗原结合的特异性强的特点。本发明还提供了2F7免疫球蛋白、及其片段和免疫偶联物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶联物的药物组合物。本发明还提供了一种检测小细胞肺癌的检测试剂盒。

Description

抗人小细胞肺癌单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和医学领域。更具体地，本发明涉及抗人小细胞肺癌的特异性单克隆抗体及其应用。

背景技术

肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤，研究开发新的、有效的诊断和治疗方法，具有重要的社会和经济意义。目前临床诊断中，依据常规X线透视、CT检查、支气管镜检、痰涂片检查等方法，仍有10％的肺部块影不能明确诊断。肺部穿刺可以帮助诊断一些病例，但遇大血管周围等一些不适合肺部穿刺部位的肺部块影，将无法诊断。因此，临床上急需无创、特异的生物学诊断方法。肺癌在临床上分为小细胞肺癌、鳞癌、腺癌和大细胞肺癌。虽然小细胞肺癌在肺癌中所占的比例只有15-20％，但小细胞肺癌是恶性程度最高的一种，往往在确诊时已到了肺癌晚期，常发生早期远处转移，根治机会相对较小。并且小细胞肺癌与其余三种非小细胞肺癌在临床上的治疗方案完全不同，这就需要在治疗前明确肺癌的亚型，从而选择相应的治疗方案。治疗前必须明确小细胞肺癌的病理诊断，除常规病理检查外，通过电镜检查到肿瘤细胞中的神经内分泌颗粒，并经其他免疫组化检测，如神经特异性烯醇化酶等的确定小细胞肺癌的诊断无误，还要做全面的临床检查，确定属局限型或广泛型。在明确肺癌的病例中，由于没有组织学证据，部分病例不能区分小细胞肺癌和非小细胞肺癌，给治疗方案的选择造成了困难。因此，急需发展新的有效的鉴别技术。

目前小细胞肺癌临床治疗中，由于发现较晚，手术切除的可能性较小，放疗也不适宜。所以，它的主要治疗手段只有化疗，但愈后较差，5年生存率仅为15％。探索和应用新的、有效的生物治疗方法已成为肿瘤研究中的迫切任务。

由于目前仍然没有检测和或治疗小细胞肺癌的有效方法，因此，本领域迫切需要开发特异性抗人小细胞肺癌单克隆抗体，以及检测和治疗小细胞肺癌的有效方法。

发明内容

本发明的目的提供一种特异性抗人小细胞肺癌单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供一种特异性检测人小细胞肺癌的试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种特异性治疗人小细胞肺癌的治疗剂。

在本发明的第一方面，提供了一种免疫球蛋白V_H链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：14所示的CDR1，

SEQ ID NO：16所示的CDR2，

SEQ ID NO：18所示的CDR3。

较佳地，所述的免疫球蛋白V_H链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种免疫球蛋白V_L链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：20所示的CDR1，

SEQ ID NO：22所示的CDR2，

SEQ ID NO：24所示的CDR3。

较佳地，所述的免疫球蛋白V_L链，它具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种免疫球蛋白，其V_H链和V_L链分别具有SEQID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。较佳地，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。

在本发明的第四方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物具有V_H链，该V_H链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：14所示的CDR1，

SEQ ID NO：16所示的CDR2，

SEQ ID NO：18所示的CDR3，或者，

该免疫偶联物具有V_L链，该V_H链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：20所示的CDR1，

SEQ ID NO：22所示的CDR2，

SEQ ID NO：24所示的CDR3。

较佳地，所述的免疫偶联物是免疫毒素。

在本发明的第五方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是抗人小细胞肺癌杂交瘤2F7，CCTCC No.：C200110。

在本发明的第六方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：

上述的免疫球蛋白V_H链；

上述的免疫球蛋白V_L链；

上述的免疫球蛋白。

较佳地，所述的DNA分子具有选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：1、3、13、15、17、19、21、23。

在本发明的第七方面，提供了一种检测小细胞肺癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。

在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

附图说明

图1A和1B显示了抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7与多种肿瘤组织及正常组织的反应性。

图2显示了¹³¹I标记的2F7抗体的抑瘤作用。

图3显示了¹³¹I-标记的2F7抗体对荷人小细胞肺癌H128肿瘤的裸鼠存活的影响。

图4显示MTX-2F7抗体偶联物的抑瘤作用。

图5显示了2F7-HSA-MTX偶联物对荷人小细胞肺癌H128肿瘤的裸鼠存活的影响。

图6显示了2F7单抗的重链基因V_H和轻链基因V_L的克隆流程图。

图7显示了2F7单抗人-鼠嵌合Fab片段的构建及表达示意图。

图8是构建的pSW1-2F₇Fab示意图。

图9显示了2F7单抗Western印迹检测结果，其中泳道1为未诱导，泳道2为诱导条件。

图10显示了2F7单链抗体的构建和表达示意图。

具体实施方式

本发明人利用人小细胞肺癌细胞株H128为免疫原，经多年研究研制成功一种杂交瘤单克隆抗体，即抗人小细胞肺癌单抗2F7。此抗体经多年研究证实稳定性好，和小细胞肺癌抗原结合的特异性强。在此基础上完成了本发明。

本发明的2F7单抗或其片段可用于小细胞肺癌的放射性定位的诊断成像，还可用于免疫治疗，例如通过直接或间接地将2F7单抗或其片段与化学治疗剂、或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。为了具有临床价值，单克隆抗体应满足下列标准：1)标记表面，即结合于活肿瘤细胞，2)识别细胞周期非依赖的肿瘤特异性抗原，和3)在体外能同样好地与肿瘤细胞结合，而不论它们的培养活力、生长特征或培养密度。本发明的2F7单体满足这些标准。

本发明还提供了编码2F7单抗的可变区的轻链和重链的cDNA序列。本发明包括相应的氨基酸序列和具有所述特征的可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与2F7单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与本发明的2F7单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与2F7单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如¹³¹I-2F7，MTX-2F7偶联物等。

此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明还提供了编码上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。本发明的2F7单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

此外，本发明还提供了一种检测小细胞肺癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。一种人小细胞肺癌诊断试剂盒，已完成临床实验17例，检测阳性率高达93％。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于小细胞肺癌的治疗。此外，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α等。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的2F7免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

2F7单抗的制备和纯化

(1)杂交瘤和单克隆抗体的制备

免疫原为小细胞肺癌细胞株NCI-H128和H69。免疫时细胞先用与人肺腺癌、鳞癌有较强反应的HLC3-AB单克隆抗体在37℃处理1小时，免疫时用1×10⁷细胞腹腔注射于10周龄BALB/C小鼠，2-3周加强一次，融合前5、4、3天连续注射1×10⁷细胞。

骨髓瘤细胞为小鼠SP2/0细胞，经8-氮鸟嘌呤处理一周后，繁殖3天后使用。

杂交瘤的制备和单克隆抗体的筛选过程如下：取免疫小鼠的脾脏获得脾细胞与SP2/0细胞混合，以PEG-100为交联剂进行融合，挑取阳性克隆，用检测细胞性抗原的ELISA法和细胞悬液滴片的ABC免疫酶染色法进行筛选。每个杂交瘤上清液都对包括小细胞肺癌、肺腺癌、正常人混合淋巴细胞(部分实验用正常人肺细胞)等一组细胞进行试验，用有限稀释法连续克隆5次，对部分克隆并配之以免疫病理(ABC法)筛选，得到阳性杂交瘤细胞。用阳性杂交瘤细胞注入BALB/C小鼠腹腔，取得腹水性单克隆抗体。

一种阳性杂交瘤细胞为人小细胞肺癌杂交瘤2F7，该杂交瘤于2001年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCCNo.C200110。

(2)2F7单抗的纯化

小鼠腹水先用PBS或生理盐水等体积稀释，随后上样加入预先处理过的ProteinASepharoseCL-4B柱，样品循环过夜使抗体充分上柱，用PBS(pH＝8.0)洗柱，彻底除去杂蛋白，最后用甘氨酸-盐酸(pH＝3.0)解联抗体，收集蛋白流出液，用透析的方法将抗体调节至中性。

实施例2

2F7单抗的鉴定

1.单克隆抗体IgG的分型

用常规的免疫双扩散法进行鉴定，结果表明2F7单抗的亚型为IgG2a。

2.与细胞的反应性

用常规的ABC免疫酶染色法，对2F7单抗与25种细胞反应进行鉴定。结果如表1所示，2F7与小细胞肺癌具有最高结合反应，而与其他细胞反应甚低或无明显反应，显示了这个抗体对小细胞肺癌具有极强的特异性。

表1：单克隆抗体与25种细胞的反应的结果

细胞株或细胞	单克隆抗体2F7
细胞株或细胞	单克隆抗体2F7	小细胞肺癌H69H128肺腺癌A549SPCLETP-A1肝癌740274057721Q3胃癌8037901乳腺癌MCF-7肺癌D₆大细胞肺癌PLA-801肉瘤PLA-802各种白血病和淋巴细胞HSB₂Molt3Molt4HutU937P₃HR₃SB-B混合淋巴细胞人胚胸腺人正常肺	+++±--±-----±±------------

++：强阳性

+：阳性

±：介于阳性与阴性之间

-：阴性

3.2F7单抗与多种肿瘤组织及正常组织的反应性

用常规的Western法检测2F7单克隆抗体与多种肿瘤组织及正常组织的反应性。结果如图1A和图1B所示，除了与阳性对照人小细胞肺癌H128细胞有反应之外，2F7单克隆抗体与正常组织及肿瘤组织没有交叉反应。

实施例3

¹³¹I标记2F7单抗的临床显像

在本实施例中，通过氯醛甲酰胺(Iodogen)固相法用¹³¹I标记2F7单抗，然后通过放射免疫显像法研究2F7单克隆抗体的免疫成像效果。

取氯醛甲酰胺1mg，溶于5ml二氯甲烷内，分装于一系列清洁玻璃管中，每管50ul，用氮气吹干，置于冰箱内保存待用。标记时在上述氯醛甲酰胺涂膜管内依此加入2F₇ 0.5-1mg，¹³¹I 370MBq，0.5mol/l PH7.4磷酸缓冲液50ul，室温反应10min。然后吸取反应液加样到Sephadex G50淋洗柱上，收集¹³¹I标记结合峰，所得的¹³¹I-2F₇比放射性230MBq/mg左右，放化纯度＞95％。

结果表明，用氯醛甲酰胺法标记的2F7单抗标记率达80％以上，标记后的单抗与靶细胞的结合活性为63％-95％，14例病人显像结果，12例为阳性，2例为阴性。

实施例4

含^99mTc标记的2F7 F(ab’)₂片段的放射免疫显像诊断试剂盒

(1).2F7 F(ab’)₂片段的制备

1. 2F7单抗在柠檬酸缓冲液中透析过夜。

2.次日，将单抗移入试管，按抗体∶酶＝10∶1的比例加入猪胃蛋白酶(10mg/ml)，37℃水浴反应(轻轻振荡)2小时，1N NaOH调节PH7左右。

3.将酶解产物在Protein A柱上循环1-2小时，去掉未酶切的单抗。

4.将酶切产物上Sephadex G200柱，以PH7.4的PBS缓冲液洗脱，流速0.5ml/min。

5.收集洗脱峰，浓缩F(ab’)₂片段。

(2).用^99mTc标记2F7 F(ab’)₂片段

称取一定量的氯化亚锡溶于0.05M的HCl中配置成0.25％的氯化亚锡溶液，取抗体片段适量(5mg/ml)，加适量0.25％氯化亚锡(2H₂O)，混匀后用0.22uM的无菌过滤器除菌，加入高锝酸钠注射液，置室温5分钟即可使用。

将含^99mTc标记的2F7 F(ab’)₂片段的注射液分装在小瓶中，包装好。

该试剂盒经临床试验17例，阳性率达93％，17例患者从注药到显像结束无任何不良反应。

实施例5

2F7单克隆抗体作为放疗中的导向分子

将¹³¹I标记2F7单抗作为导向药物，腹腔注射荷人小细胞肺癌细胞株H128裸鼠，治疗组给药数天后肿瘤生长抑制，一周后肿瘤体积逐渐缩小(图2)，外观呈萎缩状，平均存活期明显延长(图3)。

类似地，用¹⁸⁸Re标记2F7单抗，对荷H128裸鼠初步治疗。结果表明，尾静脉给药20天后，治疗组的抑瘤率达50.3％，具有相当的抑瘤作用。

这表明，2F7单克隆抗体可以作为放疗中的导向分子，将放疗剂有效地导向小细胞肺癌细胞。

实施例6

2F7单克隆抗体作为化疗中的导向分子

以人血清白蛋白(Human Albumen Serum，HAS)作为中间载体，将肿瘤化疗药物甲氨喋呤(MTX)和2F7交联在一起研制成免疫药物2F7-HAS-MTX偶联物，对荷人小细胞肺癌H128肿瘤的裸鼠体内导向药物治疗。

结果显示，此免疫药物具有明显的肿瘤生长抑制作用，长瘤潜伏期延长，长瘤率降低，长瘤体积明显小于对照(图4)，自然生存期延长(图5)。

这表明，2F7单克隆抗体可以作为化疗中的导向分子，将化疗剂有效地导向小细胞肺癌细胞。

实施例7

2F7单抗的重链基因V_H和轻链基因V_L的克隆

鼠单抗的轻链和重链恒定区的DNA序列是已知的，所以对2F7单抗可变区的测序将导致对其的完全鉴定。

参见图6，用常规方法从2F7杂交瘤细胞(CCTCC No.：C200110)抽提出总RNA，以Oligo(dT)为引物合成第一链cDNA。

(1)重链基因V_H的获得：

用以下引物：

V_H反向：5’-agg tsm arc tgc ags agt cwg g-3’(SEQ ID NO：5)

其中S＝G或C；M＝A或C；R＝A或G；W＝A或T

V_H正向：5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3’(SEQID NO：6)

以cDNA为模板，PCR扩增得到V_H基因，PCR产物装入pT-Adv载体，转化受体菌TOP10，得到克隆pT-Adv-2F7V_H，挑取三个克隆经测序序列完全一致。

ctgcaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagtgtccctgaaactctcctgtgca

L Q E S G G G L V K P G V S L K L S C A

CDR1

gcttct

tgggttcgccagactccagagaag

A S G F T F S S Y A M S W V R Q T P E K

CDR2

aggctggagtgggtcgcatcc

R L E W V A S I S K N G N T Y Y A D S V

cgatttaccatctccagagataatgccagaaacatcctgtacctgcacatgaga

K G R F T I S R D N A R N I L Y L H M R

CDR3

actctgaggtctgaggacacggccatgtattactgttcaaga

T L R S E D T A M Y Y C S R D W L V A S

tggggccaagggaccacggtcacc

E D W Y F D V W G Q G T T V T

2F7单抗重链可变区基因及编码氨基酸序列(SEQ ID NO：1和2)及CDR1-3

2F7单抗重链可变区的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ IDNO：14、16和18，对应的编码核酸序列分别列于SFQ ID NO：13、15和17。

(2)轻链基因V_L的获得

用以下引物：

Vk正向：5’-GTT AGA TCT CGA GCT TGG TCC C-3’(SEQ ID NO：7)

Vk反向：5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’(SEQ ID NO：8)

以cDNA为模板，通过PCR扩增得到基因，PCR产物用T4 DNA聚合酶补平装入pUC19/SamI，转化受体菌TG1，得到克隆pUC19-2F7V_L，挑取三个克隆经测序序列完全一致。

1 GCCATTGAGCTCACCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACC

1 A I E L T Q S P T I M S A S P G E K V T

CDR1

61 ATGACCTGCA

TGGTACCAGCAGAAGTCAGGC

21 M T C S A S S S V S Y M H W Y Q Q K S G

CDR2

121 ACCTCCCCCAAAAGATGGATTTAT

GGAGTCCCTGCTCGC

41 T S P K R W I Y D T S E L A S G V P A R

181 TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA

61 F S G S G S G T S Y S L T I S S M E A E

CDR3

241 GATGCTGCCACTTATTACTGC TTCGGAGGGGGG

81 D A A T Y Y C Q Q W S S Y P P T F G G G

301 ACCAAGCTCGGGGATCCTCTA

101 T K L G D P L

2F7单抗轻链可变区基因及编码氨基酸序列(SEQ ID NO：3和4)及CDR 1-3

2F7单抗轻链可变区的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ IDNO：20、22和24，对应的编码核酸序列分别列于SEQ ID NO：19、21和23。

实施例8

2F7单抗人-鼠嵌合Fab片段的制备

(1)2F7单抗人-鼠嵌合Fab片段的构建及表达

构建过程见图7。pT-Adv-2F7V_H通过PstI/BstEII双酶切得到2F7V_H小片段。表达载体pSW1-Fab(一种常用载体，由英国Royal Free Hospital，Schoolof Medicine，Kerry A.Chester博士赠送)通过PstI/BstEII双酶切得到载体大片段，T4 DNA连接酶连接得到pSW1-2F7V_HFab。pUC19-2F7V_L通过SacI/XhoI双酶切得到2F7V_L小片段，与pSW1-2F7V_HFab经SacI/XhoI双酶切后回收得到的大片段连接，最后拼接得到质粒pSW1-2F7Fab(图8)，转化受体菌TG1，用IPTG(终浓度1mM)，30℃，诱导16小时，收集上清，浓缩20倍，PBS透析使蛋白复性。

(2)2F7单抗人-鼠嵌合Fab片段的功能及活性检测

(a)Western印迹检测

因pSW1-Fab载体上在重链基因后带有C-myc tag，因此可以通过检测C-myctag的免疫反应性，来检测Fab的表达情况。

取浓缩上清20ul，走10％SDS-PAGE电泳，再转移至0.45um的硝酸纤维膜上，膜先用5％脱脂奶粉封闭1小时后，加入一抗：C-myc(3ug/ml)37℃反应1小时，用PBST洗涤三次，每次5分钟，随后加入二抗：羊抗鼠-HRP，室温反应2小时，用PBST洗涤三次，每次5分钟，将洗净的滤膜放入10ml含5mg3，3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)的显色液中，加入适量3％H₂O₂显色。

结果如图9所示，经IPTG诱导后的pSW1-2F7Fab与C-myc tag抗体有明显的杂交条带，说明有目的蛋白表达，而未经诱导的菌种则无蛋白表达。

(b)ELISA法检测

取5×10⁴H₁₂₈细胞包板，37℃烘箱过夜，加入200ul 1％BSA封闭1小时，拍去封闭液，加入浓缩上清50ul，反应1小时，用PBST洗板三次，加入50ul 2.5ug/ml C-myc tag抗体，反应1.5小时，PBST洗板三次，再加入羊抗鼠-HRP反应1小时，PBST洗板三次，最后每孔加入0.5mg/ml OPD 50ul，显色、读数。

结果如表2所示。pSW1-2F7Fab与H₁₂₈细胞有反应，而对照pSW1-XFab即装入非2F7单抗重、轻链的载体则与H₁₂₈细胞无反应。这说明此重组的2F7单抗人-鼠嵌合Fab片段仍具有与人小细胞肺癌细胞的结合活性。

表2.2F7 Fab ELISA检测结果

样品	OD值(402nm)
样品	OD值(402nm)	PSW1-X Fab	0
pSW1-2F7 Fab	0.40	PSW1-X Fab	0

实施例9

2F7单链抗体的构建和表达

参见图10。以已知序列的2F7V_H和VK为模板，用以下引物：

Linker正向：5’-GAC CAC GGT CAC CGT CTC CTC AGG TGG AGG CGG TTCAGG CGG AGG TGG CTC AGG CGG TGG CGG ATC GGC CAT TGA GCT CAC CCA GTCTC-3’(SEQ ID NO：9)

Linker反向：5’-GAG ACT GGG TGA GCT CAA TGG CCG ATC CGC CAC CGCCAC AGC CAC CTC CGC CTC AAC CGC CTC CAC CTG ACC AGA CGG TGA CCG TGGTC-3’(SEQ ID NO：10)，

先94℃1min，65℃2min 7个循环后，再以此产物为模板，用以下引物：

V_H正向：5’-GCC ATG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG-3’(SEQ ID NO：11)；

VK反向：5’-CAG ACT CAC GCT CGA GTA GAG GAT CCC CGA GCT TGG TC-3’(SEQ ID NO：12)

用PCR方法扩增得到单链抗体2F7V_H-LINKER-VK基因，并将PCR产物装入pT-Adv载体，转化受体菌TOP10，挑取1个亚克隆经测序，序列与模板一致，然后用NcoI和XhoI双酶切切下单链抗体片段并将其装入pET22b载体(Invitrogen公司)中，转化受体菌BL21(DE3)后挑取克隆用于表达。

经测试，所表达的2F7单链抗体也具有针对小细胞肺癌细胞的专一性。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市肿瘤研究所

<120>抗人小细胞肺癌单克隆抗体及应用

<130>013399

<160>24

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>345

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(345)

<400>1

ctg cag gag tca ggg gga ggc tta gtg aag cct gga gtg tcc ctg aaa 48

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Val Ser Leu Lys

1 5 10 15

ctc tcc tgt gca gct tct gga ttc act ttt agt agt tat gcc atg tct 96

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

20 25 30

tgg gtt cgc cag act cca gag aag agg ctg gag tgg gtc gca tcc att 144

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile

35 40 45

agt aaa aat ggt aac acc tac tat gca gac agt gtg aag ggc cga ttt 192

Ser Lys Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

50 55 60

acc atc tcc aga gat aat gcc aga aac atc ctg tac ctg cac atg aga 240

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu His Met Arg

65 70 75 80

act ctg agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt tca aga gac tgg 288

Thr Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Trp

85 90 95

tta gta gct tcg gag gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc 336

Leu Val Ala Ser Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

acg gtc acc 345

Thr Val Thr

115

<210>2

<211>115

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Val Ser Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

20 25 30

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile

35 40 45

Ser Lys Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu His Met Arg

65 70 75 80

Thr Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Trp

85 90 95

Leu Val Ala Ser Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr

115

<210>3

<211>321

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(321)

<400>3

gcc att gag ctc acc cag tct cca aca atc atg tct gca tct cca ggg 48

Ala Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

gaa aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tac atg 96

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

cac tgg tac cag cag aag tca ggc acc tcc ccc aaa aga tgg att tat 144

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

gac aca tcc gaa ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192

Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

ggg tct ggg acc tct tat tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt tac cca ccc acg 288

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

85 90 95

ttc gga ggg ggg acc aag ctc ggg gat cct cta 321

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Asp Pro Leu

100 105

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Ala Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Asp Pro Leu

100 105

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>合成的引物

<220>

<221>misc_feature

<223>S＝G或C；M＝A或C；R＝A或G；W＝A或T

<400>5

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>6

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>7

gttagatctc gagcttggtc cc 22

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>8

gacattgagc tcacccagtc tcca 24

<210>9

<211>89

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>9

gaccacggtc accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct caggcggtgg 60

cggatcggcc attgagctca cccagtctc 89

<210>10

<211>89

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>10

gagactgggt gagctcaatg gccgatccgc caccgccaca gccacctccg cctcaaccgc 60

ctccacctga ccagacggtg accgtggtc 89

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>11

gccatggagt cagggggagg cttagtg 27

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>12

cagactcacg ctcgagtaga ggatccccga gcttggtc 38

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>V_H CDR1编码序列

<400>13

ggattcactt ttagtagtta tgccatgtct 30

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>V_H CDR1

<400>14

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210>15

<211>45

<212>DNA

<213>V_H CDR2编码序列

<400>15

attagtaaaa atggtaacac ctactatgca gacagtgtga agggc 45

<210>16

<210>15

<212>PRT

<213>V_H CDR2

<400>16

Ile Ser Lys Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>V_H CDR3编码序列

<400>17

gactggttag tagcttcgga ggactggtac ttcgatgtc 39

<210>18

<211>13

<212>PRT

<213>V_H CDR3

<400>18

Asp Trp Leu Val Ala Ser Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>V_L CDR1编码序列

<400>19

gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcac 29

<210>20

<211>10

<212>PRT

<213>V_L CDR1

<400>20

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>V_L CDR2编码序列

<400>21

gacacatccg aactggcttc t 21

<210>22

<211>7

<212>PRT

<213>V_L CDR2

<400>22

Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser

1 5

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>V_L CDR3编码序列

<400>23

cagcagtgga gtagttaccc acccacg 27

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>V_L CDR3

<400>24

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

Claims

1.一种免疫球蛋白V_H链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并且其互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：14所示的CDR1，

SEQ ID NO：16所示的CDR2，

SEQ ID NO：18所示的CDR3。

2.一种免疫球蛋白V_L链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，并且免疫球蛋白V_L链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：20所示的CDR1，

SEQ ID NO：22所示的CDR2，

SEQ ID NO：24所示的CDR3。

3.一种免疫球蛋白，其特征在于，其V_H链和V_L链分别具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是由抗人小细胞肺癌杂交瘤2F7，CCTCC No.：C200110所产生的单克隆抗体。

5.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物具有氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示V_H链，该V_H链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：14所示的CDR1，

SEQ ID NO：16所示的CDR2，

SEQ ID NO：18所示的CDR3。

6.如权利要求5所述的免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物还具有氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的V_L链，该V_L链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQ ID NO：20所示的CDR1，

SEQ ID NO：22所示的CDR2，

SEQ ID NO：24所示的CDR3。

7.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是抗人小细胞肺癌杂交瘤2F7，CCTCC No.：C200110。

8.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：

权利要求1所述的免疫球蛋白V_H链；

权利要求2所述的免疫球蛋白V_L链；或

权利要求3所述的免疫球蛋白。

9.一种检测小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求3所述的免疫球蛋白或权利要求5所述的免疫偶联物。