CN1033289A

CN1033289A - 制备单链尿激酶的方法

Info

Publication number: CN1033289A
Application number: CN88103967A
Authority: CN
Inventors: 乔瓦尼·卡萨尼; 玛里亚路易萨·诺利; 费德里科·玛里亚·罗比亚蒂; 安杰洛·科尔蒂; 弗朗切斯科·布拉西
Original assignee: Gloplapitit Co Ltd
Current assignee: Gloplapitit Co Ltd; Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1987-08-10
Filing date: 1988-06-25
Publication date: 1989-06-07
Also published as: NZ225143A; NO882791L; AU1834488A; FI882977A; HU208712B; PT87836A; HUT47324A; KR890003950A; JPH01132378A; NO882791D0; IL86801A0; FI882977A0; DK340488A; EP0303028A1; DK340488D0

Abstract

本发明涉及一种用以制备单链前尿激酶(以下也称作前uPA或(scu-PA)的方法。更具体地说，它涉及一种制备前uPA的方法，该法包括从人体基因组库中回收uPA基因，将其插入一个表达载体中，将所得的质粒载体DNA引入动物细胞中，以得到一种能产生编码蛋白质的转化突变体，以及从所说的动物细胞中回收糖基化的前uPA。

Description

本发明涉及制备单链尿激酶原（以下称为前-uPA（pro-uPA）或sc-uPA）的方法，特别是指这样一种生产前-uPA的方法，它包括从人体基因库中获得尿激酶（uPA）基因，把它插入到一个表达载体中，并将所得质粒载体DNA引入至动物细胞内，以获得一个能生产编码蛋白的转化子，从而从上述动物细胞中获得糖基化的前-uPA。

这项发明进一步要获得的产物是人类uPA启动子衍生物，它能控制象uPA一类基因的转录。该项发明还包括一些新的真核细胞表达载体以及与此有关的表达细胞的转化。在表达载体中，将一个cDNA或一个基因放于人类uPA启动子或其衍生物的转录控制之下。

这项发明的另一个方面是一个“表达盒”，它含有人类uPA启动子或其衍生物、人类uPA转录起始子（即所谓的TATA盒）和一个多聚接头。

尿激酶（uPA）是人尿中一种纤维蛋白溶酶原激活剂，可用来治疗各种形式的血栓形成或栓塞疾病。

尿激酶的制备以纯化从人类尿中提取的酶为基础。随着细胞培养技术的发展和特异性抗尿激酶抗体（单克隆及多克隆抗体）的应用，现已知道，uPA是一个细胞内产物前-uPA的激活产物（Wun等，1982，J.Biol.Chem.257，7262-7268;Nielsen等，1982，Biochemistry 21，6410-6415）。前-uPA是一个单链蛋白质（sc-uPA），而uPA是一个双链蛋白质（tc-uPA），sc-uPA中一个单个肽键的裂解，使scd-uPA一转变为tc-uPA

这种单链前-uPA在蛋白水解酶，如胰蛋白酶或血纤维蛋白溶解酶的作用下，发生特异性裂解，使其专一性活力增加50倍以上。在体内，这种转化主要是由血纤维蛋白溶解酶起作用的。

1977年Nolan在人类胚肾细胞培养物中已找到纤维蛋白溶解酶原激活剂的非活性形式（Biochem Biophys Acta 1977;496，384-400）。这种作者认为是尿激酶的原激活剂形式的物质，可以被胰蛋白酶激活，而无分子量的变化。一旦被激活，就能被兔抗人尿激酶抗体抑制。用苄脒-琼脂糖亲和层析法可将“原激活剂”的非活性形式和活性形式分开。

单链纤维蛋白溶解酶原激活剂的分子量为56，000，在血纤维蛋白板上，其专一性活性为40，000-50，000CTA单位/mg，对血纤维蛋白的高亲和力可见于欧洲专利40238上。

欧洲专利申请出版第92182号就是关于用重组DNA技术制备尿激酶衍生物，它特别阐明了在一个原核生物的宿主（大肠杆菌）中通过重组DNA技术得到的低分子量尿激酶（约30，000D）的纯化和定性。

另一欧洲专利申请EP-A-37687描述了编码具有人类尿激酶特性的纤维蛋白溶酶原激活物的脱氧核糖核酸（DNA）片段，以及在某种细菌中表达该DNA顺序的方法。而在欧洲专利申请出版第154272号，描述了在动物细胞中生产糖基化单链尿激酶的方法，它是从已建立的人类肾脏细胞素的mRNA得到DNA，通过重组DNA技术而生产糖基化单链尿激酶。Riccio等，在Nucleic Acid Research，13，2759（1985）描述了人类uPA启动子区域约800碱基对片段的顺序，它含有一个5′侧翼区域。

如下所预期的，这项发明阐明了一个在动物细胞内通过重组DNA技术生产前-uPA的方法。这一方法包括把一个DNA载体引入适当的动物细胞中生产，该载体上有一人类基因组起始点DNA片段，含有人类-uPA基因的编码区域而不是调节区域。经培养，可生产出与自然发生的前-uPA有相同氨基酸顺序的人类型前-uPA。

含uPA编码区的人类基因组起始点DNA片段，是在一个适当的载体内，用一段基因本身或在已知编码顺序的基础上合成一个适当长度的DNA片段作为DNA探针或用一个cDNA衍生的探针进行基因库的筛选，而从人类基因库获得的，如按照这一技术，在λ噬菌体或Cosmids装配型质粒内的基因库中获得。

这个uPA编码片段是通过SmaⅠ消化DNA克隆而得到的一个7.3千碱基对片段，这样一个DNA片段在下文中还会提到，称为开放性读码（ORF），表示一个含有uPA·mRNA的转录一转译单位的基因组DNA顺序，它可能被插入一些内含子，更可能包含5′和3′不转译区域或与或其中一部份具有转译效率或mnRNA稳定性有关的一个部分。较好ORF的一例就是一个上述所定义的顺序，其中插入有10个内含子。

在这项发明所述的方法中，所使用的表达载体可以是任何已知的用于转染动物细胞，特别是哺乳动物细胞。它们必须含有一个调节mRNA转译的顺序，如启动子，以及一个多聚腺苷化位点，有些还含有一个真核细胞复制源。特别的是启动子区域，它可以是能用于动物细胞的任何已知启动子。从哺乳动物的病毒，如还原病毒（即RSV）、SV40（迟早）和腺病毒（迟早）中可以得到异种启动子，还可选用动物或人类源的调节启动子，有些这类调节启动子是来自于鼠或人的金属巯基组氨酸三甲基内盐Ⅰ和Ⅱ、热休克蛋白等，这些在参考文献中可以查阅到，如Hamer等，Eukaryotic Viral Vectors，Y.Gluzman编辑，1983，7-12，Mayo等，Cell，29，99-108（1982）和Korin等，Nature，308，513-519（1984）。

除了那些调节启动子外，发现人类uPA启动子区是在哺乳动物细胞内，表达一个它所控制的基因的高效启动子。人类uPA启动子区域是在人类基因组库中（如上），通过SmaⅠ消化而得到的，约含2.38千碱基对，在人类uPA基因上，约从-2383碱基对至+29碱基对。

这种启动子和其衍生物可通过不同试剂如佛皮醇酯被引入，并高水平地表达uPA基因。

不仅是这种“自然”人类uPA启动子可用来在一个适当的哺乳动物细胞系中表达一个基因，而且，通过缺失、插入或突变所产生的衍生物，保持着原有的调节能力，甚至是具有更好的调节能力，也可用于这项发明所述的方法中，特别是uPA启动子区域缺失所得的衍生物尤为有利。用OxaNⅠ或EcoRⅤ处理uPA启动子，接着进行连接，所得的片段即为有代表性的缺失衍生物。特别是用OxaNⅠ消化后，得到的缺失衍生物在-1827和-1202碱基对间丧失了一个0.6千碱基对的片段，而用OxaNⅠ和EcoRⅤ消化，得到的缺失衍生物在-1827和-537碱基对间缺失了一个1.29千碱基对的片段。

已发现这些缺失衍生物可以产生调节基因的表达，其产率相当于或高于通常的病毒启动子，如RSV，后者通常被认为是效率很高的启动子系统。

尽管在uPA启动子或其衍生物控制下，表达较有利的基因是uPA基因，但这一启动子可用来表达任何已知基因或哺乳动物细胞内的编码顺序。

至于多聚腺苷化位点，则可以是所知中的任何一个，例如与启动子区域相连的一个来自uPA基因本身或来自另一个哺乳动物基因的多聚腺苷化位点。一旦制备成含一个启动子区域、一个转录起始子及一个方便的多聚接头的表达盒准备完毕，就可以接入到经选择的基因中，以转化入一个动物细胞。通常，各个部分组成到一起的顺序不是很关键的，所以侧翼区可能会首先连到复制系统上，包括一个标记物或其它区域，如增强剂、转录调节区域等，这些是基因中首先插入的。

各种片段组成在一起的方式是由一系列因素决定的，这些因素与形成的容易性、限制性位点的选择、特殊片段的应用等有关。这些因素最终又需要熟悉该项专业的操作人员的选择。

复制系统的选择在某种程度上取决于这是一个短暂的还是稳定的表达。对于短暂表达，需要用含一个复制起始点的病毒顺序（如SV40）为附加体。稳定表达则可用其它附加物（如牛乳头状瘤病毒的载体）或结合入基因组的顺序而得到。将一些这样的病毒顺序，如基因gpt，neo和dhfr联上标记物，这些标记物可用于选择含载体的细胞以及整个外来顺序的扩增。

为了最大限度地增加所设计的产物，即人类前-uPA的产生，较为方便的是采用第一个含uPA表达盒的构建物和第二个含选择性标记的独立构建物共转染细胞。

或者，可将uPA盒串联到一个基因，如dhfr的表达盒上，基因通过这样一个串联构建物而得到扩增。

宿主细胞可以是任何动物细胞，最好是哺乳动物或鸟类的细胞。在这些细胞内，生产出前-uPA的量与用uPA表达载体转化细胞前相同。一些明显含人类起始点的上述细胞，包括有已知的和已建立的细胞学，这些细胞在转化前可能或不可能产生可回收量的前-uPA，比如LBb，一个来自亲本L细胞的小鼠成纤维细胞样细胞学（Corsaro C.M.和Pearson L.M.“在哺乳动物细胞中DNA介导的基因转移效率的增强”，《Somatic cell genetics》7，603-616，1981）;CHO，中国仓鼠卵巢（KaoF.T，Puck F，Proc.Natl.Acad.Sci，60，1275-1281，1968）和A431人类表皮样肿瘤细胞学（Fabricant R.N，De larco J.E，和Todaro GF，“在培养中对人体黑素瘤细胞的神经生长因子受体”，《Proc，Natl.Acad，Scr.》USA74，565-569，1977）。上述前二种细胞系（LB6和CHO）不能生产前-uPA，而后一种（A431）可以生产，通常，在该项发明的过程中，已建立的细胞学，如CHO、COS、LTK、Hela和CN-1是适用的。

生产uPA的单层CHO细胞经重复克隆后，可得到保留有uPA生产能力的衍生的细胞系后者也能在培养基悬液中自身复制。这样的细胞系在培养上的容易性和每个大发酵单元内有高的产量方面的优点对操作人员是显而易见的。这些基因组uPA DNA的转化，CHO细胞系在培养基悬液中的生长体现了这项发明较好的一方面。

可用任何方便的方法将表达载体引入宿主，如微量注射、DEAE-葡聚糖介导转染、经磷酸钙沉淀的DNA转录和电刺激（参见Banerji.J.等，Cell33，729-740（1983）;Graham F.L.和Van der Eb A.J，Virology，52，456-467（1983）和PotterH等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，81，7161-7165（1984））。

转染后，细胞在一个适当的培养基中生长，如Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM），它含10%-20%灭活胎小牛血清，在这一培养基中，细胞能稳定地生长，然后加入适当的选择剂，如一种抗菌素。

重复克隆经选择的细胞，用常用的方法测定前-uPA/uPA的产量，如血纤维蛋白溶解试验或免疫胺溶解试验（IAA）。产生的克隆进行群块培养，以大量生产前-uPA。

在大量培养中，重要的一点是在起始培养基中要加无嘌呤核酸或在培养过程中加入这一物质，可回收得到高的前-uPA的产量，典型的加入的浓度是10-50 Iu/ml.多效用20-25 Iu/ml。

根据前导顺序是否保留、产物是否能分泌，可连续地或反复地更改培养基从培养基中分离前uPA。如果前导顺序不保留，产物滞留于细胞内，则可以收获细胞，杀死并使之溶出后，分离产物。常用的分离和纯化方法是亲和层析，HPLC、反相HPLC、FPLC、电泳、抽提、沉淀等常用技术。

一个惊奇的发现是，利用这项发明所生产的sc-uPA在β-链上有一个不同的糖基化，却保留了与人类尿中的sc-uPA相同的结构和组成，以及有相同类型的生物活性。实际上，这些产物的α-链有与尿中sc-uPA相同的电泳迁移率，而β-链则有明显的不同的电泳迁移率，其迁移率相当于分子量增加1000-2000。这些差别可以用特异性糖苷酶，如糖肽酶F或唾液酸苷酶来测定，前者能移去糖蛋白上所有的N-链糖，后者能够去除糖蛋白的末端唾液酸残基。

可以看到，该项发明中sc-uPA/tc-uPA得到的sc-uPA或tc-uPA蛋白，经糖肽酶F处理，以移去所有N末端的糖后，其电泳迁移率与人尿中的sc-uPA或tc-uPA的迁移率相同。用相同的方法处理，将该项发明中sc-uPA/tc-uPA的产物的末端唾液酸残基除去，所得的糖蛋白与经同样处理的来自人尿sc-uPA/tc-uPA相比，电泳迁移率不同（迁移率降低）

通过该项发明得到的sc-uPA的生物活性可用简便的体内或体外法测试。体外试验可用所谓的血纤维蛋白板方法，在一个血纤维蛋白凝胶板上测定由该项发明所生产的sc-uPA的血纤维蛋白溶解活性，这种凝胶是血纤维蛋白原和疑血酶聚合而成的。

对照来自尿成细胞的sc-uPA，校正由该项发明所生产的sc-uPA的参数的体外试验法，是一种对sc-uPA到tc-uPA在血纤维蛋白溶酶作用下激活的动力学分析。

另一个体外试验的例子是用合成底物的水解的动力学分析或用血纤维蛋白溶酶激活的seu-PA活化人类宋鞍兹苊冈亩ρ?分析。

进一步的体外试验研究了被血纤维蛋白溶酶激活的sc-uPA（即来自本发明的tc-uPA的复合物）对血纤维蛋白溶解活性的抑制作用。该项研究选用一个特殊的合成底物，用一个已知的人体纤维蛋白溶酶原激活剂的抑制剂，如内皮1（PAⅠ-1）。

所有这些实验对检测被测物的血栓溶解活性是极有意义的，且为治疗应用提供了依据。

得自该项发明的sc-uPA/tc-uPA复合物在这些试验中与人尿sc-uPA/tc-uPA有相同类型的胺溶和血纤维蛋白溶解活性。

D.Collen等在J.Clin.Inv.1983，73，368-376.一文中描述了一个兔体内实验性血栓的体内模型，用以测定得自发明的化合物的血栓溶解活性。

简单说来，用血管夹取出麻醉兔外周颈静脉的一个切片，测定容量。在空的静脉部分加入凝血酶溶液，再加入含人体血纤维蛋白碎片的新鲜血液，形成的血块在移去夹子前放置预计的时间（方便的是30分钟），然后计算碎片的量。把要测试的血纤维蛋白原激活剂注入耳边缘的静脉，一定时间后，将含凝血酶的血管段末端缝合，测定所含的碎片。以残留的碎片和刚开始所含的碎片间的百分率来计算血栓溶解的程度。

由这项发明得到的的sc-uPA化合物与尿中分离的sc-uPA具有相同的生物学特性，因此可被用作相同的治疗指征，即主要用于血栓溶解或治疗血栓疾病。按其本身的技术，这一复合物可被用作象这样的、甚至是更好的系统。在一些参考书中，如Remington的Pharm-aceutical Sciences，17th版，1985，Mack Publishing Co.中描述了这些技术。尤其是这些产物能摸拟一般uPA或scu-PA配方，而配方应用。

一个较好的治疗指征是在梗塞或栓塞早期，如心肌梗塞、肺栓塞或周围动脉栓塞，可产生血栓溶解。给药途经以e.v.为佳，药的形式可以是大丸药或灌注。较好的方法是，e.v.大丸药给药得自该项发明的复合物的血栓溶解有效量，必要的话，在一个很短的时间中进一步e.v.灌注低剂量。根据病人年龄、血栓大小、情况的不同，每日剂量差异很大。对梗塞及相应的治疗，在10-40mg/饮食范围有效，常用15-30mg/饮食对一个正常（70Kg）的病人，最好是20mg/饮食。在这个特殊的治疗范围，已经知道的适当的剂量和服药方案是通过医师一例例治疗后得出的，接该项发明，病例应是混血动物，哺乳动物尤其是人为好。含通常的稳定剂，如所述的商业用尿激酶的剂量单位是50，000-200，000 IU uPA/单位。

以下是一种冻干药物制剂，在2ml无菌盐水中复溶，e.v.注射.

3 Fll sc-uPA 5mg

甘露糖醇 20mg

乙二胺四乙酸钠 2mg

磷酸缓冲液q.s.

关于该项发明中转染载体的制备和方法方面，以下将作详细阐述。（从A.1至A.7）

A.1-人类uPA基因的克隆.

人类基因组DNA库是通过将部分消化的肝DNA克隆在Charon 28λ载体中获得的，含uPA基因的噬菌体是通过用适当探针筛选基因库得到的，这种探针来自部分未拼接的人uPA CDNA。分离阳性噬菌体克隆，用限制性分析法测定，分离含uPA“读码”（ORF）的部分或含uPA启动子的5′区域部分。

A.2-uPA编码DNA的制备

人类uPAm RNA的5′末端附近，有4个SmaⅠ限制性切点最右边的位于编码区以外，在uPA多聚腺苷化位点之上，这些5′的SmaⅠ位点聚集在第一个外显子和第一个内含子内的小片段DNA上，接着这一区域的是位于第二个外显子开始处的转译起始编码（图1）。

λ-uPA噬菌体克隆的限制性分折表明，至少在我们这样的酶解情况下，仅仅第1和第5 SmaⅠ位点被切开。所以，用SmaⅠ消化λ-uPA1，在琼脂糖凝胶上分离DNA片段，有可能切除uPA编码区域，然后插入一个不同的载体。这样做，也可得到另一个SmaⅠ片段，更确切地说，是从5′到uPA ORF的2.38千碱基对SmaⅠ片段，含uPA mRNA起始点、启动子和通过反一调节因子进行调节的区域。这一片段能调节3′邻近基团的mRNA转录。

A.3-uPA基因在动物细胞中的表达。

为了在哺乳动物细胞内表达人类uPA基因，编码uPA mRNA的DNA区域必须置于真核细胞启动子的转录控制之下。一系列不同的信号（即增强子和多聚腺苷化位点）会影响mRNA的转录率和mRNA的稳定性（Y.Gluzman，Viral Vectors，Cold Spring Harbor Press，New York）。

A.4-RSV衍生载体的构建

该项发明中，有效的真核生物启动子是劳氏肉瘤病毒（RSV）长末端重复（LTR）（见D.E.Schwartz等，“劳氏肉瘤病毒的核苷酸分析”，《Cell》32，853（1983）。转好的RSV衍生质粒是“质粒RSV-Neo”。抗菌素新霉素抗性基因来自细菌转座子Tn5，被插入至RSV增强子和启动子下游的RSV LTR中，5′一直到SV40多聚腺苷化位点。因它还含有PBR322来源的氨苄青霉素抗性和复制功能起始点，RSV-Neo质粒可在大肠杆菌中繁殖，转染到哺乳动物细胞内，RSV-Neo使这些细胞对新霉素和其类似物产生抗性（参见F.Colbere-Garapin等，“高等真核细胞的一种新的显性选择标记”;《J.Mol.Biol》.150，1（1981）和P.J.Southeton和P.Berg，“在SV40早期区域启动子控制下哺乳动物细胞向含抗菌素抗性基因的细菌基因的转化”;《J.Molec.和Appl.Genetics，》1，327（1982））。

表达人类uPA的载体可以从RSV-Neo获得，用uPA编码区域代替位于RSV启动子和SV40多聚腺苷化位点之间的新霉素抗性基因，这样，用RSV-Neo作为一种起始材料，人类uPA基因以相同的转录定向插入到RSV LTR中，这样的质粒叫RSV-sc-uPA。含有这种质粒的哺乳动物细胞的转化，可使它们产生在培养基中分泌uPA的能力。

简单地说，uPA表达载体（RSV-uPA）可以如下构建：

a）从λ-uPA噬菌体的插入中得到一个含uPA编码区域的7.3千碱基对片段。

b）一段含RSV的LTR的DNA片段，SV40多聚腺苷化位点和PBR322衍生氨苄青霉素抗性以及来源于质粒RSV-Neo中的原核生物复制起始点。

c）在RSV启动子的控制之下插入了uPA编码区域，形成细菌质粒RSV-uPA。

d）RSV-uPA与RSV-Neo一起共转染至哺乳动物细胞内

e）选择带有抗菌素抗性，并产生uPA的克隆，进一步扩增。

A.4.1-载体DNA的制备

RSV-Neo是一个已知的、目前应用的质粒，它含有来自细菌转座子Tn5在RSV启动子转录控制之下的新霉素抗性基因，转染入哺乳动物细胞后，质粒使其对新霉素类似物G418产生抗性。

RSV-Neo用HindⅢ消化，5′凸出未端用DNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段补平。用HpaⅠ消化，用小牛小肠磷酸酶（CIP）处理，使之产生两个平整末端的、去磷酸化片段。小的含有复制起始点和来自质粒PBR322的氨苄青霉素抗性基因。在它的端点，有RSV启动子和SV40多聚腺苷化位点（PAS），在琼脂糖上分离后，这个3.5千碱基对片段被纯化，作为一个真核生物的表达读码，其中可以插入uPA基因。

A.4.2-在RSV启动子下uPA基因的克隆

插入片段和载体DNA被连在一起，转化感受态大肠细胞，在氨苄青霉素抗性克隆中筛选出RSV-uPA，它含有接适当方向插入到RSV LTR内的人类uPA编码区域

A.5 BPV衍生游离载体的构建

增加用外源基因转化哺乳动物细胞的蛋白质生产的可能性是增加基因拷贝数。例如，使用脱氢叶酸还原酶（DHFR）来源的载体或牛乳头状瘤病毒（BPV）来源的载体。

BPV是一个通常出现在牛肉瘤中的7945bp（碱基对）长的双链环状DNA病毒[见C.Y.Chen等，“牛乳头状瘤病毒Ⅰ型基因组的基本结构和遗传组织”，《Nature》299，529（1982）]。感染细胞使染色体外的病毒DNA保持稳定的游离基因形式高拷贝地存在。（见M.F.Law等，“用牛乳头状瘤病毒转化的小鼠细胞只含有染色体外的病毒DNA顺序”，《Proc，Narl.Acad.Sci.》USA78，2727（1981），和W.D.Lancaster，“在病毒诱导的马和牛肿瘤细胞和病毒转化的鼠细胞中牛乳头状瘤病毒DNA整合的明显缺失”，《Virology》108，251（1981））。BPV基因组能被粗略地再分成三个功能区：非编码的调节区，约1kb（千碱基对）长，在HindⅢ和HpaⅠ位点之间，转化区域在BamHⅠ和HpaⅠ之间，跨越约60%的基因组，从BamHⅠ到HindⅢ间的病毒结构蛋白的编码区（见M.Lusky和M.Botchan，“牛乳头状瘤病毒质粒完整顺序的特性”，《Cell》，391（1984），和B.A.Spalholz等，“用E2基因产物反向激活牛乳头状瘤病毒转录调节因子”，《Cell》42，183（1985））。BPVDNA能被用来转化啮齿类细胞，但在体外转化的细胞中却不能形成BPV颗粒，因为BamHⅠ-HindⅢ区域不能被表达（E.Antmann，“BPV转录，多聚腺嘌呤RNA和转录方向的评价”，《J.Virol.》43，59（1982），和L.W.Engel，BPV型的转录方向，《J.Virol.》47，516（1983））。但这个区域似乎对转化并不必须。用BPV和pMLd构建了杂化质粒，pMLd是一个缺失了抑制病毒在哺乳动物细胞中复制的某种“有害”顺序的质粒pBR322衍生物[M.Lusky和M.Botchan，“牛乳头状瘤病毒质粒完整顺序的特性”，《Cell》36，391（1984）;B.A.Spalholz等，“用E基因产物反向激活牛乳头状瘤病毒转录调节因子”，《Cell》42，183（1985）]。这些重组病毒能在E.coli和动物细胞中扩增，并能容易地在重组DNA过程中使用[D.Di Maio等，“BPV载体能象质粒一样在小鼠和细菌细胞中复制”，《Proc.Natl.Acad.Sci.》USA79，4030（1982）;P.J.Kushner等，“一个能在小鼠细胞和E.coli中复制的质粒”，《J.Mol.Appl.Gen.》1，527（1982），N.Sarver等，BPVDNA：“一个新的真核细胞克隆载体”，《Molec.and Cell.Biol.》1，486（1981）]。BPV基因组体外转化啮齿类细胞的能力保持在杂化质粒中[C.A.Heilman：“在BPV转化的小鼠细胞中病毒的专一性转录”;《Virology》119，22（1982）]，这种重组质粒能被用作哺乳动物的表达载体（F.Colbere-Garapin等，“一个对高级真核细胞的新的明显的选择性标记”，《J.Mol.Biol.》150，1（1981））。P.J.Southern和P.Berg，“用SV40早期启动子控制之下的细菌基因对哺乳动物细胞转化为抗菌素抗性”，《J.Molec.and Appl.Genetics，》1，327（1982）;N.Sarves等，“能在细菌中存活的BPV-pML2质粒载体在小鼠细胞中的复制和转化”，《Proc.Natl.Acad.Sci.》USA79，7147（1982）;N.Sarver等，“BPV穿梭载体，基因表达”，《J.Setlow》和A.Hollander ed，173，Plenum Press，NewYork.N.Sarver等，“在BPVI型载体中大鼠前胰岛素原基因的增加子依赖性表达”，《Mol.Cell.Biol.》5，3507（1985）;E.T.Scherborn等，“经BPV载体导入小鼠细胞的人U1基因的表达”，《Mol.Cell.》5，1318（1985）;M.Eiden等，“通过使用BPV来源的穿梭载体，在小鼠细胞中引入Ⅰ型人T细胞型白血病毒小外壳蛋白”，《Mol.Cell.Biol.》5，3320（1985）;P.M.Howley等，“来源于BPVDNA的真核的克隆载体”;《Methods in enzymology》101，387（1983），D.Di Maio等，“经BPV载体导入小鼠细胞的克隆的HLA重链基因的高水平表达”;《Mol.Cell.Biol.》4，340（1984）;N.Husiung等，“用BPV-金属巯基组氨酸三甲基内盐载体高效生产乙型肝炎表面抗原”，《J.Molce.Appl.Genet.》;Y.Wang等，“用染色体外复制的BPV载体在NIH3 T3小鼠成纤维细胞中增加生产乙型肝炎表面抗原”，《Mol.Cell.Biol.》3，1032（1983）;M.Karin等，“携带在自主复制穿梭质粒上的人金属巯基组氨酸三甲基内盐基因的表达和调节”，《Proc.Natl.Acad.Sci.》USA80，4040（1983），L.Maroteaux等，“BPV-干扰素β-1重组子转化的小鼠细胞中，人类干扰素β-1-基因的放线菌酮诱导表达”，《J.Virol.》47，89（1983）;S.Mitrani-Rosenbam等，“小鼠细胞中BPVDNA载体上的人干扰素β-1基因的诱导表明及染色体外表达的维持”，《Mol.Cell.Biol.》3，233（1983）;G.N.Palakis和D.H.Hanmer，“在异源细胞中克隆的生长素和金属巯基组氨酸三甲基内盐基因的表达”，《Recent Progress in Hormone Research》39，363（1983），含有BPVDNA的BPV230.8质粒在BamHⅠ位点克隆λp BR322来源的pML2d质粒，（见B.Binetruy等，“含有与质粒DNA相连的BPV型1DNA的重组DNA分子的质粒状态在啮齿动物成纤维细胞和细菌细胞中”，《EMBOJ.》1，621（1982））。

游离基因表达载体有两个主要优点：

a）转染的DNA与转化不同，它是插入在细胞染色体DNA中，游离基因载体保持基因在一特定的环境中表达。

b）基因拷贝数通常较用插入基因得到的高且更稳定。

含有RSVuPA启动子ORF转录单位的一系列BPV衍生载体构建如下：

Ⅰ）在pBPV230.8的三个不同的位点插入单一的XhoⅠ位点可获得三种不同的载体。

Ⅱ）在RSV-uPA的转录单位末端插入两个XhoⅠ位点。

Ⅲ）用XhoⅠ酶切RSV-uPA转录单位，双向插入三种BPV衍生载体上

Ⅳ）通过在哺乳动物细胞中用RSV-Neo与它们共转染，并筛选具有抗菌素抗性，产生uPA克隆的方法来检测六种质粒产生uPA的能力。

A.5.1-BPV230.8的限制性位点的修饰。

为了避免不适当的插入位点和基因定向（如启动子阻抑），最好在BPV230.8质粒的三个不同位点双向插入RSV-uPA结栓。为了做到这点，通过插入一个磷酸化的XhoⅠ接头分别将质粒的限制性内切酶位点BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ进行改造。质粒DNA首先用合适的酶酶切，然后用DNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段将凸出端补平，加入大量的XhoⅠ接头进行连接，得到的DNA片段用XhoⅠ分解，自身联结后再转化E.coli的感受态细胞。

得到的三种质粒：

-pBB：新的单一位点XhoⅠ被插入在BamHⅠ位置，通过接头与载体的融合，使两侧各有一个BamHⅠ位点。

-pBS：新的单一位点XhoⅠ被插入SalⅠ位置，通过接头与载体的融合，使两边各产生一个SalⅠ位点。

-pBH：新的单一位点Xho1被插入HindⅢ位置。

A.5.2.-RSVuPA的限制性内切酶修饰

在RSV-uPA质粒中，限制性内切酶NdeⅠ和ApaⅠ每个只能切割一次，前者在接近RSV启动子的pBR322的衍生区，而后者在靠近uPA多聚腺嘌呤位点的SV40的分区。这两个位点用XhoⅠ接头修饰如下：质粒DNA用NdeⅠ和ApaⅠ双酶切，凸出端补平后用XhoⅠ接头修饰。将含有复制起始点和氨苄青霉素（Amp）抗性的片段去磷酸化。然后连接到含有RSV/uPA表达功能的片段上，这样得到质粒p71。该质粒上的RSV/uPA结构两侧各有一个XhoⅠ位点。用XhoⅠ酶切之后，它将产生一个含有RSV启动子，uPA编码区的DNA片段，适用于克隆到任何含有XhoⅠ或者SalⅠ位点的载体或者那些可被改造后含有这些插入位点的载体。

A.5.3-在BPV衍生载体中RSV/uPA的插入

将pBB和pBH分别XhoⅠ酶切，而pBS用SalⅠ酶切，并将线性化的载体各自用CIP去磷酸化，含有RSV/uPA结构的片段是通过用XhoⅠ酶切质粒p71，并在琼脂糖凝胶上分离得到的，将载体和插入的DNA连接，再用在BPV上仅有一个切点的XbaⅠ酶解，然后自身对合，用于转化E.Coli感受态细胞，可以得到一定数量的在三个不同位点双向插入RSV/uPA转录结构的质粒。

A.6-人类uPA启动子的制备

已知通过RNA多聚酶Ⅱ转录的真核基因是在非常复杂的启动子的转录控制之下，这些启动子的激活或阻遇导致了每一个基因在细胞周期、组织和分化阶段的专一性表达。而且细胞外因素（如：激素、离子、温度）通过完全不同的机制激活，调节或阻遇活性的稳定状态水平。DNA结合因子、核基质和DNA共价修饰，如甲基化，给启动子提供了转录附近基因的能力。

将一个位于编码pro UK ORF上游并含有pro UK mRNA起始位点和启动子的DNA片段克隆到无启动子质粒pEMBL8-CAT SmaⅠ位点上，该位点在细菌氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因上游得到的质粒（定名为puPA2），在向启动子方向的SmaⅠ位点的5′端插入XhoⅠ接头以便于进一步修饰。puPA2质粒及其衍生物最终转染到培养的哺乳动物细胞中，通过估计CAT的活力来测定它们的转录能力。

该实验的结果表明，uPA启动子能推动CAT基因的转录，其转录水平可以与RSV启动子相比，因此，当外源基因或cDNA插入在uPA启动子下游的多聚接头区域时，puPA2质粒及其衍生物是强表达载体。所以含有uPA启动子区域的质粒片段可被用作插入在质粒多聚接头中的基因和cDNA前的“表达盒”（多聚接头来自pEMBL8）。

A.6.1-uPA表达载体

用SmaⅠ酶切λ-PA1 DNA可产生一个含有人类uPA启动子的片段（参见前），该片段可被克隆到一个基团的上游以起始该基团在合适的哺乳动物细胞内转录，这种结构主要有三个优点：

-表达载体不需要含有任何病毒源的一些顺序-启动子含有具有可被离子、化学物质、激素等信号诱导的特性的顺序

-保留在mRNA5′端的启动子来源顺序给mRNA提供了较高的稳定性

简而言之，含有可起始3′区域基因转录的人类uPA启动子的载体制备如下：

a）通过SmaⅠ酶切从λ-uPA1中得到一个2.38千（碱基对）片段

b）该片段以一定方向，在SmaⅠ位置插入到一个质粒中，如pEMBL8 CAT，从而得到质粒puPA2;

c）启动子的SmaⅠ5′位点通过接头作用转变为XhoⅠ位点，因而产生了质粒puPA2/41（该质粒与puPA2相似），当进入一个适当的哺乳动物细胞时能表达邻近的CAT基因。

d）用XbaⅠ部分酶切puPA2/41将CAT基团切掉，补平凸出末端，与SalⅠ接头连接，再用SalⅠ酶切以得到质粒pPP41;

e）从λ-uPA1噬菌体中得到含有uPA ORF的一个7.3（千碱基对）SmaⅠ片段（见A.2），将其按正确的方向插入到pPP41单一的SmaⅠ位点中，以得到各为pPP41XS的uPA表达质粒;

f）pPP41XS与RSV-Neo共转染;

g）选择带有抗菌素抗性及产生uPA的克隆并扩增。

A6.2-puPA2质粒的构建

为了得到puPA2质粒，用SmaⅠ酶切λ-uPA1噬菌体DNA，从凝胶中回收纯化2.38kb的色带，插入到用SmaⅠ酶切并用CIP去磷酸化的PEMBL8载体中，选择具有正确方向启动子重组质粒的细菌克隆，其中，puPA2含有一个从前uPA启动子5′端到CAT基因的2.38千碱基对片段。当转染入前uPA生产细胞时，它能起始细菌基因的转录。

A6.3 puPA2/41质粒的构造

为了在前uPA启动子5′端插入一个单一位点以用于进一步改造puPA2质粒，可以用SmaⅠ部分酶切，然后插入XhoⅠ接头，以改造该限制性酶切点，得到的质粒puPA2/41的uPA启动子的上游端SmaⅠ位点被单一的XhoⅠ位点所代替。

puPA2质粒以及衍生物起始邻近CAT基因转录的能力与RSV-CAT相比较，在RSV-CAT质粒中，CAT基因是在RSV LTR的转录控制之下，通过磷酸钙沉淀法将质粒导入A1251细胞（细胞系源于肾癌），用瞬时表达检测法测量CAT活性。

puPA2/41 DNA用XhoⅠ部分酶切，凸出端用DNA多聚酶Ⅰ Klenow片段补平，与过量的SmaⅠ接头连接，再用SmaⅠ酶切，在琼脂糖凝胶上纯化4.8千碱基对的片段，自身连接笞惺芴珽.coli细胞，用小量制备分析法筛选质粒pPP41。外源基因可以插入在PEMBL8的uPA启动子和mRNA转录起始点下游的多聚接头，可使用XhoⅠ和SalⅠ将启动子基因结构从pPP41上切下来，插入已知质粒的XhoⅠ或SalⅠ位点上。

A6.4-在pPP41中uPA基因的插入

将λ-uPA1 DNA用SmaⅠ酶切得到的7.3千碱基对片段的uPA ORF，与SmaⅠ酶切，CIP处理过的pPP41DNA连接起来，转化E.coli感受态细胞。在抗氨苄青霉素克隆中，筛选载有由其本身启动子控制的uPA ORF毗邻区域的质粒pPP41XS，这个结构重新建成了在mRNA起始位置下游的原来的SmaⅠ位点及原来的mRNA转录顺序。

A.7-uPA启动子缺失衍生物的构建

质粒细胞启动子的改造，如缺失、插入或突变都可以给启动子提供一个新的特性，如更广的专一性和更高的转录水平。事实上，在这类启动子中，诱导区域仍然保留着，因此，当所产生的蛋白质对细胞的生物学有负干扰时，可以通过外界因子来调节它们，以提供特殊的作用。

来源于人uPA启动子的2.38千碱基对DNA片段的内部缺失可以通过基因工程改造细菌质粒（如上述的）puPA2/41方便地得到，尤其是通过使用已经存在于uPA启动子内的限制性位点得到的缺失，用这种方法得到两种质粒：

质粒puPA2/17，在两个OxaNⅠ位点之间有625bp（碱基对）的缺失。

质粒puPA2/254，从在5080位置的OxaNⅠ位点到6369位置的EcoRⅤ位点内有1.28千碱基对的缺失。（参见图8，puPA2质粒图）

这两个质粒在修饰过的uPA启动子的下游载有CAT基因，因此，当质粒转染真核细胞后启动子活性可以通过在真核细胞内的质粒的转染之后测量CAT活性而方便地检测。

由于使用了来自于PEMBL8读码的多聚接头，不同的基因可以容易地置于这些缺失启动子的控制之下，这些缺失启动子能被称为“表达盒”，从5′→3′方向，带有启动子、mRNA起始位点、多聚接头及不同载体所带有的插入的上游基因。

使用这个结构，还表达了uPA基因，简单地说，组建如下：

a）puPA2/41用OxaNⅠ完全消化，以得到puPA2/17;

b）puPA2/41用ECoRV、OxaNⅠ完全酶解，然后用DNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段补平，以得到质粒puPA2/254;

c）测定CAT的转录水平以检测两个由uPA衍生的缺失性启动子的转录的转录能力;

d）如A6.3所述，将CAT基因从puPA2/17和puPA2/254中切除;

e）将uPA ORF置于两个有缺头的启动子的控制之下;

f）将两个uPA表达载体转染哺乳动物细胞。

附图用于进一步列举本发明，在说明书和权利要求书中参考附图是用作说明的，但它并非将本发明局限于这个范围。下面对于附图的简短说明被用于帮助理解附图和更全面更容易地理解本发明。

图1是uPA基因、mRNA和蛋白质的结构。

从上到下：

uPA基因插入至噬菌体λ-uPA2的限制图;

uPA基因插入至噬菌体λ-uPA1的限制图。

uPA“开放读码”（Ba：BamHⅠ;EⅠ：EcoRⅠ;S：SmaⅠ;HⅢ：HindⅢ）的限制图;

人体uPA基因的外显子/内含子的结构：黑块：末转译的5′和3′区，阴影块：转译的外显子;划线处：转译的内含子;

部分未剪接的cDNA克隆体pHUKI的外显子/内含子的结构;

在外显子和前uPAmRNA的氨基酸之间的对应性;

在蛋白质区和前uPA中的氨基酸之间的对应性。

图2是RSV-uPA的结构。

一含有用于从λ-uPA1中得到的uPAmRNA的完整ORF的SmaIDNA片段（见图的上部）被插入消化后的RSV-Neo质粒至HindⅢ和HpaⅠ上的转录有用的部分中，RSV-Neo质粒携带细菌质粒的功能和RSV的LTR（见该图的左面）。RSV-uPA具有在包含于RSVLTR中的启动子控制下的uPA ORF，当它插入到一个合适的真核细胞宿主时，它可以表示蛋白质（见该图的下部）。

图3是RSV-uPA的限制性位置的修饰。

RSV-uPA中的NdeⅠ和ApaⅠ的部位可通过产生质粒p71的连接物的插入而被两个XhoⅠ位置所取代（见图3中部）。在RSV启动子控制下，用XhoⅠ消化p71质粒得到一含有uPA ORF的片段，该RSV启动子可以被插入至含有载体的XhoⅠ或SalⅠ中（图3下）。

图4是pBPV-230.8的限制图。

由pBR332衍生的pML2d被插入到BPV-1基因组（Saver等《mol.Cell.Biol.》5，3507;1985）的唯一的BamHⅠ位置，BamHⅠ系邻近转译区的3′末端的位置被修饰成SalⅠ。

图5是将RSV-uPA结构插入至游离基因载体。

质粒pBPV230.8通过取代分别从pBB、pBH和pBS中得到的三个病毒位置BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ的一个而被修饰，相应地得到pBB、pBH及pBS。在每一衍生的载体中的新的XhoⅠ位置被涂块。由XhoⅠ连接物插入而产生的新的BamHⅠ和SalⅠ的位置以及位于pBB和pBS中的XhoⅠ位置的侧面的BamHⅠ和SalⅠ均被显示。

在上述三种质粒中，RSV/uPA结构（见图3）被插入到由下面的两组质粒定位的XhoⅠ位置：

pBBuPAa、pBHu PAa和pBSu PAa，这里uPA和BPVm RNAs转录成和BPV有同样的方向。

pBBuPAb，pBHuPAb和pBSuPAb，这里uPAmRNA和BPVmRNAs在反方向转录。

图6是puPA2的结构。

质粒pEMBL8-CAT是通过用携带细菌CAT基因（Dente等，《Nucl.Acid Res.》，1645-1655;1983）的片段取代ClaⅠ和HindⅢ之间的片段而从pEMBL8衍生的。一含有uPA启动子的SmalⅠ片段插入到产生质粒puPA2的CAT基因的上游（本图的右边），质粒puPA2具有可转录CAT基因的正确的启动子顺序位置。

图7是人体uPA启动子的顺序

这里显示的是从含有mRNA启动点的λ-uPAⅠ噬菌体DNA的2.38Kb SmaⅠ片段的顺序、TATA盒状室和uPA启动子的上游调节基因区。在图上的核苷酸+1对应于由Riccio等引述的采用引物扩张分析后的uPAmRNA中的第一个核苷酸。

图8是uPA启动子和它的衍生物的限制图。

这里显示了表明uPA启动子已经被修饰的puPA2修饰质粒的限制图;尤其是：

puPA2/41，这里，在启动子5′末端位置的SmaⅠ已被转化为XhoⅠ;

puPA2/17，这里在两个OxaNⅠ位置之间的区被删除了;

puPA2/254，这里在5′OxaNⅠ位置和EcoRⅤ位置之间的区被删除了。

图9是uPA启动子衍生的载体

图9A描述了质粒puPA2/41、puPA2/17和puPA2/254的限制图。

图9B描述了用SalⅠ/XbaⅠ消化和SalⅠ连接而切除CAT基因而依次从puPA2/41、puPA2/17和puPA/254得到的质粒pPP41、pPP17和pPP254的限制图。

这些载体含有uPA启动子（或它们的衍生物）、TATA盒状室和mRNA启动点，苯遣迦牒螅纾镁哂蠱boⅠ、BglⅡ、BclⅠ和BamHⅠ末端的片段，将它们插入平整末端的SmaⅠ位置或插入BamHⅠ的位置，它们可用于表达基因。这些结构可以用Xhol和SalⅠ双重消化而切除。同样的双重消化可以用切除在所表达的基因或cDNA不同质粒5′上插入的启动子结构，如“挤出喑盒”一样。黑圆点表明质粒复制的起始源。

图9C描述了通过将含有uPA ORF的7.3Kb SmaⅠ片段插入质粒的SmaⅠ位置而依次从pPP41、pPP17和pPP254衍生的质粒pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS。

图10是3Fllscu-PA与人肾scu-PA（Kohno T.、Hopper P.、Lillquist J.S.、Suddith R.L.、Greenlee R.、Moir D.T.《Biotechnol.》1984，2，628-634）、人体A431scu-PA、人体尿scu-PA和鼠scu-PA的N-末端的氨基酸顺序（18个残基）的对比。

图11是：

a）尿的scu-PA

b）从A431细胞中得到的scu-PA

c）RSV-A431-scu-PA

d）RSV-LB6-scu-PA

e）BPV-LB6-scu-PA

f）RSV-CHO-scu-PA

在非还原条件下的SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳）结果

最右边的一行表示分子量标准。

图12是在还原条件下（见1.6.2），在用血浆酶将图11中所述的scu-PA′s（以相同的顺序）转化为相应的tcu-PA′s的活化作用后的SDS-PAGE结果。最右边的一行表示分子量标准。

图13是在还原条件下（见1.6.5），用血浆酶活化如图11中所述的scu-PA（以相同的顺序）而得到的tcu-PA′s未经处理的和用糖肽酶F处理后的SDS-PAGE的比较。未处理的tcu-PA和糖肽酶F处理后的tcu-PA为1∶1的混合物置于一个行列上。

最右边的一行表示分子量标准。

图14是在还原条件下（见1.6.5），用血浆酶活化如图11中所述的scu-PA′s（以相同的顺序）而得到的tcu-PA′s未经处理和用神经氨酸酶处理后的SDS-PGAE的比较。未经处理的tcu-PA和神经氨酸酶处理后的tcu-PA的1∶1的混合物置于每一行列中。

最左边的一行表明分子量标准。

下面的实例只是用于阐述明本发明和开发本发明的途经，但并非将本发明局限于此。为了使它们更容易理解，我们在一些章节（从1.1-1.6.7）中描述了一些实例中所要应用的技术和方法（如酶修饰、DNA沉淀、蛋白质纯化等），在不同的实例中，所用的技术和方法基本相同。

1.1所使用的细胞是商业上可得到的或通过科学团体可以得到的

1.2细胞在一合适的培养基，诸如含有10%加热灭活的胎儿温血清的改进的Dulbecco′s培养基（Eagle）（DMEM）中生长。

1.3用于分子生物学的培养基、缓冲液和溶液。

在所有情况中试剂是在可得到的情况下用“DNA/RNA级”和“分析纯级”的。如果不另加说明，则用于细菌和噬菌体生长的液体和固体培养基、缓冲液和溶液均采用在Maniatis T.、Fritsch E.F.、Sambrook J.著《分子克隆》，（一本实验室手册，Cold Spring Harbor实验室，（1982），以后称“Maniatis等”中所描述的方法制备、贮存和使用。如果不另加注明，则玻璃器皿、塑料器皿和实验室的设备均采用同样的参考文献中所描述的方法置备、贮存和使用。使用去离子/蒸馏水，如用于酶缓冲液，则要使用热压处理后的水。

1.4用于分子生物学的酶

限制性核酸内切酶、DNA修饰酶和RNase（核糖核酸酶）均是商业上可得到的。我们所使用的是从Boehringer、Bethesda Reserch Laboratories（BRL）、Collaborative Reserch、New England Biolabs和Pharmacia处购买的。溶菌酶和牛血清白蛋白（BSA）也是商业上可得到的。我们从Boehringer的BSA和Sigma处购买溶菌酶。通常所使用的缓冲液被用于每一个酶反应。它们的组成和制备是公知的，通常是根据卖酶的公司提供的报告而制备的，制成物均进行无菌过滤并于20℃等分贮存。一般所使用的很多缓冲液也都是在商业上以浓缩液购得的。合成的DNA衔接物如t-RNA和鲱鱼精液DNA均是商业上可得到的。我们从P-LPharmacia或New England Biolabs购买合成DNA街接物，从Boechringer购买t RNA和鲱鱼精液DNA。

1.5 rDNA技术

如果在下列实例中不另外注明，rDNA技术是以Maniatis等和在本文最初的参考文献中所描述的方法而进行的。

1.5.1.限制性消化和DNA的酶修饰

一次或多次限制性消化和DNA酶修饰均以已有技术的方式进行，也可用通常可得到的制造手册中或Maniatis等，Ch.4中描述的方式进行。“热灭活”是指在70℃保温10-15分钟使酶灭活，然后在室温下保持10-15分钟，并在Eppendorf离心机中旋转2分钟，使混合物沉出。较佳地，限制性消化和DNA酶修饰后的结果可于含有1%琼脂凝胶的0.5微克/ml的溴化3.8二氨基5-乙基-6-苯基菲啶翁上于100V层析1-2小时进行证实（也可参见Maniatis等，Ch.5）。

1.5.2 苯酚/三氯甲烷抽提

较佳的是以Maniatis等，P.458-459中描述的方式从核酸水溶液中得到蛋白质的苯酚/三氯甲烷的抽提物。当反应体积小于200微升时，DNA可被反抽提。

1.5.3 DNA沉淀

较佳地，通过加入0.1倍体积的3MpH5.2的醋酸钠和2.5倍体积的乙醇（在-20℃）而进行DNA沉淀。只有当在下列实例中指明时，可加入20～40微克的tRNA。混合物置于干冰/乙醇浴中15～30分钟，或保持在-20℃过夜，然后在Eppendorf微型离心机中或在Sorvall离心机中于4℃离心15分钟（10000×G）。DNA块状物用70%乙醇洗一次，再用100%的乙醇清洗一遍，最后在Savant真空离心机中干燥。

1.5.4：5′末端脱磷酸作用

较佳地，DNA5′末端脱磷酸是用商业上可得到的腓肠磷酸酯酶（CIP，从Boehringer购买的），在37℃，pH＝8下保持1小时而进行的。CIP可以通过苯酚：三氯甲烷抽提除去，也可将EGTA（亚乙基双（氧亚乙基次氨基）四乙酸）加入到其最后的浓度为约50mM并在68℃加热45分钟而除去CIP。

1.5.5 DNA连接

DNA连接以已有技术中的方法进行。通常，要遵循T4 DNA连接酶的制造商的说明。通常，当合成衔接物被使用时，连接酶反应在8℃进行，而在所有其它的情况下，则在14～16℃下进行反应。当DNA的平整末端要进行连接时，PEG1500或PEG4000被加入到10%的最终浓度。通常，下列组成的10×连接用缓冲液被使用：0.66MTris-HCl（pH＝7.6）、50mM Mg Cl₂、50mM二硫代苏糖醇和50mMATP。

1.5.6 DNA衔接物

较佳地，衔接物DNA以Maniatis等，125-126页中所描述的方法使用，磷酸化和验证，以392页中描述的方法使用，单个衔接物以及衔接DNA片段的连续激酶反应、连接和限制均可采用电泳来检验：将衔接物置于2%琼脂糖凝胶上10～20分钟（衔接DNA片段则为1～2小时），然后，以Maniatis等，172页中描述的采用自体放身造影照片法目测DNA。

1.5.7 制备型凝胶电泳

较佳地，制备型凝胶电泳在含有0.5微克/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡的0.7%～0.8%的琼脂凝胶上于1×TBE缓冲液[0.089M Tris、0.089M硼酸和0.002M EDTA，（Maniatis等，156页）中进行。DNA首先在25V移动2小时，并在50V移动16～20小时。DNA片段在紫外透射器305nm下被目测，DNA带被切割下来并放在一电洗提系统（ISCO），在0.1×TBE于400V电洗提10～15分钟。DNA在一预备好的Elutip-D层析柱（Schleicher & Schuell）中纯化，并用一低盐缓冲液淋洗和用一高盐缓冲液洗提。较典型的是层析柱在一含有0.2M Nacl，20mM pH7.3-7.5的Tris-HCl（Tris是2-氨基-2-羧甲基-1，3-丙二醇）和1.0mM EDTA的缓冲液中制备。该缓冲液也可用于洗涤。洗脱缓冲液含有1.0M NaCl、20mM Tris-HCl（pH7.3-7.5）和1.0mM EDTA。最后，DNA如1.5.3中所描述的那样沉淀。

1.5.8 大肠杆菌的转化

较佳地，大肠杆菌的转化[C.f.Hanahan D.“带质粒的大肠杆菌的转化作用研究”《J.Mol.Biol.（1983）155，557-580]采用商业上可得到的或其它机构可得到的感受态细胞，诸如本技术领域中已知的BRL（Bethesda Research Laboratories）的菌株DH1、DH5或HB101而进行，这些菌株在制造商的说明书中都进行过摘录。通常，当DNA片段被插入至不同的质粒中时，要使用100微升（BRL）的原液，当用DNA衔接物转化限制位置时，使用少量的20微升（BRL）的原液。在无抗生素培养后，细胞被展开于LB琼脂平板上（Maniatis等，P440-444）并在合适的抗生素存在下，37℃培养过夜。

1.5.9 转化后的细胞的筛选（小型处理分析器分析）

较佳地，DNA转化感受态大肠杆菌的抗性菌落通过在5ml LB和适量抗生素（Maniatis等，P440）和液体培养的分析样品（1.5ml），于37℃过夜使独立的菌落生长而进行筛选，采用Maniatis等（P366-367）所描述的煮沸法。通常，要引入下面的更改。

反应体积增加为1.5倍;

大肠杆菌菌株DH1被煮沸60秒;

不增加盐，但增加1倍体积的异丙醇并将试管在-20℃保持20～25分钟而进行DNA沉淀;

沉淀的DNA用1ml70%的乙醇清洗一次，再用1ml100%的乙醇清洗一次;

无DNA酶的RNA酶以10微克/ml的浓度加入，DNA在70℃培养20分钟。

1.5.10 质粒的大规模制备

较佳地，质粒的大规模制备以Maniatis等，Ch.3中描述的方法进行。较佳为碱性溶菌法被用于回收质粒DNA（参见，Mamiatis等，P.90-91），质粒DNA在含有Cs Cl梯度级分的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁中纯化二次，然后，混合物用异戊醇抽提，含有DNA的水相被分离出来，进行TEpH8透析（Maniatis等）并在4℃贮存。

1.6所得到的前-尿激酶（Pro-uvikinase）的纯化和特性测定。

1.6.1 化学药品

所有使用的化学药品是商业上广范围可得到的或能从商业上可得到的产品制备的。例如，下面的一览表包括了在下面的实例中所使用的化学药品和它们的来源：从Bio Rad，Richmond，USA得到的Affi-凝胶10（活化琼脂糖）、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、Camassie亮蓝、从pharmacia，Uppsala，Sweden得到的CNBr活化的琼脂糖（凝胶）、用于低分子量蛋白质电泳标定的工具;安福林两性电解质系从LKBAB Bromma Sweden购得;从Sigma.化学公司，St Louis，MO63178，USA得到的牛血清白蛋白（BSA）、Cohn级分V、猪胰蛋白酶、猪血浆酶、纤维蛋白原Ⅰ型级分Ⅳ、苄脒、从Bayer，Leverkusen，GFR得到的无嘌呤核酸，从Boehringer Mannheim GmbH，FRG得到的糖肽酶F，从Kabi AB，Stockolm，Sweden得到的S-2444。高分子量的尿激酶（HMW-uPA）由Lepetit Rsesarch Laboratories Sp A Milano，Italy制备。Scu-PA（pro-uPA）可以根据Stump.D.C.，Thienpoint M.、Collen D《J.Biol.Chem，》261，1267-1273，1986中所描述的方法而大量地制备。A431-scu-uPA是根据CortiA.Nolli M.L.、Soffientini A.、Cassani G.在《Thromb Haemostas》56，219-224，1986中所描述的方法而得到的。人体内皮血纤维蛋白溶酶原活性剂的抑制剂（PAI-1）可以根据Van Mourik J.A.、Lawrence D.A.和Loskutoff D.J在“由内皮细胞合成的血纤维蛋白溶酶原活性剂（抗活性剂）的抑制剂的纯化”，《J.Biol.Chem.》259，14914-14921，1984中描述的方法而大量地制备。

所有其它的试剂均是从Merck Darmstad，GFR或Carlo Erba，Italy得到的商业上可得到的分析纯级的产品。

1.6.2 免疫和活性的分析

血纤维蛋白分析是通过血纤维蛋白单体板方法（Asturp T.、Mullertz S.“估计血纤维蛋白活性的血纤维蛋白单体板方法”《Arch.Biochem Biophys》40∶346-351，1952）而进行。尿激酶参考标准被用于标定每一个分析。活性测定采用国际单位（I·U），它是与国际参考制品相关的原始标准。sc-uPA（产生单链尿激酶的细胞）血纤维蛋白的潜在活性在活化后以下列方式测定：血浆酶（10mg）用CNBr-活化琼脂糖（交联琼脂）（2.5ml）进行偶联。采用0.5M碳酸钠缓冲液作为偶联缓冲液。一血浆琼脂糖（0.9ml）与0.15M氯化钠和0.05M磷酸钠缓冲液（pH7.4）之比为1∶10的悬浮液用sc-uPA样品（0.1ml）混合，并于20℃下缓慢旋转（离心）1小时。通过在10000×g离心2分钟而将血浆琼脂糖除去，上清液用血纤维蛋白单体板分析进行测定。

蛋白质的浓度根据Lowry（Lowry O.、Rosebrough H.、Parr A、Randall R.，“用叶素酚试剂进行蛋白质测定”《J.Biol.Chem.》1951，193，265-275）的方法进行测定。

酰胺分解鉴定通过测定合成的基质pyro-Glu-Gly-Ary-PNA，S-2444的水解速度而进行（Claeson G.、Friberger P.、Knos M.、Erikssow E.，“在血浆酶、腺激肽释放酶和尿激酶中前激肽释放酶的测定方法”《Haemostasis》7∶76-78，1978）。

免疫吸附剂-酰胺分解（IAA）鉴定是根据Corti A.、Nolli ML.、Cassani G.“采用一种新的免疫吸附剂酰胺分解鉴定（IAA）分别测定单链和双链尿激酶型血纤维蛋白溶酶原的激活剂”《Throm.Hae-mostas》56∶407-10（1986）中描述的方法而进行的。该鉴定法结合了免疫测定的选择性和酶活力测定的专一性，开发出两种蛋白质的抗原测定和酶性能测定。tcu-PA和scu-PA被选择地免疫吸附在涂覆有单克隆抗体5B4的微量滴定板的一侧，并进行血浆酶活化处理前、后的酶活性测定。

1.6.3 逆相FPLC

逆相色谱在FPLC（快速蛋白质液体色谱）体系（pharmacia Fine Chemicals）中进行，采用pro-RPC HR5/10逆相色谱柱（大孔、微颗粒的二氧化硅与C1/C8基团相结合）。洗脱缓冲液为：缓冲液A：在水中含0.1%三氟乙酸，和缓冲液B：在乙腈中含0.1%三氟乙酸;洗提方式：先100%A缓冲液20分钟，再在65分钟内线性梯度增加缓冲液B，从0～60%。然后100%缓冲液B25分钟，流速为0.3ml/小时。

1.6.4 电泳过程

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是根据LaemmliUK（“在噬菌体T4头部装配过程中结构蛋白质的裂解”《Nature》227∶680-685，1970）描述的，在-1.5×120×150mm的凝胶平板或在一快速、高分辨的电泳体系（如Phar macia的Phast体系，也可参见Olsson I.等《Electrophoresis》9∶16-22，1988）进行。聚集的和分散的凝胶中分别含有3%和12.5%的丙烯酰胺。在每片凝胶板上使用商业上可以得到的用于分子量测定的电泳标定工具（Pharmacia）的标准蛋白质（Ampholinse）在凝胶上移动。2-巯基乙醇被用作还原剂，Comassie亮蓝R250被用作凝胶着色剂。免疫吸印法基本上根据（参见Salerno G.，Verde P.、NolliML.、Corti A.、Szots H.、MeoT.、Johnson J.、Bullok S.、Cassaani G.和Blasi F.，“人体尿激酶的单克隆抗体测定单链前尿激酶前体”，《Proc Natl Acad SciUSA》81∶110-114，1984）描述的进行，使用纯化的抗-uPA单克隆抗体，如Mab 5B4（Nolli ML.，Corti A.，SoffientiniA.，CassanoG.“识别人体尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂的受体连接区的单克隆抗体”《Throm Haemostas》，56∶214-8，1986）、Mab105 IF10和Mab52C7（见上SalernoG.等）和兔的抗-uPA抗血清。

1.6.5 用糖肽酶F和神经氨酸酶处理Pro-uPA

整份（2微升）重组scu-PA（pro-rPA）和在0.1MpH7.4的磷酸钠缓冲液中浓度为1.5mg/ml的由Stump等描述的方法制备的（见1.6.1）尿scu-PA在同样的缓冲液用2微升浓度为5微克/ml的血浆酶溶液混合，并在37℃静置4小时。然后，将在100mM磷酸钠、20mM EDTA（乙二胺四乙酸）、0.1%2-巯基乙醇、1%Triton×-100（聚对异辛基苯基醚乙二醇酯）和10mM苄脒中的3微升浓度为6.6IU/ml的糖肽酶F（Boerhinger Mannheim）或在50mM pH＝5的己酸钠缓冲液、50mM氯化钠和10mM的苄脒中的4微升浓度为1mg/ml的神经氨酸酶（产气英膜梭状芽孢杆菌，Boehringer）加入到每一样品中。所有样品均于37℃反应过夜，然后，用SDS-PAGE法分析（见1.6.4）。

1.6.6 等电（点）聚集（IEF）

IEF在1mm厚的凝胶平板上进行，凝胶平板中含有5%丙烯酰胺（丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例较佳地为25∶1）、2%pH3.5-10的两性电解质、4M尿素和3.5%甘油。凝胶冷至12℃。预聚焦后，将50微升样品（0.3mg/ml）加到阳极过滤纸带上。在20W，1500V在平衡状态下总的移动时间为150分钟。切下5mm的凝胶薄片作pH测定，用1ml 10mM的氯化钾洗提并在12℃测定pH。对所存在的尿素未作等电点（PI）修正。凝胶染色采用Blakesley RW.Boezi JA，“使用Comassie亮蓝G-250进行聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质染色的一种新染色技术”《Anal Biochem》82，580-582，（1977）中描述的方法进行。

1.6.7 N末端顺序分析

N末端的氨基酸分析用一生物体系中应用的470A型气相蛋白质顺序分析器进行。

1.6.8 C末端顺序分析

C末端分析是通过在100微升含0.1M pH5.5的乙酸钠和4M尿素的溶液中，用羧肽酶Y（Sigma，St.Louis，Mo，USA）在室温下培养3Fllsc-uPA（RSV_LB6-scu-PA）（200微克）而进行的。羧肽酶Y与3Fllsc-uPA的质量比约为1∶50。在期间移出10微升整数份的物质，在100℃加热10分钟并真空干燥。将每一个样品都溶解于40微升0.2M pH9.5的硼酸钠中，取5微升的部份用过量的邻苯二甲醛处理1分钟（室温下），然后放入Backman超球状（ultrasphere）ODS（250×4.6mm）层析柱中，该层析柱置于（HP1090HPLC体系中。在0.1MpH6.8的磷酸钠中平衡。在23分钟内，线性梯度增加甲醇水溶液的浓度从40%～80%。流速为0.7ml/min，可以成功地分离。氨基酸衍生物用HP1046荧光色谱仪侧定，并用HP3390积分仪根据通常的统计分析法和计算方法进行定量。

1.6.9 用PAⅠ-1人体内皮血纤维蛋白溶酶原激活剂的抑制剂来抑制tcu-PA的活性

人体内皮血纤维溶酶原激活剂的抑制剂（PAⅠ-1，20ug/ml）用SDS（最终浓度为0.5%）活化，在37℃活化30分钟。往55微升的活化后的PAⅠ-1中，加入55微升在0.2M Tris-HCL缓冲液（H7.6）中的1%（V/V）Triton×-100和0.1%（V/V）Tween20进行稀释。然后，加入30微升8ng/ml tcu-PA（试验样品），混合并在室温下培养30分钟。为了测定残余的活性，往其中加入在0.1M Tris-HCl（pH＝7.6）和0.1%Tween 20中的110微升的人体血纤维溶酶原（6C·U·/ml），样品在37℃保温45分钟。然后加入0.5ml 0.9m MS-2251，样品在室温下保温20分钟。在用0.1ml 50%乙酸钠使反应停止后，测定405nm的光密度值。PAⅠ-1以不同的量存在时，残余的活性以无PAⅠ-1作为对照的活性的百分数来表示，一次剂量响应曲线被标绘。从该曲线可以计算控制血纤维蛋白溶酶原激活体活性为50%时，维持用的PAⅠ-1的量。

1.7 动力学分析

1.7.1 用血浆酶活化scu-PA′s

用血浆酶活化尿和重组scu-PA的动力学在含有38mM氯化钠、0.01% Tween 20，0.01%牛血清白蛋白和0.5mM）Pyro-Glu-Gly-Ary-对硝基苯胺（S-2444）的50mM pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，在37℃时测定。反应体系用0.5nM血浆酶和50-750nM scu-PA′s标定。S-2444是tcu-PA的专一性的底物，它不被血浆酶水解，因而在这些条件下，由血浆酶的活化作用而从每一scu-PA产生的tcu-PA的量与在405nm进行光学测定得的排放的对硝基苯胺量成正比。当标绘成Lineweaver-Burk型图时，根据活化初速度可以计算Km和Vmax的值。

1.7.2 在S-2444上的酰胺分解活性

为了测定酰胺分解活力的动力学参数，可将血浆酶活化的u-PA′s（4.5nm）置于不同浓度（0.03-0.3mM）的0.1M Tirs Cl（pH8.8）、50mM NaCl和0.1%牛血清白蛋白中的Pyro-Gly-Arg-对硝基苯胺（S2444）中于37℃下保温。对硝基苯胺排出的初速度在405nm光学测定。从Lineweave-Bark图中可看出，对于各种浓度的S-2444的吸收率随时间而线性增长，由此，Km和Vmax可以通过将线性回归程序所得到的曲线外推而计算。

1.7.3 人体血纤维蛋白溶酶原的活化

用尿和重组tcu-uPA′s（20pm）将血纤维蛋白溶酶原活化为血浆酶的动力学在37℃，于含有0.04M NaCl，0.01% Tween 80、0.01%牛血清白蛋白、0.5mM D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺（S-2251）和血纤维蛋白溶酶原（5.2-23mM）的0.05M Tris-HCl缓冲液（pH＝7.4）中进行。因为S-2251是血浆酶的专一性底物，它不被tcu-PA水解，在该条件下，所产生的血浆酶活性是与对硝基苯胺的排放量成正比的，在405nm下光学地测定。对于各种浓度的血纤维溶酶原的活化初速度被显示于Lineweaver-Burk图中，由此，Km和Vmax可以通过将线性回归程序所得到的曲线外推而计算。

实例EO

人体基因库

在噬菌体λ-Charon 28中的人体基团DNA的库采用已有技术[参见P.H.Hieter等，《Cell》Vol.22，197-207（1980）和Maniatis等]建立。重组λ-溶胞产物在大肠杆菌K12族LE392（Maniatis等，P504）上滴定。噬菌体滴定技术以及带有切口的转译探针的噬菌体库的筛选技术也是已有技术中的（如可参考Maniatis等），而且被大量地应用于下列具体实验中Ｎ松秆。?0微升稀释1000倍的溶胞产物被吸收到在10mM MgSO中的0.3ml大肠杆菌K12 LE 392的2.5倍浓缩的培养物上，并于37℃培养20分钟。加入7ml 0.7%琼脂糖，整个混合物被铺展于含有NZYMC琼脂（A型酪蛋白水解物10g/l;NaCl5g/l;酵母提取物5g/l;酪氨酸1g/l;MgSO₄.7H₂O2g;pH调整到7.5;见Maniatis等）的150mm塑料平板上。总量为0.41ml的10^-3倍稀释的溶胞产物被用于41块板。保温一天后，观察到平均每块板上的噬菌斑为1.5×10⁴个。在41块板上所观察到的总数为6×10⁵个噬菌斑是完好的。每块板上的所有噬菌斑均转移到两个硝化纤维素过滤质中（Schleicher和Schuell公司）。过滤质进行常规的干燥、洗涤、真空烘干和预杂交（见Maniatis等）。杂交采用一由人体尿激酶cDNA中分离出来的DNA片段所组成的切口转译探针而进行（Verd A.等，《Proc.Natl.Acad.Sci.》81，4727-4731，1984）。

E0.1-缺口转译

质粒pHUK-1（Verde et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，4727-4731，1984）含有一个与人体尿激酶的信使RNA互补的重组体插入子。通过琼脂糖凝胶电泳切开相应的凝胶区，并用电洗脱（参见1.5.7）回收DNA片段，由此分离得到的1.5千碱基对pstⅠ片段约含有人体尿激酶信使RNA的75%的密码区（Verde et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，4727-4723，1984）。上述pstⅠ片段（5.0微克）的均匀标记系在200微居的α-³²P-dCTP和200微居α-³²P-dGTP的存在下，用Bethesda研究实验室的一套切口转译设备进行的（参见Maniatis et al.）。标记DNA的产率为1.8-2.9×10⁸居里/分·微克。

E0.2-uPA基因正噬菌体的分离

41对过滤器（如在EO中得到）用切口转译Rst-Ⅰ片段进行杂交。由8只过滤器形成的组被杂交在一只塑料袋中的40毫升杂交溶液内，该溶液约含有10⁸居里/分的标记DNA。在2x SSC（将17.5克Na Cl和88克柠檬酸钠溶解在800毫升水中，用NaOH水溶液将pH值调节至7.4，并将总体积调节至1升）和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）（Maniatix et al，pag.447）中杂交17小时，温度为42℃。在室温下，用2x SSC-0.1%SDS将过滤器洗涤4次，时间为15分钟，然后在68℃温度下，再用1x SSC-0.1%SDS洗涤1次，时间为2小时。干燥后，使过滤器在X-射线胶片（kodak）中暴露12-24小时，然后显影。从这一筛选，用少量NZYMC液体培养基（Maniatis et al.）采集在两只相同的过滤器（3只）中的同样位置上具有正杂交斑点的噬菌斑，并将其以不同的稀释度来感染大肠杆菌K12 L392，然后铺展在10厘米的NZYMC-琼脂培养平板上。接着挑选出具有500-5000噬菌斑的平板，并再次进行筛选。此后将这些噬菌斑转移到一对硝基纤维素过滤器（Schleicher和Schuell公司出品）上，并用上述缺口转译的人体uPA cDNA的1.5千碱基对Pst-Ⅰ片段处理和杂交该过滤器。实际上，所有噬菌斑均给出正杂交信号，富集因子约为10⁵。三个正噬菌斑中的单个噬菌斑分离体被称为λ-uPA-1，λ-uPA-2，λ-uPA-3。

E0.3-大规模噬菌体的制备

用大量培养液的溶菌产物将噬菌斑在大肠杆菌K12 LE392上进行放大，噬菌体通过在氯化铯中反复分成色带（banding）而进行分离，然后相继用酚，以及氯仿/异戊醇（24∶1）萃取水相，并按“Maniatis等，cH3”所述的方法，从水相中用乙醇沉淀出DNA，由此对噬菌体进行提纯。

实施例E1

uPA-密码基因在哺乳类动物细胞中的表达

E1.1-uPA ORF的分离

基本上按E0.3中所述的方法得到的200微克λ-uPA1，使之在80微升溶液中用30单位的SmaⅠ消化1小时，温度为25℃，然后用EDTA（最终浓度为50mM）终止反应，并且一个10厘米的探针（comb）在100伏电压下，使DNA在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，此后在紫外光下对凝胶进行分析，从凝胶中截取第二个最慢带（约7.3千碱基对），此即含有人体uPA基因敞开读码（ORF）的SmaⅠ段片。用电洗脱所含的DNA，并按1.5.7中所述的方法进行提纯。

E1.2-载体DNA的制备

通过HindⅢ消化、插入、HpaⅠ消化、CIP处理，以及在琼脂糖凝胶上的片段分离，由此制备含有RSV启动区和pBR322衍生氨苄青霉素抗性及复制源的RSV-neo衍生片段。

有关RSV-neo的更为详细的修饰描述如下（参见图2）：

E1.2.1-HindⅢ消化

在37℃温度下，用含80单位HindⅢ的200微升溶液将20微克RSV-neo质粒DNA消化完毕。限制酶通过加热灭活，然后用等体积的酚和氯组成的溶液对混合物进行萃取，再加入50微克转移DNA（参见1.5.3），使DNA沉淀析出，接着再将其溶解在20微升TE（Tris 10mM，pH8，EDTA 1mM，Maniatis et al.）中。

E1.2.2-插入和HpaⅠ消化

由上述制备得到的敞开载体，通过在37℃的温度下，由1单位的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，在25微升溶液（Manintis et al，pag.113）中对DNA培养1小时，使该载体的凸出端齐平，然后按1.5.2和1.5.3中所述的方法进行提纯。此后在37℃下，用含有80单位HpaⅠ的40微升溶液处理1小时，将线性圆头载体DNA切开，接着再用同样方法提纯。以上这些操作切开了对新霉素有抗性的基因，留下一个平端的3.5千碱基对长的DNA片段，该片段具有在LTR启动区和SV40多腺苷酸化点之间敞开的RSV-neo，并含有复制源和由质粒pBR322（参见图2）衍生得到的对氨苄青霉素有抗性的基因。

E1.2.3-CIP处理

用含有1.5单位的小牛肠磷酸酶（CIP）的50微升反应培养基（最终体积）处理DNA，以从DNA端除去5′磷酸残基;以后再加入双（氧乙烯基次氮基）四乙酸亚乙酯，（EGTA）（最终浓度为10mM），并在68℃温度下进行处理，以对酶进行灭活（参见1.5.4）。

E1.2.4-片段的提纯

如1.5.7中所述的方法，用0.6%琼脂糖制备型凝胶分离DNA片段。截取含有3.5千碱基对色带的凝胶部分，并用电泳洗脱DNA片段（参见1.5.7），然后将所得的混合物调节至合适的盐浓度，接着再在Elutip-D柱（Schleicher和Echuell公司制造）中进行提纯。洗脱后，将乙醇、乙酸钠和载体转化RNA加到DNA溶液中，使DNA沉淀析出，而后按1.5.3所述的方法再使其溶解在20微升TE中。

E1.3-uPA基因在RSV-LTR启动区下的克隆。

将3单位的T4 DNA连接酶和2.5微升的10X缓冲液（Mani-ayis等，246页）加到3微克脱磷酸化的DNA载体（按上述E1.2中所述的方法制备）和7.5微克的7.3千碱基对的uPA片段（按E1.1中所述的方法制备）中。将上述25微升的反应混合液在14℃下培养16小时（参见1.5.5）后，用于转化100微升的HB101大肠杆菌感受态细胞（参见1.5.8）。于37℃温度下，在含有50微克/升氨苄青霉素的LB琼脂培养平板（10克/升胰化胨，5克/升酵母浸液，10克/升氯化钠，用氢氧化钠水溶液将pH值调节至7.5）上放置过夜，挑选出细菌。取出分离的菌落，使之在含有氨苄青霉素的5毫升LB中生长，并用标准微量制品分析（Standard miniprep analysis）（参见1.5.9）处理。对提纯后质粒DNA的限制图谱进行研究，以确定质粒结构中uPA基的正确定向。具有正确定向的这些质粒中的一种被称之为RSV-uPA，将其分离，并用于以后的实验中（参见图2）。

E1.4.1-转染

在转染前一天，将含有细胞（鼠LB6，由Corsaro C.M和Pearson L.M在Somatic Cell Genetics，7，603，1981中作了描述）的Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM，Flow Labo-ratories Inc.）以约10⁴微升/平方厘米的浓度铺展在培养平板上，在上述培养基中还添加了青霉素（50单位/毫升）、链霉素（50微克/毫升）、2mM谷氨酰胺和10%热灭活的小牛胎血清（FCS）。在转染的当天，细胞处于对数生长阶段，在加入DNA之前3小时，再补充以养分。转染基本上采用磷酸钙-DNA共沉淀法（Graham and Van der Eb，Virology 52，456，1983）将含有DNA[此处是RSV-uPA（参见E1.3）和RSV-neo（参E1.2）的混合物，二者之比约为1∶1）的2M CaCl₂（0.25毫升，最终体积）溶液加到2x HBS（137mM NaCl、0.7mM Na₂HPO₄、21mM HEPES、4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪乙基磺酸，pH7.1）（0.25毫升）中，由此制备磷酸钙DNA沉淀物。然后将此DNA共沉淀混合物加到细胞中。在37℃下保持3小时后，从细胞中移出沉淀物，用DMEM（不加牛胎血清）将细胞洗涤二次，然后加入1.5倍的15%丙三醇的HBS溶液，使细胞在37℃温度下培养1-2小时，接着再用DMEM（不加牛胎血清）洗涤，以除去丙三醇。此后用上述全部的DMEM供给细胞（当进行细胞培养时），并使之在37℃左右的温度下保持48小时左右，在这过程中，细胞慢慢地进行胰蛋白酶化，在含有10%热灭活FCS、50单位/毫升毒霉素、50微克/毫升链霉素、2mM谷氨酰胺和0.8微克/毫升G418（Geneticin，Gibco）的DMEM中的细胞以约10⁵细胞/培养平板的浓度铺展。然后将细胞培养2-3周左右，且每隔三天更换一次培养基。此后，对菌落计数，将其转移到24-井型微量滴定板上，在测定上清液之前让其生长至饱和。在添加含有10%DMSO的热灭活牛胎血清后，将显示出有效的前-uPA（pro-uPA）生产水平（大于0.5微克/毫升）的克隆以冻结物形式贮藏在液氮中。将这些细胞再次克隆，以选出高产率者，亦按上述方法将其冻结贮藏。在这些实验中显示出最高的前uPA生产能力的克隆（称为3 F11或RSV-LB6），再进行克隆，并大量培养。

E1.4.2-大量培养

按上述实施例所述方法得到的具有最高生产能力的克隆的接种物，使之在一只能自动控制溶解氧浓度、pH和温度的4升细胞反应器中生长，为方便起见，将其称为3 F11。培养用的介质是含有5%热灭活的FCS、1mM谷氨酰胺、25单位/毫升青霉素、25微克/升链霉素、400微克/毫升G418和27国际单位/毫升的抑肽酶的DMEM，或者也可用无血清的配方，该配方以1∶1的DMEM和F10（Flow Labs.Inc.）为基本组分，并加有27国际单位/毫升的抑肽酶、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、胆碱、维生素和微量金属。使细胞接种物在一只150平方厘米的烧瓶中生长，瓶内装有DMEM，并加入10%热灭活的FCS、2mM谷氨酰胺、50单位/毫升毒霉素、50微克/毫升链霉素和400微克/毫升G418，细胞系在Cytodex微型载体（Pharmacia）上进行培养。

在整个培养过程中，细胞达到了最高总体密度（即2.5×10⁶个/毫升），并合成得到前-uPA，然后用已知的方法，例如纤维蛋白溶解法或IAA测定法（参见1.6.2.）进行分析测定。由IAA方法测定表明，最高浓度达到20微克/毫升。

E1.4.3

用CHO（Kao F.T.Puck F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，1275-1281，1968）或A431（Fabricant RN.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，565-569;1977）细胞重复上述克隆实验（参见E1.4.1和E1.4.2.）。转染/培养条件基本上不变，但用Ham的F10（Flow Labs）代替DMEM作为CHO细胞的培养基。

为方便起见，用上述RSV载体转染CHD细胞后所产生的单链uPA被称为RSV-CHD-scu-PA，而由A431所产生的称为RSV-A431-scu-PA。

产生前uPA的单层CHD克隆的再次克隆，及未附着生产克隆的选择，由此得到一种能产生产前uPA的克隆悬浮液（1.5毫克/升，用IAA法测定）。

E1.5-前uPA的定量测定

按上述方法（E1.4）得到的细胞系所产生的前uPA的量可用纤维蛋白溶解法（参见1.6.2.）进行测定。在劳氏（Rous）肉瘤病毒（RSV-LTR）的长末端重复的控制下，使含有该基因的质粒共转染，以产生对新霉素（RSV-neo）抗性，以及在同样的RSV-LTR（质粒RSV-uPA）控制下，使含有uPA基因的质粒共转染，以上所进行的这些实验的结果被归纳在下表中：

表1

G418抗性前uPA 被选出克前uPA的产量

细胞系克隆的编号克隆的编号隆的编号（微克/毫升）

（用IAA法）

LB6 28 1 1 0.2-2

LB6 50 3 1 0.8-2

LB6 158 14 3 1-5

1.5-5

2-10

从EXP3所进行的产生2-10微克/毫升前uPA的克隆，以后再进行亚克隆，并在大量培养物中生长，以生产前uPA。

表1（续）

G418抗性前uPA 被选出克前uPA的产量

细胞系克隆的编号克隆的编号隆的编号（微克/毫升）

（用IAA法）

CHO 222 118 5 0.5-1

0.5-1.5

1-5

1.5-5

2-10

A431＊ 2 2 1 5-10

＊非转化细胞的前uPA生产能力为0.5毫克/毫升

实施例E2

用RSV-uPA-BPV载体生产uPA

在RSVuPA质粒DNA中，限制核酸内切酶NdeⅠ和ApaⅠ各自仅仅切割一次（图3），第一个在靠近RSV启动区的pBR322衍生区，而第二个在靠近uPA多腺苷酸化位点的3′区。这二个位点可通过XhoⅠ连结而进行修饰，经XhoⅠ消化后，得到一个含有RSV启动区/uPA密码区的片段，后者适合于将其克隆在含有XhoⅠ位点或SaⅡ位点的载体中。

E2.1.1

在37℃下，用含有420单位NdeⅠ的300微升溶液将70微克的RSV-uPA DNA消化完全（测定条件：150mM NaCl，10mMM Tris·HCl，pH7.8，7mM MgCl₂，6mM 2-巯基乙醇，100微克/毫长BSA）。经热灭活后，将Nacl浓度调节到ApaⅠ的条件（6mM NaCl，6mM Tris·HCl，pH7.4，6mMMgCl₂，6mM2-巯基乙醇，100微克/毫升BSA），并在30℃温度下，用含有160单位ApaⅠ的400微升（最终体积）溶液在4小时内完全切开DNA。然后按1.5.3中所述的方法对DNA进行提纯和沉淀，接着再使其溶于20微升TE中，并在37℃下，用5单位的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ将DNA（最终反应体积为25微升）培养1小时，以插入NdeⅠ突出端，而后将酶加热灭活（Maniatis等，113页）。

E2.1.2

如1.5.5所述，将以上所得的经NdeⅠ/ApaⅠ消化的圆端RSV-uPA质粒与磷酸化的XhoⅠ连接酶DNA（摩尔比约1∶50）混合，并在8℃下培养18小时（最终体积为50微升）（如1.5.5所示），然后对连结酶进行热灭活。接着在37℃下，用含有120单位XhoⅠ的200微升溶液消化4小时，并对XhoⅠ进行热灭活。

E2.1.3

用电泳法，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁的0.75%琼脂糖凝胶上分离以上所带的DNA片段，分离时间为20小时，电压为35伏（详细情况可参见1.5.7）所得到的色带在紫外透穿照射器上进行检测，最大的色带相应于8.35千碱基对RSV启动区/uPA密码的片段，而最小的色带相应于2.45千碱基对的抗氨苄青霉素的，并含有复制源的巍＝饬礁錾?.5.7中所述的方法进行切割和提纯。最小的色带用3单位的CIP在37℃下处理30分钟，再在56℃下处理30分钟，提纯和沉淀按1.5.2和1.5.3中所述的方法进行。将大片段和小片段以不同的摩尔比（大致在1∶1至4∶1的范围内）混合，在14℃下连接3小时，并按1.5.8所述的方法，将各种反应混合物的一部分用于转化大肠杆菌DHI反应感受态细胞。细胞在含有氨苄青霉素的琼脂培养皿上生长过夜，对分离出来的菌落的质粒进行分析，以测得合适的限制片段图谱，从中选出一个（质粒p71），在该质粒中，置于RSV启动区转译控制下的人体uPA基因可通过用XhoⅠ（图3底部）切割，而与其余质粒分离。

E2.1.4-限制位点修饰

通过插入一个独特的XhoⅠ位点，在三个不同的位点（分别为BamHⅠ，HindⅢ或SalⅠ）对pBPV230.8（图4）进行修饰，所说的单一的XhoⅠ位点可使RSV-启动区/uPA密码区（RSVuPA）较容易地插入。在每一实验中，使用过量的合适限制酶（BamHⅠ，HindⅢ或SalⅠ）在37℃温度下，将100微升（最终体积）溶液中的10微克BPV230.8DNA在3小时内消化完全。上述的酶经由加热的方式灭活，而DNA系按1.5.3中所述的方式提纯，然后再溶解在10微升缓冲液（50mM Tris，pH7.2，10mM MgSO，0.1mM二硫苏糖醇，50微克/毫升BSA，Maniatis等，113页）中，接着在37℃下，用5单位的大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理2小时，使之成平端。聚合酶经热灭活后，在37℃温度下用5单位CIP在50微升（最终体积）溶液中对DNA进行30分钟的脱磷酸化处理，接着再在56℃下处理30分钟。最后，在EGTA存在下，通过加热对酶进行灭活处理，并按1.5.2和1.5.3所述的方法对DNA予以提纯。向重新溶解的圆头线形的BPV230.8DNA加入标记的XhoⅠ联结子DNA（摩尔比为200∶1），并使其在2.5单位的T4DNA连接酶的存在下（1.5.4），在50微升（最终体积）溶液进行15小时的连接，温度为8℃。对连接酶进行热灭活后，用8个单位的XhoⅠ消化约含有1%连接DNA的试样，再在连结前后用等分量的DNA进行电泳，并按1.5.6中所述的方法分析。然后，将盐浓度调节至100mM NaCl，而将pH值调节至7.5左右（Maniatis et al，pag.104 and Biochemicals for Molecular Biology;Boehringer Mannheim，Munich 1985），在200微升溶液中用XhoⅠ切割所有的DNA，处理时间为1小时，温度为37℃，接着使之负载在0.6%的琼脂糖凝胶中，并进行电泳，截出相应于线形质粒的色带，再经电洗脱和提纯（按1.5.7中所述的方法）。线形DNA通过连结进行自对合，并用于转化大肠杆菌DH5感受态细胞（BRL）（参见1.5.8）。在含有氨苄青霉素的琼脂培养平皿上培养过夜后，分离所得到的菌落中的质粒，用微量制品分析（参见1.5.9）法鉴别是否有新XhoⅠ位点存在。结果表明，获得了下述pBPV230.8衍生质粒（图5中间）：

（1）pBB，其中XhoⅠ位点产生在BamHⅠ位置上，两侧与二个BamHⅠ位点相接;

（2）pBS，其中XhoⅠ位点产生在SalⅠ位置上，两侧与二个SalⅠ位点相接;

（3）pBH，其中XhoⅠ位点产生在HindⅢ位置上。

E2.1.5

在各个实验中，用含有过量XhoⅠ（在pBS的情况下为SalⅠ）的50微升溶液在37℃的温度下，将含量各为50微克的pBB、pBH和pBS DNA消化完全，时间为2小时，用加热的方式对酶进行热灭活，按1.5.4中所述的方法，用1单位的CIP对直线化质粒DNA进行脱磷酸化处理。酶经灭活后，将DNA载在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%琼脂糖凝胶上，电泳16小时，电压为30伏。按1.5.7中所述的方法，电洗脱一个相应于单体形线形质粒的主要DNA色带，再经提纯和重新溶解。同样，用80单位的XhoⅠ将50微克的p71质粒DNA消化完全，对酶进行热灭活，将混合物载在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%琼脂糖凝胶上，并在30伏电压下电泳16小时，具有8.35千碱基对的色带的凝胶部分含有RSV启动区/uPA密码区结构，此处按1.5.7中所述的方法对其进行电洗脱、提纯和使之重新溶解。BPV载体DNA（图5中间）和插入DNA（图3底部）以2∶1至1∶4的比例混合，并在DNA浓度约为0.2微克/微升的条件下，用2单位的T4DNA连结酶试样进行连接，?5℃下处理24小时。用缓冲液调节反应介质，连接的DNA在37℃温度下用含有20单位XbaⅠ的15微升（最终体积）溶液消化1小时（测定条件：50mM NaCl，6mMTris-HCl，pH7.9，6mM MgCl₂，100微克/毫升BSA）。所说的酶并不切割RSV/uPA结构，而仅对BPV230.8衍生载体切割一次。在XbaⅠ经热灭活后，所得的DNA混合物用水稀释1至5倍，再加入10X连接缓冲液，并在14℃下，用2.5单位的T4 DNA连接酶培养2小时。从各个反应实验中取出5微升试样，用来转化大肠杆菌DH5感受态细胞（参见1.5.8）。这些细菌在含有氨苄青霉素的琼脂培养平皿上生长过夜，温度为37℃，然后用微量制品分析法（参见1.5.9）分析从所产生的菌落中取出的试样。从具有合适限制图谱的隔离菌落中选出质粒（参见1.5.9，图5底部）。

E2.1.6-转染/大量培养

按E1.4.1中所述的方法，对鼠的LB6细胞进行转染实验，而生产率最高的细胞按E1.4.2所述的方法进行大量培养。

E2.1.7-uPA的定量测定

根据E2.1.6中所述的方法转染后的细胞，它所产生的uPA的量，按E1.5所述的方法进行测定。在劳氏肉瘤病毒（RSV-LTR）的长末端重复控制下，转染引起含有该基因的RSV-Neo质粒共转染，以产生对新霉素（neo）的抗性。而含有RSV-uPA盒（Cassette）（参见图3底部，并参看E2.1.5）的BPV衍生载体给出抗新霉素的生产前uPA的克隆，而前uPA的量在1.3微克/毫克至26微克/毫升的范围内。由这些细胞所产生的单链uPA称为BPV-LB6-scu-PA。有关这些实验的数据归纳如下：

G418抗性前uPA克被选出克前uPA

克隆的编号隆的编号隆的编号产量

（微克/毫升）

（用IAA法测定）

1 96 5 1-3

1-5

2-10

10-20

例E3

前-uPA的纯化和特性测定

将培养的经转化的细胞的上清液（见E1，4，2）分别进行纯化和然后进行分析以确定它们的主要结构特征，将RSV-LB6-scu-PA、RSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA的电泳情况与人类尿源的scu-PA和A431未转化细胞的scu-PA（A431-scu-PA）作平行比较。

E3.1-前-uPA的纯化

通过基本按照前面所述的用于A431-uPA从A431肿瘤细胞上清液中的纯化的方法[考铁A（CortiA）、诺里M.L.（NolliM.L）、索弗安蒂那A.（Soffientini A.）;加沙尼G（CassaniG）单链尿激酶类纤维蛋白溶酶原激体从人类A431细胞中的纯化和特性化，血栓形成和止血法（Throm Haemostas）1986;56∶219-224]，采用Mab5 B4-琼胶糖和离子交换FPLC上的免疫亲和性色层层析，可从细胞培养上清液中分别纯化3 F11-scu-PA（RSV-LB6-scu-PA）、RSV-A431-SC uPA、RSV-CHO-SC-uPA和BPV-LB6-uPA（见E1.4.2）。

用0.15M氯化钠和包含1%聚乙二醇（PEG）6000的pH值为7.4的0.05M磷酸钠缓冲剂耒平衡带有一种结合高分子量尿激酶而不结合低分子量形式的单克隆抗体的一种琼脂糖变性基层[MAB5B4-琼脂糖，2.6cm×8.6cm，根据常规方法制备，如由考铁A.（CortiA）、诺里M.L（Nolli M.L）、索弗安蒂那A（SoffientiniA）和加沙尼G.（Cassani G）在（Throm Haemostas1986;56∶219-24中所描述的]。所述柱负载有24公升4℃的流速为220ml/h的含有scu-uPA的细胞上清液（见上面和E1，4，2），然后用平衡缓冲剂对其洗涤，用1M氯化钠和包含1%PEG6000的0.1M乙酸进行解吸。用IAA试验全部蠓荩切┌瑂cu-PA的馏份收集、合并和进一步纯化，并通过采用由pH值为4的约0.05M乙酸钠缓冲剂预平衡的单SHR5/5柱（以球状亲水树脂为基础的强阳离子交换剂，它具有狭的颗粒尺寸分布，带电荷的基团为-CH₂SO₃）的在一种FPLC（块速蛋白质液相色层分析）系统（Pharmacia fine chemical，瑞典）中的离子交换色层分析对其进行纯化及浓缩。通常用两倍蒸馏水稀释试样以减小离子强度，然后将其负载于柱之上。在用平衡缓冲剂洗涤后，在50分钟内用从30-70%（B在A中浓度）的缓冲剂A（0.05M乙酸钠缓冲剂，pH4）和缓冲剂B（1M氯化钠，0.05M乙酸钠，pH5）的盐/pH线性梯度混合物进行洗脱所结合蛋白质，然后用100%B将其洗脱20分钟，流速为60ml/h。通过IAA（见1.6.2）测量包含0.034mg/l酶催化活性的uPA抗原和0.870mg/l酶催化非活性、可被血浆酶活化的uPA抗原的3F11（RSV-LB6）细胞上清液，各个回收步骤中所回收的酶催化活性和非活性uPA（前-uPA）的数量报道在表2中。如由IAA评价的那样，从24.1升3F11上清液中回收到约0.95mg活性uPA和15.5mg可被血浆活化的uPA，相应于全部收得率分别为116%和73.8%。在最终产物中的酶催化活性uPA占总量的5.8%，对3F11-scu-PA（RSV-LB6-scu-PA）的反相FPLC分析导致了在280nm处有一个单个的吸附峰，它具有与A431scu-PA和尿scu-PA（c.f1.6.1）相同的停留时间。

当将从产生PSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA的细胞中得到的细胞上清液置于该纯化过程中时，可获得相似的结果。

E3.2-scu-PA的结构特性测定

E3，2，1-分子量和免疫反应性

通过SDS-PAGE和免疫吸印法对从3F11细胞上层液（3P11scu-PA）中纯化得到的材料（见E1.6）进行分析以确定其纯度、分子形式和免疫学性能。针对尿uPA的不同表位[例如Mab5 B4，Mab 105 IF10和Mab 52C7（见1.6.4）]，在与兔抗-uPA抗血清和各种不同的单克隆抗体进行免疫反应的硝化纤维素膜上的吸印后，在非还原条件下3F11-uPA的SDS-PAGE（见1.6.4）展示了一条52，000Mr的色带。对于自然尿scu-PA（1.6.1）也可获得相似的免疫反应性式样，它表明3 F11scu-PA在免疫学上与人类尿scu-PA紧密相关。在还原条件下3 F11-uPA的SDS-PAGE显示出50，000Mr主色带（它相应于大于总蛋白质的90%）以及33，000Mr和20，000Mr的两个次色带。所有色带都通过韦斯顿（Western）吸印法与抗uPA抗血清进行免疫反应，它表明由3F11细胞上清液纯化得到的材料基本上由含量小于10%双链uPA（3F11tcu-PA）的单链uPA（3F11scu-PA）50，000Mr色带、33，000Mr和20，000Mr色带组成。

E3.2.2-链结构和糖基化

在用血浆酶（c.f.1.6.2）活化后，探索了3F11-scu-PA（RSV-LB6-uPA）、RSV-A431-scu-uPA、RSV-CHO-scu-uPA和BPV-LB6-scu-PA的分子形式，上面所有的物质（scu-PA的）都由血浆酶转化为由一个20，000Mr A链和一个33，000Mr B链组成的52000Mr双链蛋白质（tcu-PA的），它由SDS-PAGF在还原条件下确定。在用血浆酶和苷肽酶F或用血浆酶和神经氨酸苷酶（neuraminidasr）（见1.6.5）处理之前和之后，将重组体scu-PA的分子量和链结构与那些自然尿scu-PA（1.6.1）进行比较。

上述scu-PA的各个重组体在非还原条件下的电泳活动度比尿SCu-PA略低，相应于分子量（见图11）上相差1000-2000，在还原条件下也获得了相似的结果。根据tcu-PA的B链活动度，可计算得其分子量为32，000-33，000Mr，同时得到尿tcu-PA的B-链的分子量为31，000Mr（见图12）。A链（20，000Mr）上没有观察到任何区别，当用甘肽酶F处理所有的scu-PA以使N-糖苷键水解时[斯代芬G.J（Steffens G.J）、根兹勒.W.A（Günzler W.A）、奥丁.F.（Otting F）、弗兰库斯.E.（Frankus E.）、弗劳赫.L.（Flohe L.），低分子量的人类尿尿激酶的完整氨基酸顺序，赫普-赛勒（Hoppe-Seyler）的Z.物理化学1982，363，1043-1058]，观察到对于所有蛋白质的B-链（见图13）来说，都具有相同的30000Mr色带，这些数据反映出scu-PA的重组体和尿scu-PA在电泳活动度方面的不同与不奶呛坑泄亍Ｍü蒙窬彼彳彰福ㄍ僖核彳彰福?.6.5），一种选择性地切除糖蛋白的终端唾液酸残基的酶来处理上述scu-PA，可证实这种在糖含量方面的不同。在用血浆酶培养和随后用唾液酸苷酶培养后，尿scu-PA只用血浆酶处理的尿scu-PA相比较，表明在A链和B链上都没有明显的不同，而在相同条件下，重组体scu-PA的B链的电泳活动度则在未处理蛋白质和完全去糖基化的蛋白质（见图14）的中间，因此这些蛋白质具有不同的唾液酸含量。

E3.2.3-等电位聚焦（isoelectrofocusing）

将3 F11scu-PA和RSV-A431-scu-PA进行等电位聚焦（IEF）（见1.6.6，）以与A431 scu-PA和尿scu-PA比较，对于所有的蛋白质，观察到几种等电位形态;具体地说，对于3 F11 scu-PA和RSV-A431-scu-PA来说，至少观察到六种等电位形态PI8.75，8.85，9.0，9.1，9.15和9.25，而对于A431-scu-PA，观察到四种等电位形态PI9.1，9.15，9.25和9.3。尿scu-PA呈现出所有3 F11scu-PA和A431 scu-PA所观察到的色带，虽然其数量上是不同的。

E3.2.4-氨基酸顺序分析

A）由自动埃德迈（Edman）降解（见1，6，7）分析3 F11scu-PA的N-末端氨基酸顺序（18基），获得的顺序报道于图10中，如图示，3F11scu-PA的顺序与自然人类尿scu-PA和A431 scu-PA的相同[加塞S.（Kasais.）、阿里莫拉H.（Arimura H.）、尼希达M.（NishidaM.）、苏亚马T.（Suyama T），单链前-尿激酶的初步结构，J.生物化学（J.Biol.Chem）1985;260/12382-12389]，但它明显地与鼠scu-PA的顺序不同[伯林D.（BelinD.）、迈沙里J.D（Vassali J.D.）、康贝派恩C.（Combep-ine C.）、高杜F.（Godeau F.）、那加迈恩Y.（Nagamine Y.）、里奇E.（Reich E.）、高泄H.P.（Kocher H.P.）、杜伏奥埃新R.（Duvoisin R.），互补DNA编码鼠尿激酶类纤维蛋白溶酶原活化剂的克隆化、核苷酸排列和表示，Eur J.生物化学（Eur.J.Biochem）1985，148，225-232）。

B）用羧肽酶Y对3 F11scu-PA的消化的动力学分析（见1.6.8）表明C-末端顺序Ala-Leu（COOH）与人类尿scu-PA的相一致（加塞S.、阿里莫拉H.、尼希达M.和苏亚马T.的单链前-尿激酶的初步结构，J.生物化学（J.Biol.chem）1985，260，12382-12389]。

E3.2.5-uPA和PAⅠ-1的相互作用

人类内皮纤维蛋白溶酶原激活抑制剂（PAI-1）与tcu-PA反应而形成1∶1克分子复合物，它在第二个步骤中成为共价的，因此阻止了tcu-PA的蛋白分解活性[贝许迈F.（Bachmann F.），纤维蛋白溶解，血柱形成和止血法（Thrombosis and Haemostasis）1987由M.维斯却瑞特（M.Verstraete）、J.维米兰（J.Vermylen）、H.R里能（H.R.Lijnen）和J.阿努特（J.Arnout）编辑，国际血柱形成和止血法协会（Intevnational society on Thrombosis and Haemostasis）和罗文（Leuven）大学印刷，罗文1987，第227-265页]。我们已探索了由PAI-1（见1.6.9）对上述uPA的（RSV-LB6-scu-PA，RSV-A431-scu-PA，RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA在血浆酶活化之后）抑制作用的程度，为了这个目的，用固定量的血浆酶活化的tcu-PA（见1.6.2）预培养增加量的PAⅠ-1，并使用血浆酶特定酶解物S-2251，用一种间接测定法测量残留纤维蛋白溶酶原激活体活性，绘制出抑制作用的剂量-效果曲线（无PAⅠ-1的活性百分数作为PAⅠ-1浓度的函数）。在1.7ng/ml下，uPA达到50%活性抑制作用，在有6-8ng/mlPAⅠ-1的所有情况下，所有的tcu-PA呈现出相似的曲线。

E3.3-酶催化活性

E3.3.1溶解血纤维蛋白的活性

在通过用血浆酶琼脂糖处理（见1.6.2）而使3 F11scu-PA转化成酶催化活性的3 F11tcu-PA后，确定其酶催化活性，通过离心分离可容易地将固定化的血浆酶从经活化的酶中分离，这样就防止了在接下来的测定中的可能的干扰，由血纤维蛋白板方法确定的3F11tcu-PA特定的溶解血纤维蛋白活性为117225Iu/mg（见表2），这个结果与对A431 tcu-PA报道的值符合得很好[考梯A.（CortiA.）、诺里M.L（Nolli M.L.）、加沙尼G.（CassaniG.），由一种新的IAA方法对单链和双链尿激酶类纤维蛋白溶酶原激活体的不同探测，血栓形成和止血（Throm Haemostas）1986，56，407-410]

E3.3.2-动力学分析

将3 F11-scu-PA（RSV-LB6-scu-PA）、RSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA与尿scu-PA和A431-scu-PA在它们在纯化系统（见1.7.1，1.7.2和1.7.3）中的动力学状态方面进行比较，用莱恩威弗-伯克（Lineweaver-Burk）类型的分析方法研究通过血浆酶使scu-PA向tcu-PA的活化（表3）和血浆酶活化的uPA水解显色酶解物S-2444（表4）和活化纤维蛋白溶酶原（表5）能力。在所有情况下，各种不同的scu-PA呈现出相似的动力学状态，其米氏常数（Michaelis-Menten）（Km）和催化常数（Kcat）的值相差不大。

表3

采用血浆酯的scu-PA的活化动力学

（pH7.6和37℃）

scu-PA K_m（微摩尔） Kcat（S^-1）催化常数

尿的 0.17 0.09

A431 0.21 0.09

RSV-A431 0.28 0.11

RSV-LB6 0.14 0.11

BPV-LB6

RSV-CHO

表4

在Glp-Gly-Ayg-PNA（S-2444）

上的酰胺分解动力学

（pH8.8和37℃）

scu-PA K_m（微摩尔） Kcat（S^-1）催化常数

尿的 80 25

A431 72 23

RSV-A431 76 23

RSV-LB6 69 24

BPV-LB6 78 26

RSV-CHO 76 26

表5

人类纤维蛋白溶酶原的活化动力学

（pH7.4和37℃）

scu-PA K_m（微摩尔） Kcat（S^-1）催化常数

尿的 23 1.1

A431 17 1.0

RSV-A431 21 1.1

RSV-LB6 24 1.3

BPV-LB6 24 1.3

RSV-CHO 24 1.3

实施例E4

人类uPA启动子区的修饰的衍生物的结构

E4.1-puPA2质粒的结构

50微克（microg）如E0.3所述所制备的λ-uPA1 DNA，在30℃下，在合适的缓冲剂中，在100微升（microl）（最终体积）中具有30单位（U）的SmaⅠ中消化60分钟。500毫微克（ng）所得到的DNA在一种含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%的琼脂糖凝胶（体）上分析，而剩余物在-20℃下贮藏。然后酶在68℃（10分钟）下热失活，且所产生的DNA制剂加在一种含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓上0.8%预制的琼脂糖凝胶（体）上。在TBE缓冲剂（Maniatis）等，ch.5）中，50体积（V）下，进行电泳分离20小时，DNA色带在一种中级长度UV透照（射）器上显示。切出一条约2.38千碱基对（kb）含有前-uPA（pro-uPA）启动子的色带，且如1.5.7所述的经电洗脱和纯化的DNA、50微克pEMBL8 CAT DNA（图6）相似地在30℃下，在25微升（最终体积）中具有30单位的SmaⅠ中消化1小时。加入64微升水、10微升CIP10X缓冲剂和在1微升（最终体积）中的1单位的CIP，再在37℃下培养该反应混合物60分钟。CIP如1.5.4所述加入EGTA和加热是失活的，且在如1.5.7所述的相样条件下，DNA在一种含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓0.8%的琼脂糖凝胶（体）上纯化。1.5微克2.38千碱基对λ-uPA1衍生的片段和500毫微克如上面所制备的直线型的脱磷p EMBL8 CAT DNA混合在一起，并在14℃下在20微升含有10%的聚乙二醇（PEG）和2单位的T4 DNA连接酶的合适的缓冲液中连接20小时。然后，5微升该反应混合物如1.5.8所述用于转化感受态HB101 E.Coli细胞。分析对氨苄青霉素抗性菌落，且在其中含有在正确定向处的插入物的一个选出，并称为puPA2（图6右面）。

E4.2-puPA2/41质粒的结构

得到一种上面所制备的Sma部分消化直线型的puPA2 DNA的最佳条件是通过分别用1.0，2.0，3.0和4.0单位在10微升（最终体积）合适的缓冲剂中的SmaⅠ消化250毫微克该质粒来研究。50%（体积/体积）各反应混合物转移至不同的管子中，并在30℃下反应6分钟后在干冰/乙醇浴中冷冻，而剩余部分在培养9分钟之后冷冻。然后，各冷冻样品用EDTA配为10毫摩尔/升，酶为热失活的，且DNA在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基苯基菲啶鎓的1%琼脂糖微小凝胶（体）上分析。通过用2单位培养15分钟和用3单位培养6分钟得到良好的效果。然后，一种预制的浸提确定如下：5微克puPA2 DNA用40单位在50微升合适的缓冲剂中的SmaⅠ消化，该反应通过加入1微升500毫摩尔/升EDTA而停止，且冷冻。在所加的酶热失活之后，该puPA2制品与2.25微克XhoⅠ接合子混合，如1.5.6所述磷酸化，并在86微升一种含有10%的聚乙二醇1500和2.5单位的T4 DNA连接酶的反应混合物中进行连接，先在7℃下培养6小时，然后缓慢地升高温度至17℃，并进一步培养10小时。连接酶是热失活的，10%连接的DNA在37℃PRT下，用在20微升（最终体积）中的55单位的XhoⅠ消化，然后，该酶热失活，且DNA如1.5.3所示沉淀。沉淀的DNA再溶解在4微升TE（Maniatis等）中，加入1微升含有5X连接缓冲剂（Maniatis等）的1单位的T4 DNA连接酶，在15℃下放置该混合物自连接2小时30分钟，且然后用于转化HB101感受态E.Coli细胞（1.5.8）。氨苄青霉素抗性菌落通过微型制品（minimprep）分析筛选。其中之一，含有SmaⅠ位（位于含有2.38千碱基对插入物的5′末端的侧翼）转化为一个XhoⅠ位（图8）的，称为puPA2/41。

E4.3-CAT分析

puPA2、其衍生物puPA2/41和RSV-CAT分析它们进行CAT基团转录的能力。质粒DNA转染给人类A1251细胞列（1.1），它通过磷酸钙沉淀步骤（方法）从一种肾脏癌中衍生出来（Stoppe-lli M.P.Verde P.，Grimaldi G.，Locatelli E.K.，Blasi F.细胞生物学杂志（J.Cell Biol.，1968，102，1231-1241），且在64±4小时之后，测定可能在转染细胞中产生的CAT蛋白质的含量。

E.4.3.1-质粒DNA的纯化

质粒DNA用如Brinboim H.C.和Doly J.1979，核酸研究（Nucleic acid Res.），7，15 13（也在Maniatis等第90页中报道）的在（强）碱溶解方法，从一种400毫升LB流体培养液中培养过夜的各细菌细胞系来纯化。因此所得到的质粒DNA在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓Cs Cl级份上纯化两次，含有其的色带通过穿孔（punturing）收集，并用异戊醇（参见Maniatis等第93-94页）彻底萃取。含有DNA Cs Cl水溶液然后用水以1∶4稀释，且通过加入0.1体积3摩尔/升的乙酸钠pH5.2和3体积乙醇而沉淀。在-20℃下放置该混合物30分钟后，DNA部分在4℃下，15分钟内，以10000Xg离心下来，用70%的乙醇洗涤一次，并用100%的乙醇洗涤一次，干燥，溶解在2毫升TE中，再沉淀，并用同样的方法洗涤，且最后再溶解在1毫升TE（Maniatis等）中。测定O.D.260，并调节浓度至约500毫微克/微升，在微小凝胶（体）上校对，且再通过分光光度计测定。最终，质粒DNA用无水乙醇以1∶1稀释，并在-20℃下贮藏。

E.4.3.2-通过磷酸钙步骤沉淀

对每一个使将受转染的60毫米陪替氏（Petri）碟，40微升DNA乙醇/TE溶液，等当量为10微克DNA，在一莎文特（Savant）真空离心机中干燥，且再溶解于220微升水中。加入30微升2/摩尔/升Ca Cl₂（来自Mallinkrodt或Merck），并迅速混合。混合250微升2XHBS（10克/升HEPES，4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸、16克/升NaCl，pH7.1±0.05，无菌的）和5微升100×PO₄（70毫摩尔/升Na₂HPO₄和70毫摩尔/升NaH₂PO₄，无菌的），并广泛地鼓泡时用一根巴斯德（Pasteur）吸移管缓慢地滴加DNA/CaCl₂溶液。然后，在室温下，将该混合物放置30分钟（Graham和Vander Eb，病毒学（Virology），52，456;1984）。

E.4.3.3-A1251病毒学细胞的转染（transfection）

在37℃下，5%的Ca增湿培养器中A1251细胞生在接近汇集在全部介质中[用10%的胎儿小牛血清（Hyclone）和1%的抗菌溶液（Gibco）补充的DME介质（Gibco）]中。在转染前24小时，该细胞在60毫米陪替氏碟中以10⁵细胞/碟分裂，且在转染前再用新的介质增补4至6小时。在to时，加入沉淀的DNA，且将该混合物放置在培养器中16至18小时。在培养过夜之后，细胞用DME（7.2）洗涤一次，再用全部介质补充，放置在培养器中以完成培养，且收获。在实验中重复三次，干的DNA溶解后的各步骤分别为各样品进行。所获得的细胞用于后续步骤。

E.4.3.4-细胞溶胞产物的制备

在添加沉淀的DNA后64±4小时之后，该细胞（如E.4.3.3制备）用一种无Ca⁺⁺的磷酸盐-缓冲盐水（PBS）（80克NaCl，2克KCl，11.5克Na₂HPO₄·2H₂O，2克KH₂PO₄每1升蒸馏水，调节pH7.2）洗涤3次，然后加入1毫升STE（100毫摩尔/升NaCl，10毫摩尔/升TRIS，1毫摩尔/升EDTA），且在室温下将该混合物放置5分钟。然后，用一把橡胶淀帚刮出该细胞，并放在一根埃本道夫（Eppendorf）管中，在4℃下，3分钟内在微型离心机中旋转下来，并再悬浮在100微升Tris250毫摩尔/升pH7.8中，将该细胞悬浮液放置在干冰/乙醇浴中15分钟，且然后转移至一个37℃浴中;重复这冷冻/解冻两次，在4℃下，3分钟内，在微型离心机中将该细胞核旋转下来，且将上层清液转移至一根新的管子中。为了克服由于板（盘）至板的细胞数目中可能的很小的差别（所引起的）各样品的蛋白质含量的微小差异，蛋白质浓度根据洛里（Lowry）的方法（参见E.1.6）通过从各样品中测定10微升来决定。溶胞产物的剩余部分在-20℃下贮藏，直至用于CAT检定。

E.4.3.5-CAT检定

将一个含有100⒖死醋愿魅馨锏牡鞍字实奶寤贾?33.5微升水和44微升含有22.5微升2摩尔/升Tris pH7.8的预混合溶液中，向其中加入20微升一种3毫克/毫升乙酰（基）Co A（Sigma）和1.5微升放射性¹⁴C-氯霉素（50-60毫居里（mci）/毫摩尔，来自Amersham）的新制备溶液。在37℃下培养该混合物1小时，然后，该反应通过加入1毫升乙酸乙酯并搅动以终止反应。所形成的两个相在一个埃本道夫微型离心机（5分钟）中分离，且有机相转移至一根新的埃本道夫管中，在一个莎文特真空离心机中干燥essicated），再溶解在20微升乙酸乙酯中，并通过在0.25-1毫升硅胶板（Kodak）薄层层析上检定。用氯仿∶甲醇（HPLC级）进行层析2-3小时，95∶5为流动相，且相应于示踪抗菌的放射性点通过射线显迹法显影。相应于放射性点的色谱的区域切下，放在具有5毫升的一种合适的闪烁液如埃康诺佛劳瓦（Econofluor）的小玻璃瓶中，用一个β计数器测定（新英格兰核）和放射性。结果如下列表3所示。

E4.4.1-质粒puPA2/17的结构

300毫微克puPA2/41 DNA（参见E3.2）在37℃下，在合适的缓冲液（100毫摩尔/升Na Cl₂，10毫摩尔/升Tris.HCl pH7.5，10毫摩尔/升Mg Cl，10毫摩尔/升2-巯基乙醇，100微克/毫升BSA）中，用4.2单位的OxaNⅠ完全消化4小时。DNA抗（氨苄青霉素）性在一种含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的微小凝胶（体）（1.5.1）上校对，且酶通过在68℃下加热10分钟而失活。然后，加入2微升水、1.5微升10X缓冲液（参见1.5.5）和1.5微升T4 DNA连接酶，且该混合物在15℃下培养18小时。2.5微升该混合物用于转化E.Coli HB101耐久细胞（1.5.8）。氨苄青霉素抗性菌落通过微型制品分析（1.5.9）分析。选出那些具有正确限制样本的，且其中之一称为puPA2/17。（图8）。

E4.4.2质粒puPA2/254的结构

4微克puPA2/41 DNA（参见图8）在10微升合适的缓冲液（50毫摩尔/升Na Cl，10毫摩尔/升Tris HCl，10毫摩尔/升Mg Cl₂和1毫摩尔/升二硫苏糖醇）中，用5单元EcoRⅤ消化至完全;（Maniatis等）然后，在37℃下，2小时内加入～种7微升水、2微升0.5摩尔/升Tris pH8和在1微升缓冲液（Maniatis等）中的1单位CIP的混合物。该混合物在37℃下培养1小时，加入EGTA至一个最终浓度10毫摩尔/升，且该混合物在68℃下培养45分钟。DNA（如1.5.3所述）沉淀，洗涤和干燥，且最终再溶解在7.5微升TE（Maniatis等）中。DNA在37℃下，用在10微升（最终体积）中的4.2单位OxaNⅠ彻底消化4小时，且5′端在37℃下用1单元DNA PolⅠ（20微升，最终体积）的克雷诺（Klenow）片段补平1小时。然后DNA沉淀（1.5.3），且再悬浮在7.5微升TE（Maniatis等）中。加入0.5微升100毫摩尔/升ATP、1微升10X缓冲液（参见1.5.5）（Maniatis等）和2.5单位T4 DNA连接酶（1微升，最终体积），且该混合物在15℃下培养18小时。然后2.5微升该混合物用于转化E.Coli HB101感受态细胞（1.5.8），该细菌沉积在含有LB板（Maniatis等）的氨苄青霉素上。选择含有正确限制样本的菌落，且其中之一称为puPA2/254（图8）。

E4.4.3-CAT分析

测试puPA2/41、其缺失衍生物puPA2/17和puPA2/254及RSV-CAT的CAT基因转录的能力。质粒DNA在A1251细胞列（1.1）中通过磷酸钙沉淀技术转染，且在64±4小时之后测定细胞内CAT含量。基本上如E4.3中所述进行质粒DNA的纯化、通过磷酸钙的沉淀、细胞转染、细胞溶胞产物的制备和CAT检定。结果如下所示：

表

A1251

RSV-CAT 100

puPA2/41 128

puPA2/17 303.8

puPA2/254 378.5

E4.5-uPA衍生的表达载体的结构

细菌CAT基因可从质粒puPA2/41，puPA2/17和puPA2/254中切去，为了用它们作为表达载体。优先地，改进（变换）将保存uPA启动子导出顺序、uPA TATA盒、mRNA起始点和pEMBL8-衍生出来的多元连接物。包括这┓段У腄NA片段可从载体中切去，且插入上游至不同的基因如“表达盒”。从上述质粒，三种uPA-衍生物表达载体通过切开细菌CAT基团：得到来自puPA2/41的p PP41，来自puPA2/17的p PP17;来自puPA2/254的p PP254。

E4.5.1-p PP41的结构

2.5微克puPA2/41DNA在37℃下用4单位XbaⅠ部分消化45分钟，且该反应通过加入EDTA（至10毫摩尔/升）而停止，并加热失活。沉淀（1.5.3）之后，DNA在37℃下，用2.5单位DNA PolⅠ（最终体积20微升）的克雷诺片段充满1小时，在8℃下，用2单位连接酶连接至一种50摩尔过量的SalⅠ连接物（1.5.5和1.5.6）16小时，且在酶热失活后，在37℃下用一种过量的SalⅠ完全消化2小时。DNA片段连接在一种0.75琼脂糖凝胶上（层析），且含有一个5.6千碱基对范围的DNA片段凝胶（体）部分切出。然后，该DNA如1.5.7所述萃取和纯化，再悬浮在10微升TE中，且2微升该溶液在16℃下用2单位连接酶（最终体积10微升）自行连接4小时。。然后，2.5微升该DNA制剂用于转化DH 5 E.coli感受态细胞（1.5.8-1.5.9）。在该氨苄青霉素-抗性菌落质粒pPP41中，即是通过微型制品分析选择一种含有包括在SalⅠ位和XbaⅠ位之间下游至CAT基因被删除的区域的质粒（图9B）。

E4.5.2-pPP/17和pPP/254的结构

基本上在依照上面概述的步骤，通过在37℃下分别用24单位XbaⅠ完全消化10微克puPA2/17 DNA或10微克puPA2/254DNA2小时可得到两种表达载体。直线的质粒的5′凸出端在37℃下，用DNA PolⅠ（2.5单元）的克雷诺片段补平1小时，且在8℃，用2单位连接酶连接至一种50摩尔过量的SalⅠ连接物（1.5.5和1.5.6）16小时，且在该酶热失活之后，DNA在37℃下用一种过量的SalⅠ完全消化2小时。然后，该酶热失活，且DNA沉淀（1.5.3），并再悬浮在10微升TE中。2微升该DNA溶液在15℃下用2单位DNA连接酶（最终体积10微升）连接16小时，且2.5微升用于转化DH5 E.Coli感受态细胞。在苄青霉素抗性菌落中，选择质粒pPP17和pPP254，它们运载uPA-导出删除启动子，且有如E4.5.1中pPP41所述的相同的一般特性（图9B）。

实施例E5

uPA衍生微型基因的制备

E5.1.载体的制备

来自pPP41、pPP17、pPP254质粒DNA（各20微克，如上面所述制备的）通过在25℃下用50单位SmaⅠ分别消化它们3小时（最终体积50微升）而直线化。然后直线的质粒在37℃下用1单位CIP脱磷酸化1小时，在0.8%的琼脂糖凝胶（体）（参见1.5.3）上纯化，再悬浮在20微升TE中，并在4℃下贮藏。

E5.2-微小基因的制备

上面所得到的直线或脱磷酸化质粒DNA（E5.1）（3微克）在15℃下，在具有2单位连接酶的10%PEG1500（最终体积10微升）中，与1微克uPA-ORF（例如，含有如E1.1所述得到的uPA编码区域的SmaⅠ断片（7.3.千碱基对）混合。

2.5微升来自各反应混合物用于转化感受态E.Coli DH5细胞（参见1.5.8）。在氨苄青霉素-抗性菌落质粒pPP41XS、pPP17XS和pPP254 XS中，通过微型制品分析（参见1.5.9）具有下列性质（图9C）的选择分别从pPP41、pPP17和pPP254衍生出的质粒：

-uPA编码区域插入在含有载体的uPA启动子的SmaⅠ位中

-uPA mRNA起始位与人类uPA基因的一样

-它们含有一种pEMBL8衍生出的顺序

-uPA-导出微小基因可从那载体中切去，且最好通过用XhoⅠ和SalⅠ消化插在不同的载体中

-切去的微小基因因插在具有一个SalⅠ或一个XhoⅠ位的载体中

-切去的微小基因可插在载体中，使它们在插在一种合适的宿主中时能维持一种游离（episomal）形式

-在来自uPA启动子的一种2.35片段的控制下，pPP41XS具有uPA编码区域;

-在pPP41XS中所得到的同样的启动子片段的强制下，pPP17XS具有uPA编码区域，但其中在两个OxaNⅠ位之间产生缺失;

-在pPP41XS中所得到的同样的启动子片段的控制下，pPP254XS具有uPA编码区域，但其中在5′OxaNⅠ位和EcoRⅤ位之间产生缺失。

E5.4-转染（trasfection）大量培养

在鼠LB6细胞中的转染实验如E.1.4.1所述进行。最多所产生的细胞为如E.1.4.2所示的大量培养。

E.5.5-uPA的定量估计

根据E.5.4通过细胞转染而产生的uPA的量如E.1.5.所示测定，使共同传染的含有该基因的质粒在劳氏（Rous）肉瘤病毒（RSV-LTR）的长端重复控制下用于抗新霉素（neo），含有uPA基因的质粒在一种uPA-衍生出的启动子（pPP41XS、pPP17XS或pPP254XS）控制下的转染的结果如下报道（隐蔽（暗）的前-uPA通过IAA测定，参见1.6.2.来自RSV-uPA转化的细胞系的含量认为是100%）：

%前-uPA产物

RSVuPA 100

1 73

pPP41XS：克隆 2 62

3 63

1 212

pPP17XS：克隆 2 202

3 183

1 209

pPP254XS：克隆 2 178

231

所回收的scu-PA的物理-化学和生物学性质与上面所报道的RSV-LB6-scu-PA（3F11 scu PA）的性质相同。

通过在CHO或A431细胞中重复转染和大量培养，得到一种scu-PA，分别具有同样的RSV-CHO-scu-PA或RSV-A431-scu PA化学-物理和生物学性质。

Claims

1、一种制备人类型单链糖基化尿激酶(前uPA)的方法，它包括用含有uPA密码基因组顺序的表达载体转化动物细胞。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的uPA基因组顺序是约7.3千碱基对的DNA片断，该片段是通过克隆在合适的克隆载体中的基因组DNA经SmaⅠ部分消化而得到的。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所说的克隆载体是λ-噬菌体。

4、根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所说的动物细胞是哺乳类动物细胞。

5、根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所说的动物细胞选自给定的人、鼠、仓鼠和猴类的细胞系。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所说的细胞系选自鼠LB6、中国仓鼠卵巢（CHO）和人体表皮样癌的细胞系。

7、根据权利要1、2、3、4、5或6所述的方法，其特征在于所说的uPA密码顺序是处于人体uPA启动区或其来自人体的衍生物的控制下。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所说的人体uPA启动区具有图7中所示的顺序，或其等位基因型。

9、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所说的人体uPA启动区是2.38千碱基对片段，该片段是通过用SmaⅠ消化被克隆在合适克隆载体中的基因组DNA而得到的。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所说的克隆载体是λ-噬菌体。

11、根据权利要求1至10中任一条所述的方法，其特征在于所说的启动区是人体uPA启动区的缺失衍生物。

12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于所说的人体uPA启动区衍生物是一种缺失衍生物，它失去被约在1827千碱基对和1202千碱基对之间的OxaNⅠ所切割的0.6千碱基对片段，或者是这样一种缺失衍生物，它失去在约为1827千碱基对的OxaNⅠ位点和约为537千碱基对的EcoRⅤ位点之间的1.29千碱基对片段。

13、一种用于表达哺乳类动物细胞中密码顺序的启动区顺序，其特征在于它是一种人体uPA启动区的插入、缺失或突变衍生物。

14、根据权利要求13所述的启动区顺序，其特征在于所说的启动区顺序是一种人体uPA启动区的缺失衍生物。

15、根据权利要求13所述启动区顺序，其特征在于所说的人体uPA启动区衍生物是一种缺失衍生物，它失去被OxaNⅠ所切割的0.6千碱基对片段，或者是这样一种缺失衍生物，它失去在约1827千碱基对的OxaNⅠ位点和约597千碱基对的EcoRⅤ位点之间的1.29千碱基对片段。

16、一种表达盒（exepression cassette），它包括权利要求13、14或15的启动区。

17、一种能转录真核细胞中侧翼基因或cDNA的表达载体，它包括人体uPA启动区顺序或权利要求13、14或15中的启动区。

18、一种具有DNA顺序的表达载体，它包括uPA密码人体基因组顺序和启动区顺序，后者是人体uPA启动区顺序或根据权利要求13、14或15中所述的启动区。

19、一种质粒，其特征在于该质粒选自pPP41、pPP17或pPP254。

20、一种能表达哺乳类动物细胞中人体uPA密码顺序的质粒，其特征在于所说的质粒选自pPP41XS、pPP17XS或pPP254XS。

21、一种转化动物细胞，其特征在于它包含权利要求13、14或15中的启动区，或者是权利要求19或20的质粒。

22、根据权利要求21所述的转化细胞，其特征在于所说的转化细胞能表达uPA或scu-PA。

23、根据权利要求21或22所述的转化细胞，其特征在于所说的转化细胞选自已建立的人、鼠、仓鼠或猴类的细胞系。

24、根据权利要求21或22所述的转化细胞，其特征在于所说的转化细胞选自鼠LB6、中国仓鼠卵巢或人类表皮样癌的细胞系。

25、根据权利要求21或22所述的转化细胞，其特征在于所说的转化细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，它能够在生长培养基中生长或在悬浮液中表达蛋白质。

26、根据权利要求21、22、23、24或25所述的转化细胞，其特征在于所说的转化细胞含有一种针对选择剂的抗性基因。

27、一种糖基化单链人类型尿纤维蛋白溶酶原激活剂，用凝胶电泳分析测得的表观分子量较之从人尿中所得的scu-PA高500-3000单位，上述差异是由于分子量的差异取决于B链的不同糖基化而造成的。

28、糖基化单链人体尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂具有：

（a）人体前uPA的氨基和羧基末端顺序;

（b）在SDS-PAGE的表现分子量约为52，000，相应于较之从人体尿中所得的前uPA的分子量高1000-2000左右（在同样的测定条件下测得），上述分子量的差异主要是由于B链分子链的相应差异造成的;

（c）A链的表观分子量与人类A链分子量相等;

（d）用糖肽酶F除去N-糖取代基后，B链的表观分子量与人的B链表观分子量相等。

29、根据权利要求27或28所述的糖基化单链人体尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂，其进一步特征在于所说的激活剂系由转化的鼠LB6、中国仓鼠卵巢或人体表皮样癌的细胞所产生的。

30、根据权利要求29所述的糖基化单链人体尿激酶型蛋白溶酶原激活剂，其特征在于所产生的细胞系按权利要求7所述的方法进行转化。

31、一种糖基化单链人体尿激酶型蛋白溶酶原激活剂，其特征在于3F11-sc-μPA、RSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA或BPV-LB6-scu-PA。

32、一种人类型双链尿激酶，它由权利要求27、28、29、30或31中的糖基化单链人类型前uPA的蛋白质分解而得到，或者可按权利要求1至11中任何一条所述的方法进行制备。

33、一种药剂，它含有权利要求27、28、29、30或31的中化合物，这种化合物用作药剂的活性组分。

34、一种治疗血栓形成或栓塞疾病的方法，它包括给所需治疗的病人施用抗血栓形成或抗栓塞的有效量的权利要求27、28、29、30或31中所述的化合物。