KR890003950A - 단일 사슬 유로키나아제의 제조 방법 - Google Patents

단일 사슬 유로키나아제의 제조 방법 Download PDF

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KR890003950A KR1019880007734A KR880007734A KR890003950A KR 890003950 A KR890003950 A KR 890003950A KR 1019880007734 A KR1019880007734 A KR 1019880007734A KR 880007734 A KR880007734 A KR 880007734A KR 890003950 A KR890003950 A KR 890003950A
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카싸니 기오반니
놀리 마리아루이사
마리아 토비아티 페데리코
코르티 안젤로
블라시 프란체스코
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레나토 스가르비
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Abstract

내용 없음

Description

단일 사슬 유로키나아제의 제조 방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 uPA 유전자, mRNA 및 단백질의 구조임. 상부에서 하부: -파지(phage) 람다-uPA2에서 uPA 유전자 삽입물의 제한 지도, -파지 람다-uPA1에서 uPA 유전자 삽입물의 제한 지도, -uPA 개방 해독 프레임(open reading frame) (Ba:BamHI, EI:EcoRI,S:Smal,HIII:Hind III), -인체 uPA 유전자의 엑손(exon)/인트론(intron)구조:검은색 박스:미번역 5'와 3'영역, 그늘진 박스: 번역된 엑손, 선:인트론, -부분적으로 비접합된 cDNA 클론 pHUK1의 엑손/안트론 구조, -pro-uPA mRNA에서 엑손과 아미노산간의 대응 원리, -pro-uPA에서 단백질 영역과 아미노산간의 대응 원리. 제2도는 RSV-uPA의 구성을 나타냄. 람다-uPA1에서 얻은 uPA mRNA의 완전한 PRF를 함유하는 Smal DNA 단편(이 도면의 상부 참조)은 박테리아 플라스미드 기능과 RSV의 LTR을 운반하는 HindIII와 Hpal 침지 RSV-Neo 플라스미드(이 도면의 좌측 부분 참조)중에서 전사시에 삽입된다. RSV-uPA는 RSV LTR에 함유된 프로모터(promoter) 조절하에 uPA ORF를 가지며, 적당한 진핵 생물 숙주에 삽입될 경우 단백질을 표현할 수 있다(이 도면의 하부 참조).

Claims (34)

  1. 동물세포를 uPA암호화 게놈 서열을 하유하는 표현벡터로 형질 전환시키는 것으로 됨을 특징으로 하는 인체형 단일 사슬 글로코실화 유로키나아제(pro-uPA)의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, uPA 게놈 서열의 적당한 클로닝 벡터에 클로닝시킨 게놈 DNA를 Smal부분 침지시켜 얻은 약 7.3kb의 DNA 단편임을 특징으로 하는 방법
  3. 제2항에 있어서, 클로닝 벡터가 박테리오파지람다임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1,2 또는 3항에 있어서, 동물세포가 포유동물세포임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1,2,3 또는 4항에 있어서, 동물세포가 입증된 사람, 쥐, 햄스터 및 원숭이의 세포주 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세포주가 쥐의 LB6, 차이니즈햄스터 난소(CHO) 및 사람의 유표피암 세포주 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1,2,3,4,5 또는 6항에 있어서, uPA암호와 서열이 인쇄 uPA프로모터 또는 인체에서 기원하는 그의 유도체의 조절하에 있음을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 인체 uPA프로모터가 제7도에 표시된 서열 또는 그의 대립 형질형을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 인체 uPA-프로모터가 적당한 클로닝 벡터에 클로닝시킨 게놈 DNA를 Smal침지시켜 얻은 2.38kb 단편임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 클로닝 벡터가 박테리오파지람다임을 특징으로 하는 방법
  11. 제1 내지 10항중 어느 하나의 항에 있어서, 프로모터가 인체 uPA프로모터의 결실 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,인체 uPA프로머터 유도체가 약 -1827bp와 -1202bp 사이에서 OxaNI에 의해 절단된 0.6kb 단편이 누락된 결실 유도체이거나 또는 약 -1827bp에서 OxaNI부위와 약 -537bp에서 EcoRV부위 사이의 1.29kb 단편이 누락된 결실 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  13. 인체 uPA프로모터의 삽입, 결실 또는 돌연변이 유도체임을 특징으로 하는, 포유동물세포에서 암호와 서열을 표현하는데 사용하기 위한 프로모터 서열.
  14. 제13항에 있어서 인체 uPA프로모터의 결실 유도체임을 특징으로 하는 프로모터 서열.
  15. 제13항에 있어서, 인체 uPA프로모터 유도체가 OxaNI에 의해 절단된 0.6kb 단편이 누락된 결실 유도체이거나 또는 약 -1827bp에서 OxaNI부위와 약 -597bp에서 EcoRV부위 사이의 1.29kb 단편이 누락된 결실 유도체임을 특징으로 하는 프로모터 서열.
  16. 제13,14 또는 15항의 프로모터로 됨을 특징으로 하는 표현 카세트.
  17. 인체 uPA프로모터 서열 또는 제13,14 또는 15항의 프로모터로 됨을 특징으로하는 전핵 생물세포에서 측면에 접한 유전자 또는 cDNA를 전사할 수 있는 표현벡터.
  18. uPA암호화 인체 게놈 서열로 되는 DNA서열 및 인체 uPA프로모터 서열이거나 또는 제13,14 또는 15항에 의한 프로모터인 프로모너 서열을 가짐을 특징으로 하는 표현벡터.
  19. pPP41,pPP17 및 pPP254중에서 선택됨을 특징으로 하는 플라스미드.
  20. pPP41XS, pPP17XS 및 pPP254XS중에서 선택됨을 특징으로 하는, 포유동물세포에서 인체 uPA암호화 서열을 표현할 수 있는 플라스미드.
  21. 제13,14 또는 15항의 프로모터 또는 제19 또는 20항의 플라스미드를 함유ㅎ람을 특징으로 하는 형질 전환시킨 동물세포.
  22. 제21항에 있어서, uPA 또는 scu-PA를 표현할 수 있음을 특징으로 하는 형질 전환시킨 세포.
  23. 제21 또는 22항에 있어서, 입증된 사람, 쥐, 햄스터 및 원숭이의 세포주 중에서 선택됨을 특징으로 하는 형질 전환시킨 세포.
  24. 제21 또는 22항에 있어서, 쥐의 LB6, 차이니즈햄스터 난소 및 사람의 유표피암 세포주 중에서 선택됨을 특징으로 하는 형질 전환시킨 세포.
  25. 제21 또는 22항에 있어서, 생장 배지 중의 현탄액에서 단백질을 생장시키고, 표현할 수 있는 차이니즈햄스터 난소 세포주임을 특징으로 하는 형질 전환시킨 세포.
  26. 제21,22,23,24 또는 25항중 어느 하나의 항에 있어서, 선택제에 대한 내성 유전자를 함유함을 특징으로 하는 형질 전환시킨 세포.
  27. 전기 영동 분서에서 사람의 요에서 얻은 scu-PA보다 500-3000단위 높은 겉보기 분자량을 가지며, 이 차이가 B-사슬의 상이한 글리코실화에 의존하는 분자량의 차이로 인한 것임을 특징으로 하는 글리코실화 단일 사슬 인체형 요의 플라스미노겐 활성화제.
  28. a) 인체 pro-uPA의 아미노 및 카르복시 말단 서열, b) SDS-PAGE에서 동일한 분석 조건하에 측정된 인체요에서 얻은 pro-uPA보다 약 1000-2000단위 높은 분자량에 대응하는 약 52,000의 겉보기 분자량(분자량에 있어서 이러한 차이는 B사슬의 분자량에 대응하는 차이로 인한 것임.), c) 인체 A사슬과 같은 A사슬의 겉복 분자량, d) 글리코펩티다아제 F로 N-글리코시드 치환체를 제거한 후 인체 기원의 B-사슬의 겉보기 분자량과 같은 B-사슬의 겉보기 분자량을 가짐을 특징으로 하는 글리코실화 단일 사슬 인체 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화제.
  29. 제27 또는 28항에 있어서, 추가로 형질 전환시킨 쥐의 LB6, 차이니즈햄스터 난소 또는 사람의 유표피암 세포주에 의해 생성됨을 특징으로 하는 글리코실화 단일 사슬 인체 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화제.
  30. 제29항에 있어서, 생성된 세포주가 제7항의 방법에 의해 형질 전환됨을 특징으로 하는 글리코실화 단일 사슬 인체 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화제.
  31. 3F11-sc-uPA, RSV-A431-scu-PA, RSV-CHO-scu-PA 또는 BPV-LB6-scu-PA의 특성을 가짐을 특징으로 하는 글리코실화, 단일 사슬 인체 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화제.
  32. 제27,28,29,30 또는 31항의 글리코실화, 단일 사슬, 인체형 pro-uPA의 단백질 분해 분열에 의해 얻거나 또는 제1항 내지 12항중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의하여 제조된 인체형 2개 사슬 유로키나아제.
  33. 유효성분으로서 제27,28,29,30 또는 31항의 화합물을 함유함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  34. 치료를 필요로 하는 환자에게 제27,28,29,30 또는 31항의 화합물의 혈전붕괴 또는 색전적으로 유효한 양을 투여하는 것으로 됨을 특징으로 하는 혈전증 또는 색전성 질환의 치료 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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