KR920005918B1 - 인간 푸리푸로 인슐린-양성장 인자 i - Google Patents
인간 푸리푸로 인슐린-양성장 인자 i Download PDFInfo
- Publication number
- KR920005918B1 KR920005918B1 KR1019870000030A KR870000030A KR920005918B1 KR 920005918 B1 KR920005918 B1 KR 920005918B1 KR 1019870000030 A KR1019870000030 A KR 1019870000030A KR 870000030 A KR870000030 A KR 870000030A KR 920005918 B1 KR920005918 B1 KR 920005918B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- lys
- arg
- gly
- igf
- thr
- Prior art date
Links
- 108010022667 preproinsulin-like growth factor I Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 174
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 137
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 122
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 91
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 89
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 81
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 56
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 55
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 28
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 claims description 8
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 claims description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 6
- GXCSUJQOECMKPV-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Gln Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GXCSUJQOECMKPV-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 5
- CVKOQHYVDVYJSI-QTKMDUPCSA-N Arg-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O CVKOQHYVDVYJSI-QTKMDUPCSA-N 0.000 claims description 5
- RRUWMFBLFLUZSI-LPEHRKFASA-N Asp-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RRUWMFBLFLUZSI-LPEHRKFASA-N 0.000 claims description 5
- UWHCKWNPWKTMBM-WDCWCFNPSA-N Lys-Thr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O UWHCKWNPWKTMBM-WDCWCFNPSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- OHYQKYUTLIPFOX-ZPFDUUQYSA-N Arg-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O OHYQKYUTLIPFOX-ZPFDUUQYSA-N 0.000 claims description 4
- LEFKSBYHUGUWLP-ACZMJKKPSA-N Asn-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LEFKSBYHUGUWLP-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 4
- KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 4
- CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N Cys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 4
- KWUSGAIFNHQCBY-DCAQKATOSA-N Gln-Arg-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O KWUSGAIFNHQCBY-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 4
- GFLQTABMFBXRIY-GUBZILKMSA-N Glu-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GFLQTABMFBXRIY-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 4
- HFXJIZNEXNIZIJ-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HFXJIZNEXNIZIJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 4
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 4
- QCBYAHHNOHBXIH-UWVGGRQHSA-N His-Pro-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CN=CN1 QCBYAHHNOHBXIH-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 4
- QLRMMMQNCWBNPQ-QXEWZRGKSA-N Ile-Arg-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)O)N QLRMMMQNCWBNPQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 claims description 4
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 4
- ZASPELYMPSACER-HOCLYGCPSA-N Lys-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ZASPELYMPSACER-HOCLYGCPSA-N 0.000 claims description 4
- YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N Lys-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 4
- WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 4
- WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N Pro-Lys-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N 0.000 claims description 4
- KWMZPPWYBVZIER-XGEHTFHBSA-N Pro-Ser-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWMZPPWYBVZIER-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims description 4
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 4
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 claims description 4
- XSEPSRUDSPHMPX-KATARQTJSA-N Thr-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XSEPSRUDSPHMPX-KATARQTJSA-N 0.000 claims description 4
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 claims description 4
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 8
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 4
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 4
- DCGLNNVKIZXQOJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DCGLNNVKIZXQOJ-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 4
- NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N Arg-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims 4
- PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims 4
- TWTWUBHEWQPMQW-ZPFDUUQYSA-N Gln-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWTWUBHEWQPMQW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 claims 4
- HPCOBEHVEHWREJ-DCAQKATOSA-N Gln-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HPCOBEHVEHWREJ-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 4
- FLQAKQOBSPFGKG-CIUDSAMLSA-N Glu-Cys-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FLQAKQOBSPFGKG-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 4
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 4
- DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N 0.000 claims 4
- LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 4
- GRADYHMSAUIKPS-DCAQKATOSA-N Lys-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GRADYHMSAUIKPS-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 4
- XATKLFSXFINPSB-JYJNAYRXSA-N Lys-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XATKLFSXFINPSB-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims 4
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 4
- RNMRYWZYFHHOEV-CIUDSAMLSA-N Ser-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RNMRYWZYFHHOEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 4
- JTEICXDKGWKRRV-HJGDQZAQSA-N Thr-Asn-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JTEICXDKGWKRRV-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims 4
- YUOCMLNTUZAGNF-KLHWPWHYSA-N Thr-His-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O YUOCMLNTUZAGNF-KLHWPWHYSA-N 0.000 claims 4
- XDQGKIMTRSVSBC-WDSOQIARSA-N Trp-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CNC2=CC=CC=C12 XDQGKIMTRSVSBC-WDSOQIARSA-N 0.000 claims 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 claims 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 claims 4
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 claims 4
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 claims 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 129
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 75
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 47
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 47
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 37
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 22
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 22
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 20
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 8
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 8
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 6
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CUJMXIQZWPZMNQ-XYYGWQPLSA-N 13,14-dihydro-15-oxo-prostaglandin E2 Chemical compound CCCCCC(=O)CC[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O CUJMXIQZWPZMNQ-XYYGWQPLSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000004135 Bone phosphate Substances 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001076293 Mus musculus Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 101001034655 Xenopus laevis Insulin-like growth factor I-B Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 5-fluorouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101500006448 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) Endonuclease PI-MboI Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101000599960 Rattus norvegicus Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 101001034661 Xenopus laevis Insulin-like growth factor I-A Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 244000145841 kine Species 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011022 opal Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009645 skeletal growth Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000001755 vocal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
내용 없음.
Description
다음의 도표의 표현에 있어서, 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단부(NH2)로부터 카르복시 말단부(CooH)까지를 판독하는데 사용되며, DNA 서열이란 5' 내지 3'배 양에 사용되여, 관련 제한 효소 부분 역시 보여진다.
DNA 영역은 다만 도표 표현의 목적으로 아래에 도시한 바와 같이 표시하였으며 달리 참조없이 규격화하여 그린 것은 아니다.
DNA 서열의 번호 5'에서 3'까지이고 아미노 말단부에서 카르복시 말단부까지의 아미노산 서열은 다만 도표상 목적을 위해서이다.
제1도 인간 IGF-1B cDNA 크론을 지도로 도시한 것이다. 수평방향 화살은 cDNA의 DNA 서열에 접근을 표시한다 : 열린 테두리 부분은 585염기가 open 리딩후레임(reading frame)을 표시하고 한편 크로스 해치된 테두리 부분은 성숙된 인간 IGF- I 펩타이드로 암호된 DNA 서열을 표시한다 : 얇은 선은 1136의 뉴크레오타이드 cDNA의 5'와 3'의 미번역 영역을 표시한다. 인간 IGF-1B cDNA의 지도 하부는 λIGF-2와 λIGF-5를 표시한 cDNA 크론을 나타낸 것이다. λIGF-5 크론중 "A42"는 42의 아데노신(A)염기로 구성된 포리 A 암호된 서열을 표시한다.
제2도 IGF-1B cDNA 크론(1136개 뉴클레오타이드류)의 DNA 서열과 뉴클레오타이드 183(에 ppIGF-1B 아미노산 서열)에서 시작되는 open 리딩후레임(reading frame)을 585염기의 번역을 도시한 것이다. 말단암호는 ###와 * * *까지로 표시하였다. 절단된 언더라인 영역은 성숙한 인간 IGF- I 펩타이드(뉴클레오타이드 327 내지 뉴클레오타이드 536)로 암호된 뉴클레오타이드를 표시하며, 성숙된 인간 IGF- I 의 아미노산 서열이 부수된다. 연속적인 언더라인 영역은 IGF-1B 카르복실-말단 확장 펩타이드로 암호된 뉴클레오타이드를 표시하여, 전기 확장 펩타이드의 아미노산 서열이 부수된다.
제 3도 (a) 인간 IGF- I 유전자 구조와 제한 지도를 도시한 것이다. 5'에서 3'도의 방향 화살은 IGF-I 유전자의 5'에서 3' 배향을 나타낸 것이다. 엷은 선은 인트론(intron)과 면제된 영역이다. ∫∫는 분자 크로닝으로 분리되지 않은 인트론의 영역를 표시한다. 연속적인 테두리 부문(1,2,3,4,5)는 암호된 영역을 표시하고 크로스 해치된 테두리 암호되지 않은 영역을 표시하고 : 엑손 4와 5아래 수직화살은 포리아데닐 화학부분을 표시한다. "Alu"라고 표시된 부분은 Alu 타입의 중앙 반복성의 DNA로 세포 융합된 것을 표시하고 제한 부분은 "B"=BamH I, "E"=EcoR I, "H"=HindⅢ. 제한지도 하부는 게놈성 클론을 표시한다. (b)IGF-.I 엑손 1 내지 5의 상세한 제한 지도를 도시한 것이다. 수평 방향 화살은 DNA 서열 전략을 표시한다. 테두리 부분은 엑손을 표시하며 연속적인 영역은 암호된 영역을 표시하고 크로스 해치된 영역은 미암호영역을 표시한다. 엑손 4와 5아래에 수직화살은 포리아데닐화한 부분을 표시한다.
제4도 인간 IGF-I 유전자의 DNA 서열을 도시한 것이다. 엑손은 상부에 있고 인트론 및 후랭킹DNA는 하부에 있다. ppIGF-I 단백질(예, ppIGF-1A 및 ppIGF-1B의 아미노산 서열)의 번역이 표시되어 있고, pIGF-1A 및 pIGF-1B의 카르복실-말단 확장을 별개로 연속적으로 오버라인하여 1A와 1B로 표지하여 표시하였다. 성숙된 IGF-I의 70개의 아미노산이 절단된 언더라인으로 표시하였다. 후레임 번역말단 코돈중에서 TGA와 TAA 선도 번역 개시 출발 신호 암호인 ATG는 ***으로 표시하였다. 추정되는 전사 시작 부위는 AA로 표시하였다. 프리아데닐화 신호인 AATAAA와 AATATA는 연속적인 오버라인으로 표시하였고, 포리 A부기 부분으로 계속되고, 엑손 4와 5에서 별개로 "poly AA"로 표시하였다. 점선라인은 Kb(킬로베이스)로 표시된 길이에 서열화되지 않은 영역을 표시한다.
제5도 IGF-1A와 IGF-1B cDNA 서열을 비교하여 도시한 것이다. 상부 라인은 IGF-1B를 표시하고 하부라인은 IGF-1A를 표시한다. 말단(5'와 3') 뉴클레오타이드류는 "X"로 표시하였다.
제 6도 ppIGF-1B 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
본 발명은 신규한 인슐린양 성장 인자 전구 단백질과 신규한 인간 푸리푸로 인슐린양 성장 인자 I 유전자 및 DNA 배열에 관한 것이다.
인슐린양 성장 인자들(Insulin-like growth factors, 이하 IGF's라 한다)은 여러 종류의 동물종으로부터 분리되어져 왔으며, 성장 홀몬 및 태반 락보겐과 같이 이와 같은 홀몬의 등화 효과를 조정하는 성장 촉진구조물로 활동하고 있다고 알려져 있다. 이와 같이 IGF's는 치료 및/또는 여러 성장 조건의 효력 증강 및/또는 부상의 처리시에 사용될 수 있다. "인슐린양 성장 인자"라는 용어는 인슐린양 효과 및 이런 펩타이드화합물의 인슐린양 구조를 강조하기 위하여 선택된 것이다. IGF's는 인슐린과 함께 50% 아미노산 동족체에 가깝고 푸로 인슐린을 닮은 3차원의 구조를 갖는다. 나아가 3차원의 형태로, IGF's의 구조는 단순사슬 펩타이드, 3개의 디설파이드 브리지에 의해 가교되어 있고 푸로 인슐린과 유사하며, B-사슬양 아미노 터미날파트(B 영역), 펩타이드 연결(C 영역), A-사슬양 부분(A 영역)으로 구성되어 있다. 부가적으로, 푸로인슐린에서 발견해낼 수 없는 카르복실-터미날 확장 부분도 있다(D 영역), 최근 연구는 또한 아직은 푸로인슐린에서 발전할 수 없는 다른 카르복실-터미날 확장 부분의 존재를 보고하면서 E 영역이라하였다.
E 영역 펩타이드는 쥐와 인간 IGF-II는 연관되어 있다는데까지는 확인되었다. 힐카등(1985) 및 줌스테인등(1985). 오늘날, IGF's의 여러 분류가 확인되어졌다. 여기에 IGF- I (소마토스타딘 C), IGF-II, 소마토스타딘 A 세포증식 촉진 인자인 펩타이드 혼합물(MSA)을 포함한다. 이런 펩타이드류의 이종군은 도그하디(1977) : 크램몬스 앤드 반위크(1981a)는 생체외에서, 반 부로퍼스 앤드 반 덴 브란데(1980), 숀넬등(1982)은 생채내에서 중대한 성장 촉진 효과를 보인다. 2개의 인간 IGF's는 특징을 갖으며, 이들중 IGF-I은 린델 크넥트 앤드 훔벨(1978a), 루빈등(1982)의 70개의 아미노산 염기성 단백질로 구성되어 있으며, IGF-II는 린텔크넥트 앤드 훔벨(1978), 마쿠아르드트 앤드 토다로(1981)의 67개의 아미노산 중성 펩타이드로 구성되어 있다.
한편 완전한 아미노산 배열은 다만 쥐와 인간의 IGF-I과 IGF-II 훔벨, 알.이(1984)에 의해서만이 측정되어졌는데, 동촉체의 고도 및/또는 방사성 면역 시험법(radio immuno assay)으로 알 수 있는 교차-재생능 및/또는 다른 종으로부터 IGF-I's 가운데와 IGF-II's 가운데서 존재하는 방사성 수용체 시험법(radioreceptor assay)으로 측정하였다. 윌슨 앤드 힌즈(1982). 이 펩타이드류의 순환치는 IGF-II 보다더 넓은 영역으로 조절된 IGF-I로 더 넓은 또는 더 적은 영역 성장 홀몬을 조절하에 있음을 나타난다. 예를 들면, IGF-I은 성장 홀몬 작용의 중요 중계자로서 출생후 포유동물의 성장에 기초적인 역활을 한다. 코페란드등(1980) 및 쇼넬등(1982)을 참조하시오. 바실르포로-세린과 필립스(1982)는 IGF- I 활동성을 분자체 크로마토그라피를 사용하며, 생체내외에서 분석하며 평가하였으여, 쥐의 간에서 추츨된 것이 혈장으로부터 추출된 활동성(거의 8킬로달톤)보다 더 높은 분자량(거의 30킬로달톤)을 갖는다. 저자들은 높은 분자량을 물질이 IGF-I 전구체를 대표한다고 암시했다. 저자들은 또한 높은 분자량을 갖는 쥐의 간 IGF- I의 대사성 규정은 쥐 혈청에서 유도된 IGF- I 과 유사하다고 주장하였다.
최근 줌스테인등(1985)은 상체내에서 IGF-II 양의 활동성을 갖는다고 하는 인간 혈청으로부터 여러 종류의 IGF-II 전구체를 분리하였다. 여러 성장 조건의 촉진 및/또는 치료에 있어서 IGF-I 단백질의 전구체 즉 고분자량의 물질의 유용성과 가능한 생물학적 역가때문에 이와 같은 전구체 단백질의 아미노산 서열과 DNA 암호 배열을 오래전부터 조사하였다.
잔센등(1983)은 더 큰 IGF- I 전구체의 암시를 주어 인간 IGF- I cDNA 클론으로부터 유도된 아미노산 배열을 제공하였다. 또한 네덜란드 특허출원 번호 제8302324호,1985.1.16. 공고에도 알려져 있다. 그러나 잔센에 의해서 공지된 cDNA는 암시된 전구체 단백질을 상세히 번역하는 시초를 가르치도록 충분한 DNA 서열정보를 제공하지는 않았다. 부가적으로, 잔센등(1983)과 네덜란드 특허 출원번호 제8302324호에서는 cDNA 서열이 표시되어 있거나 표시할 수 있다(예, 암시된 전구체단액절이 제조되었다)고 가르쳐 주고 있다.
정말로, IGF- I 생합성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 기초적인 연구로 다만 한 인간의 IGF-I유전자가 하프로이드 게놈마다 존재하는 것으로 암시하였다. 울리히등(1984) : 부리센덴둥(1984) : 트리크리등(1984). IGF- I 생합성의 연구는 조직중에 IGF- I 농도가 매우 낮아 방해가 되어왔다. 바실로포로-셀린 및 필립스(1982),IGF-II와 대조하여 볼 때, 배양 세포 계통은 이 펩타이드의 중대한 양으로 통화하는 것으로 확인이 되지 않았기 때문이다. 클레몬스와 반위크(1981b) : 클레몬스와 쇼(1983).
부가적으로, 완전한 인간 IGF- I 유전자는 분리해 낼 수 없을 뿐만 아니라 완전한 DNA 서열을 확인할수도 없다.
벨 등에 의한 (1985) 최초 연구는 인간 IGF- I 유전자는 적어도 길이로 35킬로베이스(Kb)이며, 오로지 210개의 염기쌍(base pairs : bp)가 성숙된 인간 IGF-I로 암호되었다고 암시하였다. 벨등에 의한 연구(1985)는 또한 인간 IGF- I 유전자는 다만 4개의 엑손(exon)을 가지며 서로 단일 전구체 IGF- I 단백질은 암호되어 있음을 암시하였다. 성숙된 IGF- I 암호된 서열에 관한 유전자의 크기 규모(예 35Kb보다 큰경우)와 복잡성은 완전한 게놈성 DNA 서열의 확인 및 분리는 극히 어렵게 다루어졌다. 게놈성 IGF-I크론(예 IGF- I 유전자)의 단리는 IGF- I 생합성의 연구를 손쉽게 하였으며, 그것에 의하여 전구제 성숙 및/또는 중간체 IGF-I 종 그리고 알레릭(Allelic)변형체의 확인 및 생산하는 방법을 제공한다. 이들 게놈성 클론은 단백질이 활동성 성장 촉진 펩타이드라고 믿는데 확인을 손쉽게 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 고순도의 유전자 및/또는 IGF- I 전구체 단백질(푸리푸로 인슐린양 성장 인자-I)로 합성된 DNA 서열, 및/또는 그것에 의한 펩타이드 단편및 이와 같은 단백질을 만드는데에 있어서의 유용성 및/또는 단편을 제공하는데 있는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이와 같은 단백질이나 펩타이드의 생산에 있어서 이와 같은 DNA를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 푸리푸로 인슐린양 성장 인자-I의 아미노산 배열과 동물에 있어서 원하는 데로의 성장 또는 세포의 기능을 촉진시킬 수 있는 이와 같은 단백질 또는 단편을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 신규한 푸리푸호 인슐린양 성장 인자- I (ppIGF- I ) 단백질 본래의 순수한 인간 IGF- I 유전자 및 신규한 ppIGF- I 단백질로 암호된 합성 DNA 서열의 발견에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 본래의 적어도 2개의 ppIGF- I 단백질로 암호되고 제4도에서 표시된 바와 같이 뉴크레오타이드류의 서열(또는 단백질 표현에 대한 그들의 기능의 동일)을 포함하는 순수한 IGF-I 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 다른 면에서 본 발명은 신규한 ppIGF-I 단백질로 암호된 합성 DNA 서열을 제공하는 것이다.이와 같은 합성 DNA 서열은 제2도에서 표시된 바와 같이 뉴클레오타이드류의 서열(또는 단백질 표현에대한 그들의 기능의 동일)을 포함한다.
더욱 다른면에서, 본 발명은 신규 ppIGF- I 단백질의 카르복실-말단 확장으로 암호된 본래의 순수한 DNA 서열을 제공하는 것이다.
이런 본래의 순수한 DNA 서열은 뉴클레오타이드류의 다음 서열을 포함한다.(또는 펩타이드 표현에 대한 그들의 기능 동일) :
5'TATCAGCCCCCATCTACCAACAAGAACACGAAGTCTCAGAGAAGGAAAGGTTGGCCAAAGACACATCCAGGAGGGGAACAGAAGGAGGGGACAGAAGCAAGTCTGCAGAGATCAGAGGAAAGAAGAAAGAGCAGAGGAGGGAGATTGGAAGTAGAATGCTGAATGCAGAGGCAAAAAAGGAAAATGA3'
또 다른 관점에서, 본 발명은 제6도에서 볼 수 있는 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 신규한 ppIGF- I단백질을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 신규한 확장된 펩타이드를 제공하는 것이다.
NH2-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.
이런 확장된 펩타이드는 신규 ppIGF- I 단백질의 카르복실-말단 확장 부위로 나타난다.
다른 관점에서, 본 발명은 이와 같은 효과를 일으키는데 충분한 량으로 동물에게 본 발명의 신규한 단백질 및/또는 펩타이드를 복용하여 동물중에 세포의 성장 및/또는 다른 요망되는 기능을 촉진키 위한 여러가지 방법을 제공하는 것이다.
다른 점에서, 본 발명은 여기에서 유전자 및/또는 제공되는 합성 DNA 서열의 표현으로 일어나도록 본발명의 본래의 순수한 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 여기서는 아미노산(예를 들면 알라닌 대신에 Ala)을 나타내는 상징을 사용하고 뉴클레오타이드류(G,C,A,T)라고 편리하게 사용했다. 레닝거(1976)을 참조하시오.
여기서 사용되는 "유전자(gene)"이란 주어진 단백질로 암호화한 DNA 서열을 포함한 영역인 염색체 DNA를 말한다.
전형적인 진핵 유전자(eucaryotic genes)는 인트론(introns) 파 엑손(exons)을 포함한다. 엑손(exon)이란 RNA로 전사된 이를 유전자(예를 들면 DNA) 서열을 말한다. 그러므로 엑손은 단백질 암호화된 및 암호되지 않은 DNA 서열 둘다로 구성되어 있으며 암호된 및 암호되지 않은 DNA 서열은 단백질로 번역된 암호된 서열뿐만 아니라 RNA로 전사된 것이다. 인트론(intron)이란 전사되지도 않고 번역되지도 않은 유전자를 갖는 DNA 서열을 말하고 일반적으로 엑손사이에서 발견되었다.(앞으로는 인트론(intron)이라 칭한다).
여기서 사용하는 단백질, 펩타이드, 핵산(DNA 또는 RNA) 서열 유전자 및/또는 화합물을 설명시에 "반드시 순수한 또는 본질의 순수한(essentially pure)"이란 용어는 자연상태(예를 들면, 생체내)에 있어 연관된 기재된 단백질, 펩타이드, 핵산서열, 유전자 및/또는 분자를 가진 단백질류, 펩타이드류, 핵산서열들, 유전자들 및/또는 분자들로부터 실질적으로 또는 본질의 자유로운 것을 뜻한다, 여기에서 사용되는 단백질또는 펩타이드를 묘사시에 "합성(synthetic)"이란 용어는 동물에 있어서 자연산생 보다는 다른 기술(예를들면 화학적 또는 효소적 합성 또는 재조합 DNA 표현)에 의해서 산생된 단백질 또는 펩타이드를 말한다.
그래서, 생산된 것으로, "합성 단백질류 또는 펩타이드류"는 전형적으로 필연적으로 순수한 것이다(예를들면, 자연상태 본래의 단백질류나 펩타이드류와는 자유로운(free) 상태). 유사하게도 DNA 서열이나 분자물에 관하여 "합성(Synthetic)이란 용어는 생체내에서의 그들의 자연 복제보다 다른 기술에 의해서 만들어지는 그와 같은 DNA 서열 또는 분자물을 뜻한다. 이와 같이, 여기에서 묘사되는 뉴클레오타이드 서열의 사용할 때 본 발명에서 어느 DNA 서열은 이와 같은 기술분야에서 숙련 기술로 알려진 여러가지 "합성(Synthetic)"기술로 제조될 수 있으며, 자동화된 DNA 합성기구, 다른 화학 합성방법, 효소분리, cDNA합성 또는 크로닝 기술등에 제한받지 않는다. "카르복실-터미날 확장 펩타이드" 또는 달리 "확장 펩타이드(extension peptide)"라는 용어는 여기에서는 성숙된 IGF-I으로 암호된 DNA 서열에서 다운 스트림(3')DNA 서열중 암호된 펩타이드를 뜻한다. 예를 들면, 본 발명에서의 한확장 펩타이드는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
NH2-Arg-Ser-Val-Arg-Ala-Gln-Arg-His-Thr-Asp-Met-Pro-Lys-Thr-Gln-Lys-Tyr -Gln - Pro - Pro - Ser - Thr - Asn - Lys - Asn - Thr - Lys - Ser - Gln - Arg - Arg - Lys - Gly - Trp -Pro - Lys - Thr - His - Pro - Gly -Gly -Glu - Gln - Lys -Glu - Gly - Thr - Glu - Ala - Ser - Leu - Gln -Ile - Arg - Gly - Lys - Lys - Lys - Glu - Gln - Arg -Arg - Glu - Ile - Gly - Ser - Arg - Asn - Ala -Glu -Cys - Arg - Gly - Lys- Lys- Gly - Lys - COOH
두번째 확장 펩타이드는 상기 서열중 언더라인된 아미노산들로 구성되어 있다. 이 두번째 확장 펩타이드는 본 발명의 신규 IGF- I 엑손 4로 암호되어 있다. 이들 확장 펩타이드들은 IGF- I 유전자에서 암호된 단백질을 소유하거나 주거나 하는 것으로 생물학적 능력을 증강시키는 것으로 믿어진다.
또한, 기술분야에서 잘 알려진 것으로 알려져 있는바, 단백질의 능력이 실제적으로 유지되는 한 여러가지 아미노산의 치환물, 부가물 및/또는 결실물로 둘러싸인 개개의 아미노산 서열에 의해서 본 발명의 단백질에 참고되었다. 유사하게도 본 발명에 의하여 확인된 본질의 순수한, 합성 DNA 서열, 유전자는 암호된 단백질의 능력이 실제적으로 유지되는한 암호된 단백질의 표현을 위해 뉴클레오타이드 결실, 치환물, 역위, 부가, 알레닉(Allelic) 변형체 및/또는 기능상 동등물과 같은 여러가지 뉴클레오타이드 서열 변형물로 둘러싸여져 있음을 알 수 있다.
이와 같은 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열 변형물은 이 기술분야에서 잘 알려져 있고 노보(NOVO)사의 화학적 합성, 효소조작, 재조합 DNA 기술과 같은 편리한 기술로 창제될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 특별한 DNA 서열 및/또는 유전자의 변형은 특별한 숙주세포 또는 본 발명에서 합성되면 단백질에 이용된 유기체의 더 좋은 발현 및/또는 암호되어 알려진 유전암호 퇴화에 따라 만들어진다고 예상되고 있다.
[발명 DNA]
본 발명의 요지는, 여기서는 IGF-1B cDNA로서 표시되는, 신규한 IGF- I 특수 cDNA를 확인하고 분리하였다.
이 IGF-1B cDNA 뉴클레오타이드 서열은 제2도에서 나타난 바와 같이 결정되었다. 나아가 IGF-1B cDNA의 DNA 서열분석으로 585의 뉴클레오타이드 오픈리딩 푸레임(뉴클레오타이드 183개 내지 767개,제2도)이 분명해졌으며, 신규 195아미노산 푸리푸로 인슐린양 성장 인자-I 단백질 여기서는 ppIGF-1B라고 표시되어 암호되었음이 밝혀졌다. 신규 ppIGF-1B의 아미노산 서열은 제6도에 표시된 바와 같다. 잔센등(1983)에 의해서 공표된 ppIGF- I cDNA와 IGF-1B cDNA 사이의 비교는 제 5도에 표시하고 아래에 좀더 충분하게 묘사했는데, 신규하고 진귀한 ppIGF-I 단백질(예를 들면 ppIGF-1B)을 암호하여 신규하고 진귀한 합성 DNA 서열로된 IGF-1B cDNA를 밝혔다.
특히, 한편 IGF-1B cDNA 서열이 처음 402개의 뉴클레오타이드로된 잔센등(1983)의 서열에서 본질적으로 동족체임이 확정되었고, 그 뉴클레오타이드 서열은 예리하제 분기되어 있다. 잔센등은 이와 같은 IGF-1B cDNA는 양자크기(IGF-1B의 195개 아미노산 대 153개 아미노산)와 카르복실-터미날 확장 펩타이드 조성이 다른 2개의 상이하고 진귀한 ppIGF- I 단백질을 나타내게(예를 들면, 암호화)되었다.
신규한 IGF-1B cDNA는 생체외에서 ppIGF-1B 산생에 유용됨이 밝혀졌고, 관례적인 재조합 DNA 기술과 유전공학에 의해 적당한 숙주세포(예를 들면 세균,효모,포유동물 또는 식물)에서 ppIGF-1B 또는 어느 부분을 생산하는데 유용한 합성 DNA 서열을 제공하는 것으로 예상된다.
또한, 선택된 포유 동물 세포에서 합성 IGF-1B DNA 서열은 IGF- I을 성숙시켜 ppIGF-1B의 세포또는 후생산 공정의 결과로 성숙된 IGF- I 을 생산하는데 이용된다고 예상하였다.
오늘날 IGF-1B cDNA(제2도 참조)의 DNA 서열을 제공하는데 있어서 전기 서열로 구성된 합성 DNA분자는 자동화된 DNA 합성과 같은 관례적인 방법에 의해서 만들어진다.
본 발명의 용지중 하나는, IGF-1B cDNA를 인간의 간전령 RNA(mRNA)로부터 조립된 cDNA 라이브러리(library)로부터 분리되었다.
cDNA 라이브러리는 크옥크등(1985) 및 구블러와 호프만(1983)에 의해서 묘사된 방법과 연관하여 IGF-I cDNA를 포함한 클론을 위하여 조립되고 스크린되었다. 비록 간이 IGF 생산의 주요 부위이며 다른 많은 조직들 예를 들면 태아의 조직, 피브로브라스트에서도 꼭같이 IGF's가 합성된다.
이런 다른 조직은 별도로 인간 cDNA 라이브러리를 조립하는데 별도로 채택된다.
본 발명의 바람직한 요지중 하나는, 성숙된 IGF- I 암호된 서열에 따른 올리고뉴클레오타이드 소식자는 IGF- I 특수 cDNA 서열을 포함한 클론의 분석 존재를 위하여 인간 cDNA 수집을 조사하는 것을 채택하였다.
특히, 소식자는 성숙된 인간 IGF-I의 아미노산 10개에서 23개(제6도에서 아미노산 58-70 참조)로 암호된 DNA 서열에 따른 42의 뉴클레오타이드 분자(42mer)로 구성되어 있다.
이와 같은 소식자는 게놈, 성숙된 IGF- I의 전체 또는 부분이 암호된 DNA 및/또는 RNA 서열을 분리하는데 이용될 수 있다. 성숙된 IGF-I DNA 암호된 서열의 다른 영역은 별도로 이용된다.
부가적으로 이와 같은 올리고 뉴클레오타이드 소식자의 길이(예를 들면, 뉴클레오타이드의 수)는 채용된 잡종 세포 와 조건(hybridization condition)의 스트린전시(stringency)에 따라 변이된다.
대표적으로, 이와 같은 올리고 뉴클레오타이드 소식자는 확인될 DNA 또는 RNA 서열을 가진 동족체에서 분리된 적어도 13개 또는 14개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있다.
성숙된 IGF-I에서 제시된 소식자를 갖는 cDNA 라이브러리 조사는 조립된 cDNA 라이브러리로부터 조직중에서 활동력있게 표현된 가능한 모든 IGF-I 전령 RNA(mRNAs)를 확인하도록 허용되었다.
이와 같은 mRNAs의 번역을 포함할 수 있는 것이나, 성숙된 IGF-I 단백질의 적어도 한 부분을 포함하는 성숙한 IGF- I, IGF-1 전구체로 전기 단백질의 생합성의 mRNA 차에서 성숙된 IGF- I 단백질의 적어도 일부분을 함유하는 다른 단백질로 제한되는 것은 아니다.
비록 더 바람직한 요지는 IGF-I 유전자 제품의 cDNA 분석을 사용했다. 대신에 IGF-I 특수 mRNAs를 확인하는 기술로 알려진 방법론과 관련하여 노던브롯트 분석(Northern blotanalysis)법에 의하여 세포 mRNA를 조사할 수 있다. 토마스 페.에스 참조(1980).
아래와 같이 좀 더 충분히 묘사해 본다면, IGF- I 특수 DNA 서열을 포함한 클론은 그것에 있어서 포함한 IGF-I 특수 cDNA 삽입물의 크기 및 영역을 결정하도록 여러가지 제한효소(restiction endonucleases)로 처리하여 단리하고 절개한다. 다른 제한효소를 사용할 수도 있다. 마니아티스등(1982)을 참조하시오.
그런 방법에 의해서 크기에서 약 800개에서 1150개의 뉴클레오타이드 상의 범위를 갖는 I-GF-IcDNA 삽입물은 확인되고 분리될 수 있다.
이런 DNA 삽입물의 후속되는 제한 지도는 뜻밖에도 IGF-1A cDNA(IGF-1A)와 IGF-1B cDNA(IGF-1B)가 별개로 두가지 형으로 되어 있는 분리된 삽입물을 절개하였다.
신규한 ppIGF- I 단백질 암호된 서열의 발전은 신규한 IGF- I 유전자 서열, 합성생산, 본질적으로 순수, 신규한 ppIGF- I 단백질을 확인하고 분리하는 수단을 제공하는데 중요하고, 성숙된 IGF- I 생합성을 연구하고 바람직한 생물학적인 역가 및/또는 효과를 성취하도록 가능한한 복제되는 수단을 제공하는 것이다.
이 두개의 cDNAs의 DNA 서열 분석이 이루어졌고, 개개의 서열은 제5도에서 볼 수 있는 바와 같이 비교되었다.
사전에 토론된 바와 같이 IGF-1B cDNA는 신규하고 진규한 것이며, ppIGF-B라고 하는 ppIGF-1 단백질로 암호된 합성 IGF- IDNA 서열이다. IGF-1A cDNA는 잔센등(1983)에 의하여 분리된 cDNA 서열과 동일한 것으로 확인되었다. 특히 본 발명의 방법에 의해서 분리된 두개의 IGF-I cDNA's(-1A와 -1B)는 부수적으로 오늘날 그것에 의하여 암호된 전구체 단백질(들) ppIGF-I의 모든 가능한 번역개시의 정확한 확인이 될 수 있는 5'-말단 서열을 포함한다.
특히, 제2도에서 보는 바와 같이, 4개의 가능한 번역 개시 신호 암호(ATG'S), 성숙한 IGF-I으로 암호된 DNA 서열을 가진 인-프레임(in-frame)이 동정되었다. 첫번째 ATG 암호는 뉴클레오타이드 84에서 시작되고 두번째는 183에서, 세번째는 252에서, 네번째는 261에서 시작되었다. 제2도에서 볼 수 있는 바와 같이 또한 본 발명의 신규한 5'-IGF-1B, DNA 서열은(5'에서) 및 ppIGF-I 단백질을 위하여 첫째로 조작 가능한 번역 개시 신호 암호(ATG)를 갖는 뉴클레오타이드 183 내지 185를 암시하는 것에 의해서 뉴클오레오타이드 183에서 시작하는 2번째 ATG 암호를 가진 인-푸레임(in-frame)으로부터 거슬러 올라가는 두개의 인-푸레임 번역말단 암호(###와 * * *로 표시됨)의 존재를 제시하였다.
실제로, 더 충분하게는 하기 실시예에서 보이고 있는 바와 같이, 뉴클레오타이드 183 내지 185, 사실상, 두개의 IGF-1A와 -1B 합성 DNA 서열로 암호된 ppIGF-I 단백질을 위해서 한개의 조작 가능한 번역개시 신호 암호(ATG)를 갖는다.
이와 같은 발견은 두가지 즉 특정한 번역 개시 신호 암호와 번역 말단 암호를 주어진 유전자내에서 또는주어진 단백질 아미노산 서열전의 합성 DNA 서열내에서 확인할 수 있고 또는 단백질은 암호하여 추론할수 있고 및/또는 결과적으로 거기서 생산할 수 있어 중요하다. 본 발명에 의해서 만들어지는 IGF- I 유전자와 합성 DNA 서열은 새로히 발견된 ppIGF-I 단백질(ppIGF-1B)로 암호와 IGF-B와 잔센등(1983)에 의하여 만들어진 1GF-I 전구체 단백질 두가지에 대하여 조작 가능한 번역 개시 신호 암호의 첫번째 표시이다.
나아가, ppIGF-I 단백질(들)에 대한 번역 개시의 확인은 관례적인 방법인 화학, 효소 및/또는 제조합 DNA 방법에 의해 합성 ppIGF-I 단백질(들)을 량적, 질적 생산이 가능하다.
실제, 하기 실시예에서 묘사된 바와 같이 본 발명의 ppIGF- I 단백질은 ppIGF- I cDNAs의 발현을 일으켜 효과적으로 생산되고, 생체의 세포 라이세이트 발현시스템(Cell lysate expression system)내에서 확인되고 분리되었다. 별도로, ppIGF-1A와 -1B 단백질 및/또는 단편(fragments)은 재조합 DNA(rDNA) 기술에 의해서 생산될 수 있다. 재조합 DNA 생산 방법은, 종래의 기술에 의해서, 클로닝을 포함할 수 있는데, 세포(박테리아,효모,포유동물 및/또는 식물) 발현 벡터(Vectors)내에서 적어도 단백 암호서열(예를 들면, 적어도 뉴클레오타이트 183 내지 767, 제2도, IGF-1B) 기술분야에서 사용이 가능하고, 선택된 숙주 세포내에서 ppIGF- I 단백질을 최종생산(예를 들면, ppIGF-1DNA 암호서열)할 수 있다.
그렇게 생산된 단백질은 종래의 기술로 단리한다. 여기에서 종래의 방법이란 화학적 합성 방법에 제한된것은 아니며, DNA 서열 정보와 IGF-1A와 IGF-1B cDNAs 전체 또는 부분을 포함한 합성 DNA 서열은 본질의 순수한 성숙한, IGF- I,ppIGF- I (예를 들면, ppIGF-1B 및/또는 확장펩타이드)를 산생하는데 이용될 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 DNA 서열과 유전자는 고도의 효과적인 연구 및/또는 성숙된 IGF-I 생합성 복제와 생물학적인 규칙등의 기술 분야에 응용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 IGF- I 유전자 또는 DNA 서열의 전체 또는 부분은 DNA 및/또는 RNA 서열이 존재하는 충분한 동족체라는 점에서 인체내 및 다른 종(예를 들면, 소,돼지, 및/또는 새)에서 DNA 분자,RNA 분자, 유전자(들) 및 또는 알레릭 변형체를 확인하는데 사용된다.
실제로, 본 발명에 의해서 포용된 RNA 분자의 한 예는 IGF-1B cDNA 및/또는 신규의 확장 펩타이드로 암호된 합성 DNA를 갖고 잡종화(hybridigation)에 의하여 확인될 수 있는 1.7,3.7 및 6.3Kb(Kilobase) 포리아데닐화된 IGF- I RNAs를 포함한다.
동촉체의 정도는 이와 같은 DNA 및 또는 RNA 서열 또는 이 기술 분야에서 잘 알려진 분자를 확인하는데 필요하며, 예를 들면, 이용되는 잡종화(hybridigation) 조건의 스트린전시(stringency) 및/또는 유전자또는 헥산서열의 관계 크기에 의존되며 소식자를 이용한다.
여기에서 제공된 유전자와 DNA 서열의 알레릭 변형체(allelic vadations)에 관해서, 잔센등(1983)의 (IGF-1A) cDNA는 413 뉴클레오타이드류를 위한 신규한 IGF-1B를 가진 확인(예를 들면 정확한 동족체)를 유지하기 위해서 동정됐는뎨, 잔센등(1983) cDNA 서열에서 하나의 뉴클레오타이드 상이점을 제외하고, 글리이신 암호(IGF-1B 서열의 뉴클레오타이드 452)내에서 보존적인 세번째 부위 변화에 차이가 있다. 주어진 암호내에서 이와 같은 부분 변화는 알레릭 변형체(Allelic Variations)로부터 및/또는 증폭의 결과이다.
본 발명의 IGF-1B DNA 서열내에서 일어나는 이와 같은 알레릭 변형체는 여기에서 제공되는 IGF- I유전자와 DNA 서열의 동등물을 표현하기 위하여 고찰되었다.
제 5도에서 볼 수 있는 바와 같이,459 뉴클레오타이드를 확인한 후 그다음 IGF-1A와 IGF-1B DNA로 갈린다.
특히, 제2도에서 보는 바와 같이 단백질 서열면에서 분석할 때, 분기점을 성숙된 IGF-I 영역 다음 라이신잔류 16개의 아미노산 다음이다. 좀 더 상세히 아래에 묘사했으며 분기점을 제3도에서 보여주는 바와같이 IGF-I 유전자 구조내에 나타난 액손-인트론 집합(exon-intron Junction)에 따른다. IGF-1A DNA 서열은 부가적인 19개 아미노산으로 IGF-1A와 1B 분기점을 지나 암호화하여 길이로 153개 아미노산 길이의 ppIGF- I 단백질로 암호화하며, 이하 ppIGF-1A라 부른다. IGF-1B DNA 서열은 부가적인 61개 아미노산의 IGF-1A와 113분기점을 지나 암호화하며 길이로 약 195개 아미노산만큼 큰 ppIGF-1 단백질을 암호화하여, 이하 ppIGF-1B라 부른다. 두개의 카르복실-말단 확장은 본질로 IGF-1A의 19개 아미노산과 IGF-1B의 61개 아미노산으로 구성되어 있으며, 각기 서로 아미노산 동촉체는 아님을 보인다.
부가적으로, 카르복실, 말단 확장 펩타이드 또한 국립생의학 연구 조사 단백질 서열 데이타 뱅크내에서 어느 다른 단백질을 갖는 동촉체를 보인다. 데이호프등(1983)과 월버 및 리프만(1983), mRNA 분자에 연관되어 생체내에서 후속되는 확인에 의해서 다양화된 두개의 진귀한 ppIGF-I cDNAs의 발견 존재를 짝지은 이들 차이점은(하기 실시예에서 참조하시오) 본 발명에서 제공된 합성 ppIGF-1B DNA 서열은 신귀하고 진귀한 ppIGF-I 단백질(ppIGF-1B)와 확장 펩타이드(들)을 암호한 신규한 ppIGF-I cDNA를나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에서의 중요한 점의 하나는, 신규한 인간 IGF-I 유전자가 확인되었고 분리되었다. 유전자는 달라서 벨등에 의해서(1985) 확인되었고, 본 발명의 IGF-1 유전자는 5개의 엑손을 포함하고 적어도 2개의 ppIGF- I 단백질로 암호화한다.
유전자의 구조가 신규한 IGF-I 유전자의 DNA 서열은 별도로 제3도와 제4도에서 볼 수 있다. 한편 제3도에서 보이는 엑손 1,2,3 및 5는 구조적으로 벨등(1985)에 의해서 확인되었으며, 이를 엑손의 완전한 DNA 서열은 제공되지 못했다. 이 서열은 IGF- I 유전자에서 암호된 가능한 ppIGF- I 단백질(들)의 아미노산 조성(들)과 수의 결정을 위해서 필수적이다.
나아가, 서열 정보는 유전자 또는 생체내의 단백질 생산조직에서 그것의(예를 들면 특히 엑손 또는 인트론-엑손 조합) 부분을 후속 이용하는데 필연적이다.
합성 ppIGF- I 단백질의 목적은, IGF- I 유전자는 단백질 및 성숙한 IGF- I 단백질과 관련된다. 예를 들면 포유동물중에서 본질적으로 순수한 IGF- I 유전자 또는 그들의 부분(예를 들면 엑손)을 이용하는것이 바람직한 것이다.
특히, 인트론 및 엑손 영역으로 구성된 IGF- I 특수 DNA 서열을 이용하는 것이 바람직한 것이다.
대신, 여기서 제공된 IGF-1 유전자로부터 유도된 본질적인 인트론-후리 DNA 서열의 사용은 ppIGF- I 단백질 또는 확장 펩타이드를 생산하는데 바람직하게 이용된다. IGF- I 유전자 서열 이내에서본 발명의 신귀한 DNA 서열의 위치에 관하여 이들의 이유와 목적을 위해서, 분리하였고 IGF-I 유전자서열을 크론화하였다.
본 발명에서의 더 바람직한 요지는, 두개의 게놈성 라이브러리(library)는 IGF-1A와 1B cDNA 또는 단편을 사용한 IGF- I 유전자 삽입물을 위하여 조사하였다.
좀더 충분하도록 하기와 같이 묘사되었고, 제3도와 제4도에서 보였다. 우리는 5개의 엑손을 확인했으며 다만 4개가 전에 보고된 바 있다.
벨등(1985) 참조. 새로히 발견된 엑손 4(제3도와 제4도 참조)는 엑손 5가 ppIGF-1A의 카르복실-말단 확장으로 암호한 것에 대하여 ppIGF-1B의 카르복실-말단 확장으로 암호한 것으로 확인되었다.
엑손 1은 적어도 21개 이상의 아미노산으로 암호화했으며 IGF- I 의 분비 능력을 준 리더 펩타이드로 구성된다. IGF-I은 IGF-I 전구체 단백질을 표시하기 위하여 지금부터 "Preproinsulin-like growth factor-1" ppIGF-1)을 산생하는 세포에 의해서 분비되는 것이라고 알려져 있다.
엑손 2는 약 157개의 뉴클레오타이드 길이를 갖으며 52개의 아미노산으로 암호화되었고 울리히동(1984)에 의해서 보고된 IGF- I 엑손에 DNA 서열에서 확인되었다. 엑손 2에서 암호되고 최초 27번째 아미노산 잔재는 성숙한 IGF-1B 영역의 출발로 전제되며, 부가적인 번역 출발신호로서 나타낸 두개의 메티오닌 잔재를 포함한다. 엑손 2 역시 성숙한 IGF-I의 B영역의 시작 25번째 아미노산으로 암호화한다. 암호(Codon) 26은 적어도 21Kb의 큰 인트론에 의해서 방해되는 것이 알려졌다. 특히 엑손 3은 B영역의 나머지로 암호화된 11개의 뉴클레오타이드를 혼합하며, C영역으로 암호된 12개의 코돈, A영역으로 암호된 21개의 코톤, D영역으로 암호된 8개의 코톤을 포함한다. 부가적으로 엑손 3은 16개의 부가적인 아미노산으로암호화되었으며 새로히 묘사된 E영역 및/또는 PPIGF-1A와 pIGF-1B의 카르복실-말단 확장의 부분을나타낸다. 이와 같이 본 발명의 "카르복실-말단 확장 단백질" 또는 "확장 펩타이드류(extension peptides)"는 엑손-3(예를 들면 NH2-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys-COOH)으로 암호된 마지막 16개의 아미노산 과 엑손 4로 암호된 펩타이드, 엑손 4로 암호된 펩타이드 및/또는 엑손 4와 엑손 3의 마지막 48개 뉴클레오타이드류 이내에서 발견되는 DNA 서열에서 암호된 아미노산 다른 시리즈의 조합으로 구성되어 있다.
엑손 4와 엑손 5는 진귀한 확장 펩타이드류, 번역 말단 암호, 3', 미번역 영역, 포리 A부가(예를들면,아데닐화)신호와 부위가 각기 암호화되었음을 알 수 있다. 엑손 4는 엑손 3에서 3', 1.5Kb에 위치하며 515개의 뉴클레오타이드로 구성되고, IGF-1B암호 서열의 3'-말단(예를들면 카르복실만단)을 구성한다. 확장 펩타이드는 여러개의 이 염기성 및 삼염기성 잔재를 갖는 매우 높은 알카리 61 아미노산 펩타이드로 구성된 엑손 4에서 암호되었다. 전구체 단백질 중간체(예를들면 인슐린으로 변형할 수 있는 푸로인슐린)를 사용하는 다른 생합성 방법으로 동촉체에 기초를 두고, 이와 같은 이 염기성 및 삼염기성 잔재는 유전자 또는 본발명의 유전자내 예를들면 성숙한 IGF-1 단백질로 암호된 ppIGF-I 단백질(들)의 효소 공정으로 제공된다.
부가적으로 또는 별도로 이들 잔재는 DNA와 같이 이와 같은 음성하전을 된 고분자의 결합을 용이하게한다. 다음 엑손 4중에서 TGA말단 암호는 3'미번역된 DNA의 327개의 염기이다. 엑손 3으로부터 아래쪽으로 (3')17Kb에 위치된 엑손 5는 344개의 염기 길이를 갖으며, IGF-1A암호 서열의 3'-말단으로 암호되고 TAG번역 말단 번호와 3'미번역 DNA의 284개 염기를 포함한다. 부가적으로, 모든 인트론-엑손 경계부분에는 공통 염기 연결서열 지시들로 합하여 엑손의 어느 조합은 mRNA분자 내에 존재하고 IGF-I유전자 관련 단백질로 번역된다.
여기서 제공된 유전자 및 DNA서열은 생체외에서 재조합 DNA와 화학합성, 검출과 같은 기술에 의해서, 생체내에서 단백질로 암호된 단일 엑손으로 구성된 단백질 및/또는 단백질로 암호된 엑손의 조합에 의해서 산생된다. 이와 같은 단백질은 생물학적인 활성 및 특히 IGF-I-양 활성을 갖은 것으로 믿어진다. 그것만으로, 부수적인 생물학적인 활성은 생체의 및/또는 생체내 분석을 이용하여 해당 분야에서 알려진 기술에 의하여 확인될 수 있다. 독그하디(1977) : 클래몸스 앤드 반워크(1981) : 반 불 오퍼스 앤드 반드브란데(1980) : 쇼넬등(1982) : 힐카등(1985).
나아가 분리, 제한지도와 IGF-1유전자 구조의 확정과 서열은, 예를들면 염색체 제한 효소 분석에 의해서 검출해낼 수 있는 DNA다형 현상의 위치를 알아낼 수 있는 기회를 주는 것으로 중요하다. 실제 우리는 게놈성 IGF-I 유전자의 엑손 5에서 지도되어 있거나 서로 연결되어 있다고 벨등(1985)에 의해서 보고된 제한 효소 힌드(Hind)Ⅲ와 피브(PVU) II에 대해 다형현상위치를 알아내었다. 이와 같은 다형현상은 가족성 유전관계를 알아내고 여러 질병을 진단하는데 이용될 수 있다.
부가적으로, 이와 같은 IGF-I 유전자 다형 현상은 성장 영양 조건을 진단하는데 이용된다. 나아가, 이와 같은 다형 현상은 여기에서 제공된 유전자 서열의 동등물을 만드는 것으로 생각된다
본 발명은 더우기 본 발명의 본래의 순수한 IGF-I유전자 또는 그들의 부분(예를들면 엑손)이 다시 생기는데 이용되거나 및/또는 생체내에서 증강되는 ppIGF-I 단백질에 제한되지 않고 성숙된 IGF-I단백질, 그들의 변행물 및/또는 그들의 생합성 중간체를 포함하는 IGF-I 유전자 관계 단백질을 이용되는 것이 예상된다.
[단백질]
본 발명의 한요지는 제6도에서 보여준 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 신규 ppIGF-I 단백질(ppIGF-1B)을 가리킨다. 여기서 제공된 서열에 기초를 두고 이 단백질과 그들의 동등물은 화학 합성, 생체의 효소합성, rDNA 기술 및/또는 인간 조직으로부터의 분리와 같은 보통의 방법에 의해서 제조될 수 있다. r-DNA 및/또는 아미노산 조성에서 소수변형을 가져오는 화학적합성에 의해서 본 발명의 단백질이나 팹타이드의 산생이 예견된다. 예를들면 박테리아 산생은 아미노(NH2-말단에서 메티오닌의 부가로 일어나며 화학 합성은 카르복시(-COOH)말단의 변형 즉 -COOR,-CRO,-CONHNR,-ConR1R2또는 -CH2OR(R1과 R2는 각각 저급알킬 또는 수소이다) 기들에 기술을 두고 일어난다.
이런 본질적으로 순수한 및/또는 합성 단백질은 본 발명의 범위내라고 여겨진다.
나아가, 본 발명에 의해 제공되는 신규한 DNA서열 및 유전자는 확인, 분리 및/또는 ppIGF-I 단백질을 생산 및/또는 제한없이 성숙된 IGF-I 및 확장 펩타이드를 포함한 그를의 생물학적 활성 단편을 생산하는데 이용할 수 있다.
이들 단백질의 생물학적인 활성은 제한없이 성숙된 IGF-I의 성장촉진 활성을 포함하여 그러므로 해당분야에서 잘 알려진 생체내의 분석에 따라 조사될 수 있다.
특히, IGF-I은 세포증식, 골격성장, 체중증가와 포유 동물 전 성장을 촉진하는 것을 보여 주었으며, 후자는 증강된 (보강된)우유 생산을 위하여 선행 조건이다.
신규한 ppIGF-1B단백질은 여기서 이와 같은 성장 촉진 활력의 전체 또는 대부분을 보이는 것으로 나타내었고 선택된 조직에서는 증강된 활력을 보여줄 수 있음을 기대하였다.
또한 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 단편은 보통의 방법으로 만들어질 수 있음을 예견하였다. 이 단편은 하기에는 때때로 "IGF-I gene related proteins"이라고 칭하였으며, 적어도 전기 단백질의 부분은 유전자 및/또는 본 발명의 합성 DNA서열 및/또는 그들의 알레릭 변형물(Allelic variations)으로 암호화된 단백질로 구성되었다고 알려져 있다.
하나의 접근된 힘은, ppIGF-1C(예를들면 ppIGF-1A 및 ppIGF-1B)단백질의 아미노산 서열 및 그들의 확장 펩타이드는 그들의 개개의 cDNA의 DNA서열로부터 및 본 발명에 의해 제공된 신규한 IGF-I유전자로부터 추론될 수 있다.
예를들면 ppIGF-1B단백질은 제6도에서 보여준 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것으로 확인되었다.
또 하나의 접근된 점을 ppIGF-I 단백질은 IGF-1A와 -1B cDNAs의 발현으로 제공된 생체의 조직에서 사용되므로서 확인되었다.
여기서 유전자 또는 합성 DNA서열에 관하여 사용할 때 "발현(expression)"이란 용어는 주어진 유전자또는 DNA서열을 mRNA로 전사하고 mRNA를 단백질로 번역하는 것을 뜻한다.
그 다음 그렇게 생산된 단백질은 포리아크릴아미드겔 전기 영동법, 친화성 크로마토그라피, 이온교환, 역상 HPLC, 면역 침전 또는 다른 보통 분획기술로 분리하고 그 다음 서열화한다.
이와 같은 방법에 의해서, 195번째 아미노산 ppIGF-1B단백질과 153번째 아미노산 ppIGF-1A 단백질을 생체외에서 산생될 수 있음을 확인하였고, 이들 단백질은 여기에서 확인된 그들의 개개 cDNA서열에서 추론된 그들의 개개의 아미노산 서열에 따르며, 첫번째 인-후레임 메티오닌 암호(예를들면 염기쌍 183-185IGF-1B(제2도 참조)는 두 ppIGF-I 단백질의 메이져 번역 개시 신호 암호(major translation start-signal codon) 이다.
단백질(예를들면 ppIGF-1A와 ppIGF-1B)이 합성 IGF-1A와 -1B DNA서열 및/또는 그들의 말단 확장으로 암호된 것을 확인하기 위하여, 진귀하고, 분리된 펩타이드로서 및/또는 생체내에서 분리 부분 및 진귀한 단백질로서 산생되었음을 확인하기 위해 다음과 같이 행하였다.
방사성 표시된 완전한 IGF-1A cDNA 또는 완전한 IGF-1B cDNA 및 엑손 4나 엑손 5중의 하나를 포함한 암호된 서열에 따른 방사성 표시된 DNA를 개별적으로 인체간에서 생산된 RNA전자(mRNA)와 잡종화하였다.
이 방법에 따라, 우리는 포리아데닐화한 RNA 분자는 앞에서 말한 소식자 전부와 잡종화되어 길이가 약900개에서 약 1350개까지의 뉴클레오타이드의 범위임이 확인되었다.
이와 같은 결과는 생체내에서 두개의 IGF-1A와 -1B DNA서열로 암호된 DNA의 활성전사로 확인되었다. 나아가 우리는 세개의 부수적인 포리 아데닐화된 RNAs(mRNAS) 대략 1.7,3.7 및 6.3 Kilobases(Kb)의 개별적인 길이를 갖음을 확인하였다.
한편 출원인은 메카니즘으로 다음의 이론에 속박받는 것을 바라지 않으며, 우리는 거대한 mRNAs는 ppIGF-I 전구체 mRNAs 또는 IGF-I 유전자 관련 단백질(예를들면 본질의 순수한 ppIGF-I의 서열 및/또는 본질의 순수한 확장 펩타이드의 본질적으로 구성된 단백질)의 형태를 갖는 것으로 믿는다.
부가적으로, 우리는 본 발명의 인간 IGF-I 유전자는 동화한 다수단백질이 IGF-I생합성 및/또는 성숙도가 조절된 방법 및/또는 IGF-I 유전자 관련 단백질이 조절된 방법 및/또는 합성된 방법으로 나타나는 것을 발견하였다.
특히, IGF-I는 리니어 성장(linea growth)을 보충하기 위하여 기본적으로 필요한 것과 같이, 유전자 발현의 레블은 성장 및 발전하는 동안 여러가지로 변형되고 및/또는 전기조직의 성장 요구에 의존하여 다른조직에서 여러가지로 변형될 것이다.
ppIGF-I단백질은 성숙한 IGF-I단백질을 위한 조절 영역 및/또는 이들 성장 단계에 있는 동안 IGF-I유전자 관련 단백질 및/또는 조직에서 특수한 방법으로 제공될 것이다.
생체내에서 합성된 ppIGF-I cDNAs와 상응하는 mRNA의 확인 및 분리는 본 발명의 ppIGF-I단백질이 생체내에서 만들어진 것을 의미한다. 비록 수율면에서 낮은 것이 예상되나, 상업적으로 바람직한 수율이며,여기서 제공되는 DNA와 아미노산 서열에 기초를 둔 것으로 예상되며, 본질적으로 순수한 ppIGF-I 단백질은 조직(예를들면 피브로 브라스트 혈액, 간등) 및/또는 그들의 세포로부터 분리된 것이다. 이런 본질적인 순수한 단백질은 본 발명의 부분이 되는 것으로 생각된다.
E영역을 포함하는 쥐의 IGF-II 단백질의 최근 확인 및 쥐혈청에서 E영역을 갖는 활성 후리 펩타이드의 분리는, 줌스테인등(1985)과 힐카등(1985)생체내에서 만들어질 생물학적인 활성 펩타이드와 관련된 IGF유전자계 또는 단백질을 암시한다.
이와 같은 단백질은 여기서 공개된 신규한 IGF-1B카르복실-말단 확장 펩타이드에 제한없이 포함될 것이다. 또한 IGF-I유전자 엑손의 여러 조합으로 구성된 단백질에는 IGF- 유전자 관련 단백질의 계가 포함될 것이다. 에를들면 pIGF-1A 및 /또는 -1B의 카르복실-말단 확장 펩타이드는 특수히 조직의 제한, 생물학적 기능을 맡고 있다. 대신하여, 발현된 카르복실-말단 펩타이드의 기능은, 에를들면 합성 펩타이드및 항생제까지 사용함으로 기술분야에서 잘 알려진 방법으로 시험될 것이다.
대신하여, RNA스프라이싱(splicing)은, 로젠 훼드등(1983)에 의하여, 상이한 조직에서 엑손 기능의 상이한 조합으로, 다른 유전자를 암시해왔던 IGF-I유전자 발현에 대한 조절점을 제공한 것이다. 이런 가능한 엑손 조합은 본 발명에 의해서 깨닫게 될 것으로 고려된다.
본 발명은 또한 여기에서 제공되는 유전자 및 DNA서열은 전기 IGF-l 유전자 관련 단백질의 분리시에 이루어지거나 및/또는 도움을 주거나 이용될 것으로 예견된다.
한편, 본 발명이 유전자 및 DNA 서열로 암호된 특수한 ppIGF-1B 아미노산 서열을 표시하는 반면, 변경 개열 리딩 후레임(alternative open reading frames) 및 변경 단백질(예를들면 아미노산 서열)이 여기서 제공된 유전자 및 DNA 서열로 암호화되는 것이 예시되었다.
이런 단백질은 여기에서 제공된 신규한 유전자와 DNA서열에 의해서 제공된 IGF-I 유전자 관련 단백질가운데 있다고 여기에서 사료된다.
전에 토의된 바와 같이, 본 발명의 신규 ppIGF-I과 확장 펩타이드는 성장 촉진을 위해서, 우유 생산을 증가시키기 위해서 및/또는 야위고 비대한 비율 또는 동물에 있어서 근육량을 증가시키기 위해서 투여되어 사용할 수 있다. 이와 같은 용도의 목적으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 펩타이드(또는 그들의 비독성염)는 소화관 내에서 분해되는 것으로부터 단백질이나 펩타이드를 방어하기 위한 형태로 적당한 기술에 의해서 예를들면 정맥내, 피하내, 근육내, 비강내, 또는 경구로 동물에 투여될 수 있는 조성물 형태로 비독성이여, 물리학적인 허용가능한 매체(액체 또는 고체)와 조합할 수 있다.
이런 조성물은 주사나 용액이나 이식에 의해서 동물에 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 매체(예를들면 기름중에 또는 중합체중에 분산)중에서, 바람직한 속도로 동물의 목표세포(target cells)에 펩타이드를 자극적으로 이용하는 것이다. 동물(예를들면 임신한 암소와 어린암소)에 투여를 하기 위한 방법중의 하나는 계류중인 미국특허출원, 출원인 1986.3.7. 출원번호 제837477호에 좀더 상세히 지시된 바와 같이 유방 조직내에 적당히 분산될 수 있도록 적당한 매체로 단백질 또는 펩타이드를 유방내 주입하는 것이다. 전기 출원공개내용을 여기서는 참조로 통합하였다.
이와 같은 조성물에 있어서 매체와 생물학적인 활성 펩타이드의 비율은 동물에 있어서 바람직한 효과를 촉진하게 할 수 있다. 바람직한 비율은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 즉시 확인될 수 있다.
바람직한 용량은 특별한 결과를 요구하거나 바람직한 치료의 지속함에 여러가지가 될 것이다. ppIGF-1B단백질 및/또는 확장 펩타이드의 유효량은 약 1주일에서 3주일간의 치료 기간동안 매일 투여로 동물체중 키로그람(Kg)당 약 60미크로 그람(μg)에서 약 6미리그람(mg)까지이다. 더욱 바람직한 용량은 1일 kg당 약 400μg에서 약 800μg까지이다.
여기서 사용된 것으로 치료 효과를 갖은 농도는 바람직한 세포 성장 및/또는 기능을 만족할만하게 촉진시킬 수 있는 특별한 단백질 또는 펩타이드의 농도로서 정하여진다. 바람직한 결과(예를들면 우유생산 증가)를 성취하기 위하여 가장 바람직한 량 또는 가장 효과를 낼 수 있는 용량은 일상적인 경험에 의해서 결정될수 있다. 바람직한 용량은 특정 동물의 크기, 일반적인 건강 상태 영양 상태에 따라 다양할 것이다.
본 발명의 생활성 펩타이드는 본질의 순수한 형태 즉 본 발명의 단백질 또는 펩타이드(들)의 역가에 중요한 효과를 갖은 다른 단백질 또는 펩타이드(무엇이든지 원형)에서 후리인 것을 사용할 수 있다. 이는 필수적인 것은 아니나 본 발명의 많은 이용 가능한 단백질 또는 펩타이드는 단백질 또는 펩타이드와는 상이한 예를들면 소(또는 다른 동물)와 같은 다른 동물성장 인자 IGF-I, EGF 또는 TGF-α(알파-형질전환 성장인자)를 갖는 혼합물 또는 다른 조합물에서 만족할만하게(많은 경우에 있어서, 유리하도록)사용될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 요지의 예시이며 어쨌든 발명의 한계를 제한하기 위한 것은 아니다.
한편 본 발명에서는 바람직한 요지의 용어로 묘사하였으며 그들의 여러가지 수식어와 변형체는 이 출원을 해석함에 있어 기술 분야에서 잘 알려진 것으로 나타내었다.
제한효소, T4DNA리가제, T4폴리뉴클레오타이드 키나체, T4포리머라제, 리보누크레아제 A, DNA수식효소, 휘트검라이세이트, 토끼 레리큐로싸이트라이세이트, 표시되지 않은 아미노산과 푸로테인나제 K를 포함한 모든 효소는 뉴잉글랜드 바이오랩스(베버리, 메사추세츠)와 베터스다 리서치 라보라토리즈(BRL)에서구입되었으며 제조자의 규격에 따라 사용되었다. 나이트로 셀루로즈(Nitrocellulose)필터는 샤이처 앤드 슈엘(키네, 뉴햄프셔) 와 밀리포(베드포드, 메사츄세츠) 로부터 얻었다.
라디오뉴클라이드(radio nuclides)와 라디오라벨(radio labelled)된 아미노산은 뉴잉글랜드뉴크리오(보스톤 메사츄세츠)와 아메삼(알링톤 하이츠, 일리노이즈)에서 구입하였다.
데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트와 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 팜마시아-피엘 바이오 케미칼(피스카타웨이, 뉴져지)에서 구입되었다. 성숙된 인간 1GF-I(잔센등 1983, 울리히등 1984)의 아미노산 10개 내지 23개로 암호된 DNA서열에 따른 42염기 올리고 뉴클레오타이드는 제조자에 의하여 출발되는 공정에 따라 어프라이드 바이오시스템 DNA합성 장치를 이용한 몬산토사(샌트루이스 미조리) 생물과학부에서 합성되었다.
어프라이드 바이오시스템 잉크(포스터시티, 켈리포니아).42머(mer)의 서열은 다음과 같다.
5' - AAAGCCCCTGTCTCCACACACGAA CTG -
AAGAGCATCCACCAG - 3'
42머(mer)는 피코몰(picomole)당 약 107dmp의 고유활성도를 갖기 위하여, 마니아티스등에 의해 출발되는 공정에 따라 32P아데노신 트리포스페이트와 T4포리뉴클레오타이드 키나제에 감마를 사용하여 5'말단에 표지하였다. 다음 방사성으로 표지된 42머(mer)는 크옥크등(1985)와 구블러와 호프망(1983)에 의해 출발되는 공정에 따라 제조된 인체간 cDNA라이브러리에서 DNA서열을 포함한 IGF-I조사에 사용된다. lambda gtll내에서 인체간 cDNA라이브러리는 에스.엘.씨.우와 리.칸드라(베일러 의학대학, 휴스톤, 텍사스)에서 얻었다. lambda gtll은 또한 수탁번호 제37,194호로 아메리칸 타이프 컬쳐 콜렉숀(ATCC)(록크빌, 메리랜드)에서 얻을 수 있고 인간 cDNA간 라이브러리는 여기에서는 크옥크 에스.씨.엠등(1985)에 의해서 알려진 방법에 따라 제조된다.
대장균 K12균주 Y 1088은 ATCC수탁번호 제37195호로서 ATCC에서 얻을 수 있으여 프라스미드 PGEM1과 PGEM2는 푸로메가 바이오텍크(매디슨, 위스콘신)에서 얻어진다.
[실시예 1]
다음 실시예는 인체 간 cDNA라이브러리에서 1GF-1A와 1GF-1B cDNA를 분리함으로서 시작된다.
간단히, lambda gtll중 인체간 cDNA라이브러리는 다음과 같이 스크린되었다. lambda gtll는 영과 데이비스(1983)가 기술한 방법에 따라 대장균 K12균주 Y 1088에 도포(plate)하였다. 복제·나이트로셀루로오즈 필터는 우.에스.엘.씨(1979)에 의해 알려진 방법에 따라 제조되었고, 5×SSC(1×SSC=150mM 염화나트륨, 15mM 구연산나트륨 pH 7.0), 50mM 인산나트륨, pH 6.8 40%(v/v)탈이온화한 포름아마이드, 50마이크로그람/미리리터 변성된 새몬 스핌 DNA, 5×덴하르드트 용액 [0.1%(w/v) 피콜(ficoll),0.1%(w/v)소알부민, 0.1%(w/v)포리비닐피롤리돈, 매니아티스등(1982)를 포함한 완충액 중에서 필터당 2×106dpm프로우드를 사용하여 약 20시간 동안 42℃에서 잡종화한다.
잡종화한 후 필터를 22℃에서 15분간 그리고 0.2×SSC,0.1%(w/v)소디움도데실설페이트(SDS)를 포함한 용액중에서 40℃에서 15분간 세척한 후 코닥×AR5필름(이스트만 코닥사, 로체스타, 뉴욕)으로 증감스크린을 사용하여 감광시켰다. 양성 플라그(positive plagues)는 낮은 밀도에서 rescreen되었다. 특히, 첫번째 스크리닝은 137미리리터 필더당 약 2.5×104플라그를 사용했고, 두번째 스크리닝에서는 87미리리터 필터당 약 1-2×102플라그를 사용했다. 다음양성 프라그로부터 DNA 파지를 헤름스등(1985)에 의해서 알려진 방법으로 제조하였고 제한효소소화와 겔전기영동법 마니아티스등(1982)에 의해 지도화되었고 하여 서열화되었다.
인체의 간 cDNA라이브러리의 대략 5×105플라그는 약 800에서 약 1150뉴클레오타이드쌍의 범위의 DNA인서트(inserts)를 갖은 7개의 양성 플라그의 분리를유도할 수 있는 특수 42머(mer)소식자를 갖는 것으로 기술된 바와 같이 스크린 되었다. ECORI, BamHI와 PstI를 갖는 제한지도에 의하여 cDNA'S는 2가지 형이 있음이 알려졌다. 대략 800 내지 850개의 뉴클레오타아드 쌍의 인서트(inserts)를 포함한 7개의 양성 플라그중에서 2개는 내부 BamHI제한효소부위를 포함하여 잔센등(1985)에 의해 보고된 IGF-I cDNA에 따르고 있음이 확인되었다. 나머지 5개의 양성클론은 IGF-1A cDNA의 지도와는 다른 제한 효소지도를 갖으며, 이 5개의 클론은 IGF-1B cDNA로 묘사된다. 그 다음 제1도에서 λIGF-2와 λIGF-5로 표시된 가창 큰 2개의 인서트(inserts)가 DNA서열분석을 위해 선택되었다.
DNA 서열화는 놀란더 등(1983)에 의하여 기술된 M13mp18과 M13mp19로 제한단편을 서브크로닝한 후생거등(1977)과 비킨등(1983)에 의하여 알려진 디데옥시사슬터미네이팅 방법에 의해서 이루어진다. 서열전략은 제1도에 나타나 있다. 두개의 IGF-1B cDNA분리물의 DNA서열은 두개의 사슬(strands)로 그들의 전체에서 확인되었고 교차전체 제한효소부위가 다만 한번 배향에서 3배로 서열되는 한개의 크론 IGF-5(제3도 참조)의 극히 3-말단을 제외한 개시지점으로 사용된다.
두 분리물에서 위로 나뉘어진 영역으로 동일한 결과를 가져왔다. DNA서열과 아미노산 번역은 제2도에 나타냈다. 집합된 IGF-1B cDNA는 포리 트랙의 42개 데옥시아데노신잔류물을 포함하는 1136개의 뉴클레오다이드로 구성된다. IGF-1B cDNA의 크기는 필티잡종화에 의해서 결정된 대다수 mRNA(900 내지1350개 뉴클레오타이드)의 크기와 일치하였으며, 좀더 상세히는 하기에 서술하였다. 서열은 3개의 부분으로나뉘어질 수 있는데 : 개시 182개 뉴클레오타이드로 구성된 51미번역된 영역 : 개시암호와 오파(TGA)말단암호에 따른 약 585개 뉴클레오타이드(195암호)의 오픈리딩 후레임(open reading frame) : 그리고 포리 트릭에서 약 368개 뉴클레오파이드 말단의 31미번역 영역기다.
제2도에 볼 수 있는 바와 같이, 588뉴클레오타이드 오픈 리딩 후레임은 상 ATG암호에서 두번째로 시작된다. 뉴클레오타이드 84 내지 86에서 첫번째 ATG는 후레임오팔 터미네이터에 의해서 바로 뒤따르고 있다. 제2도에 보인 오픈리딩 후레임은 염기 183 내지 185에서 ATG암호로 단백질합성을 개시한 것으로 약21,841달톤의 분자량을 갖는 약 195개 아미노산의 ppIGF-I을 암호화하였다. 성숙된 IGF-I 단백질 서열은 제1도에서 교차선부분과 제2도에서 언더라인 부분으로 표시된 뉴클레오타이드 327 내지 536개로 암호화되어 있다. 70개의 성숙한 IGF-I 암호는 77개의 아미노산으로된 유일하고 신규한 카르복실-터미날 확장 다음에 온다. 비록 이 카르복실 말단 확장의 첫번째 16개 아미노산이 IGF-1A 카르복실-터미날 확장의 첫번째 16개의 아미노산과 일치할지라도, 남은 61개의 아미노산은 IGF-1A카르복실터미날 확장을 가진또는 네이셔날 바이오메디칼 리서치 화운데이슨 푸로테인 시퀸스 데이타 뱅크내 다른 단백질을 갖인 동족체결실에 의해서 유일하게 결정되는 것이다. 데이호프등(1983)과 윌버앤드 리프만(1983).
IGF-1A와 1B cDNA's 개별적으로 암호된 두개의 진귀한 ppIGF-I 단백질의 발현을 생체내에서 확인은 이들 단백질로 암호된 전령 RNA분자와 동일한 것에 의하여 이루어졌다. 특히 간 포리아데닐화한 RNA은 칠 그윈등(1979)이 묘사한 방법에 따라 구아니디니움 티오시아네이트로 추출하여 -70℃에서 조직을 신선하게 냉동시켜서 분리하였고 올리고 dT셀룰로우즈에 대한 크로마토그라피의 1회로 아비브와 레더(1972)에 의해서 설명되었다. 포리아데닐화한 RNA를 맥매스터와 카미차엘(1977)에 의해서 알려진 바와 같이 그리옥살(glyoxal)로 변성하고, 1.25%(w/v) 아갈로오스겔을 통하여 전기영동하고, 토마스(1980)에 의하여 알려진 방법에 따라 침투시켜 나이트로셀룰로오즈 필터에 전이되는 것이다. 완전한 1GF-1A 또는 -1BcDNA's또는 DNA 암호든지간에 1GF-1A 또는 -1B 카로복실-터미날확장은 미크로그람당 8-12×108dpm에서 릭비등(1977)에 의해서 알려진 바와 같은 닉크트란 스레이션(nick translation)에 의하여 32p로 모두 개별적으로 포기하였으며, 50%(v/v)포름아이드, 5×ssc, 50mM인산나트륨, pH 6.5, 변성된 새몬스핌 DNA미리리터당 100마이크로 그람, 1×덴하르드트 용액과 10%(w/v) 황산댁스트란을 포함한 용액에서 필터로 잡종화하였다. 필터는 0.2×SSC와 0.1%(w/v)SDS를 포함한 완충용액에서 22℃에서 15분간 세척하고, 48℃에서 동일한 완충액의 2가지 변형에서 30분간 세척하고, 그 다음 -70℃에서 62시간 동안 증감스크리닝을사용하여 방사선사진을 찍었다. 1GF-1A과 -1B cDNA's는 둘다 인체간에서 RNA전사로 잡종화된다. IGF-1A 또는 -1B cDNA중의 하나의 유일한 카르복시-말단확장의 잡종화는 대략 900 내지 약 1350개의 뉴클레오타이드의 주요밴드를 보인다. 다른 더 큰 밴드는 1.7∼3.7과 6.3kilobase에서 개개 잠재적으로 보이며, 전구체 mRNA's 또는 대신하여 mRNA's와 관련된 다른 IGF-I 유전자를 가공처리하였다. 완전한 IGF-1A와 -1B cDNA's를 사용한 평형실험에서 유사한 결과를 얻었다.
[실시예 2]
본 실시예는 인간 IGF-I게놈성 유전자의 지도와 분리에 관한 것이다. 인간 게놈성 라이브러리는 하이브리드 벡터인 λMG14을 이용하여 제조되며, 헤롬스등(1985), 부분적으로 크기-분획된 인간백혈구 DNA는 마니아티스등(1982)에 의하여 알려진 바와 같이 MboI으로 침지하였다. 게놈성 라이브러리는 마니아티스등(1982)에 의하여 묘사된 것과 같이 제조되었을 것이다. 론등(1978)에 의하여 알려진, 인간태아의 간에서 유도된 다른 것과 이 라이브러리로부터 대략 4×105푸레이크가 32p-표시된 IGF-IcDNA's를 사용하여 마니아티스등(1982)에 의하여 알려진 방법에 따라 스크린되었으며, 잡종화 소식자로서 릭비등(1977)에 의하여 알려진 바와 같은 닉크 트랜스레이션(nickded translation)에 의해서 제조되었다.
분리물에서 DNA는 헤름스등(1985), 쉬미드와 제리넥에 의하여 묘사된 것 같이 제조원 32p IGF-I와 인간 알루 소식자로 잡종화하여 BamHI, E oR1와 Hind Ⅲ 단일 그리고 복수 침지를 사용하여 지도되었다. IGF-I 엑손을 포함한 15개의 게놈성 크론으로부터,8개가 제한 효소지도와 서던 브롯팅(Southern blotting)이 이루어지는 종래의 분석으로 선택되었다. 8개의 크론이 선택되고 게놈성 DNA 영역은 제3도(a)에서 보인점에서 포함되었고, 숫자적으로 λIGF-다음에 특징을 보인다.
이 분석 결과는 제3도(a)에 요약되어 있고 분리된 게놈성 IGF-I 유전자의 제한지도를 보였다. 분리된 DNA의 5개 영역은 cDNA소식자로 잡종화되었고 제3도(a)에서 번호를 메긴 테두리로 보여주고 있는 엑손1-5를 묘사하고 있다. 엑손 1,2,3파 5는 IGF-1A mRNA(예를들면 pIGF-1A로 암호된 DNA)로 구성되고, 엑손 1,2,3과 4는 IGF-1B mRNA(예를들면 pIGF-1B로 암호된 DNA)로 구성된다. 엑손 1의 출발점에부터 엑손 5의 종지부까지 유전자는 45Kilobases(Kb)이상 확장된다. 엑손 2와 엑손 3사이에 불안전하게 특징된 DNA영역은 성숙된 IGF-I의 B영역에 있어서 아스파라긴 암호를 방해하는 서열로서 인트론이 존재함이 확인되었고, 이것은 부가적으로 엑손을 포함할 수는 없다. 제3도(a)에서 볼 수 있는 바와 같이, 게놈성 IGF-I 유전자 이내에는 쉬미드 앤드 제리넥(1982)에 따른 아루타입(Alu type)의 중간반복성의 DNA를 강하게 잡종화되는 5개의 영역이 있다.
엑손을 포함한 섭클론(sub clons)은 나아가 제한 지도를 의해서 놀란더등(1983)에 의하여 알려진 공정에따라 pUC18과 pUC19푸라스미드 내에서 제조되고 그리고 DNA서열을 위해서 놀란더등(1983)에 의하여 알려진 공정에 따라 M13mp18과 M13mp19내에서 제조된다. M13mp18, M13mp19, puc18과 pUC19는 뉴잉글랜드바이오랩스(베브리, 메사츄세츠)로부터 얻어질 것이다. DNA서열분석은 디데옥시 체인 말단 억제제인35S-dATP와 표준 및 변성 겔 전기영동을 사용하는 생거등(1977)과 비긴등(1983)에 의하여 알려진 방법에 따라 수행되었다. DNA서열전략 이용은 제3도(b)에서 도표로 표시하였다. 엑손 3과 4의 개시 DNA선열은 제3도(b)에서 볼 수 있는 서열스킴에서 연속된 원으로 나타낸 것과 같이 폰즈등(1982)에 의해서알려진 Ba1 31 엑손 뉴쿨레아제를 사용하여 겹치는 것을 제외한 부분으로 제조된 후에 얻어졌다. 모든 다른 서열 분석은 제 3도(b)에서 짧은 수직선으로 표시된 특수히 제한 엔드 뉴클레아아제 부위에서 개시되었다. 화살표는 확인된 서열 범위를 나타낸다. 엑손 2선행 인트론과 엑손 4의 부분의 100개의 뉴클레오타이드를 제외하고 제4도에 나타난 모든 서열은 개시지점으로 사용된 모든 한 엔도뉴클레아제 부분을 포함하고 두개의 DNA스트랜드로부터 다양화된다. 모든 엑손-인트론 스프라이스(Splice) 접합점과 포리아데닐화한 부분이 IGF-1A와 IGF-1B DNA서열을 비교하므로서 확인되었다.
서던브로트 분석(Southern blot ananylsis)는 다음과 같이 간략하게 인도되었다. 인체벡혈구로 부터 DNA10미크로그람이, 마니아티스등(1982), 여러가지 제한효소 Hind III, Pvu II, EcoR I, Bam H I 그리고 Bgl II로 침지되었고 그다음 0.298M트리스 붕산염, 0.089M붕산 그리고 0.001M Na2EDTA를 포함한 완충액중 20-25볼트에서 0.8%(w/v)아갈로즈 겔을 통하여 전기영동하였다. DNA 단편은 서던(1975)에 의해서 묘사된 공정에 따라 침투(blotting)되어 니트로 셀루로오즈 필터로 이송된다. 필터의 전잡종화, 방사선 표시된 IGF-I cDNA 소식자에 잡종화는 전에 기술된 데로 제조되었고, 후 잡종화는 왈등(1979)의 공정에 따라 세척되었다. 잡종화 밴드는 방사선 사진으로 확인되었다. 서던 브로트 분석(Southern blot analysis)이 IGF-1A와 IGF-1B cDNA소식자 그리고 위에서 나열한 제한효소를 사용하여 18명의 정상상태의 관련되지 않은 성인을 대상으로 수행되었다.
우리는 서로 연결되어 있는 벨등(1985)에 의하여 보고된 Hind Ⅲ과 PvuII에 대한 부분 다형 현상을 발견했으며 게놈성 IGF- I 유전자의 엑숀 5에 득점적으로 가까이 지도화 하였다. 완전한 게놈성 IGF- I 유전자 서열은 제4도에 나타내었다. 엑숀 4의 영역은 pIGF-1B의 카르복실-말단 확장 펩타이드로 암호된 대응 cDNA 서열과 한 배향으로 완전히 일치되는 서열이 되었다.
엑숀 5의 DNA서열은 pIGF-1A의 C-말단 활장 펩타이드로 암호된 대응 cDNA서열과 완전히 일치하였다. 인체간 RNA와 32p-표시된 올리고 뉴크레오타이드 5'TGAGAGCAATGTCACATTTC3'를 사용한 첫번째 확장분석에 의해서 ppIGF-I mRNA의 5'-말단은 제4도에서 1108부위 첫번째 위치에서 상향으로 583개 뉴클레오타이드로 확장된 것을 알 수 있었다.
만일 유전자의 5'-비번역 영역이 인트론을 포함되지 않는다면, 전사는 제4도 525 또는 526부위에서 시작되어야 하다. 만일 인트론이 5'미번역 영역내 포함된다면, 전사는 대부분 525 또는 526부위에서 더 상향(5')된 부분에서 시작될 것이다.
제2도에서 보인 IGF-IB cDNA는 번역 개시암호로 182개 뉴클레오타이드 5'로 확장되고 제4도에서 표시된 것과 같이 상대 번역 말단암호를 여러 상향으로 포함된다. 제4도에서 199 내지 241부위에서 나아가 5'에 42개 뉴클레오 라이드 영역을 서열에서 활력있게 전사된 DNA를 가리키는 ZDNA를 형성하기 위하여 전위를 갖는 푸린과 피리미딘 잔사를 번갈아 포함한다. 놀드 하임 앤드리치(1983).
[실시예 3]
본 실시예는 IGF-!A와 IGF-1B 전구체 펩타이드의 생체의 발현에 관한 것이고 ppIGF- I 번역의 출발신호에 첫번째 인-후레임 메티오닌(ATG)암호의 능력에 관한 것이다. 본 실시예에서는 인간 IGF-1A와 IGF-1B cDNAS는 pGEM 프라즈메드내에 포함된 박테리오파지 T7promotor와 인접한 이의 5'-말단을 갖는 IGF-I cDNA를 포함한 제조한 프라스미드를 제조하기 위하여 프라스미드 pGEM1과 pGEM2로 분리결찰하였다.
특히 IGF-1A cDNA는 이전에 대장균(Eco RI)에 침지된 pGEM1프라스미드로 결찰되었다. 재조합 프라스미드내에서 IGF-1A cDNA의 정확한 배향은 Bam HI를 이용한 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의하여 입증되었다.
IGF-IB cDNA를 포함한 재조합 pGEM2프라스미드는 미리 Eco RI과 HincII로 2중 침지된 pGEM2프라스미드에 그의 3'-말단에 연결된 E co R I링커를 포함한 Rsa I으로 침지한 IGF-1B cDNA를 결찰함으로써 구성되었다. 재조합 프라스미드에서 T7프로모터 관하여 IGF-1B cDNA의 정확한 배양은 Pst I으로 침지함으로서 입증되었다.
재조합 프라스미드를 분리한 후, 각기 pGEM1/IGF-1A와 pGEM2/IGF-1B로 표시한다. 각 프라스미드는 개별적으로, 효소 Hind Ⅲ과 E co RI를 사용한 각각의 IGF-IDNA 서열의 3'말단에서 선형화 하였다. IGF-1A cRNA와 IGF-1B cRNA로 표시되는 상보 RNA'S는 멜톤등(1984)의 방법에 따라서 T7RNA포리머라제(다반루등 1984)를 사용하여 생체외에서 전사하여 제조된다. 서열 번역의 효율을 증가시키기 위하여, 각 RNA는 하트등(1985)의 공정에 따라서 보조 전사적인 "캡을한(capped)"것이었다. 캡을한(capped), 즉 충분한 길이의 IGF-1A와 1GF-1B cRNAS는 동등한 결과를 갖는35S-메티오닌 또는 3H-루신 그러고 19개의 표시되지 않는 아미노산의 잔존 보충물 존재하에서 소맥 배야와 토끼 레틱큐로싸이트라이세이트(reticulocyte lysates)(폘함 앤드 잭슨 1976)를 둘다 사용하면서 생체외에서 번역되었다.
첫번째 번역 제품은 12%(w/v) 또는 15%(w/v)아크릴 아마이드 용액중에서 포리아크릴 아미이드 겔 전기 영동(래므리,1970)에 의해 평가되었고 다음은 방사선 사진으로 처리하였다. 실험적으로 첫번째 IGF-1A번역 제품은 거의 17,000달톤의 운동성을 보임이 확인되었으며, 특히 153아미노산 전구체의 예견된 분자량은 17,026달톤이었다. 부가적으로, 생체외에서 합성된 IGA-IA펩타이드의 아미노-말단 아미노산 서열이 확정되었고, IGF-1A cDNA로부터 예견된 첫번째 번역 제품의 서열과 완전히 일치하였다.
이와 같은 번역은 첫번째 인-후레임 메티오닌 암호(예를들면, 염기쌍 59-61의 IGF-1A, 제5도 참조)에서 시작되며 메티오닌 잔류물 24 또는 27 예를들면 염기쌍 128-130 또는 137-139, 각각으로 제5도 참조)에서는 아니다. IGF-1A는 이와 같이 153아미노산 전구체로서 합성된다. 유사하게도, 실험적으로 결정된 첫번째 IGF-1B번역 제품이 대략 22,000달톤의 운동성을 가진 포리아크릴 아미이드 겔로 이동되었고, 또한 IGF-1B cDNA에 의해서 확인된 것 같이, 또한 195아미노산 IGF-1B의 예견된 분자량은 21,841으로 특히 일치하였다. 이와 같은 IGF-1B는 합성 DNA와 본질적으로 본 발명의 순수한 IGF-1 유전자로 암호된 단백질과 일치하는 195아미노산 분자로서 생산되었다.
본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 본 공개 내용을 읽은 후 이 분야에서 숙련된 사람으로 인해서 여러 다른 예가 나타날 수 있으며, 모든 이와 같은 다른 예는 첨부된 특허청구의범위내에 포함되는것 이라고 간주된다.
Claims (21)
- 제2도의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 푸리푸로 인슐린양 성장인자-Ⅰ단백질을 생성하는 방법.
- 제2도의 뉴클레오타이드 1에서부터 1136까지의 뉴클레오타이드 서열을 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 푸리푸로 인슐린양 성장인자-I 단백질을 생성하는 방법.
- 제2도의 뉴클레오타이드 183에서부터 767까지의 뉴클레오타이드 서열을 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 푸리푸로 인슐린양 성장인자-I 단백질을 생성하는 방법.
- 하기의 아미노산 서열로 구성원 펩타이드의 아미노 말단으로, 그것의 카복시 말단에 직접 연결된 성숙한 인간 IGF- I 펩타이드를 암호하는 DNA서열로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 성숙한 인간 IGF-l펩타이드를 생성하는 방법 :NH2-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr AspMet Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro ProSer Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln ArgArg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro GlyGly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala SerLeu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu GlnArg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala GluCys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH
- 제4항에 있어서, 그 DNA 서열로 세포를 전환시키는 것을 포함하는, 제2도의 뉴클레오타이드 327에서부터 767까지의 뉴클레오타이드 DNA서열에 의해 암호되는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 생성방법.
- 하기의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암호하는 DNA 서열로로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 펩타이드의 생성방법 :NH2-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr AspMet Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro ProSer Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln ArgArg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro GlyGly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala SerLeu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu GlnArg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala GluCys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH
- 제6항에 있어서, 그 DNA 서열로 세포를 전환시키는 것을 포함하는, 제2도의 뉴클레오타이드 537에서부터 767까지의 뉴클레오타이드 DNA 서열에 의해 암호되는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 생성방법.
- 하기의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 펩타이드의 생성방법 :NH2-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn ThrLys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro LysThr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu GlyThr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys LysLys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly SerArg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys GlyLys-COOH.
- 제8항에 있어서, 하기의 DNA 서열로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 펩타이드의 생성방법 :5'-TATCAGCCCCCATCTACCAACAAGAACACGAAGTCTCAGAGAAGGAAAGGTTGGCCAAAGACACATCCAGGAGGGGAACAGAAGGAGGGGACAGAAGCAAGTCTGCAGATCAGAGGAAAGAAGAAAGAGCAGAGGAGGGAGATTGGAAGTAGAATGCTGAATGCAGAGGGAAAAAAGGAAAATAGA-3'
- 제6도의 아미노산 서열을 암호하는 DNA로 세포를 전환시키는 것을 포함하는, 제6도의 아머노산서열을 포함하는 본질적으로 순수한 푸리푸로 인슐린양 성장인자-I(essentially pure prepro insulin-1ike growth factor I)을 생성하는 방법.
- 하기의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 펩타이드의 아미노-말단으로, 그것의 카복시-말단에 직접 연결된 본질적으로 순수한 성숙된 인간 인슐린양 성장인자- I 을 생성하는 방법 :NH2-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr AspMet Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro ProSer Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln ArgArg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro GlyGly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala SerLeu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu GlnArg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala GluCys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH
- 하기의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 본질적으로 순수한 확장 펩타이드(extension peptide)를 생성하는 방법 :NH2-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr AspMet Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro ProSer Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln ArgArg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro GlyGly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala SerLeu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu GlnArg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala GluCys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH
- 하기의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 특징으로 하는 본절적으로 순수한 확장 펩타이드를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법 :NH2-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn ThrLys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro LysThr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu GlyThr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly LysLys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly SerArg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys GlyLys-COOH.
- 제 6도의 아미노산을 암호하는 DNA로 세포를 전환시키는 것을 포함하는, 제 6도의 아미노산 서열로 구성된 푸리푸로 인슐린양 성장인자-I을 암호하는 DNA서열에 잡종화(hybridization)한 인간 전령 RNA분자로부터 암호됨을 특징으로 하는 본질적으로 순수한 단백질 생성방법.
- 제14항에 있어서, 제6도의 아미노산 서열을 암호하는 DNA로 세포를 전환시킴을 모항하는, 길이가 1.7kb,3.7kb,6.3kb인 인간전령 RNA분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질의 생성방법.
- 전령 RNA분자가 하기의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암호하는 DNA서열과 잡종화되는 인간전령 DNA분자로부터 암호됨을 특징으로 하는 본질적으로 순수한 단백질을 생성하는 방법 :NH2-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn ThrLys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro LysThr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu GlyThr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly LysLys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly SerArg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys GlyLys-COOH.
- 제10항에서 규정된 단백질의 치료적 효과가 있는 양을 동물에게 투여하여 성장을 촉진하는 방법.
- 제10항에서 규정된 단백질의 치료적 효과가 있는 양을 암소에제 투여하여 수유를 보강하는 방법.
- 제11항의 방법에 의해 생성된 펩타이드와 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하되, 펩타이드를 동물체중 kg당 60g 내지 6mg 투여하여 성장촉진 효과가 있도록 함을 특징으로 하는 치료적 조성물.
- 제11항의 방법에 의해 생성된 펩타이드와, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하되, 펩타이드를 동물체중 kg당 60g 내지 6mg 투여하여 암소에서 우유생산을 촉진하도록 하는 것을 특징으로하는 조성물.
- 제 4 도에서 볼 수 있는 IGF- I 유전자 엑손 4에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 본질적으로 순수한 DNA분자의 측정방법.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81666286A | 1986-01-07 | 1986-01-07 | |
| US816662 | 1986-01-07 | ||
| US816,662 | 1986-01-07 | ||
| US929,671 | 1986-11-20 | ||
| US929671 | 1986-11-20 | ||
| US06/929,671 US4963665A (en) | 1986-01-07 | 1986-11-20 | Human preproinsulin-like growth factor I |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR880006362A KR880006362A (ko) | 1988-07-22 |
| KR920005918B1 true KR920005918B1 (ko) | 1992-07-24 |
Family
ID=27124101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019870000030A KR920005918B1 (ko) | 1986-01-07 | 1987-01-06 | 인간 푸리푸로 인슐린-양성장 인자 i |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4963665A (ko) |
| EP (1) | EP0229750B1 (ko) |
| JP (1) | JPH0819158B2 (ko) |
| KR (1) | KR920005918B1 (ko) |
| AR (1) | AR246765A1 (ko) |
| AU (1) | AU588072B2 (ko) |
| CA (1) | CA1340455C (ko) |
| DE (1) | DE3789559T2 (ko) |
| DK (1) | DK4387A (ko) |
| ES (1) | ES2062993T3 (ko) |
| IL (1) | IL81175A (ko) |
| NZ (1) | NZ218811A (ko) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5070075A (en) * | 1986-01-07 | 1991-12-03 | Washington University | Human preproinsulin-like growth factor I |
| US4885163A (en) * | 1987-02-24 | 1989-12-05 | Eli Lilly And Company | Topical use of IGF-II for wound healing |
| US4876242A (en) * | 1987-09-21 | 1989-10-24 | Merck & Co., Inc. | Human insulin-like growth factor analoges with reduced binding to serum carrier proteins and their production in yeast |
| US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
| SE9002731D0 (sv) * | 1990-08-24 | 1990-08-24 | Kabivitrum Ab | Product comprising growth factor |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5231178A (en) * | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
| SE9201573D0 (sv) * | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Kabi Pharmacia Ab | Use of igf-1 |
| US5643867A (en) * | 1992-08-26 | 1997-07-01 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating catabolic conditions |
| US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
| SE9402370D0 (sv) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Pharmacia Ab | Use of IGF-I |
| EP0779927A1 (en) * | 1994-09-08 | 1997-06-25 | Chiron Corporation | A method of improved production of insulin-like growth factor |
| US6030613A (en) | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| GB9605124D0 (en) * | 1996-03-11 | 1996-05-08 | Royal Free Hosp School Med | Method of treating muscular disorders |
| US20030204864A1 (en) * | 2001-02-28 | 2003-10-30 | Henry Daniell | Pharmaceutical proteins, human therapeutics, human serum albumin, insulin, native cholera toxic b submitted on transgenic plastids |
| US7741536B2 (en) | 1997-08-07 | 2010-06-22 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Expression of human serum albumin in plastids |
| US20100251425A9 (en) | 1998-05-15 | 2010-09-30 | University Of Central Florida | Expression of human interferon in transgenic chloroplasts |
| ATE510916T1 (de) * | 2000-03-01 | 2011-06-15 | Univ Auburn | Plastidtransformationsvektoren zur expression von proinsulin, das an die cholera toxin b- untereinheit fusioniert ist, in pflanzen |
| AU2000239309A1 (en) * | 2000-03-29 | 2001-10-08 | Dgi Biotechnologies Llc | Insulin and igf-1 receptor agonists and antagonists |
| GB0011278D0 (en) | 2000-05-10 | 2000-06-28 | Univ London | Repair of nerve damage |
| US7326417B2 (en) | 2001-09-11 | 2008-02-05 | Merial Ltd. | IGF-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses |
| FR2829498B1 (fr) * | 2001-09-11 | 2003-11-28 | Merial Sas | Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
| GB0202906D0 (en) | 2002-02-07 | 2002-03-27 | Univ London | Prevention of myocardial damage |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| JPS61502657A (ja) * | 1984-07-13 | 1986-11-20 | チロン コ−ポレイシヨン | プレプロインシュリン様成長因子１及び２ |
| ATE81779T1 (de) * | 1985-08-22 | 1992-11-15 | Gropep Pty Ltd | Peptidanalogedes insulinaehnlichen wachstumsfaktors-1 bei saeugetieren. |
| US4783524A (en) * | 1985-09-17 | 1988-11-08 | Monsanto Company | Growth factors |
| ES2007309T3 (es) * | 1987-04-23 | 1994-11-01 | Monsanto Co | Secrecion del factor de crecimiento insulinoide 1 en e.coli. |
-
1986
- 1986-11-20 US US06/929,671 patent/US4963665A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-01-06 KR KR1019870000030A patent/KR920005918B1/ko active IP Right Grant
- 1987-01-06 DK DK004387A patent/DK4387A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-01-06 AR AR87306394A patent/AR246765A1/es active
- 1987-01-06 EP EP87870001A patent/EP0229750B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-06 CA CA000526772A patent/CA1340455C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-06 AU AU67151/87A patent/AU588072B2/en not_active Ceased
- 1987-01-06 DE DE3789559T patent/DE3789559T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-06 IL IL8117587A patent/IL81175A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-01-06 NZ NZ218811A patent/NZ218811A/xx unknown
- 1987-01-06 JP JP62000969A patent/JPH0819158B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-06 ES ES87870001T patent/ES2062993T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0229750A2 (en) | 1987-07-22 |
| DK4387D0 (da) | 1987-01-06 |
| DE3789559D1 (de) | 1994-05-19 |
| AU6715187A (en) | 1987-07-09 |
| KR880006362A (ko) | 1988-07-22 |
| IL81175A (en) | 1994-08-26 |
| JPS62228285A (ja) | 1987-10-07 |
| ES2062993T3 (es) | 1995-01-01 |
| EP0229750A3 (en) | 1989-10-25 |
| IL81175A0 (en) | 1987-08-31 |
| EP0229750B1 (en) | 1994-04-13 |
| AR246765A1 (es) | 1994-09-30 |
| CA1340455C (en) | 1999-03-23 |
| JPH0819158B2 (ja) | 1996-02-28 |
| NZ218811A (en) | 1991-07-26 |
| US4963665A (en) | 1990-10-16 |
| DE3789559T2 (de) | 1994-10-13 |
| AU588072B2 (en) | 1989-09-07 |
| DK4387A (da) | 1987-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR920005918B1 (ko) | 인간 푸리푸로 인슐린-양성장 인자 i | |
| KR910002692B1 (ko) | 수정 호르몬의 제조방법 | |
| Kuivaniemi et al. | Structure of a full-length cDNA clone for the preproα2 (I) chain of human type I procollagen. Comparison with the chicken gene confirms unusual patterns of gene conservation | |
| JP2583214B2 (ja) | 牛ソマトトロピン含有組成物およびこれを用いる牛の乳汁分秘促進法 | |
| CZ636081A3 (en) | Process for preparing a vector for dna transfer | |
| AU634517B2 (en) | Somatotropin analogs | |
| JPH0341096A (ja) | インシュリン様成長因子類の結合蛋白 | |
| EP0456642A1 (en) | Somatotropin analogs | |
| US6103466A (en) | Double-muscling in mammals | |
| Nicoll et al. | The primary structure of coho salmon growth hormone and its cDNA | |
| Ceci et al. | Androgen induction of alcohol dehydrogenase in mouse kidney. Studies with a cDNA probe confirmed by nucleotide sequence analysis | |
| KR0142675B1 (ko) | 유전자 발현 조절인자 | |
| Keshet et al. | Cloning of bovine growth hormone gene and its expression in bacteria | |
| US5747290A (en) | Process for the production of recombinant polypeptides | |
| US5070075A (en) | Human preproinsulin-like growth factor I | |
| HU197939B (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor | |
| US5631227A (en) | Somatotropin analogs | |
| KR970009158B1 (ko) | 돼지 성장호르몬 동족체 | |
| US5045471A (en) | Cloned DNA for P450scc and expression thereof | |
| EP0236452B1 (en) | Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation | |
| US6692941B1 (en) | Bovine growth hormone | |
| JP2552942B2 (ja) | ヒトｂーＦＧＦ受容体遺伝子 | |
| KR860001922B1 (ko) | 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법 | |
| JP3149216B2 (ja) | 転写活性増強因子ＰｉｔＩをコードするＤＮＡ | |
| Henry | Construction of fish (Ctenopharvngodon idellus) genomic and |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| J2X1 | Appeal (before the patent court) |
Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL |
|
| G160 | Decision to publish patent application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| NORF | Unpaid initial registration fee |