FI100055B - Ihmisen tekijää VII koodaava yhdistelmä-DNA-rakenne - Google Patents

Description

100055

Ihmisen tekijää VII koodaava yhdistelmä-DNA-rakenne Tämä keksintö kohdistuu yleisesti ottaen veren hyytymiseen liittyviin tekijöihin ja erityisemmin proteiinien, joilla on veren hyytymiseen liittyvää biologista aktiivisuutta, ilmentämiseen.

Veren hyytyminen on prosessi, jonka saa aikaan veren eri komponenttien tai tekijöiden mutkikas keskinäinen vuorovaikutus, joka lopulta johtaa fibriinihyytymän muodostumiseen. Yleisesti, niin kutsuttuun porrasmaiseen koaguloitumiseen ("kaskadi") osallistuvat veren komponentit ovat proentsyymejä tai zymo-geenejä, eli entsymaattisesti epäaktiivisia proteiineja, jotka muuttuvat proteolyyttisiksi entsyymeiksi aktivaattorin vaikutuksen seurauksena, joka aktivaattori on itse aktivoitunut hyytymistekijä. Täten muuntuneita, hyytymiseen (koaguloitumiseen) liittyviä tekijöitä kutsutaan yleisesti "aktivoiduiksi tekijöiksi", ja niistä käytettyjen lyhenteiden perään on lisätty pikkukirjain "a" (esimerkiksi Vila).

Olemassa on kaksi järjestelmää, jotka voivat edistää veren hyytymistä ja täten osallistua normaaliin verenvuodon tyrehdyttämiseen (haemostasis). Näitä järjestelmiä kutsutaan sisäiseksi ja ulkoiseksi koaguloitumisreitiksi. Sisäisellä reitillä tarkoitetaan niitä reaktioita, jotka johtavat trom-biinin muodostumiseen pelkästään plasmassa läsnäolevia tekijöitä hyväksikäyttäen. Välivaiheena sisäisessä reitissä on tekijän IX aktivoituminen tekijäksi IXa, ja tätä reaktiota katalysoivat tekijä Xla ja kalsiumionit. Tämän jälkeen tekijä IXa osallistuu tekijän X aktivoimiseen, tekijän Villa, • fosfolipidin ja kalsiumionien läsnäollessa. Ulkoinen reitti käsittää sekä plasman tekijöitä että kudosuutteissa läsnäolevia komponentteja. Tekijä VII, joka on yksi edellä mainituista proentsyymeistä, osallistuu veren koaguloitumisen ulkoiseen reittiin muuntamalla (aktivoituessaan itse tekijäksi Vila) tekijän X tekijäksi Xa kudostekijän ja kalsium-ionien läsnäollessa. Tämän jälkeen puolestaan tekijä Xa muuntaa protrombiinin trombiiniksi tekijän Va, kalsium- 2 1000Γ5 ionien ja fosfolipidin läsnäollessa. Koska tekijän X aktivoituminen tekijäksi Xa on yhteinen tapahtuma sisäisessä ja ulkoisessa reitissä, niin tekijää Vila voidaan käyttää potilaiden, joissa tekijä VIII on puutteellinen tai inhiboitunut, hoitamiseen (US-patenttijulkaisu 4 382 083). Samoin käytettävissä olevan todistusaineiston perusteella epäillään, että tekijä Vila osallistuu myös sisäiseen reittiin (Zur ja Nemerson, J. Biol. Chem. 253: 2203-2209, 1978) vaikuttamalla tekijän IX aktivoitumiseen.

Koeanalyysi on osoittanut, että ihmisen tekijä VII on yksiket-juinen glykoproteiini, jonka molekyylipaino on suurin piirtein 50 000 daltonia. Tässä muodossaan tämä tekijä kiertää veressä epäaktiivisena zymogeenina. Tekijän VII aktivoitumisessa tekijäksi Vila katalyytteinä voivat toimia useat erilaiset plasman proteaasit, kuten tekijä Xlla. Tekijän VII aktivoituminen johtaa kahden polypeptidiketjun muodostumiseen, joista ketjuista toinen on raskas ketju (M, = 28 000) ja toinen on kevyt ketju (M, = 17 000), joita pitää yhdessä vähintään yksi disulfidisi-dos. Tekijä VII voidaan aktivoida myös in vitro tekijäksi Vila, esimerkiksi menetelmällä, joka esitetään US-patenttijulkaisussa 4 456 591.

Tekijä IX kiertää veressä yksiketjuisena iprekursorina (esiasteena) , jonka molekyylipaino on 57 000, ja se muuttuu aktiiviseksi seriiniproteaasiksi (tekijäksi IXa), kun se pilkotaan tekijällä Xla tekijän VIII läsnäollessa. Tekijä IXa muodostuu kevyestä ketjusta ja raskaasta ketjusta, joiden molekyylipainot ovat 16 000 ja 29 000, vastaavasti.

Nykyisiin hoitotoimenpiteisiin käsiteltäessä potilaita, joilla esiintyy häiriöitä veren hyytymisessä (esimerkiksi puutteellinen tekijä VIII ja IX), kuuluu yleensä korvaushoito käyttäen ihmisplasman kylmäsaostumia tai muita fraktioita, jotka sisältävät tiettyä tekijää rikastuneina pitoisuuksina. Näitä valmisteita on tähän saakka saatu kerätystä ihmisplasmasta, vaikkakin kylmäsaostumien valmistaminen edellyttää ihmisplasman suhteellisen suuren määrän käyttämistä lähtöaineena.

3 100055

Tekijää VII käytetään lääkinnällisesti hoidettaessa yksilöitä, joissa tekijä VII on puutteellinen, sekä hoidettaessa henkilöitä, joilta puuttuu tekijä VIII ja tekijä IX, tai joilla on von Willebrandin sairaus. Täsmällisemmin, korvaushoidossa tekijöitä VIII ja IX vastaanottavissa yksilöissä kehittyy usein näitä proteiineja vastaan vaikuttavia vasta-aineita. Hoidon jatkaminen vaikeutuu jatkuvasti näiden vasta-aineiden läsnäolon seurauksena. Potilaita, joilla tätä ongelmaa esiintyy, hoidetaan tavallisesti aktivoidulla protrombiinikompleksilla, jonka tiedetään muodostuvan aktiivisten ja epäaktiivisten, hyytymistä aikaansaavien entsyymien, tekijä Vila mukaan lukien, seoksesta. Edelleen, viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että tekijän Vila pienet injektoidut määrät (40-50 mikrogrammaa) säätävät tehokkaasti esiintyviä verenvuotojaksoja potilaissa, joilla tekijä VIII on puutteellinen, ja joiden veressä vasta-aineen pitoisuus on korkea (Hedner ja Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983).

Kylmäsaostumien valmistuksessa käytetyn plasman lukuisista lähteistä johtuen on vaikeata varmistua näitä valmisteita testaamalla siitä, ettei niissä ole viruskontaminaatioita. Esimerkiksi jokseenkin kaikilla kylmäsaostumia vastaanottaneilla henkilöillä saadaan positiivinen tulos hepatitis-kokeessa. Viimeaikaiset tutkimustulokset osoittavat samoin, että joissakin verenvuototaudista kärsivissä, kylmäsaostumia saaneissa henkilöissä on kehittynyt saadun immunologisen puutostilan oireyhtymä (AIDS). Lisäksi näiden tekijöiden suurten määrien puhdistaminen on erittäin vaikeata ja kallista.

Näin ollen, alalla on olemassa tarve saada aikaan menetelmä tekijän Vila ja tekijän IX puhtaiden valmisteiden tuottamiseksi suhteellisen suurina määrinä. Tämä keksintö tyydyttää tämän tarpeen yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, välttäen samalla onnistuneesti viruskontaminaatioista johtuvat vaikeudet, ja keksinnöllä saadaan samanaikaisesti aikaan aktiivisen tekijän Vila yhdenmukainen ja homogeeninen lähde potilaiden, joilta puuttuu tekijä VIII ja tekijä IX, sekä von Willebrandin tautia sairastavien yksilöiden hoitamiseksi, ja edelleen keksinnössä saadaan aikaan puhtaan tekijän IX lähde, jota puhdasta tekijää IX voidaan käyttää korvaushoidossa.

Lyhyesti esitettynä, tämä keksintö käsittää DNA-muodosteen, jonka sisältämä nukleotidiketju koodaa vähintään osittain tekijää VII. Tämä nukleotidiketju muodostuu ensimmäisestä, kalsiumia sitovaa aluetta koodaavasta nukleotidiketjusta, joka liittyy toiseen, ensimmäisen ketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidiketjuun. Tämä toinen nukleotidiketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän Vila seriiniproteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi. Nämä toisiinsa liittyneet ketjut koodaavat proteiinia, jolla on aktivoituna olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä Vila. Ensimmäinen nukleotidiketju voi muodostua olennaisesti geenistä, joka koodaa tekijää VII, tekijää IX, tekijää X, proteiinia C, protrombiinia tai proteiinia S. Edelleen, ensimmäinen nukleotidiketju voi myös koodata vastaavan geenin mukaista johtopeptidiä.

Erityisesti, ensimmäinen nukleotidiketju on voitu saada tekijän VII perimän kloonista tai cDNA-kloonista, ja se voi koodata tekijän VII johtopeptidiä ja aminopään osaa. Tämä ensimmäinen nukleotidiketju voi myös sisältää kaksijuosteisen oligonukleo-tidin. Erityisen edullinen ensimmäinen nukleotidiketju on ketju, joka koodaa tekijän IX johtopeptidiä ja aminopään osaa.

Tämä keksintö kohdistuu lisäksi yhdistelmäplasmideihin, jotka kykenevät yhtenäistymään isäntänä toimivan nisäkässolun DNA:han.

Eräs näistä plasmideista sisältää promoottorin, ja sen suhteen alavirran puolella sijaitsevan joukon RNA-jatkoskohtia, ja näiden RNA-jatkoskohtien suhteen alavirran puolella sijaitsee edelleen nukleotidiketju, joka koodaa vähintäin osittain tekijää VII. Tämä nukleotidiketju muodostuu ensimmäisestä nukleotidi-ketjusta, joka koodaa kalsiumia sitovaa aluetta, ja tämä ensimmäinen nukleotidiketju on liittynyt toiseen, ensimmäisen nukleo-tidiketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidi-ketjuun. Tämä toinen nukleotidiketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän Vila seriiniproteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi. Nämä toisiinsa liittyneet ketjut koodaavat proteiinia, jolla on aktivoituneena olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä Vila. Tämän nukleo-tidiketjun suhteen alavirran puolella sijaitsee polyadenylaation signaali.

5 100055 Tämä keksintö kohdistuu samoin edellä mainitun yhdistelmäplas-midin kaltaiseen toiseen plasmidiin, joka käsittää promoottorin ja eoeileen promoottorin suhteen alavirran puolella sijaitsevaan joukkoon RNA-jatkoskohtia, ja näiden RNA-jatkoskohtien suhteen alavirran nuolella sijaitsee edelleen nukleotidiketju, joka koodaa vähintään osittain tekijää IX. Tämä nukleotidiketju muodostuu ensimmäisestä nukleotidiketjusta, joka koodaa kalsiumia sitovaa aluetta, ja tämä ensimmäinen nukleotidiketju on liittynyt toiseen, ensimmäisen nukleotidiketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidiketjuun. Tämä toinen nukleotidiketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän IX seriiniDroteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi. Nämä toisiinsa liittyneet ketjut koodaa-vat proteiinia, jolla on olennaisesti samaa, veren koaguloitu-miseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä IX. Tämän nukleotidiketjun suhteen alavirran puolella sijaitsee edelleen polyadenylaation signaali.

Kolmannen piirteensä suhteen tämä keksintö kohdistuu nisäkässo-luihin, jotka on infektoitu pysyvästi paljaalla virusperäiset la nukleiinihapolla (transfektio) sellaisen proteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on aktivoituneena olennaisesti samaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä Vila. Nämä solut on transfek-toitu DNA-muodosteella, jonka sisältämä nukleotidiketju koodaa vähintään osittain tekijää VII. Tämä nukleotidketju muodostuu ensimmäisestä nukleotidiketjusta, joka koodaa kalsiumia sitovaa aluetta, ja tämä ensimmäinen nukleotidiketju on liittynyt toiseen, tämän ensimmäisen ketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidiketjuun. Tämä toinen nukleotidiketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän Vila seriiniproteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi. Nämä toisiinsa liittyneet ketjut koodaavat proteiinia, jolla on aktivoituna olennaisesti samaa veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä Vila.

Tämän keksinnön eräs muu piirre kohdistuu nisäkässoluihin, jotka on transfektoitu pysyvästi sellaisen proteiinin tuottamiseksi , jolla proteiinilla on olennaisesti samaa biologista 6 100055 vaikutusta kuin tekijällä IX. Nämä solut on transfektoitu DNA-muodosteella, jonka sisältämä nukleotidiketju koodaa vähintään osittain tekijää XI. Tämä nukleotidiketju muodostuu ensimmäisestä nukleotidiketjusta, joka koodaa kalsiumia sitovaa aluetta, ja tämä ensimmäinen ketju on liittynyt toiseen, ensimmäisen nukleotidiketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidiketjuun. Tämä toinen nukleotidiketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän IX seriiniDroteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi. Nämä toisiinsa liittyneet nukleo-tidiketjut koodaavat oroteiinia, jolla on olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen liittyvää biologista aktiivisuutta kuin tekijällä IX.

Tässä keksinnössä saadaan edelleen aikaan menetelmä sellaisen oroteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on veren koaguloi-tumiseen vaikuttavaa, tekijän Vila välittämää biologista aktiivisuutta, muodostamalla isäntänä toimiva nisäkässolu, jonka sisältämän DNA-muodosteen käsittämä nukleotidiketju koodaa vähintään osittain tekijää VII. Tämä nukleotidiketju muodostuu ensimmäisestä nukleotidiketjusta, joka koodaa kalsiumia sitovaa aluetta, ja tämä ensimmäinen nukleotidiketju on liittynyt toiseen, ensimmäisen ketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidiketjuun. Tämä toinen ketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän Vila seriiniproteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi. Nämä toisiinsa liittyneet nukleotidi-ketjut koodaavat proteiinia, jolla on aktivoituneena olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista vaikutusta kuin tekijällä Vila. Tämän jälkeen isäntänä toimivia nisäkässoluja kasvatetaan asianmukaisessa alustassa ja DNA-muodosteen koodaama ja isäntänä toimivien nisäkässolujen tuottama proteiinituote eristetään. Sitten proteiinituote aktivoidaan tekijän Vila muodostamiseksi.

Edelleen, tämän keksinnön eräs muu piirre kohdistuu menetelmään sellaisen proteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on veren koaguloitumiseen vaikuttavaa, tekijän IX välittämää aktiivisuutta. Tässä menetelmässä muodostetaan isäntänä toimiva nisäkässolu, jonka sisältämän DNA-muodosteen käsittämä 100055 7 nukleotidiketju koodaa vähintään osittain tekijää IX.

Tämä nukleotidiketju muodostuu ensimmäisestä nukleotidiket-justa, joka koodaa kalsiumia sitovaa aluetta, ja tämä ensimmäinen nukleotidiketju on liittynyt toiseen, ensimmäisen ketjun suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidiketjuun.

Tämä toinen nukleotidiketju koodaa katalyyttistä aluetta tekijän IX seriiniproteaasin aktiivisuuden aikaansaamiseksi.

Nämä toisiinsa liittyneet nukleotidiketjut koodaavat proteiinia, jolla on olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä IX. Tämän jälkeen isäntänä toimivia nisäkässoluja kasvatetaan asianmukaisessa alustassa ja isäntänä toimivien nisäkässolujen tuottama proteiinituote eristetään. Edellä kuvatuilla menetelmillä tuotetut proteiinituotteet kuuluvat samoin tämän keksinnön piiriin.

Edelleen, tämän keksinnön eräs muu piirre kohdistuu DNA-muodos-teeseen, jonka käsittämä DNA-ketju koodaa tekijää VII. Edul-lisimmassa suoritusmuodossaan tämä DNA-ketju käsittää kuvan Ib mukaisen cDNA-ketjun emäsparista 36 emäspariin 1433. Eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa tämä DNA-ketju käsittää kuvan Ib mukaisen cDNA-ketjun emäsparista 36 emäspariin 99, ja edelleen sen suhteen alavirran puolella sijaitsevan ketjun emäs-parista 166 emäspariin 1433. Tämä keksintö kohdistuu samoin yhdistelmäplasmideihin, jotka käsittävät välittömästi edellä kuvatut DNA-ketjut, ja jotka kykenevät yhtenäistymään isäntänä toimivan nisäkässolun DNArhan.

Tämä keksintö kohdistuu samoin nisäkässoluihin, jotka on trans-fektoitu pysyvästi tekijää VII koodaavan DNA-ketjun käsittävällä yhdistelmäplasmidilla. Edullisissa suoritusmuodoissa tämä DNA-ketju käsittää kuvan Ib mukaisen cDNA-ketjun emäsparista 36 emäspariin 1433, tai kuvan Ib mukaisen cDNA-ketjun emäsparista 36 emäspariin 99, ja edelleen sen suhteen alavirran puolella sijaitsevan ketjun emäsparista 166 emäspariin 1433.

8 100055 Tämä keksintö kohdistuu samoin menetelmään sellaisen proteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on veren koaguloitumiseen vaikuttavaa, tekijän Vila välittämää biologista vaikutusta, muodostamalla isäntänä toimiva, edellä kuvatun DNA-muodosteen sisältämä nisäkässolu. Tämän jälkeen tätä nisäkässolua kasvatetaan asianmukaisessa alustassa, ja DNA-muodosteen koodaama proteiinituote eristetään. Proteiinituote aktivoidaan sitten tekijän Vila muodostamiseksi.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista .

Tämän keksinnön muut piirteet ilmenevät seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen ja liitteenä olevien piirustusten avulla.

Piirustusten lyhyt kuvaus kuva la esittää tekijän VII osittaista cDNA-ketjua, joka on muodostettu liittämällä yhteen osia cDNA-klooneista XVII2115 ja XVII1923, kuva Ib esittää tekijän VII cDNA-ketjua XVII2463. Nuolet tarkoittavat häviämän (deletion) laajuutta ketjussa XVII565. Ketjun yläpuolella olevat numerot tarkoittavat aminohappoja. Alapuolella olevat numerot tarkoittavat nukleotidejä, kuva 2a esittää aminohappojen järjestystä useiden hyytymistekijöiden aminopään alueissa, kuvassa 2b verrataan toisiinsa tekijän VII aminohappoketjua, joka saatiin selvittämällä proteiiniketjun järjestys, ja ketjua, jota cDNA koodaa, kuva 3 esittää tekijän IX johtoketjun liittämistä ketjuun, joka koodaa kalsiumia sitovaa yhtäpitävää aluetta, kuva 4 esittää tekijän IX ketjun ja yhtäpitävän ketjun muodostamien hybridien liittämistä tekijän VII osittaiseen cDNA-ket-juun kehyksen sisäisen koodaavan ketjun tuottamiseksi, kuva 5 esittää sellaisen plasmidin muodostamista, joka plasmidi sisältää tekijän IX ja tekijän VII välistä fuusioproteiinia koodaavan ketjun, kuva 6 esittää ilmentämisvektoria FIX/VII/pD2. Käytetyt symbolit ovat: Ad2 MLP pääasiallinen myöhäispromoottori adenoviruksesta 9 100055 2; Ll-3, adenoviruksen 2 kolmiosainen johtoketju; 5'ss, 5'-jatkoskohta; 3'ss, 3 '-jatkoskohta; ja pA, myöhäinen poly-adenylaation signaali viruksesta SV40.

Kuva 7 esittää tekijän IX ja tekijän VII välisen cDNA-fuusion nukleotidiketjua.

Kuva 8 esittää ilmentämisvektoria pM7135. Käytetyt symbolit ovat: E, SV40-edistin; ori, 0-10 karttayksikköä Ad 5; pA, varhainen polyadenylaation signaali viruksesta SV40; Δ, plasmidin PBR322 "myrkky"-ketjujen häviämisalue; ja muut symbolit ovat kuten kuvassa 6.

Kuva 9 esittää tekijän VII 2463 emäsparin suuruisen cDNA-ketjun alikloonausta.

Kuva 10 esittää tekijän VII 565 emäsparin suuruisen cDNA-ketjun alikloonausta.

Kuva 11 esittää ketjun pVH565 5'-pään ja ketjun pVH2463 31-osan liittämistä kloonissa pUCl8 ketjun pVII2397 muodostamiseksi.

Kuva 12 esittää ilmentämisplasmidien FVII(2463)pDX ja FVII(565+ 2463)/pDX muodostamista. pA tarkoittaa polyadenylaation signaalia viruksesta VS40 varhaisesti tai myöhäisesti suuntautuneena, kuten esimerkissä 9 kuvataan. Muut symbolit ovat kuten kuvan 8 yhteydessä esitetään.

Edullisin tapa tämän keksinnön toteuttamiseksi.

Ennen tämän keksinnön kuvaamista keksinnön ymmärtämiseksi saattaa olla hyödyllistä esittää tiettyjen, jäljempänä käytettävien käsitteiden määritelmät.

• ‘ Täydentävä DNA tai cDNA: DNA-molekyyli tai -ketju, joka on synte- toitu entsymaattisesti mRNA-mallissa läsnäolevista ketjuista.

DNA-muodoste: DNA-molekyyli tai tällaisen molekyylin klooni, joka on joko yksi- tai kaksijuosteinen, ja joka voidaan eristää osittaisena luonnossa esiintyvästä geenistä, tai joka on muuntamalla saatu sisältämään sellaisia DNA-kappaleita, jotka 100055 10 kappaleet on yhdistetty ja asetettu vierekkäin tavalla, jota ei muutoin esiintyisi luonnossa.

Plasmidi tai vektori: DNA-muodoste, jonka sisältämä geneettinen informaatio pitää huolen DNA-muodosteen replikoitumisesta, kun se istutetaan isäntäsoluun. Plasmidi sisältää tavallisesti vähintään yhden geeniketjun, joka on tarkoitus ilmentää isäntä-solussa, sekä tällaista geenin ilmentymistä helpottavia ketjuja, kuten promoottoreita ja kopioitumisen käynnistymiskohtia. Se voi olla lineaarinen tai suljetun renkaan muotoinen molekyyli.

Liitetty: DNA-ketjujen sanotaan olevan liitetyt toisiinsa, kun yhden ketjun 5'- ja 3'-päät on yhdistetty fosfodiesterisidok-silla viereisen ketjun 3'- ja 5'-päihin, vastaavasti. Liittäminen voidaan toteuttaa eri menetelmillä, kuten epäreaktiivisten (blunt) tai tarttuvien päiden ligaatiolla, liitettyjen ketjujen synteesillä cDNA-kloonausta käyttäen, tai poistamalla kyseisten ketjujen välissä sijaitsevat ketjut suunnatulla mutageneesi-prosessilla.

Johtopeptidi: Aminohappoketju, joka esiintyy joidenkin proteii nien aminopäässä, ja joka tavallisesti pilkkoutuu irti proteiinista myöhemmän jatkojalostumisen ja erittymisen aikana. Johto-peptidit käsittävät ketjuja, jotka ohjaavat proteiinin solun erittymisreittiin. Ohessa käytetyllä käsitteellä "johtopeptidi" voidaan myös tarkoittaa osaa luonnossa esiintyvästä johtopepti-distä.

Alue: Kolmiulotteinen, tietyistä aminohapoista itsestään muodos tuva rakenne proteiinimolekyylissä joka rakenne käsittää kaikki tämän proteiinin tietylle biologiselle aktiivisuudelle välttämättömät rakenteelliset elementit tai osan niistä.

Biologinen aktiivisuus: Toiminto tai toimintojen sarja, jonka molekyyli suorittaa biologisessa yhteydessä (esimerkiksi organismissa tai in vitro jäljitelmässä). Proteiinien biologiset aktiivisuudet voidaan jakaa katalyyttisiin ja tehollisiin aktiivisuuk- 100055 11 siin. Hyytymiseen liittyvien tekijöiden katalyyttiset aktiivisuudet käsittävät yleensä muiden tekijöiden aktivoimisen esiasteita spesifisesti pilkkomalla. Tehollisiin aktiivisuuksiin kuuluu biologisesti aktiivisen molekyylin spesifinen sitoutuminen kalsiumiin tai muihin pieniin molekyyleihin, makromolekyy-leihin kuten proteiineihin, tai soluihin. Tehollinen aktiivisuus parantaa tavallisesti katalyyttistä aktiivisuutta, tai on olennaista katalyyttiselle aktiivisuudelle, fysiologisissa olosuhteissa. Joissakin tapauksissa katalyyttinen ja tehollinen aktiivisuus voivat olla lähtöisin proteiinin samasta alueesta.

Tekijän Vila tapauksessa biologisen aktiivisuuden tunnusomaisena piirteenä on se, että veren koaguloituminen välittyy ulkoisen reitin kautta. Tekijä Vila aktivoi tekijän X tekijäksi Xa, joka puolestaan muuntaa protrombiinin trombiiniksi käynnistäen täten fibriinihyytymän muodostumisen. Koska tekijän X aktivoituminen on yhteinen tapahtuma sekä veren koaguloitumisen ulkoisessa että sisäisessä reitissä, niin tekijää Vila voidaan käyttää yksilöiden, joilla tekijän IX, tekijän VIII tai von Willebrand'in tekijän aktiivisuus on erittäin puutteellinen, hoitamiseen.

Tekijän IX biologisen aktiivisuuden tunnusomaisena piirteenä on se, että veren koaguloituminen välittyy sisäisen reitin kautta. Tekijä Xla aktivoi tekijän IX tekijäksi IXa. Sitten tekijä IXa aktivoi tekijän X tekijäksi Xa tekijän Villa, fosfolipidin ja kalsiumionien läsnäollessa. Tämän jälkeen tekijä Xa osallistuu protrombiinin muuntamiseen trombiiniksi, käynnistäen täten fibriinihyytymän muodostumisen.

Kuten edellä huomautettiin, tekijän VII eristäminen ihmisplasmasta on aikaavievä ja kallis prosessi, koska tämä tekijä on harvinainen proteiini, jota on veressä läsnä suurin piirtein pitoisuutena 300 mikrogrammaa/litra. Lisäksi se on vaikeasti erotettavissa protrombiinista, tekijästä IX ja tekijästä X, ja se on altis proteolyyttiselle hajoamiselle puhdistamisen aikana (Kisiel ja McMullen, edellä). Vaikka ihmisen yksiketjuinen tekijä VII onkin puhdistettu aina homogeenisuuteen saakka (Kisiel ja 12 100055

McMullen, edellä), niin kuitenkin julkaistujen puhdistusmenetelmien rajoitteina on tavallisesti alhainen saanto ja/tai kontaminoituminen muilla hyytymistekijöillä.

Tekijöitä VII ja IX syntyy maksassa, ja ne tarvitsevat biosynteesiinsä K-vitamiinia. K-vitamiini on välttämätöntä tekijöissä olevien spesifisten gamma-karboksiglutaamihapon jäännösten muodostumiselle. Nämä epätavalliset aminohappojäännökset, joita muodostuu luennan (translaatio) jälkeisen muuntumisen seurauksena, sitoutuvat kalsiumioneihin ja ne huolehtivat proteiinin ja fosfo-lipidivesikkelien välisestä vuorovaikutuksesta. Lisäksi kumpikin tekijä VII ja IX sisältää yhden β-hydroksiasparatiinihappojäännöksen, joka muodostuu samoin proteiinien liientavaiheen jälkeen. Tämän aminohappojäännöksen merkitystä ei kuitenkaan tunneta.

Ottaen huomioon, että tekijöiden VII ja IX aktiivisuudet riippuvat luentavaiheen jälkeen tapahtuvista muuntumisista, käsittäen spesifisten glutaamihappojäännösten gamma-karboksylaation, ja että ne saattavat myös riippuen spesifisen aspargiinihappojäännöksen hydroksylaatiosta, niin on epätodennäköistä, että aktiivista tuotetta saataisiin tuotetuksi kloonaamalla ja ilmentämällä tekijät VII ja IX mikro- organismissa.

Näin ollen tässä keksinnössä saadaan aikaan menetelmä sellaisen proteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on veren koaguloitu-miseen vaikuttavaa, tekijän Vila välittämää biologista aktiivisuutta, käyttämällä pysyvästi transfektoituja nisäkässoluja. Lisäksi, tässä keksinnössä saadaan myös aikaan menetelmä sellaisen proteiinin tuottamiseksi, jolla proteiinilla on veren koagu-loitumiseen vaikuttavaa, tekijän IX välittämää biologista aktiivisuutta .

Kuten edellä mainittiin, tekijät VII ja IX tarvitsevat K-vitamii-nia biosynteesiinsä. Lisäksi plasman proteiinit protrombiini, tekijä X, proteiinit C ja proteiini S tarvitsevat myös K-vitamii-nia biosynteesiinsä. Näiden proteiinien aminopään osat, jotka sisältävät gamma-karboksiglutaamihapon jäännökset, ovat homologiset sekä aminohappoketjun että biologisen toiminnan suhteen (kuva 2a). Edelleen, tekijän VII, protrombiinin, tekijän IX, tekijän X

13 100055 ja proteiinin C karboksipään osat määräävät niiden spesifiset seriiniproteaasin toiminnot.

Tekijä VII on plasman hivenproteiini, ja tekijää VII koodaavan mRNA-molekyylin uskotaan olevan harvinainen. Näin ollen, tekijän VII puhdistaminen plasmasta määrinä, jotka riittävät mahdollisimman kattavaan ketjun analyysiin ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittämiseen, pysyy vaikeana. Kisiel ja McMullen (edellä) totesivat tekijän VII hajoamisen puhdistamisen aikana, jopa prote-aasien inhibiittoreidenkin läsnäollessa. Näistä vaikeuksista johtuen tekijän VII tunnusomaiset piirteet tunnetaan huonosti, verrattuna veren koaguloitumisjärjestelmän muihin, runsaampana esiintyviin komponentteihin. Todellakin, tutkijoiden Kisiel ja McMullen (edellä) tutkimuksesta saatiin järjestykseen liittyvää informaatiota ainoastaan tekijän VII kummankin ketjun 10 jäännöksen kohdalla, ja kummassakin aminohappoketjussa kahden jäännöksen tunnistaminen oli epävarmaa. Naudan tekijän VII kohdalla on myös julkaistu osittaista aminohappojäännösten järjestykseen liittyvää tietoutta. (DiScipio et ai., edellä).

Tekijän VII mRNA-molekyylin oletettu harvinaisuus on johtanut siihen, ettei tekijän VII geeniä tunneta. Tavanomaisten cDNA-kloonaukseen perustuvien tekniikoiden onnistuminen riippuu siitä, onko käytettävissä riittävä määrä mallina toimivia mRNA-molekyylejä. Käänteisen kopioitumisen ennenaikainen päättyminen johtaa sellaisten, cDNA-kloonien muodos tiimi seen, joilta cDNA-klooneilta puuttuu 5-pää, ja alhaiset mRNA-pitoisuudet pahentavat tätä tilaa. Alalla on kehitetty lukuisia menetelmiä alhaisina pitoisuuksina esiintyvän lähetin cDNA-kloonaamiseksi (Ma-niatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), mutta sen seurauksena, ettei mielenkiinnon kohteena olevan tuotteen aminohappojärjestystä tun-* neta, DNA-ketjun ennustaminen ja asianmukaisten oligonukleotidi- koettimien kokoaminen on mahdotonta. Vaikka näitä kehittyneitä 14 100055 menetelmiä käyttäen saattaakin olla suhteellisen yksinkertaista saada osittainen cDNA-klooni harvinaista proteiinia koodaa-vasta geenistä, niin kuitenkin harvinaisia proteiineja, kuten tekijää VII koodaavien geenien täysimittaisten cDNA-kloonien saaminen on edelleenkin erittäin vaikeata.

Tekijään VII verrattuna tekijä IX on suhteellisen runsaana esiintyvä proteiini, ja ihmisen tekijää IX koodaavasta geenistä saadun cDNA-kloonin ketju tunnetaan (Kurachi ja Davie, Proc. Natl. Acad. Sei. USA _79_: 6461-6464, 1982; sekä Anson et ai., EMBO J. 3_: 1053-1060, 1984). Tekijää IX koodaavan geenin rakenteen tunnusomaiset piirteet on selvitetty ja aminohappojen järjestys proteiinissa on määritetty tunnetun nukleotidiketjun perusteella. Alalla on julkaistu jonkin verran ihmisen ja naudan tekijän IX proteiiniketjuun liittyvää tietoutta ja nämä ketjut on analysoitu (DiScipio et ai., edellä). Tämän proteiinin aminopään osa sisältää 12 glutaamihappojäännöstä, jotka lopullisessa proteiinissa ovat muuntuneet gamma-karboksiglutaamihapon (Gla) jäännöksiksi. Tekijän IX aktivoitumiseen liittyvät pilkkoutumiskohdat on samoin tunnistettu (Kurachi ja Davie, edellä). Tekijästä IX saadun cDNA-kloonin 5’-päässä oleva ketju koodaa viestipep-tidiä, joka on tyypillinen, useimmista erittyvistä proteiineista löytyvä viestipeptidi (Kurachi ja Davie, edellä). Tekijän IX geenin ilmentämistä yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla ei olla esitetty aikaisemmin.

Koska täysimittaisen cDNA-kloonin saaminen tekijän VII geenistä on vaikeata, niin keksinnön puitteissa sovellettiin kolmea uutta lähestymistapaa koodaavan ketjun 5'-pään, johtopeptidiä koodaa-va alue mukaan lukien, muodostamiseksi. Ensimmäisen menetelmän mukaisesti tekijän VII osittainen cDNA-klooni liitetään kappaleeseen, joka koodaa tekijän IX johtopeptidiä ja 5'-osaa.

Tämä lähestymistapa perustuu siihen havaintoon, että näiden kahden molekyylin aminopään osat saavat aikaan kalsiumin sito-misaktiivisuuden vastaavissa proteiineissa, seka siihen toteamukseen, että tekijän VII kalsiumin sitomisaktiivisuus voidaan korvata tekijän IX vastaavalla aktiivisuudella. Tuloksena olevassa polypeptidissä säilyy todellisen tekijän VII biolo- 15 100055 ginen aktiivisuus, koska hyytymistekijöiden spesifiset serii-nin proteaasiaktiivisuudet ovat peräisin molekyylien karboksi-pään alueista. Toisessa lähestymistavassa osittainen cDNA-klooni yhdistetään DNA-ketjuun, joka koodaa tekijän VII johtoketjua ja aminopään aluetta. Ohessa esitetyt tekijän VII osittaiset cDNA- ja aminohappoketjut mahdollistavat perimän DNA-kirjas-ton tai cDNA-kirjaston seulonnan niiden kloonien suhteen, jotka käsittävät 51-osan tekijän VII geenistä. Kolmannessa lähestymistavassa osittainen cDNA-klooni liitetään koodaaviin hybridiketjuihin, jotka muodostuvat tekijän IX johtopeptidiä koodaavasta cDNA-kappaleesta sekä synteettisestä geenikappa-leesta, joka koodaa kalsiumia sitovaa yhtäpitävää aluetta, tai tekijän VII tapauksessa ennustettua aminopään ketjua. Tekijän VII aminopäätä koodaava ketju selvitettiin ohessa julkaistun, mutta aikaisemmin julkaisemattoman, aminohappoketjun järjestykseen liittyvän tietouden perusteella. Yhtäpitävä ketju johdettiin tekijään VII liittyvästä tietoudesta, sekä muihin K-vitamii-nista riippuvaisten plasman proteiiniketjuihin liittyvien ja julkaistujen tietojen perusteella.

Yhtäpitävästi sen lähestymistavan, joka edellä kuvattiin tekijää VII koodaavan geenin 5'-osan käsittävien kloonien seulomiseksi, kanssa tässä keksinnössä on onnistuttu saamaan ilmentymiseen soveltuva, täyspitkä ja täsmällinen cDNA.

Muodostetuista cDNA-klooneista klooni, josta käytetään merkintää "XVII2463" sisälsi tekijän VII suurimman cDNA-istutteen. Sen todettiin sisältävän tekijän VII koko koodaavan ketjun. Tämä klooni käsitti 35 nukleotidin pituisen, lukematta jäävän 5'-alueen, 180 nukleotidiä, jotka koodaavat 60 aminohapon pituista johtoketjua, 1218 nukleotidiä, jotka koodaavat 406 aminohaposta muodostuvaa lopullista proteiinia, pysäytyskodonin, 1026 nukleotidin pituisen lukematta jäävän 3'-ketjun, sekä 20 emäksestä muodostuvan poly(A)-hännän (alkaa asemasta 2463). Tämän cDNA-molekyylin molempien juosteiden järjestys on selvitetty kokonaisuudessaan. Sen vertaaminen kahteen aikaisemmin klooneista XVII2115 ja XVIII923 eristettyyn cDNA-istutteeseen paljasti, että XVII2463 sisältää yhdessä ainoassa EcoRI-kappaleessa 100055 16 tekijän VII cDNA-ketjun, joka koodaa tekijän VII johtoketjua ja lopullisen proteiinin ketjua.

Toinen klooni, XVII565, jonka sisältämä cDNA-istute oli identtinen kloonin XVII2463 cDNA-molekyylin kanssa nukleotidien 9-638 osalta, paitsi että siitä puuttuivat nukleotidit 100-156 (kuva Ib),eristetti in. Verrattaessa näitä cDNA-molekyylejä perimästä saatuun tekijän VII DNA-ketjuun todettiin, että puuttuvat ketjut vastaavat täsmällisesti yhtä eksonin kaltaista aluetta. Näin ollen on saatu kaksi tekijän VII cDNA-molekyyliä, jotka ilmeisesti vastaavat mRNA-molekyylin vaihtoehtoisia jatka-mis tapahtumia.

Kloonin XVII2463 koodaama johtoketju on poikkeuksellisen pitkä (60 aminohappoa), ja sen hydrofobisuusprofiili on hyvin erilainen verrattuna tekijään IX, proteiiniin C ja protrombiiniin.

Tämä johtoketju sisältää kaksi Met-jäännöstä, asemissa -60 ja -26. Käynnistyminen alkaa mitä todennäköisimmin ensimmäisen Met-jäännöksen kohdalta, sillä viestipeptideille tyypillinen hydrofobinen alue sijaitsee asemassa -60 olevan Met-jäännöksen jälkeen, muttei asemassa -26 olevan Met-jäännöksen jälkeen. On mielenkiintoista todeta, että kloonista XVII565 puuttuva ketju, joka vastaa täsmälleen eksonin kaltaista aluetta genomisessa (perimästä saadussa) kloonissa, johtaa 38 aminohapon pituiseen johto-ketjuun, jonka hydrofobisuusprofiili vastaa paremmin tekijää IX, proteiinia C ja protrombiinia.

Koska oli epäselvää, kumpi näistä edellä kuvatuista johtoketjuis-ta, mikäli kumpikaan, on todellisuutta vastaava, niin uusi lähestymistapa otettiin käyttöön 5'-pään ketjun analysoimiseksi. Lyhyesti, tässä lähestymistavassa muodostettiin ihmisen perimästä saatu DNA-kirjasto ja sitä seulottiin, ja tekijän VII geeniketjut käsittävät genomiset kloonit tunnistettiin. Tämän jälkeen genomisen ketjun 5'-osa liitettiin cDNA-molekyyliin täysipituisen kloonin muodostamiseksi.

Eräässä toisessa muodosteessa kloonista XVII565 saatu tekijän VII cDNA-ketjun 5'-kappale, joka sisälsi koko johtoketjua ja 17 100055 lopullisen proteiinin 29 aminohappoa koodaavan ketjun, liga-toitiin kloonista AVII2463 saatuun cDNA-kappaleeseen (joka sisälsi loput lopullisen proteiinin ketjusta sekä lukematta jääneen 3'-ketjun). Tämä "565-2463"-ketju koodaa tekijän VII täysipitkää cDNA-ketjua yhtenä EcoRI-kappaleena.

Tämän jälkeen edellä kuvatut DNA-ketjut istutetaan sopivaan ilmentyvään vektoriin, jota käytetään puolestaan nisäkkäästä saadun solusukupolven transfektoimiseen . Tämän keksinnön toteuttamiseksi käyttökelpoiset ilmentymisvektorit käsittävät promoottorin, joka kykenee ohjaamaan vieraan geenin kopioitumista transfektoidussa nisäkässolussa. Edullisimpia ovat virusperäiset promoottorit, koska ne ohjaavat tehokkaasti kopioitumista. Erityisen edullinen tällainen promoottori on pääasiallinen myöhäinen promoottori adenoviruksesta 2. Tällaiset ilmentymisvektorit sisältävät myös joukon RNA-jatkoskohtia, jotka sijaitsevat promoottorin suhteen alavirran puolella ja ylävirran puolella sen geenin istuttamiskohdasta, jonka geenin koodaamalla proteiinilla on veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta. Edullisimpia RNA-jatkoskohdan ketjuja voidaan saada adenoviruksesta ja/tai immunoglobuliinien geeneistä. Nämä ilmentymisvektorit sisältävät lisäksi polyadenylaa-tion signaalin, joka sijaitsee alavirran puolella istuttamis-kohdan suhteen. Edullisimpia ovat viruksesta saadut polyadeny-laation signaalit, kuten varhainen tai myöhäinen polyadenylaa-tion signaali viruksesta SV40, tai polyadenylaation signaali ade-noviruksen 5:Elb-alueesta. Erityisen edullisessa suoritusmuodossa ilmentymisvektori sisältää myös virusperäisen johtoketjun, kuten adenoviruksen 2 kolmiosaisen johtoketjun, sijoitettuna promoottorin ja RNA-jatkoskohtien väliin. Edulliset vektorit voivat samoin sisältää edistäjäketjuja, kuten SV40-edistäjän.

Tämän jälkeen kloonatut DNA-ketjut voidaan viedä viljeltyjen nisäkässolujen sisään kalsiumfosfaatin välittämää transfektiota käyttäen (Wigler et ai., Cell 14_: 725, 1978; Corsaro ja Pearson, Somatic Cell Genetics Ί_: 603, 1981; Graham ja Van der Eb,

Virology 5_2: 456, 1973). DNA: sta ja kalsiumfosf aatista muodoste- 100055 18 taan saostuma ja soluja käsitellään tällä saostumalla. Osa soluista ottaa sisäänsä DNA:ta, joka pysyy solujen sisällä useita vuorokausia. DNA yhtenäistyy pysyvästi perimään pienessä osassa -4 soluja (tyypillisesti 10 ). Näiden pysyvien yhtymien tunnista miseksi mielenkiinnon kohteena olevan geenin ohella soluun istutetaan tavallisesti myös geeni, joka saa aikaan valikoitavissa olevan fenotyypin (valikoitava merkitsin). Edullisimpia valikoitavia merkitsimiä ovat geenit, jotka saavat aikaan vastustuskykyä lääkeaineille, kuten G-418 ja metotreksaatti. Valikoitavia merkitsimiä voidaan istuttaa soluun joko erillisen plasmidin avulla, samanaikaisesti mielenkiinnon kohteena olevan geenin kanssa, tai niitä voidaan viedä soluun saman plasmidin avulla. Edullisin valikoitava merkitsin on lääkeaineen G-418 vastustuskyvyn aikaansaava geeni, joka sisältyy plasmidiin pKO-neo (Southern ja Berg, J. Mol. Appi. Genet. _1: 327-341, 1982). Samoin saattaa olla edullista lisätä solun sisään vietävään seokseen ylimääräistä DNA:ta, jota kutsutaan "kantaja-DNA:ksi". Sen jälkeen, kun DNA on saatu viedyksi solujen sisään, niiden annetaan kasvaa tietyn pituisen ajanjakson ajan, tyypillisesti 1-2 vuorokautta, jolloin mielenkiinnon kohteena olevan geenin ilmentyminen alkaa. Tämän jälkeen käytetään lääkeaineeseen perustuvaa valikointia niiden kasvavien solujen valikoimiseksi, joissa soluissa valikoitava merkitsin ilmentyy pysyvästi. Näiden solujen klooneja voidaan seuloa mielenkiinnon kohteena olevan prote-: iinin ilmentymisen suhteen.

Transfektoitujen solujen tuottamat tekijät VII ja IX voidaan poistaa solujen viljelyalustasta adsorboimalla ne bariumsitraat-tiin. Käytettyyn alustaan sekoitetaan natriumsitraattia ja ba-riumkloridia, ja saostuma otetaan talteen. Tämän jälkeen saostuneesta materiaalista voidaan määrittää asianmukaisen hyytymistekijän läsnäolo. Tuotetta voidaan puhdistaa edelleen immunoadsorptiolla. On edullista, että immunoadsorptiossa käytettävä kolonni käsittää erittäin spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta. Vaihtoehtoisesti bariumsitraatilla saostettu materiaali voidaan puhdistaa tavanomaisimmilla biokemiallisilla menetelmillä tai korkean suorituskyvyn nestekromatografisesti.

100055 19

Yksiketjuinen tekijä VII voidaan muuntaa aktiiviseksi kaksi-ketjuiseksi tekijäksi Vila käyttäen tekijää Xlla, kuten Hedner ja Kisien esittävät (J. Clin. Invest. _71: 1836-1841, 1983), tai muilla proteaaseilla, joilla on trypsiinin kaltaista spesifisyyttä (Kisiel ja Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 7_3: 29-42, 1983 ) .

Yhteenvetona esitettäköön, että tässä keksinnössä saadaan aikaan menetelmä proteiinien, joilla on K-vitamiinista riippuvien veren hyytymistekijöiden aktiivisuutta, tuottamiseksi transfektoituja nisäkässoluja käyttäen. Näiden hyytymistekijöiden spesifisiä seriiniproteaasin alueita koodaavat geeniketjut on eristetty cDNA-kirjastoista. Johtopeptidejä ja kalsiumin sitomisalueita koodaavat ketjut on eristetty cDNA-kirjastoista tai genomisista kirjastoista, tai ne on muodostettu syntetoiduis-ta oligonukleotideistä. Tämän jälkeen nämä ketjut liitetään asianmukaiseksi ilmentymisvektoriksi siten, että ne koodaavat proteiinia, jolla on toivottavaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta. Tuloksena oleva vektori ja plasmidi, joka sisältää lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen, transfektoidaan samanaikaisesti asianmukaisiin, nisäkkäästä saadun kudosviljelmän soluihin. Transfektoituneet solut voidaan tämän jälkeen valikoida lisäämällä asianmukaista lääkeainetta, kuten G-418. Sitten proteiinituotteet puhdistetaan solujen kasvatusalustasta, ja niiden biologinen aktiivisuus määritetään veren koagulointikokeella, ja niiden immunologinen ristireaktiivisuus määritetään ihmisen todellisia hyytymistekijöitä vastaan muodostettuja vasta-aineita käyttäen.

Esimerkeistä yhteenvetona mainittakoon, että esimerkissä 1 esitetään tekijän VII täysipitkän cDNA-ketjun kloonaaminen. Esimerkissä 2 esitetään ihmisen tekijän VII osittainen aminohappo-ketju, mukaan lukien suurin piirtein 30 aminohapon ketju amino-päässä. Esimerkissä 3 esitetään ihmisen genomisen DNA-kirjaston muodostaminen ja seulonta, sekä tekijän VII geeniketjuja käsittävien genomisten kloonien tunnistaminen. Esimerkissä 4 esitetään kahden hybridigeenikappaleen muodostaminen, näiden kummankin 100055 20 kappaleen käsittäessä tekijän IX johtopeptidiä koodaavan cDNA-kappaleen sekä kalsiumin yhtäpitävää sitomisaluetta koodaavan, syntetoidun kaksijuosteisen kappaleen. Tämän jälkeen nämä hybridiketjut liitetään tekijän VII osittaisiin cDNA-klooneihin. In vitro mutageneesiä käyttäen yhtäpitävä ketju muutettiin tämän jälkeen tekijän VII proteiiniketjusta saatujen tietojen mukaiseksi. Esimerkissä 5 kuvataan sellaisen geenin muodostaminen, jonka geenin koodaama fuusioproteiini käsittää tekijästä IX kalsiumin sitomisalueen sekä spesifisen seriinipro-teaasin alueen tekijästä VII. Esimerkissä 6 kuvataan vektorin pD2 muodostaminen, ja tätä vektoria voidaan käyttää proteiinien, joilla on veren koaguloitumiseen liittyvää biologista aktiivisuutta, ilmentämiseen transfektoiduissa nisäkässoluissa. Esimerkissä 5 kuvattu geenifuusio ilmennetään tätä vektoria käyttäen. Esimerkissä 7 kuvataan vektorin dD2 käyttö tekijän IX geenin ilmentämiseksi nisäkkään transfektoidussa solusukupolves-sa. Esimerkissä 8 kuvataan vektorin DM7135 muodostaminen, jonka vektorin sisältämät DNA-ketjut koodaavat tekijään VII yh-teensulautuneesta tekijän IX johtoketjusta muodostuvaa primääriä luennan tuotetta. Tätä vektoria voidaan käyttää proteiinin, jolla on tekijän VII aktiivisuutta, tuottamiseen transfektoidussa nisäkkään solusukupolvessa. Esimerkissä 9 kuvataan tekijän VII ilmentäminen cDNA-ketjuja käyttäen, sekä tekijän VII ilmentäminen genomisesta ketjusta ja cDNA-ketjusta muodostuvaa hybridi-Ketjua käyttäen.

Seuraavat esimerkit ovat keksintöä havainnollistavia, eikä sitä rajoittavia.

Esimerkit

Restriktioentsyymit saatiin yhtiöistä Bethesda Research Laboratories (BRL) sekä New England Biolabs, ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti, mikäli toisin ei mainita. Oligonukleotidit syntetoitiin yhtiön Applied Biosystems DNA-syntetisaattorilla, malli 380 A, ja ne puhdistettiin elektro-foreettisesti polyakryyl i amidigeeliä, denaturoivia geelejä, käyttäen. E. coli-solut transformoitiin tutkijoiden Maniatis 100055 21 et ai. kuvaamalla tavalla (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Kloonaavat vektorit M13 ja pUC sekä isäntäkannat saatiin yhtiöstä BRL. Tekijä VII eristettiin ihmisen plasmasta tutkijoiden Kisiel ja McMullen (edellä) kuvaamalla tavalla.

Esimerkki 1

Tekijän VII osittaisen cDNA-ketjun kloonaaminen A. Ihmisen maksasta peräin olevan cDNA-kirjaston muodostaminen DNA-kirjasto valmistettiin ihmisen maksasta saadusta mRNA:sta menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Chandra et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 80: 1845-1848, 1983). Tämä cDNA-preparaatti sedimentoitiin alkalista sakkaroosigradienttia käyttäen (Monahan et ai.. Biochemistry 1_5: 223-233, 1976), ja ne fraktiot, joiden sisältämät ketjut olivat suurempia kuin noin lOOO nukleotidiä, yhdistettiin. Ensimmäinen juostepreparaatti tehtiin kaksi-juosteiseksi käyttäen käänteiskopioivaa entsyymiä (käänteis-transkriptaasi; Chandra et ai., 1983), käsiteltiin Sl-nukleaa-silla ja jääneet porrastuneet päät täytettiin käyttäen DNA-polymeraasia I (Klenow-fragmentti) kaikkien neljän deoksiribo-nukleotidin trifosfaatin läsnäollessa (Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Päistään epäreaktiivista (blunt) cDNA:ta käsiteltiin EcoRI-mety-laasilla ja ligatoitiin fosforyloituihin EcoRI-kytkijoihin T^-DNA-ligaasia käyttäen (Maniatis et al., edellä). Tämä ligatoitu DNA-preparaatti pilkottiin täydellisesti EcoRI-entsyymillä ylimääräisten kytkijäketjujen poistamiseksi, ja suurin piirtein yli 1000 emäsparin pituiset kaksijuosteiset DNA:t puhdistettiin sentrifugoimalla neutraalia sakkaroosigradienttia käyttäen (Maniatis et ai., edellä). Luonnollista Agtll-DNA:ta ligatoitiin konkatemeereiksi (yhdeksi ketjuksi), pilkottiin täydellisesti EcoRI-entsyymillä, ja 5'-pään fosfaatit poistettiin käsittelemällä bakteeriperäisellä alkalisella fosfataasilla.

Yhdistetty, ihmisen maksasta saatu cDNA ligatoitiin faagi-DNA:n kanssa, siirrettiin in vitro olosuhteisiin (Maniatis et ai., edellä) ja käytettiin E. coli-kannan Y1088 infektoimiseen (Young ja Davis, Science, 222: 778-782, 1983). Tässä kirjastossa kehittyi suurin piirtein 14 x 10^ primääriä faagitäplää (josta bakteerikasvu puuttui), tämän kirjaston muodostuessa 100055 22 seitsemästä kirjastosta, jossa kussakin oli noin 2 x 10^ faagitäplää. Yli 90 % näistä faageista oli ihmisen DNA-istuttei-ta sisältäviä yhdistelmäfaageja sen perusteella, että niistä puuttui β-galaktosidaasin aktiivisuus, ja minkä osoitti myöskin 20 satunnaisen kloonin tunnusomaisten piirteiden selvittäminen EcoRI-entsyymillä pilkkomalla, mitä seurasi elektroforeesi agaroosigeelillä. Faagipartikkeleina oleva cDNA-kirjasto puhdistettiin sentrifugoimalla kesiumkloridigradienttia käyttäen, ja se tallennettiin SM-puskuriin (Maniatis et ai., edellä).

B. Ihmisen maksasta peräisin olevan cDNA-kirjaston seulominen tekijän VII kloonien suhteen

Edellä kuvattua ihmisen maksasta saatua ilmentyvää cDNA-kirjastoa seulottiin spesifisen antigeenin suhteen (Yong ja Davis, edellä) 125 käyttäen I-merkittyä tekijän VII monoklonaalista vasta-ainetta, joka oli valmistettu puhdasta tekijää VII käyttäen tutkijoiden Brown et ai. menetelmällä (J. Biol. Chem. 225: 4980-4983, 1980). 6 x 10^ faagitäplän seulonnalla saatiin tunnistetuksi yksi eriste, josta käytetään lyhennettä AVII2155, joka reagoi positiivisesti vasta-aineen kanssa.

Faagiklooni AVII2115 testattiin kahta muuta monoklonaalista anti-tekijä VII vasta-ainetta vastaan sekä tekijää VII vastaan vaikuttavaa kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan.

Eriste AVII2115 reagoi positiivisesti näiden kaikkien, tekijää VII vastaan vaikuttavien vasta-aineiden kanssa.

DNA preparoitiin kloonin XVII2115 maljalysaatista (Maniatis et ai., sivut 65-66, 1982). Tämän DNA:n pilkkominen entsyymillä EcoRI vapautti 2139 emäsparin pituisen istutteen. Tämä istute alikloonattiin Ml3-faagivektoreihin (Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983; sekä Norrander et ai., Gene 26: 101-106, 1983) ketjun päättävän DNA-järjestyksen määrittämiseksi dideoksi-menetelmallä (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5476, 1977). Tämä cDNA-istute sisältää Pstl-kohdat 100055 23 asemissa 214, 839 ja 1205 (merkitty kuvassa la lyhenteillä Pstla, Pstlb ja Pstlc, vastaavasti), sekä asemassa 611 sijaitsevan Smal-kohdan. Seuraavien M13-mallien ketjut määritettiin: 1) täysipituinen (2139 emästä) EcoRIa -> EcoRIb-kappale mallissa M13mpl8 (kutsutaan klooniksi F7-1); 2) Pstla -> EcoRIa-kappale, 214 emästä, mallissa M13mpl9 (F7-2); 3) Pstla -> Pstlb-kappale, 625 emästä, mallissa Ml3mpl8 (F7-3); 4) Pstlb -> Pstla-kappale, 625 emästä, mallissa Ml3mpl8 (F7— 7); 5) Smal -> Pstlb-kappale, 228 emästä, mallissa Ml3mplO (F7-8); 6) Pstlb -> Pstlc-kappale, 366 emästä, mallissa Ml3mpl8 (F7-9); 7) Pstlc -> Pstlb-kappale, 366 emästä, mallissa Ml3mpl8 (F7-10); 8) Pstlc -> EcoRIb-kappale, 930 emästä, mallissa Ml3mpl9 (F7-11); ja 9) EcoRIb -> EcoRIa täysipituinen kappale mallissa Ml3mpl8 (F7-12); (restriktiokohtien merkinnät ovat kuvan la mukaiset).

Tiedot vahvistivat molempien juosteiden ketjut koodaavan alueen osalta 91-prosenttisesti ja koodaamattoman 3'-alueen osalta 15-prosenttisesti, ja niistä saatiin yksijuosteiseen ketjuun liittyvää informaatiota koodaavan alueen jäljellä olevan 9 prosentin osalta sekä koodaamattoman alueen 85 prosentin osalta.

Verrattaessa toisiinsa cDNA-ketjun perusteella ennustettua aminohappoketjua ja tutkijoiden Kisiel ja McMullen julkaisemaa tietoutta tunnetusta aminohappoketjusta (Thrombosis Research 22 : 375, 1981) sekä jäljempänä esitettyä aminohappoketjua (esimerkki 2) todettiin poikkeavuutta, joka voidaan selittää kolmen nukleotidin puuttumisena DNA-ketjusta läheltä asemaa 400. Lisätietouden saamiseksi klooni XVII2115 pilkottiin EcoRI-entsyymillä, ja tekijää VII koodaava kappale istutettiin plasmidiin pUC13 (Vieira ja Messing, Gene _19: 259-268, 1982; sekä Messing, edellä), joka oli pilkottu EcoRI-entsyymi1lä.

Tuloksena oleva yhdistelmäplasmidi, josta käytetään nimitystä PUCVII2115, pilkottiin entsyymillä Xbal, joka katkaisee ketjun 100055 24 asemasta 328. Pilkottu näyte jaettiin kahteen osaan: puolet 32

merkittiin merkkiaineella a p dCTP ja DNA-polymeraasi1la I

(Klenow-f ragmentti ) (Englund, P.T., J. Mol. Bio. _66: 209, 3 2 1972); toinen puoli merkittiin merkkiaineella γ P ATP ja poly-nukleotidikinaasilla (Chaconas et ai., Biochem. BioDhys. Res.

Comm. 5_6: 962, 1975). Tämän jälkeen merkityt plasmidit pilkottiin uudestaan entsyymillä PstI, jolloin saatiin 113 ja 509 emäsparin pituiset kappaleet. Emäsjärjestys kummankin kappaleen molemmissa juosteissa selvitettiin tutkijoiden Maxam ja Gilbert menetelmällä (Meth. in Enzymology JM: 560, 1980). Järjestys 113 emäsparin kappaleessa selvitettiin kokonaisuudessaan ja 210 emäsparin järjestys selvitettiin 509 emäsparin pituisessa kappaleessa. Näissä järjestyksissä ilmeni kolme ylimääräistä emästä (yksi C ja kaksi G:tä), minkä perusteella DNA-ketjuun liittyvä tietous saatiin yhtäpitäväksi proteiini-ketjun järjestykseen liittyvän tietouden kanssa, mikä osoittaa, että edellä saadut poikkeavat tulokset johtuivat järjestyksen määrittämiseen käytetyn geelin kokoonpuristumisesta, jonka aiheutti G:t ja C:t käsittävä sekundäärinen rakenne. Samoin varmistuttiin järjestyksestä koodaavan alueen viimeisessä 9 prosentissa, molemmissa juosteissa.

PUCVII2115-.istutteen järjestyksen lisäanalyysi varmisti sen, että osa tästä kloonatusta kappaleesta koodasi 11 aminohapon muodostamaa ketjua, jonka tiedetään sijaitsevan tekijän VII pilk-koontumiskohdassa (Kisiel ja McMullen, Thrombosis Research 22: 375, 1981). Vertaamalla tätä ketjua tekijän IX (Davie et ai., edellä) ja tekijän X (Leytus et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 3699-3702, 1984) aminohappoketjuihin todettiin, että tämä klooni sisälsi ketjun tekijää VII varten, joka ketju alkaa suurin piirtein niistä nukleotideistä, jotka koodaavat tekijän VII muodostavan lopullisen proteiinin aminohappoa 36, ja ketju jatkuu suurin piirtein 1000 koodaavana ja 1100 koodaamattomana nukleotidinä, ja se käsittää edelleen poly-A-ketjun. Lisäksi todettiin, että tässä kloonissa esiintyy mutaationa lukukehyksen muutoksia koodaavassa 3'-osassa.

100055 25 Täsmällisen koodaavan 31-alueen saamiseksi seitsemän λgtll-cDNA-kirjaston kaikki 14 miljoonaa kloonia seulottiin täplä-hybridisaatiolla (Benton ja David, Science 196: 180-181, 1977) avoimen fosfodiesterisillan ("nick") kohdalta luettua, kloonin AVII2115 cDNArta käyttäen (Maniatis et ai., sivut 109-112, 1982).

Tämän jälkeen seitsemän positiivista eristettä seulottiin selvittämällä niiden pUC-plasmidien järjestys dideoksi-menetelmällä, joihin pUC-plasmideihin nämä cDNA-istutteet oli alikloonattu (Wallace et ai., Gene Γ6: 21, 1981). Xgtll-kloonit pilkottiin entsyymillä EcoRI, ja tekijään VII liittyvät kappaleet istutettiin plasmidiin pUC13, joka oli pilkottu entsyymillä EcoRI.

Yhtä lukuunottamatta niiden kaikkien todettiin alkavan asemasta, joka vastaa kloonissa AVII2115 olevan istutteen emästä 212; mainittu poikkeus käsitti pelkästään koodaamattoman 3'-ketjun.

Yksi näistä emäksen 212 kohdalta alkavista klooneista valittiin analyysiä varten, ja sille annettiin nimeksi klooni pUCVII1923.

Koska kloonin pUCVII2115 analyysi osoitti lukukehyksen muuntu- mismutaatioiden läsnäolon asemien 657 ja 815 välillä, niin klooni pUCVII1923 analysoitiin ensin tämän alueen suhteen käyttäen Maxam-Gilbert-menetelmää järjestyksen selvittämiseen.

Plasmidi pUCVII1923 pilkottiin entsyymillä Narl (asema 779 kuvassa 32 la). Leikattu DNA merkittiin merkkiaineella a P dCTP käyttäen DNA-polymeraasi a I (Klenow-fragmentti), ja se pilkottiin tämän jälkeen entsyymillä Aval (joka pilkkoo samasta kohdasta kuin entsyymi Smal kuvassa 1) sekä entsyymillä Taql (kohdasta 1059), jolloin saatiin 166 emäsparin suuruinen Narl-Aval-kappale ja 200 emäsparin suuruinen NarI-TaqI-kappale. Molempien järjestykset selvitettiin. C, joka puuttui plasmidistä pUCVII2115, löydettiin asemasta 697, ja toinen C, joka puuttui samoin plasmi-dista pUCVII2115, löydettiin asemasta 798.

Ketjun loppuosa plasmidin pUCVII1923 koodaavassa alueessa todettiin oikeaksi selvittämällä järjestys dideoksi-menetelmällä koko pUCVII1923-istutteen Ml3-alikloonissa. Lac-primeeriä ZC87 100055 26 (taulukko i) käytettiin järjestyksen selvittämiseen asemasta 212 (kuva la) asemaan 512; primeeriä ZC218 (CTCTGCCTGCCGAAC) käytettiin järjestyksen selvittämiseen asemasta 715 asemaan 1140 ja primeeriä ZC217 (ATGAGAAGCGCACGAAG) käytettiin järjestyksen selvittämiseen asemasta 720 asemaan 320.

Koska pUCVII2115-istute on oikea asemasta 13 (asemat 1-12 sisältävät keinotekoisen kytkijän) asemaan 695, ja pUCVII1923 on oikea asemasta 212 loppuun saakka, niin nämä kaksi jatkos-tettiin keskenään, jolloin saatiin molekyyli, joka on oikea asemasta 13 (kuva la) loppuun saakka. Sopiva, tässä jatkos-tamisessa käyttökelpoinen piste on asemassa 328 sijaitseva Xbal-kohta. Kuvassa la esitetään jatkostamalla saadun täsmällisen molekyylin järjestys.

Koska tekijään VII liittyvän täysipituisen kloonin saaminen on vaikeata cDNA-kloonaamalla, niin puuttuvan koodaavan ketjun ja välttämättömien, ylävirran puolella sijaitsevan prosessointiket-jun ja signaaliketjun saamiseksi käytettiin kolmea menettelytapaa. Ensimmäisenä menettelytapana oli saada tarvittava ketju ihmisen genomisesta DNA-kirjastosta tai seulomalla edelleen cDNA-kirjastoja. Toisena lähestymistapana oli välttämättömän koodaavan 5'-ketjun syntetoiminen, perustuen tekijän VII amino-happoketjuun liittyvään tietouteen (esimerkki 2), sekä K-vita-miinista riippuvaisia hyytymistekijöitä koodaavien geenien julkaistuihin ketjuihin (Kurachi ja Davie, edellä; sekä Davie et ai., edellä), ja sen liittäminen osaan tekijän IX esi-esiketjua (prepro). Kolmas menettelytapa perustuu tekijän VII ja tekijän IX aminopään alueiden toiminnalliseen homologisuu-teen. Näin ollen muodostettiin ketju, joka muodostui tekijän IX johtoketjua ja aminopään osaa koodaavista alueista. Se sulautettiin tämän jälkeen yhteen, asianmukaisesti suuntautuneena, tekijän VII osittaiseen cDNA:han.

Tekijän VII koko DNA-ketjun käsittävien DNA-ketjujen saamiseksi jäljellä oleva 5'-DNA-ketju yritettiin eristää. Tämä toteutettiin käyttämällä 0,3 kiloemäsparin suuruista 51-pään EcoRI-Xbal-kappaletta plasmidin AVII2115 cDNA-istutteesta, 100055 27 £ 2 x 10 faagia käsittävän cDNA-kirjaston seulomiseksi. Kirjasto muodostettiin käyttäen poly(A)-mRNA:ta HepG2-soluista, noudattaen tutkijoiden Gubler ja Hoffman menetelmän muunnosta (Gene 25: 263-269, 1983). RNA käänteiskopioitiin ensimmäisen cDNA-juosteen muodostamiseksi, mitä seurasi toisen juosteen synteesi DNA-polymeraasia I ja RNaasi H:ta käyttäen. EcoRI-metvloinnin ja Sepharose 6B-kolonnin läpi johtamisen jälkeen DNA-päät tehtiin epäreaktiivisiksi DNA-polymeraasi1la. EcoRI-kytkijät lisättiin ja ylimääräiset kytkijät poistettiin pilkkomalla EcoRI-entsyymillä, ja kromatografoimalla Sepharose CL 2B-kolonnilla. Välitilaan jäänyt DNA kerättiin ja ligatoitiin faagiin Agtll, joka oli pilkottu EcoRI-entsyymillä, ja käsitelty vasikan suolistosta saadulla fosfataasilla. DNA käsiteltiin asianmukaisesti ja se infektoitiin E. coli-kantaan Y1088. Lukuisia positiivisia täpliä todettiin, ja tämän jälkeen EcoRI-kappaleet alikloonat-tiin M13-faagivektoreihin järjestyksen selvittämiseksi dideoksi-menetelmällä, käyttäen joko yleistä Ml3-primeeriä tai tekijän VII spesifisiä oligonukleotidejä.

Näistä saatiin tekijän VII kolme uutta cDNA-kloonia, ja niiden järjestykset määritettiin täydellisesti. Näistä cDNA-ketjuista suurimman, joka on peräisin kloonista AVII2463, todettiin sisältävän tekijän VII koko koodaava ketju. Tämä klooni käsitti 35 nukleotidin pituisen, lukematta jäävän 5'-alueen, 180 nukleotidiä, jotka koodaavat 60 aminohaposta muodostuvaa johtoketjua, 1281 nukleotidiä, jotka koodaavat 406 aminohaposta muodostuvaa lopullista proteiinia, pysäytyskodonin, 1026 nukleotidin pituisen lukematta jäävän 3'-ketjun, sekä 20 emäksen pituisen poly(A)-hännän (joka alkaa asemasta 2463). Tämän cDNA-ketjun järjestys on täten saatu selvitetyksi kokonaisuudessaan molempien -V juosteidensa osalta. Verrattaessa sitä kahteen, aikaisemmin klooneista AVII2115 ja AVII1923 eristettyyn cDNA-molekyyliin todettiin, että klooni 1VII2463 sisältää ylimääräiset 321 nukleotidiä ylävirran puolella istutteesta, kloonissa AVII2115, sekä 519 nukleotidiä ylävirran puolella istutteesta, kloonissa AVII1923. Tekijään VII liittyvät, kloonin AVII2463 päällekkäin menevät ketjut ja nämä kaksi aikaisempaa cDNA-molekyyliä ovat yhtäpitävät, paitsi että kloonin 1VII2463 cDNA ei käsitä 100055 28 yksittäisten emästen häviämiä asemissa 1005 ja 1106, jotka todettiin kloonin AVII2115 cDNA-molekyylissä. Näin ollen klooni λνΐΙ2463 sisältää yhdessä ainoassa EcoRI-kappaleessa tekijän VII cDNA-molekyylin, joka koodaa tekijän VII johtoketjua ja lopullisen proteiinin ketjua.

Ylimääräinen cDNA, AVII565, eristettiin ja sen todettiin sisältävän tekijään VII liittyviä 5'-Dään ketjuja, mutta se oli pilkkoutunut koodaavista ketjuista. Sen 51-pää alkaa nukleotidista 9 (kuva Ib).

Verrattaessa täysipituiseen klooniin XVII2463 todettiin, että kloonista XVII565 puuttuu ketju, joka vastaa yhtä eksonin kaltaista aluetta johtoketjun sisällä. Kloonista XVII565 puuttuvat emäkset 100-165 (kuva Ib). Puuttuvat ketjut vastaavat täsmälleen yhtä eksonin kaltaista aluetta, verrattuna genomiseen järjestykseen liittyvään tietouteen (kuten esimerkissä III esitetään). Näin ollen kloonin XVII565 rakenne voi olla seurausta vaihtoehtoisista jatkostumistapahtumista johtoketjussa.

Kloonin AVII2463 koodaama johtoketju on poikkeuksellisen pitkä (60 aminohappoa) ja sen hydrofobisuusprofiili on hyvin erilainen verrattuna tekijään IX, proteiiniin C ja protrombiiniin.

Tämä johtoketju sisältää kaksi Met-jäännöstä, asemissa -60 ja -26. Käynnistyminen alkaa mitä todennäköisimmin ensimmäisestä Met-jäännöksestä, koska signaalipeptidei1le tyypillinen hydrofobinen alue seuraa asemassa -60 sijaitsevaa Met-jäännöstä, muttei asemassa -26 sijaitsevaa Met-jäännöstä. On mielenkiintoista todeta, että kloonista XVII565 puuttuvat ketjut, jotka vastaavat täsmälleen eksonin kaltaista aluetta genomisessa kloonissa, johtavat 38 aminohaposta muodostuvaan johtooeotidiin, jonka hydrofobisuusrakenne vastaa paremmin edellä mainittuja proteiineja.

29

1Ö00SS

Esimerkki 2

Aminohappojärjestys ihmisen tekijässä VII

Aminohappojärjestyksen selvittäminen ihmisen tekijässä VII oli toivottavaa oletettujen cDNA-kloonien identtisyyden varmistamiseksi, tekijään VII liittyvän cDNA:n järjestyksen osoittamiseksi, sellaisen informaation saamiseksi, joka informaatio mahdollistaa spesifisten oligonukleotidikoettimien synteesin cDNA-kirjaston ja genomisen kirjaston seulomiseksi 5'-ketjun sisältävien kloonien suhteen, sekä tekijän VII aminopään osaa koodaavan synteettisen kappaleen muodostamiseksi. Vaikka Kisiel ja McMullen ovatkin esittäneet aminohapDOjen järjestykseen liittyvää rajoitettua informaatiota, niin kuitenkin lisätietoja tarvitaan.

Puhdistettu ihmisen tekijä Vila (Kisiel ja McMullen, edellä) pelkistettiin ja karboksimetyloitiin menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Crestfield et ai., J. Biol. Chem. 238: 622, 1963. Karboksimetyloidun tekijän Vila kevyt ja raskas polypepti-diketju erotettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografisesti (HPLC), käyttäen käänteisfaasilla Micro Pak C18 täytettyä kolonnia (Varian Corp.) sekä gradienttiajoa, eluentin ollessa 0,1 % TFA tislatussa vedessä (A) ja 0,1 % TFA asetonitriilissä (B), ja gradientin ollessa 0-40 % B 5 minuutissa, 40-80 % B 25 minuutissa ja 80-100 % B 5 minuutissa. Suurin piirtein 300 pikomoo-lia kumpaakin peptidiketjua analysoitiin automatisoidun Edman-hajotuksen avulla, käyttäen kaasufaasiin perustuvaa analysaattoria Gas-Phase Protein Sequencer (Applied Biosystems, Inc.). Raskaan ja kevyen polypeptidiketjun aminopäistä tunnistettiin 18 ja 29 jäännöstä, vastaavasti. Aminopään järjestys tekijän Vila raskaassa ketjussa oli yhtäpitävä cDNA-kloonin PUCVII2115 koodaaman järjestyksen kanssa (kuva 2b). Kuvissa 2a ja 2b aminohappo jäännöksiä merkitään yksikirjaimisina koodeina, seuraavasti: A alaniini; C kysteiini; D asparatiinihappo; E glutaamihappo; F fenyylialaniini; G glysiini; H histidiini; I isoleusiini; K lysiini; L leusiini; M metioniini; N asparagiini; P proliini; Q glutamiini; R arginiini; S seriini; T treoniini; V väliini; 100055 30 W tryptofaani; Y tyrosiini; X tarkoittaa tuntematonta jäännöstä ja * tarkoittaa sitä, että Gla-jäännökset (γ) määritettiin selvitettävän rakenteen ja muiden tunnettujen hyytymistekijöiden rakenteen välisen homologisuuden perusteella, sekä perustuen siihen, että näistä asemista puuttui jokainen muu fenyylitio-hydratoin-aminohappo. Aukot (-) on sijoitettu siten, että ketjut saadaan parhaiten kohdistettua keskenään. Lisäksi saatu tietous osoitti, että asemissa viisi ja yhdeksän olevat aminohapot ovat lysiiniä eikä treoniini ja arginiini, vastaavasti, kuten aikaisemmin on esitetty (Kisiel ja McMullen, edellä). Tekijän Vila kevyen ketjun järjestyksen analyysi, joka alkoi tekijän VII aminopään alueesta, oli puutteellinen noin 6 jäännöksen osalta ollakseen päällekkäin menevä cDNA-kloonin pUCVII2115 5'-pään koodaaman rakenteen kanssa.

Järjestykseen liittyvän lisätietouden saamiseksi kaksi nano-moolia karboksimetyloitua kevyttä ketjua pilkottiin 12 tunnin ajan naudan kymotrypsiinillä (1:100 w/w, entsyymi:substraatti) 0,1 M ammoniumbikarbonaatissa, pH 7,8, 37°C:n lämpötilassa. Syntyneet kappaleet puhdistettiin HPLC-käsittelyllä, käänteis-faasilla Micro Pak C18 täytetyn kolonnin avulla, käyttäen edellä mainittuja liuottimia gradienttina 0-30 % B 5 minuutissa, 30-60 % B 25 minuutissa ja 60-80 % B 10 minuutissa. Peptidit tunnistettiin UV-absorptiostaan aallonpituudella 220 ja 280 nm. Lyo-filisoidut peptidit (kutakin noin 1 nanomooli) analysoitiin Edman,hajotuksella. Tulokset (kuva 2b) vahvistivat suuren osan cDNA-ketjun järjestyksestä kloonin pUCVIl2115 vastaavassa alueessa. Tekijän Vila kevyen peptidiketjun 152 jäännöksestä tunnistettiin yhteensä 113 (75 %). Tämä järjestys on identtinen tunnetun cDNA-rakenteen koodaaman järjestyksen kanssa. Epäsuorat havainnot osoittavat ,että Asn 145 on hiilihydraatin kiinnittymiskohta.

Esimerkki 3

Tekijän VII genomisen ketjun kloonaaminen

Yhdessä menetelmässä cDNA:sta puuttuvan 51-pään ketjun aikaansaamiseksi ihmissikiön maksasta peräisin olevaa DNA:ta sisältävää lambdafaagin kirjastoa (Lawn et ai., Cell 1_5: 1157-1174) seu- 100055 31 lottiin tekijään VII liittyvällä, avoimen fosfodiesterisillan kohdalta luetulla ("nick-translated") cDNA:lla. Osa genomi- sesta kirjastosta maljattiin E. coli-kannan LE392 (ATCC 33572) päälle, jolloin muodostui yhteensä 7,2 x 10° faagitäplää (Maniatis et ai., edellä, sivut 320-321). Faagitäplät adsorboi- 32 tiin maljoilta nitroselluloosaan ja hybridisoitiin P-merkityllä cDNArlla tutkijoiden Benton ja Davis esittämän menetelmän mukaisesti (Science 196: 180, 1977). Tällöin saatiin kahdeksan pesäkettä ja faagitäplät puhdistettiin.

5'-pään ketjut sisältävät genomiset kloonit tunnistettiin käyttäen tekijään VII liittyvän cDNArn (ÄVII2115) 5'-päästä peräisin olevaa DNA-kappaletta (EcoRI-Xbal, kuva 1) sekä tavanomaisia menetelmiä (Maniatis et ai., edellä). Näille faageille annettiin nimiksi 7ml, 7m2 ja 7m3. DNA preparoitiin näistä yhdistelmäfaageista ja niistä tehtiin alustavat, restriktioendo-nukleaaseihin liittyvät kartat. Faagia 7ml, jolla saatiin vahvin hybridisaatiosignaali, käytettiin täsmällisemmän restriktio-kartan muodostamiseen sekä EcoRI-Xbal-cDNA-ketjujen sijoittamiseen tässä kartassa Southern'in täplitysmenetelmää käyttäen (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975).

Jotta saataisiin määritetyksi se, sisältääkö faagi 7ml ne DNA-ketjut, jotka koodaavat aminopään aminohapot tekijän VII muodostavassa proteiinissa, faagi-DNA:n restriktiopilkkeistä saadut Southern'in täplät hybridisoitiin niiden oiigonukleoti-dien seoksella, joiden oligonukleotidien järjestykset oli johdettu aminohappojen järjestyksestä tekijän VII aminopäässä. Oligonukleotidit ZC188, ZC360 ja ZC401 (taulukko 1) merkittiin radioaktiivisesti T^-polynukleotidikinaasilla ja hybridisoitiin faagi-DNA-täpliin lämpötilassa, joka oli muutaman asteen alle niiden Tm-pistettä (Wallace, R.B., et ai., Nuc.Acids Res. 6: 3543-3557, 1979). Tämän analyysin tulokset osoittavat, että faagin 7ml Sstl-kappale sisälsi näihin oligonukleotideihin hybridisoituvia ketjuja. Tämä Sstl-kappale alikloonattiin faagi-vektoriin M13 DNA-ketjun järjestyksen analysoimiseksi. Tulokset, jotka saatiin käyttämällä oligonukleotidia ZC360 järjestyksen 100055 32 selvittämisprimeerinä, paljastivat suurin piirtein 60 nukleotidin pituisen alueen, joka vastasi proteiinin aminopään ketjusta saatuja tietoja.

Taulukko 1

Oligonukleotidi Ketjun järjestys

ZC87 TCC CAG TCA CGA CGT

ZC188 GCC GGG^ CTCA^ CTC CTC CA^ GAA GGC GTTGG

C A G

ZC212 GAC CTG CAG GAT CCA TGC AGC GCG TGA ACA TGA

TCA TGG

ZC213 GAG GCC TGG TGA TTC TGC CAT GAT CAT GTT CAC

GCG CTG

ZC217 ATG AGA AGC GCA CGA AG

ZC218 CTC TGC CTG CCG AAC

ZC235 GAT CCA TGC AGC GC

ZC249 AGA ACA GCT TTG TTC TTT CA

ZC275 GCC CCC ATT CTG GCA

ZC286 CCA AAG AGG GCC AAC GCC TTC CTG GAG GAG AGA

CCT GGG AGC CTG GAG AGA GAG TGT ATT GAG G

ZC287 AAT ACA CTC TCT CTC CAG GCT CCC AGG TCT CTC

CTC CAG GAA GGC GTT GGC CCT CTT TGG

ZC288 AGC AGT GTA GCT TCG AGG AGA ACA GAG AGG TTT

TCG AGG CCA GCG ACG

ZC289 AAT TCG TCG CTG GCC TCG AAA ACC TCT CTG TTC

TCC TCG AAG CTA CAC TGC TCC

ZC333 CAG CTT CGT CCT GTC GCT GGC CTC

ZC336 CCT CTT TGG GCC TGG TGA

ZC360 Ca£ TC£ TC£ Tc£ TT^ CA

ZC401 CGT AGC GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG GGC

CTC CTC GAA GCT ACA C

Koska genomisen kloonin 7ml tiedettiin sisältävän 7 kiloemäs-paria eksonin 2 suhteen ylävirran puolella sijaitsevia ketjuja, niin tämän kloonin oletettiin koodaavan tekijään VII liittyviä, 100055 33 lukematta jääviä 5'-ketjuja sekä johtoketjuja aminohappoasemaan -17 saakka. Sen varmistamiseksi, että eksoni 1 koodautuu geno-misen kloonin 7ml puitteissa, klooneista AVII2463 ja AVII565 saatua, johtoketjuun liittyvää informaatiota käytettiin hyväksi oligonukleotidejä ZC528 ja ZC529 (esitetty seuraavassa) muodostettaessa .

ZC528 5'tca aca ggc agg ggc agc act gca GAG ATT3’ ZC529 5 ' 3 '

TTC CAC GGC ATG TCC CGT GTT TCT CCT CCT

Näitä käytettiin faagin 7ml DNA:n koettimina, ja tällöin löydettiin aliklooni 7SD, joka hybridisoitui molempiin oligonukleo-tideihin. Eksonin 1 todettiin muodostuvan kahdesta eksoniketjus-ta: eksoni la, joka hybridisoitui oligonukleotidiin ZC528 (vastaa nukleotidejä 1-30 kloonissa AVII2463), sekä eksoni Ib, joka hybridisoitui oligonukleotidiin ZC528 (vastaa nukleotidejä 119-148 kloonissa AVII2463). Näitä molempia eksoneita la ja Ib reunustavien introniketjujen järjestykset on selvitetty: la sisältää jatkoksen yhtäpitävän luovuttajaketjun eksonin 3'-päässä, ja lb:tä reunustaa kummassakin päässä jatkoksen yhtäpitävä vastaanottajaketju (ylävirran puolella lbrstä) tai luovut-tajaketju (alavirran puolella lbrstä). Eksonin la asema genomi-sessa kloonissa 7ml on kartoitettu täsmälleen, kun taas eksonin Ib asema on kartoitettu määrätyn alueen sisäpuolelle. Eksonin Ib ketjut ovat läsnä kloonissa AVII2463, kun taas AVII565 vaikuttaa olevan peräisin eksonin la ja eksonin 2 väliin jatkostetusta RNArsta, Ib-eksoniketjun silmukoituessa ulkopuolelle.

Lukuisia 7ml aliklooneja valmistettiin pUC- ja Ml3-vektoreihin järjestyksen selvittämisen helpottamiseksi jäljellä olevista eksoneista. Eksoneita 1-7 vastaavien cDNA-ketjujen perusteella muodostettuja, asianmukaisia oligonukleotidejä käytettiin järjestyksen selvittämiseksi kaikista muista paitsi viimeisestä eksonista. Genominen ketju vastaa täsmälleen cDNA-ketjuja koko näissä alueissa. Lisäksi intronien ja eksonien väliset rajat eksonien 1-7 tapauksessa on määritetty, ja suurin osa on 100055 34 kartoitettu täsmällisesti kloonin 7ml puitteissa. Introneiden koot ja asemat tekijän VII geenin sisällä luetellaan taulukossa 2 .

Taulukko 2

Introni/eksoni-liitoskohdat tekijän VII geenissä

Introni Aminohappoasema Intronin koko _ _ (kiloemäsparia) A -39 >0,2 B -17 >1,0 C 37/38 1,92 D 46 0,068 E 84 2 F 131 1 G 167/168 0,56 H 209 1,31

Tiedetään, että faagista 7ml puuttuu eksonin 8 sisältävä tekijän VII 3'-pää. Näiden ketjujen saamiseksi plasmidissa AL47,1 olevan, 12-13 kiloemäsparilla rikastettuna BamHI-kirjaston (Loenen ja Brammer, Gene K): 249, 1980; Maniatis, et ai., edellä), joka oli saatu ihmisen ihon primääreistä fibroplasti-soluista , koettimena käytettiin kahta, avoimen fosfodiesteri-sillan kohdalta luettua, tekijään VII liittyvän cDNArn Pstl-kappaleita (jotka vastaavat eksonissa 7 olevia ketjuja sekä lukematta jääviä 3'-ketjuja). Molemmilla koettimilla saatiin ilmaistuiksi klooni, josta käytetään lyhennettä 7DC1. Tämän jälkeen restriktioendonukleaaseilla ja Southern'in täplitysmene-telmällä toteutetut analyysit osoittivat, että klooni 7DC1 sopii päällekkäin kloonin 7ml kanssa, ja ulottuu suurin piirtein 3 kiloemäsparia kloonin 7ml pään ylitse, ja että se sisältää eksonin 8. 3,9 kiloemäsparin suuruinen (Xbal-BamHI), eksonin 8 sisältävä kappale kloonin 7DC1 DNA:sta alikloonattiin vektoriin Ml3, ja järjestyksen analysointi toteutettiin oligonukleo-tideillä, jotka täydentävät sen 5'- ja 3'-päitä. Koko eksoni-ketju on läsnä tässä kloonissa.

35 100055

Esimerkki 4

Tekijää IX ja tekijää VII vastaavat hybridigeenit, jotka sisältävät syntetoidun koodaavan ketjun_ A. Hybridin muodostaminen, joka hybridi koostuu tekijän IX johtoketjusta ja tekijän VII synteettisestä koodaavasta 5'-ketjusta

Toinen vaihtoehto tekijään VII liittyvän koodaavan 5'-ketjun saamiseksi oli asianmukaisen kaksijuosteisen kappaleen syntetoi-minen käyttäen sellaista nukleotidijärjestystä, joka oli ennustettu tekijän VII aminopään aminohappojärjestyksen perusteella, muiden K-vitamiinista riippuvaisten hyytymistekijöiden aminohappojärjestyksen perusteella seka muiden, K-vitamiinista riippuvaisiin hyytymistekijöihin liittyvien geenien tunnettujen nukleotidiketjujen perusteella (Kurachi ja Davie, edellä: Anson et ai., EMBO J. _3: 1053-1060, 1984: sekä Davie et ai., edellä). Välttämättömien erittymis- ja orosessointisignaalien aikaansaamiseksi lopullisen tekijän VII analogin erittymistä varten tämä synteettinen kappale (yhtäpitävä ketju) liitettiin yhteen niistä kahdesta johtoketjusta, jotka olivat peräisin tekijään IX liittyvästä cDNA-kloonista. Tätä menettelytapaa havainnollistetaan kuvassa 3.

Ihmisen tekijää IX koodaava cDNA saatiin kirjastosta, joka oli valmistettu ihmisen maksasta peräisin olevaa mRNArta käyttäen (Kurachi ja Davie, edellä). Tekijää IX vastaava ketju eristettiin vektorista pBR322 pilkkomalla Pstl-entsyymillä, ja se istutettiin plasmidin pUC13 Pstl-kohtaan. Tästä plasmidista käytetään lyhennettä FIX-pUC13. Runsaasti G:tä sisältävän alueen, joka oli läsnä tekijään IX liittyvän istutteen 5'-päässä cDNA-kloonauksen seurauksena, poistamiseksi kloonatun kappaleen 5'-pää korvattiin synteettisellä oligonukleotidiadapto-rilla. Oligonukleotidit ZC212 ja ZC213 (taulukko 1) synte-toitiin ja kiinnitettiin toisiinsa 22 emäsparin suhteen päällekkäin menevän osan muodostamiseksi, kappaleen päät täytettiin ja se pilkottiin asianmukaisilla restriktioendonukleaa-seilla, ja tuloksena oleva kappale liitettiin tekijän IX ketjuun.

100055 36

Adaptorin muodostamiseksi 100 pikomoolia sekä oligonukleotidiä ZC212 että ZC213 lyofilisoitiin ja suspendoitiin uudestaan 10 mikrolitraan lOx kinaasi/ligaasipuskuria (600 mM Tris, pH 8,0, 100 mM MgC^, 100 nM DTT) sekä 86 ^ul vettä. Tämän kiinnittä-misreaktion (anneal) annettiin edetä 65°C:n lämpötilassa 10 minuuttia, seoksen annettiin jäähtyä hitaasti huoneen lämpötilaan ja se pantiin jäihin. Tähän seokseen lisättiin 4 ^ul 2,5 millimolaarista dNTP-seosta ja 1 ^ul (8 yksikköä) T^-DNA-polymeraasia. Reaktion annettiin edetä 45 minuuttia 14°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen siihen lisättiin 10 ^ul 5 M NH .0 Ac-liuos ta , ja DNA uutettiin kertaalleen fenolin ja CHCl_.:n seoksella, kahdesti kloroformilla CHCl^ ja saostettiin etanolilla. DNA sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudestaan 100 mikro-litraan keskimääräisesti suolaa sisältävää puskuria (Maniatis et ai., edellä, sivu 100), pilkottiin 9 yksiköllä Pstl-entsyy-miä ja 8 yksiköllä Cfol-entsyymiä, ja uutettiin kuten edellä.

Tekijän IX muunnettu ketju muodostettiin tämän jälkeen yhdistämällä keskenään 0,16 pikomoolia synteettistä Pstl-CfoI-adaptori-kappaletta, 0,14 pikomoolia plasmidista FIX-pUC13 saatua, 1,4 kiloemäsparin suuruista, tekijään IX liittyvää CfoI-BamHI-kappaletta, sekä 0,14 pikomoolia 2,7 kiloemäsparin suuruista vektorin pUC13 BamHI-Pstl-kaopaletta 20 mikrolitran tilavuise-na reaktiona, joka sisälsi 60 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT ja 0,9 yksikköä T^-ligaasia. Reaktiota inkuboitiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa ja sitä käytettiin sopivaan tilaan saatetun E. coli-kannan JM83 transformointiin (Messing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publication No. 79-99, 2, No. 2, 43-48, 1979). Solut maljattiin yhdessä 50 mikrolitran kanssa 2 % X-gal-liuosta (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-β-D-galaktosidi) L-ravintoalustan päälle, joka ravintoalusta sisälsi ampisilliinia pitoisuutena 40 ^ug/ml, ja inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa yön yli.. Valkoiset pesäkkeet siirrettiin toiselle maljalle, joka sisälsi ampisilliinia ja maljoja kasvatettiin 37°C:n lämpötilassa yön yli. Pesäkkeistä muodostettiin täplät Whatman 540-paperille, ja paperi esikäsitel-tiin hybridisaation edellyttämällä tavalla, käyttäen tutkijoiden Wallace et ai. menetelmää (Gene J_6: 21, 1981), paitsi ettei 1Q0055 menetelmässä käytetty yli yön kestävää inkubointia kloramfeniko- limaljoilla. Papereita inkuboitiin 44°C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan liuoksessa, joka sisälsi 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris- HCl pH 7,5, 6 mM EDTA, 0,5 % Nonidet P-40, 150 ,ug/ml E. coli 3 2 tRNA. Papereilla käytettiin koettimena P-merkittyä oligonukleo-tidiä (taulukko 1), joka on 14-meeri ja spesifinen muunnetulle 5'-pään ketjulle. Suodatinpaperia kohden käytetty radioaktii- g visuuden määrä oli 1-2 x 10 cpm, ja hybridisaatio toteutettiin 44°C:n lämpötilassa, esihybridisaation puskurissa, yön yli. Tämän jälkeen suodattimet pestiin kolmasti 4°C:n lämpötilassa liuoksessa 6 x SSC, 0,1 % SDS, sekä kolmasti 44°C:n lämpötilassa liuoksessa 2 x SSC, 0,1 % SDS, ja niiden annettiin vaikuttaa röntgensädefilmiin. Tällöin saatiin kaksi positiivista kloonia. Toiselle näistä klooneista annettiin nimeksi FIX (-G) -> pUCl3.

FIX(-G) -> pUC13-muodosteessa tekijään IX liittyvän muutetun alueen järjestyksen varmistamiseksi dideoksi-järjestyksen määrittäminen toteutettiin suoraan pUC-plasmidilla BRL-käänteis- primeeriä käyttäen, tutkijoiden Wallace et ai., 1981 (edellä) menetelmällä, ja käyttäen primeeriä, jonka pää oli merkitty poly- 32 nukleotidikinaasilla ja γ P-ATP:llä tutkijoiden Chaconas et ai. (edellä) menetelmällä. Järjestys vastasi odotuksia.

Tuloksena oleva yhdistelmäplasmidi sisältää kolme Haelll-pilkko-miskohtaa, ensimmäisen sijaitessa asemassa 39 tekijän IX ketjussa (numerointi perustuu tutkijoiden Anson et ai. (edellä) julkaisemaan järjestykseen, alkaen ensimmäisestä ATG-ryhmästä), toisen sijaitessa asemassa 130, ja kolmannen pUCl3-polykytkijäs-sä. Asemassa 130 oleva kohta on yksinkertainen emäspari, joka sijaitsee ylävirran puolella kodoneista tekijään IX liittyvän esiesimolekyylin (prepro) Lys-Arg-jakokäsittelykohtaa (proses-sointikohtaa) varten. Lopullisissa tekijää IX ja tekijää VII vastaavissa hybridimuodosteissa tekijän IX johtoketju, joka päättyy asemassa 3 9 tai 130, liitettiin synteettiseen kaksi juosteiseen kappaleeseen, joka käsittää ennustetun yhtäpitävän ketjun sekä tekijään IX liittyvän johtoketjun viimeiset 3 kodonia.

100055 38

Synteettinen yhtäpitävä kappale tuotettiin liittämällä oligo-nukleotidit ZC286-ZC289 (taulukko 1) kaksijuosteisen kappaleen muodostamiseksi. Sata pikomoolia kutakin oligonukleotidiä lyo-filisoitiin ja suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraa lx kinaa-sipuskuria, ja inkuboitiin yön yli 4°C:n lämpötilassa; ja kuumennettiin sitten lO minuutin ajan 65°C:n lämpötilassa. Kinasoi-tuja oligonukleotidejä käyttäen valmistettiin kaksi seosta.

Seos 1 sisälsi oligonukleotidit ZC286 + ZC287; seos 2 sisälsi ZC288 + ZC289. Yhdistettyjä pareja käsiteltiin 10 minuuttia 65°C:n lämpötilassa, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan 2 tunnin aikana ja laitettiin jäihin 30 minuutiksi.

Muunnettu tekijän IX kappale poistettiin kloonista FIX(-G) -> pUC13 Hindlll-EcoRI-kappaleena. Suurin piirtein 20 mikrogrammaa plasmid ia pilkottiin 30 yksiköllä sekä HindiII- että EcoRI-entsyy-miä 100 mikrolitrassa Hindlll-puskuria (BRL), joka sisälsi 4 mikrogrammaa RNaasia A, 37°C:n lämpötilassa. Reaktio päätettiin lämmittämällä reaktioseosta 65°C:n lämpötilassa 10 minuuttia, ja vektori- ja tekijä IX-kappaleita käsiteltiin elektrofo-reettisesti 1-prosenttista agaroosigeeliä käyttäen, ja ne puhdistettiin sähköeluutiolla. Tekijän IX kappale saostettiin etanolilla, suspendoitiin uudestaan puskuriin, joka sisälsi RNaasia A 400 ng/^ul, ja pilkottiin 9 yksiköllä Haelll-entsyy-miä yön yli 37°C:n lämpötilassa. Tästä pilkkeestä eristettiin 39 emäsparin suuruinen tekijään IX liittyvä Hindlll-Haelll-kappale elektroforeettisesti käyttäen 1,5-prosenttista agaroosigeeliä, ja sitten sähköistä eluutiota. Tekijään IX liittyvän 130 emäsparin suuruisen Hindlll-Haelll-kappaleen saamiseksi klooni FIX-pUC13 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Hindlll ja tekijään IX liittyvä kappale eristettiin kuten edellä. Suurin piirtein 3 ^ug tätä Hindlll-EcoRI-kaopaletta pilkottiin 6 yksiköllä entsyymiä Haelll 37°C:n lämpötilassa, ja tästä reaktio-seoksesta poistettiin näytteitä viiden minuutin välein 30 minuutin aikana, ja näytteet laitettiin liuokseen, joka sisältää 50 mM EDTA-happoa. Näytteet yhdistettiin ja 130 emäsparin suuruinen Hindlll-Haelll-kappale puhdistettiin elektroforeettisesti 5 prosenttista akryyliamidigeeliä käyttäen, mitä seurasi sähköinen eluutio.

39 10G055

Lopulliset, tekijään IX liittyvän ketjun ja yhtäpitävän ketjun muodostamat hybridit valmistettiin liittämällä keskenään neliosaisella ligaatiolla oligonukleotidien seokset 1 ja 2, tekijän IX Hindlll-Haelll-kappale (39 tai 130 emäsparia) sekä plasmidin pUC13 Hindlll-EcoRI-kappale. Tuloksena olevia plasmideja käytettiin E. coli-kannan HB191 (ATCC 33694) transformoimiseen. Pesäkkeiden seulonta toteutettiin pilkkomalla DNA entsyymeillä EcoRI ja Hindlll. Ketjusta, joka muodostuu synteettiseen yhtäpitävään ketjuun liittyneestä, 39 emäsparin pituisesta tekijän IX ketjusta, käytetään seuraavassa lyhennettä mini-FIX-FVII. Tämän muodosteen sisältävästä plasmidista käytetään nimitystä pM7200(-C). Ketjusta, joka muodostuu synteettiseen yhtäpitävään ketjuun liittyneestä, 130 emäsparin pituisesta tekijän IX ketjusta, käytetään lyhennettä maksi-FIX-FVII. Tämän muodosteen sisältävästä plasmidista käytetään nimitystä pM7lOO(-C). Yhtäpitävän ketjun koodaaman polypeptidin aminohappojärjestys on Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-Gla-Gla-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-Gla-Arg-Gla-Cys-Lys-Gla-Gln-Cys-Ser-Phe-Gla-Gla-Ala-Arg-Gla-Ile-Phe-Gla-Gly-Leu-Asn-Arg-Thr-Lys-Leu.

B. Tekijään IX liittyvän ketjun ja yhtäpitävän ketjun muodostavan hybridikappaleen liittäminen tekijän VII cDNA-klooniin Tekijään IX liittyvän ketjun ja yhtäpitävän ketjun muodostamat hybridit (joko mini tai maksi) liitettiin tekijän VII cDNA-kloo-nin 5'-osaan ja vektoriin pUCl3 kolmiosaisella ligaatiolla (kuvat 4 ja 5). Vektorikappale muodostettiin pilkkomalla 6 ^,ug plasmidia pUC13 kulloinkin 10 yksiköllä entsyymiä Xbal ja Hindlll Hindlll-puskurissa, joka sisälsi RNaasia A (400 ng/^,ul). Mini-FIX-FVII-kappale muodostettiin pilkkomalla 2 ^ug) plasmidia pM7200(-C) kulloinkin 10 yksiköllä entsyymiä Hindlll ja EcoRI, * kuten edellä. Maksi-FIX-FVII-kappale muodostettiin samalla taval la plasmidista pM7l00(-C). Tekijän VII cDNA-kloonin 5'-osa tuotettiin endonukleaaseilla Xbal ja EcoRI pilkkomalla plasmidista (pUCG705), joka käsitti plasmidin PUCVII2115 EcoRI-Xbal-rajoitteisen 5'-kappaleen plasmidiin pUC13 alikloonattuna. Pilkkomisreaktioiden annettiin edetä 37°C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan, ja tuotteet erotettiin elektroforeettisesti 1,5- 100055 40 prosenttisella agaroosigeelillä. Toivotut kappaleet eluoitiin sähköisesti, uutettiin fenolin ja kloroformin CHCl^ seoksella ja kloroformilla, ja saostettiin etanolilla. Tämän jälkeen saadut kolme kappaletta, pUC13/XbaI-HindIII, tekijä ix-tekijä VII (mini tai maksi)/Hindlll-EcoRI, ja 5' tekijä VII/EcoRI-Xbal, ligatoitiin 20 mikrolitrassa ligaasipuskuria, joka sisälsi 2 ,ul 20 mM ATP:tä ja 0,9 yksikköä T DNA-ligaasia, yön yli o ., 4 4 C:n lämpötilassa. Pesäkkeet seulottiin Hindin- ja Xbal- endonukleaaseilla toteutetulla restriktioanalyysillä. Mini- ja maksi-FIX-FVII-ketjut sisältävistä yhdistelmäplasmideista käytettiin nimityksiä pM7200 ja pM7100, vastaavasti (kuva 4).

Koska tekijän VII cDNA-kloonin valmistuksessa käytettiin kytkijän lisäystä, niin fuusioketjuihin oli tehtävä muunnoksia täsmällisten, kehyksen puitteissa koodaavien ketjujen aikaansaamiseksi. Sekä mini- että maksifuusiot sisältävät EcoRI-kohdan tekijään IX liittyvän ketjun ja yhtäpitävän ketjun muodostavan hybridin ja tekijän VII cDNA-kloonin välisessä liitoskohdassa, mikä on cDNA-kloonausprosessin aiheuttama muunnos. Lisäksi mini- fuusio edellyttää C:n lisäämistä Haelll-kohdan järjestyksen 5 ' 3 1 5 ' 3 1 muuttamiseksi muodosta AGGCCA muotoon AGGCCCA t ja oikean lukukehyksen aikaansaamiseksi alavirran puolelle tästä ketjusta. Nämä korjaukset tehtiin oligonukleotidillä ohjatulla, kohta-spesifisellä mutageneesillä, noudattaen olennaisesti tutkijoiden Zoller ja Smith kaksiprimeerimenetelmää (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). Mini-FIX-FVII-kappale poistettiin plasmidista pM7200 pilkkomalla entsyymeillä Hindlll ja Xbal, ja istutettiin malliin M13mpl9. Maksi-FIX-FVII-kappale puhdistettiin plasmidista pM7lOO ja alikloonattiin samalla tavalla. Mutageenisiä primeereitä ZC333 ja ZC336 (katso taulukko 1) käytettiin EcoRI-kohdan poistamiseen ja emäksen istuttamiseen, vastaavasti. Kummassakin tapauksessa yleisprimeeriä ZC87 käytettiin toisena primeerinä. Mutageeniset primeerit fosforyloitiin yhdistämällä 40 pikomoolia primeeriä ja 60 pikomoolia ATPrtä yhdellä yksiköllä T4 DNA-kinaasia yön yli 60°C:n lämpötilassa. EcoRI-kohdan poistamiseksi maksi-FIX-FVII-hybridistä 1 ^ug yksijuosteista M13-mallia yhdistettiin kulloinkin 20 oikomooliin primeeriä 100055 41 ZC333 ja ZC87, kokonaistilavuuden ollessa 10 .ui. Primeerien

O

annettiin kiinnittyä malliin 10 minuutin ajan 65 C:n lämpötilassa, jäähdytettiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, ja laitettiin jäihin 5 minuutiksi. Primeerejä jatkettiin DNA-polymeraasia I (Klenow-fragmentti) käyttäen. EcoRI-kohdan poistamiseksi ja lukukehyksen korjaamiseksi mini-FIX-FVII-hybridissä, 1 ^ug asianmukaista yksijuosteista M13-mallia yhdistettiin kulloinkin 20 pikomooliin orimeerejä ZC333, ZC336 ja ZC87. Kiinnittymisreaktio ja primeerin jatkaminen toteutettiin edellä esitetysti. Valitut faagitäplät seulottiin 3 2 P-merkityllä primeerillä (ZC333 tai ZC336) 60°C:n lämpötilassa, ja järjestykset varmistettiin dideoksi-selvityksen avulla. Tuloksena oleville, maksi- ja mini-FIX-FVII-ketjut käsittäville muodosteille annettiin nimiksi pM7111 ja pM7211, vastaavasti.

Yhtäpitävä ketju sisältää useita alueita, jotka eivät ole tekijän VII proteiiniketjun järjestyksestä saatujen tietojen (kuva 2) mukaisia. Polypeptidiä, jonka homologisuus tekijän VII aminopään osan suhteen on suurempi, koodaavan ketjun tuottamiseksi tätä yhtäpitävää ketjua muutettiin oligonukleotidillä ohjautuvan, kohta-spesifisen mutageneesin avulla. Muutoksina käytettiin Leu-jäännöksen istuttamista asemaan 8, asemassa 18 olevan Lys-jäännöksen korvaamista jäännöksellä Ile (numerot viittaavat aminohappojen asemiin asemaan 8 istuttamisen jälkeen), asemassa 26 olevan jäännöksen Ala korvaamista jäännöksellä Asn, sekä asemissa 32-34 sijaitsevan ketjun Gly-Leu-Asn korvaamista ketjulla Ala-Ser-Asp (perustuen aminohappojärjestyksestä saatuun yritteel-liseen tietouteen).

Ketjun muutokset asemissa 8 ja 18 toteutettiin käyttäen mallina muodostetta pM7111 (järjellinen juoste). Primeerit ZC352 (5< CCC AGG TCT CAG CTC CTC CAG3’) ja ZC353 (5' CTG CTC CTC CTT ACA CTC TCT ) kiinnitettiin malliin ja niitä jatkettiin edellä kuvatusti. Tuloksena olevasta faagikloonista käytettiin nimitystä pM7114. Istutteen järjestys kloonissa pM7114 määritettiin dideoksi-selvityksellä.

100055 42

Samalla tavalla, muutokset asemissa 26-34 toteutettiin mallilla pM71.14 (järjellinen juoste) käyttäen mutageenistä primeeriä ZC366 (5' CAG CTT CGT CCT GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG GGC CTC CTC GAA^ ), sekä toisena primeerinä ketjua ZC87 (kuva 1).

Tuloksena olevasta muodosteesta käytetään nimitystä pM7115.

Koko 550 emäsparin pituisen istutteen järjestys Ml3-vektorissa määritettiin dideoksiselvityksen avulla, ja se todettiin oikeaksi.

Esimerkki 5

Tekijään IX ja tekijään VII liittyvän cDNA-fuusion muodostamisien_

Tekijään IX ja tekijään VII liittyvän cDNA-fuusio valmistettiin käyttämällä tekijän IX cDNArta, joka oli saatu ihmisen maksan cDNA-kirjastosta tutkijoiden Kurachi ja Davie (edellä) kuvaamalla tavalla, sekä esimerkissä 1 kuvattua tekijän VII cDNA-ketjua.

Hybridiproteiinia varten valittu fuusiopiste sijaitsi tekijän IX aminohapon +38 (treoniini) ja tekijän VII cDNA-ketjun koodaaman ensimmäisen lysiinin välissä. Tällaista proteiinia koodaa ketju, joka käsittää ensimmäiset 252 emäsparia tekijän IX cDNA-ketjusta ja tekijän VII koko cDNA-ketjun muodosteesta PUCVII2115, kahta ensimmäistä kodonia lukuunottamatta. Tämän hybridiketjun muodostamiseksi tekijän IX ketju sulautettiin ensin yhteen muodosteen pUCVII2115 kanssa sopivia restriktiokohtia käyttäen. Tämä fuusio johti plasmidiin FIX/vn/12 (kuvataan jäljempänä), joka sisältää ensimmäiset 310 emäsparia tekijän IX cDNA:sta liittyneenä tekijän VII koko cDNA-ketjuun. Hybridipro-teiinille toivotun täsmällisen liitoskohdan aikaansaamiseksi häiritsevät emäsparit poistettiin oligonukleotidillä ohjautuvalla mutageneesillä.

Tekijän IX cDNA-ketjun liittäminen tekijän VII cDNA-ketjuun toteutettiin ligatoimalla 0,3 kiloemäsparin suuruinen Hindlll-Ahalll-kappale kloonista FIX(-G) -> pUC13 (esimerkki 4) 4,7 kiloemäsparin suuruiseen Smal-Hindlll-kappaleeseen muodosteesta PUCVII2115 (kuva 5). Hindlll-Ahalll-kappale saatiin pilkkomalla 100055 43 3 ^,ug kloonia FIX(-G) -> pUC13 40 yksiköllä endonukleaasia Hindlll 40 mikrolitrassa keskimääräisesti suolaista puskuria (Maniatis et ai., edellä), 37°C:n lämpötilassa 4 tunnin ajan. Tämän jälkeen tilavuus nostettiin 100 mikrolitraksi tällä suolapuskurilla, ja reaktioseokseen lisättiin 5 yksikköä entsyymiä Ahalll, ja inkubointia jatkettiin 37°C:n lämpötilassa 18 tuntia. DNA-kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 1-prosenttisella agaroosilla, ja 0,3 kiloemäsparia vastaava vyöhyke eristettiin edellä kuvatusti. Muodosteen pUCVII2115 osittainen Smal-pilke saatiin inkuboimalla 3 mikrogrammaa muo-dostetta pUCVH2115 25°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan yhdessä endonukleaasin Smal 4,8 yksikön kanssa, reaktion tilavuuden ollessa 30 ^ul. Reaktio pysäytettiin inkuboimalla reaktioseosta 15 minuutin ajan 65°C:n lämpötilassa. Näyte uutettiin tämän jälkeen kertaalleen yhtä suurella tilavuudella fenolia ja saos-tettiin etanolilla.

Saostuma otettiin talteen sentrifugoimalla sitä 10 minuuttia mikrofugissa, se huuhdottiin 70-prosenttisella etanolilla ja kuivattiin ilmassa. DNA liuotettiin uudestaan 30 mikrolitraan keskimääräistä suolapuskuria ja se pilkottiin 30 yksiköllä Hindlll-endonukleaasia 37°C:n lämpötilassa 3 tunnin ajan. DNA käsiteltiin elektroforeettisesti O,7-prosenttista agaroosia käyttäen, ja 4,7 kiloemäsparin suuruinen Hindlll-Smal-kappale eristettiin edellä kuvatusti. Ekvimolaarinen määrä näitä kahta kappaletta (0,048 pmol) ligatoitiin 10 mikrolitran tilavuisena reaktiona, sisältäen 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT, 1 mM ATP ja 3 yksikköä DNA-ligaasia, 14°C:n lämpötilassa 3,5 tunnin ajan, jonka jälkeen reaktioseosta käytettiin asianmukaisen E. coli RRI-kannan (ATCC 31343) transformoi-miseen. Soluja kasvatettiin ampisilliinimaljoilla ja 12 tuloksena olevista pesäkkeistä seulottiin restriktioentsyymeillä pilkkomalla toivotun plasmidimuodosteen läsnäolon selvittämiseksi . Pesäkkeen 12 DNA:lla (FIX/VII/12) saavutettiin odotettu käyttäytyminen restriktioentsyymeillä pilkottaessa, ja sitä käytettiin seuraavassa vaiheessa hybridigeenin muodostamiseen.

100055 44

Oligonukleotidilla ohjautuva mutageneesi suoritettiin yksijuos-teista DNA-mallia käyttäen. Täten oli välttämätöntä kloonata tekijään IX ja tekijään VII liittyvät, yhteensulautetut ketjut malliin M13mpl9. Sopivan pienen DNA-kappaleen saamiseksi FIX/VII/12-ketjusta eristettiin 640 emäsparin suuruinen Hindlll-Xbal-kappale. Tämä kappale sisältää 310 emäsoaria tekijään IX liittyvän cDNArn 5'-päästä ja 330 emäsparia tekijän VII ketjusta. Vektori valmistettiin pilkkomalla 1 mikrogramma M13mpl9 RF DNA:ta 20 yksiköllä entsyymiä Hindlll ja 20 yksiköllä entsyymiä Xbal 40 mikrolitrassa keskisuolaista puskuria, 37°c:n lämpötilassa 18 tunnin ajan. DNA käsiteltiin elektroforeetti-sesti 1,2-prosenttisella agaroosigeelillä ja lineaarinen 6,4 kiloemäsparin pituinen kappale eristettiin geelistä edellä kuvatusta. Viisi mikrogrammaa FIX/VII/12-DNA:ta pilkottiin 10 yksiköllä entsyymiä Xbal 40 mikrolitrassa keskisuolaista puskuria 37°C:n lämpötilassa 18 tunnin ajan. Reaktioseokseen lisättiin 20 yksikköä entsyymiä Hindlll, ja pilkkomista jatkettiin edelleen 37°C:n lämpötilassa 7 tunnin ajan. Tuloksena olevat kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 1,2-prosenttisella agaroo-silla, ja 640 emäsparin suuruinen kappale eluoitiin edellä esitetysti. Kymmenen nanogrammaa lineaariseksi tehtyä M13mpl9-ketjua ja 1 nanogramma 640 emäsparin suuruista kappaletta ligatoi-tiin 14°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja käytettiin tämän jälkeen asianmukaisen E. coli-kannan JM101 transformoimiseen (Messing, Meth. in Enzymology, edellä). Solut maljattiin X-gal:in ja IPTGrn kanssa (Messing, Meth. in Enzymology, edellä), ja kahdeksan vaaleansinistä bakteerikasvutonta täplää otettiin maljalta ja niillä infektoitiin E. coli-kannan JM103 2,5 milli-litran suuruisia viljelmiä, joiden absorbanssi Ag00 = 0,3.

Kun soluja oli kasvatettu 18 tuntia 37°C:n lämpötilassa, ne otettiin talteen sentrifugoimalla huoneen lämpötilassa klinikka-sentrifugilla, ja 20 ^ul suprenatanttia, joka sisältää M13-faagin, sekoitettiin etidiumbromidiin, jonka pitoisuus oli 10 ^ug/1. Tunnettuihin standardeihin verrattuna kukin kahdeksasta kloonista käsitti istutteen, jonka koko oli suurin piirtein oikea. Tämän jälkeen yksijuosteista DNArta valmistettiin 1,5 millilitrasta näitä suoernatantteja, tutkijan Messing esittä- 100055 45 mällä tavalla (Meth. in Enzymology, edellä). Järjestys tässä muodosteessa selvitettiin dideoksi-menetelmällä käyttäen oligonukleotidiä ZC87 primeerinä, millä varmistettiin se, että istutteen liitoskohta oli asianmukainen. Yhtä näistä asianmukaisista klooneista (no. 4) käytettiin mallina oligonukleoti-dillä ohjautuvassa mutageneesissä toiminnallisen tekijä IX-tekijä VII-fuusion tuottamiseksi.

Mutageenisena primeerinä käytettiin oligonukleotidiä ZC249, joka on 20-meeri ja joka käsittää 10 emäsparia toivotusta tekijän IX ketjusta ja 10 emäsparia toivotusta tekijän VII ketjusta (taulukko 1). Toisena primeerinä käytettiin oligonukleotidiä ZC87, joka hybridisoituu M13mpl9-ketjuun.

Mutageneesin toteuttamiseksi käytetty toimenpide oli muunnos tutkijoiden Zoller ja Smith (edellä) menetelmästä. Kiinnittämis-reaktiota varten 20 pikomoolia oligonukelotidiä ZC249 fosfory-loitiin inkuboimalla yön yli 4°c:n lämpötilassa 20 mikrolitran suuruisena reaktioseoksena, joka sisälsi 60 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 yksikkö T^-kinaasia. Reaktio pysäytettiin inkuboimalla seosta 15 minuuttia 65°C:ssa, ja näyte lyofilisoitiin . Yksi pikomooli mallina toimivaa yksijuosteis-ta kloonia no. 4 ja 20 pikomoolia oligonukleotidiä ZC87 lisättiin 10 mikrolitraan kiinnittämispuskuria (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 500 mM Nad, 10 mM DTT). Näytettä kuumennettiin 65 C:n lämpötilassa 10 minuuttia, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, ja laitettiin sitten jäihin. Seuraavaa liuosta valmistettiin 10 ^,ul, ja lisättiin näytteeseen: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTP, 1 mM ATP, 0,15 yksikköä/^ul T^ DNA-ligaasia, 0,25 yksikköä/^ul E. coli-bakteerin DNA-polymeraasia I (Klenow-fragmentti). Tämän jälkeen reaktioseosta inkuboitiin 15°C:n lämpötilassa 3 tuntia ja näytettä käytettiin asianmukaisen E. coli-kannan JM101 trans-formoimiseen (Messing, Meth. in Enzymology, edellä).

Tuloksena olevat faagitäolät siirretttiin nitroselluloosalle ja 3 2 seulottiin hybridisoimalla P-merkittyyn oligonukleotidiin 100055 46 ZC249. Agarmaljan päälle laitettiin kuivia BA85-suodattimia (Schliecher & Schuell, 0,45 ^um), ja faagin annettiin adsorboitua 5 minuuttia. Suodattimet poistettiin ja annettiin kuivua 5 minuuttia, laitettiin Whatman 3MM-oaperin päälle, kyllästettiin 0,5 M NaOH- ja 1,5 M NaCl-1iuoksella 5 minuuttia, kuivattiin ilmassa 3 minuuttia, laitettiin Whatman-paperin päälle, kyllästettiin IM Tris-HCl pH 8, 1,5 M NaCl sisältävällä liuoksella 5 minuuttia, ja kuivattiin ilmassa 3 minuuttia. Tris-HCl-vaihe toistettiin ja suodattimet huuhdottiin 100 millilitralla 6 x SSC-liuosta 2 minuuttia huoneen lämpötilassa. Ilmassa kuivaamisen jälkeen suodattimia lämpökäsiteltiin 80°C:n lämpötilassa 2 tuntia ja esihybridisoitiin 47°C:n lämpötilassa (oligonukleo-tidin ZC249 T^-40) yön yli liuoksessa, jonka koostumus oli 6,7 x SSC pH 6,5, 2 mg/ml E. coli tRNA ja kulloinkin 0,2 % (w/v) BSA, Ficoll ja polyvinyylipyrrolidiini.

Esihybridisointivaiheen jälkeen suodattimia inkuboitiin merkityn oligonukleotidin ZC249 kanssa määränä 2,5 x 10^ cmp/suodatin, samassa SSC-hybridisaatiopuskurissa 47°C:n lämpötilassa yön yli. Hybridisaation jälkeen suodattimet pestiin kolmasti, kulloinkin 5-10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa 6 x SSC-puskurissa, ja niiden annettiin vaikuttaa röntgensädefilmiin. Oletettavasti positiiviset faagitäplät maljattiin uudestaan ja seulottiin edellä esitetysti. Tämän jälkeen erillisiä faagitäpliä otettiin talteen, ja yksijuosteista DNA:ta valmistettiin ja sen järjestys määritettiin käyttäen oligonukleotidiä ZC275 primeerinä. Oligo-nukleotidi ZC275 vastaa ketjua, joka on 40 emäsparia oligonukleo-tidistä ZC249 5'-suuntaan samassa juosteessa (taulukko 1).

Neljä positiivista faagitäplää tunnistettiin. Yhden kloonin (FIX/VII-9) mallissa M13mpl9 olevan koko istutteen järjestys määritettiin dideoksimenetelmällä, oligonukleotidejä ZC87 ja ZC275 käyttäen, ja se todettiin oikeaksi. Kuvassa 7 emäkset 1-567 esittävät tätä järjestykseltään varmistettua ketjua.

Tämän jälkeen tästä kloonista saatua RF DNA:ta käytettiin hybri-digeenin muodostamisen viimeisessä vaiheessa.

100055 47

Kolmea kappaletta käytettiin lopullisen muodosteen aikaansaamiseksi: 0,6 kiloemäsparin suuruinen Hindlll-Xbal-kappale yhteensulautuneet IX/VII-ketjut sisältävästä kloonista FIX/VII-9; 1,7 kiloemäsparin suuruinen, tekijään VII liittyvän cDNA-kloonin Xbal-BamHI-kappale muodosteesta pUCVII1923; sekä 2,7 kiloemäsparin suuruinen BamHI-Hindlll-kappale muodosteesta pUCl3. Kolme ^ug kloonia FIX/VII-9 (RF DNA) pilkottiin 37°C:n lämpötilassa 6 tuntia 45 yksiköllä Xbal, tilavuuden ollessa 50 ^ul. DNA saostettiin etanolilla, suspendoitiin uudestaan ja pilkottiin 37°C:n lämpötilassa 4 tunnin ajan 50 yksiköllä entsyymiä Hindlll. Näyte käsiteltiin elektroforeettisesti 1-prosent-tista aqaroosia käyttäen, ja 0,6 kiloemäsparin vyöhyke elxioi-tiin sähköisesti NA45-paperille (Schliecher & Schuell). DNA eluoitiin paperilta liuoksella, jonka koostumus oli 1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla.

Jäljellä olevan,teki jään VII liittyvän cDNA-ketjun saamiseksi 5 ^ug muodostetta pUCVII1923 pilkottiin 37°C:n lämpötilassa 3 tuntia 36 yksiköllä entsyymiä Xbal 40 mikrolitrassa keskisuo-laista puskuria. Tämän jälkeen reaktioseokseen lisättiin 8 ^ul lOx korkeasuolaista puskuria, 28 ^,ul H^O ja 4 ^ul (40 yksikköä) entsyymiä BamHI, ja reaktioseosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 3 tuntia. DNA-kappaleet erotettiin elektroforeet-tisesti 1-prosenttisella aqaroosilla, ja 1,7 kiloemäsparin kappale eristettiin edellä kuvatusti.

Vektorikappale valmistettiin pilkkomalla 1 ^,ug muodostetta pUCl3 10 yksiköllä entsyymiä Hindlll 20 mikrolitrassa keskisuo-laista puskuria 37°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen reaktioseokseen lisättiin 2 ^,ul lOx korkeasuolaista puskuria ja 10 yksikköä entsyymiä BamHI, ja inkubointia jatkettiin edelleen 2 tuntia. DNA puhdistettiin 1 % agaroosigeelillä, kuten edellä esitetään.

Ekvimolaariset määrät (suurin piirtein 0,56 pikomoolia) kutakin kolmea kappaletta ligatoitiin huoneen lämpötilassa 45 100055 48 minuutin ajan 10 mikrolitrassa liuosta, joka käsittää 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP ja 3 yksikköä DNA-ligaasia, Tätä reaktioseosta käytettiin sopivan E. coli-kannan JM83 transformoimiseen. Solut maljattiin alustalle, joka sisälsi ampisilliinia pitoisuutena 40 ^ug/ml, ja kullekin maljalle oli lisätty 50 ^,ul 2 % X-gal-liuosta. DNA otettiin talteen seitsemästä valkoisesta pesäkkeestä ja seulottiin restriktioentsyymeillä pilkkomalla. Yhdestä oikealla tavalla käyttäytyvästä kloonista käytetään nimitystä FIX/VII -> pUC13.

Esimerkki 6

Tekijän VII biologisesti aktiivisten analogien ilmentäminen Nisäkässolujen iImentämisvektori pD2 valittiin FIX/VII-geenin ilmentämiseksi transfektoiduissa eläinsoluissa. Se muodostettiin plasmidista pDHFR-III (Berkner ja Sharp, Nuc. Acids Res. _13_: 841-857, 1985 ) seuraavasti: muodosteessa pDHFR III DHFR-cDNArhan rajoittuva Pstl-kohta muunnettiin BamHI-kohdaksi tavanomaisesti kytkijäketjujen avulla (Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W. Riggs, A.D., ja Itakura, K., Science 196: 177-180, 1977). pDHFR III-DNA:ta inkuboitiin liuoksessa, joka käsitti 10 mM Tris pH 7,6, 6 mM g-MHS, 6 mM NaCl, 10 mM MgC^ ja 2,5 yksikköä entsyymiä PstI, 10 minuutin ajan 37°C:n lämpötilassa, mitä seurasi fenolilla uuttaminen ja etanolilla saosta-minen. Tarttuvat Pstl-päät (koheesiopäät) tehtiin epäreaktiivi-siksi (blunt) päiksi T^ DNA-polymeraasia käyttäen. Sen jälkeen, kun DNA oli uutettu fenolilla ja dialysoitu liuosta vastaan, joka liuos käsitti 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,3 M NaCl,

DNA saostettiin etanolilla. DNA suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraan liuosta, joka käsitti 1,4 mM ATP, 50 mM Tris pH

7,6, lO mM MgC^, 1 mM ditiotreitolia, ja tämän jälkeen sitä inkuboitiin 12 tunnin ajan, 12°C:n lämpötilassa, seoksessa, joka käsitti 5 ng T^-polymikleotidikinaasilla käsiteltyjä BamHI-kytkijöitä (New England Biolabs) sekä 200 yksikköä T^-polynukleotidiligaasia, mitä seurasi fenolilla uuttaminen ja etanolilla saostaminen. DNA pilkottiin 90 yksiköllä entsyymiä BamHI 37°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, mitä seurasi elektroforeesi 1,4 % agaroosigeelin läpi. 4,9 kiloemäsparin 100055 49 suuruinen DNA-kappale (vastaa pDHFR III DNA:ta, josta puuttuu DHFR cDNA ja SV40 polyadenylaation signaali) eluoitiin sähköisesti ja tehtiin jälleen rengasmaiseksi polynukleotidiligaa-silla, ja transfektoitiin tämän jälkeen E. coli-kantaan HB101. Ampisilliinille herkät pesäkkeet seulottiin nopean preparatiivi-sen analyysin avulla (Birnboim, H.C., ja Doly, J., Nucleid Acids Research 1_: 1513-1523, 1979), ja oikeata kloonia kasvatettiin plasmidi-DNA-preparaatin tuottamiseksi suuressa mitassa.

Tuloksena oleva plasmidi katkaistiin 20 yksiköllä entsyymiä BamHI ja käsiteltiin 2,5 mikrogrammalla vasikan suolistosta saatua fosfataasia, ja käsiteltiin elektroforeettisesti 1,4 % agaroosigeeliä käyttäen. 25 mikrogrammaa muodostetta pSV40 (viruksen SV40 DNA-klooni, joka on istutettu plasmidin pBR322 BamHI-kohtaan) pilkottiin 25 yksiköllä entsyymiä Bell 1 tunnin ajan 50°C:n lämpötilassa, mitä seurasi entsyymin BamHI 25 yksikön lisääminen, ja inkubointia jatkettiin 1 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen tämä DNA käsiteltiin elektroforeettisesti 1,4 % agaroosigeelillä. Entsyymillä BamHI-leikattu vektori (eli vektori, josta puuttuu polyadenylaation signaali) liitettiin viruksen SV40 DNA-kappaleeseen /0,14-0,19 karttayk-sikköä (Tooze, J., toim., "DNA Tumor Viruses, Molecular Biology of Tumor Viruses"^/, joka sisältää polyadenylaation myöhäisen signaalin, inkuboimalla geelin avulla puhdistettuja kappaleita (kutakin 0,1 ^ug) 4 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa, 20 mikrolitrassa liuosta, joka käsittää 50 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolia, 1,4 mM ATP ja 100 yksikköä T^-polynukleotidiligaasia, mitä seurasi transformointi E. coli-kantaan RRl. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin nopealla DNA-valmistuksen analyysillä, ja oikean DNA:n, pD2, plasmidi-valmistetta tuotettiin suuressa mitassa.

Tekijän IX/VII ilmentämismuodosteen valmistamiseksi 1 ^ug plasmidia pD2 pilkottiin 37°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan 20 yksiköllä entsyymiä BamHI 20 mikrolitrassa korkeasuolaista puskuria. 20 mikrolitraa liuosta, joka käsitti 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA ja 0,1 yksikköä vasikan alkalista 100055 50 fosfataasia (Boehringer), lisättiin tämän jälkeen. Reaktio-seosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, ja reaktio pysäytettiin lämmittämällä seosta 10 minuuttia 75°C:n lämpötilassa, 10 yug kloonia FIX/VII -> pUC13 pilkottiin 37°C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan 150 yksiköllä entsyymiä BamHI, 150 mikrolitrassa korkeasuolaista puskuria. DNA-kappaleet erotettiin elektroforeettisesti 1,2 % agaroosigeelillä, ja 2,3 kiloemäsparin kappale eristettiin. Ekvimolaariset määrät (0,015 pikomoolia) 2,3 kiloemäsparin suuruista BamHI-kappalet-ta ja pD2-vektorin kappaletta ligatoitiin 14°C:n lämpötilassa 2,5 tunnin ajan edellä esitetysti. Reaktioseosta käytettiin E. coli-bakteerin RRl-solujen transformoimiseen, ja nämä solut maljattiin tämän jälkeen ampisilliinia pitoisuutena 10 ^ug/ml sisältävälle alustalle. Plasmidi-DNA otettiin talteen kahdestatoista tuloksena olevasta pesäkkeestä, ja seulottiin restriktio-entsyymeillä pilkkomalla. Yhdestä näistä klooneista, jotka pilkkoutuvat entsyymeillä toivotulla tavalla, käytettiin nimitystä FIX/VIIpD2 (kuva 6). Kloonilla FIX/VII/pD2 transformoitu E. coli-kanta RR1 on tallennettu kantakokoelmaan ATCC tunnusnumerolla 53068.

Menetelmä, jota käytettiin nuoren hamsterin munuaisista (BHK) saatujen solujen (saatavana kantakokoelmasta American Type Culture Collection, tunnusnumero CCL10) transfektoimiseen kloonilla FIX/VII/pD2, oli julkaistujen menetelmien kaltainen (esimerkiksi Wigler et ai., Cell 1_4: 725, 1978; Corsaro ja Pearson, Somatic Cell Genetics Ί_: 603, 1981; Graham ja Van der Eb, Virology 5_2 : 456, 1973 ). BHK-soluja kasvatettiin 37°C:n lämpötilassa, 5 % C02-ilmakehässä, Dulbecco-alustalla (johon oli lisätty 10 % lämmöllä inaktivoitua sikiöasteisen vasikan seerumia, ja jota oli täydennetty glutamiinilla ja penisilliini-streptomysiinillä), 60 mm suuruisissa kudosviljelmille tarkoi-tetxiissa petrimal joissa, kunnes yhteenkasvamisasteeksi oli saatu 20 %. Yhden 60 millimetrin suuruisen maljan transfektoimiseen käytettiin yhteensä 10 ^ug DNA:ta: 3,75 ^,ug kloonia FIX/VII/pD2, 1,25 ^ug pKO-neo-DNA:ta (Southern ja Berg, J. Mol. Appi. Genet. 1^: 327-341, 1982) sekä 5 ^uq lohen sperman DNArta.

100055 51 DNA:t seostettiin 0,3 M NaOAc-liuoksella, 75 % etanolissa, huuhdottiin 70-prosenttisella etanolilla ja liuotettiin uudestaan 20 mikrolitraan liuosta, joka käsittää 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. DNA lisättiin seokseen, joka käsitti 440 ,ul Ho0 ja 500 ,ul 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHPO,, 12 mM dekstroo-siä, 50 mM HEPES pH 7,12. Edellä mainittuun seokseen lisättiin 60 ^ul 2 M CaC^-liuosta pisaroittain, ja liuoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Tämän jälkeen tämä liuos lisättiin soluihin, ja solut siirrettiin jälleen 37°C:n lämpötilaan 4 tunniksi. Alusta poistettiin ja 5 ml 20-prosenttis-ta DMSO-liuosta seerumia sisältävässä Dulbecco-alustassa lisättiin huoneen lämpötilassa 2 minuutiksi. Malja pestiin tämän jälkeen nopeasti vaihtamalla alusta kahteen kertaan, ja sitä inkuboitiin yön yli uudessa alustaerässä. Kun DNA-lisäyksestä oli kulunut 24 tuntia, alusta poistettiin ja maljaan lisättiin selektiivistä alustaa (10 mg/ml G418, 498 ^,uq/mq Gibco, seerumia sisältävässä Dulbecco-alustassa). 10 ja 13 vuorokauden kuluttua erilliset kloonit, joiden edustamiin soluihin oli sisältynyt pKO-neo-qeeni ja jotka kykenivät täten vastustamaan G418:tä, siirrettiin 96-koloisille (tai 24-koloisille) levyille ja niitä kasvatettiin proteiinien määrittämistä varten.

Soluja kasvatettiin 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia käsittävällä Dulbeccorn alustalla, joka lisäksi sisälsi 5 ^,ug/ml K-vitamiinia (Phytonadione, Merck). Alusta erotettiin soluista ja solujätteistä sentrifugoimalla, ja siitä määritettiin tekijän VII polypeptidi (ELISA-menetelmällä) sekä biologinen aktiivisuus. Solut poistettiin levyiltä trypsiinillä, pestiin uudella erällä alustaa, sentrifugoitiin ja pakastettiin -20°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen solukasaumat sulatettiin PBS-liuoksessa, sentrifugoitiin uudestaan ja suspendoitiin uudestaan PBS-liuokseen, joka sisälsi 0,25 % Triton X-100-tuotetta. Näytteet laimennettiin ja niistä määritettiin polypeptidi ja aktiivisuus.

Tekijän VII ELISA-määritys suoritettiin seuraavasti: Kahta sataa mikrolitraa ihmisen tekijää VII vastaan vaikuttavaa 100055 52 monoklonaalista vasta-ainetta (5 ^ul/ml 0,1 M Na2C03-liuoksessa, pH 9,6) inkuboitiin 96-koloisen mikrotiitterilevyn kussakin kolossa 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen koloissa inkuboitiin 220 ^ul 1 % naudan seerumin albumiinia (BSA) ja 0,05 % Tween 20-tuotetta PBS-1iuoksessa, pH 7,2, 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa. Levyt huuhdottiin vedellä, kuivattiin ilmassa, ja niitä säilytettiin 4°C:n lämpötilassa. Näytteiden määrittämiseksi 200 mikrolitraa näytettä inkuboitin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa kussakin vasta-aineella päällystetyssä kolossa. Tämän jälkeen kolot huuhdottiin neljään kertaan 200 mikrolitralla PBS-liuosta, joka sisältää 0,05 % Tween 20-tuotetta. Sitten koloissa inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 200 mikrolitraa IgG-fraktiota kaniinin polyklonaalises-ta, tekijää VII vastaan vaikuttavasta antiseerumista (5 ^ug/ml PBS-liuoksessa, joka sisältää 1 % BSA:ta ja 0,05 % tuotetta Tween 20). Tämän jälkeen koloissa inkuboitiin alkaliseen fosfa-taasiin kytkettyä vuohen anti-kaniini IgG:tä. Sitten kolot huuhdottiin neljästi PBS-liuoksella, joka sisälsi 0,05 % tuotetta Tween 20. Koloihin lisättiin 200 ^,ul p-nitrofenyylifosfaattia (30 mg), joka oli liuotettu 56 mg/1 MgCl2 sisältävään dietanoliamiini-puskuriin (96 ml/1), pH 9,8. Entsyymireaktio toteutettiin 37°C:n lämpötilassa ja keltaisen värin kehittymistä seurattiin aallonpituudella 405 nm käyttäen ELISA-levyjen mittauslaitetta. Solualustoi1la saadut tulokset esitetään taulukossa 3.

Tekijän VII biologinen aktiivisuus määritettiin yksivaiheisella hyytymiskokeella, jonka Quick kuvaa julkaisussa (Hemorragic Disease and Thrombosis, toinen painos, Leat Febiger, Philadelphia 1966). Solualustoilla saadut tulokset esitetään taulukossa 3.

100055 53

Taulukko 3

Vrk Soluja/ml Tekijä VII Tekijä VII

10-4) polypeptidi, ng/ml aktiivisuus (ng/ml) 1 2 9 2'7 25 6,0 2 1,9 2,8 47 15,9 3 1,96 2,26 160 93 4 4,71 4,14 550 300 5 8,79 11,28 725 531 6 5,1 8,4 975 600

Esimerkki 7

Tekijän IX ilmentäminen

Neljätoista ^ug kloonia FIX(-G) -> pUC13 pilkottiin 30 yksiköllä entsyymiä BamHI 30 mikrolitrassa korkeasuolaista puskuria 3 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa. Sitten DNA käsiteltiin elektro-foreettisesti 1 % agaroosigeeliä käyttäen, ja tekijää IX vastaavan ketjun sisältävä 1,4 kiloemäsparin vyöhyke eristettiin geelistä.

Kolme mikrogrammaa vektoria pD2 pilkottiin 30 yksiköllä entsyymiä BamHI 30 mikrolitrassa korkeasuolaista puskuria 3 tunnin o ajan 37 C:n lämpötilassa. DNA käsiteltiin elektroforeettisesti 1 % agaroosigeelillä ja lineaarinen 1,5 kiloemäsparin suuruinen kappale eristettiin. Tämän jälkeen DNA:ta käsiteltiin 0,12 yksiköllä vasikan alkalista fosfataasia 30 minuuttia 37°C:n lämpötilassa, 30 mikrolitrassa liuosta, joka käsitti 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. Suolapitoisuudeksi asetettiin 0,3 M NaOAc ja näyte uutettiin kahdesti fenolilla, kerran kloroformilla ja DNA saostettiin etanolilla. Kasauma huuhdottiin 70 % etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin uudestaan 20 mikrolitraan liuosta, joka käsitti 10 mM Tris-HCl oH 8, 1 mM EDTA. Ekvi- molaariset määrät (0,02 pikomoolia) näitä kahta kappaletta 100055 54 ligatoitiin 10 yksiköllä T^-DNA-1igaasia, kuten edellä esitetään. Reaktioseosta käytettiin E. coli-kannan RRl solujen trans-formoimiseen. Kahdestatoista tuloksena olevasta ampisillii-nille vastustuskykyisestä pesäkkeestä talteenotettu DNA seulottiin restriktioentsyymeillä pilkkomalla. Yhdestä näistä klooneista, joissa 1,4 kiloemäsparin suuruinen kappale oli saatu istutetuksi oikealla tavalla suuntautuneena, käytettiin nimitystä FIX(-G)/pD2. Kloonilla FIX(-G)/pD2 transformoitu E. coli-kanta RRl on tallennettu kantakokoelmaan ATCC tunnusnumerolla 53067.

BHK-solut transfektoitiin samanaikaisesti sekä kloonilla FIX(-G)/pD2 että pKO-neo-plasmidilla, kuten edellä esitetään. Lääkeaineelle vastustuskykyiset solut valikoitiin ja esikäsitel-tiin ELISA-määritystä ja aktiivisuusmääritystä varten, kuten esimerkissä 6 esitetään.

Biologisen aktiivisuuden määritysmenetelmä perustuu tekijän IX kykyyn lyhentää potilaista, joilta tekijä IX puuttuu, saadun plasman hyytymisaika normaaliksi. Määritys toteutettiin menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Proctor ja Rapaport, Amer. J. Clin. Path. 3^6: 212, 1961. Tulokset esitetään taulukossa 4.

100055 55

Taulukko 4

Vrk Soluja/ml Tekijä IX Tekijä IX % aktiivista (x io-^) polypeDtidi aktiivisuus proteiinia (ng/ml) (ng/ml) supernatan- superna- kasauma supernatan- tissa_ _ _ tantti _ tissa_ 1 1,65 - 2 2,66 57 20 27 50 % 45 20 24 3 9,69 150 60 72 58 % 120 60 84 4 14,79 475 160 198 50 % 225 140 150 5 50,85 875 250 408 45 % 1000 260 438

Tekijää IX vastaavan polypeptidin määrä määritettiin ELISA-menetelmällä, olennaisesti esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, käyttäen tekijää IX vastaan vaikuttavaa, polyklonaalista kaniinin antiseerumia. Sen jälkeen, kun koloissa oli inkuboitu tekijää IX sisältäviä näytteitä, kolot huuhdottiin ja niissä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 200 ^ul alkali-seen fosfataasiin konjugoitua, affiniteetin perusteella ouhdis-tettua kaniinin polyklonaalista anti-tekijää IX, laimennettuna 1:1000 PBS-liuokseen, joka sisältää 1 % BSA ja 0,05 % tuotetta Tween 20. Sitten kolot huuhdottiin neljästi 0,05 % tuotetta Tween 20 sisältävällä PBS-liuoksella, ja koloihin lisättiin entsyymi- substraattia, kuten edellä. Koloja inkuboitiin 4°C:n lämpötilassa yön yli tai 37°C:n lämpötilassa 2 tuntia.

Kuten taulukosta 4 nähdään, 70-80 % tekijän IX polypeptidistä erittyy alustaan, ja noin 50 % siitä on biologisesti aktiivista. Solukasaumista ei todettu lainkaan tekijän IX aktiivisuutta.

Korkeimmat aktiivisuustasot saavutettiin täydentämällä solujen viljelyalustaa K-vitamiinilla (Phytonadione, Merck) pitoisuuksiksi 1-10 mg/ml.

100055 56

Useita muita analyysejä suoritettiin sen osoittamiseksi, että solut erittivät todellista tekijää IX. Tekijän IX aktiivisuutta edellisen kokeen tavoin sisältäviä näytteitä inkuboitiin plasman, josta puuttuu tekijä VIII, kanssa, mutta hyytymisaikaan ei tällöin kyetty vaikuttamaan, mikä osoittaa, että aktiivisuus johtui todellisesta tekijästä IX eikä jostakin epäspesifisestä hyytymisaineesta. Tämä johtopäätös varmistui edelleen, kun tekijän IX aktiivisuus saatiin ooistetuksi näytteestä spesifisellä vasta-aineella. 97-98 % tekijän IX aktiivisuudesta immuno-saostui solujen supernatantista tekijää IX vastaan vaikuttavalla kaniinin polyklonaalisella vasta-aineella. Tämä vasta-aine saosti samoin yli 99 % tekijän IX aktiivisuudesta normaalista plasmasta. Erytropoietiinia vastaan vaikuttava kaniinin poly-klonaalinen vasta-aine ei poistanut lainkaan tekijän IX aktiivisuutta supernatanteista.

Esimerkki 8

Ilmentämisvektorin muodostaminen tekijää VII varten Tässä esimerkissä muodostetaan ilmentämisvektori, joka käsittää tekijän VII osittaiseen cDNA-klooniin liittyneen tekijän VII synteettisen koodaavan 5'-alueen. Vektori, josta käytetään nimitystä pM7135, muodostettiin istuttamalla plasmidiin pD3, joka käsittää SV40-edistimen sekä adenoviruksen 2 pääasiallisen myö-häispromoottorin ja kolmiosaisen johtoketjun, tekijän IX johtoket-jun ja tekijän VII 5'-ketjun yhdistelmän plasmidista pM7115 ja tekijän VII 3'-ketjun kloonista FIX/VII/pD2.

Plasmidi pD3 muodostettiin plasmidista pDHFRIII. Plasmidin pDHFRIII DHFR-ketjun suhteen välittömästi ylävirran puolella sijaitseva Pstl-kohta muutettiin BclI-kohta muutettiin BclI-kohdaksi pilkkomalla 10 ^ug plasmidia 5 yksiköllä entsyymiä PstI 10 minuutin ajan 37°C:n lämpötilassa lOO mikrolitrassa puskuria A (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgC^, 6 mM NaCl, 7 mM β-MSH). DNA uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoi-tiin uudestaan 40 mikrolitraan puskuria B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgC^, 7 mM 8-MSH), joka sisälsi 10 mM dCTPrtä ja 16 yksikköä T^ DNA-polymeraasia, ja sitä inkuboitiin 12°C:n 100055 57 lämpötilassa 60 minuuttia. Etanolilla saostamisen jälkeen DNA ligatoitiin 2,5 mikrogrammaan kinasoituja BclI-kytkijöitä 14 mikrolitrassa puskuria C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP), joka sisälsi 400 yksikköä T4-polynukleotidiligaa-sia, 12 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa. Fenolilla uuttamisen ja etanolilla saostamisen jälkeen DNA suspendoitiin uudestaan 120 mikrolitraan puskuria D (75 mM KC1, 6 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT), pilkottiin 80 yksiköllä entsyymiä Bell 60 minuutin ajan 50°C:n lämpötilassa, ja käsiteltiin sitten elektroforeettisesti agaroosigeelin läpi. Geelistä eristettiin III-muotoista plasmidi-DNA:ta (10 ,ug), ja ligatoitiin 2 tunnin ajan 12 C:n lämpötilassa 10 mikrolitrassa puskuria C, joka sisälsi 50 yksikköä T^-polynukleotidiligaasia, ja käytettiin edelleen E. coli-kannan HB101 transformoimiseen. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin nopean DNA-valmistuksen analyysillä, ja positiivisista pesäkkeistä saatu plasmidi-DNA (josta käytetään lyhennettä pDHFR') transformoitiin dAM E. coli-kantaan.

Tämän jälkeen muodostettiin plasmidi pD21 katkaisemalla plasmi-dit pDHFR' (15 ^ug) ja pSV40 (25 ^ug) 100 mikrolitrassa puskuria D 25 yksiköllä entsyymiä Bell 60 minuutin ajan 50°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen reaktioseokseen lisättiin edelleen 50 yksikköä entsyymiä BamHI ja sitä inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 60 minuuttia. DNA-kappaleet erotettiin elektroforeettisesti aga-roosigeeliä käyttäen, ja 4,9 kiloemäsparin suuruinen pDHFR1 -kappale ja 0,2 kiloemäsparin suuruinen SV40-kappale eristettiin. Näitä kappaleita (200 ng pDHFR' DNA:ta ja 100 ng SV40 DNA:ta) inkuboitiin 10 mikrolitrassa puskuria C, joka sisälsi 100 yksikköä T^-polynukleotidiligaasia, 4 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa, ja tuloksena olevaa muodostetta (pD2') käytettiin E. coli-kannan RRI transformoimiseen.

Plasmidi pD21 muunnettiin hävittämällä siitä "myrkky"-ketjut plas-midin pBR322-alueesta (Lusky ja Botcham, Nature 293: 79-81, 1981). Plasmideja pD2 ' (6,6 ^ug) ja pML-.l (Lusky ja Botcham, edellä) (4 ^ug) inkuboitiin 50 mikrolitrassa puskuria A, joka sisälsi kulloinkin 10 100055 58 yksikköä entsyymiä EcoRI ja NruI, 2 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa, mitä seurasi elektroforeettinen käsittely agaroosi-geelillä. 1,7 kiloemäsparin suuruinen pD2'-kappale ja 1,8 kiloemäsparin suuruinen pML-l-kappale eristettiin ja ligatoi-tiin yhteen (kutakin 50 ng) 20 mikrolitrassa puskuria C, joka sisältää 100 yksikköä T^-polynukleotidiligaasia, 2 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa, mitä seurasi transformointi E. coli-kan-taan HBIOI. Toivotun muodosteen (josta käytetään lyhennettä Δρϋ2) sisältävät pesäkkeet tunnistettiin nopealla DNA:n valmistus-analyysillä. Tämän jälkeen 10 ^ug muodostettua adD2 pilkottiin 20 yksiköllä sekä entsyymiä EcoRI että entsyymiä Bglll, 50 mikrolitrassa puskuria A 2 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa.

DNA käsiteltiin elektroforeettisesti agaroosin läpi, ja toivottu 2,8 kiloemäsparin suuruinen, plasmidin pBR322, 3'-jatkos-kohdan ja poly A-ketjut käsittävä kappale (kappale C) eristettiin .

Muiden jäljellä olevien, plasmidin pD3 muodostamiseen käytettyjen kappaleiden aikaansaamiseksi muodostetta pDHFRIII muunnettiin SacII-kohdan (SstII-kohta) muuttamiseksi joko Hindlll-tai Kpnl-kohdaksi. 10 ^ug plasmidia pDHFRIII pilkottiin 20 yksiköllä entsyymiä Sstll 2 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa, mitä seurasi uuttaminen fenolilla ja saostaminen etanolilla. Uudestaan suspendoitua DNA:ta inkuboitiin 60 minuuttia 12°C:n lämpötilassa 100 mikrolitrassa puskuria B, joka sisälsi 10 mM dCTP ja 16 yksikköä T^ DNA-polymeraasia, uutettiin fenolilla, dialysoitiin ja saostettiin etanolilla. Sen jälkeen, kun tuloksena olevat plasmidit oli suspendoitu uudestaan 50 mikrolitraan puskuria A, ne pilkottiin 50 yksiköllä entsyymiä Hindlll tai entsyymiä Kpnl, aina tilanteen mukaisesti, ja käsiteltiin elektroforeettisesti agaroosigeelin läpi. Geelillä eristetty DNA (250 ng) ligatoitiin 30 mikrolitrassa puskuria C, joka sisälsi 400 yksikköä T^ DNA-ligaasia, 4 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa, ja käytettiin E. coli-kannan RRI transformoimi-seen. Tuloksena olevista plasmideista käytettiin lyhenteitä pDHFRIII (Hindlll) ja pDHFRIII (Kpnl). Tämän jälkeen plasmi-dista pDHFRIII (Kpnl) puhdistettiin 700 emäsparin suuruinen 59 1 0 0 0 5 5

Kpnl-Bglll-kappale (kappale A) pilkkomalla entsyymeillä Bglll ja Kpnl, mitä seurasi elektroforeesi agaroosigeeliä käyttäen.

SV40-edistäjäketju istutettiin plasmidiin pDHFRIII (Hindlll) seuraavasti: 50 ^ug SV40-DNA:ta inkuboitiin 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa, 120 mikrolitrassa puskuria A, joka käsitti 50 yksikköä entsyymiä Hindlll, ja Hindlll C SV40-kappale (5089-968 emäsparia) puhdistettiin geelillä. Plasmidia pDHFRIII (Hindlll) (10 ^ug) käsiteltiin 250 nanogrammalla vasikan suoliston fosfataasia 1 tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Lineaariseksi tehty plasmidi (50 ng) ligatoitiin 250 nanogrammaan Hindlll SV40-kappaletta 16 mikrolitrassa puskuria C 3 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa, käyttäen 200 yksikköä T4-polynukleotidiligaasia, ja transformoitiin E. coli-kantaan HB101. Tämän jälkeen tästä plasmidista eristettiin 700 emäsparin suuruinen EcoRI-Kpnl-kappale (kappale B).

Plasmidin pD3 lopulliseksi muodostamiseksi kappaleet A ja B (kumpaakin 50 ng) ligatoitiin 10 nanogrammaan kappaletta C 200 yksiköllä T4-polynukleotidiligaasia 4 tunnin ajan 12°C:n lämpötilassa, mitä seurasi transfektointi E. coli-kantaan RRI. Positiiviset pesäkkeet ilmaistiin nopealla valmistusanalyysillä, ja plasmidia pD3 tuotettiin suuressa mitassa.

Tämän jälkeen muodostettiin ilmentämisvektori pM7135. Plasmidin pM7115 replikoituva muoto pilkottiin entsyymeillä BamHI ja Xbal, ja 550 emäsparin suuruinen kappale, joka sisältää tekijän IX johtoketjun ja tekijän VII 5'-ketjun, puhdistettiin geelin avulla. Plasmidi FIX/VII/pD2 pilkottiin entsyymeillä Xbal ja BamHI, ja 1700 emäsparin suuruinen kappale, joka käsittää 3'-osan tekijän VII cDNArsta, puhdistettiin geelin avulla. Plasmidi pD3 pilkottiin entsyymillä Bell, käsiteltiin vasikan alkalisella fosfataasilla, ja nämä kolme kappaletta liitettiin kolminkertaisella ligaatiolla. Tuloksena olevat muodosteet seulottiin 2000 emäsparin suuruisen Xbal-kappaleen läsnäolon selvittämiseksi. Oikealla tavalla suuntautunut plasmidi valittiin ja siitä käytetään nimitystä pM7135 (kuva 8).

100055 60

Esimerkki 9

Tekijän VII ilmentäminen cDNA-klooneista

Tekijään VII liittyvän, tekijän VII johtoketjun sisältävän cDNA:n ilmentämiseksi DNArta kloonista XVII2463 tai klooneista XVII565 ja XVII2463 kloonattiin ilmentämisvektorin, joka sisältää adenoviruksen 2 pääasiallisen myöhäisen promoottorin, SV40-viruksen edistäjäketjut, adenoviruksen 2 kolmiosaisen johtoketjun, jatkossarjan sekä SV40-viruksen polyadenylaation signaalin. Tämä vektori muodostettiin siten, että se sisältää yhden ainoan EcoRI-ketjun cDNA-kloonin istuttamiskohtana.

Kloonista XVII2463, joka koodaa 60 aminohapon muodostamaa johto-peptidiä, sekä kloonista AVII565 ja kloonista \VII2463, josta puuttuvat aminohappojen -18 - -39 kodonit, sen koodatessa täten 38 aminohapon pituista johtopeptidiä, saatujen ketjujen ilmentyminen arvioitiin. Koska tekijän VII johtopeptidin rakenne on saatu selvitetyksi ainoastaan cDNA-kloonauksen avulla, sekä johtuen siitä kaksiselitteisyydestä, jonka kahden erilaisen 5'-päähän liittyvän cDNA-molekyylin saaminen aiheutti, tämän keksinön puitteissa muodostettiin samoin tekijän VII genominen cDNA-ketju. Kloonin XVII2463 3'-osa (BglII-kohdasta eksonissa 2 EcoRI-kohtaan, joka on 3'-kytketty poly(A)-häntään) yhdistettiin kloonin 7ml aligenomiseen kappaleeseen, sen koodatessa eksonei-ta la, Ib ja loppuosaa eksonista 2. Tämä aligenominen kappale, joka muodostettiin 4,4 kiloemäsparin suuruisena EcoRI-Bglll-kappaleena, yhdistettiin klooniin XVII2463 ja kloonattiin nisäkkään ilmentämisvektoriin.

Lyhyesti, alikloonien muodostamiseksi tekijän VII cDNA-EcoRI-kappale kloonissa XVII2463 kloonattiin plasmidin pUC18 EcoRI-kohtaan, ja siitä käytetään nimitystä pVII2463. Samoin, kloonin XVII565 EcoRI-cDNA-istute alikloonattiin plasmidiin pUCl8, ja siitä käytetään nimitystä pVII565. Tekijään VII liittyvän, kloonista pVH565 saatavan ketjun 5'-osan ja tekijään VII liittyvän DNA:n, kloonista pVII2463, 3'-segmentin välinen hybridi muodostettiin kloonaamalla entsyymeillä EcoRI ja HindIII pilkottuun plasmidiin pUC18 tekijään VII liittyvä, 100055 61 lähimpänä 5'-päätä sijaitseva EcoRI-Bglll-kappale kloonista pVH565 sekä tekijän VII Bglll-Hindlll-kappale (Hindlll-kohta kloonin pVH2463 polykytkijässä) kloonista pVII2463. pVII2463- ja pVII2397-istutteet poistettiin pilkkomalla entsyymillä EcoRI ja puhdistettiin geelin avulla nisäkkään ilmentämisvektoriin istuttamista varten, kuten edellä esitetään.

A. Tekijän VII täysipituisen cDNA:n ilmentäminen

Tekijän VII ilmentämiseen käytettiin vektoria pDX. Tämä vektori saatiin vektorista pD3 (kuvattu edellä esimerkissä 8) sekä vektorista dD3', joka on sama kuin pD3, paitsi että SV40-viruksen polyadenylaation signaali (eli SV40-viruksen BamHI /2533. emäs-pari_/ - Bell /2110. emäspari^/ -kappale) on myöhäisestä suuntautuneena. Näin ollen pD3' sisältää BamHI-kohdan geeni-istutuksen kohtana.

Vektorin pDX muodostamiseksi EcoRI-kohta vektorissa pD31 muunnettiin BclI-kohdaksi pilkkomalla entsyymillä EcoRI, inkuboimal-la Sl-nukleaasin kanssa, ja ligatoimalla tämän jälkeen BclI-kytkijöiden kanssa. DNA erotettiin positiiviseksi tunnistetusta pesäkkeestä, ja 1,9 kiloemäsparin suuruinen, muutetun rest-riktiokohdan sisältävä XhoI-Pstl-kappale erotettiin elektroforeet-tisesti agaroosigeeliä käyttäen. Toisessa muunnoksessa BclI-pilkottu vektori pD3 ligatoitiin kinasoitujen EcoRI-BclI-adaptoreiden (muodostettu oligonukleotideista ZC 525, 5 GGAATTCT3': sekä ZC526, 5'GATCAGAATTCC3’) kanssa EcoRI-kohdan muodostamiseksi, joka EcoRI-kohta toimii asemana geenin istuttamiseksi ilmentämisvektoriin. Positiiviset pesäkkeet txinnistettiin restriktioendonukleaasei 11a suoritetulla analyysillä, ja niistä saatua DNA:ta käytettiin 2,3 kiloemäsparin suuruisen, muunnetun restriktiokohdan sisältävän XhoL-Pstl-kappa-leen eristämiseen. Näitä kahta edellä kuvattua DNA-kaooaletta inkuboitiin yhdessä T4 DNA-ligaasin kanssa, transformoitiin E. coli-kantaan HB101, ja positiiviset pesäkkeet tunnistettiin restriktioanalyysin avulla. Tällaista DNA:ta, eli pDX, erotettiin (kuva 12). Tämä DNA pilkottiin entsyymillä EcoRI ja tämän jälkeen inkuboitiin vasikan suolistosta saadun fosfataasin kanssa. Sitten puhdistettua DNA:ta inkuboitiin 100055 62 yhdessä DNA-ligaasin ja kloonista pVIl2463 saadun, tekijän VII EcoRI-kappaleen kanssa, tai kloonista pVII2397 saadun, tekijän VII EcoRI-cDNA-kappaleen kanssa. Tuloksena olevista klooneista käytettiin nimitystä FVII(2463)/pDX ja FVII(565+2463)/pDX, vastaavasti (kuva 12). E. coli-kantaan JM83 transformoimisen jälkeen, ja sen jälkeen, kun tunnistaminen oli toteutettu restrik-tioentsyymeillä analysoimalla, plasmidi-DNA:ta erotettiin ja sitä analysoitiin restriktioendonukleaasei11a hmolellisesti pilkkoen. Plasmidit FVII(2463)/oDX ja FVII(565+2463)/pDX on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection tunnusnumeroilla 40206 ja 40205, vastaavasti.

Kumpikin plasmideista FVII(2463)/pDX ja FVII(565+2463)/pDX (kumpaakin 10 ^,ug) transfektoitiin, yhdessä lohen spermasta saadun kantaja-DNA:n 10 mikrogramman kanssa, joko BHK tk-tl3-soluihin (Floros et ai., Exper. Cell Res. 132:215-223, 1981) tai COS-soluihin, käyttäen tavanomaista kalsiumfosfaatilla saostamista. Transfektoimisen jälkeen soluja kasvatettiin sopivilla alustoilla, jotka sisälsivät K-vitamiinia pitoisuutena 5 ^ug/ml, kaksi vuorokautta. Tämän ajan kuluttua supernatanteista määritettiin ELISA-positiivinen materiaali, käyttäen tekijää VII vastaan vaikuttavaa monoklonaalista vasta-ainetta. Sekä FVII(2463)/pDX että FVII(565+2463)/pDX johtivat tekijän VII polypeptidin muodostumiseen, mikä kyettiin ilmaisemaan COS-solujen supernatanteista, ja plasmidista FVII(565+2463)/pDX peräisin oleva tekijä VII voitiin ilmaista BHK-solujen supernatantista. Sham-transfektoi-dut BHK-solut tai COS-solut eivät tuottaneet ilmaistavia määriä tekijää VII (taulukko 5).

100055

Taulukko 5 DNA Solu- Solujen ELISA-määrityksessä sukupolvi lukumäärä positiivinen mate riaali (nq/ml) kas- _ _ _ vatusalustasta_ FVII(2463)/pDX COS 2 x 106 15 FVII(565+2463)/pDX COS 2 x 106 12

Vertailu COS 2 x 10^ <2 FVII(2643)/pDX BHK 9 x 106 62 FVII(565+2463)/pDX BHK 9 x 106 6

Vertailu BHK 9 x 106 <2

Tekijän VII lyhytaikaista ilmentämistä kokeiltiin samoin lukuisissa muissa solusukupolvissa, jotka on lueteltu taulukossa 6.

Taulukko 6

Nimitys Kuvaus Viite _ _ (ATCC no. ) 1. Rotan Hep I Rotan hepatoma H4-II-E-C3 CRL 1600 2. Rotan Hep II Rotan hepatoma H4-II-E CRL 1548 3. TCMK Hiiren munuainen, trans formoitu SV40-viruksella, TCMK-1 CCL 139 4. Ihmiskeuhko SV40-viruksella transfor moitu WI-38 VA13, ali- sukupolvi 2RA CCL 75,1 5. Ihmisen hepatoma Ihmisen maksan adenokarsi- nooma SK-HEP-1 HTB-52 6. Hep G2 Ihmisen hepatoma, kehittä nyt Barbara Knowles/Wistar

Institute HTB 8065 7. Hiiren maksa NCTC klooni 1469 CC 29,1 8. COS SV40-viruksella transfor moidut (apinan) CV-l-solut CRL 1650 ; 9. BHK Nuoren hamsterin munuainen ! BHK-21 (c—13) CCL 10 10. 293 Ihmissikiön munuainen/Ad- transformoitu CRL 1573 11. DUKX CHO-DHFRSenS (Urlaub &

Chasin, PNAS (USA) 77.= 4216-4220, 1980) 100055 64

Solut transfektoitiin samanaikaisesti 10 mikrogrammalla joko plasmidia FVII(2463)/pDX tai FVII(565+2463)/pDX ja 1 mikrogrammalla plasmidia, joka käsitti kloramfenikoli-asetyyli-transasety-laasigeenin (molemmilla plasmideilla transfektoitujen solujen tunnistamiseksi), sekä 10 mikrogrammalla lohen sperman DNA:ta. Vertailuina käytettiin näennäisesti transfektoituja soluja. Käytetty alusta analysoitiin ELISA-menetelmällä kuuden vuorokauden kuluttua. Tulokset esitetään taulukossa 7.

Taulukko 7

Näyte Solusukupolvi Plasmidi Solujen ELISA

lukumää- (ng/ml) _ _ _ rä, x 10b _ 1. Rotan Hep I Näennäinen 11,6 2,4 2. Rotan Hep I FVII(565+2463)/pDX 7,0 2 3. Rotan Hep I FVII(2463)/pDX 7,0 <2 4. Rotan Hep 2 Näennäinen 13,0 <2 5. Rotan Hep 2 FVII(565+2463)/pDX 18,4 <2 6. Rotan Hep 2 FVII(2463)/pDX 14,6 <2 7. TCMK Näennäinen 18,8 <2 8. TCMK FVII(565+2463)/pDX) 9,8 <2 9. TCMK FVIl(2463)/pDX 12,8 <2 10. Ihmiskeuhko Näennäinen 7,2 <2 11. Ihmiskeuhko FVII(565+2463)/pDX 3,4 16,5 12 Ihmiskeuhko FVII(2463)/pDX 3,4 12,2 13. Ihmisen Hepatoma Näennäinen 13,0 <2 14. Ihmisen Hepatoma FVII(565+2463)/pDX 11,0 3,5 15. Ihmisen Hepatoma FVII(2463)/dDX 6,0 3,0 16. HepG2 Näennäinen 6,8 21 17. HepG2 FVII(565+2463)/pDX 6,0 45,5 18. HepG2 FVII(2463)/pDX 6,0 28 19. Hiiren maksa Näennäinen 3,8 <2 20. Hiiren maksa FVII(565+2463)/pDX 4,0 <2 21. Hiiren maksa FVII(2463)/pDX 3,6 <2 22. COS Näennäinen 5,6 <2 23. COS FVII(565+2463)/pDX 5,6 15,5 24. COS FVII(2463)/pDX 4,4 14,5 25. BHK tk tl3 Näennäinen 3,0 <2 26. BHK tk-tl 3 FVII(565 + 2463)/pDX 5,0 25 100055 65

Taulukko 7 (jatkuu)

Näyte Solusukupolvi Plasmidi Solujen ELISA

lukumää- (ng/ml) _ _ _ rä, x I0b__ 27. BHK tk”tl 3 FVII(2463)/pDX 4,0 22,5 28. 293 Näennäinen 5,8 <2 29. 293 FVII(565+2463)/pDX 6,2 94 30. 293 FVII(2463)/pDX 8,2 100 31. DUKX Näennäinen 11,6 <2 32. DUKX FVII(565+2463)/pDX 13,0 <2 33. DUKX FVII(2463)/pDX 13,6 <2

Plasmidi FVII(2463)/pDX (10 /ug) tai FVII(565+2463)/pDX (10 ^ug) transfektoitiin samanaikaisesti yhdessä lohen sperman DNA:n 10 mikrogramman kanssa sekä dihvdrofolaattireduktaasin vastustuskykyistä muotoa koodaavan plasmidin 1 mikrogramman kanssa (Simonsen ja Levinson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80_: 2495-2499, 1983, nisäkkään ilmentämisvektorissa, BHK tk tl3 soluihin. Kahden vuorokauden kuluttua solut jaettiin 1:14 ja laitettiin selektiivisille alustoille, jotka sisälsivät joko 250 nM tai 1000 nM metotreksaattia (MTX) ja K-vitamiinia (Phytadione,

Merck) pitoisuutena 5 ^ug/ml. Pesäkkeet eristettiin kahden viikon kuluttua, ja kasvatettiin 50-90-prosenttisesti yhteen. Supernatanteista määritettiin tämän jälkeen tekijän VII poly-peptidi ELISA-menetelmällä. 25 positiivisesta kloonista 4 22 analysoitiin edelleen. Solut maljattiin määränä 5 x 10 (ryhmä I) tai 1 x 10^ (ryhmä II) 10 senttimetrin suuruisille maljoille, jotka sisälsivät K-vitamiinia pitoisuutena 5 ^ug/ml, ja joko 250 nM tai 1000 nM metotreksaattia. Viiden vuorokauden kuluttua nopeammin kasvavat kloonit (merkitty tähdellä taulukossa 8) jaettiin suhteessa 1:2, ja sitten 24 tunnin kuluttua, jokaisen maljan alusta vaihdettiin. 23 tuntia (ryhmä I) tai 20 tuntia (ryhmä II) myöhemmin, alustan supernatantti otettiin talteen ja solut laskettiin kunkin kloonin tapauksessa. Alusta analysoitiin sekä ELISA-menetelmällä että yksivaiheisella hyytymiskokeella. Tulokset esitetään taulukossa 8.

100055 66

Taulukko 8

Ryhmä 1-23 tunnin koe

Klooni Plasmidi Solujen ELISA- ELISA- Hyyty- Aktii- lukumäärä, (pg/solu/ (ng/ml) minen visia, _ _ x 10~? vrk)__(ng/ml) % B4-A1* FVII(565+2463)/pDX 2 6,5 130 206 158 B4-B1* FVII(565+2463)/pDX 27 1,9 513 360 70 B4-C1 FVII(565+2463)/pDX 16 2,5 393 480 122 B4-C2* FVII(565+2463)/pDX 9 <0,2 <20 21 B4-C3 FVII(565+2463)/pDX 52 1,5 800 910 114 B4-D1* FVIK565+2463)/pDX 27 2,0 553 570 103 B4-D2* FVII(565+2463)/pDX 13 1,2 150 154 103 B4-E1 FVII(565+2463)/pDX 39 2,2 870 1160 133 B4-E2* FVII(565+2463)/pDX 8 2,5 205 240 117 B4-E3 FVIK565+2463)/pDX 23 1,2 275 320 116 B4-E4 FVIK565+2463)/pDX 31 1,3 410 300 73 B3-5,3* FVIK2463)/pDX 5 8,2 410 290 70

Ryhmä II - 20 tunnin koe

Klooni Plasmidi Solujen ELISA- ELISA- Hyyty- Aktii- lukumäärä, (pg/solu/ (ng/ml) minen visia, x 10-5 vrk _ (ng/ml) % B3-2,2 FVIK2463)/pDX 41 2,5 1043 500 48 B3-2,3 FVIK2463)/pDX 19 3,0 580 610 105 B3-3,2 FVIK2463)/pDX 13 1,5 197 216 110 B3-4,2 FVIK2463)/pDX 41 1,8 760 620 82 B3-5,1 FVIK2463)/pDX 14 3,3 460 400 87 B3-5,2 FVIK2463)/pDX 9 2,7 257 184 72 B6-D FVIK2463)/pDX 54 3,0 1700 780 46 B6-E FVIK2463)/pDX 101 1,6 1640 970 59 B6-G FVIK 2463 )/pDX 31 5,7 1853 1080 58 B6-M FVII(2463)/pDX 75 2,2 1743 940 54 B. Tekijään VII liittyvän genomisen ketjun ja cDNA-ket jun välisen hybridin ilmentäminen

Ilmentämisvektori, joka sisälsi tekijän VII genomista 5'-päätä vastaavia genomisia ketjuja, sekä cDNA-ketjuja tekijään VII liit- 67 100055 tyvän geenin 3'-päästä, valmistettiin seuraavasti. 5'-pään muodostamiseen käytettiin genomisen plasmidin 7ml kolmea ali-kloonia: 7Bam, 7SD ja 7SE. Plasmidi 7Bam on 3,6 kiloemäsparin suuruinen, eksonin la sisältävä EcoRI-BamHI-kappale, joka on alikloonattu plasmidiin pUC12. Tästä alikloonista eristettiin 0,7 kiloemäsparin suuruinen, eksonin la sisältävä EcoRI-Xbal-kappale, ja sille annettiin nimeksi kappale a. Plasmidi 7SD on 3,7 kiloemäsparin suuruinen, eksonin Ib sisältävä Sstl-kappale, joka on alikloonattu plasmidiin dUC18. Tästä alikloonista eristettiin 3,1 kiloemäsparin suuruinen, eksonin Ib sisältävä Xbal-Sstl-kappale, ja sille annettiin nimeksi kappale b. Plasmidi 7SE on 3,9 kiloemäsparin suuruinen, eksonit 2-4 sisältävä Sstl-kappale, joka on alikloonattu muodosteeseen M13mpl9. Geelin avulla eristettiin eksonin 2 5'-osan sisältävä Sstl-Bglll-kappale (0,6 kiloemäsparia), ja sille annettiin nimeksi kappale c. Loppuosa 3'-tekijä VII-cDNA:sta (kappale d) saatiin 2 kiloemäsparin suuruisena Bglll-EcoRI-kappaleena plasmidista pUVII2463. Kappaleet a-d ligatoitiin EcoRI-pilkottuun ja vasikan suolistosta saadulla fosfataasilla käsiteltyyn plasmidiin pDX, ja transformoitiin tämän jälkeen E. coli-kantaan JM83 tai HB101. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin restriktioendonukleaasei1la toteutetulla analyysillä, ja plasmidi-DNA erotettiin näistä pesäkkeistä.

Tekijän VII ilmentämiseksi plasmidi-DNA transfektoidaan BHK-tai COS-soluihin, kuten edellä esitetään. Transfektoituja soluja viljellään K-vitamiinia sisältävässä alustassa 2 vuorokautta, ja alustasta määritetään tekijä VII ELISA-menetelmällä.

Edellä esitetyn perusteella on ilmeistä, että vaikka havainnollisuuden vuoksi keksinnöstä onkin kuvattu erityisiä suoritusmuotoja, niin kuitenkin siihen voidaan tehdä lukuisia muunnoksia keksinnön tavoitteesta ja hengestä poikkeamatta. Näin ollen tätä keksintöä rajoittavat pelkästään seuraavat, liitteenä olevat patenttivaatimukset.

Claims (12)

68 100055

1. Yhdistelmä-DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen tekijä VII:ää, joka sisältää kuviossa Ib esitetyn mukaisen aminohapposekvenssin aminohappotähteestä 1 aminohappotähteeseen 406.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää ihmisen tekijä VII:ää koodaa-van nukleotidisekvenssin, joka käsittää kuvan Ib mukaisen cDNA-sekvenssin emäsparista 36 emäspariin 1433, tai kuvan ib mukaisen cDNA-sekvenssin emäsparista 36 emäspariin 99 ja sen jälkeen alavirran puolella sekvenssin emäsparista 166 emäspariin 1433.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää myös johtopeptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että nukleotidisekvenssi käsittää syntetisoidun kaksijuos-teisen oligonukleotidin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että mainittu syntetisoitu kaksijuosteinen oligonukleotidi koodaa olennaisesti tekijän VII aminopään osaa.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että vähintään osa mainitusta nukleotidisekvenssistä on peräisin tekijän VII cDNA-kloonista tai genomisesta kloonista.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-rakenne, tunnettu sii- : tä, että se käsittää tekijän VII cDNA-kloonista tai genomises ta kloonista peräisin olevan ensimmäisen nukleotidisekvenssin, joka on liitetty toiseen, mainitun ensimmäisen nukleotidisekvenssin suhteen alavirran puolella sijaitsevaan nukleotidisek-venssiin, tämän toisen nukleotidisekvenssin ollessa peräisin tekijän VII cDNA-kloonista ja näiden toisiinsa liitettyjen ketjujen koodatessa proteiinia, jolla on aktivoituna samaa tai olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kuin tekijällä Vila. 69 100055

8. Yhdistelmäplasmidi, joka kykenee yhtenäistymään isäntänä toimivan nisäkässolun DNAihan, tunnettu siitä, että se käsittää promoottorin ja sen suhteen alavirran puolella missä tahansa edellä esitetyssä patenttivaatimuksessa 2-7 mainitun nukleotidisekvenssin, jonka nukleotidisekvenssin suhteen ala-virran puolella sijaitsee polyadenylaation signaali.

9. Nisäkässolut, tunnetut siitä, että ne on transfektoitu patenttivaatimuksen 8 mukaisella yhdistelmäplasmidilla.

10. Menetelmä sellaisen proteiinin valmistamiseksi, jolla on veren koaguloitumiseen vaikuttavaa, tekijän Vila välittämää biologista aktiivisuutta, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa - saadaan aikaan isäntänä toimiva nisäkässolu, joka sisältää minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen DNA-rakenteen; - mainittuja isäntänä toimivia nisäkässoluja kasvatetaan sopivassa alustassa; - mainitun DNA-rakenteen koodaama, mainittujen isäntänä toimivien nisäkässolujen tuottama proteiinituote eristetään; ja - mainittu proteiinituote aktivoidaan sellaisen proteiinin muodostamiseksi, jolla on samaa tai olennaisesti samaa, veren koaguloitumiseen vaikuttavaa biologista aktiivisuutta kun tekijällä Vila.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-rakennetta lisätään transfektoimalla isäntäsolu samanaikaisesti dihydrofolaattireduktaasia koodavalla geenillä, jolloin sopiva alusta käsittää metotreksaattia.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu proteiinituote aktivoidaan antamalla tämän proteiinin reagoida proteolyyttisen entsyymin kanssa, joka proteolyyttinen entsyymi valitaan tekijän Xlla, tekijän IXa, kallikreiinin, tekijän Xa ja trombiinin muodostamasta ryhmästä . 70 100055