HU204556B - Process for expressing proteins of vii factor activity in mammalian celles - Google Patents

Description

A jelen találmány általánosságban a véralvadási faktorokkal, pontosabban a véralvadáshoz szolgáló biológiai aktivitással bíró fehéq'ék kifejeződésével foglalkozik.

A véralvadás olyan folyamat, amely különböző vérkomponensek vagy faktorok komplex együttműködéséből áll, amelyek végűi is egy fibrinrögöt hoznak létre. Általában azok a vérkomponensek, amelyek ebben részt vesznek, és amelyeket alvadási „sorozatinak nevezünk, proenzimek vagy zimogének, enzimesen inaktív fehéq'ék, amelyek egy aktivátor működésére proteolitikus enzimekké alakulnak át, az aktivátor maga aktivált alvasztó faktor. Az alvadási faktorokat, amelyeket ilyen átalakításnak alávetettünk, általában „aktivált faktorának nevezzük, és egy „a” kisbetűs utójel hozzátételével jelöljük (pl. Vlla).

Két külön rendszer van, amely elősegítheti a véralvadást és ezáltal részt vehet a normális vérzéscsillapításban. Ezeket a rendszereket „belső” és „külső’ alvadási utaknak nevezzük. A „belső’ út azokra a reakciókra vonatkozik, amelyek trombin képződéséhez vezetnek, olyan faktorok alkalmazása útján, amelyek csak a plazmában vannak jelen. Egy közbenső esemény a „belső’ útban a IX. faktor aktiválása IXa faktorrá, ezt a reakciót a Xla faktor és kalciumionök katalizálják. A Xla faktor azután részt vesz a X. faktor aktiválásában Villa faktor, foszfolipid- és kalciumionok jelenlétében. A „külső’ út plazmafaktorokat, valamint szövetextraktumokban jelen levő komponenseket foglal magában. A VH. faktor, a fentebb bemutatott proenzimek egyike, részt vesz a véralvadás „külső’ útjában, a X. faktort (saját aktiválásával együtt Vlla-vá) Xa faktorrá alakítva át szöveti tényezők és kalciumionok jelenlétében. A Xa faktor viszont ezután átalakítja aprotrombint trombinná az Va faktor, kalciumionok és foszfolipid jelenlétében. Mivel a X. faktor aktiválása Xa faktorrá olyan esemény, amely megtörténik mind a „belső’, mind a „külső’ útban, a VHa faktort lehet alkalmazni olyan betegek kezelésére, akik ezen a téren hiányosságban szenvednek, vagy akiknek VHI. faktorgátlásuk van (Thomas: 4 382 083 lajstromszámú amerikai egyesült ‘ államokbeli szabadalmi leírás). Van néhány bizonyíték, amely azt sugallja, hogy a VHa faktor részt vehet a „belső’ útban is [Zűr és Nemerson: J. Bioi. Chem. 253, 2203-2209 (1978)J, szerepet játszva a IX. faktor aktiválásában. ^z

A kísérleti elemzés feltárta, hogy a humán VH. faktor egyláncű glikoprotein, mintegy 50 000 dalton molekulatömeggel. Ebben a formában a'faktor inaktív zimogénként kering a véráramban. A VH. faktor aktiválását VHa-vá számos különböző plazma proteázzal lehet ka- £ talizálni, pl. a XHa faktorral. A VH. faktor aktiválása két polipeptíd lánc képződését eredményezi, a nehéz láncét (M_s«28 000) és a könnyű láncét (M_s=17 000), amelyeket legalább egy diszulfidhíd tart össze. A VH. faktort lehet aktiválni VHa-vá in vitro is, pl. a Thomas 5 által bemutatott módszernél (4 456 591 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

A IX. faktor a véráramban egyláncű prekurzorként kering, amelynek molekulatömege 57 000, és úgy alakul át aktív szerilproteázzá (IXa faktor), hogy Xla θ faktorral hasítjuk VHI. faktor jelenlétében. A IXa faktor egy könnyű láncot és egy nehéz láncot tartalmaz 16 000, illetve 26 000 dalton molekulatömeggel.

A jelenlegi kezelési gyakorlat az alvadási rendel5 lenességekkel bíró (pl. VHI. és IX. faktorhiányos) betegekhez általában magában foglalja a helyettesítéses terápiát a szóban forgó faktor feldúsult szintjét tartalmazó humán plazma krioprecipitátum-frakcíójával vagy más frakcióival. Ezeket a készítményeket eddig 0 összegyűjtött humán plazmából nyerték, bár a krioprecipitátumok készítményei viszonylag nagy mennyiségű humán plazmát igényelnek kiindulási anyagként.

A VH. faktor terápiás használata azoknak az egyéneknek a kezelésére szokásos, akiknél hiány mutatko5 zik VH. faktorban, valamint a VHI. faktor- és IX. faktorhiányos népesség kezelésére, és azoknak az egyéneknek a kezelésére, akik Willefarand-betegségben szenvednek. Részletesebben, azok az egyének, akik VHI. és IX. faktort kapnak a helyettesítéses terápiában, 0 gyakran fejlesztenek ki antitesteket ezekre a fehérjékre. Akezelés fenntartása rendkívül nehéz ezeknek az antitesteknek a jelenléte miatt. Azokat a betegeket, akiknél ezt a problémát tapasztalják, normálisan egy aktivált protromhin komplexszel kezelik, amelyről ismert, hogy aktív és inaktív alvasztó enzimek keverékéből áll, beleértve a VHa faktort is. Ezenkívül jelenleg folyó tanulmányok azt jelzik, hogy kis mennyiségű (40-50 mikrogramm) injektált VHa faktor hatásos súlyos, folyamatos vérzéses esetek szabályozásában VHI. faktor) hiányos betegekben, akiknek magas az antítestszint a vérükben [Hedner és Kisiel: J. Clin. Invest. 71, 1836—

1841 (1983)].

A krioprecipitátumok készítésében alkalmazott plazma különböző eredetű forrásai következtében nehéz i megvizsgálni a készítményt, hogy biztosak legyünk: a készítmény mentes vírusfertőzéstől. így pl. lényegében a krioprecipitátumok befogadói közül lényegében mindenki pozitív vizsgálati eredményt mutat hepatitisre. A mostani beszámolók azt is jelzik, hogy számos vérzékeny betegnél, akik krioprecipitátumot kaptak, szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) fejlődött ki. Ezenkívül ezeknek a faktoroknak tisztítása nagy mennyiségben rendkívül nehéz és drága.

Következésképpen szükség van a szakterületen olyan módszerre, amellyel viszonylag nagy mennyiségű tiszta VHa és IX. faktorkészítményt lehet előállítani.

A jelen találmány kielégíti ezt az igényt rekombináns DNS-technolőgia segítségével, sikeresen elűzve a vírusos fertőzés problémáját és ugyanakkor állandó és homogén forrást nyújtva a VHa faktorhoz a VHI. faktorés IX. faktorhiányos betegek és a Van Willebrand-betegséghen szenvedő betegek kezeléséhez, valamint forrást nyújtva tisztított IX. faktorhoz a helyettesítéses terápiában való felhasználáshoz.

Röviden fogalmazva a jelen találmány olyan DNSkonstrukciót ismertet, amely VH. faktort legalább részlegesen kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. A nukleotidszekvencía tartalmaz egy első nukleotidszekvenciát, amely egy kalciumkötő tartományt tartalmaz, összekapcsolva egy második nukleotidszekvenciával,

HU 204 556 Β amely az első szekvenciától „lefelé” helyezkedik el. A második nukleotidszekvencia a VHa faktor szerilproteáz aktivitású részéhez szolgáló katalitikus tartományt kódolja. Az egyesített szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amely aktiválásra lényegében azonos biológiai aktivitással bír a véralvadásnál, mint a Vlla faktor. Az első nukleotidszekvencia lényegében lehet egy VII. faktort, IX. faktort, X. faktort, C fehérjét, protrombint vagy S-fehérjét kódoló gén nukleotidszekvenciája. Ezenkívül az első nukleotidszekvencia kódolhat egy vezető peptidet is, amely az illető génnek felel meg.

Pontosabban az első nukleotidszekvencia származhat a VII. faktor genomklónjából vagy cDNS-klónjából, és kódolhatja a vezetőpeptidet és a VII. faktor aminoterminális végét. Az első nukleotidszekvencia magában foglalhat egy kettős szálú oligonukleotidot is. Egy különösen előnyös első nukleotidszekvencia az, amely a vezetőpeptidet és a IX. faktor aminoterminális végét kódolja.

Ezenkívül a jelen találmány ismertet olyan rekombináns plazmidokat, amelyek képesek integrálódásra emlős gazdasejt DNS-ben. A plazmidok egyike magában foglal egy promotort, amelyet lefelé RNS összeillesztő helyek készlete követ; az RNS összeillesztő helyeket lefelé olyan nukleotidszekvencia követi, amely legalább részlegesen kódolja a VE. faktort. A nukleotidszekvencia magában foglal egy első nukleotidszekvenciát, amely egy kalciumkötő tartományt kódol, összekapcsolva egy második nukleotidszekvenciával, amely az első szekvenciától „lefelé” helyezkedik el. A második nukleotidszekvencia egy katalitikus tartományt kódol a Vlla faktor szerilproteáz aktivitású részéhez. Az egyesített szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amelyek aktiválására véralvadáshoz lényegileg azonos biológiai aktivitással bírnak, mint a Vlla faktor. A nukleotidszekvenciát ezután „lefelé” egy poliadenilező szignál követi.

Hasonlóképpen a fentebb említett rekombináns plazmidhoz a jelen találmány ismertet egy második plazmidot is, amely magában foglal egy promotort, ezt követi „lefelé” az RNS összeillesztő helyek sorozata, az RNS összeillesztő helyeket „lefelé” egy olyan nukleotidszekvencia követi, amely legalább részlegesen a IX. faktort kódolja. A nukleotidszekvencia magában foglal egy első nukleotidszekvenciát, amely egy kalciumkötő tartományt kódol, az első nukleotidszekvencia egy második nukleotidszekvenciával van összekapcsolva, az első szekvenciától „lefelé” elhelyezkedve. A második nukleotidszekvencia egy katalitikus tartományt kódol a IX faktor szerilproteáz aktivitású részéhez. Az egyesített szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amelyek lényegében azonos biológiai aktivitással bírnak a véralvadáshoz, mint a IX. faktor. A nukleotidszekvenciát ezután „lefelé” egy poliadenilező szignál követi.

A találmány egy harmadik szempontja szerint stabilan fertőzött emlős sejteket mutatunk be egy fehérje termeléséhez, amely fehérje aktiválásra lényegében azonos biológiai aktivitással bír, mint a Vlla faktor. A sejteket olyan DNS-konstrukcióval fertőzzük, amely a

VH. faktort legalább részlegesen kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. A nukleotidszekvencia egy első nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely egy kalciumkötő tartományt kódol, ez az első szekvencia össze van kapcsolva egy második nukleotidszekvenciával, amely az első szekvenciától „lefelé” helyezkedik el. A második nukleotidszekvencia egy katalitikus területet kódol a Vlla faktor szerinproteáz aktivitású részéhez. Az összekapcsolt szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amely aktiválásra lényegében azonos biológiai aktivitással bír a véralvadásnál, mint a Vlla faktor.

A találmány egy még további szempontja szerint stabilan fertőzött emlős sejteket mutatunk be egy fehérje termeléséhez, amely fehérje lényegében azonos biológiai aktivitással bír, mint a IX. faktor. A sejteket olyan DNS-konstrukcióval fertőzzük, amely a IX. faktort legalább részlegesen kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. A nukleotidszekvencia egy első nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely egy kalciumkötő tartományt kódol, ez az első szekvencia össze van kapcsolva egy második nukleotidszekvenciával, amely az első szekvenciától „lefelé” helyezkedik el. A második nukleotidszekvencia egy katalitikus területet kódol a IX. faktor szerinproteáz aktivitású részéhez. Az összekapcsolt szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amelyek lényegében azonos biológiai aktivitással bírnak véralvadásnál, mint a IX. faktor.

A jelen találmány továbbá eljárást nyújt olyan fehérje előállítására, amely biológiai aktivitással bír a Vlla faktor által közvetített véralvadáshoz, egy olyan emlős gazdasejtet létesítve, amely olyan nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS- konstrukciót tartalmaz, amely legalább részlegesen kódolja a VII. faktort. A nukleotidszekvencia egy első nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely egy kalciumkötő tartományt kódol, ez a szekvencia össze van kapcsolva egy második nukleotidszekvenciával, amely az első szekvenciától „lefelé” helyezkedik el. A második nukleotidszekvencia egy katalitikus területet kódol a Vlla faktor szerilproteáz aktivitású részéhez. Az összekapcsolt szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amely aktiválásra lényegében azonos biológiai aktivitással bír a véralvadásnál, mint a Vlla faktor. Ezt követően az emlős sejtet megfelelő tápközegben növesztjük és a DNS-konstrukció által kódolt és az emlős gazdasejt által termelt fehérjeterméket izoláljuk. A fehérjeterméket ezután aktiváljuk, a Vlla faktort alakítva ki.

A jelen találmány még további szempontja szerint eljárást ismertetünk olyan fehérje előállítására, amely biológiai aktivitással bír a ΓΧ. faktor által közvetített véralvadáshoz. A módszer egy emlős gazdasejt létesítését foglalja magában, amely olyan nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-konstrukciót tartalmaz; amely legalább részlegesen kódolja a IX. faktort. A nukleotidszekvencia egy első nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely egy kalciumkötő tartományt kódol, ez a szekvencia össze van kapcsolva egy második nukleotidszekvenciával, amely az első szekvenciától „lefelé” helyezkedik el. A második nukleotidszekvencia egy katalitikus területet kódol a IX. faktor szerinproteáz

HU 204556 Β aktivitású részéhez. Az összekapcsolt szekvenciák olyan fehérjét kódolnak, amely lényegében azonos biológiai aktivitással bír a véralvadásnál, mint a IX. faktor.

Ezt követően az emlős gazdasejtet megfelelő tápközegben növesztjük, és a DNS- konstrukció által kódolt és 5 az emlős gazdasejt által termelt fehérjét izoláljuk. A fentebb említett módszerek által termelt fehéretermékeket szintén ismertetjük.

A jelen találmány egy még további szempontja szerint egy olyan DNS-konstrukciót ismertetünk, amely a 10 VH. faktort kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza. Egy előnyös kiviteli módban a DNS-szekvencia az IB ábra szerinti cDNS-szekvenciát tartalmazza a 36. bázispártól a 1433. bázispárig. Egy másik előnyös kiviteli módban a DNS-szekvencia az IB ábra szerinti cDNS-szek- 15 venciát tartalmazza a 36. bázispártól a 99. bázispárig, ezt követi „lefelé” a 166. bázispártól az 1433. bázispárig terjedő szekvencia. Azokat a rekombináns plazmidokat, amelyek képesek integrálódni emlős gazdasejt DNS-ekben, amelyek a most fentebb leírt DNS- szék- 20 venciákat tartalmazzák, szintén ismertetjük.

Ismertetjük azokat az emlős sejteket is, amelyek a VH. faktort kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns plazmiddal vannak stabilan fertőzve. Egy előnyös kiviteli módban a DNS-szekvencia magában 25 foglaljaaz IB ábra cDNS-szekvenciáját a 36. bázispártől az 1433. bázispárig, vagy az IB ábra cDNS-szekvenciáját a 36. bázispártól a 99. bázispárig, ezt követi „lefelé” a 166. bázispártól az 1433. bázispárig terjedő szekvencia. 30

Eljárást ismertetünk olyan fehérje előállítására is, amely a VHa faktor által közvetített véralvadásnál biológiai aktivitással bír; az eljárás emlős gazdasejt létesítését foglalja magában, amely olyan DNS-konstrukciót tartalmaz, amint ezt fentebb leírtuk. Az emlős gazda- 35 sejtet ezután megfelelő tápközegben növesztjük, és a DNS-konstrukció által kódolt fehéqeteiméket izoláljuk. A fehérjeterméket azután aktiváljuk, hogy a VHa faktort hozzuk létre.

A találmány további szempontjai nyilvánvalóvá vál- 40 nak az ezután következő részletes leírásbői és az ezekhez kapcsolódó ábrákból.

Az alábbiakban megadjuk az ábrák rövid leírását.

Az 1A ábra mutatja be a XVH2115 és XVH1923 cDNS-klónok egyesített részei által termelt részleges 45 VH. faktor cDNS-szekvenciát.

Az IB ábra mutatja be a XVH2463 VH. faktor cDNS-szekvenciát. A nyilak jelzik a kihagyások terjedelmét a XVH565 szekvenciában. A számok a szekvencia fölött az amínosavakat jelölik. A számok lent a 50 nukleotidokat jelölik.

A 2A ábra számos alvasztó faktor aminoterminális területének aminosavszekvenciáját mutatja be.

A 2B ábra összehasonlítást mutat be a fehérjeszekvencia-elemzésből nyert VH. faktor aminosavszek- 55 vencia és a cDNS által kódolt aminosavszekvencia között.

A 3. ábra a IX. faktor vezetőszekvencia összekapcsolását mutatja be egy olyan szekvenciához, amely egy együttműködő kalciumkötő helyet kódol. 60

A 4. ábra a IX. faktoregyüttmúködő szekvenciahibridek összekapcsolását mutatja be egy részleges VH. faktor cDNS-hez, hogy egy kereten belüli kódolőszekvenciát nyeljünk.

Az 5. ábra egy olyan plazmid megalkotását mutatja be, amely egy IX. faktoriVH. faktor fúziós fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz.

A 6. ábra a EIX/Vn/pD2 kifejeződő vektort mutatja be. Az alkalmazott jelek: Ad2 MLP, a nagyobb késői promotor a 2. adenovírusból; Ll-3, a 2. adenovírus háromrészes vezetőszekvencíája; 5’ss, az 5’ összeillesztési hely; 3’ss, a 3’ illetési hely, és pA, a késői poliadenilezési jel az SVO-ból.

A 7. ábra a IX. faktor/VH. faktor cDNS fúziós termék nukleotidszekvenciáját mutatja be.

A 8. ábra a pM7135 kifejező vektort mutatja be. Az alkalmazott jelek: E, az SV40 fokozó; őri, a 0-1 térképegységek Ad5; pA, a korai poliadenilező jel az SV40ből; Δ, a pBR322 „mérgező” szekvenciájának kiiktatott területe; a többi jelet a 6. ábránál leírtuk.

A 9. ábra a 2463 bp-s VH. faktor cDNS szubklónozását mutatja be.

A10. ábra az 565 bp-s VH. faktor cDNS szubklónozását mutatja be.

A 11. ábra a pVH565 5’ végének és a pVH2463 3’ részének összekapcsolását mutatja be pUC18-ban, hogy a pVH2397 létrejöjjön.

A 12. ábra a FVH(2463)/pDX és FVH(565+2463)/pDX kifejeződő plazmídok megalkotását mutatja be. A pA jelenti a poliadenilezési helyet az SV40-ből a korai vagy késői orientációban, amint ezt a 9. példában leírjuk. A további jelek a 8. ábránál vannak leírva.

A legjobb leírási forma a találmány kivitelezéséhez

Mielőtt megkezdenénk a találmány leírását, segítséget jelenthet ennek megértéséhez, ha bizonyos, később használandó kifejezéseket megmagyarázunk.

Komplementer DNS vagy cDNS. Olyan DNS-molekula vagy -szekvencia, amelyet enzimes úton szintetizáltak az mRNS templátban jelen levő szekvenciákból.

DNS-konstrukció. Egy DNS-molekula, vagy egy ilyen molekula klőnja, vagy egy- vagy kétszálú, amelyet részleges formában egy természetben előforduló génből lehet izolálni, vagy amelyet úgy lehet módosítani, hogy olyan DNS-szegmenseket tartalmazzon, amelyek kombinálódnak és egymás mellé helyeződnek olyan módon, amely egyébként a természetben nem létezik.

Plazmid. vagy vektor. DNS-konstrukció, amely genetikai információt tartalmaz, amely saját replikációját nyújtja, amikor egy gazdasejtbe beiktatják. Egy plazmíd általában legalább egy kifejezendő génszekvenciát tartalmaz a gazdasejtben, valamint olyan szekvenciákat, amelyek megkönnyítik az ilyen génkifejeződést, beleértve a promotorokat és az áthásbeindító helyeket.

Ez lehet lineáris vagy zárt, kör alakú molekula.

Összekapcsolt. DNS-szekvenciákat akkor mondunk összekapcsoltnak, amikor egy szekvencia 5’ és 3’ végeit összekötjük foszfo-diészter kötésekkel egy szom4

HU 204 556 Β szédos szekvencia 3’, illetve 5’ végeivel. Az összekapcsolást olyan módszerekkel lehet elérni, mint pl. a tompa vagy kohezív végek ligálása, az egyesített szekvenciák szintézise cDNS-klónozás útján, vagy közbeeső szekvenciák eltávolítása irányított mutagenezis révén.

Vezetőpeptid. Aminosavszekvencia, amely bizonyos fehérjék aminoterminálisán fordul elő, és amelyet általában lehasítunk a fehérjéről a későbbi feldolgozás és kiválasztás során. A vezetőpeptidek olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a fehérjét a sejt kiválasztási útjba irányítják. Amint itt használjuk, a „vezetőpeptid” jelentheti a természetben előforduló vezetőpeptid egy részét is.

Tartomány. Speciális aminosavak háromdimenziós, önmagától összeálló elrendezése egy fehérjemolekulában, amely tartalmazza a fehérje bizonyos biológiai aktivitásához szükséges szerkezeti elemek egy részét vagy egészét.

Biológiai aktivitás. Egy molekula által végrehajtott funkció vagy funkciók sorozata egy biológiai szervezeti egységben (pl. egy organizmusban vagy egy in vitro másolatban). A fehérjék biológiai aktivitását katalitikus és effektor aktivitásokra lehet osztani. Az alvadási tényezők katalitikus aktivitásai általában magukban foglalják más faktorok aktiválását prekurzorok fajlagos hasítása révén. Az effektor aktivitások magukban foglalják a biológiailag aktív molekulák fajlagos kötését kalciumhoz vagy más kis molekulákhoz, makromolekulákhoz, mint fehérjékhez, vagy sejtekhez. Az effektor aktivitás gyakran (vagy esetleg elengedhetetlenül is) fokozza a katalitikus aktivitást fiziológiai körülmények között. A katalitikus és effektor aktivitások bizonyos esetekben a fehérje adott tartományában helyezkednek el.

A VHa faktornál a biológiai aktivitás a véralvadásban való közreműködéssel jellemezhető a „külső” út révén. A VHa faktor aktiválja a X. faktort Xa faktorrá, amely viszont a protrombint alakítja át trombinná, ezáltal egy fibrinalvadék képződését indítva be. Mivel a X. faktor aktiválása közös a véralvadásnak mind a belső, mind a külső útján, a Vlla faktort olyan egyének kezeléséhez lehet alkalmazni, akik súlyosan hiányosak IX. faktor-, VIII. faktor- vagy Van Willebrand-faktoraktivitásban.

AIX. faktornál a biológiai aktivitás a véralvadásban való közreműködéssel jellemezhető a „belső” út révén. A IX. faktor IXa faktorrá aktiválódik a Xla faktor révén. A IXa faktor azután aktiválja a X. faktort Xa faktorrá Villa faktor, foszfolipid- és kalciumionok jelenlétében. A Xa faktor azután a protrombinnak trombinná való átalakulásában működik, beindítva egy fibrinalvadék képződését.

Amint fentebb megjegyeztük, a VII. faktor izolálása humán plazmából időrabló és drága folyamat, mivel a faktor ritka fehérje, amely csupán mintegy 300 pg/liter vérkoncentrációban van jelen. Ezenkívül nehéz elkülöníteni a protrombintól, IX. faktortól és X. faktortól, és nagyon érzékeny a proteolitikus támadásokra a tisztítás során (Kisiel and McMullen, fentebb idézett munka). Bár az egy láncos humán VII. faktort homogenitásig tisztították (Kisiel és McMullen, fentebb idézett munka), a publikált tisztítási módszerek általában kis kitermelésre és/vagy más koagulációs faktorokkal szennyezettségre korlátozottak.

A VII. és IX. faktorok a májban termelődnek és K-vitamint igényelnek bioszintézisükhöz. A K-vitamin specifikus γ-karboxi-glutaminsav-gyökök képződéséhez szükséges a faktorokban. Ezek a szokatlan aminosavgyökök, amelyek transzláció utáni módosítások által képződnek, kalciumionokhoz kötődnek, és felelősek a fehérjék kölcsönhatásáért foszfolipidüregecskékkel (vezikulumokkal). Ezenkívül a VII. és IX. faktorok mindegyike tartalmaz egy β-hidroxi-aszparaginsavgyököt, amely szintén azután képződik, miután a fehérjék transzláció révén létrejöttek. Ennek az aminosavgyöknek a szerepe azonban nem ismeretes.

Figyelembe véve azt a tényt, hogy a VII. és IX. faktorok aktivitása függ a transzláció utáni módosításoktól, beleértve a speciális glutaminsavgyökök γ-karboxilezését, és függhet a speciális aszparaginsavgyökök hidroxilezésétől is, valószínűtlen, hogy egy aktív termék képződhetne a VII. és IX. faktorok klónozása és kifejeződése révén mikroorganizmusban.

Következésképpen a jelen találmány módszert nyújt a Vlla faktor által közvetített véralvadáshoz biológiai aktivitással bíró fehérje előállításához, stabilan fertőzött emlős sejteket alkalmazva. Ezenkívül a jelen találmány módszert nyújt olyan fehérje előállításához is, amely IX. faktor által közvetített véralvadáshoz bír biológiai aktivitással..

Amint fentebb megjegyeztük, a VH. faktor és a IX. faktor K-vitamint igényel bioszintéziséhez. Ezenkívül a protrombin, X. faktor, C-fehérje és S-fehérje plazmafehérjék szintén igényelnek K-vitamint bioszintézisükhöz. Ezeknek a fehérjéknek az aminoterminális részei, amelyek γ-karboxi-glutaminsav-gyököket tartalmaznak, homológok mind aminosavszekvenciában, mind biológiai funkcióban (2A ábra). Ezenkívül a VII. faktor, protrombin, IX. faktor, X. faktor és C-fehérje karboxiterminális részei meghatározzák fajlagos szerinproteáz funkcióikat.

A VH. faktor egy nyomnyi mennyiségben előforduló plazmafehérje, és a VII. faktort kódoló mRNS-ről úgy véljük, hogy ritka. Következésképpen a VII. faktor tisztítása plazmából kielégítő mennyiségekben, hogy lehetővé váljék a kiterjedt szekvenciaelemzés és -jellemzés, nehéz marad. A VII. faktor lebomlását a tisztítás folyamán, még proteáz-inhibitorok jelenlétében is, megemlítik Kisiel és McMullen (fentebb idézett munka). E nehézségek következtében a VII. faktor még csak kevéssé van jellemezve, összehasonlítva a véralvadási rendszer más, bőségben lévő komponenseivel. Sőt, Kisiel és McMullen (fentebb idézett) munkája a VH. faktor egyes láncainak csak 10 gyökéről adott szekvencia-információt, és mindegyik szekvenciában két gyök azonosítása csak próbálkozás volt. A szarvasmarha VH. faktor részleges aminosavszekvencia adatait szintén ők publikálták.

A VII. faktor feltételezett ritkaságához hozzájárul a VH. faktor génjével kapcsolatos ismeretek hiánya. A

HU 204556 Β hagyományos cDNS-klónozási technikák sikere függ az mRNS megfelelő mennyiségétől, amelyet, mint templátot használnak. A reverz átírás érés előtti befejeződése olyan cDNS-klónok termelését eredményezi, amelynek 5’ vége hiányzik és ezt a körülményt súlyosbítják az alacsony mRNS-szintek. Számos stratégiát fejlesztettek ki a cDNS klónozásához [Maniatis és munkatársai: Molecular CIoning: A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi kézikönyv), Cold Spring Harbor Laboratory (1982)], de a szóban forgó tennék aminosavszekvenciája ismeretének hiánya lehetetlenné teszi, hogy megbecsüljük a DNSszekvenciát és megfelelő olígonukleotíd vizsgálati mintákat tervezzünk. Míg viszonylag egyszerűen lehet más ritka fehéq'ét kódoló gén részleges cDNS-klónját megkapni ezeket a kifejlesztett stratégiákat alkalmazva, néhány ritka fehérjét, mint pl. a VH. faktort kódoló gének teljes hosszúságú cDNS-klónjait változatlanul rendkívül nehéz megkapni.

A VH. faktorral összehasonlítva a IX. faktor viszonylag nagy mennyiségben előállított fehérje és a humán IX. faktoigén cDNS-klónjának szekvenciája ismert [Kurachi és Davie: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6461-6464 (1982); Anson és munkatársai: EMBO J. 3, 1053-1060 (1984)]. AIX. faktor génszerkezetét jellemezték és a fehérje aminosavszekvenciáját meghatározták az ismert nukleotidszekvencia alapján. Bizonyos fehérjeszekvencia adatokat publikáltak a humán és szarvasmarha IX. faktornál, és a szekvenciákat elemezték DiScipio és munkatársai is (fentebb idézett munka). A fehéq'e aminoterminális része 12 glutaminsavat tartalmaz, amelyek β-karboxi-glutaminsav (Glu) gyökökké alakulnak át az érett fehérjében. A hasítási helyeket, amelyek a IX. faktor aktiválásában játszanak szerepet, szintén azonosították (Kurachi és Davie, fen- ! tebb idézett munka). Egy szekvencia a IX. faktor cDNS-klón 5’-végénél egy szignálpeptidet kódol, amely tipikusan megtalálható a legtöbb kiválasztott fehéqeben (Kurachi és Davie, fentebb idézett munka).

AIX. faktorgén kifejeződését rekombináns DNS-mőd- ^{ szerek révén eddig még nem közölték.

A VH. faktorgén teljes hosszúságú cDNS-klőnja nyerésének nehézségei miatt három új megközelítést választunk, hogy a kődolószekvencia, beleértve a vezetőpeptidet kódoló területet, 5’ végét szolgáltassuk. 4 Az első módszer szerint egy VH. faktor részleges cDNS-klónját összekapcsoljuk a vezetőpeptid és a IX. faktor 5’részét kódoló fragmenssel. Ez a megközelítés azon a megfigyelésen alapszik, hogy a két molekula aminoterminális részei felelősek a megfelelő fehérjék 5 kalciumkötő aktivitásáért, és azon a felfedezésen, hogy a IX. faktor kalciumkötŐ aktivitása helyettesítheti a VII. faktor kalciumkötő aktivitását. Az így létrejött polipeptid megőrzi az autentikus VH. faktor biológiai aktivitását, mivel az alvadási faktorok fajlagos szeril- 5 proteáz aktivitásai a molekulák karhoxíterminális területeiben helyezkednek el. A második megközelítés kombinálja a részleges cDNS-klőnt egy, a VH. faktor vezető- és aminoterminális területeit kódoló DNSszekvenciával. Az itt ismertetett VH. faktor részleges 61 cDNS- és aminosavszekvenciáí lehetővé teszik egy genom DNS-könyvtár vagy cDNS-könyvtár átvizsgálását olyan kiónokra, amelyek a VH. faktorgén 5’ részét tartalmazzák. A harmadik megközelítés magában fog5 lalja a részleges cDNS-klón összekapcsolását egy olyan hibrid kódolószekvenciával, amely a IX. faktor vezető peptidjét kódoló cDNS-fragmenst és egy együtíműködőkalciumkötő tartományt kódoló szintetikus génszegmenst, vagy egy VH. faktorhoz szolgáló előre megjósolt aminoterminális szekvenciát kódoló génszegmenst tartalmaz. A VH. faktor aminoterminálisát kódoló szekvenciát az itt megadott, korábban nem publikált aminosavszekvencia révén állapítjuk meg. Az együttműködő szekvencia a VH. faktor adataiból és más K-vítaminfuggő plazmafehérjék publikált adataiból származik.

A fentiekkel összhangban a VH. faktoigén 5’ részét tartalmazó kiónok vizsgálata során egy teljes hosszúságú, korrektcDNS-tkaptunk, amely alkalmas akifejeződésre. 0 A kialakított cDNS-klónok között egy „XVH 2463”nak nevezett klón tartalmazza a legnagyobb VH. faktor cDNS-inszertumot Úgy találjuk, hogy ez tartalmazza a VH. faktort kódoló teljes szekvenciát. Ez akión magában foglal egy 35 nukleotidból álló 5’-transzlációnak 5 alá nem vetett területet, egy 60 aminosavnyi vezetőrészt kódoló 180 nukleotidot, az érett fehéq'e 406 aminosavát kódoló 1218 nukleotidot egy állj (stop) kodont, egy 1026 nukleotidból álló, 3'-transzlációnak alá nem vetett területet, és egy 20 bázisból álló poli(A) ) farokrészt (a 2463. helytől kezdődőén). Ezt a cDNS-t szekvenciaelemzésnek vetjük alá teljes egészében mindkét szálon. Ennek összehasonlítása a XVH2115 és λνΐΠ923 kiónokból korábban izolált két cDNS beiktatással feltáqa, hogy a XVH2463, egy egyedi EcoRI » fragmensen, egy VH. faktor vezető és érett fehérjeszekvenciákat kódoló VH. faktor cDNS-t tartalmaz.

Egy második klőnt, a XVH565-öt izoláljuk, amely olyan cDNS-inszertumot tartalmaz, amely a 9-638. nukleotidok között azonos a XVII2463 klón cDNSével, azzal a különbséggel, hogy ebben hiányoznak a 100. és 165. helyzetek közti nukleotidok (IB ábra). A cDNS-eket a VH. faktor genom DNS-sel összehasonlítva, a távollevő szekvenciák pontosan egy exonszerű területnek felelnek meg. Ennek megfelelően két VH. faktor cDNS-t nyerünk, amely úgy tűnik, alternatív mRNS összeillesztési eseményeket tükröz.

A XVH2463 által kódolt vezetőszekvencia kivételesen hosszú (60 aminosav), és nagyon eltérő hidrofobicitási profilt mutat, amikor a IX. faktorral, C-fehérjével és protrombinnal összehasonlítjuk. Ez a vezetőszekvencia két met-csoportot tartalmaz a -60. és -26. helyzetben. Az iniciálás valószínűleg az első met-csoportnál kezdődik, mível ez egy hidrofób terület, amely a szígnálpeptidekre jellemző, ezt követi a met-csoport a 60. helyzetben, de nem követi a -26. helyzetben. Érdekes, hogy a VH565 szekvenciája, amely a genomklónban pontosan egy exonszerű területnek felel meg, egy olyan hidrofobicitási tulajdonságokkal rendelkező 38 aminosavas vezető, amelyek inkább a IX. faktorhoz, C-fehérjéhez és protrombinhoz hasonlítanak.

HU 204 556 Β

Mivel nem világos, hogy a fentebb leírt vezetőszekvenciák melyike (ha egyáltalán valamelyik) autentikus, továbbelemeztük az 5’ végszekvenciákat. Röviden, ez az elemzés magában foglalja egy humán genom DNSkönyvtár megalkotását és átvizsgálását, valamint a VII. faktor génszekvenciákat tartalmazó genomklónok azonosítását. A genomszekvencia 5’ végét ezután a cDNSsel egyesítjük, hogy teljes hosszúságú kiónt alkossunk meg.

Egy további konstrukcióban a vezető szekvenciát és az érett fehérje 29 aminosavát kódoló szekvenciát tartalmazó VII565 VII. faktor cDNS 5’-fragmensét ligáljuk egy VII2463 cDNS-fragmenshez (amely az érett fehérje maradékát kódoló részt és a 3'-transzlációnak alá nem vetett szekvenciákat tartalmazza). Ez az „565-2463” szekvencia kódol egy teljes hosszúságú VÉL faktor cDNS-szekvenciát, mint egyedi EcoRl fragmenst.

A fentebb leírt DNS-szekvenciákat azután beiktatjuk egy megfelelő kifejeződő vektorba, amelyet viszont emlős sejtvonal fertőzéséhez használunk fel. A jelen találmány kivitelezésében alkalmas kifejeződő vektorok tartalmaznak egy promotort, amely képes egy idegen gén átírásának irányítására egy fertőzött emlős sejtben. Vírus eredetű promotorok az előnyösek hatékonyságuk miatt az átírás irányításában. Különösen előnyös ilyen promotorként a 2. adenovírusból származó nagyobb, késői promotor. Az ilyen kifejeződő vektorok tartalmaznak még egy sorozat RNS-ülesztő helyet is a promotortól lefelé és a véralvadás biológiai aktivitásával bíró fehérjét kódoló gén beiktatási helyétől lefelé. Előnyös RNS-t kapcsoló szekvenciákat nyerhetünk az adenovírus és/vagy immunoglobulingénekből. A kifejeződő vektorokban van még egy poliadenilező jel is, a beiktatási helytől lefelé elhelyezkedve. Előnyösek a vírus eredetű poliadenilező helyek, mint pl. az SV40-ből származó korai vagy késői poliadenilezési jelek, vagy az adenovírus 5:E/b területből származó poliadenilezési jel. Egy különösen előnyös kiviteli módban a kifejeződő vektor tartalmaz egy vírus eredetű vezetőszekvenciát is, mint pl. a 2. adenovírus háromrészes vezetőszekvenciája, a promotor és az RNSillesztő helyek közt elhelyezkedve. Az előnyös vektorok lehetnek erősítő-(enhancer) szekvenciák is, ilyen pl. az SV40 erősítőszekvencia.

A klónozott DNS-szekvenciákat azután be lehet vezetni tenyésztett emlős sejtekbe kalcium-foszfáttal közvetített fertőzéssel [Wigler és munkatársai: Cell, 14, 725 (1978); Corsara és Pearson: Somatic Cell Genetics 7,603 (1981); Grahamés van dér Eb: Virology, 52,456 (1973)]. A DNS és kalcium-foszfát csapadéka képződik, és ezt a csapadékot alkalmazzuk a sejtekhez. A sejtek egy része felveszi a DNS-t és fenntartja ezt a sejten belül több napon át. A sejteknek egy kis része (tipikusan 1 θ'⁴) stabilan integrálja a DNS-t a genomba. Abból a célból, hogy azonosítsuk ezeket a stabil integránsokat, általában egy olyan gént vezetünk be a szóban forgó génnel együtt, amely egy szelektálható fenotípust (egy szelektálható markert) hordoz. Az előnyös szelektálható markerek között vannak azok a gének, amelyek gyógyszerek elleni, pl. G-418 és metotrexát elleni rezisztenciát adnak át. Szelektálható markereket lehet bevezetni a sejtbe külön plazmidokon ugyanakkor, amikor a szóban forgó gént bevezetjük, vagy lehet ezeket ugyanazon a plazmidon is bevezetni. Előnyös szelektálható marker a G-418 gyógyszer elleni rezisztencia génje, amelyet a pKO-neo plazmid hordoz [Southern és Berg: J. Mól. Appl. Génét. 1, 327341 (1982)]. Előnyös továbbá hozzáadni egy további DNS-t, amely „hordozó-DNS-ként ismert, a keverékhez, amelyet bevezetünk a sejtbe. Miután a sejtek felvették a DNS-t, ezeket hagyni kell nőni egy ideig, tipikusan 1-2 napig, hogy megkezdődjék a szóban foigó gén kifejeződése. A gyógyszeres szelekciót alkalmazzuk ezután, hogy növekedés alapján azokat a sejteket kiválasszuk, amelyek a szelektálható markert stabilan kifejezik. Az ilyen sejtek kiónjait vizsgálhatjuk át a szóban forgó fehérje kifejezésére.

A fertőzött sejtek által termelt VII. faktort és IX. faktort a sejtek tápközegéből bárium-citrátra való adszorpcióval távolíthatjuk el. A használt tápközeget nátrium-citráttal és bárium-kloriddal összekeverjük és a csapadékot összegyűjtjük. A kicsapódott anyagot ezután megvizsgálhatjuk a megfelelő alvasztó faktor jelenlétére. További tisztítást lehet elérni immuno-adszorpcióval. Előnyös, ha az immuno-adszorpciós oszlop tartalmaz egy nagy fajlagosságú monoklonális antitestet. Egy más módszer szerint a bárium-citráttal kicsapott anyag tisztítását végre lehet hajtani többféle hagyományos biokémiai módszerrel, vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfíával (HPLC).

Az egyláncú VII. faktor átalakítását aktív, kétláncú VHa faktorrá a Xlla faktort alkalmazva hajthatjuk végre, amint ezt Hedner és Kisiel leírták [J. Clin. Invest. 71, 1836-1841 (1983)], vagy olyan proteázokat alkalmazva, amelyeknek tripszinszeru aktivitása van [Kisiel és Fujikawa: Behring Inst. Mitt. 73,29-42 (1983)].

Összefoglalva, a jelen találmány eljárást nyújt K-vitaminfüggő véralvadási faktorok aktivitásával bíró fehérjék előállítására, fertőzött emlős sejteket alkalmazva. Az alvadási faktorok fajlagos szerinproteáz tartományát kódoló génszekvenciákat cDNS-könyvtárakból izoláljuk. A vezető peptideket és kalciumkötő tartományokat kódoló szekvenciákat cDNS vagy genomköny vtárakból izoláljuk vagy szintetikus oligonukleotidokból alkotjuk meg. A szekvenciákat azután összekapcsoljuk megfelelő kifejező vektorban olyan módon, hogy a véralvadás szempontjából a kívánt biológiai aktivitással bíró fehérjét kódolja. Az így létrejött vektort és egy gyógyszer-rezisztencia markert tartalmazó plazmidot ezután együtt fertőzzük megfelelő emlős szövettenyészet sejtjeibe. A fertőzött sejteket azután a megfelelő gyógyszer, pl. G-418 hozzáadásával választhatjuk ki. A fehérjeterméket azután a sejtnövesztő tápközegből megtisztítjuk, és biológiai aktivitását véralvadási vizsgálattal mérjük, és immunológiai keresztreaktivitását is mérjük, autentikus humán alvadási faktorok ellen készített antitesteket alkalmazva.

Az alábbi példákat a következőképpen foglaljuk össze. Az 1. példa a VH. faktorhoz tartozó teljes hoszszúságú cDNS-szekvencia klónozását ismerteti. A 2. példa a humán VH. faktor részleges aminosavszekven7

HU 204556 Β ciáját ismerteti, beleértve az aminoterminálisnál levő mintegy 30 aminosav szekvenciáját A 3. példa egy humán genom DNS-könyvtár megalkotását és átvizsgálását, valamint a VH faktor génszekvencíákat tartalmazó genomklőnok azonosítását ismerteti. A 4. példa 5 két hibrid génszegmenst ismertet, amelyek mindegyike egy, a EX. faktor vezetopeptidjét kódoló cDNS-fragmenst és egy, az együttműködó kalciumkötó tartományt kódoló szintetizált kettős szálú fragmenst tartalmaz. A hibrid molekulát azután összekapcsoljuk a VH. 10 faktor részleges cDNS-klónjaival. In vitro mutagenezist alkalmazva az együttműködő szekvenciát azután megváltoztatjuk olyan módon, hogy összhangban legyen a VH. faktorhoz tartozó fehérjeszekvencia adatokkal. Az 5. példa a IX. faktor kalciumkötő tartomá- 15 nyát és a VH. faktor fajlagos szerinproteáz tartományát tartalmazó fúziós fehéq'ét kódoló génszekvencia megalkotását íq'a le. A 6. példa a pD2-vektor megalkotását íq’a le a véralvadás szempontjából biológiai aktivitással bíró fehérjék fertőzött emlős sejtekben történő kife- 20 jezésére. Az 5. példában lent fúziós gént fejezzük ki ezt a vektort alkalmazva. A 7. példa a pD2-vektor alkalmazását íq'a le egy IX. faktorhoz tartozó gén kifejezéséhez fertőzött emlős sejtvonalban. A 8. példa pM7135-vektor megalkotását íq'a le, amely a VH. fák- 25 torhoz fuzionált EX. faktor vezetőszekvenciáját tartalmazó primer transzlációs terméket kódoló DNS-szekvencíákat tartalmazza. Ezt a vektort lehet alkalmazni VH. faktor aktivitásával bíró fehérje termelésére fertőzött emlős sejtvonalban. A 9. példa írja le a VH. faktor 30 kifejeződését cDNS-szekvencíákat alkalmazva, és a VH. faktor kifejeződését egy genom cDNS hibrid szekvenciából.

Az alábhi példák célja a bemutatás, és semmiképpen sem az oltalmi kör korlátozása. 35

Példák

A restrikciós enzimeket a Bethesda Research Laboratories-tól (BRL) és a New England Biolabs-tól szerezzük be, és olyan módon használjuk, ahogyan ezt a 40 gyártó előírja, hacsak másként nem jelezzük. Az oligonukleotidokat Applied Biosystems 380A Model DNSszintetizátorral szintetizáljuk, és poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk denaturáló géleken. AzE. coli sejteket úgy transzformáljuk, ahogyan ezt Maniatis és 45 munkatársai leírták [Molecular CIoning·. A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Labóratőriumi kézikönyv), Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az M13 és pUC klónozó vektorokat és a gazdasejteket a BRL-től szerezzük be. A VH. faktort a humánplazmá- 50 bői a Kisíel és McMullen (lásd fentebb) által leírtak szerint állítjuk elő.

I. példa

A részleges VII. faktor cDNS klónozása 55

A) Emberi máj cDNS-könyvtár megalkotása Emberi máj mRNS-ből cDNS-kőnyvtárat állítunk elő Chandra és munkatársai módszerével [Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 80, 1845-1848 (1983)]. A cDNS-készítményt alkalikus szacharóz gradiensen át ülepítjük 60 [Monakon és munkatársai: Biochemistry 15, 223-233 (1976)], és a több mint 1000 nukleotidot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Az egyszálas készítményt kétszálassá alakítjuk, reverz transzkriptázt alkalmazva^ (Chandra és munkatársai, 1983. fentebb idézett közlemény), SÍ nukleázzal kezelve, és a maradék elcsúsztatott végeket betöltjük DNS-polimeráz I-et (Klenowfragmens) alkalmazva mind a négy dezoxiribonukleotíd-trifoszfát jelenlétében [Maniatis és munkatársai: Molecular CIoning: A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi kézikönyv) Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. A tompa végű cDNS-t EcoRl metilázzal kezeljük és foszforilezett EcoRl linketekhez ligáljuk T4DNS-lígázt alkalmazva (lásd Maniatis és munkatársai: fentebb idézett munka). A ligáit DNS-készítményt kimerítően emésztjük EcoRI-gyel, hogy eltávolítsuk a fölösleges Iinkerszekvenciákat, és kb. 1000 bázispámál hosszabb kettős szálú DNS-eket semleges szacharőzgradiens centrifugálással tisztítjuk (lásd Maniatis és munkatársai: fentebb idézett munka). Natív Xgtll DNS-t Iigálunk konkatamerekbe, teljességig emésztjük EcoRI-gyel, és az 5’ terminális foszfátokat bakteriális alkalikus foszfatázos kezeléssel eltávolítjuk. Az összegyűjtött humán máj cDNS-t a fág DNS-sel ligáljuk, in vitro „csomagoljuk” (lásd Maniatis és munkatársai: fentebb idézett munka) és E. coli Y1088 fertőzésére használjuk [Young és Davis: Science, 222,778782 (1983)]. Mintegy 14· 10® primer fág tarfoltot alakítunk ki ebben a könyvtárban, amely hét, egyenként ~2·10® tarfoltot tartalmazó könyvtárból tevődik össze. Ezeknek több mint 90%-a olyan rekombináns, amely humán DNS inszertumot tartalmaz. Ezt a β-galaktozidáz aktivitásuk hiányára, valamint 20 véletlenszerűen kiválasztott klón jellemzésére alapozzuk, ahol a jellemzést EcoRl emésztéssel és ezt követő agarózgél elektroforézissel végezve, A cDNS-könyvtárat, fágrészecskék formájában, cézium-kloridos gradiens centrifugálással tisztítjuk, és SM pufferben tároljuk (lásd Maniatis és munkatársai: fentebb idézett munka).

B) Humán máj cDNS-könyvtár átvizsgálása VII. faktorklónokra

A fentebb leírt emberi máj kifejeződő cDNS-köny vtárat fajlagos antigénre vizsgáljuk át (Young és Davis, fentebb idézett munka), ¹²⁵I-jelzett monoklonális VH. faktorantitestet alkalmazva; ezt az antitestet Brown és munkatársainak módszerével állítjuk elő [J. Bioi. Chem. 225, 4980-4983 (1980)] tisztított VH. faktort alkalmazva. 6*10® fág tarfolt átvizsgálása során egy antitesttel pozitív választ adó izolátumot azonosítunk, ezt LVII2115-nek nevezzük.

A XVH2115 fágklónt két másik VH. faktor elleni monoklonális antitest ellen is megvizsgáljuk, valamint egy VH. faktor elleni nyúl poliklonáüs antitesttel. A λνΠ2115 pozitív választ ad mindezekre a VH. faktor elleni antitestekre.

DNS-t készítünk XVH2U5 lemez lizátumából [Maniatis és munkatársai: fentebb idézett munka, 65-66. oldal (1982)]. Ennek a DNS-nek az emésztése EcoRIgyel egy 2139 bázispáros inszertumot szabadít fel. Ezt

HU 204 556 Β az inszertumot M13 fágvektorokba szubklónozzuk [Messing: Meth. in Enzymology, 101, 20-77 (1983); és Norrander és munkatársai: Gene, 26, 101-106 (1983)] a láncvégzódéses didezoxi-DNS-szekvenciaelemzéshez [Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,5463-5476 (1977)]. Ez a cDNS-beiktatás Pst helyeket tartalmaz a 214., 839. és 1025. helyeknél (ezeket az 1A ábrában Pst Ia-nak, Pst Ib-nek, illetve Pst Ic-nek jelöljük), és egy Sma helyet tartalmaz a 611. helyzetnél. A következő M13 templátokat vetjük alá szekvenciaelemzésnek:

1. teljes hosszúságú (2139 bázis) EcoRIa->EcoRIb fragmens az M13mp 18-ban (F7-1 kiónnak nevezve);

2. Pst Ia->EcoRIa 214 bázis fragmens M13mpl9-ben (F7-2);

3. Pst Ia-^Pst Ib 625 bázis fragmens M13mpl8-ban (F7-3);

4. Pst Ib—>Pst la 625 bázis fragmens M13mpl8-ban (F7-7);

5. Sma I->Pst Ib 228 bázis fragmens M13mpl0-ben (F7—8);

6. Pst Ib->Pst Ic 366 bázis fragmens M13mpl8-ban (F7-9);

7. Pst Ic—>Pst Ib 366 bázis fragmens M13mpl8-ban (F7-10);

8. Pst Ic—>EcoRIb 930 bázis fragmens M13mpl8-ban (F7-11);

9. EcoRIb—>EcoRIa teljes hosszúságú fragmens

M13mpl8-ban (F7-12). (A restrikciós hely jelölések mind az 1A ábrára utalnak.)

Az adatok igazolják a szekvencia mindkét szálán a kódoló terület 91%-át és a nem kódoló terület 15%-át, és egyszálú szekvencia-információt adnak a kódoló terület fennmaradó 9%-ára és a nem kódoló terület fennmaradó 85%-ára.

A cDNS-szekvenciából előre jósolt aminosavszekvencia összehasonlítása Kisiel és MacMullen ismert aminosavszekvencia adataival [Thrombosis Research 22, 375 (1981)], és az alább bemutatott aminosavszekvencia (2. példa) anomáliát tár fel, amelyet három nukleotid hiányával lehet megmagyarázni a 400. hely közelében. Hogy további szekvenciaadatokat nyeljünk, 7VH2115-öt emésztünk EcoRI-gyel, és a VH. faktor kódolt fragmenst pUC 13-ba [Vieira és Messing: Gene, 19, 259-268 (1982)] iktatjuk, amelyet előzőleg EcoRI-gyel hasítottunk. Az így létrejött rekombináns plazmidot, amelyet pUCVH2115-nek nevezünk, Xbal-gyel hasítjuk, amely a 328. helyzetnél hasít. Az emésztett mintát megfelezzük: az egyik felet ct-³²P-dCTP- vei és DNS-polimeráz I-gyel (Klenow-fragmens) jelöljük [Englund P.T.: J. Mól. Bioi. 66,209 (1972)]; a másik felet γ-³²Ρ-ATP-vel és polinukleotid-kinázzal jelöljük [Charonas és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 66, 962 (1975)]. Ajelölt plazmidokat azután újra hasítjuk Pst I-gyel, így 113 és 509 bázispáros fragmenseket kapva. Ezek mindegyikének mindkét szálát szekvenciaelemzésnek vetjük alá Maxam és Gilbert módszerével [Meth. in Enzimology 74, 560 (1980)]. A113 bázispáros fragmenst teljes egészében szekvenciaanalízisnek vetjük alá, míg az 509 bázispáros fragmensből 210 bázispárt vetünk alá szekvenciaelemzésnek. Ezek a szekvenciák három további bázist tárnak fel (egy C-t és két G-t), amelyek helyreállítják a DNSszekvenciaadatok egyezését a fehérjeszekvencia adatokkal, jelezve, hogy a korábbi rendellenes eredmények a szekvenciavizsgálathoz használt gélen való sűrítésből fakadnak; ez a G-ket és C-ket érintő másodlagos szerkezetnek tulajdonítható. A kódoló terület utolsó 9%-ának szekvenciáját is bizonyítjuk mindkét szálon.

A pUCVII2115 inszertum szekvenciájának további elemzése bebizonyítja, hogy ennek a klónozott fragmensnek egy része 11 aminosavból álló szekvenciát kódol, amelyről ismert, hogy a VII, faktor hasítási helyénél van [Kisiel és McMullen: Thrombosis Research 22, 375 (1981)]. Ennek a szekvenciának az összehasonlítása a IX. faktor (Davie és munkatársai, korábban idézett munka) és a X. faktor [Leytus és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,3699-3ΊΟ2 (1984)] aminosavszekvenciáival azt sugallja, hogy a klón tartalmazza a VII. faktorhoz tartozó szekvenciát az érett VH. faktorfehérje kb. 36. aminosavját kódoló nukleotidoktól kezdve, és folytatódik mintegy 1000 kódoló és 1100 nem kódoló nukleotidon és a poli-A-szekvencián keresztül. Ezenkívül azt találjuk, hogy ennek akiónnak keretelcsúszásos mutációi vannak a 3’ kódolórészben.

Abból a célból, hogy korrekt 3’ kódolóterületet kapjunk, a hét Xgtll cDNS-könyvtár mind a 14 millió kiónját átvizsgáljuk telep (tarfolt) hibridizálással [Benton és Dávid: Science, 196,180-181 (1977)] %VÜ2115 hézagtranszlációnak (nick-transzláció) alávetett cDNSével [Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka 109-112 (1982)].

Hét pozitív izolátumot vizsgálunk át ezután pUC plazmidok didezoxi-szekvencia-elemzésével, amely plazmidokba a cDNS beiktatásokat előzőleg szubklónoztuk [Wallace és munkatársai: Gene, 16, 21(1981)]. A Xgtll kiónokat EcoRI-gyel emésztjük és a VII. faktorfragmenseket pUC13-ba beiktatjuk, amelyet előzőleg EcoRI-gyel hasítottunk. Ezek közül egy kivételével mindegyikről úgy találjuk, hogy a 7VII2115-ben levő beiktatás 212. bázisának megfelelő helyzetnél kezdődnek; az egyetlen kivétel csak 3 ’ nem kódoló szekvenciából áll. A 212. bázisnál kezdődő kiónok egyikét elemzésre kiválasztjuk, ezt pUCVII1923-nak nevezzük.

Mivel a pUCVH2115 elemzése keretelcsúszásos mutációk jelenlétét jelzi a 657. és 815. helyzetek között, a pUCVH1923-at először ebben a területben elemezzük Maxam- és Gilbert-szekvenciaelemzéssel. A pUCVII1923 plazmidot Narl-gyel emésztjük (az 1A ábra szerinti 779. helyzet). A hasított DNS-t ³²P-dCTPvel jelezzük, DNS polimeráz I-et (Klenow-fragmens) alkalmazva, és ezt követően Aval-gyel (amely azonos helyen hasít, mint az Smal az 1. ábrában) és Taql-gyel (1059. hely) hasítunk, egy NarI - Aval 160 bp-s fragmenst és egy NarI - Taql 200 bp-s fragmenst nyerve. Ezeknek mindegyikét szekvenciaelemzésnek vetjük alá. Egy C hiányát találjuk a pUCVH2115-ben a 697. helyen, és egy másik C hiányát találjuk szintén a pUCVII2115-ben a 798. helyen.

HU 204556 Β

ApUCVH923 kódoló területe szekvenciájának további részéről kimutatjuk, hogy korrekt a didezoximódszerrel a pUCVH1923 teljes beiktatása M13 szubklónján végzett szekvenciaelemzés szerint. A ZC 87 Lac prímért (1. táblázat) alkalmazzuk a 212. helyzettől az 512. helyzetig (IA ábra) tartó szekvenciához, a ZC 218 prímért (CTCTGCCTGCCGAAC) alkalmazzuk a 715-től 1140_T ig, és a ZC 217 prímért (AIGAGAAGCGCACGAAG) alkalmazzuk a 720-től 350-ig terjedő szekvenciákhoz. Mivel a pUCVH2115 beiktatás korrekt a 13. helyzettől (az 1-12. helyzetek egy mesterséges kapcsolót foglalnak magukban) a 695. helyzetig és a pUCVII1923 korrekt a 212. helyzettől a végéig, a kettőt egymásba illeszthetjük egy olyan molekulát nyerve, amely konekta 13. helyzettől a végéig (IA ábra). Egy ehhez az összeillesztéshez hasznosított kényelmes pont az Xbal hely a 328. helyzetnél. Az összeillesztett, korrigált molekula szekvenciáját az 1A ábrán mutatjuk be.

Mivel nehéz egy teljes hosszúságú VH. faktorklónt nyerni cDNS-klőnozással, három stratégiát választunk, í hogy a hiányzó kődolószekvencrát és a szükséges „felfelé” levő feldolgozó- és szignálszekvenciákat megkapjuk. Az első stratégia az, hogy a szükséges szekvenciát egy humán genom DNS-könyvtárból vagy cDNSkönyvtárak további átvizsgálása útján nyerjük. A máso- 2 dik megközelítés a szükséges 5’ kődolószekvencia szintézise, a VH. faktor aminosavszekvencia adataira alapozva (2. példa) és a K-vitaminfüggő alvadási faktorokat kódoló gének publikált szekvenciáira alapozva (Kurachi és Davie, fentebb idézett munka; valamint 3 Davie és munkatársai, fentebb idézett munka), és ezt a IX. faktor preproszekvenciájának egy részletével egyesítjük. A harmadik stratégia a VH. faktor és IX. faktor ammoterminális területeinek funkcionális homolőgiájára épül. Olyan szekvenciát alkotunk meg, amely a IX. 3; faktor vezető- és aminoterminális részét kódoló területeket tartalmazza. Ezt azután megfelelő orientációban fuzionáljuk a részleges VH. faktor cDNS-hez.

Abból a célból, hogy olyan DNS-szekvenciákat nyerjünk, amely a VH. faktor teljes DNS-szekvenciáját 41 tartalmazza, kísérletet teszünk, hogy izoláljuk a maradék 5’ DNS-szekvenciát. Ezt a λνΠ21Ι5 cDNS beiktatásából származó 5’ terminális 0,3 kb-s EcoRl - Xbal fragmens felhasználása révén valósítjuk meg, hogy átvizsgáljunk egy 2U0⁵ fágot tartalmazó cDNS könyv- 4£ tárat. A könyvtárat HepG2 sejtekből származó poli(A)mRNS-t alkalmazva alkotjuk meg, Gubler és Hofiman módszerének egy átalakítását követve [Gene,

25,263-269 (1983)]. Az RNS-t fordított átírásnak vetjük alá, hogy egyes szálú cDNS-t hozzunk létre, ezt 5C követi a második szál szintézise DNS-polimeráz I-et és RN-áz H-t alkalmazva. Az EcoRl metilezést és egy Sepharose 6B oszlopon való átbocsátást követően, a DNS-végeket tompavégűvé alakítjuk TíDNS-polhnerázzal. EcoRl kapcsolókat adunk hozzá és a kapcsolók 55 fölöslegét EcoRI-gyel végzett emésztéssel és Sepharose Cl 2B-n végzett kromatografálással eltávolítjuk. Az üres térfogatban levő DNS-t összegyűjtjük és Xgtllhez ligáljuk, amelyet előzőleg EcoRI-gyel emésztettünk és borjúbél-foszfatázzal kezeltünk. A DNS-t „be- 60 csomagoljuk” és E. coli Y1088-ba fertőzzük. Számos pozitív telepet észlelünk, és az EcoRl fragmenseket ezt követőén M13 fágvektorokba szubklónozzuk didezoxiszekvenciaelemzéshez, vagy Ml 3 univerzális prímért, vagy VH. faktor fajlagos oligonukleotidokat alkalmazva.

Ezekből három új VH. faktor cDNS-klónt nyerünk, és szekvenciájukat teljesen meghatározzuk. Ezeknek a cDNS-eknek legnagyobbikáról, egy XVH2463-nak ne10 vezett klőnról, úgy találjuk, hogy tartalmazza a VH. faktorhoz tartozó teljes kódolószekvenciát. Ez a klón magában foglal egy 35 nukleotidos 5’-transzlációnak alá nem vetett területet, a vezetőszekvencia 60 aminosavát kódoló 180 nukleotidot, az érett fehérje 406 ami15 nosavát kódoló 1218 nukleotidot, egy stop-kodont, a 3'-transzlációnak alá nem vetett 1026 nukleotidot, és egy 20 bázisból álló poli(A)-faktort (amely a 2463. helyzetnél kezdődik). Ezt a cDNS-t azután szekvenciaelemzésnek vetjük alá teljes egészében mindkét szálon.

Ennek összehasonlítása a korábban a XVH2115 és λΎΠ1923 kiónokból izolált cDNS-ekkel feltálja, hogy a λνΠ2463 klón tartalmaz egy 321 tagból álló többletnukleotidot a λνΠ2115-ben levő beiktatástól „fölfelé” és egy 519 tagú nukleotidot a XVH1923-ban lévő beik!5 tatástól „fölfelé”. A XVH2463-nak és ennek a korábbi két cDNS-nek az átfedő VH. faktorszekvenciái megegyeznek, kivéve, hogy a XVH2463 cDNS-e nem tartalmaz egyedi báziskihagyásokat (deléció) az 1005. és 1106. helyeken, amelyet a XVH2115 cDNS-ében észle0 lünk. így a λΥΠ2463 tartalmaz egy egyedi EcoRl fragmensen egy VH. faktor cDNS-t, amely a VH. faktor vezető- és érett fehérje szekvenciáit kódolja.

Egy további cDNS-t, a λνΠ565-δζ izoláljuk és úgy találjuk, hogy tartalmazza az 5’ terminális VH. faktor5 szekvenciákat, de meg van csonkítva a kódolőszekvencián belül. 5’ vége a 9. nukleotidnál van feltérképezve (IB ábra).

Amikor a teljes hosszúságú kVn2463-mal összehasonlítjuk, a λνΠ565-Γ01 úgy találjuk, hogy hiányzik 3 egy olyan szekvenciája, amely egy exonszerű területnek felel meg a vezetőszekvencián belül. A 100-165 bázisok hiányoznak a VH565-ből (IB ábra). A hiányzó szekvenciák pontosan megfelelnek egy exonszerű területnek, összehasonlítva a genomszekvencia-adatokkal ) (amint ezt a 3. példában leírjuk). így a XVH565 szerkezet egy más irányú összeillesztési esemény következménye lehet a vezetőszekvenciában.

A λνΠ2463 által kódolt vezetőszekvencia kivételesen hosszú (60 aminosav), és nagyon eltérő hidrofobicitási ¹ profilt mutat, amikor a IX. faktorral, C-fehérjével és protrombinnal összehasonlítjuk. Ez a vezetőszekvencia két Met-et tartalmaz, a -60. és -26. helyzeteknél. A beindulás legvalószínűbben az első Met- nél kezdődik, mivel egy hidrofób terület, amely a szignálpeptidekre jellemző, követi a -60. helyzetnél levő Met-et, de nem követi a -26. helyzetnél levőMet-et. Érdekes, hogy a XVH565-ben hiányzó szekvenciák, amelyek pontosan megfelelnek egy exonszerű területnek a genomklőnban, 38 aminosavból álló vezetőszekvenciát eredményeznek, olyan hidrofobicitási profillal, amely inkább analóg a fenti fehérjékkel.

HU 204 556 Β

2. példa

A humán VII. faktor aminosavszekvenciája

A humán VH. faktor aminosavszekvenciájának tisztítása kívánatos azért, hogy igazoljuk a vélt cDNS-klónok azonosságát, bebizonyítsuk VH, faktor cDNSszekvenciáját, információt nyújtsunk, amely lehetővé teszi a fajlagos oligonukleotid vizsgáló minták szintézisét az 5’ szekvenciát tartalmazó kiónokhoz tartozó cDNS- és genom-könyvtárak átvizsgálásához, és megalkossunk egy, a VH. faktor aminoterminális részét kódoló szintetikus fragmenst. Bár korlátozott aminosavszekvenciát már adott Kisiel és McMullen (fentebb idézett munka), további információk szükségesek.

Tisztított humán VHa faktort (Kisiel és McMullen, fentebb idézett munka) redukálunk és karboxi-metilezünk Crestfield és munkatársai módszerével [J. Bioi. Chem. 238, 622 (1963)]. A karboxi-metilezett VHa faktor könnyű és nehéz polipeptidláncait nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) különítjük el Micro Pák C18 fordított fázisú oszlopon (Varian Corp.), 0,1% TFA desztillált vízben (A) és 0,1% TFA acetonitrilben (B) gradiensét alakítva ki 0-40% B-ig 5 perc alatt, 40-80% B között 25 perc alatt és 80-100% B között 5 perc alatt. Mindegyik peptidláncból mintegy 300 pikomólt elemzünk automatizált Edman-lebontással, Gas-Phase Protein Sequencer-t (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazva. 18 és 29 gyököt azonosítunk a nehéz, illetve könnyű polipeptidlánc aminosavterminálisáról. A VHa faktor nehéz láncának aminosavszekvenciája egybevág a pUC2115 cDNS-klón által kódolt szekvenciával (2B ábra). Az aminosavakat a 2A és 2B ábrákban egyedi betűkódokkal jelöljük a következőképpen: A=alanin; C-cisztein; D=aszparaginsav; E-glutaminsav; F-fenil-alanin; G=glicin; H=hisztidin; I-izoleucin; K=lizin; L-leucin; M=metionin; N=aszparagin; P=prolin; Q=glutamin; R-arginin; S=szerin; T=treonin; V=valin; W=triptofán; Y=tirozin; X=ismeretlen gyököt jelent, és * azt jelzi, hogy a Glu-gyökök (γ) homológiát jelentenek más ismert alvadási faktorok szerkezetéhez és bármilyen más fenil-tio-hidantoinaminosav távollétet jelenti ezeknél a helyzeteknél. A hézagok (-) úgy helyezkednek el, hogy a legjobb felállítást nyújtsák a szekvenciák között. Ezenkívül az információ azt jelzi, hogy az aminosav a 3. és 9. helyzetnél lizin, és nem treonin, illetve arginin, amint ezt korábban leírták (Kisiel és McMullen, korábban idézett munka). A VHa faktor könnyű láncának szekvenciaelemzése, amely a VII. faktor aminoterminális területéből ered, lemarad mintegy 6 gyökkel az pUCVH2115 cDNS-klón 5’ vége által kódolt szerkezettel való átfedéshez.

Hogy további szekvenciaadatokat nyerjünk, két nanomól karboxi-metilezett könnyű láncot emésztünk 12 órán át szarvasmarha-eredetű kimotripszinnel (1:100 tömeg/tömeg enzimszubsztrátum arány) 0,1 mól/l-es ammónium-karbonátban (pH-7,8), 37 ’C hőmérsékleten. A keletkezett fragmenseket HPLC-vel tisztítjuk Micro Pák C18 fordított fázisú oszlopon, a fenti oldószereket alkalmazva 0-30 B gradiensben 5 percen át, 30-60% B közti gradiensben 25 percen át és 60-80% B közti gradiensben percen át. A peptideket 220 és 280 nm-en mutatott abszorpciójuk alapján azonosítjuk. Liofilizett peptideket (mindegyik kb. 1 nanomól) elemzünk Edman-lebontással. Az eredmények (2B ábra) igazolják a cDNS-szekvencia nagy részét a pUCVH2115 klón megfelelő területében. Összességében a VHa faktor könnyű peptidláncának 152 gyökéből 113-at (75%) azonosítunk. Ez a szekvencia azonos azzal, amelyet az ismert cDNS-szerkezet kódol. Közvetett bizonyítékok azt jelzik, hogy az Asn 145 a szénhidrát-kapcsolás helye.

3. példa

A genom VII. faktor szekvenciájának klónozása

Egyik megközelítésként, hogy a cDNS-ből hiányzó 5’ végszekvenciát szolgáltassuk, humán embrió máj DNS-t tartalmazó lambda-fág könyvtárat (Lawn és munkatársai: Cell, 15, 1157-1174) vizsgálunk át „bemetszett” transzlációnak (nick-transzláció) alávetett VH. faktor cDNS-sel. A genom könyvtár egy részletét E. coli LE392-n (ATCC 33572) szélesztjük, hogy öszszesen 7,2· 10⁶ tarfoltot alakítsunk ki (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 320-321. oldal). A fágtarfoltokat azután a lemezekről nitrocellulózra adszorbeáljuk és a ³²P-ral jelzett cDNS-sel hibridizáljuk Benton és Davis módszere szerint [Science, 196, 180 (1977)]. Nyolc kiónt nyerünk és tarfoltból tisztítunk.

A VH. faktor cDNS (XVH2115) 5’ végéből származó DNS-fragmenst (EcoRI-Xbal, 1. ábra) és standard technikákat (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka) alkalmazva 5’ végszekvenciákat tartalmazó genomklónokat azonosítunk. Ezeket a fágokat 7ml-nek, 7m2-nek és 7m3-nak nevezzük. DNS-t készítünk ezekből a rekombináns fágokból és előzetes restrikciós endonukleázos térképet kapunk. A 7ml-et, amely a legerősebb hibridizációs jelet adja, használjuk kiterjedtebb restrikciós térkép megalkotására és az EcoRIXbal cDNS-szekvenciák elhelyezésére ezen a térképen Southem-foltképzéssel [Southern: J. Mól. Bioi. 98,503 (1975)].

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon a 7ml fág tartalmazza-e a VII. faktor fehérje aminoterminális aminosavait kódoló DNS- szekvenciákat, a fág DNS restrikciós emésztésének Southem-foltjait olyan oligonukleotidok keverékeivel hibridizáljuk, amely szekvenciákat a VII. faktor aminoterminális aminosavszekvenciájából vezetünk le. A ZC188, ZC360 és ZC401 oligonukleotidokat (1. táblázat) radioaktivan jelezzük T4-polinukleotid-kinázzal és a fág DNS foltokhoz hibridizáljuk néhány ’C-kal alacsonyabb hőmérsékletnél, mint a Tm értékük [Wallace R. B. és munkatársai: Nuc. Acids. Rés. 6, 3543-3557 (1979)]. Ennek az elemzésnek az eredményei azt jelzik, hogy a 7ml 3,7 kb-s SstI fragmense tartalmaz ezekhez az oligonukleotidokhoz hibridizáló szekvenciákat. Ezeket az SstI fragmenseket Ml3-ba szubklónozzuk DNS-szekvenciaelemzéshez. A ZC360-at, mind szekvenciaelemző prímért alkalmazva nyert eredmények egy mintegy 60 nukleotid hosszúságú területet azonosítanak, amely megfelel az aminoterminális fehérje szekvenciaadatoknak.

HU 204556 Β

1. táblázat

Oligonukleotíd Szekvencia

ZC&7	TCC CAG TCA CGA CGT	A
T	G
ZC188	GCC	GGG CTCA CTC	CTC		CA	GAA	GGC	GTTGG
		(		A			G
ZC212	GAC	CTG	CAG	GAT	CCA	TGC	AGC	GCG	TGA	ACA	TGA
	TCA	TGG
ZC213	GAG	GCC	TGG	TGA	TTC	TGC	CAT	GAT	CAT	GTT	CAC
	GCG	CTG								•
ZC217	ATG	AGA	AGC	GCA	CGA	AG
ZC218	CTC	TGC	CTG	CCG	AAC
ZC235	GAT	CCA	TGC	AGC	GC
ZC249	AGA	ACA	GCT	TTG	TTC	TTT	CA
ZC275	GCC	CCC	ATT	CTG	GCA
ZC286	CCA	AAG	AGG	GCC	AAC	GCC	TTC	CTG	GAG	GAG	AGA
	CCT	GGG	AGC	CTG	GAG	AGA	GAG	TGT	ATT	GAG	G
ZC287	AAT	ACA	CTC	TCT	CTC	CAG	GCT	CCC	AGG	TCT	CTC
	CTC	CAG	GAA	GGC	GTT	GGC	CCT	CTT	TGG
ZC288	AGC	AGT	GTA	GCT	TCG	AGG	AGA	ACA	GAG	AGG	TIT
	TCG	AGG	CCA	GCG	ACG
ZC289	AAT	TCG	TCG	CTG	GCC	TCG	AAA	ACC	TCT	CTG	TTC
	TCC	TGG	AAG	CTA	CAC	TGC	TCC
ZC333	CAG	CTT	CGT	CCT	GTC	GCT	GGC	CTC
ZC336	CCT	CTT	TGG	GCC	TGG	TGA
	C	C	C	C	G
ZC360	CA:	TC	TC	TC	TT	CA
	T	T	T	T	A
ZC401	CGT	AGC	GTT	CAG	GCC	CTC	GAA	GAT	CTC	GCG	GGC
	CTC	CTC	GAA	GCT	ACA	C

Mivel a 7ml genomklónról ismert, hogy tartalmaz egy 7 kb-s szekvenciát a 2. exontól „fölfelé”, erről a klónról előre feltételezzük, hogy kódolja a VH. faktor 5’ le nem fordított szekvenciákat és a vezetőszekvenciákat a -17. aminosavhelyig. Abból a célból, hogy

ZC528:

5’

TCA ACA GGC AGG GGC AGC

ZC529

5’

TTC CAC GGC ATG TCC CGT igazoljuk, hogy az 1. exon a 7ml genomklónon belül kódolódik, a XVH2463 és XVH565 kiónokból származó vezetőszekvencia információt használjuk fel, hogy a ZC528 és ZC529 (lásd alább) oligonukleotidokat megtervezzük.

3’

GCA GAG ATT

3’

TCT CCT CCT

Ezeket alkalmazzuk 7ml DNS átvizsgálására, és egy szubklőnról, a 7SD-röl úgy találjuk, hogy hibridizál mindkét oligonukleotídhoz. Az 1. exonról meghatározzuk, hogy két exonszekvenciából tevődik össze: az la exonből, amely a ZC528-hoz hibridizál (amely az 1-30. nukleotidoknak felel meg a XVH2463-ban), és az lb exonból, amely a ZC529-hez hibridizál (amely a 119-148. nukleotidoknak felel meg a XVII2463-ban).

Az intronok, amelyek mind az la, mind az lb exonokat szegélyezik, szekvenciáját meghatározzuk: az la egy együttműködő illesztődonor szekvenciát tartalmaz az exon 3’ végénél, és az lb mindkét végénél az együttműködő illesztőakceptor (az lb-től fölfelé) vagy donor 60 (az lb-től lefelé) szekvenciával van szegélyezve. Az la exon helyzetét a 7ml genomklónon belül pontosan feltérképezzük, miközben az lb helyzetét egy meghatározott területen belül térképezzük fel. Az lb szekvenciák a LVH2463-ban vannak jelen, míg a ZVH565, úgy tűnik, az exon la és exon 2 közé illesztett RNS-ből származik, kihurkolva az lb exonszekvenciát.

7ml szubklőnok választékát készítjük el pUC és Μ13 vektorokban, hogy megkönnyítsük a maradék exonok szekvencíaelemzését. Azokról a cDNS-szekvenciákről, amelyek az 1-től a 7-íg terjedő exonoknak felelnek meg, elnevezett megfelelő oligonukleotidokat alkalmazzunk, hogy szekvenciaanalízisnek vessük alá

HU 204 556 Β az utolsó előtti exont. A genomszekvencia pontosan az ezeken a területeken át húzódó cDNS-szekvenciáknak felel meg. Ezenkívül az intron/exon határokat meghatározzuk az 1-7. exonokhoz és a legtöbbet pontosan feltérképezzük a 7ml kiónon belül. Az intronméreteket és a helyzetüket a VII. faktorgénen belül a 2. táblázatban soroljuk fel.

2. táblázat

Intron/exon elágazások a VII. faktorgénben

Intron	Aminosavhelyzet	Intronméret (kb)
A	-39	0,2
B	-17	1,0
C	37/38	1,92
D	46	0,068
E	84	-2
F	131	-1
G	167/168	0,56
H	209	1,31

A 7ml fágról ismeretes, hogy hiányzik belőle a VII. faktor 3’ terminális, amely magában foglalja a 8. exont. Abból a célból, hogy ezeket a szekvenciákat magkapjuk, egy 12-13 kb-ban dúsított BamHI könyvtárat XL47.1-ben [Loenen és Brammer, Gene, 10, 249 (1980); Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka], amely humán bőr primer fibroblaszt sejtekből származik, vizsgálunk át két nick-transzlációnak alávetett VII. faktor cDNS PstI fragmenssel (amelyek a 7. exonban levő szekvenciáknak és a 3’ le nem fordított szekvenciáknak felelnek meg). Egy kiónt, amelyet 7DCl-nek nevezünk, mutatunk ki mindkét vizsgáló mintánál. Az ezt követő restrikciós endonukleázos és Southem-folt elemzés megállapítja, hogy a 7DC1 klón átfedi és mintegy 3 kb-vel túl is haladja a 7ml klón terminálisát, és hogy ez tartalmazza a 8. exont. A 8. exont tartalmazó 7DC1 DNS-ből származó 3,9 kb-s fragmenst szubklónozzuk M13-ba, és végrehajtjuk a szekvenciaelemzést, 5’ és 3’ végeihez komplementes oligonukleotidokat alkalmazva. A teljes exonszekvencia jelen van ebben a kiónban.

4. példa

Szintetizált kódolószekvenciát tartalmazó IX. faktor-VII. faktor hibrid gének A) AIX. faktorvezető szekvenciaszintetikus VII. faktor 5’ kódoló szekvenciahibrid megalkotása. Másik lehetőség a VH. faktor 5’ kódolószekvenciájának nyerésére egy megfelelő kettős szálú fragmens szintézise, a VH. faktor aminoterminális aminosavszekvencia alapján, más K-vitaminfüggő alvadási faktorok aminosavszekvenciája alapján, és más, ismert Kvitaminfüggő alvadási faktorok ismert nukleotidszekvenciája alapján [Kurachi és Davie: fentebb idézett munka; Anson és munkatársai: EMBO J. 3,1053-1060 (1984); Davie és munkatársai: fentebb idézett munka] előre vélt nukleotidszekvenciát alkalmazva. Abból a célból, hogy a szükséges kiválasztó és műveleti szignálokat szolgáltassuk az érett VII. faktor analóg kiválasztásához, ezt a szintetikus fragmenst [az együttműködő (konszenzus) szekvenciát] összekapcsoljuk a IX. faktor cDNS-klónból származó két vezetőszekvencia egyikéve. Ezt a stratégiát a 3. ábrában körvonalazzuk.

A humán IX. faktort kódoló cDNS-t emberi májból származó mRNS-sel készített könyvtárból nyerjük (Kurachi és Davie, fentebb idézett munka). AIX. faktorszekvenciát a pBR322 vektorból izoláljuk Pstl-gyel végzett emésztéssel, és ezt pUC13 PstI helyébe iktatjuk be. Ezt a plazmidot FIX-pUC13-nak nevezzük. Abból a célból, hogy a G-ben gazdag területet, amely a cDNS-klónozás eredményeképpen a IX. faktorbeiktatás 5’ végén jelen van, eltávolítsuk, egy szintetikus oligonukíeotid csatlakozó darabot (adaptert) helyettesítünk a klónozott fragmens 5 ’ vége helyébe. A ZC212 és ZC213 oligonukleotidokat (1. táblázat) szintetizáljuk és összeforrasztjuk, 22 bázispáros átfedést alakítva ki, a fragmensvégeket betöltjük, és megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasítunk, és az így létrejött fragmenst a IX. faktorszekvenciával összekapcsoljuk.

Az adapter megalkotásához 100-100 pmól ZC212-t, illetve ZC213-at liofilezünk és újraszuszpendáljuk 10 μΐ lOx kináz/ligázpufferben (600 mmól/1 trisz, pH=«8,0; 100 mmól/1 MgCh, 10 mmól/1 DTT) és 86 μΐ HíO-ban. Az összeforrasztási reakció 65 ’C hőmérsékleten fut 10 percen át, majd a reakcióelegyet lassan lehűtjük szobahőmérsékletre, végül jégre helyezzük. Ehhez a keverékhez 4 μΐ 2,5 mmól/1 dNTP keveréket adunk, és 1 μΐ (8 egység) T₄DNS-polimerázt. A reakciót hagyjuk 45 percig 14 ’C-on végbemenni. 10 μΐ 5 mól/1 NHíOAc-ot adunk hozzá és a DNS-t egyszer fenol/kloroformmal, kétszer kloroformmal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t centrifugáljuk és újra szuszpendáljuk 100 μΐ „középső” sópufferben (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 100. oldal), emésztjük 9 egység Pstl-gyel és 8 egység Cfol-gyel, és extraháljuk a fentiek szerint.

A módosított IX. faktorszekvenciát azután olyan módon alkotjuk meg, hogy egyesítünk 0,16 pmól szintetikus Pstl-Cfo adapter fragmenst, 0,14 pmól FIXpUC13-ból származó 1,4 kb-s CfoI-BamHI IX. faktorfragmenst, és 0,14 pmól 2,7 kb-s BamHI-PstI pUC13 vektorfragmenst 20 μΐ reakciókeverékben, amely 60 mmól/1 trisz-HCi-ot (pH-7,5), 10 mmől/1 MgCU-ot, 10 mmól/1 DTT-t és 0,9 egység T₄-ligázt tartalmaz. A reakciókeveréket 3 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten, és felhasználjuk kompetens E. coli JM83 törzs transzformálására [Messing: Recomhinant DNA Technical Bulletin) Rekombináns DNS technikai kiadvány), NIH Publication 79-99. sorozat, 2,2. szám, 43-48. (1979)]. A sejteket 50 μΐ 2%-os X-gallal (5bróm-4-klór-3-indolil-P-D-galaktozid) együtt olyan Ltápközegre szélesztjük, amely 40 gg/ml ampicillint is tartalmaz, és 37 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A fehér telepeket egy másik, ampicillint tartalmazó lemezre szűrjük át és növesztjük 37 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át. A telepeket Whatman 540 papírra itatjuk, és a papírt a hibridizáláshoz Walla13

HU 204556 Β ce és munkatársai módszere szerint [Gene, 16, 21 (1981)] előkészítjük, azzal a kivétellel, hogy az egy éjszakán át végzett inkubálást klóramfenikolos lemezeken elhagyjuk. Apapírokat 44 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk 0,9 mől/1 NaCl-ot, 0,09 mól/1 trisz-HCl- 5 ot (pH=7,5), 6 mmó]/l EDTA-t, 0,5% Nonidet Ρ-40-et és 150 g/ml E. coli tRNS-t tartalmazó közegben. A papírokat átvizsgáljuk ³²P-ral jelzett ZC235-tel (1. táblázat), vagyis egy olyan 14-merrel, amely fajlagos a megváltozott 5’ végszekvenciára. A hibridizálást 1- 10 2·10⁶ cpm/szúrővel hajtjuk végre 44 °C hőmérsékleten előhibridizáló pufferben egy éjszakán át. A szűröket azután háromszor mossuk 6’SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal 4 °C hőmérsékleten, és háromszor 2*SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal 44 °C hő- 15 mérsékleten, és röntgensugárfilmre helyezzük. Két pozitív kiónt nyerünk. Ezeknek a klőnoknak egyikét FIX(-G)->pUC13-nak nevezzük. Abból a célból, hogy igazoljuk a HX(-G)->pUC13 konstrukció IX. faktor része megváltozott területének szekvenciáját, didezoxi- 20 szekvenciaelemzést hajtunk végre közvetlenül a pUC plazmidon BRL fordított (reverz) prímért alkalmazva Wallace és munkatársai módszerével (1981, fentebb idézett munka), amelyben polinukleotid-kinázzal és y-³²P-ATP-vel, Chaconas és munkatársai módszerével 25 (fentebb idézett munka) végjelzett prímért alkalmazunk. A szekvencia az előre várttal azonos.

Az így létrejött rekombináns plazmid három Hae© hasítási helyet tartalmaz, az elsőt a 39. helynél a IX. szekvenciában [a számolás Anson és munkatársai (fen- 30 tebb idézett munka) publikált szekvenciáján alapszik, az első ATG-vel kezdve], a másodikat a 130. helyről és a harmadikat a pUC13 polilinkerben. A 130. helynél egy egyedi bázispár van a prepro-IX. faktor molekula Lys-Arg műveleti helyéhez tartozó kodonoktől „fői- 35 felé”. A végső IX. faktor-VH. faktor hibrid konstrukciókban a IX. faktor vezetőszekvencia, amely a 39. vagy 130. helynél fejeződik be, egy szintetikus kettős szálú fragmenssel kapcsolódik össze, amely az előre várt együttműködő (konszenzus) szekvenciát és a IX. 40 faktor vezetőszekvencia utolsó 3 kodonját tartalmazza.

A szintetikus együttműködő (konszenzus) fragmenst ügy állítjuk elő, hogy a ZC286-ZC289 oligonukleotidokat (1. táblázat) egyesítjük, kettős szálú fragmenst képezve. Az egyes oligonukleotidokból 100-100 pmólt 45 Iiofílezünk és újra szuszpendálunk 20 pl Ix kinázpufferben, és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten, ezután 65 °C hőmérsékleten melegítjük 10 percen át. Az 1. gyűjtemény ZC286+ZC287-et tartalmaz, a 2. gyűjtemény ZC288+ZC289-et tartalmaz. A gyűjte- 50 ménypárokat összeforrasztjuk 10 perc alatt 65 °C hőmérsékleten, majd 2 óra alatt hűtjük le szobahőmérsékletre, végül 30 percre jégre helyezzük.

A módosított IX. faktorfragmenst eltávolítjuk a FIX(-G)->pUC13-róI, mint Hmd©-EcoRI fragmenst. 55 Mintegy 20 pg plazmidot emésztünk 30-30 egység HindHI-mal és EcoRI-gyel 100 pl Hind© pufferben (BRL), amely 4 pg RN-áz A-t is tartalmaz, 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. A reakciót 65 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett melegítéssel leállít- 60 juk, és a vektort és a EX. faktorfragmenseket 1%-os agarózgélen elektoforézisnek vetjük alá, és elektroelúcióval tisztítjuk. A IX. faktorfragmenseket etanollal kicsapjuk, 400 ng/pl RN-áz A-t is tartalmazó pufferben űjraszuszpendáljuk, és 9 egység HaelH-mal emésztjük egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten. A 39 bázispáros HindHI- Hae© IX. faktorfragmenst 1,5%-os agarózgélen végzett elektroforézissel és ezt követő elektroelúciőval izoláljuk az emésztett termékből. Hogy a 130 bázispáros Hind©-Hae© IX. faktorfragmenst kapjuk, EIX-pUC13-at emésztünk EcoRI-gyel és Hind©-mal, és a IX. faktorfragmenst a fentiek szerint izoláljuk. Mintegy 3 pg-ot ebből a Hind©-EcoRI fragmensből emésztünk 6 egység Hae©-mal 37 °C hőmérsékleten, és 5 perces időközönként alkivotokat viszünk át 30 percen keresztül 50 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatba. Az alikvotokat összegyűjtjük és a 130 bázispáros Hind©-Hae© fragmenseket 5%-os akrilamidgélen végzett elektroforézissel tisztítjuk, amelyet elektroelució követ.

A végsőIX. faktoregyüttműködő (konszenzus) szekvenciahibrideket olyan módon készítjük el, hogy négyszeres Iígálással egyesítjük az 1. és 2. gyűjteményeket, a IX. faktor Hind©-Hae© fragmensét (a 39 vagy 130 bázispárosat) és a pUC13 Hind©-EcoRI fragmensét Az így létrejött plazmidot használjuk E. coli HB101 (ATCC 33694) transzformálására. A telepeket a DNS EcoRI-gyel és Hind©-mal végzett emésztésével vizsgáljuk át. Azt a szekvenciát amely a IX. faktor 39 bázispáros szekvenciáját tartalmazza a szintetikus együttműködő (konszenzus) szekvenciával, ezután mini-FIX-FVII-nek nevezzük. Az ezt a konstrukciót tartalmazó plazmidot pM7200(-C)-nek nevezzük. Azt a szekvenciát, amely a IX. faktor 130 bázispáros szekvenciáját tartalmazza a szintetikus együttműködő (konszenzus) szekvenciával, ezután maxi-HX-FVII-nek nevezzük. Az ezt a konstrukciót tartalmazó plazmidot pM7100(-C)-nek nevezzük. Az együttműködő (konszenzus) szekvencia olyan polipeptidet kódol, amelynek aminosavszekvenciája a következő: Ala-Asn-AlaPhe-Leu-Gla-Gla-Arg-Pro-GIy-Ser-Leu-Gla-Arg-GIaCys-Lys-Gla-Gln-Cys-Ser-Phe-Gla-Gla-Ala-Arg-GlaHe-Phe-Gla-Gly-Leu-Asn-Arg-Thr-Lys-Leu.

Β) AIX. faktoregyüttműködő (konszenzus) szekvenciahibrid összekapcsolása a VII. faktor cDNS-klőnnal.

AIX. faktoregyüttműködő (konszenzus) szekvenciahibrideket (vagy mini, vagy maxi) összekapcsoljuk a VH. faktor cDNS 5’ részével és a pUC13 vektorral háromrészes Iígálással (lásd 4. és 5. ábrák). A vektorfragmenst úgy állítjuk elő, hogy 6 pg pUC13-mat emésztünk 10-10 egység Xbal-gyel és Hind©-mal olyan Hind© pufferben, amely 400 ng/pl RN-áz A-t is tartalmaz. A nuni-FIX-FVH fragmenst úgy állítjuk elő, hogy 2 g pM7200(-C)-t emésztünk 10—10 egység Hind©-mal és EcoRI-gyel a fentiek szerint. A maxi-HXFVH fragmenst hasonlóképpen készítjük pM7100(-C)ből. A VH. faktor cDNS 3’ részét egy (pUCG705) plazmidból állítjuk elő, amely a pUC13-ba Xbal-gyel

HU 204 556 Β és EcoRI-gyel végzett emésztéssel szubklónozott pUCVH2115 EcoRI-Xbal 5’ fragmenst tartalmaz. Az emésztést 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át folytatjuk és a terméket 1,5%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel különítjük el. A kívánt fragmenseket elektroelúció- 5 nak vetjük alá, fenol/kloroformmal, majd kloroformmal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A három fragmenst, a pUC13/XbaI-HindIII-mat, a IX. faktor-VII. faktor (mini vagy maxi) (HindlII-EcoRI-et, és az 5’

VII. faktor) EcoRI-Xbal-et azután ligáljuk 20 μΐ ligáz- 10 pufferben, amely 20 mmól/1 ATP-t és 0,9 egység T^DNS-ligázt is tartalmaz, egy éjszakán át 4 ’C hőmérsékleten. A telepeket HindlH-mal és Xbal-gyel végzett restrikciós elemzéssel átvizsgáljuk. A mini- és maxiFIX-FVII szekvenciákat tartalmazó szekvenciákat 15 pM7100-nak nevezzük (4. ábra).

A VII. faktor cDNS előállításában alkalmazott kapcsoló (linker) hozzáadás következtében módosításokat kell végrehajtani, hogy a keretben korrektté alakítsuk a kódolószekvenciákat. Mind a mini-, mind a maxifúziós 20 termékek tartalmaznak egy EcoRI helyet a IX. faktoregyüttműködő (konszenzus) szekvenciahibrid és a VII. faktor cDNS közti elágazásnál, amely a cDNS-klónozó folyamatnak mesterséges terméke. Ezenkívül a minifúziós termék igényli egy C hozzáadását, hogy a szék- 25 vencia megváltozzék a HaelII helynél 5’ AGGCCA 3’-ről 5’ AGGCCCA 3’-vé, és létrejöjjön a korrekt leolvasókeret ettől a szekvenciától lefelé. Ezeket a korrekciókat oligonukleotid-irányított helyspecifikus mutagenezissel végezzük el, lényegében olyan módon, 30 ahogyan ezt a kétprimeres módszernél Zoller és Smith leírták [Manual fór Advanced Techniques in Molecular Cloning Course (Kézikönyv a fejlett technikához a molekuláris klónozási folyamatokban), Cold Spring Harbor Laboratory (1983)]. A mini-FIX-FVH frag- 35 menst a pM7200-ból eltávolítjuk HindlII-mal és XBalgyel végzett emésztéssel, és M13mpl9-be iktatjuk. A maxi-FIX-FVH fragmenst pM7100-ból tisztítjuk és hasonló módon szubklónozzuk. A ZC333 és ZC336 mutagén primereket (lásd 1. táblázat) alkalmazzuk az Eco- 40 Rí hely eltávolításához, illetve a bázis beiktatásához. Mindegyik esetben a ZC87 univerzális prímért alkalmazzuk második primerként. A mutagén primereket foszforilezzük olyan módon, hogy 40 pmól prímért és 60 pmól ATP-t egyesítünk 1 egység T₄DNS- kinázzal 45 egy éjszakán át 60 ’C hőmérsékleten. Hogy eltávolítsuk az EcoRI helyet a maxi-FIX-VII hibridből, 1 pg Ml3 egyszálú templátot egyesítünk 20-20 pmól ZC333-mal és ZC87-tel 10 pl teljes térfogatban. A primereket a templáthoz forrasztjuk 10 percen át 65 ’C 50 hőmérsékleten, 5 perc alatt szobahőmérsékletre hűtjük, majd 5 percre jégre helyezzük. A primereket kiterjesztjük, DNS-polimeráz I-gyel (Klenow-fragmens) alkalmazva. Hogy eltávolítsuk az EcoRI helyet és korrigáljuk a leolvasókeretet a mini-FIX-FVII hibridben, 1 pg 55 megfelelő M13 egyszálú templátot egyesítünk 2020 pmól ZC333-mal, ZC336-tal és ZC87-tel. Az összeforrasztási és primer kiterjesztési reakciókat úgy hajtjuk végre, ahogyan fentebb leírtuk. A tarfoltokról kiemelt telepeket ³²P-jelzett prímeméi (ZC333 vagy 60

ZC336) vizsgáljuk át 60 ’C hőmérsékleten, és a szekvenciákat didezoxi-szekvenciaelemzéssel igazoljuk. Az így létrejött konstrukciókat, amelyek a maxi-, illetve mini-FIX-FVII szekvenciákat tartalmazzák, pM7111 -nek, illetve pM7211 -nek nevezzük.

Az együttműködő (konszenzus) szekvencia számos olyan területet tartalmaz, amely nem vág egybe azokkal a fehérjeszekvencia adatokkal, amelyet a VH. faktorhoz nyerünk (2. ábra). Abból a célból, hogy olyan szekvenciát állítsunk elő, amely a VH. faktor aminoterminális részéhez nagyobb homológiával bíró polipeptidet kódol, az együttműködő (konszenzus) szekvenciát megváltoztatjuk oligonukleotid-irányított helyspecifikus mutagenezissel. Az elvégzett változások a Leu beiktatása a 8. helyzetnél, a Lys helyettesítése Ile-vel a 18. helyzetnél (a számozás a 8. helyzetnél végzett beiktatás utáni aminosavhelyzetre vonatkozik), az Ala helyettesítése Asn-val a 26. helyzetnél, és a Gly-Leu-Asn szekvencia helyettesítése Ala-Ser-Asp-pal a 32-34. helyzetnél (a kísérleti aminosavszekvencia adatokra alapozva).

A szekvenciacseréket a 8. és 18. helyzeteknél pM7111-et (ép szál), mint templátot alkalmazva végezzük el. A ZC352 (5’ CCC AGG TCT CAG CTC CTC CAG 3’) és ZC353 (5’CTG CTC CTC CTT ACA CTC TCT 3’) primereket összeforrasztjuk a templáttal és kiterjesztjük, amint fentebb leírtuk. Az így létrejött fágklónt pM7114-nek nevezzük. A beiktatás szekvenciáját a pM7114-ben didezoxi-szekvenciaelemzéssel igazoljuk.

Hasonló módon a 26-34. helyzetnél levő cserét pM7114 templáton (ép szál) végezzük el, a ZC366 mutagén prímért (5’ CAG CTT CGT CCT GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG GGC CTC CTC GAA 3’) és második primerként ZC87-et (1. táblázat) alkalmazva. Az így létrejött konstrukciót pM7115-nek nevezzük. Az M13 vektorban levő teljes 550 bp-s beiktatás szekvenciáját didezoxi-szekvenciaelemzési módszerrel meghatározzuk és korrektnek találjuk.

5. példa

AIX. faktor-VII. faktor cDNS fúziós termék megalkotása

IX. faktor-VH. faktor cDNS fúziós terméket készítünk, emberi máj cDNS-könyvtárból (ahogyan ezt Kurachi és Davie leírták, lásd fentebb idézett munka) nyert IX. faktor cDNS-t és az 1. példában leírt VH. faktor cDNS-szekvenciát alkalmazva.

A hibrid fehérjéhez választott fúziós pont a IX. faktor +38. aminosava (treonin) és a VII. faktor cDNSszekvencia által kódolt első lizin között van. Egy ilyen fehérjét lehetne kódolni egy olyan szekvenciával, amely a IX. faktor cDNS első 252 bp-ját és a pUCVH2115 VH. faktor cDNS-nek az első két kodon kivételével teljes szekvenciáját tartalmazza. Hogy ezt a hibrid szekvenciát megalkossuk, a IX. faktorszekvenciát először pUCVH2115-höz fúzionáljuk a hagyományos restrikciós helyeket alkalmazva. A fúzió az FIX/VII/12 plazmidot (lásd alább) eredményezi, amely a IX. faktor cDNS első 310 bp-ját tartalmazza a teljes

HU 204556 Β

VH. faktor cDNS-szekvenciával összekapcsolva. Hogy a hibrid fehérjéhez kívánt pontos elágazást elegük, a közbeavatkozó bázispárokat oEgonukleotid-irányított mutagenezissel eltávolítjuk.

A IX. faktor cDNS-szekvencia összekapcsolását a 5

VH. faktor cDNS-szekvenciával úgy végezzük el, hogy a FIX(-G)->pUC13 (4. példa) mintegy 0,3 kb-s HindlΠ-AkaIH fragmensét Iigáljuk a pUCVH2115-ből származó, mintegy 4,7 kb-s Sma-HindlH fragmenshez (5. ábra), A HindHI-Akain fragmenst úgy készítjük el, 10 hogy 3 pg FEX(-G)->pUC13-mat emésztünk 40 egység HindHI-mal 40 pl „közepes” sópufferrel (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka) 37 ’C hőmérsékleten 4 órán át. A térfogatot azután „közepes” sópufferrel 100 I- re növeljük, és 5 egység AkalH-mat adunk 15 hozzá, és a 37 ’C hőmérsékleti inkubálást 18 órán át folytatjuk. A DNS-fragmenseket azután 1% agarózgéIen végzett elektroforézissel elkülönítjük, és a 0,3 kbnak megfelelő csíkokat a fentebb leírtak szerint izoláljuk. ApUCVH2115 részleges Smal emésztési terméket 20 úgy kapjuk, hogy 3 pg pUCVH2115-öt inkubálunk 25 ’C hőmérsékleten 1 órán át 4,8 egység Smal-gyel 30 pl reakciótérfogatban. A reakciót 15 perces, 65 °C hőmérsékleten végzett inkubálással állítjuk le. A mintát azután egyszer extraháljuk azonos térfogatú fenollal, és 25 etanollal kicsapást végzünk.

A csapadékot 10 perces, mikrocentrifugán végzett forgatássá! összegyűjtjük, 70%-os etanollal öblítjük és levegőn szárítjuk. A DNS-t újra oldjuk 30 pl „közepes” sópufferrel és 30 egység HindlH-mal emésztjük 37 ’C 30 hőmérsékleten 3 órán át. A DNS-t elektroforézisnek vetjük alá 0,7%-ös agarózon, és a 4,7 kb-s HindlHSmal fragmenst á fentebb leírtak szerint izoláljuk. A két fragmens ekvimoláris mennyiségeit (0,048 pmól) Egáljuk 10 pl-es reakciókeverékben, amely 50 mmól/1 35 trisz-HCI-ot (pH=7,5), 10 mmól/1 MgCU-ot, 1 mmól/1 DTT-ζ 1 mmól/I ΑΊΡ-t és 3 egység T₄-DNS-ligázt tartalmaz, 14 ’C hőmérsékleten 3,5 órán át, majd az így létrejött terméket használjuk kompetens E. coE RRI (ATCC 31343) transzformálására. A sejteket ampicil- 40 lint tartalmazó lemezeken növesztjük és az így létrejött telepek közül 12-t átvizsgálunk restrikciós enzimes emésztéssel a kívánt plazmindkonstrukció jelenlétére.

A 12. telepből nyert DNS (HX/VH712) a várt restrikciós elemzési mintát adja, és ezt alkalmazzuk a hibrid 45 génmegalkotás következő lépésében.

Az oEgonukleotid-irányítottmutagenezis folyamatát egyszálú DNS-templáton hajtjuk végre. így szükséges a fuzionált IX. faktor-/VH. faktorszekvenciákat M13mpl9-be klónozni. Hogy kellemesen kicsiny 50 DNS-fragmenst kapjunk egy 640 bp-s HmdlH-Xbal fragmenst izolálunk FIX/VI]712-ből. Ez a fragmens 310 bp-t tartalmaz a IX. faktor cDNS 5’ végéből és 330 bp-t a VH. faktorszekvenciáből. A vektort úgy készítjük el, hogy 1 pg M13mpl9 RF DNS-t emész- 55 tünk 20 egység HindHI-mal és 20 egység Xbal-gyel 40 pl „közepes” sőpufferben 37 ’C hőmérsékleten 18 órán át. A DNS-t elektroforézisnek vetjük alá 1,2%os agarózon és a lineáris 6,4 kb-s fragmenst a fentebb leírtak szerint izoláljuk a gélről. 5 pg FIX/VH/12 60

DNS-t emésztünk 10 egység Xbal-gyel 40 pl „közepes” sőpufferben 37 °C hőmérsékleten 18 órán át. 20 egység HmdlH-mat adunk hozzá és az emésztést 37 ’C hőmérsékleten folytatjuk további 7 órán át. Az így létrejött fragmenseket 1,2%-os agarózgélen végzett elektroforézissel különítjük el, és a 640 bp-s fragmenst a fentiek szerint eluáljuk. 10 ng linearizált M13mpl9-et és 1 ng 640 bp-s fragmenst Egálunk 14 ’C hőmérsékleten 1 órán át, majd az így létrejött terméket alkalmazzuk kompetens E. coE JM101 törzs transzformálására (Messing: Meth. in Enzimology, fentebb idézett munka). A sejteket azután X-galt és IPTG-t tartalmazó lemezekre (Messing: Meth. in Enzimology, fentebb idézett munka) szélesztjük, és nyolc halványkék tarfoltot szúrunk fel és alkalmazunk E. coE 2,5 ml-es tenyészetének (A«)o=O,3-nál) fertőzésére. 18 órán át 37 ’C hőmérsékleten végzett növesztés után a sejteket centrifugálással kinyerjük, a centrifugálást szobahőmérsékleten, klinikai centrifugában végezve, és 20 pl felülúszőt, amely az M13 fágot tartalmazza, összekeverjük 10 pg/I etidiumbromiddal. Ismert standardokkal összehasonlítva a nyolc klón mindegyike a mintegy korrekt méretű beiktatással rendelkezik. Ezután egyszálú DNS-t készítünk 1,5 ml felűlúszőból, amint ezt Messing leírta (Meth. in Enzimology, fentebb idézett munka). Ezt a konstrukciót azután szekvenciaelemzésnek vetjük alá didezoximódszeirel, a ZC87 oHgonukleotidot alkalmazva primerként, hogy bebizonyítsuk: a beiktatás elágazása korrekt. A korrekt kiónok egyikét (a 4. számút) alkalmazzuk íemplátként az oEgonukleotidirányított mutagenezisben, hogy működőképes IX. faktor-VH. faktor fúziós terméket áüítsunk elő.

A ZC249 oEgonukleotídot, a kívánt IX. faktorszekvencia 10 bp-játés a kívánt VH. faktorszekvencia 10 bpját tartalmazó 20-mert, alkalmazzuk mutagén primerként. A ZC87 oEgonukleotídot, amely az M13mpl9 szekvenciához hibridizál, használjuk második primerként.

Az aBcalmazott mutagenezis eljárás Zoller és Smith (fentebb idézett munka) eljárásának módosítása. Az összeforrasztási reakcióhoz 20 pmól ZC249-et foszforilezünk olyan módon, hogy egy éjszakán át ínkubáljuk 4 ’C hőmérsékleten 20 pl olyan oldatban, amely 60 mmól/1 trisz-HCI-ot (pH-8,0), 10 mmól/1 MgCk-ot, 1 mmól/I DTT-t, 1 mmől/1 ATP-t, és 1 egység T₄-kinázt tartalmaz. A reakciót 65 ’C hőmérsékleten 15 percen át végzett inkubálással állítjuk le, és a mintát Eofílezzük. A 4. számú klón egyszálú templát 1 pmólját és 20 pmól ZC87-et adunk 10 pl összeforrasztó pufferbe [200 mmól/1 trisz-HCl (pH-7,5), 100 mmól/1 MgCh, 500 mmól/1 NaCl, mmól/1 DTT]. A mintát 65 ’C hőmérsékleten 10 percen át melegítjük, 5 percen át szobahőmérsékleten ínkubáljuk, majd jégre helyezzük. 10 pl, következő összetételű oldatot készítünk el és adjuk a mintához:

mmól/1 trisz-HCl (pH-7,5), 10 mmól/1 MgCl₂, mmól/I DTT, 1-1 mmól/I a dNTP-kból, 1 mmól/1 ATP, 0,15 egység/1 T₄DNS-Iigáz, 0,25 egység/μϊ E. coE DNS-polimeráz I (Klenow-fragmens). A reakció16

HU 204 556 Β keveréket azután 15 ’C hőmérsékleten 3 órán át inkubáljuk és az így létrejött mintát alkalmazzuk kompetens E. coli JM101 transzformálására (Messing: Meth. in Enzimology, fentebb idézett munka).

Az így létrejött tarfoltokat nitrocellulózra emeljük át és ³²P-ral jelzett ZC249-hez hibridizálással átvizsgáljuk. Száraz BA85 szűrőket (Scheicher and Schuell) fektetünk az agarlemezre és a fágokat adszorbeálódni hagyjuk 5 percen át. A szűrőket eltávolítjuk és hagyjuk száradni 5 percen át, majd Whatman 3MM papírra helyezzük, 0,5 mól/1 NaOH-ot és 1,5 mól/1 NaCl-ot tartalmazó oldattal telítjük, 3 percen át levegőn szárítjuk, Whatman papírra helyezzük, 1 mól/1 trisz-HCl-ot (pH=8) és 1,5 mól/1 NaCl-ot tartalmazó oldattal telítjük 5 percen át, majd levegőn 3 percig szárítjuk. A trisz-HCl-os lépést megismételjük és a szűrőket 100 ml 6· SSC-ben öblítjük 2 percen át szobahőmérsékleten. Levegőn szárítás után a szűrőket 80 °C hőmérsékleten 2 órán át sütjük és 47 °C hőmérsékleten előhibridizáljuk egy éjszakán át 6,7· SSC-t (pH-6,5), 2 mg/ml E. coli tRNS-t és 0,2-0,2% (súly/térfogat) BSA-t, Ficollt és polivinil-pirrolidont tartalmazó oldatban.

Az előhibridizálási lépés után a szűrőket 2.5U0⁶ cpm ZC249/szűrővel inkubáljuk ugyanebben az SSC előhibridizáló pufferben 47 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át. A hibridizálást követően a szűrőket háromszor mossuk, minden esetben 5-10 percig, szobahőmérsékleten 6· SSC-ben és röntgensugárfilmmel hozzuk össze. A vélt pozitív foltokat újból lemezre visszük és átvizsgáljuk a fentebbiek szerint. Az egyedi telepeket azután felszúrjuk, és egyszálú DNS-t készítünk belőle, és szekvenciájukat meghatározzuk, primerként ZC275-öt alkalmazva. A ZC275 oligonukleotid egy 40 bp-s szekvenciának felel meg a ZC249 5’ irányában ugyanazon a szálon (lásd 1. táblázat).

Négy pozitív tarfoltot azonosítunk. A teljes beiktatást az M13mp 19-ben az egyik klónnál (FIX/VII-9) szekvenciaelemzésnek vetünk alá a didezoximódszerrel, a ZC87 és ZC275 oligonukleotidokat alkalmazva, és a szekvenciát korrektnek találjuk. Az igazolt szekvenciákat a 7. ábrán az 1-567. bázisok képviselik. Az ebből a klónból származó RF DNS-t használjuk azután a végső lépéshez a hibrid gén megalkotásához.

Három fragmenst alkalmazunk a végső konstrukció megalkotásában: a 0,6 kb-s HindlH-Xbal fragmenst a fuzionált IX/VII szekvenciákat tartalmazó FIX/VII-9ből; egy 1,7 kb-s Xbal-BamHI VU. faktor cDNS-fragmenst apUCVHl923-ból; és egy 2,7 kb-s BamHI-HindlH fragmenst a pUC13-ból. 3 pg FIX/VII-9(RF DNS)-t emésztünk 37 ’C hcímérsékleten 6 órán át 45 egység Xbal-gyel 50 pl térfogatban. A DNS-t etanollal kicsapjuk, újból szuszpendáljuk, és 37 ’C hőmérsékleten emésztjük 4 órán át 50 egység HindlII-mal. A mintát elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agarózon, és a 0,6 kb-s csíkot elektroelúcióval NA45 papírra (Schleicher és Schuell) visszük át. A DNS-t eluáljuk a papírról 1,5 mől/1 NaCl-ot, 50 mmól/l trisz-HCl-ot (pH-8) és 1 mmól/l EDTA-t tartalmazó oldattal, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.

Hogy a további VII. faktor cDNS-t megkapjuk, 5 pg pUCVII1923-mát emésztünk 37 ’C hőmérsékleten 3 órán át 36 egység Xbal-gyel 40 pl „közepes” sópufferben. Ezután 8 pl lOx „nagy sótartalmú” puffért, 28 pl H₂O-t és 4 pl (40 egység) BamHI-et adunk hozzá és a reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 3 órán át. A DNS frakmenseket 1%-os agarózon végzett elektroforézissel elkülönítjük és az 1,7 kb-s fragmenst izoláljuk a fentebb leírtak szerint.

A vektorfragmenst úgy készítjük, hogy 1 pg pUC13mat emésztünk 10 egység HindlII-mal 20 pl „közepes” sópufferben 37 ’C hőmérsékleten 1 órán át. 2 pl lOx „nagy sótartalmú” puffért és 10 egység BamHI-et adunk ezután hozzá és az inkubálást további 2 órán át folytatjuk. A DNS-t 1%-os agarózon tisztítjuk, amint fentebb leírtuk.

A három fragmens ekvimoláris mennyiségét (mintegy 0,56 pmól) ligáljuk szobahőmérsékleten 45 percen át 10 pl, 50 mmól/l trisz-HCl-ot (pH=7,5), 10 mmól/l MgCL-ot, 1 mmól/l DTT-t, 1 mmól/l ATP-t és 3 egység DNS-ligázt tartalmazó oldatban, A reakciókeveréket használjuk kompetens E. coli JM83 transzformálására. A sejteket olyan tápközegre szélesztjük, amely 40 pg/ml ampicillint is tartalmaz, 50 pl 2%-os X-galt hozzáadva lemezenként. 7 fehér telepből DNS-t állítunk elő és azután ezeket restrikciós enzimes emésztéssel átvizsgáljuk. Az egyik kiónt, amely a korrekt mintát adja, FIX/VH—>pUC13-nak nevezzük.

6. példa

Biológiailag aktív VII. faktoranalógok kifejeződése

A pD2 emlős sejt kifejeződő vektort választjuk az FIX/VII gén kifejeződéséhez fertőzött állati sejtekben. Ezt a pDHFRIII plazmidból [Berkner és Sharp: Nuc. Acid. Rés. 13, 841-857 (1985)] alkotjuk meg a következő módon. A DHFR cDNS-sel határoló PstI helyet a pDHFRIH-ban átalakítjuk BamHI hellyé hagyományos kapcsolóképzéssel [Scheller, R.H.; Dickerson, R.E.; Boger, H.W.; Riggs, A.D., és Itakura, K.: Science, 196, 177-180 (1977)]. A pDHFRIII DNS-t inkubáljuk 10 mmól/l triszt (pH=7,6), mmól/l pMSH-t, 6 mmól/l NaCl-ot, 10 mmól/l MgCL-ot és 2,5 egység Pstl-et tartalmazó oldattal. 10 percen át 37 ’C hőmérsékleten, ezt követi a fenolos extrahálás és etanolos kicsapás. A Pst! kohezív végeit tompa végűvé alakítjuk, T₄DNS-polimerázt alkalmazva. A fenolos extrakció és a 10 mmól/l triszt (pH=8,0), 1 mmól/l EDTA-t és 0,3 mól/1 NaCl-ot tartalmazó oldattal szembeni dialízis után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t újraszuszpendáljuk 20 pl, 1,4 mmól/l ATP-t, 50 mmól/l triszt (pH=7,6), 10 mmól/l MgCL-ot és 1 mmól/l ditiotreitolt tartalmazó oldatban, majd inkubáljuk 5 ng,- T₄ polinukleotid-kinázzal kezelt BamHI kapcsolóval (New England Biolabs) és 200 egység T₄ polinukleotid- ligázzal 12 órán át 12 ’C hőmérsékleten ezt követi a fenolos extrahálás és etanolos kicsapás. A DNS-t 90 egység BamHI-gyel emésztjük 37 ’C hőmérsékleten 1 órán át, ezt követi az elektroforézis 1,4%-os agarózgélen át. A 4,9 kb-s DNS-fragmenst (amely olyan

HU 204556 Β pDHERIH DNS-nek felel meg, amelyből hiányzik a dHFR cDNS és az SV40 poliadenilező jel), elektroelúciónak vetjük alá, és újból kör alakúvá alakítjuk polinukleotid-kinázzal, majd E. coli HB 101-be fertőzzük. Ampicíllínérzékeny telepeket vizsgálunk át 5 gyors preparatív elemzéssel [Bimbóim, H.C. és Doly,

J.: Nucleic Acids Research, 7,1513-1523 (1979)], és a korrekt klőnt növesztjük, hogy nagyléptékű plazmid DNS-készítményt hozzunk létre.

Az így létrejött plazmidot 20 egység BamHI-gyel ha- 10 sítjuk és 2,5 pg boqúbél-foszfatázzal kezeljük, és elektroforézisnek vetjük alá 1,4%-os agaróz gélen. 25 pg pSV40-et (ez egy SV40 klón a pBR322 BamHI helyére beiktatva) emésztünk 25 egységBclI-gyel 1 órán át50 ’C hőmérsékleten, ezt követően 25 egység B amHI-et adunk 15 hozzá, és az inkubálást 1 órán át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk. Ezt a DNS-t azután elektroforezisnek vetjük alá 1,4%-os agarőzgélen. A BamHI- gyei hasított vektort (azaz azt, amelyből a poh'adenilező szignál hiányzik) egyesítjük a késői poliadenilező szignált tartalmazó 20 SV40 DNS-fragmenssel (0,14-0,19 térképegység (Tooze, J. kiadásában: „DNA Tumor Viruses, Molecular Biology of Tumor Viruses” (DNS-tumorvírusok; A tumorvírusok molekuláris biológiája)] }> a gélen tisztított fragmenseket (0,1-0,1 pg/20 pl, 50 mmól/I triszt (pH-7,6), 25 10 rnmói/1 MgCb-ot, 1 mmól/1 ditiotreitolt, 1,4 mmól/1 ATP-t és 100 egység T₄ polinukleotid-ligázt tartalmazó oldatban inkubálva 4 őrán át 12 ’C hőmérsékleten, ezt követi a transzformálás E. coli RRl-be. A pozitív telepeket gyors preparatív elemzéssel azonosítjuk, és a korrekt 30 DNS, a pD2 nagyléptékű plazmidkészítményét előállítjuk. *

Hogy a IX/VÍI. faktort kifejező^- konstrukciót elkészítsük, I pg pD2-t emésztünk 37 °C hőmérsékleten 1 őrán át 20 egység BamHI-gyel 20 pl „nagy sótartalmú” 35 pufferben. 20 pl, 10 mmól/1 triszt (pH=8), 1 mmól/1 EDTA-t és 0,1 egység borjúból alkalikus foszfatázt (Boehringer) tartalmazó oldatot adunk hozzá ezután. A reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk és a reakciót 75 ’C hőmérsékleten 10 percen át 40 végzett melegítéssel leállítjuk. 10 pg FEX/VH-+pUC13-mat emésztünk 37 ’C hőmérsékleten 2 őrán át 150 egység BamHI-gyel 150 pl „nagy sótartalmú” pufferben. ADNS-fragmenseket elektroforézissel választjuk szét 1,2%-os agarőzgélen, és a 2,3 kb-s fragmenst 45 és a pD2 vektorfragmens ekvimoláris mennyiségeit (0,015 pmól) ligáljuk 14 ’C hőmérsékleten 2,5 órán át a fentebb leírtak szerint A reakciókeveréket használjuk E. coli RR1 sejtek transzformálására, amelyet azután olyan tápközegre szélesztünk, amely 10 pg/ml ampicil- 50 lint is tartalmaz. Plazmid DNS-t készítünk 12 így létrejött telepből, és átvizsgáljuk ezeket restrikciós enzimes emésztéssel. A korrekt enzimemésztéses mintákkal rendelkezd Idónok egyikét FK/VH/pD2-nek nevezzük el (6. ábra). Az FIX/VII/pD2-veI transzformáit E. coli 55 ű RRl-et az ATCC-nél 53068 letéti számon helyeztük letétbe.

Az újszülött hörcsögvese (BHK) sejtek (amelyek az American Type Culture Collection-nál ATCC CCL10 letéti számon állnak rendelkezésre) FIX/VH/pD2-vel 60 való fertőzéshez használt eljárás hasonló a már közölt módszerekhez [például Wigler és munkatársai: Cell, 14,125 (1978); Corsaro és Pearson: Somatic Cell Genetics, 7,603 (1981); Graham és Van dér Eb: Virology, 52, 456 (1973)3. A BHK-sejteket 37 ’C hőmérsékleten 5% CO₂ jelenlétében növesztjük Dulbecco-féle tápközegen (+10% hővel inaktivált borjúembrió-szérum, és kiegészítve még glutaminnal, penicillinnel és streptomicinnel) 6 mm-es szövettenyésztő Petri-csészében 20%- os összefolyásig. Összesen 10 pg DNS-t alkalmazunk egy db 60 mm-es csésze fertőzéséhez: 3,75 pg fTX/VH/pD2-t, 1,25 pgpKO-neo-t [Southern és Berg: J. Mól. Appl. Génét. 1, 327-341 (1982)], és 5 pg lazacsperma DNS-t. A DNS-eket 0,3 mól/1 Na-acetátot és 75% etanolt tartalmazó keverékkel kicsapjuk, 70%os etanollal öblítjük, és újra oldjuk 20 pl, 10 mmól/1 trisz-HCl-ot (pH=8) és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban. A DNS-t egyesítjük 440 pl H₂O-val és 500 pl, 280 mmól/1 NaCl-ot, 1,5 mmól/1 NaHPCL-ot, 12 mmól/I glükózt és 50 mmól/1 HEPES-t (pH-7,12) tartalmazó oldattal. 60 pl 2 mól/1 CaCl₂-ot adunk cseppenként a fenti keverékhez, és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk 30 percen át. Az oldatot azután a sejtekhez adjuk, és a sejteket visszatesszük 37 ’C hőmérsékletre 4 órára. A tápközeget eltávolítjuk, és 5 ml, 20% DMSO-t és szérumot tartalmazó Dulbecco tápközeget adunk hozzá 2 percre szobahőmérsékleten. A csészét azután gyorsan mossuk két váltás tápközeggel és egy éjszakán át inkubáljuk friss tápközegben. 24 órával azután, hogy a DNS-t hozzáadtuk, a tápközeget eltávolítjuk és szelektív tápközeget adunk hozzá (10 mg/ml G418,498 pg/ing, Gibco, szérumos Dulbecco-féle tápközegben). 10 és 13 nap után olyan egyedi klőnokat, amelyek a pKO-neo-gént magukba beépítették és így G418-ra rezisztens sejteket képviselnek, viszünk át 96 üreges (vagy 24 üreges) lemezekre, és növesztjük ezeket fehérjemeghatározáshoz.

Sejteket növesztünk Dulbecco-féle +10% borjúembrió tápközegen, amely még 5 pg/ml K-vitamint is tartalmaz (Phytonadione, Merck). A tápkőzeget a sejtektől és a sejtüledékektől centrifugálással elkülönítjük, és VH. faktor polipeptidre (ELISA-val) és biológiai aktivitásra vizsgáljuk. A sejteket a lemezekről tripszinnel eltávolítjuk, friss tápkőzeggel mossuk, centrifugáljuk és -20 ’C hőmérsékleten fagyasztjuk. A sejtüledéket azután PBS-ben felengedtetjük, üledékbe visszük, és újraszuszpendáljuk 0,25% Triton Χ-100-at tartalmazó PBS-ben. A mintákat felhígítjuk, és polipeptidre, illetve aktivitásra vizsgáljuk.

A VH. faktorhoz szolgáló ELISA-meghatározást a következőképpen végezzük. 200 mikroliter humán VH. faktor elleni antitestet (5 pl/ml 0,1 mől/1 Na₂CO₃-ban, pH-9,6) inkubálunk egy 96 üreges mikrotitráló lemez mindegyik üregében 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten. Az üregeket ezután 220 pl, 1% szarvasmarhaszérum-albumint (BSA) és 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-ben (pH=7,2) inkubálunk 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten. A lemezeket H₂O-val öblítjük, levegőn szárítjuk, és 4 ’C hőmérsékleten tároljuk. Hogy megvizsgáljuk a mintákat, 200 pl mintát inkubálunk 1 órán át szobahőmér18

HU 204 556 Β sékleten az antitesttel fedett üregekben. Az üregeket azután négyszer átöblítjük 200 pl PBS-sel, amely 0,05% Tween 20-at tartalmaz. Az üregeket ezután 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk 200 pl, VII. faktor elleni nyúl poliklonális antiszérium egy IgG frakciójával (5 pg/ml, 1% BSA-t és 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-ben). Ezt követi az inkubálás alkalikus foszfátéhoz kötött kecske-anti-nyúl IgG-vel. Az üregeket ezután négyszer öblítjük 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel. Az üregekhez 200 pl, 56 mg/1 MgCk-ot tartalmazó dietanol-amin-pufferben (96 ml/1) (pH=9,8) oldott p-nitrofenil-foszfátot (30 mg) adunk. Az enzimreakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük, és a sárga szín kifejlődését figyeljük 405 nm-nél, ELISA-lemezleolvasót alkalmazva. A sejtközegekhez nyert eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.

A VH. faktor biológiai aktivitását az egylépéses alvadási vizsgálattal vizsgáljuk, amelyet Quick írt le (Hemorragic Disease and Thrombosis, 2. kiadás, Leat Febiger, Philadelphia, 1966). A sejtközegekhez nyert eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.

3. táblázat

Nap	Sejt/ml (•10-4)	VH. faktor polipeptid (ng/1)	VH. faktor aktivitás (ng/ml)
1	2,9 2,7	25	6,0
2	1,9 2,8	47	15,9
3	1,96 2,26	160	93
4	4,71 4,14	550	300
5	8,79 11,28	725	531
6	5,1 8,4	975	600

7. példa

AIX. faktor kifejeződése pg FIX(-G)—>pUC13-mat emésztünk 30 egység BamHI-gyel 30 pl „nagy sótartalmú” pufferben 3 órán át 37 °C hőmérsékleten. A DNS-t azután elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agarózgélben és a IX. faktorszekvenciát tartalmazó 1,4 kb-s csíkot izoláljuk a gélről.

pg pD2 vektort emésztünk 30 egység BamHI-gyel 30 pl „nagy sótartalmú” pufferral 3 órán át 37 °C hőmérsékleten. A DNS-t elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agarózgélen és lineáris, 1,5 kb-s fragmenst izolálunk. A DNS-t azután 0,12 egység borjú alakalikus foszfatázzal kezeljük 30 pl, 10 mmól/1 trisz-HCl-ot (pH-8) és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban 30 percen át 37 °C hőmérsékleten. A sótartalmat 0,3 mól/l Na-acetátra állítjuk be és a mintát extraháljuk kétszer fenollal, egyszer kloroformmal, és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az üledéket 70%-os etanollal öblítjük, megszárítjuk, és 20 pl, 10 mmól/1 trisz-HCl-ot (pH=8) és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban újraoldjuk. Akét fragmens ekvimoláris mennyiségét (0,2 pmól) ligáljuk 10 egység TíDNS-ligázzal, amint ezt fentebb leírtuk. A reakciókeveréket használjuk fel E. coli RR1 sejtek transzformálására. Az így létrejött ampicillinrezisztens telepek közül 12 telepet átvizsgálunk restrikciós enzimes emésztéssel. A kiónok egyikét, amely be az 1,4 kb-s fragmens a korrekt orientációban van beépítve, FIX(-G)/pD2-nek nevezzük. Az FIX(-G)/pD2-vel transzformált E. coli RRl-et az ATTC-nél letétbe helyeztük ATCC53067 letéti számon.

A BHK-sejteket együtt transzformáljuk FIX(-G)/pD2vel és pKO-neo-val, amint ezt fentebb leírtuk. Gyógyszerrezisztens törzseket választunk ki és készítünk elő ELISA-méréshez és aktivitásméréshez, amint ezt a 6. példában leírtuk.

A biológiai mérés azon alapszik, hogy a IX. faktor képes normálisra csökkenteni a IX. faktorhiányos betegekből származó plazma alvadási idejét. Ezt úgy végezzük el, ahogyan ezt Proctor és-Rapaport leírták Amer. J. Clin. Path. 36,212 (1961). Az eredményeket a

4. táblázat mutatja be.

4.táblázat

Nap	Sejt/ml (•ΙΟ'4)	IX. faktor polipeptid (ng/ml)	IX. faktor aktivitás (ng/ml) a felül úszóban	% aktív fehérje a felül- úszóban
felülúszó	üledék
1	1,65	—			—
2	2,66	57	20	27	50%
		45	20	24
3	9,69	150	60	72	58%
		120	60	84
4	14,79	475	160	198	50%
		225	140	150
5	50,85	875	250	408	45%
		1000	260	438

A IX. faktor polipeptid mennyiségét ELISA-módszerrel határozzuk meg lényegében olyan módon, ahogyan a 6. példában leírtuk, a IX. faktor elleni poliklonális nyúl antiszérumokat alkalmazva. Az üregek IX. faktortartalmú mintákkal való inkubálását követően az üregeket öblítjük és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk 200 pl affinitásos módszerrel tisztított nyúl poliklonális anti-IX. faktorral, amely alkalikus foszfatázzal van konjugálva, és 1:1000 arányban hígítva 1% BSA-t és 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-ben. Az üregeket azután négyszer öblítjük 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel, és enzim-szubsztrátumot adunk hozzájuk a fentiek szerint. Az inkubálást 4 °C hőmérsékleten végezzük egy éjszakán át, vagy 37 °C hőmérsékleten 2 órán át.

Amint a 4. táblázatból látható, a IX. faktor polipeptid 70-80%-a kiválasztódik a tápközegbe, és ennek

HU 204556 Β mintegy 50%-a biológiailag aktív. IX. faktoraktivitás nem mutatható ki a sejtüledékben.

Az aktivitás legmagasabb szintjét úgy éljük el, ha a sejttenyésztő tápközeget kiegészítjük K-vitaminnal (Phytonadione, Merck) 1-10 mg/ml koncentrációnál.

Számos további elemzést hajtunk végre annak demonstrálására, hogy a sejtek autentikus IX. faktort választanak ki. A fenti vizsgálatok szerint IX. faktoraktivitást tartalmazó mintákat VHI. faktorhiányos plazmával inkubálunk, de ez nem hat az alvadási időié, jelezve, hogy az aktivitás inkább az autentikus IX. faktornak tulajdonítható, mintegy nem fajlagos alvasztószernek. Ezt a következtetést továbberősítjük a mintákból nyert IX. faktoraktívitás kimentésével egy fajlagos antitest segítségével. AIX. faktoraktívitás 97-98%-a immunológiai úton kicsapódik egy IX. faktor elleni nyúl poliklonális antitesttel a sejtek felülúszójából. Ez az antitest kicsapja a IX. faktoraktívitás több, mint 99%-át a normál plazmából. AIX. faktoraktívitás nem távolítődik el a felülúszóból az eritroprotein elleni nyúl poliklonális antitesttel.

8. példa

Kifejeződő vektor megalkotása VII. faktorhoz

Kifejeződő vektort alkotunk, meg, amely a VH. faktor szintetikus 5’kódoló területét tartalmazza a részleges VH. faktor cDNS-sel összekapcsolva. A pM7135nek nevezett vektort úgy alakítjuk ki, hogy apM7115ből származó IX. faktorvezető, VII. faktor 3’ szekvenciát pD3 plazmidba iktatjuk, amely az SV40 fokozót, a

2. adenovírus nagyobb későbbi promotoqát és háromrészes vezetőt tartalmaz.

ApD3 plazmidot a pDHFRin plazmidból alakítjuk ki. ApDHFRIH-ban a DHFR szekvenciától közvetlenül felfelé levő PstI helyet átalakítjuk BcII-gyé olyan módon, hogy 10 pg plazmidot emésztünk 5 egység Pstl-gyel 10 percen át 37 ’C hőmérsékleten 100 pl „A” pufferben (10 mmól/1 trisz, pH=8, 10 mmól/1 MgClí, 6 mmól/1 NaCl, 7 mmól/l β-MSH). A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és újraszusz- ‘ pendájuk 40 pl „B” pufferben (50 mmól trisz, pH=8, mmól/I MgCh,7 mmől/I β-MSH), amely 10 mmól/I dCTP-t és 16 egység DNS-poInnerázt tartalmaz, és 12 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 60 percen át. Etanolos kicsapást követően a DNS-t 2,5 pg kinázzal ² kezelt Bell kapcsolóhoz ligáljuk 14 pl „C” pufferben (10 mmól/I trisz, pH-8, 10 mmól/1 MgCh, 1 mmól/1 DTT, 1,4 mmól/1 ATP), amely 400 egység T₄ polinukleotíd-ligázt is tartalmaz, 12 órán át 12 ’C hőmérsékleten. Fenolos extrahálást és etanolos kicsapást kö- £ vetőén a DNS-t újraszuszpendáljuk 120 pl „D” pufferben (75 mmól/1 KC1, 6 mmól/I trisz, pH-»7,5, mmól/1 MgCb, 1 mmól/1 DTT), emésztjük 80 egység BclI-gyel 60 percen át 50 ’C hőmérsékleten, ezután elektroforézisnek vetjük alá agarózon. Forrni- 5 plazmid DNS-t (10 pg) izolálunk a gélből, és Egálunk 10 pl, 50 egység T₄ polinukleotid-ligázt tartalmazó pufferben 2 órán át 12 ’C hőmérsékleten, és E. coli HB 101 transzformálására használjuk fel. Pozitív telepeket azonosítunk gyors DNS-preparátumelem- 6 zéssel, és a pozitív telepekből készített DNS-t (amelyet pDHFR’-nek nevezünk) ampícillinrezisztens E. coliba transzformáljuk.

A pD2 plazmidot azután úgy alakítjuk ki, hogy 5 pDHER’-t (15 pg) és pSV40-et (25 pg) hasítunk 100 pl „D” pufferben 25 egység BclI-gyel 60 percen át 50 ’C hőmérsékleten, ezt követi 50 egység BarnHT hozzáadása és további inkubálás 37 ’C hőmérsékleten 60 percen át A DNS-fragmenseket agarózgélen elektroforézissel 0 szétválasztjuk és a 4,9 kb-s pDHFR’ fragmenst és a 0,2 kb-s SV40 fragmenst izoláljuk. Ezeket a frag menseket (200 ng pDHFR’ DNS és 100 ng SV40 DNS) 10 pl „C” pufferben, amely még 100 egység T₄ polinukleotid-ligázt is tartalmaz, inkubáljuk 4 órán át 12 ’C hő5 mérsékleten, és az így létrejött konstrukciót (pD2’) alkalmazzuk E. coli RRI transzformálására.

A pD2’ plazmidot módosítjuk olyan módon, hogy . kihagyjuk belőle a „méreg” szekvenciákat a pBR322 területben [Lusky és Botchamr Natúré, 293, 79—81 ) (1981)]. pD2’ plazmidot (6,6 pg) és pML-l-et (Lusky és Botcham, fentebb idézett munka) (4 pg) inkubálunk 50 pl „A” pufferben 10-10 egység EcoRI-gyel és Nrul-gyel 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten, ezt agarózgél elektroforézis követi. Az 1,7 kb-s pD2’ fragi menst és az 1,8 kb-s pML-1 fragmenst izoláljuk és ligáljuk egymással (50-50 ng) 20 pl „C” pufferben, amely 100 egység T₄ polinukleotid-ligázt is tartalmaz, 2 órán át 12 ’C hőmérsékleten, ezt követi a transzformálás E. coli HBlOl-be. A kívánt konstrukciót (amelyet ApD2-nek nevezünk) tartalmazó telepeket gyors preparátumelemzéssel azonosítjuk. 10 pg ÁpD2-t emésztünk ezután 20-20 egység EcoRI-gyel és BglU-vel 50 pl „A” pufferben 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten. A DNS-t elektroforézisnek vetjük alá agarózon keresztül, és a kívánt 2,8 kb-s fragmenst („C” fragmens), amely a pBR322 3’ illesztési helyet és poIi-A-szekvenciákat tartalmazza, izoláljuk.

Hogy a pD3 megalkotásában használt hiányzó fragmenseket kialakítsuk, pDHFRHI-mat módosítunk úgy, hogy a SacH (SstlI) helyet átalakítjuk vagy Hindin, vagy KpnI hellyé. 10 pg pDHFRHI-mat emésztünk 20 egység SstH-vel 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten, ezt követi a fenolos exírahálás és etanolos kicsapás. Az újraszuszpendált DNS-t 100 pl „B” pufferben, amely 10 mmől/1 dCTP-t és 16 egység TJDNS-polimerázt is tartalmaz, inkubálunk 60 percen át 12 ’C hőmérsékleten, fenollal extraháljuk, dializáljuk és etanollal kicsapjuk. 5 pg DNS-t ligálunk 50 ng, kinázzal kezelt Hindin vagy KpnI kapcsolóval 20 pl „C” pufferben, amely 400 egység TíDNS-ligázt tartalmaz, 10 órán át 12 ’C hőmérsékleten, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. 50 pl „A” pufferben való újfaszuszpendálás után az így létrejött plazmidokat 50 egység HindlH-mal vagy KpnI-gyel emésztjük a megfelelő módon, és agarőzon elektroforézisnek vetjük alá. A gélről izolált DNS-t (250 ng) ligáljuk 30 pl „C” pufferben, amely 400 egység TDNS-Iigázt is tartalmaz, 4 órán át 12 ’C hőmérsékleten, és ezt használjuk fel E. coli RRI transzformálására. Az így létrejött plazmidokat nevezzük pDHFRIII(HindIII)-nak, illetve pDHERlH(KpnI)-nek.

HU 204 556 Β

Egy 700 bp-s Kpnl-Bglü fragmenst („A” fragmens) tisztítunk azután pDHFRIII(KpnI)-ból BglII-vel és KpnI-gyel végzett emésztéssel és ezt követő agarózgél elektroforézissel.

Az SV40 fokozószekvenciát a kővetkezőképpen iktatjuk be a pDHFRHI(HindHI)-ba. 50 pg SV40 DNS-t inkubálunk 120 pl „A” pufferben 50 egység HindlH-mal 2 órán át 37 °C hőmérsékleten, és a Hindin C SV40 fragmenst (5089-968 bp) gélen tisztítjuk. A pDHFRHI(HindlH) plazmidot (10 pg) 250 ng borjúbél-foszfatázzal kezeljük 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A linearizált plazmidot (50 ng) 250 ng Hindin C SV40-nel ligáljuk 16 pl C pufferben 3 órán át 12 °C hőmérsékleten, 200 egység T₄ polinukleotid-ligázt alkalmazva, és ezt E. coli HB 101-be transzformáljuk. Egy 700 bázispáros EcoRI-KpnI fragmenst („B” fragmens) izolálunk ebből a plazmidból.

A pD3 végső megalkotásához az „A” és „B” fragmenst ligáljuk 10 ng „C” fragmenssel 200 egység T₄ polinukleotid-ligázzal 4 órán át 12 °C hőmérsékleten, ezt követi az E. coli RRI fertőzése. Gyors preparátumelemzéssel pozitív telepeket mutatunk ki, és a pD3 nagyléptékű előállítását elvégezzük.

Ezután megalkotjuk a pM7135 kifejeződő vektort. A pM7115 replikatív formáját emésztjük BamHI-gyel és Xbal-gyel, és a IX. faktorvezető és a VII. faktor 5’ szekvenciáját tartalmazó 550 bázispáros fragmenst gélen tisztítjuk. Az FIX/VII/pD2 plazmidot Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a VII. faktor cDNS 3’ részét tartalmazó 1700 bp-s fragmenst gélen tisztítjuk. A pD3 plazmidot BclI-gyel emésztjük, borjú alkalikus foszfatázzal kezeljük, és a három fragmenst hármas ligálással összekapcsoljuk. Az így létrejött konstrukciókat átvizsgáljuk 2000 bázispáros Xbal fragmens jelenlétére. Egy plazmidot, amely a korrekt orientációval rendelkezik, választunk ki, és eztpM7135-nek nevezzük (8. ábra).

9. példa

A VII. faktor kifejeződése a cDNS-klónokból

Abból a célból, hogy egy VII. faktorvezetőt tartalmazó VH. faktor cDNS-t kifejezzünk, a XVII2463-ból vagy XVII565-ből és XVn2463-ból származó DNS-t klónozzunk egy olyan kifejeződő vektorba, amely az Ad2 nagyobbik késői promotort, S V40 fokozószekvenciákat, az Ad2 háromrészes vezetőt, egy illesztési készletet és SV40 poliadenilezŐ helyet tartalmaz. Ezt a vektort úgy tesszük alkalmassá, hogy ez egy egyedi EcoRI szekvenciát tartalmazzon a cDNS beiktatás helyeként. A λVH2463-ból származó, amely egy 60 aminosavas vezetőt kódol, és a XVII565-ből és ÁVII2463ból származó, amelyekből hiányzanak a -18 és -39 közti aminosavakhoz tartozó kodonok és így 38 aminosav hosszúságú vezetőt kódolnak, szekvenciák kifejeződését értékeljük. Mivel a VII. faktorvezető szerkezetét csak cDNS- klónozással azonosítjuk, és két különböző 5’ terminális cDNS nyerése által létrejött kétértelműség miatt, a feltalálók megalkotnak egy VII. faktor genom-cDNS-szekvenciát is. A XVH2463 3’ részét (a BglH helytől a 2. exonban a poli(A) faktorhoz farokhoz 3’ végén kapcsolt EcoRI helyig) összekapcsoljuk 7ml klón egy olyan szubgenom fragmenséhez, amely az la, lb exonokat és a 2. exon további részét kódolja. Ezt a szubgenom fragmenst, amelyet mint 4,4 kb-s EcoRIBgffl fragmenst rekonstruálunk, összekapcsoljuk a XVII2463cDNS-sel és valamely emlős kifejeződő vektorba klónozzuk.

Röviden leírva: abból a célból, hogy a szubklónokat megalkossuk, a XVII2463 VH. faktor cDNS EcoRI fragmensét pUC18 EcoRI helyébe klónozzuk, az így létrejött tennéket pVH2463-nak nevezzük. Hasonlóképpen a XVII565 EcoRI cDNS beiktatását pUC18-ba szubklónozzuk, ezt a terméket pVII565-nek nevezzük. A pVH565 klón VH. faktor szekvenciájának 5’ része és a pVH2463 VII. faktor DNS 3’ szegmense közti hibridet alkotunk meg olyan módon, hogy a pVH565 EcoRI-BglII VII. faktorfragmens 5’ részének legvégét és a pVII2463 BgUI-Hindm VII. faktorfragmenst (HindHI hely a pVII 2463 polilinkerjében) EcoRI-vel és HindlΠ-mal emésztett pUC18-ba klónozzuk. Ezt a konstrukciót pVH2397-nek nevezzük. A pVH2463 és pVII2397 beiktatásait EcoRI emésztéssel eltávolítjuk és gélen tisztítjuk emlős kifejeződő vektorokba való beiktatáshoz, amint ezt fentebb leírtuk.

A) A teljes hosszúságú VII. faktor cDNS kifejeződése

A VH. faktor kifejeződését a pDX vektorban érjük el. Ez a vektor a pD3-ból származik (amelyet a fenti 8. példában írtunk le) és a pD3’-ból, amely a pD3-mal azonos azzal a kivétellel, hogy az SV40 poliadenilezŐ jel [azaz az SV40 BamHl helyétől (2533 bp) a BcU helyéig (2770 bp) terjedő fragmens] a késői orientációban van. így a pD3 ’ BamHl helyet tartalmaz a génbeiktatás helyeként.

Hogy a pDX-et létrehozzuk, az EcoRI helyet a pD3’-ban BcU hellyé alakítjuk olyan módon, hogy EcoRI-gyel hasítunk, SÍ nukleázzal inkubálunk, és ezt követően BcU linkerekkel ligálunk. Egy pozitívnak azonosított telepből DNS-t állítunk elő, és a megváltozott restrikciós helyet tartalmazó, 1,9 kb-s XhoI-PsŰ fragmenst agarózgél elektroforézissel izoláljuk. Egy másik módosításban BclI-gyel hasított pD3-mat ligálunk kinázzal kezelt EcoRI-BcU adapterekkel [amelyeket a ZC525-ből (5’-GGAATTCT 3’) és ZC526-ból (5’-GATCAGAATTCC 3’) alkotunk meg] abból a célból, hogy egy EcoRI helyet hozzunk létre, mint egy génnek a kifejeződő vektorba való beiktatására szolgáló helyet. Restrikciós endonukleázos elemzéssel pozitív telepeket azonosítunk, és ebből a DNS-t arra használjuk fel, hogy a módosított restrikciós helyet tartalmazó 2,3 kb-s XhoI-PsŰ fragmenst izoláljuk. A két fentebb leírt DNS-fragmenst T4DNS-ligázzal együtt inkubáljuk, E. coli HBlOl-be transzformáljuk, és restrikciós elemzéssel pozitív telepeket azonosítunk. Egy ilyen DNS-készítményt, amelyet pDX-nek nevezünk, állítunk elő (12. ábra). Ezt a DNS-t EcoRI-gyel hasítjuk és ezt követően borjúbél-foszfatázzal kezeljük. A tisztított DNS-t azután TíDNS-ligázzal inkubáljuk és a pVn2463-ból a VH. faktor EcoRI-fragmenssel, vagy a pVU2397-ből származó VH. faktor EcoRI cDNS-fragmenssel. Az így létrejött kiónokat FVn(2463)/pDX21

HU 204556 Β nek, illetve FVH(565+2463)/pDX-nek nevezzük (12. ábra) . E. coli JM83-ba transzformálás és az ezt követő, restrikciós enzimes elemzéssel végzett azonosítás után plazmid DNS-készííményeket állítunk elő és ezeket kiterjedt restrikciós endonukleázos emésztéssel ellenő- 5 rizzük. Az FVH(2463)/pDX és FVH(565+2463)/pDX plazmidokat az American Type Culture Collection-nál letétbe helyeztük, ahol ezek a 40206, illetve 40205 letéti számot kapták.

10-10 gg FVH(2463)/pDX-et és 10

FVH(565+2463)/pDX-et fertőzünk 10 gg lazacsperma hordozó DNS-sel együtt vagy BHK tk:tl3 sejtekbe [Eloros és munkatársai: Exper. Cell Rés. 132,215223 (1981)], vagy COS-sejtekbe, a standard kalciumfoszfátos kicsapást alkalmazva. A fertőzést követően 15 a sejteket a megfelelő tápközegben tenyésztjük két napon át, amely tápközeg 5 gg/ml K-vitamint is tartalmaz. Ebben az időben a felülúszókat ELISA pozitív anyagokra megvizsgáljuk, a VH. faktor ellen irányuló monoklonális antitesteket alkalmazva. Mind az 20 FVH(2463)/pDX, mind az FVH(565+2463)/pDX a VH. faktor polipeptid termelésére áll be, amelyet a COS-sejtek felülűszóiból mutatunk ki, és az

FVH(565+2463)/pDX-ből eredő VH. faktort a BHKsejtek felülúszójából mutatjuk ki.

Az álfertőzött BHK-sejtek vagy COS-sejtek nem termelnek VH. faktortkimutatható szinten (5. táblázat).

5. táblázat

DNS Sejtvonal Sejtszám ELISA pozitív anyag (ng/ml tápközeg)

FVH(2463)/pDX	COS	2-106	15
FVH(565+2463)/pDX	COS	2· 10«	12
Kontroll	COS	2*10®	<2
FVH(2463)/pDX	BHK	9-106	62
FVH(565+2463)pDX	BHK	9^106	6
Kontroll	BHK	9*106	<2

A VH. faktor átmeneti kifejeződését szintén megvizsgáltuk számos más sejtvonalon, amelyek a 6. táblázatban vannak felsorolva.

6. táblázat

Név *'·	Leírás	Referencia (ATCC-szám)
1.	RatHepI	Patkány hepatóma H4-H-E-C3	CRL1600
2.	RatHepH	Patkány hepatóma Η4-Π-Ε	CRL1548
3.	TCMK	Egérvese, SV40 vírussal transzformált, TCMK-1	COL 139
4.	Humán Iung (tüdó)	SV40 vírussal transzformált WI-38 VA13,2RAalvonal	COL 75.1
5.	Humán hepatőma	Emberi máj adenokarcinóma SK-HEP-1	HTB-SZ
6.	HepG2	Emberi hepatóma, a Barbara Knowles/Wisfar Intézetből származó	HTB 8065
7.	Mouse liver	NCTC 1469 klón (egénnáj)	CC29.1
8.	COS	SV40-nel transzformált CVl(majom) sejtek	CRL 1650
9.	BHK	Újszülött hörcsögvese BHK-21 (C-13)	CCL10
10.	293	Humán embrióvese/transzfoimált Ad	CRL 1573
11.	DÜKX	CHO-DHFRsras	[Urlaub és Chasin, PNAS (USA) 77,4216-4220 (1980)]

A sejteket együtt fertőzzük 10 gg FVH(2463)/pDXszel vagy FVH(565+2463)/pDX-szel, 1 gg olyan plazmiddal, amely a klóram-fenikol acetil-transzacetilázgént tartalmazza (hogy lehetővé váljék az együtt fertő- 50 zött törzsek azonosítása), és 10 gg lazacsperma DNSsel. Kontrollként áltranszformált sejteket alkalmazunk. Az elhasznált tápközeget ELISA-módszerrel mérjük 6 nap után. Az eredményeket a 7. táblázatban adjuk meg.

7.táblázat

Minta	Sejtvonal	Plazmid	Sejtszám· 106	ELISA (ng/ml)
1.	RatHepI	Álfertőzés	11,6	2,4
2.	Rat Hep I	FVH(565+2463)/pDX	7,0	2
3.	Rat Hep I	FVH(2463)/pDX	7,0	<2
4.	Rat Hep 2	Álfertőzés	13,0	<2
5.	Rat Hep 2	FVH(565+2463)/pDX	18,4	<2

HU 204 556 Β

Minta	Sejtvonal	Plazmid	Sejtszám· 106	ELISA (ng/ml)
6.	Rat Hep 2	FVII(2463)/pDX	14,6	<2
7.	TCMK	Álfertőzés	18,8	<2
8.	TCMK	FVII(565+2463)/pDX	9,8	<2
9.	TCMK	FVII(2463)/pDX	12,8	<2
10.	Humán Lung (tüdő)	Alfertőzés	7,2	<2
11.	Humán Lung	FVII(565+2463)/pDX	3,4	16,5
12.	Humán Lung	FVII(2463)/pDX	3,4	12,2
13.	Humán Hepatóma	Álfertőzés	13,0	<2
14.	Humán Hepatóma	FVII(565+2463)/pDX	11,0	3,5
15.	Humán Hepatóma	FVII(2463)/pDX	6,0	3,0
16.	HepG2	Álfertőzés	6,8	21
17.	HepG2	FVII(565+2463)/pDX	6,0	45,5
18.	HepG2	FVII(2463)/pDX	6,0	28
19.	Mouse Liver (egérmáj)	Álfertőzés	3,8	<2
20.	Mouse Liver	FVII(565+2463)/pDX	4,0	<2
21.	Mouse Liver	FVII(2463)/pDX	3,6	<2
22.	COS	Álfertőzés	5,6	<2
23.	COS	FVII(565+2463)/pDX	5,6	15,5
24.	cos	FVII(2463)/pDX	4,4	14,5
25.	BHK tktl3	Álfertőzés	3,0	<2
26.	BHKtk’tl3	FVII(565+2463)/pDX	5,0	25
27.	BHKtk'tl3	FVII(2463)/pDX	4,0	22,5
28.	293	Álfertőzés	5,8	<2
29.	293	FVII(565+2463)/pDX	6,2	94
30.	293	FVII(2463)/pDX	8,2	100
31.	DUKX	Álfertőzés	11,6	<2
32.	DUKX	FVH(565+2463)/pDX	13,0	<2
33.	DUKX	FVH(2463)/pDX	13,6	<2
FVII(2463)/pDX-et (10 pg)	vagy	zitív kiónból 22-t tovább elemzünk. A sejteket 5·104

FVII(565+2463)/pDX-et (10 pg) együtt transzformálunk 10 pg lazacsperma DNS-sel és 1 pg olyan plazmiddal, amely a dihidrofolát reduktáz rezisztens formáját kódolja [Simonsen és Levinson: Proc. Natl. 40 Acad. Sci. USA, 80,2495-2499 (1983)] emlős kifejeződő vektorba, BHK tk'tl3 sejtekbe. 2 nap után a sejteket 1:14 arányban felosztjuk és szelektív tápközegekre helyezzük, amelyek vagy 250 nmól/1 vagy 1000 nmól/1 metotrexátot (MTX) és 5 pg/ml K-vitamint (Phytadione, Merck) tartalmaznak. Két hét múlva telepeket izolálunk és növesztünk 50-90% összefolyásig. A felülúszó tápközeget azután VII. faktor polipeptidre vizsgáljuk ELISA-módszerrel. A 25 po(I. csoport) vagy 1·10⁵ (II. csoport) mennyiségben szélesztjük 10 cm-es lemezekre, amelyek 5 pg/ml K-vitamint és/vagy 250 nmól/1, vagy 1000 nmól/1 metotrexátot tartalmaznak. 5 nappal később a gyorsabban növő kiónokat (amelyeket a táblázatban csillaggal jelölünk) 1:2 arányban felosztjuk, majd 24 óra múlva a tápközeget mindegyik lemezen lecseréljük. 23 órával (I. csoport) vagy 20 órával (II. csoport) a 45 felülúszó tápközeget kinyerjük és sejtszámlálást végzünk minden egyes kiónnál. A tápközegeket mind ELISA-módszerrel, mind egyfázisú alvasztási módszerrel megvizsgáljuk. Az eredményeket a 8. táblázat mutatja be.

8. táblázat

I. CSOPORT - 23 órás meghatározás

Klón	Plazmid	Sejtszám •1(P	ELISA (pg/sejt/nap)	ELISA (ng/ml)	Alvadás (ng/ml)	% aktív
B4-A1*	FVII(565+2463)	2	6,5	130	206	158
B4-B1*	FVII(565+24ő3)	27	1,9	513	360	70
B4-C1	FVH(565+2463)	16	2,5	393	480	122
B4-C2*	FVII(565+2463)	9	<2	<20	21	-

HU 204556 Β

Klón	Plazmid	Seítszám •105	ELISA (pg/sejt/nap)	ELISA (ng/ml)	Alvadás (ng/ml)	% aktív
B4-C3	FVH(565+2463)	52	1,5	800	910	114
B4-D1*	FVH(565+2463)	27	2,0	533	570	103
B4-D2*	FVH(565+2463).	13	1,2	150	154	103
B4-E1	FVH(565+2463)	39	2,2	870	1160	133
B4-E2*	FVH(565+2463)	8	2,5	205	240	117
B4-E3	FVH(565+2463)	23	1,2	275	320	116
B4-E4	FVH(565+2463)	31	1,3	410	300	73
B3-5.3*	FVH(565+24Ó3)	5	8,2	410	290	70
		Π. CSOPORT-	20 órás meghatározás
Klón	Plazmid	Sejtszám	ELISA	ELISA	Alvadás	%
		•105	(pg/sejt/nap)	(ng/ml)	(ng/ml)	aktív
B3-2.2	FVH(2463)/pDX	41	2,5	1043	500	48
B3-2.3	FVH(2463)/pDX	19	3,0	580	610	105
B3-3.2	FVH(2463)/pDX	13	1,5	197	216	110
B3-4.2	FVH(2463)/pDX	41	1,8	760	620	82
B3-5.1	FVH(2463)/pDX	14	3,3	460	400	87
B3-5.2	FVH(2463)/pDX	9	2,7	257	184	72
B6-D	FVH(2463)/pDX	54	3,0	1700	780	46
B6-E	FVH(2463)/pDX	101	1,6	1640	970	59
B6-G	FVH(2463)/pDX	31	5,7	1853	1080	56
B6-M	FVH(2463)/pDX	75	2,2	1473	940	54

B) VB. faktor genom-cDNS hibrid kifejeződése A VH. faktor genom 5’-terminálist képviselő genomszekvenciákat és a VH. faktorgén 3’-tennináIisból eredő cDNS-szekvenciákat tartalmazó kifejeződő vektort készítünk az alábbi módon. A 7 ml genomplazmid három szubklónját használjuk az 5’-terminális helyreállítására: a 7Bam-ot, 7SD-t és 7SE-t. A 7Bam plazmid egy 3,6 kb-s, la exont tartalmazó EcoRI-BamHI fragmens pUC12-be szubklónozva. Egy 0,7 kb-s EcoRIXbal fragmenst, amely az la exont tartalmazza, izolálunk ebből a szubklónból és ezt „a” fragmensnek nevezzük. A7SD plazmid egy 3,7 kb-s lb exont tartalmazó SstI fragmens pUC18-ba klónozva. Egy lb exont tartalmazó, 3,1 kb-s Xbal-SstI fragmenst izolálunk ebből a szubklónból és ezt „b” fragmensnek nevezzük. A 7SE plazmid egy 2-4. exonokat tartalmazó 3,9 kb-s SstI fragmens Ml3mpl9-be szubklónozva. Egy SsűBglH (0,6 kb) fragmenst, amely a 2. exon 5’ részét tartalmazza, izolálunk és ezt „e” fragmensnek nevezzük. A 3’-VH. faktor cDNS további részeit („d” fragmens) 2 kb-s BglH-EcoRI fragmensként nyerjük pUVVII2463-b61. Az a-d fragmenseket ligáljuk EcoRI-gyel hasított és borjúbél- foszfatázzal kezelt pDX-szel, majd E. coli JM83-ba vagy HBIOl-be transzformáljuk. Restrikciós endonukleáz elemzéssel pozitív telepeket azonosítunk, és ezekből a telepekből plazmid DNS-t készítünk.

A VH. faktor kifejeződéséhez a plazmid DNS-t együtt fertőzzük BHK- vagy COS-sejtekbe, amint ezt fentebb leírtuk. A fertőzött sejteket K-vitamin tartalmú tápközegben tenyésztjük 2 napon át és a tápközeget VH. faktorra vizsgáljuk ELISA-módszerrel.

Az előzőekben leírtakból méltányolni lehet, hogy bár a találmány speciális kiviteli módjait írtuk le itt a bemutatás céljából, különböző módosításokat lehet végrehajtani anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől és túllépnénk annak oltalmi körét. Következésképpen a találmány oltalmi körét a mellékelt igénypontok adják meg.

Claims (16)

1. Eljárás DNS-konstrukció előállítására, mely egy olyan fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely fehérje aktiválva a véralvadásnál a VHa faktorral azonos biológiai aktivitást mutat, azzaljellemezye, hogy a nukleotidszekvenciához egy kalciumkötő tartományt kódoló első nukleotidszekvenciát kapcsolunk, mely lefelé elhelyezkedőén egy, a VHa faktor szerinproteáz aktivitásához tartozó katalitikus tartományt kódoló második nukleotidszekvenciát tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első nukleotidszekvenciaként egy VH. faktort vagy IX. faktort vagy X. faktort, C-fehérjét, protrombint vagy S-fehérjét kódoló gént kapcsolunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vezetőpeptidet is kódoló első nukleotidszekvenciát kapcsolunk.

HU 204556 Β

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy szintetizált kettős szálú oligonukleotidot is magában foglaló első nukleotidszekvenciát kapcsolunk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szintetizált kettős szálú oligonukleotidként a VII. faktor aminoterminális részét kódoló szekvenciát magában foglaló első nukleotidszekvenciát kapcsoljuk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy VII. faktort kódoló nukleotidszekvenciát kapcsolunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia legalább egy részletének a VII. faktor egy cDNS-klónjából vagy genomiális kiónjából származó DNS- konstrukcióját kapcsoljuk.

8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VH. faktor egy cDNS vagy genomiális klónjából származó első nukleotidját az említett első szekvenciától lefelé elhelyezkedően egy, a második szekvenciának a VII. faktor egy cDNS-klónjából származó második nukleotidszekvenciával kapcsoljuk.

9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS- szekvenciaként az 1. ábra szerinti 36. bptóhaz 1433. bp-ig tartalmazó nukleotidszekvenciát kapcsoljuk.

10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-szekvenciaként az IB ábra szerinti a 36. bp-től a 99. bp-ig, majd ezt követően lefelé a 166. bp-tól 1433. bp-ig tartalmazó nukleotidszekvenciát kapcsoljuk.

11. Eljárás emlős gazdaszervezet DNS-be integrálódni képes rekombináns plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő plazmidhordozóba egy promotortól lefelé és egy poliadenilező jel közé az 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított nukleotidszekvenciát inszertálunk.

12. Eljárás emlős sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely emlős sejtet egy 11. igénypont szerint előállított rekombináns plazmiddal fertőzünk.

13. Eljárás VUa faktor által közvetített véralvadáshoz biológiai aktivitással bíró fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy

- egy olyan emlős gazdasejtet hozunk létre, amely egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti DNSkonstrukciót tartalmaz;

- az említett emlős gazdasejtet megfelelő tápközegben növesztjük;

- az említett DNS-konstrukció által kódolt, és az említett gazdasejt által termelt fehérjeterméket izoláljuk; és

- az említett fehérjeterméket aktiváljuk.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cDNS-konstrukciót tartalmazó gazdasejtet egy dihidrofolát reduktázt kódoló génnel együtt fertőzve, metotrexátot tartalmazó tápközegben tenyésztjük.

15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét XHa, vagy IXa, vagy kallikrein, vagy Xa faktor, vagy trombin proteolitikus enzimmel reagáltatva aktiváljuk.

16. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, különösen vérzési rendellenességek kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy, a 14. igénypont szerint előállított fehérjét gyógyszerkészítésnél általánosan alkalmazott adalékanyagokkal szokásos dózisformává formálunk.