JP6088974B2 - ヒト血液凝固第vii因子の大量生産方法 - Google Patents
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Description
より血液を凝固させるセリンプロテアーゼ(serine protease)の前駆体であり、分子量50,000Daの単鎖糖タンパク質である。FVIIは、第Xa因子、第XIIa因子、第IXa因子、トロンビンによって、2本の鎖に分解された第VIIa因子に活性化される。第VIIa因子は組織因子(tissue factor)、陰電荷を帯びたリン脂質Aに結合することにより酵素活性が強化することが知られている(非特許文献1)。
が除去されたジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターの塩基配列およびこれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする塩基配列、並びにii)サイトメガ
ロウイルス(CMV)初期遺伝子プロモーターの塩基配列およびこれに作動可能に連結されたヒト血液凝固第VII因子をコードする塩基配列を含む発現ベクターを製作することができる。
因子のうち第VII因子を大量生産する方法に関するものである。
が除去されたジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターの塩基配列およびこれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする塩基配列を含むベクターであり、好ましくは図1に示されたpXOGC−FVIIであることを特徴とするベクターでありうる。その例として、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、およびアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターのようなのウイルスベクターなどを含み、好ましくはプラスミドである。
<1−1> 第VII因子遺伝子の増幅
動物細胞内で組み換え第VII因子の過発現を誘導するための発現ベクターを製作した。ヒトの第VII因子遺伝子は、重合酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)技法を用いて、信号配列を含むヒトの第VII因子遺伝子を獲得した。第VII因子遺伝子増幅のために、Clontech社(USA、今はTAKARA BIO USA)から購入したヒト胎児肝臓(fetal liver)cDNAライブラリーを鋳型として、配列番号1および2の正方向および逆方向プライマーを用いた。クローニング作業を容易にするために、第VII因子正方向プライマーには制限酵素BamHI認識部位を挿入し、逆方向プライマーには制限酵素XhoI認識部位を挿入した。前記プライマーは表1に示した。
実施例<1−1>で増幅された第VII因子PCR産物をCMVプロモーターの調節下で発
現できるようにするために、動物細胞発現ベクターであるpXOGCベクターとライゲーション(ligation)させた。上記で使用されたpXOGCベクターは、一つ以上のCCGCCC反復配列が除去されたDHFRプロモーターの塩基配列およびこれに作動可能に連結されたDHFRをコードする塩基配列を含む発現ベクターであって、組み換えタンパク質の高発現誘導のために製作されたベクターである(特許文献2参照)。
<2−1>細胞株の形質転換
実施例1で製造した組み換えヒト第VII因子発現ベクター(pXOGC−FVII)を、DHFR遺伝子が毀損して核酸生合成過程が不完全なCHO細胞株(CHO/dhfr−)(非特許文献10)に形質導入させ、ヒト第VII因子タンパク質を大量生産することが可能な細胞株を製造した。具体的に、培養中のDG44−CHO(dhfr欠損)細胞(コロンビア大学のChasin博士から購入)をT75培養容器で培養し、培養容器の底部の80〜90%を覆う程度に細胞が増殖したときにリポフェクタミン(Gibco社、cat.no.18324−012)を用いて形質転換させた。すなわち、2つのチューブにそれぞれ3mLのOpti−MEM(Gibco社、cat.No.51985034)を入れ、一つのチューブには5μgのDNAを仕込み、もう一つのチューブには20μLのリポフェクタミンを入れて常温で30分間各溶液を静置した後、2つの溶液を混ぜて予めOpti−MEM培地で3回水洗した細胞に入れた。前記細胞を37℃、5%CO2培養器で約18時間培養した後、さらに10%ウシ胎仔血清(BSA)の含まれたDMEM−F12(Gibco社、cat.no.11330)で3回洗浄した後、培養培地に変えて48時間培養した。培養容器の底部にほぼ一杯増殖した細胞をトリプシン処理によって収得した後、形質導入された細胞のみを選別するために10%の透析されたウシ胎仔血清および1mg/mLのG418(Cellgro社、cat.no.61−234−RG)の含まれたHT(Hypoxanthine-Thymidine)補充剤のないMEM−α培地(WELGENE社、cat.no.LM008−02)入りの新しい培養容器に移して培養した。形質導入された細胞のみが生き残ってコロニーを形成して増殖するまで2日または3日間隔で培地を交換しながら培養した。
実施例<2−1>で形質導入された細胞の一部を24−ウェルプレートに2×104細胞数/ウェルの濃度で移して培養容器の底部を殆ど覆う程度に培養した後、0.3mMの酪酸ナトリウム(Sigma社、cat.no.B5887)の添加された無血清培地CHO−A−SFM(Gibco社、cat.no.05−5072EF)をウェル当り200μLずつ入れて33℃、5%CO2培養器で48時間培養した。細胞の培養液を1.5mLのチューブに移した後、遠心分離を行って上澄み液のみをさらに集め、ヒト第VII因子の発現量を測定した。発現量の測定は製造社のプロトコールに従って酵素免疫測定キット(American Diagnostica、cat.no.877)を用いて行った。具体的に、まず、細胞培養液とキットに入っている標準物質を、0.05%のツイン−20が添加されている生理食塩水で一定に希釈した後、キットのウェルに100μLずつ添加し、常温で1時間プレート振盪器(plate shaker)を用いて反応させた。その後、製造社の洗浄液を用いてウェルを4回ずつ洗浄した後、抗ヒト第VII因子抗体をウェルに100μLずつ添加して常温で1時間プレート振盪器を用いて反応させた。再び製造社の洗浄液で4回洗浄した後、HRP(horseradish peroxidase)の結合している抗ヒト第VII因子抗体に対する抗体をウェル当り100μLずつ添加し、しかる後に、同じ方法によって常温で30分間反応させた。反応が終わった後、4回洗浄した後、基質液を100μLずつ入れ、常温で静置して反応させた。約5分後、50μLの反応停止液を入れて反応を停止させた後、450nmの吸光度で測定した。キット製造社で提供する標準液の濃度と得られた吸光度値を用いて標準曲線および関数を得た後、これを用いてヒト第VII因子の量を定量化した。その結果、形質導入されて選別された細胞が一定量のヒト第VII因子を発現することを確認することができた。
実施例<2−2>でヒト第VII因子の発現が確認された細胞のヒト第VII因子の発現量を増
加させるために、10nMのMTX(Methotrexate、Sigma社、cat.no.M8407)が含まれた選別培地を用いて、選別された細胞をT75培養容器で2週間3日毎に継代培養し、各ウェルの一部の細胞を実施例<2−2>と同様の方法で24ウェルプレートに移して培養した後、ヒト第VII因子の発現量を測定した。10nM以上の濃度ではそれ以上ヒト第VII因子の発現量が増加しないため、この段階で異種性(heterogeneity)を減らすために、限界希釈法(limiting dilution method)を用いた単クローン選別を行った。すなわち、不均一なヒト第VII因子の発現率を示すクローンを限界希釈法を用いてヒト第VII因子の発現率が均一で生産性に優れた単一細胞を分離する実験を行った。具体的に、6ウェルプレートの細胞のうち最も発現量が高かったウェルの細胞を96ウェルプレートにウェル当り1個以下で接種されるように希釈した後、細胞が1個のみ接種されたプレートを選別して2〜3週培養した。その後、コロニーを形成するウェルプレートの細胞を分離した後、継代培養してヒト第VII因子の発現量を酵素免疫測定法で測定した(図2)。限界希釈法によって分離された細胞株のうち10nM MTXで安定した増殖特性とヒト第VII因子の高生産性を示す組み換えCHO細胞株を最終選別してHMF708と命名した。前記HMF708菌株を2010年10月25日に韓国生命工学研究院の生物資源センター(韓国大田市儒城区科学路111韓国生命工学研究院)に寄託番号KCTC11779BPで寄託した。選別された細胞株は無血清培地(EX−CELL CHO培地、米国Sigma社、cat.no. 14360C)を用いて浮遊培養に適応させた。
<3−1>種菌および本培養
実施例<2−3>で選別された後、浮遊培養に適応され、液体窒素タンクに保管中のhFVII発現細胞株1バイアル(1×107細胞/mL)を取り出して37℃の恒温水槽で最
大限迅速に溶かした後、種菌培養培地(グルタミン0.3g/Lが添加されたEX−CELL CHO培地(Sigma社、cat.no.63225C)で1回洗浄し、90×gで5分間遠心分離して種菌培養培地50mL入りの三角フラスコ(Erlenmeyer flask、米国Corning社 cat#431144)に接種した。CO2培養器(37℃、5%CO2)で細胞濃度が10×105細胞/mLとなるまで1〜2日間培養した後、上述と同様の方法で遠心分離して新鮮な種菌培養培地100mL入りの新しい三角フラスコで継代培養した。同じ方法で十分な数の細胞が得られるまで2倍ずつ培養体積を増やしながら継代培養した。
量の測定
生産培地内の酪酸ナトリウムの添加がhFVIIの生産量に及ぼす効果を考察するために、培養中の組み換えCHO細胞株約5.0×106細胞/mLを3つの三角フラスコに50mLの培養体積で接種した。この際、培養培地に酪酸ナトリウム(cat.no.B5887、Sigma社、米国)がそれぞれ0.3、1.0、1.5mMとなるように添加し、酪酸ナトリウム0.3mMを入れたフラスコ対照群として培養を開始した。hFVIIの生産のために培養温度を30.0℃に合わせて4日間培養した。培養4日目に培養液を回収して細胞株の細胞濃度と細胞活性度を観察した結果、酪酸ナトリウムによる細胞濃度および細胞活性度の変化はなかった。
れた値を対照群対比生産量(%)で計算し、下記表2に示した。
<4−1>種菌および本培養
実施例<2−3>で選別された後、浮遊培養に適応され、液体窒素タンクに保管中のhFVII発現細胞株1バイアル(1×107細胞/mL)を取り出して37℃の恒温水槽で最
大限迅速に溶かした後、種菌培養培地(グルタミン0.3g/Lが添加されたEX CELL CHO培地)(Sigma社、cat.no.63225C)で1回洗浄し、90×gで5分間遠心分離して種菌培養培地50mL入りの三角フラスコ(Erlenmeyer flask、米国Corning社、cat#431144)に接種した。CO2培養器(37℃、5%CO2)で細胞濃度が10×105細胞/mLとなるまで1〜2日間培養した後、上記と同様の方法で遠心分離して新鮮な種菌培養培地100mL入りの新しい三角フラスコで継代培養した。同じ方法で十分な数の細胞が得られるまで2倍ずつ培養体積を増やしながら継代培養した。
量の測定
培養器で酪酸ナトリウムの添加がhFVIIの生産量に及ぼす効果を考察するために、作業体積4Lの培養器で組み換えCHO細胞株約1.2×107細胞/mLの濃度で培養した3台の培養器を準備した。そして、培養培地に酪酸ナトリウム(cat.no.B5887、Sigma社、米国)がそれぞれ0.3、1.5、2.0mMとなるように添加し、酪酸ナトリウム0.3mMを入れた培地を供給する培養器を対照群として培養を開始した。hFVIIの生産のために培養温度を30.0℃に合わせて11〜18日間培地を0.5〜1.0VVDで連続的に供給して培養した。細胞活性度が80%以下になると、培養を終了した。生産期に一定量の培養液を回収して細胞株の細胞濃度と細胞活性度を観察した。
値を対照群対比生産量(%)で計算し、下記表3に示した。
限外濾過膜(SARTOCON Slice Cassette、PESU、Sartorius社、MWCO 30K)を1Lの1N NaOHで1時間以上洗浄し、5Lの滅菌水を用いて洗浄した。その後、1次精製カラムの平衡バッファで限外濾過膜を平衡させた後、 第VII因子生産細胞培養液を注入して10倍濃縮した。濃縮された培養液に同一
体積の1次精製カラム平衡バッファを添加して2倍希釈し、これをさらに初期濃縮体積まで濃縮した。このような希釈−濃縮過程を7回以上繰り返し行って培養液を1次精製カラム平衡バッファで定容濾過した。この際、第VII因子の損失は殆どなく、濃縮された第VII因子の最終濃度は0.3mg/mLに保たれた。限外濾過および定容濾過過程は4℃の条件で行われた。定容濾過された第VII因子培養液は0.22μm(NALGENE、PES)の濾過フィルターで最終濾過して陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷した。本発明では、陰イオン交換クロマトグラフィーでQ−セファロース(Q Sepharose Fast Flow、GE Healthcare)レジンの充填されたカラムを使用した。負荷された試料は平衡バッファA(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン)、洗浄バッファB(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン+0.2M NaCl)、洗浄バッファC(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン+0.1M NaCl)および溶出バッファD(20mMトリス pH8.0+2mMベンズアミジン+25mM NaCl+35mM CaCl2)溶液を用いて洗浄バッファCから溶出バッファDに達するように2.5カラム容量で線形濃度勾配を用いてタンパク質を溶出させた。陰イオン交換クロマトグラフィーを介して溶出した第VII因子含有タンパク質溶出液は、溶出が終わり次第、サイズ排除クロマトグラフィーを介して20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジンバッファでバッファ交換した。濾過、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー過程は4℃の条件で行われた。サイズ排除クロマトグラフィーによってバッファ交換された試料を陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷した。本発明では、Q−セファロース(Q Sepharose High Performance、GE Healthcare)レジンの充填されたカラムを使用した。負荷された試料は平衡バッファA(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン)と溶出バッファB(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン+1M NaCl)溶液を用いて溶出バッファBの濃度が20%〜35%に達するように15カラム容量で線形濃度勾配を用いてタンパク質を溶出させた。溶出した第VII因子タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーを介して20mMリン酸カリウム、pH5.5で剤形化した。全ての過程は4℃の条件で行われた。上述したように第VII因子は不活性化された形に精製した後で保管が可能であり、必要に応じて、実施例6と同様に活性化した第VII因子への転換が可能である。
第VII因子タンパク質を活性化(activation)させるために、精製された第VII因子試料を平衡バッファA(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン)で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷した。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ソース15Q(Source 15Q、GE Healthcare)レジンの充填されたカラムが使用された。負荷された試料は、平衡バッファAと溶出バッファB(20mMトリスpH8.0+2mMベンズアミジン+25mM NaCl+35mM CaCl2)を用いて5%溶出バッファBの濃度で40分間オンカラム活性化過程を経た後、溶出バッファBを用いて定組成溶離(isocratic elution)法でタンパク質を溶出させた。精製された第VII因子の活性化段階は常温で行われた。
Claims (7)
- a)i)GCリッチ領域(GC-Rich region)から一つ以上のCCGCCC反復配列が除去されたジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターおよびこれに作動可能に連結されたジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子、並びにii)サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびこれに作動可能に連結された、配列番号3の塩基配列を有するヒト血液凝固第VII因子遺伝子を伴う発現ベクターを製作する段階と、
b)前記a)段階の発現ベクターをジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠乏したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株にトランスフェクションする段階と、
c)ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤の存在下に、前記b)段階のトランスフェクションされた動物細胞株を培養して高効率でヒト血液凝固第VII因子を発現する細胞を選別する段階と、
d)前記c)段階の選別された動物細胞株を含有する培地に酪酸ナトリウムを1〜1.5mMの濃度になるように添加する段階とを含んでなる、ヒト血液凝固第VII因子を大量生産する方法。 - 前記GCリッチ領域が1個以下のCCGCCC反復配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記発現ベクターが図1に示されたpXOGC−FVIIである、請求項1に記載の方法。
- 前記c)段階の選別された細胞株がHMF708(寄託番号KCTC11779BP)である、請求項1に記載の方法。
- ヒト血液凝固第VII因子を精製する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ヒト血液凝固第VII因子を活性化させる段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ヒト血液凝固第VII因子を生産する、寄託番号KCTC11779BPを有するHMF708細胞株。
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