KR101030978B1 - 동물세포용 재조합 발현벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다이하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase: DHFR) 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동물세포용 재조합 발현벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 동물세포주, 그리고 그를 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 기존 동물세포 발현 벡터와 비교하여 훨씬 적은 메토트렉세이트 농도 하에서도 효과적으로 DHFR 유전자와 함께 외래 유전자가 증폭된 세포주 클론을 선별할 수 있도록 한다. 또한 본 발명에 따르면, 단백질 생산 세포주 확립과정에서 감소 된 농도의 메토드렉세이트의 사용을 통해서 높은 생산성의 세포주를 단기간에 확보하게 되므로 세포주 제작 측면에서 우수한 효과를 나타낸다.

다이하이드로폴레이트 환원효소, 프로모터, 메토트렉세이트, 발현벡터, 동물세포

Description

동물세포용 재조합 발현벡터{Recombinant Expression Vectors for Animal Cells}

본 발명은 동물세포용 재조합 발현벡터, 이를 포함하는 세포주 및 이를 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 유용한 목적단백질을 산업적으로 과다 발현하기 위한 기술로서 동물세포배양을 많이 선호하고 있으며, 그 이유는 산업적으로 유용한 단백질들이 대개 사람 또는 동물유래 단백질들로서, 적절한 생물학적 활성을 갖기 위하여 요구되는 특수한 단백질의 변형기작(당쇄화, 인산화, 아마이드화)이 동물세포에서 용이 하게 수행되기 때문이다. 현재 사용되는 산업용 동물세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney), 골수종(myeloma)등이 있으며, 미생물 발현시스템과 동일하게 발현벡터를 상기 세포주에 도입하여 목적하는 외래 단백질을 발현시킨다.

그러나 동물세포의 경우, 미생물을 이용한 발현에 비하여 형질전환을 통해 도입한 외래 유전자의 발현량이 현저하게 낮은 단점을 갖고 있다. 이러한 단점을 보안하기 위하여 현재 산업계에서 많이 사용하고 있는 시스템이 다이하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase :DHFR) 유전자와 이 유전자의 활성 저해제인 메토트렉세이트(Methotrexate :MTX)를 이용하는 외래 유전자의 증폭 시스템이다. 이 시스템은 목적한 단백질을 암호화하는 유전자와 선별 마커인 DHFR 단백질을 암호화하는 유전자가 함께 염색체상의 DNA내의 동일부위에 삽입됨으로써, 인위적으로 MTX 농도를 단계별로 높여줄 때마다 세포주에서 생존에 필요한 DHFR 유전자와 함께 인근에 위치한 외래 유전자가 동시에 증폭되는 현상을 이용하는 것이다.

MTX를 처리하면 발현벡터내의 DHFR 유전자와 부근의 다른 유전자가 같이 증폭된다는 것은 이미 발표 되었으며(Kaufman et al. Mol Cell Biol. J㎕;5(7):1750-9(1985)), 이러한 이유로 발현벡터내의 DHFR 유전자 부근에 삽입시킨 외래 유전자가 함께 증폭되어 동물세포 내에서 외래 유전자가 높은 수준으로 잘 발현된다는 보고가 있다 (Alt et al. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 42 Pt 2:649-57(1978); 미국특허 제4656134호).

일반적으로 유전자 증폭은 매우 드물게 일어나는 현상이지만, 유전자 증폭이 이루어진 세포의 확보 과정은 세포배양시 단계별로 높아진 MTX의 높은 농도하에서도 잘 자라는 저항성을 보이는 세포를 선별해나가는 과정에 의해 현실적으로 가능하게 이루어지고 있으며, 보통 MTX에 적응된 콜로니를 형성하는데 3-4 주의 시간이 필요하며, 50 nM MTX 농도에서 시작하여 500 mM MTX 농도까지 산업적으로 의미 있는 충분한 증폭 과정을 수행하는 것은 몇 달의 시간과 몇 단계의 증폭과정을 거쳐 야 한다.

그러나 MTX 처리에 의한 유전자 증폭 유도과정 중에서 단계별로 증가하는 MTX의 농도에 따라 세포주의 성장속도 및 생산성에 문제가 생기는 경우가 많으며, 실제로 MTX농도를 증가시켜도 재조합 단백질의 발현이 증가하지 않고 오히려 감소 한다는 보고가 있다(Kaufman et al. Mol Cell Biol. J㎕;5(7):1750-9(1985)). 이러한 맥락에서 최근에는 발현벡터내의 DHFR 유전자 조절인자 서열에 돌연변이를 일으켜 MTX에 의한 유전자의 증폭 효과를 현저하게 증가시킨 사례가 보고 된 바 있다(Bai et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. Feb 25;83(4):333-7(2003)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 DHFR 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 동물세포를 이용한 단백질의 발현에 있어서 낮은 발현율의 문제점과 유전자 증폭 유도과정에서 이용되는 메토트렉세이트의 고농도에 의한 낮은 세포주의 성장속도 및 생산성의 문제점을 해결하고자 노력하였다. 그 결과, 마우스 유래 DHFR 프로모터에 작동적으로 연결된 인간 DHFR 유전자 서열이 포함된 재조합 발현벡터를 사용하여 보다 낮은 메토트렉세이트 농도 하에서도 외래 유전자의 효율적인 증폭을 유도할 수 있어 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 동물세포용 재조합 발현 벡터를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터에 의해 형질전환된 dhfr^- 동물세포주를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 dhfr^- 동물세포주를 이용하는 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다이하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase: DHFR) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명자들은 DHFR 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 동물세포를 이용한 단백질의 발현에 있어서 낮은 발현율의 문제점과 유전자 증폭 유도과정에서 이용되는 메토트렉세이트의 고농도에 의한 낮은 세포주의 성장속도 및 생산성의 문제점을 해결하고자 노력하였다. 그 결과, 마우스 유래 DHFR 프로모터에 작동적으로 연결된 인간 DHFR 유전자 서열이 포함된 재조합 발현벡터를 사용하여 보다 낮은 메토트렉세이트 농도 하에서도 외래 유전자의 효율적인 증폭을 유도할 수 있어 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 동물세포용 재조합 발현 벡터를 개발하였다.

본 발명의 명세서 용어 ‘DHFR(Dihydrofolate reductase)’은 다이하이드로폴산을 테트라하이드로폴산으로 환원시키는 효소로서, 핵산 합성에 필수적인 효소이며 세포성장에 반드시 필요한 효소이다.

본 발명은 dhfr^- 동물세포에서 낮은 농도의 DHFR의 저해제, 특히 메토트렉세 이트(MTX)의 낮은 농도에서 벡터의 증폭이 효율적으로 이루어져 외래 재조합 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서, 용어 ‘dhfr^- 동물세포’는 DHFR이 정상적으로 발현되지 않아, 세포 내 상기 효소의 활성이 없거나 또는 거의 없도록 형질전환된 동물세포를 의미한다. 본 발명은 상기 숙주 세포의 특성 및 선택(selection) 되기 위한 DHFR 유전자를 포함하는 유전자의 증폭(gene amplification) 원리를 이용한 것이다. 즉, dhfr^- 동물세포를 dhfr 유전자-포함 벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 세포에 DHFR 저해제를 처리한 경우에는 dhfr를 포함하는 벡터가 세포 내에서 많이 증폭된 세포가 선택되게 된다. 결국, 벡터의 증폭이 달성된다.

본 발명에서 명세서 용어‘MTX(Methotrexate)’는 DHFR 저해제로서 폴산이 다이하이드로폴레이트(FH₂)를 거쳐 테트라하이드로폴레이트(FH₄)로 환원되는 것을 억제시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 DHFR 프로모터는 마우스 유래이고, DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열은 인간으로부터 유래한다.

본 발명에서 이용되는 DHFR 프로모터는 마우스의 dhfr 유전자의 프로모터 서열 중에서 본 발명의 목적에 적합한 프로모터 활성을 갖는 일부 서열이다. 본 발명에서 사용하는 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 프로모터는 종래의 동물세포 발현용 프로모터보다 상대적으로 낮은 프로모터 활성을 나타내며, 이에 이 프로모터에 작동적으로 연결된 dhfr 유전자의 발현율이 감소되고, 훨씬 적은 양의 MTX 농도 하에서도, dhfr 유전자를 포함하는 벡터가 세포 내에서 많이 증폭된 세포가 선택된다. 결국, 벡터의 증폭이 이루어지며, 동시에 목적으로 하는 외래 유전자의 발현율도 증가하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 프로모터 서열은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 구성되어 있다.

본 발명의 제조합 발현벡터에서 DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결(operatively linked)된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명에서 이용되는 DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 인간 유래 DHFR 유전자이고, 가장 바람직하게는 GenBank 접근번호 NM_000791에 개시된 인간 DHFR 유전자의 CDS(coding sequence, 493번째 서열부터 1056번째 서열까지) 서열이 본 발명에서 DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열로 이용될 수 있다.

본 발명이 재조합 발현벡터는 dhfr^- 동물세포에 이용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 동물 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 또는 포유동물세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물세포이고, 보다 더 바람직하게는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주 , W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주 또는 BHK(Baby Hamster Kidney) 세포주이고, 가장 바람직하게는 CHO 세포주를 의미한다. DHFR이 결핍된 CHO 세포는 안전성과 효용성이 검증되어 FDA로부터 승인 받아 의약용 재조합 단백질의 생산에 널리 사용되고 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현벡터는 외래 유전자 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함한다.

본 발명에서 발현하고자 하는 목적의 단백질을 코딩하는 외래 유전자는 어떠한 유전자 서열도 포함한다. 예를 들어, 상기 외래 유전자는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 또는 백신 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 벡터에 의해 증폭 및 발현되는 외래 유전자는 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, BMP(bone morphogenetic protein), TGF(transforming growht factor), 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs(granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs(epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), TNFR(tumor necrosis factor receptor), IDS(iduronate-2-sulfatase), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레 린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 외래 유전자 뉴클레오타이드 서열의 업스트림에 진핵세포에서 작동 가능한 프로모터 서열이 결합되어 있다. 상기 외래 유전자를 발현시키기 위한 진핵세포에서 작동 가능한 프로모터 서열은, 사이토메갈로 바이러스의 즉시 초기형 프로모터, SV40의 프로모터(SV 40 후기형 프로모터 및 SV 40 초기형 프로모터), HSV(herpes simplex virus)의 tk 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기형 프로모터(Adeno 2 major late promoter P_Adml), 아데노바이러스 2 초기형 프로모터(P_AdE2), AAV (human parvo virus-associated virus)의 p19 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 마우스의 메탈로티오네인 프로모터 (metallothionein), MT 프로모터, MMTV LTR 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, β-액틴 프로모터, EF1 알파 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 그리고 인간 헤로글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 발현벡터에는 전사 종결 서열로서, 폴리 아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res . 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol . Cell Biol . 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res . 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol . Cell . Biol . 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol . Cell . Biol . 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 발현벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신(G418), 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 외래 단백질을 대량으로 생산하기 위한 동물세포용 발현벡터는 도 3a에 도시된 유전자 지도를 갖는 벡터이고, 가장 바람직하게는 pJK-dhfr-1(KCTC 11299BP) 또는 pJK-dhfr-2(KCTC 11300BP)이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 dhfr^- 동물세포용 벡터에 의해 형질전환된 dhfr^- 동물 세포주를 제공한다.

본 발명에 있어서, dhfr^- 동물세포를 발현벡터로 형질전환하는 방법은 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질전환법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 외래 단백질을 대량으로 생산하기 위한 본 발명의 세포주를 다이하이드로폴레이트 환원효소의 저해제의 첨가 하에서 배양하는 단계; 및 (b) 배양물에서 외래 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 제조방법를 제공한다.

상기 DHFR의 저해제는 예를 들어, 아미노프테린(aminopterin) 및 메토트렉세 이트 (MTX) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 메토트렉세이트이다.

유전자 증폭에 이용되는 MTX는 고가이기 때문에, 시험관 수준으로 실시되는 실험실에서의 실험에서는 중요한 고려 요소가 되지 않지만, 대용량 수준으로 실시되는 경우에는 중요한 고려 요소가 된다. 또한, 예컨대 1 μM 농도까지 단계별로 세포를 적응시키기 위해서는 6 개월 이상의 오랜 기간이 소요되며, MTX의 고농도 배양으로 세포 성장이 저하되는 부작용이 있다.

이에, 당업계에서는 유전자 증폭을 위해 첨가되는 MTX의 농도를 감소시킬 수 있는 방안을 계속적으로 연구하고 있다. 한편, 통상적으로 당업계에서는 유전자 증폭을 위하여 MTX 0.05-5 mM 정도가 이용되고 있다. 본 발명의 제조방법에 이용되는 세포주는 저농도의 MTX에서도 유전자 증폭이 잘 이루어지도록 형질전환 된 것이다. 본 발명에 첨가되는 메토트렉세이트의 농도는 0.001-10 μM이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.003-1 μM이며, 가장 바람직하게는 0.005-0.32 μM이다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 배양하는 단계는 본 발명에서 통상적으로 이용되는 배지에서 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc. Exp . Bio . Med ., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

상기 배양 단계에서, 숙주 세포 내에 발현된 외래 단백질이 배지로 분비 되고, 이렇게 분비된 외래 단백질을 정제하면, 목적의 단백질을 다량으로 얻게 된다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 프로모터 활성이 감소된 DHFR 프로모터를 포함하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 벡터는 기존 동물세포 발현 벡터와 비교하여 훨씬 적은 메토트렉세이트 농도 하에서도 효과적으로 DHFR 유전자와 함께 외래 유전자가 증폭된 세포주 클론을 선별할 수 있도록 한다.

(ⅲ) 본 발명에 따르면, 감소된 농도의 메토드렉세이트의 사용에 따른 비용절감 효과가 있고 세포주의 성장속도 및 생산성 측면에서 우수한 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 마우스 유래 DHFR 프로모터, SV40 바이러스의 초기 프로모터, SV40 바이러스의 초기 프로모터와 인핸서의 클로닝

DHFR 프로모터에 대한 중합효소연쇄반응(PCR)은 다음과 같은 방법으로 수행 하였다.

먼저 마우스 DHFR 유전자의 5’부분에 속한 서열 중에서 강력한 TATA 서열을 포함하고 있는 기본 프로모터 활성을 갖는 DHFR 프로모터의 부위를 확보하기 위하여 지놈 DNA 분리 키트(Intron, 대한민국)를 사용하여 마우스의 지놈 핵산(genomic DNA)을 분리하였다. 분리된 마우스 핵산 200 ng을 50 pmol P1과 P2 프라이머, 0.5 mM dNTP 및 SoftMax DNA 중합효소(Intron, 대한민국)를 첨가하고, 95℃에서 1분, 55℃에서 40초 및 72℃에서 40초를 1 사이클(Cycle)로 29회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 중합효소연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction시켜 마우스 유래 DHFR 프로모터를 얻었다.

SV40 바이러스의 초기 프로모터와 프로모터/인핸서(프로모터와 작동적으로 연결된 인핸서) DNA 단편은 10 ng의 pcDNA3(Invitrogen, 미국) 벡터를 주형으로 하여 P3, P4와 P3, P5 각각의 프라이머를 사용하여 상기 마우스 유래 DHFR 프로모터를 얻는 동일한 PCR 방법(온도, 시간 및 사이클)을 이용하여 합성하였다. 각각의 프라이머의 염기 서열과 PCR을 통해 얻어진 DNA 절편의 크기는 하기 표 1과 같다.

프라이머	염기서열	DNA 절편 크기
P1	5'-TCGAAGCTTGATGGCAGCGGGGATAA-3'	118 bp
P2	5'-GGGCTCGAGTAAGCATTGGGGGGGGG-3'
P3	5'-GATAAGCTTCGAAAAAGGATATACAA-3'	243 bp
P4	5'-CAACTCGAGCATCTCAATTAGTCAGC-3'
P3	5'-GATAAGCTTCGAAAAAGGATATACAA-3'	340 bp
P5	5'-CCACTCGAGCCAGGCAGGCAGAAGTA-3'
P6	5'-CCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAAC-3'	1462 bp
P7	5'-GGGGGATCCGACATGATAAGATACAT-3'
P8	5'-GGGGGATTCACTAGAGCATTGGGGGGGGGGACAGCTCAGGGCTGC-3'	165 bp
P9	5'-CCAATCCCCATATTTTGGGACACGGC-3'
P8	5'-GGGGGATCCACTAGAGCATTGGGGGGGGGGACAGCTCAGGGCTGC-3'	1605 bp
P7	5'-GGGGGATCCGACATGATAAGATACAT-3'
P10	5'-GGGGGATCCACAGCTCAGGCTGCGAT-3'	1583 bp
P7	5'-GGGGGATCCGACATGATAAGATACAT-3'
P11	5'-TGCATCTAGATATTCTATAGTGTCAC-3'	316 bp
P12	5'-CCCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAA-3'

각각의 PCR를 통해 얻은 DNA 절편은 HindIII와 XhoI 효소를 처리한 다음 진클린 III 터보키트(Bio 101, 미국)로 정제하여 상기 동일한 효소로 절단된 pGL2-Basic 벡터(Promega, 미국)에 서브클로닝하여 pGL2-DHFR , pGL2-SV40 프로모터 및 pGL2-SV40 프로모터/인핸서 벡터를 각각 제조하였다. pGL2-Basic 벡터는 루시페라아제 유전자가 포함되어 있는 벡터이다.

실시예 2: pGL2 - DHFR , SV40 프로모터, SV40 프로모터 및 인핸서에 의해 전사가 조절되는 루시페라아제 유전자의 발현 측정을 통한 프로모터 성능 비교실험

1) 유전자 도입

COS7 세포(ATCC, 미국)를 소 태아 혈청이 10% 첨가된 DMEM 배양배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; GIBCO BRL, 미국)에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 계대 배양하였다. 상기 세포를 100 ㎜ 배양접시에 1 x 10⁶ cells/㎖ 농도로 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 후 OPTI-MEM I(osteogenic media I; GIBCO BRL, 미국) 용액으로 3회 세척하였다. 한편, 상기에서 제조한 벡터 pGL2-Basic, pGL2-DHFR, pGL2-SV40P(Promoter) 및 pGL2-SV40 P/E(Promoter/Enhancer)를 각각 5 ㎍씩 취하여 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였고, 25 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine, GIBCO BRL사, 미국)도 동일하게 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였다. 상기 발현 벡터와 리포펙타민 희석액을 15 ㎖ 튜브에 혼합하여 DNA-리포펙타민 혼합물을 제조한 후 이를 15분 이상 실온에서 방치하였다. 상기 각각의 DNA-리포펙타민 혼합물에 5 ㎖의 OPTI-MEM I를 첨가하였고 이를 깨끗이 세척된 COS7 세포에 균일하게 혼합한 후 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 48시간 동안 배양하였다.

2) 루시페라아제 발현량 비교 측정

각각의 벡터에 삽입된 프로모터의 활성을 비교하기 위하여 각 벡터에 의해 발현되는 루시페라아제 양을 측정하였다. 유전자가 도입된 후 48시간 동안 배양한 세포를 5 ㎖ PBS로 씻어낸 후 다시 1 ㎖ PBS를 넣고 스크레퍼를 이용하여 세포들을 수거하였다. 수거된 세포를 4000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 제거하였다. 세포를 용해시키기 위하여 상등액 제거 후 250 mM Tris (pH 7.8)/1 mM DTT(Dithiothreitol) 용액을 50 ㎕ 첨가한 뒤, 액체 질소에 1분간 담근 후 다시 37℃에서 1분간 방치하는 과정을 3회 반복하였다. 그 다음 13000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하고 세포가 제거된 상등액만을 취하여 -20℃에 보관하였다.

루시페라아제 측정을 위해 12 x 75 mm 5 ㎖ 튜브에 A용액(25 mM glycylglycine(pH 7.8), 0.2 M ATP, 1 M MgSO₄, H₂O)을 350 ㎕씩 분주 한 후 B용액 (25 mM glycylglycine(pH 7.8), D-루시페린(5 mg/16.5 ㎖ H₂O))을 100 ㎕ 첨가 하여 발광측정기에 삽입하였다. 루시페라아제 측정 전에 A용액에 측정액을 40 ㎕를 넣고 25℃에서 30초간 루시페라아제 활성을 측정하였다. 그 결과, 새로이 선택된 DHFR의 기본 프로모터의 활성은 의도한 대로 기존의 SV40 프로모터나 프로모터 및 인핸서가 같이 들어간 프로모터들의 활성에 비해 2,300배 및 3,800배 정도로 현저히 낮은 활성을 보임을 확인할 수 있었다(표 2 및 도 2).

사용 벡터	루시퍼라아제 활성도
Cell only	1,412
pGL2-Basic	2,457
pGL2-DHFR 프로모터	6,346
pGL2-SV40 프로모터	14,713,514
pGL2-SV40 프로모터/인핸서	24,355,978

실시예 3: pJK - DHFR -1 벡터의 제조

DHFR 유전자를 클로닝 하기 위하여 인간 혈액에서 지놈 DNA 분리 키트 (Intron, 대한민국)를 사용하여 인간 지놈 핵산(genomic DNA)을 분리하였다. 순수 분리한 인간 지놈 DNA을 주형으로 하여 PCR 과정을 거쳐 부분 DHFR 유전자를 합성하였다.

PCR 합성은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저 DHFR 유전자의 경우 분리한 인간 지놈 핵산 200 ng을 주형으로 사용하고 P6 및 P7 프라이머를 각각 50 pmol을 사용하고 0.5 mM dNTP 및 SoftMax DNA 중합효소(Intron, 대한민국)를 첨가하여 95℃에서 1분, 55℃에서 40초 및 72℃에서 40초를 1 사이클(cycle)로하여 29회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시킨 후 PCR을 수행하여 1462 bp의 DHFR 유전자를 합성하였다. 마우스 DHFR 기본 프로모터는 pGL2-DHFR을 주형으로 하여 P8 및 P9 프라이머로 상기 동일한 PCR 방법(온도, 시간 및 사이클)을 이용하여 DHFR 프로모터 부위를 합성하였다.

합성된 DHFR 기본 프로모터 3’과 DHFR 유전자 5’부위는 서로 공통적인 19 bp 염기서열 부위를 가지고 있으며, 상기 공통적인 부위를 P8 및 P7 프라이머로 PCR을 수행하여 기본 프로모터와 DHFR유전자가 연결된 1605 bp의 DNA 절편을 합성하였다. 각각의 프라이머의 염기 서열과 PCR을 통해 얻어진 DNA 절편의 크기는 상기 표 1과 같다.

PCR를 통해 얻어진 프로모터와 DHFR 유전자 DNA 절편을 BamHI 효소를 사용하여 절단하고 pMS 벡터(에이프로젠, 대한민국)를 BglII 효소로 개환하여 DHFR 프로모터와 유전자를 삽입하여 pJK-DHFR-1 벡터를 제조하였다(도 3a 및 3b). pJK-DHFR-1 벡터는 2008년 3월 11일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11299BP).

실시예 4: pJK - DHFR -2 벡터의 제조

pJK-DHFR-1 벡터의 DHFR 프로모터를 좀 더 짧게 만들어 pJK-DHFR-2 벡터를 제조하였다. PCR 합성은 실시예3과 같은 방법으로 수행하였다. pJK-DHFR-1 벡터를 주형으로 하여 P10 및 P7 프라이머로 PCR 방법을 사용하여 DHFR 프로모터 및 DHFR 유전자를 합성하였으며, 프라이머의 염기 서열과 PCR을 통해 얻어진 DNA 절편의 크기는 상기 표 1과 같다.

PCR를 통해 얻어진 프로모터와 DHFR 유전자 절편을 BamHI 효소를 사용하여 절단하고 pJK-DHFR-1 벡터를 BglII 효소로 개환하여 DHFR 프로모터와 유전자를 삽입하여 pJK-DHFR-2 벡터를 제조하였다(도 4). pJK-DHFR-2 벡터는 2008년 3월 11일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 11300BP).

실시예 5: pJK - DHFR - Or2 벡터의 제조

pJK-DHFR-1과 비교하여 DHFR 유전자가 역방향으로 삽입된 벡터인 pJK-DHFR-Or2 를 제작하는 방법은 다음과 같다. 위의 실시예3에서와 같이 PCR을 통해 DHFR 프로모터와 유전자를 합성하여 pJK- DHFR-1 벡터를 BglII로 개화하고 합성한 프로모터와 유전자를 BamHI으로 처리하여 삽입한 다음, pJK-DHFR-1과 비교하여 DHFR 유전자가 역방향으로 삽입된 벡터를 스크리닝하여, pJK-DHFR-Or2를 제작하였다(도 5).

실시예 6: pJKIg 벡터 및 pJKIg 벡터를 이용한 재조합 항체 벡터제조

pJK-DHFR-1 벡터를 활용하여 다음과 같이 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 클로닝하기 위한 벡터인 pJKIg 벡터를 제조하였다.

우선, pJK-DHFR-1 벡터의 HindⅢ-BamHI 단편을 제거하고 클레나우(Klenow) 효소(Roche, 스위스)를 처리하여 연결시키고, 다시 XhoI-ApaI 단편을 제거하고 다시 연결하였으며 BsmI 효소로 벡터를 클레나우 효소를 처리하여 개환하여 준비 하였다.

또 다른 pJK-DHFR-1 벡터의 다수 클로닝 부위의 BamHI-XhoI 범위를 제거하고 클레나우 효소와 리가아제(ligase)를 처리하여 자가 연결하였다. 다수 클로닝 부위에 있는 ApaI 부위를 제거하기 위하여 XbaI 및 PvuII 제한효소로 절단한 뒤 프라이머 P11 및 P12로 PCR을 통하여 XbaI-PvuII 범위의 316 bp 단편을 만든 뒤 재삽입하였다. XbaI-PvuII 단편이 삽입된 pJK-DHFR-1 벡터를 NruI-PvuII 효소로 절단하여 1075 bp의 단편을 만들고, 이 단편을 상기 제한 효소 BsmI으로 개환된 벡터에 삽입하여 pJKIg 벡터를 제작하였다(도 6a). pJKIg 벡터에 RSV(respiratory syncytial virus) 항체의 중쇄 및 경쇄가 삽입된 pJKIg-RSV HK 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 RSV에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 및 불변 영역이 pGEM T 벡터(Promega, 미국)에 삽입된 pGEM T/RSV HvHc 벡터의 면역글로불린 중쇄의 가변 및 불변 영역을 EcoRⅠ-NotI 효소로 절단한 후에 pJKIg 벡터를 동일한 효소로 절단하여 삽입하였다. 상기 동일한 방법으로 pGEM T/RSV KvKc 벡터의 면역글로불린 경쇄의 가변 및 불변 영역을 HindIII-XbaI 효소로 절단한 후에 pJKIg 벡터에 삽입하여 pJKIg-RSV HK 벡터를 제작 하였다(도 6b).

실시예 7: pJK - DHFR 및 pJKIg 벡터의 유용성을 확인하기 위한 재조합 단백질 및 항체 생산 세포주 확립실험

pJK-DHFR 벡터를 사용하기 위해, pJK-DHFR-1과 pJK-DHFR-Or2 벡터를 각기 EcoRI 및 XbaI 제한효소로 처리하여 사람유래 TNF-R(tumor necrosis factor-receptor) 및 IDS(iduronate-2-sulfatase) 효소를 암호화하는 cDNA를 삽입하였다. pJKIg-GS051 H/K 벡터는 상기 pJKIg-RSV HK 벡터의 중쇄 영역을 EcoRI 및 ApaI 제한 효소로 절단한 뒤 GS051 항체의 중쇄 영역을 암호화 하는 cDNA를 삽입하고, 경쇄 영역을 HindIII 및 BsiWI 제한효소로 절단한 뒤 GS051 항체의 경쇄 영역을 암호화하는 cDNA를 삽입하여 제조하였다. 또한 위와 같은 방법으로 GS071 항체를 발현하는 pJKIg-GS071 H/K 벡터를 제조하였다.

상기와 같이 제조된 목적단백질 발현 또는 항체 발현 벡터들을 DHFR 유전자 기능이 결여되어 있는 CHO DG44(콜롬비아 대학교, 미국) 세포에 각각 형질도입하고 항생제 G418(Gibco BRL, 미국)을 사용하여 일차적으로 세포주를 선별하였다. 선별된 세포주 배지내 MTX 농도를 20, 80, 320 및 1000 nM 로 점차적으로 증가시키면서 클론별 목적단백질 또는 항체 발현양에 따라 고발현 세포주를 선별하였다. 이 때 발현양은 각각 선별된 세포주를 6-웰 플레이트에 5 x 10⁵ 세포를 넣고 3일간 배양한 후 배지를 회수하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법에 의하여 측정하였다. 표준품은 각각을 정제하여 농도를 이미 알고 있는 단백질을 사용하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 80 nM MTX 농도에서 고발현세포주를 선별하였으며, 도 9에서는 320 nM 및 1 uM MTX 농도에서 고발현세포주를 선별하였다. 그러나 1 uM MTX 농도에서 선별된 세포주는 성장성이 않좋은 것을 확인 하였으며, 도 11에서는 20 nM 과 80 nM에서 MTX에서 증폭하여 선별된 3-5-6 clone을 다시 서브클로닝을 통하여 고발현세포주를 선별하였다. 이와 같이 기존에 목적단백질 및 항체 발현을 위하여 사용해왔던 MTX 농도와는 달리 약한 DHFR 프로모터와 유전자를 이용하여 0.005-0.32 μM의 적은 농도에서도 고발현된 목적단백질 및 항체를 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a-1b는 본 발명에서 사용한 DHFR 기본 프로모터의 서열 A 및 B이다.

도 2는 본 발명에서 루시페라아제 발현양 비교를 통한 프로모터 성능 실험 결과이다.

도 3a는 본 발명의 동물세포용 재조합 발현벡터의 모식적인 유전자 지도이고, 도 3b는 본 발명의 동물세포용 재조합 발현벡터의 구체적인 일 실시예인 pJK-DHFR-1의 유전자이다. 도 3c는 본 발명의 동물세포용 재조합 발현벡터를 구축하기 위하여 사용되는 pMS 발현벡터의 유전자 지도이다. 도 3a에서, DHFR: 인간유래 DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열; dhfr Promoter: 서열번호 제1서열 또는 제2서열의 마우스 유래

도 4는 본 발명의 pJK-DHFR-2 발현벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.

도 5는 본 발명의 pJK-DHFR-Or2 발현벡터의 구조를 나타낸 도식도이다.

도 6a-6b는 본 발명의 pJKIg 및 pJKIg-RSV HK 발현벡터의 구조를 나타낸 도식도이다.

도 7은 pJK-DHFR-1 벡터를 이용하여 제작한 인간 TNFR 발현 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

도 8은 pJK-DHFR-Or2 벡터를 이용하여 제작한 사람의 IDS 발현 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

도 9는 pJKIg 벡터를 이용하여 제작한 RSV 항체 발현 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

도 10은 pJKIg 벡터를 이용하여 제작한 GS051 항체 발현 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

도 11-a 는 pJKIg 벡터를 이용하여 제작한 GS071 항체 발현 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

도 11-b 는 GS071 항체 발현 세포주의 20 nM MTX 로 증폭한 후 다시 서브클로닝하여 얻은 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

도 11-c 는 GS071 항체 발현 세포주의 80 nM MTX 로 증폭한 후 다시 서브클로닝하여 얻은 세포주의 발현역가를 ELISA에 의하여 분석한 결과이다.

<110> Genexel-Sein, Inc. <120> Recombinant Expression Vector for Animal Cells <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 145 <212> DNA <213> Mouse <400> 1 actagagcat tggggggggg gacagctcag ggctgcgatt tcgcgccaaa cttgacggca 60 atcctagcgt gaaggctggt aggattttat ccccgctgcc atcatggttc gaccattgaa 120 ctgcatcgtc gccgtgtccc aaaat 145 <210> 2 <211> 124 <212> DNA <213> Mouse <400> 2 acagctcagg gctgcgattt cgcgccaaac ttgacggcaa tcctagcgtg aaggctggta 60 ggattttatc cccgctgcca tcatggttcg accattgaac tgcatcgtcg ccgtgtccca 120 aaat 124

Claims (10)

1. (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다이하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase: DHFR) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 DHFR 프로모터는 마우스 유래이고, DHFR-코딩 뉴클레오타이드 서열은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포인 것을 특징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 외래 유전자 뉴클레오타이드 서열을 추 가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 동물세포에서 발현시키고자 하는 외래 유전자 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하고, 상기 외래 유전자 뉴클레오타이드 서열의 업스트림에 진핵세포에서 작동가능한 프로모터 서열이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 3a의 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 발현벡터는 KCTC 11299BP로 기탁된 벡터인 것을 특징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 발현벡터는 KCTC 11300BP로 기탁된 벡터인 것을 특 징으로 하는 dhfr^- 동물세포용 재조합 발현벡터.
9. 상기 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 항의 벡터에 의해 형질전환된 동물세포.
10. 다음 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법:

    (a) 상기 제 9 항의 동물세포를 메토트렉세이트의 첨가 하에서 배양하는 단계; 및

    (b) 상기 단계 (a)의 배양 결과물에서 목적단백질을 정제하는 단계.

Images