KR100502701B1 - 사이클린 ｄ1 과발현에 의해 매개되는, 진핵 세포에서의목적 단백질의 과발현 - Google Patents
사이클린 ｄ1 과발현에 의해 매개되는, 진핵 세포에서의목적 단백질의 과발현 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100502701B1 KR100502701B1 KR10-2001-7001843A KR20017001843A KR100502701B1 KR 100502701 B1 KR100502701 B1 KR 100502701B1 KR 20017001843 A KR20017001843 A KR 20017001843A KR 100502701 B1 KR100502701 B1 KR 100502701B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cyclin
- cell
- cells
- protein
- delete delete
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 title description 17
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 title description 17
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 152
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 72
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 claims description 22
- 102000006311 Cyclin D1 Human genes 0.000 claims description 21
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 claims description 21
- 101000980756 Homo sapiens G1/S-specific cyclin-D1 Proteins 0.000 claims description 14
- 102000047723 human CCND1 Human genes 0.000 claims description 13
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 2
- 101001072338 Homo sapiens Proliferating cell nuclear antigen Proteins 0.000 claims 2
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 14
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 abstract 2
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 abstract 2
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- -1 OPG-Fc Chemical compound 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 101000798130 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Proteins 0.000 description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 23
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 16
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 15
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 15
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 12
- ADXLZWYVJHRTST-BIWMIDHDSA-N (1r,2r,3s,4r,5s,6s)-2-amino-6-(hydroxymethyl)-7-oxabicyclo[4.1.0]heptane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](N)[C@H]2O[C@]21CO ADXLZWYVJHRTST-BIWMIDHDSA-N 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 108010019673 Darbepoetin alfa Proteins 0.000 description 10
- 102100032610 Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Human genes 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 6
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 6
- 210000004128 D cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 6
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 5
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108090000257 Cyclin E Proteins 0.000 description 2
- 102000003909 Cyclin E Human genes 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000052781 human TNFRSF11B Human genes 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000013698 Cyclin-Dependent Kinase 6 Human genes 0.000 description 1
- 108010025468 Cyclin-Dependent Kinase 6 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 101001063991 Homo sapiens Leptin Proteins 0.000 description 1
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000002299 affinity electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000023359 cell cycle switching, meiotic to mitotic cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000049953 human LEP Human genes 0.000 description 1
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 (a) 사이클린 D 유전자 산물을 코드하는 삽입 핵산 및 (b) 목적 단백질을 코드하는 삽입 핵산을 포함하는 단백질 발현에 유용한 진핵세포에 관한 것으로, 상기 사이클린 D 유전자 산물과 목적 단백질은 세포에서 발현된다. 또한 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다 : (a) 사이클린 D 유전자 산물 및 목적 단백질을 코드하는 각각의 핵산을 진핵 세포 내로 삽입하고 ; (b) 목적 단백질이 발현될 수 있는 조건하에서 세포를 배양한 다음 ; (c) 목적 단백질을 분리한다. 이 세포는 포유동물 세포가 바람직하며, 그 중에서도 CHO 세포가 가장 바람직하다. 인체 기원의 사이클린 D 유전자 산물 또한 바람직하다. 적당한 목적 단백질은 에리트로포이에틴(EPO), 오스테오프로테게린(OPG), OPG-Fc, 렙틴, Fc-렙틴 및 신규한 조혈 자극 단백질(NESP)을 포함한다.
Description
포유동물 세포 주기가 진행됨으로써 사이클린-의존성 키나아제(CDK)가 활성화된다. 활성 CDK 는 촉매성 아단위와 사이클린이라는 조절성 아단위로 이루어진다. CDK 활성은 사이클린과 CDK 저해제(CKI)의 상호작용 및 번역후 변이(예를들어, 인산화)에 의해 조절된다.
각 세포 주기 단계 간의 천이는 정해진 시기에 서로 다른 사이클린 아단위에 의해 조절된다 : G1/S 기의 천이는 G1 사이클린이 조절하고, S 기로의 진행은 S 사이클린이 조절하며 유사분열기로의 진입은 G2 또는 유사분열 사이클린이 조절한다. S 기로 진입하는 세포의 개시는 G1 후기에 제한점(R)에서 일어나며, 그 후에는 세포가 분열하는데 있어서 더 이상 유사분열촉진 성장 인자를 필요로 하지 않는다.
사이클린 D 및 E 는 G1 기에 순서대로 합성되며 S 기 진입을 위해 그것의 합성 비율이 제한되므로, G1 사이클린으로 간주된다. 적어도 세 개의 포유동물 유전자는 D-형 사이클린(D1, D2 및 D3)을 코드한다. D-형 사이클린은 유사분열촉진 자극에 대한 지연성 초기 반응의 일부로서 점차적으로 증가하며, 세포계-특이 방식으로 발현된다. CDK4 및 CDK6 과 D-형 사이클린의 결합은 마이토젠에 의해 번역후에 조절된다. 일단 결합된 후에는, 사이클린 D-결합 CDK 가 촉매 활성을 얻기 위해 CDK-활성 키나아제(CAK)에 의해 인산화되어야 한다.
사이클린 D 의 유전자는 A- B- 또는 E-형 사이클린과는 진화론적으로 상이하며 D-형 사이클린은 다른 사이클린과는 다른 특성들을 갖는데, 그 특성 중 하나는 그것이 수명이 짧은 단백질이라는 것이다(t1/2 < 25 분). G1 기에 성장 인자들이 철수함으로써 사이클린 D 의 지속적인 축적이 중단되며, 성장 인자-유래 세포가 R 점을 지나 더 이상은 진행되지 못하게 된다. 따라서, 사이클린 D 의 발현은 사이클린 A, B 및 E 의 주기적인 발현과는 달리 세포외 신호에 의해 조절된다.
설치류나 인체 섬유아세포에서의 인체 사이클린 D1 및 E 의 과발현은 G1 기를 줄이고 세포 크기를 감소시키며 G1 기에서 S 기로의 천이에 필요한 혈청 양을 감소시킨다[Resnitzky 등의, MCB 14, 1669 - 79 (1994) ; Quelle 등의, Genes & Development 7, 1559 - 71 (1993) ; Ohtsubo & Roberts, Science 259, 1908 - 12 (1992) 참조]. 이러한 결과는 사이클린 D 가 사이클린 E 에 의해 생리학적으로 조절되는 기능을 무력하게 할 수 있음을 시사하는 것으로, 그 역이 성립될 수도 있다. 그러나, 사이클린 D 또는 E 의 과발현으로 인해 섬유아세포가 형질전환되는 것은 아니며, 세포는 여전히 혈청 의존성이고 접촉저지성이며 반고체 배지에서 콜로니를 형성하지 못한다. 또한 사이클린 D1 이 과발현됨으로써 내인성 유전자의 증폭이 증가되는 것으로 나타났는데, 이것은 이러한 과발현이 종양 발달 중에 게놈 불안정성에 영향을 미침을 시사하는 것이다[Zhou 등의, Cancer Res. 56 : 36 - 9 (1996) 참조].
발명의 요약
본 발명은 다음을 포함하는 진핵 세포에 관한 것이다 :
(a) 세포에서 천연 발현량보다 많은 양으로 기능상 발현되는 사이클린 D 유전자 산물 ; 및
(b) 세포에서 천연 발현량보다 많이 발현되는 목적 단백질.
또한 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다 :
A. 다음을 발현시키는 진핵 세포를 생산하고
1. 천연 발현량보다 많이 발현되는 사이클린 D 유전자 산물 및
2. 천연 발현량보다 많이 발현되는 목적 단백질 ;
B. 목적 단백질의 발현과 사이클린 D 유전자 산물의 기능상 발현을 가능하게 하는 조건하에서 세포를 배양하며 ;
C. 목적 단백질을 분리한다.
본 발명의 세포는 포유동물 세포가 바람직하며, 그 중에서도 CHO 세포가 가장 바람직하다. 사이클린 D 유전자 산물은 포유동물에서 유래된 것이 바람직하며, 그 중에서도 인체 기원이 가장 바람직하다. 사이클린 D 유전자나 목적 단백질을 코드하는 유전자(또는 둘 다)는 세포내 발현 벡터(들)에 포함되거나 세포 게놈에 통합될 것이다.
다수의 목적 단백질이 본 발명에 사용될 수 있다. 특히, EPO, OPG, 렙틴 및 NESP 와 그 유도체들을 사용할 수 있다.
도 1 은 pcDNA3.1/사이클린 D1 으로 형질감염시킨 다음 인체 사이클린 D1-특이 항체(재료 및 방법 항목 참조)로 처리한 AM-1 세포 용균액에 대한 웨스턴 블롯팅을 나타낸 것이다. 이러한 블롯팅으로 AM-1/D 세포내에서 인체 사이클린 D1 이 발현됨이 확인된다.
도 2A, 2B, 2C 및 2D 는 요오드화 프로피듐으로 염색하여 FACScan (벡톤 디킨슨에서 입수 ; 재료 및 방법 항목 참조)으로 분석한 AM-1/D 및 AM-1 세포주의 비동기 세포수(y 축) 및 상대적인 DNA 함량(x 축)을 나타내는 히스토그램이다. 이 도면은 AM-1/D 세포의 S 기에 상당히 많은 세포들이 존재함을 보여준다.
도 3 은 다양한 농도에서 OPG-Fc 를 발현시키는 클론의 수를 나타내는 그래프이다. 하기 실시예 1 에 기술한 플라스미드 pDSRα2/OPG-Fc 로 AM-1/D 세포를 형질감염시켰다. 이 그래프로, 가장 많이 발현시키는 클론이 AM-1/D 세포로부터 유도한 것임을 알 수 있다.
도 4 는 증폭에 사용하는 MTX 의 농도에 대한 EPO 의 발현을 도식화한 그래프이다. 하기 실시예 2 에 기술한 플라스미드 pDSRα2/hEPO 로 AM-1/D 세포를 형질감염시켰다. 2 개의 클론에서 MTX 농도가 증가하였음에도 불구하고 EPO 생산량이 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 유전자 증폭이 성공적으로 이루어졌음을 입증하는 것이다.
도 5 는 AM-1 CHO 세포 또는 AM-1/사이클린 D CHO 세포에서 유도한 46 개 클론 각각에서의 OPG(22 - 194)-cys-Fc 발현량을 비교한 것이다. AM-1/사이클린 D CHO 세포주로부터 유도한 클론의 OPG(22 - 194)-cys-Fc 발현량이 AM-1 CHO 세포에서 유도한 클론의 발현량보다 상당히 많은 것으로 나타나 있다.
도 6 은 웨스턴 블롯팅으로 미리 측정하여 가장 많이 발현되는 클론 중 24 개의 OPG(22 - 201)-Fc 발현을 비교한 것이다. 각 경우에서 AM-1/사이클린 D CHO 세포주에서 유도한 클론의 OPG(22 - 201)-Fc 발현량이 CHO(SF) 세포에서 유도한 클론의 발현량보다 상당히 많은 것으로 나타나 있다.
도 7 은 각각의 CHO 모세포주에서 유도한 클론 중 가장 우수한 14 개 클론에서의 평균 NESP 발현량을 EIA 에 의해 측정한 것이다. 24 웰 평판으로부터 2 일간 조정 배지 시료를 수집한 후, 시료를 웨스턴 블롯팅하여 예비 스크린하였다.
도 8A 및 8B 는 스피너 배양액 및 생물반응기 배양액로부터 분비된 NESP 단백질의 이소화합물 분포와 비교하여 스피너 수확물 및 생물반응기 수확물에 대한 IEF 웨스턴 블롯팅을 나타낸 것이다. 스피너 수확물은 증폭되지 않은 클론으로부터 수확한다. 롤러병 조정 배지로부터 정제된 표준 NESP 단백질은 바람직하게 고 분자량의 이소화합물을 나타낸다. 조정 배지 수확물은 모든 이소화합물을 함유한다. 이 블롯팅으로 모든 시료내에 이소화합물이 고 농도로 존재함을 알 수 있다.
아래와 같은 용어의 정의는 실례를 들어 특별히 한정하지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 적용된다.
핵산의 "삽입" 은 외부적인 방법(예, 형질감염)에 의해 핵산을 세포 또는 유기체 내로 도입함을 의미한다. 삽입된 핵산은 외부 서열 또는 세포 게놈내에 이미 존재하는 서열을 가질 것이다. 후자의 경우에 삽입된 핵산은 삽입되는 핵산에 의해 코드되는 단백질의 발현을 더 많이 또는 차등적으로 조절할 수 있다.
용어 "EPO-관련 단백질" 은 에리트로포이에틴 및 DNA 재조합과 그외의 방법에 의해 제조되는 유도체와 유사체를 말한다. 이러한 유도체는 그것의 말단이 절두되거나 내부 아미노산이 삭제되고(예를들어, 결합된 DNA 의 제한 및 재결합), 아미노산이 치환되는 등의 변이를 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 유도체는 또한 융합 단백질(예를들어, Fc 부위와의 융합)도 포함한다. 에리트로포이에틴 유도체의 예는 국제 특허 출원 제 WO 91/05867 호, 제 WO 94/09257 호, 제 WO 88/03808 호 및 제 WO 86/07594 호에 기술되어 있으며, 각각의 상기 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용되었다.
용어 "렙틴-관련 단백질" 은 렙틴, 바람직하게 인체 렙틴 및 DNA 재조합과 그외의 방법에 의해 제조되는 그것의 유도체를 말한다. 이러한 유도체는 그것의 말단이 절두되거나 내부 아미노산이 삭제되고, 아미노산이 치환되는 등의 변이를 갖는 단백질을 포함한다. 여기에는 렙틴과 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질과 같은 렙틴 함유 융합 단백질도 포함된다. 적합한 렙틴 유도체는 특허 출원 제 WO 96/40912 호(1996년 12월 19일에 제출), 제 WO 96/05309 호(1996년 2월 22일에 제출), 제 WO 97/06816 호(1997년 2월 27일에 제출) 및 제 WO 97/18833 호(1997년 5월 29일에 제출)에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
용어 "OPG-관련 단백질" 은 OPG 및 DNA 재조합과 그외의 방법에 의해 제조되는 그것의 유도체를 말한다. 이러한 유도체는 그것의 말단이 절두되거나 내부 아미노산이 삭제되고(예를들어, 결합된 DNA 의 제한 및 재결합), 아미노산이 치환되는 등의 변이를 갖는 단백질을 포함한다. 또한 이러한 유도체는 융합 단백질(예를들어, Fc 부위와의 융합)도 포함한다. OPG 유도체의 예는 국제 특허 출원 제 WO 97/23614 호에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용되었다.
제조 방법
유전자 구성물
본 발명에 사용된 핵산은 핵산 재조합 방법에 의해 제조된다. 예를들어, Nelles 등의 J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987) 문헌에 기재되어 있는 DNA 재조합 방법을 참조하라.
핵산은 게놈 DNA, 아게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 그것의 배합물을 포함한 여러가지 다양한 원으로부터 유도된다. 게놈 DNA 와 cDNA 는 여러가지 방법으로 수득할 수 있다. 원하는 서열을 코드하는 세포를 분리한 다음, 게놈 DNA 를 단편화하고(예를들어, 하나 또는 그 이상의 제한 엔도누클레아제로 처리), 그결과 생성된 단편을 클로닝하여 원하는 서열에 상보적인 프로브로 확인한 다음, 바람직한 활성을 갖는 부위를 코드하는 서열의 존재여부를 스크리닝하였다. cDNA 의 경우, cDNA 를 클로닝하여 그결과 생성된 클론을, 원하는 부위를 코드하는 cDNA 의 프로브로 스크리닝하였다. 바람직한 클론을 분리할 때, cDNA 는 게놈 DNA 와 실질적으로 동일한 방법으로 처리할 수 있다.
목적 단백질의 코딩 서열 이외에, 유전자 구성물은 다수의 조절 부위를 포함해야 한다. 발현시, 적당한 숙주에 의해 인식되는 전사 신호 및 번역 신호가 필요하다. 코딩 서열은 또한 숙주 세포와 양립되는 프로모터와 결합시켜야 한다. 이 프로모터는 발현 조절이 가능하도록 유도가능하며 구성할 수 있다. 적합한 프로모터 중 다수가 본 분야에 공지되어 있다.
택일적으로, 코딩 서열과 관련하여 게놈 DNA 로부터 프로모터 부위를 수득할 수 있다. 숙주 세포가 코딩 부위와 관련된 전사 조절 신호 및 번역 개시 신호를 인식하는 한, 코딩 서열에 인접한 5' 부위는 전사 조절 및 번역 조절 능력을 가지며 조절에 사용된다. 이 부위는 일반적으로 TATA 박스, 캡 서열, CAAT 서열 등과 같이 전사와 번역의 개시와 관련된 서열을 포함한다. 일반적으로, 이 부위는 그 길이가 적어도 약 150 bp 이며, 보다 일반적으로는 약 200 bp 이고, 드물게는 약 1 - 2 kb 를 초과하기도 한다.3' 비-코딩 부위는 특히 정지 신호 및 폴리아데닐화 부위 등의 전사 종결 조절 서열도 내포한다. 그외에도 3' 비-코딩 부위는 인핸서를 내포한다. 전사 종결 신호가 숙주 세포에서 충분히 기능성이지 않은 경우에는 다른 유전자로 기능성 3' 부위를 치환할 수 있다. 치환되는 3' 부위는 발현을 위해 선택한 세포계에 따라 선택할 수 있다.
숙주의 성질에 따라 광범위한 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열을 사용할 수 있다. 숙주에서 다량으로 발현되는 유전자로부터 조절 신호가 유래될 경우에, 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열은 바이러스 원(예, 아데노바이러스, 소의 파필로마 바이러스, 시미안 바이러스 등)에서 유도된다. 택일적으로, 포유동물 발현 산물(예, 액틴, 콜라겐, 미오신 등)의 프로모터도 사용될 수 있다. 저해 또는 활성이 가능하도록 전사 개시 조절 신호를 선택하여 유전자 발현을 변이시킬 수 있다. 이러한 제어가능한 변이 기술 중 하나는 온도-민감성 조절 신호를 사용하는 것으로, 온도를 변화시킴으로써 발현을 저해하거나 개시할 수 있다. 또다른 제어가능한 변이 기술은 특정한 화학물질에 민감한 조절 신호를 이용하는 것이다.
구성물은 프로모터, 인핸서 및 세포내에서 기인하거나 그렇지 않은 그외의 조절 부위와 연결시킨 내인성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구성물은 내인성 서열의 발현을 증가시킬 수도 있고(예를들어, 구성 프로모터와 결합할 경우) 제어할 수도 있다(예를들어, 조절 신호와 결합할 경우).
유전자 구성물을 구성하기 위하여 본 분야에 공지된 통상 기술에 의해 DNA 단편을 결합시켰다. 이러한 기술은 단편의 접착성 말단을 블런트 말단으로 변화시키는(또는 그 역으로 변화시킴) 제한 효소 ; 접착성 말단을 채워서 블런트 말단을 형성시키는 폴리메라제와 누클레오티드 ; 부적절한 결합을 막기 위한 알칼리성 포스파타제 ; 및 단편을 결합시키는 리가아제의 사용을 포함한다.
이 구성물은 선별가능한 유전자와 결합되어 세포내로 형질전환됨으로써 세포 내로 도입되는데, 이때 이 구성물은 숙주 게놈내로(예를들어, 상동 재조합에 의해) 통합될 것이다. 일반적으로, 구성물은 숙주 세포에 의해 인식되는 복제계를 갖는 벡터의 일부일 것이다.
발현 벡터
본 발명의 분자 제조용 발현 담체는 플라스미드 또는 그외의 벡터를 포함한다. 일반적으로, 이러한 벡터는 여러 형태의 세포에서 발현될 수 있는 조절 서열을 포함한다. 바람직한 코딩 서열과 조절 서열을 포함하는 적당한 발현 벡터는 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 문헌에 기술되어 있는 다수의 공지된 DNA 재조합 기술을 이용하여 구성할 수 있다.
본 발명에 의한 발현 벡터는 적어도 사이클린 D 유전자 산물이나 목적 단백질을 코드하는 핵산의 복제와 발현에 관여할 수 있다. 일 군의 벡터는 동물 바이러스(예를들어, 소의 파필로마 바이러스, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스 또는 SV40)로부터 유도한 염색체외 플라스미드를 자율적으로 복제할 수 있는 DNA 성분을 사용한다. 이 군의 벡터는 숙주 세포 염색체 내로 원하는 유전자 서열을 통합시킨다.
본 발명에 유용한 발현 벡터는 일반적으로 복제 기원, 발현되는 DNA 서열의 5'(즉, 상류)에 위치한 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 적당한 복제 기원에는 예를들어 ColE1, pSC101, M13, SV40 및 EBV 복제 기원이 포함된다. 적당한 종결 서열에는 예를들어 소의 성장 호르몬, SV40, lacZ 및 AcMNPV 다면형 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 적당한 프로모터에는 예를들어 시토메갈로바이러스 프로모터, lacZ 프로모터, 갈 10 프로모터(gal 10 promoter) 및 AcMNPV 다면형 프로모터가 포함된다. 프로모터 서열은 또한 발현을 조절(예를들어, 성장 배지내 영양소 또는 그외의 유도 인자의 존재 또는 부재에 의해 조절)할 수 있도록 유도할 수 있다. 한 예로서 IPTG 에 의해 유도될 수 있는 박테리오파지 람다 plac5 로부터 수득한 락 오페론을 들 수 있다.
발현 벡터는 또한 원하는 산물의 발현에 적합한 그외의 조절 서열을 포함한다. 이러한 서열은 발현 산물의 안정성에 기여하는 안정한 리더 서열 ; 발현 산물의 분비를 위한 분비성 리더 서열 ; DNA 서열의 발현을 상향 조절하는 인핸서 ; 및 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위인 제한 효소 인식 서열을 포함한다. 이들 물질 모두는 본 분야에 공지되어 있으며, 통상적으로 입수가능하다. 예를들어, Okayama, Mol. Cell Biol., 3, 280 (1983) 문헌을 참조하라.
적당한 발현 벡터는 또한 형질전환된 숙주 세포의 표현형을 선택할 수 있는 마커 서열도 포함한다. 이러한 마커는 영양요구성 숙주, 살생물 내성(예, 항생제 내성) 등에 대한 프로토트로피(prototrophy)를 제공한다. 이러한 선별가능한 마커 유전자는 발현되는 코딩 서열에 직접적으로 결합하거나 공동-감염에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 선별가능한 마커의 예로는 네오마이신, 암피실린, 하이그로마이신 등에 대한 내성 유전자를 포함한다.
실제상으로 사용되는 발현 벡터의 특성은 사용된 숙주 세포와 양립되는 것이어야 한다. 예를들어 포유동물 숙주의 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 분리한 프로모터(예, 마우스 메탈로티오닌 프로모터) 또는 이들 세포에서 성장한 바이러스로부터 분리한 프로모터(예, 백시니아 바이러스 7.5 K 프로모터)가 포함된다.
본 발명의 코딩 서열 내로 삽입되기에 적합한 통상적으로 입수가능한 발현 벡터는 포유동물 발현 벡터인 pcDNAI 또는 pcDNAI/Neo(바람직한 벡터임), 바쿨로바이러스 발현 벡터인 pBlueBac, 원핵 발현 벡터인 pcDNAⅡ 및 효모 발현 벡터인 pYes2 를 포함하며, 이들 모두는 미국 캘리포니아 샌디에고 소재 인비트로겐 코포레이션에서 입수할 수 있다.
숙주 세포
본 발명은 또한 목적 단백질 및 사이클린 D 유전자 산물의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 적당한 숙주 세포는 진핵 세포로서, 스포도프테라 프루지페르다 곤충 세포(Spodoptera frugiferda insect cell), COS-7 세포, 인체 섬유아세포 및 맥주효모균 세포가 포함된다. 숙주로 유용한 포유동물 세포는 섬유아세포 기원 세포(예, VERO 또는 CHO-K1)나 림프구 기원 세포(예, SP2/O-AG14 또는 P3x63Sg8) 또는 그것의 유도체를 포함한다. 바람직한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다.
골수종이나 림프종 세포와 같은 불사화 세포(immortalized cell) 역시 적절한 숙주 세포이다. 이러한 세포는 배양 플라스크내 적절한 영양 배지에서 성장될 수 있고, 또는 상승적 숙주(예를들어, 마우스 또는 랫) 또는 면역결핍 숙주나 숙주 부위(예를들어, 누드 마우스 또는 햄스터 낭)내로 주사될 수 있다. 특히, 복수액(ascites fluid)의 생산과 키메라 분자의 수확을 위해 복강내로 세포를 도입할 수 있다. 대안적으로, 세포를 피하주사하여 숙주의 혈액으로부터 항체를 수득할 수 있다. 세포는 하이브리도마 세포와 같은 방식으로 사용될 수 있다. Diamond 등의, N. Eng. J. Med., 304, 1344 (1981) ; Monoclonal Antibodies : Hybridomas - A New Dimension in Biologic Analysis(Kennatt 등, eds.) Plenum (1980) 참조하라.
발현 벡터는 본 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 예를들어, 인산칼슘 침전법에 의해 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 그러나, 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 다른 방법들도 사용될 수 있다[예를들어, 일렉트로포레이션, 리포좀성 융합(liposomal fusion), 세포핵 주사 및 바이러스나 파지 감염].
발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 다음의 일반적인 6 가지 방법 중 하나 이상에 의해 확인될 수 있다 : (a) DNA-DNA 혼성 ; (b) 마커 유전자 기능의 존재 또는 부재 ; (c) 숙주 세포내에서 유전자 구성물을 코드하는 mRNA 전사체의 생성을 측정함으로써 전사 수준 평가 ; (d) 유전자 산물을 면역학적으로 검출 ; (e) 효소 분석 ; (f) PCR. 이러한 방법들은 본 분야에 잘 알려져 있다 ; 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 5,744,314 호를 참고하라.
또한 본 발명의 발현 벡터 및 DNA 분자는 서열결정될 수 있다. 다양한 서열결정 방법들이 본 분야에 공지되어 있다. 예를들어, Sanger 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 - 7 (1977) 에 기술된 디데옥시 사슬 종결 방법(dideoxy chain termination method), 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 - 4 (1977) 에 기술된 Maxam - Gilbert 방법을 참고하라.
일단 발현 벡터가 적절한 숙주 세포내로 도입되면, 숙주 세포는 목적 단백질을 다량 발현하도록 하는 조건하에서 배양된다. 목적 단백질은 통상적인 방법에 따라 분리되고 정제되는데, 예를들어, 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등이다. 바람직한 방법은 친화성 크로마토그래피이다.
물론 모든 발현 벡터와 DNA 조절 서열이 본 발명의 핵산을 동등하게 잘 발현하는 것은 아니라는 점을 이해해야 한다. 또한 동일한 발현계라도 모든 숙주 세포가 동등하게 기능성이지는 않을 것이다. 그러나, 본 분야의 숙련자는 부당한 실험 및 본 발명의 범위와 의도를 벗어남 없이 본원에서 제공된 지침을 사용하는 발현 벡터, DNA 조절 서열 및 숙주 세포 중에서 잘 선택할 수 있을 것이다.
바람직한 실시형태의 상세한 설명
하기 내용은 본 발명의 특정 실시형태의 상세한 설명이다. 본 실시형태들은 전형적인 예이고 본 발명의 광범위한 응용성을 예를들어 설명한다. 명세서에 기재되지 않았다 하더라도, 본 실시형태들은 본 발명의 바람직한 요소들을 포함한다.
재료 및 방법
플라스미드
인체 사이클린 D1 유전자(진뱅크 기탁번호 제 M64349 호)를 pcDNA3.1(인비트로겐에서 입수)내로 클로닝하고 pcDNA3.1/사이클린 D1 을 만들기 위해 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인핸서 하에서 발현시켰다. 또한 벡터는 G418 의 존재시 안정한 포유동물 세포주를 선별하기 위한 네오마이신 내성 유전자도 지니고 있다.
세포 배양
CHOd-(SF) 세포를 100 ㎜ 접시의 완전 배지에서 배양하였다[DMEM(기브코/BRL), 5 % 우태아 혈청(JRH 바이오사이언시즈), 1 % 비-필수 아미노산(기브코/BRL), 1 % 하이포잔틴/티미딘(HT)(기브코/BRL) 및 1 % 글루타민/페니실린/스트렙토마이신(기브코/BRL)]. 세포를 트립신처리하고 계수하여 60 ㎜ 플레이트(팔콘)에 1×106 세포/접시의 밀도로 접종하였다. AM-1 CHOd- 세포를 암젠 VM-SOY 배지에서 현탁 스피너 배양하였다. 세포를 계수하고, 원심분리하고, 완전 배지에 재현탁하여 60 ㎜ 플레이트에 1×106 세포/접시의 밀도로 접종하였다. 세포를 밤새 배양하였다. 형질감염시키기 3 시간 전에 세포의 배지를 4 ㎖ 의 신선한 배지로 교체하였다.
사이클린 D1 형질감염
형질감염은 사이클린 D1 cDNA 삽입물을 함유하는 벡터 pcDNA3.1 neo(R) (인비트로겐에서 입수)를 사용하였다. 세포의 60 ㎜ 플레이트 각각에 대해, 5 ㎍ 의 pcDNA3.1/사이클린 D1 (2 ㎎/㎖) 및 5 ㎍ 의 마우스 게놈 담체 DNA (클론테크에서 입수)(100 ㎍/㎖)를 172.5 ㎕ 의 살균한 증류수에 첨가하였다. 25 ㎕ 의 2.5 M CaCl2 를 DNA 용액에 첨가하여 최종 부피를 250 ㎕ 로 맞추었다. 벡터 대조로서, 5 ㎍ 의 pneo 벡터 DNA(1.126 ㎎/㎖)(G418 과 같은 네오마이신의 항생 유도체에 세포 내성을 보이는 유전자 구성물 ; 미국 캘리포니아 소재 암젠 인코포레이티드에서 입수)와 5 ㎍ 의 담체 DNA 를 함께 170.5 ㎕ 의 정균수에 첨가한 다음 25 ㎕ 의 2.5 M CaCl2 를 첨가하였다. 모의 대조로서, 25 ㎕ 의 2.5 M CaCl2 를 225 ㎕ 의 물에 첨가하였다. DNA 용액을 동등한 부피(250 ㎕)의 2X HBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM NaHPO4·2H2O, 0.2 mM 덱스트로스, 50 mM HEPES, pH 7.05)에 점적하여 첨가하였는데, 첨가하는 동안 계속 거품이 생겼다. DNA/HBS 용액을 30 분간 실온에서 배양하였다. CHO 세포 플레이트에서 배지를 제거하고 DNA/HBS 용액(접시 당 500 ㎕ 총 부피)을 점적하여 첨가하였다. 총 3 개의 플레이트를 pcDNA3.1/사이클린 D1 과 각 세포주에 대한 벡터 대조 및 모의 대조로 처리하였다. 5 ㎖ 의 완전 배지를 각 접시에 첨가한 후, 세포를 30 분간 실온에서 배양하였다. 그런다음 세포를 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 신선한 배지로 교체하였다.
형질감염 48 시간 후에 CHO(SF) 세포가 전면생장하였다. 세포를 트립신처리하고 1×60 ㎜ 접시 대 8×100 ㎜ 접시의 비율로 완전 배지에 재평판하였다. 다음날, 배지를 1 ㎎/㎖ 의 제네티신(G418) (기브코/BRL)을 함유하는 완전 배지로 교체하였다. 형질감염 72 시간 후에 AM-1 CHO 세포가 전면생장하였고, 상기한 것과 유사한 방법으로 재평판하였다. 세포의 배지는 1 주에 2 번씩 G418 을 더한 신선한 완전 배지로 교체하였다. G418 선별 배지를 처음으로 첨가한지 10 일 후, CHO(SF) 및 AM-1 CHO 사이클린 D1-형질감염된 플레이트로부터 글래스 클로닝 실린더(벨코)를 사용하여 콜로니를 분리하였다. 세포를 트립신처리하고 24-웰 플레이트에 재접종하였다. CHO(SF) 세포의 형질감염 빈도(> 100 콜로니/플레이트)는 AM-1 CHO 세포(20 - 30 콜로니/플레이트)보다 훨씬 더 높았다. 총 72 개 콜로니를 CHO(SF)/사이클린 D1 플레이트로부터 분리하였고, AM-1 CHO/사이클린 D1 플레이트에서는 68 개 콜로니를 분리하였다. G418 선별 배지를 함유하는 모의 대조 접시 세트 상에는 콜로니가 존재하지 않았다. 콜로니를 수집한 후, 플레이트 각 세트의 남은 세포를 트립신처리하고 100 ㎜ 플레이트에 풀 배양액(pool culture)으로 합하였다[CHO(SF)/사이클린 D1 풀 3 개, 및 AM-1 CHO/사이클린 D1 풀 2 개].
형질감염된 세포를 전면생장시킨 다음 6-웰 플레이트에 클론/풀 당 2 웰을 재-평판하였다. 전면생장하면 각 클론/풀에 대한 세포의 한 웰을 250 ㎖ 의 1 % 트립톤 용균 완충액(1 % 트립톤 X100, 1 mM NaVO3, 50 mM 트리스/HCl pH 8, 100 mM NaCl, 프로테아제 저해제)으로 용균시켰다. 용균액을 14 K 에서 15 분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하여 -20 ℃ 에 저장하였다. 웨스턴 블롯팅하여 사이클린 D1 발현에 대해 용균액을 분석하였다. CHO(SF) 모세포주 및 AM-1 CHO 세포주의 대조 시료를 더한 샘플 각각 25 ㎕ 를 5 ㎕ 5X PAGE 겔 시료 완충액과 혼합하고, 3 분간 끓이고 12 % 노벡스 트리스-글리신 겔에 로딩하였다. 겔을 0.2 μ 니트로셀룰로스 필터(슐레이처 앤드 슈엘) 상에 일렉트로블롯팅하였다. 필터를 항-사이클린 D1 Ab-3 모노클로날 항체(칼바이오켐에서 입수)로 탐침하고 애머샴 ECL 시약을 사용하여 현상하였다. 풀 배양액 및 대부분의 클론에서 사이클린 D1 의 과발현 정도가 다양하게 나타나는 결과가 나왔다.
2 개의 AM-1 CHO/사이클린 D1 풀 배양액 및 2 개의 최대 발현 CHO(SF)/사이클린 D1 풀 배양액을 차후의 형질감염에 사용하기 위하여 각 세포주에 대한 "마스터 풀(master pool)" 로 합하였다. 마스터 풀 배양액이 DHFR 음성 표현형을 보유하고 있는지를 측정하기 위해 세포를 하이포잔틴/티미딘-결핍 선별 배지[DMEM, 5 % 투석된 우태아 혈청(히클론에서 입수), 비-필수 아미노산, 글루타민/페니실린/스트렙토마이신]에서 성장시켜 실험하였다. 이러한 배지에서는 세포 성장이 검출되지 않았다.
EPO 형질감염
CHO(SF)/사이클린 D1 및 AM-1 CHO/사이클린 D1 의 마스터 풀 배양액을 1 ㎎/㎖ 의 G418 이 보충된 완전 CHOd- 배지에 보존하였다. 이 세포를 60 ㎜ 플레이트에 8×105 세포/접시의 밀도로 접종하고 밤새 배양하였다. pSW19(pDSRα2 와 매우 유사한 유도체 ; 미국 캘리포니아 소재 암젠 인코포레이티드에서 입수)/EPO 표적 DNA, pDSRα2 벡터 대조 DNA 및 청어 정자 담체 DNA(기브코/BRL)로 상기 프로토콜을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 5 ㎍/접시의 pSW19/EPO DNA 가 최종 농도로 사용되었다. 형질감염 24 시간 후, 세포에 신선한 배지를 공급하였다. 형질감염 72 시간 후, 세포를 트립신처리하고 1 : 8, 1 : 10 및 1 : 20 의 비율로(60 ㎜ 플레이트 대 100 ㎜ 플레이트) 1 ㎎/㎖ 의 G418 을 더한 선별 배지에 재평판하였다. 배지를 1 주일에 2 번 G418 을 함유한 신선한 배지로 교체하였다. 재평판 12 일 후, CHO(SF)/사이클린 D1/EPO-형질감염된 플레이트로부터 48 개의 콜로니를 분리하였다. 남아있는 세포를 트립신처리하고 2 개의 풀 배양액으로 합하였다. 재평판 15 일 후, AM-1 CHO/사이클린 D1/EPO-형질감염된 플레이트로부터 48 개의 콜로니를 분리하고 남아있는 세포를 2 개의 풀 배양액으로 합하였다. 분리된 클론의 전면생장한 24-웰 배양액 또는 풀의 100 ㎜ 플레이트 배양액으로부터 수확한 무-혈청 조건 배지 상에서 웨스턴 블롯팅하여 EPO 발현을 분석하였다. 환원 조건하에서 겔을 런닝시키고, 항-EPO 모노클로날 항체 2D8 로 블롯을 검출하였다.
OPG 형질감염
pSW19/OPG DNA 구성물을 CHOd-(SF)/사이클린 D1, AM-1 CHOd-/사이클린 D1 마스터 풀 및 CHOd-(SF) 모세포주 내로 형질감염시키는 것은 EPO 형질감염과 동일한 방법으로 실시하였다. 3 개의 모든 숙주 세포주 내로 OPG-Fc(22 - 201) 각각 2 개의 형질감염을 실시하였다. OPG-Fc(22 - 201) 형질감염체로부터 총 124 개 CHO(SF), 110 개 CHO(SF)/사이클린 D 및 147 개 AM-1 CHO/사이클린 D 콜로니를 수득하였다. OPG 발현은 결과적으로 생성된 클론 및 풀에서 항-huIgG-Fc-HRP 항체(피어스에서 입수) 또는 친화-정제된 토끼 폴리클로날 항-huOPG 를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다.
DNA 의 요오드화 프로피듐 염색
세포를 100 ㎜ 플레이트에 접종하고 약 50 % 전면생장 하도록 두었다. 세포는 분석을 위해 대수기(log phase)에 있어야 한다. 트립신처리하여 세포를 수득하고 피펫으로 동일 부피의 DMEM/FBS 를 함유하는 원심분리 튜브내로 옮겼다. 세포 현탁액 분획을 혈구계 (hemocytometer)로 계수하였다. 세포 밀도는 약 106 - 107 세포/5 ㎖ 이다. 1000 xg 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 얼음같이 차가운 PBS 로 두 번 세척하였다. 세포는 단일-세포 현탁액에 있다. 0.5 ㎖ 의 PBS 를 첨가하고 세포 현탁액을 볼텍싱하였다. 그런다음, 세포 현탁액을 서서히 혼합하는 동안 2 ㎖ 의 70 % 에탄올을 튜브 벽면에 점적하여 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 최소한의 고정 시간은 30 분이다(이 때 세포 현탁액은 염색과 분석 전 약 2 주간 4 ℃ 에서 보관될 수 있다). 에탄올 상청액을 제거하기 위해 세포를 원심분리하고 PBS 로 한 번 세척하고 4 ℃ 에서 5 분간 재수화되도록 두었다. 세포를 원심분리하고 PBS 를 제거한 다음 펠릿을 0.5 ㎖ 의 요오드화 프로피듐 용액(모레큘라 프로브스) (PBS 내 50 ㎍/㎖ 로 제조)에 재현탁하였다. 10 ㎕ 의 DN아제-결핍 RN아제(10 ㎎/㎖)(뵈링거 맨하임에서 입수)를 첨가하고 세포 현탁액을 37 ℃ 에서 20 분간 배양하였다. 시료를 1 ㎖ 의 PBS 로 희석하고 1 시간 내에 FACS 에 의해 분석하였다.
유전자 증폭
세포에서의 유전자 증폭은 성장 배지에 메토트렉세이트(MTX)를 서서히 단계적으로 첨가함으로써 실행되었다. 3 개의 저 농도 메토트렉세이트(1 nM, 2.5 nM 및 5 nM)의 100 ㎜ 플레이트에서 1 : 10 의 비율로 세포를 계대배양하였다. 세포의 성장을 모니터하고, 가장 먼저 전면생장한 플레이트를 다음 단계의 증폭에 사용하였다. 만일 여러 농도의 메토트렉세이트에서 세포 성장이 동일하다면 가장 고 농도의 것을 다음 단계에 사용하였다. 웨스턴 블롯팅이나 EIA 으로 48-시간 무혈청 DMEM 수확물(4 ㎖/플레이트)의 단백질 발현 수준을 분석하였다. 세포를 24 시간 동안 메토트렉세이트가 보충된 완전 배지에서 회복되도록 둔 다음 3 배 더 고 농도의 메토트렉세이트로 1 : 10 의 비율로 계대배양하였다. 10 nM 에서 100 nM 까지의 양으로 MTX 의 농도를 증가시켰다. 일반적으로, 단백질 발현 수준이 100 nM 까지 피크에 도달하지 않으면, 증폭은 최대 발현 수준에 도달할 때까지 100 nM 의 증가량에서 지속된다. 세포를 이미 측정된 최적 농도의 MTX 존재하에 유지시켰다.
AM-1/D 세포주의 생성
AM-1/D 세포주는 1987년 10월 27일에 공고된 미국 특허 번호 제 4,703,008 호 및 Urlaub 등의 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., 77 : 4461 (둘 다 본원에서 참고문헌으로 인용함)에 기재된 CHOd(-) 세포주에서 유도되었다. CHOd(-) 세포주는 우태아 혈청이 감소된 수준 및 최종적으로는 모두 제거된 VM-SOY 배지에서의 계대배양을 거쳐 성장되었다. 결과적으로 생성된 무혈청 배지에서 성장가능한 세포주 AM-1 은 여전히 dhfr(-) 표현형을 지닌다. AM-1 세포주(AM-1 CHO 세포)는 인체 사이클린 D1 을 과발현하기 위해 만들어졌다.
pcDNA3.1/사이클린 D1 을 표준 인산칼슘 침전 방법에 의해 AM-1 세포주내로 형질감염시켰다. G418 로 선별한 콜로니를 트립신처리하고 2 개의 풀로 합하였다. 인체 사이클린 D1 특이 항체(항 사이클린 D1 Ab-3, 칼바이오켐에서 입수)를 사용하여 풀로부터 제조된 세포 용균액을 웨스턴 블롯팅(도 1) 함으로써 인체 사이클린 D1 단백질의 발현을 실험하였다. 몇몇 콜로니를 클로닝 링(cloning ring)으로 무작위로 골라내어 세포 용균액을 제조하고 분석하였다. 인체 사이클린 D1 의 발현은 예상한 대로 클론 사이에서 다양하였다. 클론과 비교했을 때 2 개의 풀은 전반적으로 2 배 내지 5 배 높은 고 수준의 인체 사이클린 D1 단백질을 나타내었다(도 1). 2 개의 풀을 다음 단계의 모든 실험에 사용되는 모세포주인 마스터 풀 배양액으로 합하였다(AM-1/D).
AM-1/D 세포주에서 발현된 인체 사이클린 D1 은 기능적이다
인체 사이클린 D1 은 그것의 세포 주기 역학을 변화시킴으로써 기능적으로 발현된다는 것을 증명하였다 ; 예를들어, 도 2 및 하기를 참조하라.
AM-1/D 및 AM-1 세포주로부터 동조성을 가지지 않는 세포를 요오드화 프로피듐으로 염색하고 FACScan(벡톤 디킨슨에서 입수)에 의해 분석하였다. 도 2A - 2D 는 상대적인 DNA 함량(x-축) 및 세포수(y-축)를 보여준다. AM-1 세포(33.73 %, 32.25 %)에 비해 AM-1/D 세포(40.08 %, 40.14 %)의 S-기에 더 많은 세포가 있었다. 이는 AM-1/D, CHO 세포주의 인체 사이클린 D1 의 과발현이 세포 주기 역학을 유의적으로 변화시키는데 대해 기능적이라는 것을 증명하는 것이다.
실시예 1 : 인체 OPG(진뱅크 기탁번호 제 U94332 호)-Fc 융합 단백질을 발현하기 위해 발현 벡터 pDSRα2 와 플라스미드 pDSRα2/OPG-Fc 를 구성하였다. 표준 인산칼슘 침전을 사용하여 pDSRα2/OPG-Fc 의 선형화된 DNA 를 AM-1/D 세포 및 변형되지 않은 원래의 AM-1 세포내로 동시에 형질감염시켰다. 세포를 2 주간 HT 보충없이 선별 배지에 놓아둔 후, 44 개 콜로니를 각 형질감염체로부터 무작위로 골라내었다.
콜로니를 각각 24-웰 플레이트로 옮기고 전면생장시켰다. 48 시간 후, 무혈청 조건 배지를 수집하고 인체 OPG 에 대해 항혈청 특이 항체를 사용하여 EIA 함으로써 분석하였다. 도 3 은 이러한 2 개의 세포주로부터 다양한 수준으로 OPG-Fc 를 발현하는 다수의 클론을 보여준다. AM-1/D 세포주들로부터의 클론들의 OPG-Fc 발현량이 AM-1 세포주들로부터의 클론들의 OPG-Fc 의 발현량보다 약 4 배 이상 많음을 도 3 에서 확인할 수 있다. 이는 AM-1/D 세포주로부터의 많은 클론들이 재조합 단백질을 더 높은 수준으로 발현하며, 20 ㎎/㎖ 의 OPG-Fc 보다 더 많이 발현된 최대 발현 클론 모두는 AM-1/D 세포주로부터 유도되었음을 명확히 한다.
pDSRα2 는 다음 세 가지를 변형시킨 플라스미드 pCD(Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 참조)의 유도체이다 : (ⅰ) SV40 폴리아데닐화 시그널을 소 난포자극호르몬의 α-소단위체, α-bFSH (Goodwin 등의, Nucleic Acids Res. 11 : 6873 - 6882, 1983 참조)로부터의 시그널과 대체하였다 ; (ⅱ) 마우스의 디히드로엽산 환원효소 미니유전자 (Minigene)(Gasser 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 6522 - 6526, 1982 참조)를 발현 카세트 하류에 삽입하여 형질전환체가 선택되고 증폭되도록 하였다 ; (ⅲ) 인체 T-세포 백혈병 바이러스 제 Ⅰ 형(HTLV-Ⅰ)의 긴 말단 반복체(LTR)의 "U5" 서열의 부분 및 "R-요소" 를 함유하는 267 bp 단편을 클로닝하고 SV40 프로모터와 Takebe 등의, Mol. Cell Biol. 8 : 466 - 472, 1988 에 기술된 접합 시그널 사이에 삽입하였다.
상기 플라스미드 pCD 는 Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 다음 세 단편을 T4 DNA 리가제와 함께 결합시킴으로써 제조할 수 있다 : pBR322 ori 및 AmpR 을 함유하는, pCDV1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피-엘 바이오케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로부터의 큰 HindⅢ-BamHⅠ 단편, SV40 시발 부위 프로모터 및 후기 부위 인트론을 함유하는 pL1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피-엘 바이오 케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로부터의 HindⅢ-PstⅠ 단편, 및 전체 DHFR 단백질 암호화 서열(dhfr cDNA)을 함유하는 PstⅠ-BglⅡ 단편이나 아니면 전체 길이의 α-글로빈 cDNA 분절을 함유하는 PstⅠ-BamHⅠ 단편.
실시예 2 : 인체 EPO 유전자를 발현하기 위해 플라스미드 pDSRα2/hEPO 를 구성하고 상기에서 기술된 인산칼슘 방법에 따라 AM-1/D 세포내로 형질감염시켰다. 심화 분석을 위해 48 개 콜로니를 무작위로 골라내었다. 조건 배지의 EIA 분석에 의해 다량 발현 클론 4 개를 확인하고 1 nM 의 메토트렉세이트에서 증폭하였다. 도 4 는 증폭 과정 동안 EPO 의 발현을 나타낸다. 2 개의 클론, AM-1/D 클론 2 및 AM-1/D 클론 33 은 MTX 의 농도가 증가하였음에도 불구하고 EPO 생산량이 증가됨을 보여주고, 이는 유전자 증폭이 성공적으로 이루어졌음을 증명하는 것이다. 이 클론들을 냉동-및-해동하여 실험하였고, EPO 발현의 감소 없는 광범위한 계대는 이 클론들에서 EPO 유전자 발현이 안정됨을 증명하는 것이다.
AM-1/사이클린 D CHO 세포내 OPG 발현
AM-1/사이클린 D CHO 세포와 다른 CHO 세포주에서 2 개의 OPG 구성물의 발현을 비교하였다. OPG(22 - 201)-Fc 를 AM-1/사이클린 D CHO 세포 및 CHO 모세포주{먼저 무혈청 배지에서 성장가능한 세포[CHO(SF)]}내로 형질감염시켰다. OPG(22 - 194)-cys-Fc 를 AM-1/사이클린 D CHO 세포 및 AM-1 CHO 모세포주내로 형질감염시켰다. 형질감염은 표준 인산칼슘법 및 DHFR 선별을 사용하여 실시되었다. 글래스 클로닝 실린더를 사용하여 형질감염된 콜로니를 분리하였다. 각각의 콜로니를 24-웰 플레이트에서 전면생장시켰다. OPG 에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하는 웨스턴 블롯팅을 실시하여 무혈청 조절 배지 수확물을 분비된 OPG 에 대해 분석하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 최대 수준의 발현을 보이는 클론들로부터 얻은 조절 배지 시료를 ELISA 로 더 분석하였다. OPG(22 - 194)-cys-Fc 발현 수준을 AM-1 CHO 세포 또는 AM-1/사이클린 D CHO 세포로부터 유도된 46 개 각각의 클론과 비교하였다(도 5). AM-1/사이클린 D CHO 세포에서의 OPG(22-194)-cys-Fc 발현 수준이 AM-1 CHO 세포에서의 발현 수준보다 약 4 배 이상 많음을 알 수 있다. 또한 OPG(22 - 201)-Fc 발현을 웨스턴 블롯팅으로 먼저 결정된 최대 발현 클론 24 개와 비교하였다(도 6). AM-1/사이클린 D CHO 세포에서의 OPG(22-201)-Fc 발현 수준이 AM-1 CHO 세포에서의 발현 수준보다 약 5 배 이상 많음을 알 수 있다. 각각의 경우에 있어서, AM-1/사이클린 D CHO 세포주에서 유도된 클론이 CHO(SF) 또는 AM-1 CHO 세포에서 유도된 클론보다 훨씬 더 높은 수준으로 발현됨을 보여준다.
무혈성 배지에 적응된 CHO 세포내 NESP 발현
NESP DNA 가 삽입된 pDSRα2 발현 벡터를 무혈청 배지에서 성장가능한 3 개의 다른 CHOd- 세포주내로 표준 인산칼슘법에 의해 형질감염시켰다 : CHOd-(SF), AM-1 및 AM-1/사이클린 D 내로 형질감염시킴. 형질감염, 선별 및 클론의 분리는 부착 배양액의 혈청-함유 배지에서 실시되었다. NESP 의 고 수준 발현 클론을 EPO 에 대한 모노클로날 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅으로 초기에 확인하였다. EIA 에 의해 발현을 정량하였다. 각 세포주에서의 최대 발현 클론을 무혈청 배지의 현탁 배양액에서 성장시켜 실험하였다. 또한 부착 배양액의 혈청-함유 배지에서 메토트렉세이트의 농도를 점차적으로 높여가며 클론을 성장시켜 DNA 가 증폭되게 하였다. 증폭 과정 동안 NESP 발현을 웨스턴 블롯팅 및 EIA 분석에 의해 모니터하였다. 증폭 과정 동안 다양한 시기에 클론의 성장 및 무혈청 현탁 배양액에서의 발현에 대해 분석하였다. AM-1/사이클린 D CHO 세포주에서 유도된 클론이 다른 2 개의 CHO 모세포주에서 유도된 것보다 전반적으로 더 높은 수준의 NESP 발현을 보였다(도 7). 또한 이소화합물 분포를 측정하기 위해 등전집중(isoelectric focusing)을 실시하여 클론을 분석하였다. CHO 모세포주에서 유도된 다양한 클론 또는 대조 세포주(61L)에서 이소화합물 분포상의 유의차는 관찰되지 않았다(도 8A 및 8B).
본 명세서 전반에 사용된 약어는 다음과 같이 정의된다 :
CHO 차이니즈 햄스터 난소
DHFR
EBV 엡스타인-바르 바이러스
EIA 효소 면역분석
EPO 에리트로포이에틴
HBS HEPES 완충된 식염수
IEF
MTX 메토트렉세이트
NESP 신규한 조혈 자극 단백질
OPG 오스테오프로테게린
Claims (38)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 다음을 포함하는 포유동물 세포 :(a) 사이클린 D 유전자 산물에 대한 유전자 구성물을 삽입하기 전의 세포에서의 사이클린 D 유전자 산물의 발현 수준보다 2 배 내지 5 배 높은 수준으로 세포에서 기능상 발현되는, 사이클린 D 유전자 산물에 대한 삽입된 유전자 구성물 ; 및(b) 목적 단백질에 대한 유전자 구성물을 삽입하기 전의 세포에서의 목적 단백질의 발현 수준보다 2 배 내지 5 배 높은 수준으로 세포에서 발현되는, 목적 단백질에 대한 삽입된 유전자 구성물.
- 제 21 항에 있어서, 세포는 CHO 세포임을 특징으로 하는 세포.
- 제 21 항에 있어서, 세포는 AM-1 세포임을 특징으로 하는 세포.
- 제 21 항에 있어서, 사이클린 D 유전자 산물은 포유동물 사이클린 D1 을 포함함을 특징으로 하는 세포.
- 제 21 항에 있어서, 사이클린 D 유전자 산물은 인체 사이클린 D 를 포함함을 특징으로 하는 세포.
- 제 21 항에 있어서, 사이클린 D 유전자 산물은 인체 사이클린 D1 을 포함함을 특징으로 하는 세포.
- 제 21 항에 있어서, 목적 단백질은 에리트로포이에틴(EPO)-관련 단백질, 오스테오프로게테린(OPG)-관련 단백질 또는 렙틴-관련 단백질임을 특징으로 하는 세포.
- 제 21 항에 있어서, 목적 단백질은 EPO, 신규 조혈 자극 단백질(Navel Erythropoiesis Stimulation Protein ; NESP), OPG, OPG-Fc, 렙틴 또는 Fc-렙틴임을 특징으로 하는 세포.
- 제 22 항에 있어서, 세포는 무혈청 배지에서 성장할 수 있음을 특징으로 하는 세포.
- 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법 :a. 다음을 포함하는 진핵 세포를 생산하고1. 사이클린 D 유전자 산물에 대한 유전자 구성물을 삽입하기전의 세포에서의 사이클린 D 유전자의 발현 수준보다 2 배내지 5 배 높은 수준으로 세포에서 기능상 발현되는,사이클린 D 유전자 산물에 대한 삽입된 유전자 구성물 및2. 목적 단백질에 대한 유전자 구성물을 삽입하기 전의세포에서의 목적 단백질의 발현 수준보다 2 배 내지 5 배높은 수준으로 세포에서 기능상 발현되는, 목적 단백질에 대한삽입된 유전자 구성물 ;b. 목적 단백질의 발현과 사이클린 D 유전자 산물의 기능상 발현을 가능하게 하는 조건하에서 세포를 배양하며 ;c. 목적 단백질을 분리한다.
- 제 30 항에 있어서, 세포는 CHO 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 세포는 AM-1 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 사이클린 D 유전자 산물은 포유동물 사이클린 D1 을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 사이클린 D 유전자 산물은 인체 사이클린 D 를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 사이클린 D 유전자 산물은 인체 사이클린 D1 을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 목적 단백질은 EPO-관련 단백질, OPG-관련 단백질 또는 렙틴-관련 단백질임을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 목적 단백질은 EPO, NESP, OPG, OPG-Fc, 렙틴 또는 Fc-렙틴임을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, 세포는 무혈청 배지에서 성장할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9608698P | 1998-08-11 | 1998-08-11 | |
| US60/096,086 | 1998-08-11 | ||
| US09/371,309 | 1999-08-10 | ||
| US09/371,309 US6210924B1 (en) | 1998-08-11 | 1999-08-10 | Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line |
| PCT/US1999/018213 WO2000009714A1 (en) | 1998-08-11 | 1999-08-11 | Overexpression of desired proteins in eukaryotic cells mediated by cyclin d1 overexpression |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020013462A KR20020013462A (ko) | 2002-02-20 |
| KR100502701B1 true KR100502701B1 (ko) | 2005-07-22 |
Family
ID=22255220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-7001843A KR100502701B1 (ko) | 1998-08-11 | 1999-08-11 | 사이클린 ｄ1 과발현에 의해 매개되는, 진핵 세포에서의목적 단백질의 과발현 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6210924B1 (ko) |
| EP (1) | EP1105507B1 (ko) |
| JP (1) | JP4562915B2 (ko) |
| KR (1) | KR100502701B1 (ko) |
| CN (1) | CN1151263C (ko) |
| AT (1) | ATE374827T1 (ko) |
| AU (1) | AU747640B2 (ko) |
| CA (1) | CA2338820C (ko) |
| CY (1) | CY1106987T1 (ko) |
| DE (1) | DE69937243T2 (ko) |
| DK (1) | DK1105507T3 (ko) |
| ES (1) | ES2291038T3 (ko) |
| HU (1) | HU230247B1 (ko) |
| PT (1) | PT1105507E (ko) |
| WO (1) | WO2000009714A1 (ko) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020090646A1 (en) * | 2000-05-03 | 2002-07-11 | Amgen Inc. | Calcitonin-related molecules |
| PT2087908T (pt) | 2001-06-26 | 2018-07-16 | Amgen Inc | Anticorpos contra opgl |
| EP1414517A4 (en) * | 2001-06-26 | 2008-02-06 | Photomed Technologies Inc | MULTIPLE WAVELENGTH ILLUMINATOR |
| KR100427299B1 (ko) * | 2001-08-10 | 2004-04-14 | 한국생명공학연구원 | 인체 골 재흡수 억제인자（ｈＯＰＧ）를 생산하는 재조합플라스미드 ｐＧＨＯＰＧ（ＫＣＴＣ １０１９ＢＰ） |
| CA2481074A1 (en) | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Amgen Inc. | Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors |
| NZ593428A (en) | 2002-09-06 | 2013-01-25 | Amgen Inc | Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody |
| MY146381A (en) | 2004-12-22 | 2012-08-15 | Amgen Inc | Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies |
| EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| AR056806A1 (es) | 2005-11-14 | 2007-10-24 | Amgen Inc | Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp |
| EP2500414A1 (en) | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
| SG174804A1 (ko) | 2006-09-13 | 2011-10-28 | Abbott Lab | |
| CA2676036A1 (en) * | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Amgen Inc. | Hepcidin, hepcidin antagonists and methods of use |
| US7982016B2 (en) | 2007-09-10 | 2011-07-19 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin |
| JO3382B1 (ar) | 2008-12-23 | 2019-03-13 | Amgen Inc | أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري |
| MX340971B (es) | 2009-11-23 | 2016-08-02 | Amgen Inc * | Fragmento cristalizable (fc) de anticuerpo monomerico. |
| JP5997140B2 (ja) * | 2010-07-05 | 2016-09-28 | ウニヴェルシテート フュア ボーデンクルトゥーア ウィーン | 生産細胞株 |
| MX2013008833A (es) | 2011-02-02 | 2013-12-06 | Amgen Inc | Metodos y composiciones relacionadas con la inhibicion de receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (igf-1r). |
| EP2847219A1 (en) | 2012-05-07 | 2015-03-18 | Amgen Inc. | Anti-erythropoietin antibodies |
| WO2014004549A2 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Amgen Inc. | Anti-mesothelin binding proteins |
| MX2016002870A (es) | 2013-09-05 | 2017-02-23 | Amgen Inc | Moleculas que contienen fc que presentan perfiles de glicoforma predecibles, consistentes y reproducibles. |
| US10435464B1 (en) | 2014-09-05 | 2019-10-08 | Coherus Biosciences, Inc. | Methods for making recombinant proteins |
| WO2016044224A1 (en) | 2014-09-15 | 2016-03-24 | Amgen Inc. | Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof |
| JP6749898B2 (ja) | 2014-10-15 | 2020-09-02 | アムジエン・インコーポレーテツド | 宿主細胞における異種由来遺伝子の発現を改善するためのプロモーター及び調節エレメント |
| CN105669863B (zh) | 2014-12-05 | 2019-09-13 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用 |
| WO2017058944A1 (en) | 2015-09-29 | 2017-04-06 | Amgen Inc. | Asgr inhibitors |
| US11098310B2 (en) | 2016-01-27 | 2021-08-24 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Expression from transposon-based vectors and uses |
| ES2823173T3 (es) | 2016-01-27 | 2021-05-06 | Just Biotherapeutics Inc | Promotor híbrido y usos del mismo |
| US11261462B2 (en) | 2016-01-27 | 2022-03-01 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Inducible expression from transposon-based vectors and uses |
| TWI826351B (zh) | 2016-05-31 | 2023-12-21 | 大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司 | Ｒ抗體,其藥物組合物及其應用 |
| US20190367611A1 (en) | 2017-02-01 | 2019-12-05 | CentryMed Pharmaceutical Inc. | Monomeric human igg1 fc and bispecific antibodies |
| CN117126279A (zh) | 2018-03-20 | 2023-11-28 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN110357959B (zh) | 2018-04-10 | 2023-02-28 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| JP2021521854A (ja) | 2018-05-01 | 2021-08-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | 調節されたグリカンプロファイルを有する抗体 |
| CN110655577A (zh) | 2018-06-13 | 2020-01-07 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| MA56110A (fr) | 2019-06-07 | 2022-04-13 | Amgen Inc | Constructions de liaison bispécifiques à lieurs clivables de manière sélective |
| CN112239507A (zh) | 2019-07-17 | 2021-01-19 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | ETA抗体与TGF-β Trap的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN112521501A (zh) | 2019-09-18 | 2021-03-19 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CA3184351A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
| IL303205A (en) | 2020-12-03 | 2023-07-01 | Amgen Inc | IMMUNOGLOBULINE constructs with multiple binding domains |
| CN115141276A (zh) | 2021-03-31 | 2022-10-04 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其在糖尿病肾病和慢性肾病治疗中的应用 |
| AU2022287014A1 (en) | 2021-06-04 | 2023-12-07 | Amgen Inc. | T cell engager molecules and uses thereof |
| CN113698466B (zh) * | 2021-07-30 | 2023-07-14 | 山东农业大学 | Ccnd1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用 |
| WO2024092033A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Amgen Inc. | Multispecific molecules for clearance of immunoglobulins in the treatment of autoantibody-induced diseases |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| IL79176A (en) | 1985-06-20 | 1992-06-21 | Kirin Amgen Inc | Process for the recovery of erythropoietin from a fluid |
| US5013718A (en) | 1986-11-21 | 1991-05-07 | Amgen, Inc. | Method for treating iron overload using EPO |
| JP2983629B2 (ja) | 1989-10-13 | 1999-11-29 | キリン―アムジエン・インコーポレイテツド | エリスロポエチンイソフォーム |
| JPH06117187A (ja) | 1992-10-08 | 1994-04-26 | Iseki Tory Tech Inc | シールド掘削機 |
| US5514571A (en) | 1993-08-05 | 1996-05-07 | University Technologies International Inc. | Cyclin D1 negative regulatory activity |
| US5521066A (en) | 1993-09-13 | 1996-05-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Periplasmic membrane-bound system for detecting protein-protein interactions |
| AU1552995A (en) | 1993-12-17 | 1995-07-03 | Spinal Cord Society | Method for inducing dna synthesis in neurons |
| US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO1996040912A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Amgen Inc. | Ob protein compositions and method |
| ES2216055T3 (es) | 1995-08-17 | 2004-10-16 | Amgen Inc | Metodos para reducir o mantener niveles reducidos de lipidos en sangre usando composiciones de proteina ob. |
| NZ512083A (en) | 1995-11-22 | 2003-02-28 | Amgen Inc | Methods of increasing lean tissue mass using OB protein compositions |
| US6369027B1 (en) | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| GB9608143D0 (en) * | 1996-04-19 | 1996-06-26 | Ver Nl Kanker Inst | Assay |
-
1999
- 1999-08-10 US US09/371,309 patent/US6210924B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 WO PCT/US1999/018213 patent/WO2000009714A1/en active IP Right Grant
- 1999-08-11 DE DE69937243T patent/DE69937243T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 HU HU0103485A patent/HU230247B1/hu unknown
- 1999-08-11 CN CNB998118990A patent/CN1151263C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 CA CA002338820A patent/CA2338820C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 KR KR10-2001-7001843A patent/KR100502701B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 AU AU55546/99A patent/AU747640B2/en not_active Expired
- 1999-08-11 EP EP99942098A patent/EP1105507B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 AT AT99942098T patent/ATE374827T1/de active
- 1999-08-11 ES ES99942098T patent/ES2291038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 PT PT99942098T patent/PT1105507E/pt unknown
- 1999-08-11 DK DK99942098T patent/DK1105507T3/da active
- 1999-08-11 JP JP2000565148A patent/JP4562915B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-11-08 CY CY20071101438T patent/CY1106987T1/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Cancer Research, Vol.56(1):36-39(1995. 6) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1105507B1 (en) | 2007-10-03 |
| HUP0103485A2 (hu) | 2002-01-28 |
| HU230247B1 (hu) | 2015-11-30 |
| JP4562915B2 (ja) | 2010-10-13 |
| EP1105507A1 (en) | 2001-06-13 |
| AU747640B2 (en) | 2002-05-16 |
| WO2000009714A1 (en) | 2000-02-24 |
| CA2338820A1 (en) | 2000-02-24 |
| CN1322253A (zh) | 2001-11-14 |
| JP2003524378A (ja) | 2003-08-19 |
| ATE374827T1 (de) | 2007-10-15 |
| CY1106987T1 (el) | 2012-09-26 |
| HUP0103485A3 (en) | 2010-01-28 |
| KR20020013462A (ko) | 2002-02-20 |
| PT1105507E (pt) | 2007-12-07 |
| US6210924B1 (en) | 2001-04-03 |
| CA2338820C (en) | 2005-10-18 |
| WO2000009714A9 (en) | 2000-05-18 |
| DK1105507T3 (da) | 2007-11-05 |
| AU5554699A (en) | 2000-03-06 |
| CN1151263C (zh) | 2004-05-26 |
| DE69937243T2 (de) | 2008-07-03 |
| ES2291038T3 (es) | 2008-02-16 |
| DE69937243D1 (de) | 2007-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100502701B1 (ko) | 사이클린 ｄ1 과발현에 의해 매개되는, 진핵 세포에서의목적 단백질의 과발현 | |
| AU2007278368B2 (en) | Regulatory nucleic acid elements | |
| US5578461A (en) | Gene manipulation and expression using genomic elements | |
| JP3495375B2 (ja) | 真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ｅａｓｅ） | |
| CN102165060B (zh) | 新的调控组件 | |
| Mortensen et al. | Embryonic stem cells lacking a functional inhibitory G-protein subunit (alpha i2) produced by gene targeting of both alleles. | |
| Ye et al. | Identification of the promoter region of human interleukin 1 type I receptor gene: multiple initiation sites, high G+ C content, and constitutive expression. | |
| US20100120089A1 (en) | A novel vector and expression cell line for mass production of recombinant protein and a process of producing recombinant protein using same | |
| EP0516787B1 (en) | Expression systems | |
| ES2213925T3 (es) | Seleccion entre positivos y negativos en el caso de la recombinacion homologa. | |
| KR100259933B1 (ko) | 게놈 엘리먼트를 이용한 유전자 조작 및 발현방법 | |
| US9476081B2 (en) | Method for producing protein | |
| CA2328506A1 (en) | Modifying the expression of the fsh beta gene by homologous recombination | |
| EP0546333B1 (en) | Cloned DNA having enhancer activity, recombinant vector comprising the same and process for producing gene product using the same | |
| Hofstetter et al. | A new genetic approach for studying hormonal regulation of urokinase-type plasminogen activator gene expression in LLC-PK1 cells | |
| KR101030978B1 (ko) | 동물세포용 재조합 발현벡터 | |
| Sala et al. | Inhibition of erythro-myeloid differentiation by constitutive expression of a DNA binding-deficient c-myb mutant: implication for c-myb function | |
| WO1996017933A2 (en) | Dna encoding a cell growth inhibiting factor and its product | |
| MXPA01001238A (en) | Overexpression of desired proteins in eukaryotic cells mediated by cyclin d1 overexpression | |
| WO1992021763A1 (en) | Enhancement of expression by gene targeting in endogenous retrovirus-like sequences | |
| WO1988009809A2 (en) | Cell system for expression of recombinant protein without production of virus | |
| US9315565B2 (en) | Method for producing protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130620 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140701 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150618 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160616 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170616 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190617 Year of fee payment: 15 |
|
| EXPY | Expiration of term |