ES2291038T3 - Sobreexpresion de proteinas deseadas en celulas eucariotas mediadas por sobreexpresion de ciclina d1. - Google Patents
Sobreexpresion de proteinas deseadas en celulas eucariotas mediadas por sobreexpresion de ciclina d1. Download PDFInfo
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Abstract
Una célula eucariota aislada que comprende: a) un ácido nucleico insertado que codifica un producto génico de ciclina D, en donde el producto génico de ciclina D se expresa funcionalmente en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo; y b) un ácido nucleico insertado que codifica una proteína de interés, en donde la proteína de interés se expresa en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo.
Description
Sobreexpresión de proteínas deseadas en células
eucariotas mediadas por sobreexpresión de ciclina D1.
La progresión a lo largo del ciclo de las
células de mamífero está dirigida por la activación ordenada de
quinasas dependientes de ciclina (CDKs). Una CDK activa se compone
de una subunidad catalítica y una subunidad reguladora denominada
ciclina. La actividad de las CDKs está regulada por interacciones
con ciclinas e inhibidores de CDK (CKIs) y por modificaciones
posteriores a la traducción (v.g., fosforilación).
La transición entre estados del ciclo celular
está regulada en puntos de comprobación definidos por subunidades
de ciclina diferentes: ciclinas G1 para la transición G1/S, ciclinas
S para la progresión a lo largo de la fase S, y ciclinas G2 o
mitóticas para la entrada en mitosis. El compromiso de una célula a
entrar en la fase S ocurre en un punto de restricción (R) al final
de G1, después de lo cual los factores de crecimiento mitogénicos
ya no son requeridos para que las células completen la división.
Las ciclinas D y E se sintetizan secuencialmente
durante la fase G1 y son limitantes de la velocidad para la entrada
en la fase S, por lo que pueden considerarse como ciclinas G1. Al
menos tres genes de mamífero codifican ciclinas de tipo D (D1, D2 y
D3). Las ciclinas de tipo D son inducidas progresivamente como parte
de la respuesta retardada inicial a la estimulación mitogénica, y
son expresadas de una manera específica del linaje celular. El
ensamblaje de ciclinas de tipo D con CDK4 y CDK6 está regulado por
mitógenos con posterioridad a la traducción. Una vez ensambladas,
las CDKs fijadas a la ciclina D tienen que ser fosforiladas por una
quinasa activadora de CDK (CAK) para adquirir actividad
catalítica.
Los genes de ciclina D se encuentran en una rama
diferente del árbol evolutivo de las ciclinas de tipo A, B, o E, y
las ciclinas de tipo D tienen propiedades algo diferentes de otras
ciclinas. Las mismas son proteínas de vida corta
(t_{1/2} < 25 min). La eliminación de factores de crecimiento durante la fase G1 impide la acumulación uniforme de ciclina D, en correlación con el fallo de las células privadas de factores de crecimiento para progresar más allá del punto R. Por ello, la expresión de ciclina D está regulada por señales extracelulares, al contrario que la expresión periódica de las ciclinas A, B, y E.
(t_{1/2} < 25 min). La eliminación de factores de crecimiento durante la fase G1 impide la acumulación uniforme de ciclina D, en correlación con el fallo de las células privadas de factores de crecimiento para progresar más allá del punto R. Por ello, la expresión de ciclina D está regulada por señales extracelulares, al contrario que la expresión periódica de las ciclinas A, B, y E.
La sobre-expresión de las
ciclinas D1 y E humanas en fibroblastos humanos o de roedor acorta
G1, disminuye el tamaño celular, y reduce el requerimiento de suero
para la transición G1-a-S (Resnitzky
et al., MCB 14; 1669-79 (1994);
Quelle et al., Genes & Development 7,
1559-71 (1993). Ohtsubo & Roberts,
Science 259, 1908-12 (1992)). Estos
resultados sugieren que las ciclinas D podrían contrarrestar una
función fisiológicamente regulada por la ciclina E o viceversa. Sin
embargo, la sobreexpresión de ciclina D o E no conduce a
transformación de los fibroblastos - las células siguen siendo
dependientes del suero, inhibidas por contacto e incapaces de
formar colonias en medio semisólido. Se ha encontrado también que la
sobre-expresión de la ciclina D1 mejora la
amplificación endógena de genes, lo que sugiere que la misma
desempeña una función en la inestabilidad genómica durante el
desarrollo de los tumores. Zhou et al., Cancer Res.
56: 36-9 (1996).
La presente invención concierne a una célula
eucariota que comprende:
- a)
- un producto del gen insertado de la ciclina D, en donde el producto del gen de la ciclina D se expresa funcionalmente en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo; y,
- b)
- una proteína de interés insertada, en donde la proteína de interés se expresa en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo.
La presente invención concierne también a un
proceso de producción de una proteína de interés, que comprende:
- A.
- Crear una célula eucariota que expresa:
- 1.
- un producto del gen de ciclina D a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo; y
- 2.
- una proteína de interés a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo;
por introducción de un vector de
expresión que comprende una secuencia de DNA para la proteína de
interés e introducción de un vector de expresión que comprende una
secuencia de DNA para el producto del gen de la ciclina
D;
- B.
- cultivar la célula en condiciones que permiten la expresión de la proteína de interés y la expresión funcional del producto del gen de la ciclina D; y
- C.
- aislar la proteína de interés.
Las células de esta invención son
preferiblemente células de mamífero, siendo muy preferidas células
CHO. El producto del gen de ciclina D es preferiblemente de
mamífero, siendo muy preferido el origen humano. El gen de la
ciclina D o el gen que codifica la proteína de interés (o ambos)
pueden estar comprendidos en un vector o vectores de expresión
dentro de la célula o pueden estar integrados en el genoma de la
célula.
Cualquier número de proteínas de interés puede
utilizarse en la presente invención. Específicamente, pueden
emplearse EPO, OPG, Leptina y cualesquiera derivados de las
mismas.
Se describe también una célula eucariota que
comprende:
- (a)
- un producto del gen de ciclina D, en donde el producto del gen de ciclina D se expresa funcionalmente en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo; y
- (b)
- una proteína de interés, donde la proteína de interés se expresa en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo.
Se describe también un proceso para producir una
proteína de interés que comprende:
- A.
- Crear una célula eucariota que expresa
- 1.
- un producto del gen de ciclina D a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo, y
- 2.
- una proteína de interés a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo;
- B.
- cultivar la célula en condiciones que permiten la expresión de la proteína de interés y la expresión funcional del producto del gen de ciclina B; y
- C.
- aislar la proteína de interés.
Las células de esta descripción son
preferiblemente de mamífero, siendo muy preferidas las células CHO.
El producto del gen de ciclina D es preferiblemente de mamífero,
siendo muy preferido el origen humano. El gen de ciclina D o el gen
que codifica la proteína de interés (o ambos) pueden estar
comprendidos en un vector o vectores de expresión dentro de la
célula o pueden estar integrados en el genoma celular.
En la presente descripción pueden utilizarse
cualquier número de proteínas de interés. Específicamente, pueden
emplearse EPO, OPG, Leptina y NESP, y cualesquiera derivados de las
mismas.
La Figura 1 muestra una transferencia Western de
lisados de células AM-1 transfectadas con
pcDNA3.1/ciclina D1 y tratadas con un anticuerpo específico de la
ciclina D1 humana (véase Materiales y Métodos). Esta transferencia
demuestra la expresión de ciclina D1 humana en las células
AM-1/D.
Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D son histogramas que
muestran el contenido relativo de DNA (eje x) y el número de
células (eje y) de células no sincronizadas de las líneas de células
AM-1/D y AM-1 teñidas con yoduro de
propidio y analizadas por FACScan (Becton Dickinson; véase
Materiales y Métodos). Estas figuras demuestran que había
significativamente más células en la fase S en las células
AM-1/D.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el número
de clones que expresan OPG-Fc a diversos niveles. Se
transfectaron células AM-1/D con el plásmido
pDSR\alpha2/OPG-Fc como se describe más adelante
en esta memoria en el Ejemplo 1. Este gráfico muestra que los
clones que se expresaban en mayor grado se derivaban de la línea de
células AM-1/D.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la
expresión de EPO representada gráficamente en función de la
concentración de MTX utilizada para amplificación. Se transfectaron
células AM-1/D con el plásmido pDSR\alpha2/hEPO
como se describe en el Ejemplo 2 más adelante en esta memoria. Dos
de los clones exhibían producción elevada de EPO con
concentraciones crecientes de MTX, demostrando la amplificación
exitosa del gen.
La Figura 5 muestra una comparación de los
niveles de expresión de
OPG(22-194)-cys-Fc
en 46 clones individuales derivados de células AM-1
CHO o células AM-1/ciclina D CHO. Los clones
derivados de la línea de células AM-1/ciclina D CHO
exhiben niveles de expresión de
OPG(22-194)-cys-Fc
significativamente mayores que los clones derivados de las células
AM-1 CHO.
La Figura 6 muestra una comparación de la
expresión de OPG(22-201)-Fc
en los 24 clones de expresión máxima como se determinó previamente
por transferencia Western. En cada caso, los clones que se derivaban
de la línea de células AM-1/ciclina D CHO exhiben
niveles de expresión de
OPG(22-201)-Fc
significativamente mayores que los clones derivados de las células
CHO(SF).
\newpage
La Figura 7 muestra la expresión media de NESP
determinada por EIA en los 14 clones óptimos derivados de cada
línea de células CHO materna. Se recogieron muestras de medio
acondicionadas de placas de 24 pocillos, cosechándolas durante 2
días. Las muestras se pre-escrutaron por
transferencia Western.
La Figura 8 muestra transferencias Western IEF
de cosechas de centrifugadora y biorreactor, que comparan las
distribuciones de isoformas de la proteína NESP secretada de
cultivos de centrifugadora y biorreactor. Las cosechas de
centrifugadora proceden de clones no amplificados. La proteína NESP
estándar, purificada a partir de medio acondicionado en botellas
rodantes, exhibe las isoformas de peso molecular alto deseadas. Las
cosechas del medio acondicio-
nado contienen todas las isoformas. Las transferencias muestran la presencia de isoformas altas en todas las muestras.
nado contienen todas las isoformas. Las transferencias muestran la presencia de isoformas altas en todas las muestras.
Las definiciones siguientes se aplican a los
términos tal como se utilizan a lo largo de esta memoria
descriptiva, a no ser que se limiten de otro modo en casos
específicos.
Los términos "insertado" e "inserción"
de ácidos nucleicos significan que el ácido nucleico se introduce en
una célula u organismo por métodos externos (v.g., transfección).
El ácido nucleico insertado puede tener una secuencia extraña o ya
presente en el genoma de la célula. En el último caso, el ácido
nucleico insertado permite una expresión mayor o regulada
diferencialmente de la proteína codificada por el ácido nucleico
insertado.
El término "proteína afín a EPO" hace
referencia a eritropoyetina y derivados y análogos de la misma que
pueden formarse por métodos de DNA recombinante y otros. Tales
derivados incluyen proteínas que tienen truncaciones terminales,
eliminación de aminoácidos internos (v.g., por restricción y
religación del DNA asociado), sustituciones de aminoácidos,
etcétera. Dichos derivados incluyen también proteínas de fusión
(v.g., con una región Fc). Derivados ilustrativos de eritropoyetina
se describen en las Solicitudes de Patente Internacional WO
91/05867, 94/09257, 88/03808, y 86/07594.
El término "proteína afín a leptina" hace
referencia a leptina, preferiblemente leptina humana, y derivados
de la misma que pueden formarse por métodos de DNA recombinante y
otros. Dichos derivados incluyen proteínas que tienen truncaciones
terminales, eliminación de aminoácidos internos, sustituciones de
aminoácidos, etcétera. Se incluyen también dentro de esta
definición proteínas de fusión que comprenden leptina, tales como
una proteína de fusión que comprende leptina y un fragmento Fc.
Derivados de leptina adecuados se describen en las solicitudes de
patente WO 96/40912 (presentada el 19 de diciembre de 1996), WO
96/05309 (presentada el 22 de febrero de 1996), WO 97/06816
(presentada el 27 de febrero de 1997), y WO 97/18833 (presentada el
29 de mayo de 1997).
El término "proteína afín a OPG" se refiere
a OPG y derivados de la misma que pueden formarse por métodos de
DNA recombinante y otros. Tales derivados incluyen proteínas que
tienen truncaciones terminales, eliminación de aminoácidos internos
(v.g., por restricción y religación del DNA asociado), sustituciones
de aminoácidos y análogos. Tales derivados incluyen también
proteínas de fusión (v.g., con una región Fc). Derivados
ilustrativos de OPG se describen en la Solicitud de Patente
Internacional WO 97/23614.
Los ácidos nucleicos utilizados en la presente
invención pueden prepararse por métodos de ácido nucleico
recombinante. Véanse, por ejemplo, los métodos de DNA recombinante
de Nelles et al., J. Biol. Chem., 962, 10855
(1987).
Los ácidos nucleicos pueden derivarse de una
diversidad de fuentes, que incluyen DNA genómico, DNA subgenómico,
cDNA, DNA sintético, y combinaciones de los mismos. El DNA genómico
y el cDNA pueden obtenerse de diversas maneras. Las células que
codifican la secuencia deseada pueden aislarse, el DNA genómico
puede fragmentarse (v.g., por tratamiento con una o más
endonucleasas de restricción), y los fragmentos resultantes pueden
clonarse, identificarse con una sonda complementaria a la secuencia
deseada, y escrutarse respecto a la presencia de una secuencia
codificante de la actividad deseada. Para cDNA, el cDNA puede
clonarse y el clon resultante escrutarse con una sonda para cDNA
que codifica la región deseada. Después de aislamiento del clon
deseado, el cDNA puede manipularse sustancialmente del mismo modo
que el DNA genómico.
Además de la secuencia codificante de la
proteína de interés, la construcción génica debe contener cierto
número de regiones reguladoras. Para la expresión, son necesarias
señales de transcripción y traducción reconocidas por un hospedador
apropiado. La secuencia codificante debe estar enlazada también a un
promotor compatible con la célula hospedadora. El promotor puede
ser inducible, permitir control de expresión adicional, o ser
constitutivo. Se conocen en la técnica cierto número de promotores
adecuados.
Alternativamente, la región promotora del DNA
genómico puede obtenerse en asociación con la secuencia codificante.
En la proporción en que las células hospedadoras reconocen las
señales reguladoras de la transcripción y de iniciación de la
traducción asociadas con la región codificante, la región 5'
adyacente a la secuencia codificante puede retenerse y emplearse
para regulación de la transcripción y la traducción. Esta región
incluirá típicamente aquellas secuencias implicadas con la
iniciación de la transcripción y la traducción, tales como la
secuencia TATA, la secuencia de protección terminal, la secuencia
CAAT, y análogas. Típicamente, esta región tendrá una longitud de
al menos aproximadamente 150 pares de bases, de manera más general
aproximadamente 200 pb, y rara vez excederá aproximadamente de 1 a 2
kb.
La región 3' no codificante puede retenerse,
asimismo, especialmente por sus secuencias reguladoras de la
terminación de la transcripción, tales como la señal de parada y la
región de poliadenilación. Adicionalmente, la región 3' no
codificante puede contener también un intensificador. En el caso en
que las señales de terminación de la transcripción no son
satisfactoriamente funcionales en la célula hospedadora, puede
sustituirse una región funcional 3' procedente de un gen diferente.
La elección de la región 3' sustituida dependerá del sistema
celular elegido para la expresión.
Pueden emplearse una gran diversidad de
secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción,
dependiendo de la naturaleza del hospedador. Las secuencias
reguladoras de la transcripción y la traducción pueden derivarse de
fuentes virales (v.g., adenovirus, virus del papiloma de los
bovinos, virus de los simios, y análogos) donde las señales
reguladoras se derivan de un gen que tiene un alto nivel de
expresión en el hospedador. Alternativamente, pueden emplearse
promotores procedentes de productos de expresión de mamíferos (v.g.,
actina, colágeno, miosina, y análogos). Pueden seleccionarse
señales reguladoras de la iniciación de la transcripción que
permiten represión o activación, de tal modo que la expresión de los
genes puede modularse. Una técnica de modulación controlable de
este tipo es el uso de señales reguladoras que son sensibles a la
temperatura, por lo que la expresión puede reprimirse o iniciarse
por cambio de la temperatura. Otra técnica de modulación
controlable es el uso de señales reguladoras que son sensibles a
ciertos productos químicos.
Las construcciones pueden comprender una
secuencia de ácido nucleico endógena a la célula hospedadora en
asociación con el promotor, el intensificador, y otras regiones
reguladoras que pueden ser endógenas o no a la célula. Tales
construcciones permiten que la expresión de la secuencia endógena se
incremente (v.g., por acoplamiento operativo a un promotor
constitutivo) o se controle (v.g., por acoplamiento operativo a
señales reguladoras).
Para formar las construcciones génicas, pueden
ligarse fragmentos de DNA de acuerdo con métodos convencionales
conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen el uso de enzimas
de restricción para convertir fragmentos de extremos cohesivos en
extremos romos (o viceversa), polimerasas y nucleótidos para
rellenar los extremos cohesivos a fin de formar extremos romos,
fosfatasa alcalina para evitar ligaciones indeseables, y ligasas
para unir fragmentos.
Las construcciones pueden introducirse en una
célula por transformación en asociación con un gen que permita la
selección donde la construcción llegará a integrarse en el genoma
hospedador (v.g., por recombinación homóloga). Usualmente, la
construcción será parte de un vector que tiene un sistema de
replicación reconocido por la célula hospedadora.
Vehículos de expresión para producción de las
moléculas de la invención incluyen plásmidos u otros vectores. En
general, dichos vectores contienen secuencias de control que
permiten la expresión en diversos tipos de células. Pueden
construirse vectores de expresión adecuados que contienen las
secuencias deseadas de codificación y control utilizando métodos de
DNA recombinante conocidos en la técnica, muchos de los cuales se
describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Un vector de expresión tal como se contempla en
la presente invención es capaz al menos de dirigir la replicación y
expresión del ácido nucleico que codifica la proteína de interés o
del producto del gen de la ciclina D. Una clase de vectores utiliza
elementos de DNA que proporcionan plásmidos extracromosómicos que se
replican autónomamente, derivados de virus animales (v.g., virus
del papiloma de los bovinos, poliomavirus, adenovirus, o SV40). Una
segunda clase de vectores está basada en la integración de las
secuencias génicas deseadas en el cromosoma de la célula
hospedadora.
Vectores de expresión útiles en la presente
invención contienen típicamente un origen de replicación, un
promotor localizado 5' respecto a (es decir, aguas arriba de) la
secuencia de DNA a expresar, y una secuencia de terminación de la
transcripción. Orígenes de replicación adecuados incluyen, por
ejemplo, los orígenes de replicación ColE1. pSC101, M13, SV40 y
EBV. Secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, la
hormona del crecimiento de los bovinos, SV40, lacZ y señales de
poliadenilación AcMNPV de la polihedrosis. Promotores adecuados
incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el promotor
lacZ, el promotor gal 10 y el promotor AcMNPV de la polihedrosis.
La secuencia promotora puede ser también inducible, a fin de
permitir la modulación de la expresión (v.g., por la presencia o
ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de
crecimiento). Un ejemplo es el operón lac obtenido del bacteriófago
lambda plac5, que puede ser inducido por IPTC.
Los vectores de expresión pueden incluir también
otras secuencias reguladoras para expresión óptima del producto
deseado. Tales secuencias incluyen secuencias conductoras de
estabilidad, que proporcionan estabilidad del producto de
expresión; secuencias conductoras secretoras, que proporcionan
secreción del producto de expresión; intensificadores, que regulan
en sentido creciente la expresión de la secuencia de DNA; y
secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción, que
proporcionan sitios para escisión por endonucleasas de restricción.
Todos estos materiales son conocidos en la técnica y están
disponibles comercialmente. Véase, por ejemplo, Okayama, Mol.
Cell Biol., 3, 280 (1983).
Un vector de expresión adecuado puede incluir
también secuencias de marcación, que permiten la selección
fenotípica de células hospedadoras transformadas. Un marcador de
este tipo puede proporcionar fototrofia a un hospedador auxótrofo,
resistencia a los biocidas (v.g., resistencia a antibióticos),
etcétera. El gen marcador seleccionable puede, o bien enlazarse
directamente a las secuencias codificantes a expresar, o
introducirse en la misma célula por
co-transfección. Ejemplos de marcadores
seleccionables incluyen genes para resistencia a neomicina,
ampicilina, higromicina, etcétera.
Las características de los vectores de expresión
reales utilizados tienen que ser compatibles con la célula
hospedadora a emplear. Para un hospedador mamífero, por ejemplo, el
vector de expresión puede contener promotores aislados del genoma
de células de mamífero (v.g., el promotor metalotioneína de ratón),
o de virus que crecen en estas células (v.g., el promotor 7,5 K del
virus Vaccinia).
Vectores de expresión adecuados disponibles
comercialmente en los cuales pueden insertarse las secuencias
codificantes de la presente invención incluyen los vectores de
expresión de mamífero pcDNA I o pcDNA I/Neo (que se prefiere), el
vector de expresión de baculovirus pBlueBac, el vector de expresión
procariota pcDNA II y el vector de expresión de levadura pYes2,
todos los cuales pueden obtenerse de Invitrogen Corp., San Diego,
Calif.
La presente invención se refiere adicionalmente
a células hospedadoras que contienen vectores de expresión que
comprenden secuencias de DNA para la proteína de interés y el
producto del gen de la ciclina D. Células hospedadoras adecuadas
son células eucariotas; por ejemplo, células de insecto
Spodoptera frugiperda, células COS-7,
fibroblastos humanos, y células de Saccharomyces cerevisiae.
Células de mamífero que pueden ser útiles como hospedadores
incluyen células de origen fibroblástico (v.g., VERO o
CHO-K1) o de origen linfoide (v.g.,
SP2/0-AG14, o P3x63Sg8) o derivados de las mismas.
Células hospedadoras de mamífero preferidas son células CHO.
Células inmortalizadas, tales como células de
mieloma o de linfoma, son también células hospedadoras adecuadas.
Estas células pueden cultivarse en un medio nutriente apropiado en
frascos de cultivo o inyectarse en un hospedador sinergénico (v.g.,
ratón o rata) o un hospedador o sitio hospedador inmunodeficiente
(v.g., ratón atímico o bolsa de hámster). En particular, las
células pueden introducirse en la cavidad abdominal para producción
de fluido de ascitis y recogida de la molécula quimérica.
Alternativamente, las células pueden inyectarse por vía subcutánea
y los anticuerpos cosecharse de la sangre del hospedador. Las
células pueden utilizarse de la misma manera que las células de
hibridoma. Véase Diamond et al., N. Eng. J. Med., 304,
1344 (1981), Monoclonal Antibodies: Hybridomas-A
New Dimension in Biologic Analysis (Kennatt, et al.,
eds). Plenum (1980).
Pueden introducirse vectores de expresión en
células hospedadoras por diversos métodos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, la transfección de células hospedadoras con vectores de
expresión puede llevarse a cabo por el método de precipitación con
fosfato de calcio. Sin embargo, pueden emplearse también otros
métodos para introducción de vectores de expresión de células
hospedadoras (por ejemplo, electroporación, fusión de liposomas,
inyección nuclear, e infección viral o de fago).
Las células hospedadoras que contienen un vector
de expresión pueden identificarse por uno o más de los 6 métodos
generales siguientes: (a) hibridación de DNA-DNA;
(b) la presencia o ausencia de funciones de genes marcadores; (c)
evaluación del nivel de transcripción tal como se mide por la
producción de transcritos de mRNA que codifican las construcciones
génicas en la célula hospedadora; (d) detección inmunológica del
producto génico; (e) ensayo enzimático; y (f) PCR. Estos métodos
son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, el documento
U.S. Pat. No. 5.744.314.
Los vectores de expresión y moléculas de DNA de
la presente invención pueden secuenciarse también. Se conocen en la
técnica diversos métodos de secuenciación. Véase, por ejemplo, el
método de terminación de cadenas di-desoxi descrito
en Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
5463-7 (1977), y el método de
Maxam-Gilbert, descrito en Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74, 560-4 (1977).
Una vez que se ha introducido un vector de
expresión en una célula hospedadora apropiada, la célula hospedadora
puede cultivarse en condiciones que permitan la expresión de
grandes cantidades de la proteína de interés. La proteína de
interés puede aislarse y purificarse de acuerdo con condiciones
convencionales, tales como extracción, precipitación,
cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, y
análogas. El método preferido es la cromatografía de afinidad.
Por supuesto, debe entenderse que no todos los
vectores de expresión y secuencias reguladoras de DNA funcionarán
igualmente bien para expresar los ácidos nucleicos de la presente
invención. Ni tampoco todas las células hospedadoras funcionarán de
modo igualmente satisfactorio con el mismo sistema de expresión. No
obstante, una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede
hacer una selección entre vectores de expresión, secuencias
reguladoras de DNA, y células hospedadoras utilizando las
orientaciones proporcionadas en esta memoria sin experimentación
excesiva y sin apartarse del alcance de la presente invención.
A continuación se detallan descripciones de
realizaciones específicas de la presente invención. Estas
realizaciones son ilustrativas y sirven para ilustrar la
aplicabilidad general de la presente invención. A no ser que se
indique otra cosa en la memoria descriptiva, estas realizaciones
constituyen elementos preferidos de la invención.
Se clonó el gen de la ciclina D1 humana (acceso
a Genbank #M64349) en pcDNA 3.1 (Invitrogen) y se expresó
constitutivamente bajo el promotor/intensificador de citomegalovirus
(CMV) para generar pcDNA 3.1/ciclina D1. El vector lleva también el
gen de resistencia a la neomicina para selección de líneas de
células de mamífero estables en presencia de G418.
Se cultivaron células CHOd^{-}(SF) en
cápsulas de 100 mm en medio completo {DMEM (Gibco/BRL), Suero de
Bovino Fetal al 5% (JRH Biosciences), 1% de aminoácidos no
esenciales (Gibco/BRL), 1% hipoxantina/timidina (HT) (Gibco/BRL), y
1% glutamina/penicilina/estreptomicina (Gibco/BRL)}. Las células se
tripsinizaron, se contaron, y se sembraron en placas de 60 mm
(Falcon), a 1 x 10 e6 células/cápsula. Se cultivaron células
AM-1 CHOd^{-} en cultivo de centrífuga en
suspensión en medio Amgen VM-soja. Se contaron las
células, se centrifugaron, se resuspendieron en medio completo, y
se sembraron en placas de 60 mm a razón de 1 x 10 e6
células/cápsula. Las células se incubaron durante una noche. Tres
horas antes de la transfección, se reemplazó el medio en las células
con 4 ml de medio nuevo.
Transfección de la ciclina D1. Esta
transfección utilizó el vector pcDNA 3.1 neo® (Invitrogen) que
contenía la inserción de cDNA de ciclina D1. Para cada placa de
células de 60 mm, se añadieron 5 \mug de pcDNA 3.1/ciclina D1 (2
mg/ml) y 5 \mug de DNA portador genómico de ratón (Clontech) (100
\mug/ml) a 172,5 \mul de agua destilada estéril. Se añadieron
25 microlitros de CaCl_{2} 2,5 M a la solución de DNA, dando un
volumen final de 250 \mul. Como vector de control, se añadieron 5
\mug de DNA vector pneo (1,126 mg/ml) junto con 5 \mug de DNA
portador, a 170,5 \mul de agua estéril, seguidos por 25 \mul de
CaCl_{2} 2,5 M. Como control falso, se añadieron 25 \mul de
CaCl_{2} 2,5 M a 225 \mul de agua. Se añadieron gota a gota las
soluciones de DNA a un volumen igual (250 \mul) de 2X HBS (NaCl
280 mM, KCl 10 mM, NaHPO_{4}.2H_{2}O 1,5 mM, dextrosa 0,2 mM,
HEPES 50 mM, pH 7,05), a través del cual se borboteaba
constantemente aire. Las soluciones DNA/HBS se incubaron a la
temperatura ambiente durante 30 minutos. Se separó el medio de las
placas de células CHO y se añadieron gota a gota las soluciones
DNA/HBS (500 \mul de volumen total por cápsula). Se trataron un
total de 3 placas con pcDNA 3.1/ciclina D1, y una sola placa en cada
caso para el vector y los controles falsos para cada línea de
células. Las células se incubaron a la temperatura ambiente durante
30 minutos, después de lo cual se añadieron a cada cápsula 5 ml de
medio completo. Se incubaron luego las células durante una noche a
37ºC. Al día siguiente, se reemplazó el medio con medio nuevo.
Las células CHO(SF) alcanzaron la
confluencia 48 horas después de la transfección. Las células se
tripsinizaron y se extendieron de nuevo en placas en medio completo
a una relación de 1 x cápsula de 60 mm a 8 x cápsulas de 100 mm.
Al día siguiente, se reemplazó el medio con medio completo que
contenía 1 mg/ml de Geneticina (G418) (Gibco/BRL). Las células
AM-1 CHO alcanzaron la confluencia 72 horas después
de la trascripción, y se extendieron de nuevo en placas
análogamente. El medio existente sobre las células se reemplazó con
medio nuevo completo + G418 dos veces a la semana. Diez días después
de la adición inicial del medio selectivo de G418, se aislaron
colonias de las placas transfectadas con ciclina D1 de
CHO(SF) y AM-1 CHO utilizando cilindros de
clonación de vidrio (Bellco). Las células se tripsinizaron y
sembraron de nuevo en placas de 24 pocillos. La frecuencia de
transfección de las células CHO(SF) era mucho mayor (> 100
colonias/placa) que la de las células AM-1 CHO
(20-30 colonias/placa). Se aislaron un total de 72
colonias de las placas CHO(SF)/ciclina D1, y 68 colonias de
las placas AM-1 CHO/ciclina D1. No estaba presente
colonia alguna en ninguna de las series de cápsulas de control
falso que contenían medio selectivo G418. Después que se hubieron
seleccionado las colonias, las células restantes de cada serie de
placas se tripsinizaron y combinaron en cultivos agrupados en placas
de 100 mm (3 agrupaciones para CHO(SF)/ciclina D1, y 2
agrupaciones para AM-1 CHO/ciclina D1).
Las células transfectadas se cultivaron hasta
confluencia y se re-extendieron luego en placas de 6
pocillos, 2 pocillos por clon/agrupación. Después de alcanzar la
confluencia, un solo pocillo de células por cada clon/agrupación se
lisó con 250 ml de tampón de lisis de Triton al 1% (1% Triton X100,
NaVO_{3} 1 mM, Tris/HCl 50 mM, de pH 8, NaCl 100 mM, inhibidores
de proteasa). Los lisados se centrifugaron a 14 K durante 15
minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se guardaron a -20ºC. Se
analizaron los lisados por transferencia Western para la expresión
de ciclina D1. Se mezclaron 25 \mul de cada muestra más muestras
de control de las líneas CHO(SF) y AM-1 CHO
maternas con 5 \mul de tampón de muestra de gel 5X PAGE, se
hirvieron 3 minutos, y se cargaron sobre geles Novex
Tris-glicina al 12%. Los geles se sometieron a
electrotransferencia sobre filtros de nitrocelulosa de 0,2 \mu
(Schleicher and Schuell). Los filtros se sondaron con anticuerpo
monoclonal Ab-3 anti-ciclina D1
(Calbiochem) y se revelaron utilizando reactivos Amersham ECL. Los
resultados indicaron grados variables de sobreexpresión de la
ciclina D1 en los cultivos de agrupación y la mayoría de los
clones.
\newpage
Los dos cultivos de agrupación
AM-1 CHO/ciclina D1 y los dos cultivos de agrupación
CHO(SF)/ciclina D1 de expresión máxima se combinaron en
"agrupaciones maestras" para cada línea de células a utilizar
en las transfecciones subsiguientes. Los cultivos de agrupaciones
maestras se ensayaron para determinar si habían retenido el fenotipo
DHFR negativo por cultivo de las células en medio selectivo exento
de hipoxantina/timidina (DMEM), suero bovino fetal dializado al 5%
(Hiclone), aminoácidos no esenciales,
glutamina/penicilina/estreptomicina). No se detectó en este medio
crecimiento alguno de células.
Cultivos de agrupaciones maestras de
CHO(SF)/ciclina D1 y AM-1 CHO/ciclina D1 se
mantuvieron en medio CHOd^{-} completo complementado con 1 mg/ml
de G418. Estas células se sembraron en placas de 60 mm a razón de 8
x 10 e5 células/cápsula y se incubaron durante una noche. Las
células se transfectaron utilizando el protocolo anterior con pSW19
(un derivado directo de pDSR\alpha2)/DNA diana de EPO, DNA control
del vector pDSR\alpha2, y DNA portador de esperma de arenque
(Gibco/BRL). Se utilizó una concentración final de 5 \mug/cápsula
de pSW19/DNA de EPO. Veinticuatro horas después de la transfección,
se proporcionó a las células medio nuevo. Setenta y dos horas
después de la transfección, se tripsinizaron las células y se
extendieron de nuevo en placas de medio selectivo + 1 mg/ml de G418
en una relación de 1:8, 1:10, y 1:20 (placa de 60 mm a placas de
100 mm). El medio existente sobre las células se reemplazó dos veces
por semana con medio nuevo que contenía G418. 12 días después de la
nueva extensión en placas, se aislaron 48 colonias de las placas
transfectadas con CHO(SF)/ciclina D1/EPO. Las células
permanentes se tripsinizaron y se combinaron en dos cultivos de
agrupación. 15 días después de la re-extensión en
placas, se aislaron 48 colonias de las placas transfectadas con
AM-1 CHO/ciclina D1/EPO, y las células restantes se
combinaron en dos agrupaciones. La expresión de EPO se analizó por
transferencia Western sobre cosechas en medio acondicionado exento
de suero a partir de cultivos confluentes de 24 pocillos de clones
aislados o cultivos en placa de 100 mm de las agrupaciones. Los
geles se pasaron en condiciones reductoras, y se sondaron las
transferencias con el anticuerpo monoclonal 2D8
anti-EPO.
Se llevaron a cabo transfecciones de la
construcción pSW19/OPG DNA en agrupaciones maestras CHOd^{-}
(SF)/
ciclina D1 y AM-1 CHOd^{-}/ciclina D1, y la línea materna CHOd^{-} (SF) de la misma manera que las transfecciones de EPO. Se realizaron dos transfecciones separadas de OPG-Fc (22-201) en la totalidad de las 3 líneas de células hospedadoras. Se seleccionaron un total de 124 colonias CHO(SF), 110 colonias CHO(SF)/cycD, y 147 colonias AM-1 CHO/cycD de las transfecciones OPG-Fc (22-201). Se analizó la expresión de OPG en los clones y agrupaciones resultantes por transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-huIgG-Fc-HRP (Pierce), o anti-huOPG policlonal de conejo purificado por afinidad.
ciclina D1 y AM-1 CHOd^{-}/ciclina D1, y la línea materna CHOd^{-} (SF) de la misma manera que las transfecciones de EPO. Se realizaron dos transfecciones separadas de OPG-Fc (22-201) en la totalidad de las 3 líneas de células hospedadoras. Se seleccionaron un total de 124 colonias CHO(SF), 110 colonias CHO(SF)/cycD, y 147 colonias AM-1 CHO/cycD de las transfecciones OPG-Fc (22-201). Se analizó la expresión de OPG en los clones y agrupaciones resultantes por transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-huIgG-Fc-HRP (Pierce), o anti-huOPG policlonal de conejo purificado por afinidad.
Se sembraron células en placas de 100 mm y se
dejaron crecer hasta aproximadamente 50% de la confluencia. Las
células deben encontrarse en la fase logarítmica para el ensayo. Las
células se cosecharon por tripsinización y se pipetearon en un tubo
de centrífuga que contenía un volumen igual de DMEM/FBS. Se contó
una parte alícuota de la suspensión de células con un
hemocitómetro. La densidad de células debe ser aproximadamente
10^{6}-10^{7} células/5 ml.
Las células se redujeron a un sedimento por centrifugación a 1000 x g y se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. Las células tienen que encontrarse en una suspensión de células aisladas. Se añadieron 0,5 ml de PBS y la suspensión de células se agitó enérgicamente. Las células se fijaron luego por adición de 2 ml de etanol al 70% gota a gota a lo largo de las paredes del tubo mientras se mezclaba cuidadosamente la suspensión de células. El tiempo de fijación mínimo es 30 minutos. (En este punto, la suspensión de células puede guardarse durante aproximadamente 2 semanas a 4ºC antes de la tinción y el análisis.) Las células se centrifugaron para separar el sobrenadante de etanol, se lavaron una sola vez con PBS y se dejaron rehidratar durante 5 minutos a 4ºC. Se centrifugaron las células, se retiró el PBS, y el pelet se resuspendió en 0,5 ml de solución de yoduro de propidio (Molecular Probes) (50 \mug/ml preparado en PBS). Se añadieron 10 \mul de RNasa exenta de DNasa (10 mg/ml) (Boehringer Mannheim) y la suspensión de células se incubó a 37ºC durante 20 minutos. Se diluyeron las muestras con 1 ml de PBS y se analizaron por FACS en el transcurso de una hora.
Las células se redujeron a un sedimento por centrifugación a 1000 x g y se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. Las células tienen que encontrarse en una suspensión de células aisladas. Se añadieron 0,5 ml de PBS y la suspensión de células se agitó enérgicamente. Las células se fijaron luego por adición de 2 ml de etanol al 70% gota a gota a lo largo de las paredes del tubo mientras se mezclaba cuidadosamente la suspensión de células. El tiempo de fijación mínimo es 30 minutos. (En este punto, la suspensión de células puede guardarse durante aproximadamente 2 semanas a 4ºC antes de la tinción y el análisis.) Las células se centrifugaron para separar el sobrenadante de etanol, se lavaron una sola vez con PBS y se dejaron rehidratar durante 5 minutos a 4ºC. Se centrifugaron las células, se retiró el PBS, y el pelet se resuspendió en 0,5 ml de solución de yoduro de propidio (Molecular Probes) (50 \mug/ml preparado en PBS). Se añadieron 10 \mul de RNasa exenta de DNasa (10 mg/ml) (Boehringer Mannheim) y la suspensión de células se incubó a 37ºC durante 20 minutos. Se diluyeron las muestras con 1 ml de PBS y se analizaron por FACS en el transcurso de una hora.
La amplificación de genes en las células se
llevó a cabo por la adición gradual escalonada de metotrexato (MTX)
al medio de cultivo. Las células se subcultivaron en una relación de
1:10 en placas de 100 mm a 3 concentraciones bajas de metotrexato
(1 nM, 2,5 nM, y 5 nM). El crecimiento de las células se monitorizó
y la placa que alcanzó la confluencia en primer lugar se utilizó
para la tanda de amplificación siguiente. Si las células crecían
igualmente bien en más de una concentración de metotrexato, se
utilizó para la tanda siguiente la concentración máxima. Se tomó
una cosecha de DMEM exenta de suero a las 48 horas (4 ml/placa) para
el análisis del nivel de expresión de proteínas por transferencia
Western o EIA. Se dejó que las células se recuperaran en medio
completo con metotrexato durante 24 horas y se subcultivaron luego
en una relación 1:10 en 3 concentraciones de metotrexato más altas.
La concentración de MTX se aumentó en incrementos de 10 nM hasta 100
nM. En general, si el nivel de expresión de proteínas no ha
alcanzado un pico para 100 nM, se continúa la amplificación en
incrementos de 100 nM hasta que se alcanza un nivel de expresión
máximo. Las células se mantuvieron en presencia de MTX una vez que
se había determinado la concentración óptima.
La línea de células AM-1/D se
derivó de la línea de células CHOd(-) descrita en el documento U.S.
Pat. No. 4703008, expedido el 27 de octubre de 1987 y en Urlaub
et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4461. La
línea de células CHOd(-) se adaptó por paso en el medio
VM-SOY con niveles decrecientes de suero de bovino
fetal y finalmente ausencia total del mismo. La línea de células
AM-1 adaptada y exenta de suero resultante retiene
todavía el fenotipo dhfr(-). La línea de células
AM-1 se modificó por ingeniería genética para
sobre-expresar la ciclina D1 humana.
Se transfectó pcDNA 3.1/ciclina D1 en la línea
de células AM-1 por el procedimiento estándar de
precipitación con fosfato de calcio para la transfección. Después
de selección con G418, las colonias se tripsinizaron y se
combinaron en dos agrupaciones. La expresión de la proteína ciclina
D1 humana se demostró por transferencias Western (Figura 1) de los
lisados de células preparados a partir de las agrupaciones
utilizando un anticuerpo humano específico de la ciclina D1
(AP-3 anti-ciclina D1, Calbiochem).
Se seleccionaron aleatoriamente varias colonias con anillos de
clonación y se prepararon y se analizaron asimismo los lisados de
células. La expresión de la ciclina D1 humana era variable entre
los clones, como era de esperar. En comparación con los clones, las
dos agrupaciones exhibían niveles globales elevados de la proteína
ciclina D1 humana (Figura 1). Se combinaron las dos agrupaciones en
un cultivo de agrupación maestra (AM-1/D), que fue
la línea de células materna utilizada en todos los experimentos
subsiguientes.
Se comprobó que la ciclina D1 humana se
expresaba funcionalmente por su alteración de la dinámica del ciclo
celular; véase, por ejemplo, la Figura 2 y más adelante.
Células no sincronizadas procedentes de las
líneas de células AM-1/D y AM-1 se
tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron por FACScan (Becton
Dickinson). Las Figuras 2A-2D muestran el contenido
relativo de DNA (eje x) y el número de células (eje y). Había
significativamente más células en la fase S para las células
AM-1/D (40,08%, 40,14%) en comparación con las
células AM-1 (33,73%, 32,25%). Esto demostró que la
sobreexpresión de la ciclina D1 humana en la línea de células
AM-1/D, una línea de células de CHO, era funcional
dado que alteraba significativamente la dinámica del ciclo
celular.
Se construyó el plásmido
pDSR\alpha2/OPG-Fc para expresar una proteína de
fusión de OPG humana (acceso a GenBank #U94332)-Fc
con el vector de expresión pDSR\alpha2. Utilizando la
precipitación estándar con fosfato de calcio, se transfectó DNA
linealizado de pDSR\alpha2/OPG-Fc en paralelo en
células AM-1/D y células originales
AM-1 no modificadas. Se seleccionaron aleatoriamente
44 colonias de cada transfección después de poner las células en
medios selectivos que carecían de los suplementos HT durante 2
semanas.
Las colonias se transfirieron individualmente a
placas de 24 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia.
Después de 48 horas, se recogieron medios acondicionados exentos de
suero y se analizaron por EIA utilizando antisuero específico para
OPG humana. La Figura 3 muestra el número de clones que expresaban
OPG-Fc a diversos niveles a partir de estas dos
líneas de células. Está claro que existen significativamente más
clones procedentes de las líneas de células AM-1/D
que expresaban niveles más altos de la proteína recombinante, y que
la totalidad de los clones de expresión más alta que expresaban más
de 20 mg/ml de OPG-Fc se derivaban de la línea de
células AM-1/D.
Se construyó el plásmido pDSR\alpha2/hEpo para
expresar el gen Epo humano y se transfectó a células
AM-1/D siguiendo el método del fosfato de calcio
arriba descrito. Se seleccionaron aleatoriamente 48 colonias para
análisis ulterior. Cuatro de los clones de expresión alta se
identificaron por análisis EIA de los medios acondicionados y se
sometieron a amplificación con metotrexato comenzando a 1 nM. La
Figura 4 muestra la expresión de EPO durante el proceso de
amplificación. Dos de los clones, el clon 2 AM-1/D y
el clon 33 AM-1/D exhibían producción elevada de
Epo con concentraciones crecientes de MTX, demostrando una
amplificación con éxito del gen. Estos clones se ensayaron después
de congelación-descongelación, y pasadas extensas
sin pérdida alguna de la expresión de Epo, demostrando la
estabilidad de la expresión del gen Epo en estos clones.
Se comparó la expresión de dos construcciones de
OPG en células AM-1/ciclina D CHO y otras líneas de
células CHO. Se transfectó
OPG(22-201)-Fc en células
AM-1/ciclina D CHO y la línea de células CHO
materna, que se había adaptado previamente para crecer en medio
exento de suero [CHO(SF)]. Se transfectó
OPG(22-194)\cdotcys-Fc
en células AM-1/ciclina D CHO y en su línea de
células materna AM-1 CHO. Las transfecciones se
llevaron a cabo utilizando el método estándar de fosfato de calcio
y selección con DHFR. Las colonias transfectadas se aislaron
utilizando cilindros de clonación de vidrio. Las colonias
individuales se dejaron crecer hasta confluencia de placas de 24
pocillos. Se analizaron cosechas de medio acondicionado exento de
suero respecto a OPG secretado por transferencia Western utilizando
un antisuero policlonal contra OPG. Muestras de medio acondicionado
procedentes de los clones que exhibían los niveles máximos de
expresión por transferencia Western se realizaron ulteriormente por
ELISA. Se compararon los niveles de expresión de
OPG(22-194)-cys-Fc
en 46 clones individuales derivados de células AM-1
CHO o células AM-1/ciclina D CHO (Figura 5). Se
comparó también la expresión de
OPG(22-201)-Fc en los 24
clones que exhibían el nivel de expresión máximo como se ha descrito
previamente por transferencia Western (Figura 6). En cada caso, los
clones derivados de la línea de células AM-1/ciclina
D CHO exhiben niveles de expresión significativamente mayores que
los clones derivados de las células CHO(SF) o
AM-1 CHO.
Se transfectó DNA de NESP insertado en el vector
de expresión pDSR\cdot2 por el método estándar del fosfato de
calcio en tres líneas de células CHOd^{-} diferentes adaptadas
exentas de suero: CHOd^{-}(SF), AM-1, y
AM-1/ciclina D. Las operaciones de transfección,
selección y aislamiento de los clones se llevaron a cabo en medio
que contenía suero en cultivo adherente. Los clones que expresaban
niveles altos de NESP se identificaron inicialmente por
transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal para EPO.
La cuantificación de la expresión se realizó por EIA. Los clones de
expresión máxima de cada línea de células se ensayaron respecto a
crecimiento en cultivo de suspensión en medio exento de suero. Los
clones se sometieron también a amplificación del DNA por
crecimiento en concentraciones gradualmente crecientes de
metotrexato en medio que contenía suero en cultivo adherente. La
expresión de NESP durante el proceso de amplificación se monitorizó
por transferencia Western y análisis EIA. En diversas etapas
durante el proceso de amplificación, se analizaron los clones
respecto a crecimiento y expresión en cultivo de suspensión exento
de suero. Los clones derivados de la línea de células
AM-1/ciclina D CHO tenían un nivel global de
expresión de NESP mayor que los derivados de las otras dos líneas
de células CHO maternas (Figura 7). Los clones se analizaron también
por enfoque isoeléctrico para determinar la distribución de
isoformas. No se observó diferencia significativa alguna en las
distribuciones de isoformas en los diversos clones o en una línea
de células de control (61L) derivada de la línea de células CHO
materna (Figura 8).
Las abreviaturas utilizadas a lo largo de esta
memoria descriptiva se definen como sigue:
- CHO
- Ovario de hámster chino
- EBV
- Virus Epstein-Barr
- EIA
- Inmunoensayo enzimático
- EPO
- Eritropoyetina
- HBS
- Solución salina tamponada con HEPES
- MTX
- Metotrexato
- NESP
- Nueva proteína estimulante de la eritropoyesis
- OPG
- Osteoprotegerina.
Claims (25)
1. Una célula eucariota aislada que
comprende:
- a)
- un ácido nucleico insertado que codifica un producto génico de ciclina D, en donde el producto génico de ciclina D se expresa funcionalmente en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo; y
- b)
- un ácido nucleico insertado que codifica una proteína de interés, en donde la proteína de interés se expresa en la célula a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo.
2. La célula de la reivindicación 1 en donde la
célula es una célula de mamífero.
3. La célula de la reivindicación 1 en donde la
célula es una célula CHO.
4. La célula de la reivindicación 3 en donde la
célula está adaptada a medio exento de suero.
5. La célula de la reivindicación 1 en donde la
célula es una célula AM-1.
6. La célula de la reivindicación 1 en donde el
producto génico de ciclina D comprende una ciclina D1 de
mamífero.
7. La célula de la reivindicación 1 en donde el
producto génico de ciclina D comprende una ciclina D humana.
8. La célula de la reivindicación 1 en donde el
producto génico de ciclina D comprende una ciclina D1 humana.
9. La célula de la reivindicación 1 en donde la
proteína de interés es una proteína afín a EPO, una proteína afín a
OPG, o una proteína afín a leptina.
10. La célula de la reivindicación 1 en donde la
proteína de interés es EPO, OPG, OPG-Fc, leptina o
Fc-leptina.
11. Un proceso para producir una proteína de
interés, que comprende:
- A.
- crear una célula eucariota aislada que expresa:
- 1.
- un producto génico de ciclina D a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo; y
- 2.
- una proteína de interés a un nivel mayor que cualquier nivel de expresión nativo;
- por introducción de un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA para la proteína de interés e introducción de un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA para el producto génico de ciclina D;
- B.
- cultivar la célula en condiciones que permiten la expresión de la proteína de interés y la expresión funcional del producto génico de ciclina D, y
- C.
- aislar la proteína de interés.
12. El proceso de la reivindicación 11, en donde
la célula es una célula de mamífero.
13. El proceso de la reivindicación 11 en donde
la célula es una célula CHO.
14. El proceso de la reivindicación 13 en donde
la célula está adaptada a medios exentos de suero.
15. El proceso de la reivindicación 11 en donde
la célula es una célula AM-1.
16. El proceso de la reivindicación 11 en donde
el producto génico de ciclina D comprende una ciclina D1 de
mamífero.
17. El proceso de la reivindicación 11 en donde
el producto génico de ciclina D comprende una ciclina D humana.
18. El proceso de la reivindicación 11 en donde
el producto génico de ciclina D comprende una ciclina D1
humana.
19. El proceso de la reivindicación 11 en donde
la proteína de interés es una proteína afín a EPO, una proteína
afín a OPG, o una proteína afín a leptina.
20. El proceso de la reivindicación 19 en donde
la proteína de interés es EPO, OPG, OPG-Fc,
leptina o Fc-leptina.
21. La célula de la reivindicación 1, en donde
la proteína de interés tiene una secuencia extraña al genoma de la
célula.
22. El proceso de la reivindicación 11, en donde
la proteína de interés tiene una secuencia extraña al genoma de la
célula.
23. El proceso de la reivindicación 11, en donde
la proteína de interés se inserta en la célula por transfección.
24. El proceso de la reivindicación 11 ó 23, en
donde el producto génico de ciclina D se inserta en la célula por
transfección.
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