JP2011527567A - 動物細胞用組み換え発現ベクター - Google Patents
動物細胞用組み換え発現ベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011527567A JP2011527567A JP2011517345A JP2011517345A JP2011527567A JP 2011527567 A JP2011527567 A JP 2011527567A JP 2011517345 A JP2011517345 A JP 2011517345A JP 2011517345 A JP2011517345 A JP 2011517345A JP 2011527567 A JP2011527567 A JP 2011527567A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dhfr
- vector
- promoter
- expression vector
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
- C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【選択図】図3a
Description
DHFRプロモーターに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、以下のような方法で行った。
1)遺伝子導入
COS7細胞(ATCC、米国)を、牛胎児血清が10%添加されたDMEM培養培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium; GIBCO BRL、米国)に接種して、37℃、 5% CO2恒温器で継代培養した。前記細胞を100mm培養皿に1×106cells/mLの濃度で接種して、37℃で一晩中培養した後、OPTI−MEM I(osteogenic media I; GIBCO BRL、米国)溶液で3回洗浄した。一方、上記で製造したベクターpGL2−Basic、pGL2−DHFR、pGL2−SV40P(Promoter)及びpGL2−SV40 P/E(Promoter/Enhancer)をそれぞれ5μgずつ取って、OPTI−MEM I 500μLで希釈して、25μLのリポフェクタミン(Lipofectamine, GIBCO BRL社、米国)も同様にOPTI−MEM I 500μLで希釈した。前記発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を15mLチューブに混合してDNA−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを15分間以上室温で放置した。上記それぞれのDNA−リポフェクタミン混合物に5mLのOPTI−MEM Iを添加して、これをきれいに洗浄されたCOS7細胞に均一に混合した後、37℃、5% CO2恒温器で48時間培養した。
それぞれのベクターに挿入されたプロモーターの活性を比較するために、各ベクターにより発現されるルシフェラーゼ量を測定した。ベクターが導入されてから48時間培養した細胞を5mLのPBSで洗浄した後、再び1mLのPBSを入れて、スクレーパーを利用し細胞を集めた。集められた細胞を4,000rpm、4℃で5分間遠心分離して上澄液を除去した。細胞を溶解させるために、上澄液の除去後、250mM Tris(pH 7.8)/1mM DTT(Dithiothreitol)溶液を50μL添加した後、液体窒素に1分間浸した後、再び37℃で1分間放置する過程を3回繰り返した。その後、13,000rpm、4℃で15分間遠心分離し、細胞が除去された上澄液のみを取って、−20℃に保管した。
DHFR遺伝子をクローニングするために、ヒトの血液から、ゲノムDNA分離キット(Intron、大韓民国)を使用してヒトのゲノムDNAを分離した。純粋分離したヒトゲノムDNAを鋳型として、PCRによりDHFR遺伝子を増幅した。
pJK−DHFR−1ベクターのDHFRプロモーターをさらに短くして、pJK−DHFR−2ベクターを製造した。PCR合成は、実施例3と同様の方法で行った。pJK−DHFR−1ベクターを鋳型として、P10及びP7プライマー対でPCR法を使用しDHFRプロモーター及びDHFR遺伝子を合成した。プライマーの塩基配列とPCRで増幅されたDNA断片の大きさは、上記表1に示す。
pJK−DHFR−1と比較し、DHFR遺伝子が逆方向に挿入されたベクターであるpJK−DHFR−Or2を製作する方法は、以下のようである。上記の実施例3のように、PCRによりDHFRプロモーターと遺伝子を増幅して、pJK−DHFR−1ベクターをBglIIで開環し、合成したプロモーターと遺伝子をBamHIで処理して挿入した後、pJK−DHFR−1と比較し、DHFR遺伝子が逆方向に挿入されたベクターをスクリーニングして、pJK−DHFR−Or2を製作した(図5)。
pJK−DHFR−1ベクターを活用して、以下のように抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をクローニングするためのベクターであるpJKIgベクターを製造した。
pJK−DHFRベクターを使用するために、pJK−DHFR−1とpJK−DHFR−Or2ベクターをそれぞれEcoRI及びXbaI制限酵素で処理し、ヒト由来TNF−R(tumor necrosis factor−receptor)及びIDS(iduronate−2−sulfatase)酵素をコードするcDNAを挿入した。pJKIg−GS051 H/Kベクターは、前記pJKIg−RSV HKベクターの重鎖領域をEcoRI及びApaI制限酵素で切断した後、GS051抗体の重鎖領域をコードするcDNAを挿入して、軽鎖領域をHindIII及びBsiWI制限酵素で切断した後、GS051抗体の軽鎖領域を暗号化するcDNAを挿入して製造した。また、上記のような方法でGS071抗体を発現するpJKIg−GS071 H/Kベクターを製造した。
Claims (10)
- (a)配列番号1または配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むジヒドロ葉酸還元酵素(Dihydrofolate reductase:DHFR)プロモーター、及び(b)前記プロモーターに作動的に連結されたDHFR−コーディングヌクレオチド配列を含むことを特徴とするdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記DHFRプロモーターが、マウス由来であり、DHFR−コーディングヌクレオチド配列が、ヒト由来である請求項1に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記動物細胞が、CHO(Chinese hamster ovary)細胞である請求項1に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、外来遺伝子ヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記外来遺伝子ヌクレオチド配列の上流に、真核細胞で作動可能なプロモーター配列が結合されている請求項1に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、図3aの遺伝子地図を有する請求項1に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、KCTC 11299BPとして寄託されたベクターである請求項6に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、KCTC 11300BPとして寄託されたベクターである請求項6に記載のdhfr−動物細胞用組み換え発現ベクター。
- 請求項1から8のいずれかに記載のベクターにより形質転換された動物細胞。
- (a)請求項9に記載の動物細胞をメトトレキサートの添加下で培養する工程と、
(b)前記工程(a)の培養結果物から目的蛋白質を精製する工程と、
を含む目的蛋白質の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2008-0066771 | 2008-07-10 | ||
KR1020080066771A KR101030978B1 (ko) | 2008-07-10 | 2008-07-10 | 동물세포용 재조합 발현벡터 |
PCT/KR2009/003714 WO2010005227A2 (ko) | 2008-07-10 | 2009-07-07 | 동물세포용 재조합 발현벡터 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011527567A true JP2011527567A (ja) | 2011-11-04 |
JP5514818B2 JP5514818B2 (ja) | 2014-06-04 |
Family
ID=41507570
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011517345A Active JP5514818B2 (ja) | 2008-07-10 | 2009-07-07 | 動物細胞用組み換え発現ベクター |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8426570B2 (ja) |
EP (1) | EP2314701B1 (ja) |
JP (1) | JP5514818B2 (ja) |
KR (1) | KR101030978B1 (ja) |
CN (1) | CN102177239B (ja) |
AU (1) | AU2009270108B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0915734A2 (ja) |
CA (1) | CA2733119C (ja) |
WO (1) | WO2010005227A2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI541252B (zh) * | 2010-10-26 | 2016-07-11 | 韓美科學股份有限公司 | 因子vii/viia之量產方法 |
JP2016527911A (ja) | 2013-08-20 | 2016-09-15 | レック・ファーマシューティカルズ・ディー・ディーLek Pharmaceuticals D.D. | ポリペプチドのα−アミド化および/またはC末端アミノ酸開裂を制御するための細胞培養用培地およびプロセス |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63273481A (ja) * | 1987-02-04 | 1988-11-10 | インヴィトロン コーポレーション | 増幅された外来遺伝子の発現を促進する方法 |
WO1996004388A1 (en) * | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
WO2005047512A2 (en) * | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Shering Corporation | Plasmid system for multigene expression |
WO2008048037A1 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | A novel vector and expression cell line for mass production of recombinant protein and a process of producing recombinant protein using same |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4656134A (en) | 1982-01-11 | 1987-04-07 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Gene amplification in eukaryotic cells |
US5011795A (en) | 1983-01-19 | 1991-04-30 | Genentech, Inc. | Human tPA production using vectors coding for DHFR protein |
WO1990006363A1 (en) * | 1988-12-08 | 1990-06-14 | Damon Biotech, Inc. | Expression induction method employing mutant dhfr gene |
US5736137A (en) * | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US7846724B2 (en) | 2006-04-11 | 2010-12-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies |
EP2162472B1 (en) * | 2007-05-30 | 2013-02-27 | Postech Academy-Industry- Foundation | Immunoglobulin fusion proteins |
-
2008
- 2008-07-10 KR KR1020080066771A patent/KR101030978B1/ko active IP Right Grant
-
2009
- 2009-07-07 CN CN200980126484.1A patent/CN102177239B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-07-07 WO PCT/KR2009/003714 patent/WO2010005227A2/ko active Application Filing
- 2009-07-07 US US13/002,814 patent/US8426570B2/en active Active
- 2009-07-07 EP EP09794633.9A patent/EP2314701B1/en not_active Not-in-force
- 2009-07-07 AU AU2009270108A patent/AU2009270108B2/en not_active Ceased
- 2009-07-07 BR BRPI0915734-4A patent/BRPI0915734A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-07-07 CA CA2733119A patent/CA2733119C/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-07-07 JP JP2011517345A patent/JP5514818B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63273481A (ja) * | 1987-02-04 | 1988-11-10 | インヴィトロン コーポレーション | 増幅された外来遺伝子の発現を促進する方法 |
WO1996004388A1 (en) * | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
WO2005047512A2 (en) * | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Shering Corporation | Plasmid system for multigene expression |
WO2008048037A1 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | A novel vector and expression cell line for mass production of recombinant protein and a process of producing recombinant protein using same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20100006800A (ko) | 2010-01-22 |
EP2314701A4 (en) | 2012-03-07 |
JP5514818B2 (ja) | 2014-06-04 |
BRPI0915734A2 (pt) | 2015-08-04 |
CA2733119C (en) | 2014-04-08 |
AU2009270108A1 (en) | 2010-01-14 |
CA2733119A1 (en) | 2010-01-14 |
WO2010005227A8 (ko) | 2010-06-24 |
WO2010005227A2 (ko) | 2010-01-14 |
AU2009270108B2 (en) | 2013-10-24 |
CN102177239A (zh) | 2011-09-07 |
CN102177239B (zh) | 2014-06-04 |
EP2314701B1 (en) | 2015-07-29 |
US20110117643A1 (en) | 2011-05-19 |
KR101030978B1 (ko) | 2011-04-28 |
WO2010005227A3 (ko) | 2010-04-22 |
EP2314701A2 (en) | 2011-04-27 |
US8426570B2 (en) | 2013-04-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7195915B2 (en) | Vectors for animal cells and use thereof | |
CN102165060B (zh) | 新的调控组件 | |
EP3059319A1 (en) | Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same | |
EP3088527B1 (en) | Expression vector having improved ability to express gene | |
JP2012070744A (ja) | 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系 | |
US9260721B2 (en) | Expression vector and methods of producing high levels of proteins | |
US20200283818A1 (en) | Methods and compositions for expression of polypeptides in a cell | |
JP5514818B2 (ja) | 動物細胞用組み換え発現ベクター | |
WO2014092094A1 (ja) | 発現カセット | |
WO2020204055A1 (ja) | 標的特異的な外来遺伝子の導入方法 | |
BRPI0915734B1 (pt) | Vetor de expressão recombinante para células animais dhfr- e processo para a preparação de uma proteína-alvo | |
JP2022511077A (ja) | マトリックス付着領域および遺伝子発現の促進における使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130319 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130619 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130626 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130719 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130726 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130819 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130826 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130918 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140304 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140331 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5514818 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |