JP2022511077A

JP2022511077A - マトリックス付着領域および遺伝子発現の促進における使用

Info

Publication number: JP2022511077A
Application number: JP2021532047A
Authority: JP
Inventors: ゴエル、ニヒル
Original assignee: セルテオンコーポレイション
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2022-01-28
Also published as: WO2020118169A1; KR20210113222A; US20220017916A1; CN113383081A; EP3891288A4; EP3891288A1; AU2019395023A1; CA3161115A1

Abstract

本開示は新規に同定されたマトリックス付着領域（ＭＡＲ）およびキメラ配列に関する。タンパク質の最適な発現のためにタンパク質をコードする配列に対して適切な位置にあるＭＡＲを含むヌクレオチド構築物も開示される。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年１２月７日に出願された米国仮出願第６２／７７６，６４３号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）のもとに主張し、この内容は、その全体が参照により本開示に引用される。

遺伝子配列の転写（すなわち、ｍＲＮＡの生産）は、多くの異なるレベルで制御される。転写開始部位またはプロモーターは、複数の異なる強度を有し、所与の遺伝子の転写の開始の頻度は、エンハンサー配列によって増加させることもできる。転写中の一時停止は、転写の速度、ひいては、所与の期間内に生産される転写産物の量に影響を及ぼし得る。また、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング、ポリアデニル化および切断の速度は、転写単位によって生産されるｍＲＮＡの量に影響を及ぼし得る。更に、ｍＲＮＡ分子内の配列は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、および、ｍＲＮＡのターンオーバーの速度（すなわち、細胞質内安定性）を調節し得る。

インビトロにおけるポリペプチド（例えば、治療用抗体、成長因子）の発現は、医薬品業界にとって重要であり、タンパク質発現を最大化する方法が必要とされている。

本開示は、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）の強度を評価するための新規の技術を説明し、当該技術が、これまでには知られていない新規のＭＡＲ配列を同定するために有用であることを示す。キメラＭＡＲ配列も説明される。

また、本開示は、シスＭＡＲ配置を含むヌクレオチド構築物、および目的遺伝子（ＧＯＩ）の最適な発現のための関連する他の配列を説明する。

従って、本開示の一実施形態によれば、提供されるのは、コード配列と、コード配列の転写を開始するように構成されたプロモーターと、配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から成る群より選択されるマトリックス付着領域（ＭＡＲ）コアとを含む、組換えポリヌクレオチドであり、ここで、ＭＡＲコアは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である。

別の実施形態は、細胞にコード配列をトランスフェクトする方法を提供し、当該方法は、細胞を、第１ポリヌクレオチド、および連結されていない第２ポリヌクレオチドに接触させる段階を備え、第１ポリヌクレオチドは、コード配列と、コード配列の転写を開始するプロモーターとを含み、第２ポリヌクレオチドは、配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列より選択されるマトリックス付着領域（ＭＡＲ）コアを含み、ここで、第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドが細胞にトランスフェクトされる条件下で、ＭＡＲコアは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である。

キメラマトリックス付着領域（ＭＡＲ）も提供され、キメラマトリックス付着領域は、（ａ）配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択されるＭＡＲコアであって、哺乳動物核マトリックスに付着することが可能であるＭＡＲコアと、（ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、および３４、ならびに配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、および３４のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される５'フランキング領域と、（ｃ）配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、および３５、ならびに配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、および３５のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される３'フランキング領域とを含み、ここで、ＭＡＲコア、５'フランキング領域および３'フランキング領域は、同じ天然のＭＡＲ由来ではない。

２つのＭＡＲ配列、周知のＭＡＲであるＭＡＲＸ２９（対照として）、および本発明の技術によって同定されたＭＡＲゼブラフィッシュの強度を比較する。

ＭＡＲ配列を全く含まない構築物を対照として使用した、ＭＡＲゼブラフィッシュコアの強度を示す。

実施例２において説明される構築物を含むＭＡＲコアのベクターマップである。

実施例２において説明されているような、ＭＡＲコアエレメントを含まなかった対照構築物のベクターマップである。

Ｉ．定義
すべての数字の表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量（範囲を含む）は、０．１の変化量で＋または－に変動する近似値である。常に明示的に記述されるわけではないが、すべての数字の表示には、「約」という用語が先行することを理解されたい。常に明示的に記述されるわけではないが、本明細書に記載される試薬は例に過ぎず、そのような試薬の同等物は当技術分野において周知であることも理解されたい。

文脈上の別段の明確な記載がある場合を除き、明細書および請求項において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、複数のものに対する言及を含む。例えば、「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のポリヌクレオチド（それらの混合物を含む）を含む。

「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかである、任意の長さの高分子形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造への修飾は、もしそれがある場合、ポリヌクレオチドの構築の前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは重合後、標識成分とのコンジュゲートなどにより、更に修飾され得る。また、この用語は、二本鎖および一本鎖の分子両方を指す。別段の記載がある場合、または、必要である場合を除き、本開示の任意の実施形態のポリヌクレオチドは、二本鎖形と、二本鎖形を形成することが周知である、または、予想される、２つの相補的な一本鎖形の各々とを含む。
ＩＩ．新規のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列

本開示は、インシリコでＭＡＲエレメントの強度を定量化するための方法を説明し、配列データベースから同定された新規のＭＡＲ配列の強度を定量化するためにこの方法を使用した。

本発明者らは、配列比較および構造活性分析によって、転写因子結合モチーフを含む５'および３'フランキング領域と共に、ＭＡＲエレメントが中央ＡＴリッチコア領域で構成される可能性があることを発見した。

コア領域は（ＡＴＡＴ）ｎマイクロサテライトにおいて多く存在し得る。結合モチーフはＳＡＴＢ１、ＮＭＰ４、ＣＥＢＰ、Ｆａｓｔ、およびＨｏｘ転写因子を標的とし得る。ＭＡＲが結合し得る追加の核マトリックスタンパク質は、ＭＡＲ中のコンセンサス配列ＡＴＴＴＣＡ^Ｃ／_ＧＴＴＧＴＡＡＡＡを認識するＡＲＢＰタンパク質（付着領域結合タンパク質）、核マトリックス内にのみ局在するＮＭＰ－２タンパク質、Ｓｐｌ、ＡＴＦ、ＣＣＡＡＴ、Ｃ／ＥＢＰ、およびＡＰ－１転写因子、ＡＲＳエレメントと相互作用する酵母のＡＣＢＰタンパク質（ＡＲＳコンセンサス結合タンパク質）、１つの鎖にＡ、Ｔ、またはＣを有するがＧは有しないＡＴリッチＭＡＲの特定のクラスの副溝に結合する、主として胸腺に発現される組織特異的なヒトＳＡＴＢｌタンパク質、マトリン３タンパク質、ヒトおよびラット細胞の核マトリックス内部ネットワークの酸性タンパク質、マトリンＦ／Ｇ、転写タンパク質因子ＲＦＰを含む。

分析結果は、本発明者らの新規ＭＡＲ配列の調査において助けとなり、陽性参照であるＭＡＲＸ２９（Ａｒｏｐｅｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯＮＥ８（１１）：ｅ７９２６２）と比較して遺伝子発現の促進において非常に効力がある４つの新規のＭＡＲ配列の発見をもたらした。

これらの新規に同定されたＭＡＲ配列のコアが、他のＭＡＲ由来の５'および３'フランキング領域を有する機能的ＭＡＲを形成し、追加の有用なキメラＭＡＲ配列を提供できることが更に示された。

従って、本開示の一実施形態によれば、提供されるのは、コード配列と、コード配列の転写を開始するように構成されたプロモーターと、本明細書に記載されるマトリックス付着領域（ＭＡＲ）コア、およびそのバリアントとを含む、組換えポリヌクレオチドである。そのような新規のＭＡＲコアの例は表１に列挙される。例えば、配列番号１、５、９、および１３を参照されたい。

マトリックス付着領域またはＭＡＲは、核マトリックスが付着する真核生物染色体のＤＮＡにおける配列である。真核生物のゲノムを細胞核内で機能的単位に編成する構築的なＤＮＡ成分として、ＭＡＲは核内のクロマチンの構造的編成を仲介することができる。これらのエレメントは、クロマチン足場に対するＤＮＡの固定点を成し、クロマチンを構造的ドメインに編成するのに役立つ。ＭＡＲエレメントによって仲介されるクロマチンの動的および複雑な編成は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。

ＭＡＲコアのバリアントは、参照ＭＡＲコア（例えば、配列番号１、５、９、および１３）に対して特定の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）を有し、期待されるＭＡＲ機能（例えば、哺乳動物核マトリックスに付着する機能）を有する核酸配列である。

いくつかの実施形態において、ＭＡＲコアのバリアントは、例えば、配列中に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のＡまたはＴを有する、ＡＴリッチである。

ＭＡＲコアは、配列番号２、６、１０、１４、および１８、またはそれらのバリアント（配列番号２、６、１０、１４、および１８のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列）のうちの任意の１つなどのＭＡＲの５'フランキング領域と共に存在することができる。いくつかの実施形態において、５'フランキング領域は、ＭＡＲコアに対して５'であり、かつＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である。

いくつかの実施形態において、ＭＡＲコアは更に、配列番号３、７、１１、１５、および１９、またはそれらのバリアント（配列番号３、７、１１、１５、および１９のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列）のうちの任意の１つなどの、ＭＡＲの３'フランキング領域と共に存在することができる。いくつかの実施形態において、３'フランキング領域は、ＭＡＲコアに対して３'であり、かつＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である。

ＭＡＲコア、５'フランキング領域、および３'フランキング領域を含む非限定的なＭＡＲ配列は、配列番号４、８、１２、および１６、および配列番号、４、８、１２、および１６のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、ここで、ＭＡＲは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である。
ＩＩＩ．キメラＭＡＲ配列

提供されているように、これらの新規に同定されたＭＡＲ配列のコアは、他のＭＡＲ由来の５'および３'フランキング領域を有する機能的ＭＡＲを形成し、追加の有用なキメラＭＡＲ配列を提供できる。

一実施形態において、本開示のキメラＭＡＲは、５'側に５'フランキング領域を有する、本明細書で開示されるＭＡＲコアを含む。一実施形態において、本開示のキメラＭＡＲは、３'側に３'フランキング領域を有する、本明細書で開示されるＭＡＲコアを含む。一実施形態において、本開示のキメラＭＡＲは、５'側に５'フランキング領域、および３'側に３'フランキング領域を有する、本明細書で開示されるＭＡＲコアを含む。

５'フランキング領域は、当技術分野で周知のまたは本明細書で開示される、任意の５'フランキング領域または３'フランキング領域から選択することができる。いくつかの実施形態において、５'フランキング領域は、当技術分野で周知のまたは本明細書で開示される、任意の５'フランキング領域から選択することができる。

３'フランキング領域は、当技術分野で周知のまたは本明細書で開示される、任意の５'フランキング領域または３'フランキング領域から選択することができる。いくつかの実施形態において、５'フランキング領域は、当技術分野で周知のまたは本明細書で開示される、任意の３'フランキング領域から選択することができる。

ＭＡＲコア、ＭＡＲ５'フランキング領域、およびＭＡＲ３'フランキング領域の各々は、核酸バリアント（例えば、参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する）で置換することもできる。

本明細書で開示されるＭＡＲコアは、配列番号１、５、９、および１３を含む。本明細書で開示される５'フランキング領域は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、および３４を含む。本明細書で開示される３'フランキング領域は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、および３５を含む。

いくつかの実施形態において、ここで新規に同定されたＭＡＲフランキング配列はまた、ここで新規に発見されたまたは周知のいずれかの他のコア配列に融合させて、新たなキメラＭＡＲ配列を生成することができる。いくつかの実施形態において、キメラＭＡＲ配列は、表１のＭＡＲコア領域のうちの任意の１つ、表１のＭＡＲ５'フランキング配列のうちの任意の１つ、および表１のＭＡＲ３'フランキング配列のうちの任意の１つを含む。
ＩＶ．遺伝子発現

本明細書で開示されるＭＡＲ配列および構築物は、細胞における遺伝子発現を促進するのに有用であり得る。目的遺伝子が、ＭＡＲ（ＭＡＲ単独または５'および／または３'フランキング領域を有するＭＡＲ）を含む構築物に含まれる場合、構築物は目的遺伝子を発現するために宿主細胞に導入され得る。

本明細書で開示されるＭＡＲ配列はまた、トランス作用エレメントとしてトランスで使用して、遺伝子発現を促進することできる。例えば、本明細書で開示されるＭＡＲ配列（ＭＡＲ単独または５'および／または３'フランキング領域を有するＭＡＲ、野性型、またはキメラＭＡＲ）のうちのいずれかを含む構築物は、ＭＡＲ配列が目的遺伝子（ＧＯＩまたは導入遺伝子）の発現を助け得るように、ＧＯＩを含む構築物が更にトランスフェクトされる（またはトランスフェクトされている）細胞に導入され得る。

従って、本開示の一実施形態によれば、提供されるのは、細胞にコード配列をトランスフェクトする方法であり、当該方法は、第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドが細胞にトランスフェクトされる条件下で、細胞を、第１ポリヌクレオチド、ならびに連結されていない第２ポリヌクレオチドに接触させる段階を含み、第１ポリヌクレオチドは、コード配列と、コード配列の転写を開始するプロモーターとを含み、第２ポリヌクレオチドは、本明細書で開示されるマトリックス付着領域（ＭＡＲ）コアを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＲコアは、配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択され、ここで、ＭＡＲコアは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である。

いくつかの実施形態において、第２ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、１０、１４、および１８、ならびに配列番号２、６、１０、１４、および１８のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される５'フランキング領域を更に含む。いくつかの実施形態において、５'フランキング領域は、ＭＡＲコアに対して５'であり、かつＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である。

いくつかの実施形態において、第２ポリヌクレオチドは、配列番号３、７、１１、１５、および１９、ならびに配列番号３、７、１１、１５、および１９のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される３'フランキング領域を更に含む。いくつかの実施形態において、３'フランキング領域は、ＭＡＲコアに対して３'であり、かつＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である。

いくつかの実施形態において、ＭＡＲ配列全体は、配列番号４、８、１２、および１６、ならびに配列番号４、８、１２、および１６のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択され、ここで、ＭＡＲは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である。

本明細書で開示される方法によって調製されるトランスフェクト細胞も提供される。

本明細書で開示される構築物またはベクターのうちのいずれかには、追加の転写調節配列および／または転写後調節配列が含まれ得る。転写調節配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを含み得る。転写後調節配列は、例えば、イントロンおよびＰＲＥを含む。

特定の実施形態において、異種配列の挿入を促進するために、「ポリリンカー」としても周知のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）がベクター内に存在する。例えば、ＭＣＳは、導入遺伝子配列の挿入を促すために、プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に配置され得る。導入遺伝子配列を含むベクターにおいて、プロモーター、導入遺伝子配列、およびポリアデニル化シグナルを含むベクターの部分は、「発現カセット」と称される。

真核細胞において活性のあるプロモーターは、当技術分野において周知である。例示的な真核生物プロモーターは、例えば、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス主要最初期（ＣＭＶ－ＭＩＥ）プロモーター、ＥＦ１‐アルファ（翻訳伸長因子‐１αサブユニット）プロモーター、Ｕｂｃ（ユビキチンＣ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、アクチンプロモーターなどを含む。Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ．，ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｋ０３１０４；Ｕｅｔｓｕｋｉｅｔａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５７９１－５７９８；Ｓｃｈｏｒｐｐｅｔａｌ．（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：１７８７－１７８８；Ｈａｍａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７４：１０７７８－１０７８４；Ｄｒｅｏｓｅｔａｌ．（２０１３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４１（Ｄ１）：Ｄ１５７－Ｄ１６４、および２０１４年７月１６日にアクセスされたｈｔｔｐ：／／ｅｐｄ．ｖｉｔａｌ－ｉｔ．ｃｈのｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｍｏｔｅｒｄａｔａｂａｓｅも参照されたい。

また、エンハンサーがベクター上に含まれ得る。非限定的な例には、ＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡ配列の中のものが含まれる。過去に、５個の胚性幹細胞（ＥＳＣ）転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｅｓｒｒｂ）がスーパーエンハンサーを占有することが示され、ＥＳＣの制御に貢献する多くの追加の転写因子がある。６個の追加の転写因子（Ｎｒ５ａ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｔｃｆｃｐ２ｌ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ３、Ｔｃｆ３）は、典型的なエンハンサーおよびスーパーエンハンサーの両方を占有し、これらはすべて、スーパーエンハンサーにおいて多く存在する。これらのいずれか、または、更に当技術分野において周知のものが本明細書において使用され得る。

真核細胞において活性のあるポリアデニル化シグナルが当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３'末端切断、切断部位におけるｍＲＮＡ前駆体のポリアデニル化、およびポリアデニル化シグナルの下流における転写の終了を指令する。一般的に、ポリアデニル化シグナルにはコア配列ＡＡＵＡＡＡが存在する。Ｃｏｌｅｅｔａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４－２１１３も参照されたい。

本明細書において開示されるベクターにおいて使用され得る例示的なイントロンには、βグロブリンイントロン、および「イントロンＡ」としても周知の、ヒト／マウス／ラット／他の種のサイトメガロウイルス主要最初期（ＭＩＥ）遺伝子の第１イントロンが含まれる。

本開示のベクターに含まれ得る更なる転写後調節エレメントには、これらに限定されないが、ＣＭＶＭＩＥの５'‐未翻訳領域、ヒトＨｓｐ７０遺伝子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子のＳＰ１６３配列、およびアデノウイルス後期ｍＲＮＡに関連付けられた三成分リーダー配列が含まれる。例えば、Ｍａｒｉａｔｉｅｔａｌ．（２０１０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ６９：９－１５を参照されたい。

特定の実施形態において、本明細書において開示されているベクターは、真核細胞において機能する選択マーカー（すなわち、真核選択マーカー）をコードするヌクレオチド配列を含むので、適切な選択が適用されたとき、選択マーカーを含まない細胞は、死ぬか、または、選択マーカーを含む細胞より明らかにゆっくりと増殖する。真核細胞において機能する例示的な選択マーカーは、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子であり、選択は、グルタミンを含まない培地において細胞を培養することによって適用されるか、または、Ｌ‐メチオニンスルホキシイミンを用いて選択されるか、または、その両方である。真核細胞において機能する別の例示的な選択マーカーは、ネオマイシン（ｎｅｏ）に対する抵抗性をコードする遺伝子であり、選択は、ネオマイシン、ジェネテシン、またはＧ４１８を含む培地において細胞を培養することによって適用される。追加の選択マーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲとも称され、メトトレキサートに対する抵抗性を付与する）、ピューロマイシン‐Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシンに対する抵抗性を提供する）、およびハイグロマイシンキナーゼ（ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を提供する）が含まれる。真核細胞において機能する更なる追加の選択マーカーが当技術分野において周知である。

上記の１または複数の選択マーカーをコードする配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されている。上記のように、真核細胞において機能するプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、当技術分野において周知である。

特定の実施形態において、本明細書において開示されるベクターは、２またはより多くの発現カセットを含み得る。例えば、一方が抗体重鎖をコードし、他方が抗体軽鎖をコードする２つの発現カセットを含むベクターが、機能的な抗体分子の生産のために使用され得る。

また、本明細書において開示されるベクターは、原核細胞において機能する複製起点（すなわち、原核複製起点）を含む。原核細胞において機能する複製起点が当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、大腸菌のｏｒｉＣ起点と、例えばｐＳＣ１０１起点、ｐＢＲ３２２起点（ｒｅｐ）、およびｐＵＣ起点などのプラスミド起点と、ウイルス（すなわちバクテリオファージ）複製起点とを含む。原核複製起点を同定するための方法が、例えば、Ｓｅｒｎｏｖａ＆Ｇｅｌｆａｎｄ（２００８）Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ９（５）：３７６－３９１において提供されている。

また、本明細書において開示されるベクターは、原核細胞において機能する選択マーカー（すなわち原核選択マーカー）を含む。原核細胞において機能する選択マーカーが当技術分野において周知であり、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンのうちのいずれか１つに対する抵抗性を付与するポリペプチドをコードする配列を含む。アンピシリン（および他のベータラクタム系抗生物質）に対する抵抗性を付与するポリペプチドの例は、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）酵素である。カナマイシン抵抗性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の活性によってもたらされ得て、クロラムフェニコール抵抗性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによってもたらされ得る。

例示的な導入遺伝子には、任意の組換えタンパク質、または、例えば、ホルモン（例えば成長ホルモンなど）エリスロポエチン、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）、抗体複合体、融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ‐融合タンパク質）、インターロイキン、ＣＤタンパク質、ＭＨＣタンパク質、酵素、および凝固因子が含まれる。抗体重鎖および抗体軽鎖は、別個のベクターから、または、２つの発現カセットを含む同じベクターから発現され得る。

本開示は、細胞において組換えポリペプチドを発現するための方法を提供する。方法は、本明細書に記載されているようなベクターを細胞内に導入する段階と、ベクターが一過的にまたは安定的に細胞内に維持される条件下で細胞を培養する段階とを備える。細胞は、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９を用いた標的挿入によって生成された安定的な細胞株などの、原核性または真核性の細胞であり得る。組換えポリペプチドの発現に使用できる培養真核細胞は、当技術分野において周知である。そのような細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞が含まれる。従って、本開示は、本明細書に記載されているようなベクターを含む細胞を提供する。

例示的な酵母細胞には、これらに限定されないが、トリコデルマ・エスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐ．）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂａｅ）、および、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。例示的な昆虫細胞株には、これらに限定されないが、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）細胞が含まれる。例示的な植物細胞には、これらに限定されないが、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞およびタバコＢＹ２細胞が含まれる。

組換えポリペプチドの発現に有用な培養哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ウイルス性形質転換ＨＥＫ細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２０細胞、ＣＶ‐１細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、３Ｔ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、およびＣＡＰ‐Ｔ（登録商標）細胞（後者の２つの細胞株は、ドイツ、ケルンのＣｅｖｅｃＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって市販されている）が含まれる。また、例えば、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ－４４、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＳなどのＣＨＯ細胞の多くの派生物、または、ＣＨＯ－Ｍ、ＣＫ１ＳＶＣＨＯ、およびＣＨＯＺＮなどの操作されたＣＨＯ細胞が利用可能である。また、哺乳動物初代細胞を使用することができる。

特定の実施形態において、細胞は無血清培地において培養される。例えば、患者に投与するための治療用タンパク質を製造するために、無血清培地において発現細胞を増殖させる必要がある。更なる実施形態において、細胞は、ポリペプチド発現に使用される前に、無血清培地における増殖のために事前に適応された。

本明細書に記載されているようなベクターは、当技術分野において周知である方法を使用して、上記の細胞のうちのいずれかに導入することができる。そのような方法には、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介法、電気穿孔、バイオリスティックデリバリー（すなわち、微粒子射出）、プロトプラスト融合、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介法、リン酸カルシウム共沈が含まれる。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．の「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２００１、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．の「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７、および、定期的最新情報を参照されたい。

細胞培養のための標準的方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙの「ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ」、ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００５を参照されたい。

本開示は、以下の例を参照することによって更に理解されるが、これらの例は本発明の単なる例示に過ぎないものとする。本発明の範囲は、例示されている実施形態によって限定されない。これらの実施形態は、発明の一態様の説明に過ぎないものとする。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な修正形態が、上記の説明および付属図面から、当業者にとって明らかとなるであろう。そのような修正形態は、添付の特許請求の範囲に属する。
実施例１。新規ＭＡＲの調査

この実施例では、インシリコでマトリックス付着領域（ＭＡＲ）エレメントの強度を定量化するための方法を開発し、この方法をいくつかの例示的なＭＡＲ配列の強度を定量化するために使用した。
モチーフに基づくＭＡＲ同定

文献調査を行い、特にＭＡＲ特異的転写因子、クロマチン結合ドメイン、ＤＮＡ湾曲配列、およびＤＮＡ非湾曲配列を求めて、ＭＡＲ同定に関連するすべてのモチーフを同定した。有用な可能性のある特性を要約し、更なるＭＡＲ評価のために使用した。

ＭＡＲエレメントは、中央ＡＴリッチコア領域、ならびに転写因子結合モチーフを含む５'および３'フランキング領域で構成されていると考えられる。コア領域は（ＡＴＡＴ）ｎマイクロサテライトにおいて多く存在し得る。

ＭＡＲは、２つの区別される配列ＡＡＴＡＡＹＡＡおよびＡＷＷＲＴＡＡＮＮＷＷＧＮＮＮＣで構成される二部構成のエレメントである、「ＭＡＲ認識シグネチャー」の含有物を含み、一般に当該含有物によって分類されることがある。ＭＡＲであることを表す他の配列は、様々な転写因子およびＤＮＡ構造モチーフから成る。例示的な配列には、ＤＮＡ非湾曲モチーフ、ＡＰ－１、Ａ－ボックス、およびＴ－ボックス、ＮＭＰ－２、ＳＡＴＢ１、Ｈｏｘ４Ｄ、ＴＥＦ、Ｐｉｔ１、およびＦａｓｔが含まれる。

調査によって、ＭＡＲゼブラフィッシュ、ＭＡＲコイ（ＣｙｐｒｉｎｕｓＣａｒｐｉｏ）、ＭＡＲ１２－ＲＰ１３、およびＭＡＲ１７ＸＸ＿ｆｏｓとそれぞれが名付けられた４つの新規のＭＡＲエレメントを同定した。これらの、およびいくつかの周知のもの（ＭＡＲ１－６８、ＭＡＲＳ４、ＭＡＲＸ２９、マウスｃ－ｍｙｃ５ＭＡＲ、およびＳＰＲ２Ａ－ＭＡＲ）の完全な配列、コア、ならびにコアの５'および３'フランキング領域を、表１に列挙する。

実施例２。ＭＡＲゼブラフィッシュの試験

文献から周知の最も強いＭＡＲと比較して、同定したＭＡＲエレメントのうちの１つ、ＭＡＲゼブラフィッシュの実験的な試験を実施したところ、２倍強力であることが示された。

新規に同定したＭＡＲエレメントであるＭＡＲゼブラフィッシュとＭＡＲＸ２９（参照文献、Ａｒｏｐｅｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯＮＥ８（１１）：ｅ７９２６２を参照されたい）との間で、インビトロ比較を行った。

次いで、完全長ＭＡＲゼブラフィッシュのフランキング領域を含まないＭＡＲゼブラフィッシュコアの実験的な試験を、ＭＡＲ配列を全く含まない構築物と比較して実施した。
方法および材料

ＮｅｏｎトランスフェクションをＣＴＭＣＢ細胞を用いて行った。ＢａｌａｎＣＤ＋４ｍＭＧｌｎ培地をトランスフェクションに使用した。９００μＦ、３００ｖ、抵抗０に設定して、Ｂｉｏ－ＲａｄのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩによって一過性トランスフェクションを行った。細胞をトランスフェクションの２４時間前に分割した。０日目の生存率およびＶＣＤを細胞百万個／ｍｌとして測定する。トランスフェクションを５μｇの重鎖および軽鎖ＤＮＡを使用して行った。１０μｇのＧＦＰＤＮＡを外部対照として使用してトランスフェクション効率を確認した。目的の組換えタンパク質リツキシマブ軽鎖を発現する細胞の成長に好都合な選択的圧力をもたらす濃度にメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を１４日間維持することによって、安定的なプールを生成した。得られた組換えプールを１４日間流加定量化アッセイにおいて比較した。バイオレイヤー干渉法またはＥＬＩＳＡによって、回収日における力価および培養中の力価を分析した。プール生成のための上記の実験的方法を繰り返し、ＭＳＸの濃度は８０μＭのみを使用して、ＭＡＲゼブラフィッシュコアを試験するためのプールを生成した。
結果

ＭＡＲＸ２９とＭＡＲゼブラフィッシュとのインビトロ比較の結果を図１に示す。両方の選択マーカー濃度（８０μＭおよび１００μＭのメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ））において、ＭＡＲゼブラフィッシュは、ＭＡＲＸ２９より大幅に優れていた。従ってこの実施例は、実施例１において発展させた調査およびインシリコ手法を確証した。

更なる実験において、ＭＡＲコア配列単独の効力を、ＭＡＲエレメントを全く有しない構築物と比較して試験した。図２に示すように、ＭＡＲゼブラフィッシュコア配列は、ＭＡＲ無し対照より著しく高い力価を生じた。

本発明は、上記の実施形態と併せて説明されたが、上記の説明は例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではなく説明することを意図していることを理解されたい。本発明の範囲における、他の態様、利点、および修正形態は、本発明に関連する当業者にとって明らかであろう。

Claims

コード配列と、前記コード配列の転写を開始するように構成されたプロモーターと、配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列から成る群より選択されるマトリックス付着領域コア（ＭＡＲコア）とを含む、組換えポリヌクレオチドであって、前記ＭＡＲコアは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である、組換えポリヌクレオチド。
配列番号２、６、１０、および１４、ならびに配列番号２、６、１０、および１４のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される５'フランキング領域を更に含む、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
前記５'フランキング領域は、前記ＭＡＲコアに対して５'であり、かつ前記ＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である、請求項２に記載の組換えポリヌクレオチド。
配列番号３、７、１１、および１５、ならびに配列番号３、７、１１、および１５のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される３'フランキング領域を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
前記３'フランキング領域は、前記ＭＡＲコアに対して３'であり、かつ前記ＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド。
配列番号４、８、１２、および１６、ならびに配列番号４、８、１２、および１６のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択されるＭＡＲを含み、前記ＭＡＲは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含む細胞。
細胞にコード配列をトランスフェクトする方法であって、前記細胞を、第１ポリヌクレオチド、および連結されていない第２ポリヌクレオチドに接触させる段階を備え、前記第１ポリヌクレオチドは、前記コード配列と、前記コード配列の転写を開始するプロモーターとを含み、前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列より選択されるマトリックス付着領域コア（ＭＡＲコア）を含み、前記第１ポリヌクレオチドおよび前記第２ポリヌクレオチドが細胞にトランスフェクトされる条件下で、前記ＭＡＲコアは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である、方法。
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、１０、および１４、ならびに配列番号２、６、１０、および１４のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される５'フランキング領域を更に含む、請求項８に記載の方法。
前記５'フランキング領域は、前記ＭＡＲコアに対して５'であり、かつ前記ＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である、請求項９に記載の方法。
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号３、７、１１、および１５、ならびに配列番号３、７、１１、および１５のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される３'フランキング領域を更に含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記３'フランキング領域は、前記ＭＡＲコアに対して３'であり、かつ前記ＭＡＲコアから１００ヌクレオチド以内である、請求項１１に記載の方法。
前記第２ポリヌクレオチドは、配列番号４、８、１２、および１６、ならびに配列番号４、８、１２、および１６のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択されるＭＡＲを更に含み、前記ＭＡＲは哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である、請求項８に記載の方法。
請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法によって調製されるトランスフェクト細胞。
（ａ）配列番号１、５、９、および１３、ならびに配列番号１、５、９、および１３のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択され、哺乳動物核マトリックスに付着することが可能である、ＭＡＲコアと、
（ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、および３４、ならびに配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、および３４のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される５'フランキング領域と、
（ｃ）配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、および３５、ならびに配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、および３５のうちの任意の１つに対し少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される３'フランキング領域と
を含み、
前記ＭＡＲコア、前記５'フランキング領域、および前記３'フランキング領域は同じ天然のＭＡＲ由来ではない、
キメラマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列。