WO2023027170A1 - タンパク質の翻訳制御システム - Google Patents

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WO2023027170A1
WO2023027170A1 PCT/JP2022/032192 JP2022032192W WO2023027170A1 WO 2023027170 A1 WO2023027170 A1 WO 2023027170A1 JP 2022032192 W JP2022032192 W JP 2022032192W WO 2023027170 A1 WO2023027170 A1 WO 2023027170A1
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protein
binding
translation
target
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PCT/JP2022/032192
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秀之 中西
啓史 位▲高▼
博英 齊藤
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国立大学法人 東京医科歯科大学
国立大学法人京都大学
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a cell-selective protein translation control system using intracellular molecules as indicators and a translation control method used therein.
  • mRNA medicines including mRNA vaccines.
  • DNA the genetic material in the nucleus of the cell, is transcribed to produce mRNA, which is translated in the cytoplasm to produce proteins.
  • mRNA drugs can express proteins that are useful for vaccines and disease treatment without the intervention of DNA in the nucleus by administering artificially synthesized mRNA from the outside.
  • mRNA medicine is a new drug discovery modality that is attracting worldwide attention.
  • mRNA drugs can respond to the expression of all proteins, including secretory proteins and intracellular signaling molecules. It has many advantages, such as the ability to express proteins and, in principle, to be applicable to all cells, including non-dividing cells.
  • the present inventors have developed and reported an artificial translation control factor that has both protein translation activation and translation repression (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • This artificial translational regulator comprises a translational activator, a Cap-mimicking domain, and an RNA-binding protein.
  • the artificial translational regulatory factor strongly binds to an mRNA comprising a Cap structure, a predetermined binding motif specifically recognized by the RNA-binding protein of the artificial translational regulatory factor, and a nucleic acid sequence encoding a desired protein. can bind and repress translation.
  • the present inventors have constructed a system that introduces a fragment of a translation control factor into cells and reconstitutes a full-length translation control factor in response to any target molecule in the cell, such as a target protein. bottom.
  • a target molecule such as a target protein.
  • the present invention includes the following. [1] the following (a), (b) and (c): (a) mRNA expressing a first fusion protein containing a first target-binding molecule that specifically recognizes the first site of the target molecule, an N-terminal domain of a caged intein, and an N-terminal domain of a translation control factor , (b) expressing a second fusion protein comprising a second target-binding molecule that specifically recognizes the second site of the target molecule, the C-terminal domain of the caged intein, and the C-terminal domain of the translation control factor; mRNA, (c) a switch mRNA comprising one or more binding motifs that specifically recognize the translational control factor and a nucleic acid sequence encoding a target protein; or containing DNA encoding these,
  • a protein translation control system wherein the translation control factor comprises an RNA-binding protein.
  • the mRNA of (a) is a first mRNA containing a nucleic acid sequence encoding the first fusion protein
  • the mRNA of (b) is a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein.
  • the system according to [1], wherein the second mRNA comprises [3]
  • the mRNA of (a) and the mRNA of (b) are arranged in the 5' to 3' direction, a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein, and a self-cleavage sequence encoding a self-cleavage peptide. and a nucleic acid sequence encoding said first fusion protein.
  • the translation control factor comprises an RNA binding protein and a translation activation factor.
  • the N-terminal domain of the translation control factor comprises the first part of the RNA-binding protein
  • the C-terminal domain of the translation control factor comprises the second part of the RNA-binding protein
  • the translation activation The system according to any one of [1] to [4], comprising a factor.
  • the N-terminal domain of the caged intein is caged eNpu N-intein or a variant thereof
  • the C-terminal domain of the caged intein is caged Npu C-intein or a variant thereof, [1]-[ 5], the system according to any one of the items.
  • the switch mRNA is (A) an off-switch mRNA whose translation is repressed by the translation control factor, and/or (B) an on-switch mRNA whose translation is activated by the translation control factor and said off-switch mRNA comprises a Cap structure or a Cap analogue at the 5' end, one or more binding motifs that specifically recognize said RNA binding protein, and a nucleic acid sequence encoding a first protein of interest;
  • the on-switch mRNA does not have a 7-methylguanosine 5'-phosphate structure and comprises one or more binding motifs that specifically recognize the RNA binding protein and a nucleic acid sequence encoding a second protein of interest.
  • the binding motif for MS2CP is represented by the following formula (I): (In the formula, N 1 to N 15 each independently represent A, C, G or U; R represents G or A; Y represents U or C; N 1 and N 15 , N 2 and N 14 , N 3 and N 13 , N 4 and N 12 , N 5 and N 11 , N 6 and N 10 , and N 7 and N9 form a base pair or a wobble base pair, respectively.
  • the off-switch mRNA contains two or more binding motifs that specifically recognize the MS2CP, and at least two of the two or more binding motifs are linked via an RNA scaffold structure, [8 ] or [9].
  • a method for regulating protein translation comprising the step of introducing the system according to any one of [1] to [10] into a cell.
  • a translation control factor can be reconstituted specifically for a cell type containing a desired target molecule.
  • the translation control factor By allowing the translation control factor to act on the switch mRNA encoding the target protein, it becomes possible to suppress and/or activate the translation of the target protein.
  • the translation control factor can be specifically reconstituted by any target molecule. Translational repression and/or translational activation can be achieved.
  • FIG. 1 shows the state in which the first and second mRNAs are introduced into the cell and the first and second mRNAs are translated, and (B) shows the first fusion protein and the second fusion protein.
  • C shows the rearranged full-length translational regulatory factor (left), the caged intein released by the action of the caged intein, the target-binding molecule, and the complex derived from the target protein. It is a conceptual diagram showing a body (right).
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing introduction of first, second, off-switch, and on-switch mRNAs into cells.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing that the rearranged full-length translational control factor regulates both on-switch mRNA (lower left) and off-switch mRNA (lower right).
  • Figure 4 (A) shows the plasmid DNA constructs designed in preliminary experiments with the Npu DnaE intein, (B) shows the N-terminus only, C-terminus only, and repressor at each split site.
  • FIG. 10 is a graph showing results of translation repression by the constructed translation repression factor; FIG. FIG.
  • 5(A) shows the plasmid DNA construct (left) encoding the first and second mRNAs according to Example 1 of the present invention, the DNA construct (upper right) encoding the off-switch mRNA, and the expression level of the target protein. It is a diagram showing a DNA construct encoding Nluc (middle right) and mRNA encoding the target protein eDHFR used as a control for the measurement, and (B) shows translation when each construct and mRNA were introduced into cells. It is a graph which shows a suppression result.
  • FIG. 6A shows, in order from the top, the first mRNA according to Example 2 of the present invention, the second mRNA, the mRNA encoding the target protein eDHFR, the mRNA encoding EGFP as a negative control for the target protein, and Luc2 as the target protein.
  • Fig. 2 shows the off-switch mRNA for Luc2, the on-switch mRNA for Luc2 as the target protein, and the Nluc-encoding mRNA used as a control for measuring the expression level of the target protein.
  • FIG. 6B is a graph showing the results of translation suppression of off-switch mRNA when each mRNA was introduced into cells.
  • FIG. 6C is a graph showing the results of translational activation of on-switch mRNA when each mRNA was introduced into cells.
  • FIG. 7A shows, in order from the top, the first mRNA according to Example 3 of the present invention, the second mRNA, the mRNA encoding the target protein EGFP, the mRNA encoding eDHFR as a negative control for the target protein, and Luc2 as the target protein.
  • Fig. 2 shows the off-switch mRNA for Luc2, the on-switch mRNA for Luc2 as the target protein, and the Nluc-encoding mRNA used as a control for measuring the expression level of the target protein.
  • FIG. 7A shows, in order from the top, the first mRNA according to Example 3 of the present invention, the second mRNA, the mRNA encoding the target protein EGFP, the mRNA encoding eDHFR as a negative control for the target protein, and Luc2 as the target protein.
  • FIG. 7B is a graph showing the results of translation suppression of off-switch mRNA when each mRNA was introduced into cells.
  • FIG. 7C is a graph showing the results of translational activation of on-switch mRNA when each mRNA was introduced into cells.
  • a system according to the present invention comprises: (a), (b) and (c) below: (a) mRNA expressing a first fusion protein containing a first target-binding molecule that specifically recognizes the first site of the target molecule, an N-terminal domain of a caged intein, and an N-terminal domain of a translation control factor , (b) expressing a second fusion protein comprising a second target-binding molecule that specifically recognizes the second site of the target molecule, the C-terminal domain of the caged intein, and the C-terminal domain of the translation control factor; mRNA, (c) a switch mRNA comprising one or more binding motifs that specifically recognize the translational control factor and a nucleic acid sequence encoding a target protein; or containing DNA encoding these, Said translation control element comprises an RNA binding protein.
  • the system according to the present invention comprises a first target-binding molecule in which the mRNA of (a) specifically recognizes the first site of the target molecule and the N-terminal domain of the caged intein and the N-terminal domain of a translation control factor, wherein the mRNA of (b) specifically recognizes the second site of the target molecule
  • a second mRNA comprising a nucleic acid sequence encoding a second fusion protein comprising a second target-binding molecule, the C-terminal domain of a caged intein, and the C-terminal domain of the translational control factor. That is, in the first embodiment, mRNA containing a nucleic acid sequence encoding a first fusion protein and mRNA containing a nucleic acid sequence encoding a second fusion protein are included as separate molecules.
  • the protein translation control system and method according to the first embodiment will be described below.
  • the method according to this embodiment includes the step of introducing the mRNAs of (a), (b) and (c) or DNAs encoding them into cells.
  • This embodiment relates to a protein translation control system and method, and more particularly to a system and method for cell-selectively controlling the translation of a target protein using a target molecule as an index.
  • Cell-selectively regulating the translation of a target protein using a target molecule as an indicator means that the translation of the target protein encoded by the switch mRNA of (c) can be controlled only in cells in which the target molecule is present. More specifically, translation of a protein of interest encoded by the switch mRNA in the presence of the reconstituted translational regulator relative to a control in the absence of the translational regulator or with the translational regulator split.
  • a cell type that selectively induces translational control is also referred to as a target cell.
  • other cell types are also collectively referred to as non-target cells.
  • a translation control factor is generated based on the first fusion protein in which the mRNA of (a) is expressed and the second fusion protein in which the mRNA of (b) is expressed.
  • the rearranged, rearranged translational control element enables control of the translation of the switch mRNA of (c).
  • the target molecule refers to a molecule that exists in the target cell at the time of performing the method of the present invention, and in certain embodiments, it can refer to a molecule that exists in the cytoplasm or nucleus of the target cell. .
  • the target molecule is not particularly limited as long as it has a first binding site and a second binding site that can be specifically recognized by other molecules. However, it is preferred that the first binding site and the second binding site on the target molecule are separate sites.
  • Target molecules are also preferably non-toxic to cells. Specific examples of target molecules include proteins, peptides, non-peptide compounds, synthetic low-molecular-weight compounds, natural compounds, or fragments thereof.
  • a target molecule can be appropriately selected according to the purpose of translational control.
  • any molecule specific to the intracellular state to be detected can be a protein. or peptides.
  • a low-molecular-weight compound that easily permeates the cell membrane can be selected.
  • metabolites produced as a result of natural or artificial reactions in cells can also be target molecules, and in this case metabolites may be low-molecular-weight compounds and the like.
  • a target molecule consisting of a protein or a fragment thereof is hereinafter also referred to as a target protein.
  • a target protein is selected and determined for the purpose of selectively suppressing or activating the expression of a target protein in target cells, and based on the target protein, (a) and ( The mRNA of b) can be designed.
  • the target protein it is preferable to select, for example, a protein that has a large difference in expression level or abundance between target cells and non-target cells.
  • target molecules other than target proteins it is also preferable to select molecules that have a large difference in the amount present between target cells and non-target cells.
  • target proteins include proteins that are endogenous to specific cells. Proteins that are endogenous to a particular cell include, but are not limited to, proteins that are expressed according to the differentiation stage of the cell and proteins that are expressed according to the disease state of the cell. By reconstituting translational control factors in response to the presence of these target proteins, translational control of target proteins encoded by switch mRNAs in cells at different stages of differentiation or in diseased cells characterized by each target protein is possible. It can be performed.
  • Another example of a target protein is a protein produced due to a substance introduced exogenously into a cell.
  • Proteins produced due to substances introduced from the outside include proteins that can be produced in the cells due to genes restored by genome editing, proteins that can be produced in the cells by mRNA vaccination or mRNA medicine. , proteins that can be produced in the cell by plasmid DNA, viral vectors, and the like, but are not limited to these.
  • target molecules other than target proteins include molecules produced intracellularly in specific disease states and molecules artificially produced in cells, and the types thereof are not limited.
  • cell is not particularly limited and may be any cell.
  • a cell may be a single cell or a "cell population”, which is a collection of two or more cells. There is no theoretical upper limit to the number of "cell populations”, and they refer to populations composed of any number of cells.
  • a "cell population” may be a cell population that may contain different types of cells, and may contain target cells and non-target cells.
  • Cells may be cells collected from unicellular or multicellular organisms, or may be cells (including cell lines) that have been artificially manipulated. For example, yeast, insect cells, animal cells, etc. are used, and among them, animal cells are preferred.
  • Animal cells include, for example, cells derived from mammals (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, monkeys, orangutans, chimpanzees, humans, etc.).
  • Cells derived from mammals include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, dhfr gene-deficient CHO cells, mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, and rats.
  • Cell lines such as GH3 cells, human embryonic kidney-derived cells (e.g. HEK293 cells), human liver cancer-derived cells (e.g. HepG2), human FL cells, etc., and primary cells prepared from human and other mammalian tissues Cultured cells are used. Furthermore, zebrafish embryos, Xenopus laevis oocytes and the like can also be used.
  • the cells may be (A) stem cells, (B) progenitor cells, (C) terminally differentiated somatic cells, or (D) other cells.
  • stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, spermatogonial stem cells ("GS cells”). , embryonic germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells, and the like.
  • Progenitor cells include, for example, tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • Somatic cells include, for example, keratinizing epithelial cells (e.g., keratinizing epidermal cells), mucosal epithelial cells (e.g., tongue epithelial cells), exocrine gland epithelial cells (e.g., mammary gland cells), hormone secretion cells (e.g., adrenal medulla cells), cells for metabolism and storage (e.g., hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (e.g., type I alveolar cells), luminal epithelial cells of the inner chain duct ( vascular endothelial cells), ciliated cells with carrying capacity (e.g.
  • airway epithelial cells extracellular matrix-secreting cells (e.g. fibroblasts), contractile cells (e.g. smooth muscle cells), blood and Immune system cells (e.g. T lymphocytes), sensory cells (e.g. rod cells), central and peripheral nervous system neurons and glial cells (e.g. astrocytes), pigment cells (e.g. retinal pigment epithelium) cells), and their progenitor cells (tissue progenitor cells).
  • Other cells include, for example, cells that have undergone differentiation induction, including progenitor cells and somatic cells that have undergone differentiation induction from pluripotent stem cells.
  • cells induced by so-called "direct reprogramming (also referred to as trans-differentiation)" in which somatic cells or progenitor cells are directly differentiated into desired cells without passing through an undifferentiated state, may be used.
  • the first mRNA of (a) and the second mRNA of (b) are mRNAs that express the first and second fusion proteins, respectively.
  • the first fusion protein contains the N-terminal domain of the translational regulator and the second fusion protein contains the C-terminal domain of the translational regulator. Then, when the target protein is present in the cell, it associates and reconstitutes the full-length translation control factor within the cell.
  • FIG. 1(A) is a conceptual diagram showing a state in which the first and second mRNAs have been introduced into cells and the first and second mRNAs have been translated.
  • FIG. 1(A) schematically represents the target protein (left), the first fusion protein (middle), and the second fusion protein (right).
  • the first fusion protein is a substance produced by intracellular translation of the first mRNA. are combined in this order.
  • the second fusion protein is a substance produced by intracellular translation of the second mRNA. linked in this order.
  • FIG. 1(B) shows a state in which both the first fusion protein and the second fusion protein are bound to the target protein. This binds the N-terminal domain of the caged intein and the C-terminal domain of the caged intein. Then, by the action of the caged intein, the N-terminal domain and C-terminal domain of the translational regulatory factor bind to reconstitute the full-length translational regulatory factor.
  • FIG. 1(C) shows the reconstructed full-length translational regulatory element (left), the caged intein released by the action of the caged intein, the target binding molecule, and the complex derived from the target protein (right).
  • a translational regulator is generally an artificial translational regulator and includes at least an RNA binding protein. More specifically, the translation control factor used for translational repression comprises or consists of an RNA binding protein. Translational regulatory factors used for translational activation include RNA-binding proteins and translational activators. As used herein, the full-length translational control factor refers to a translational control factor after rearrangement of the N-terminal domain and the C-terminal domain, which has a translational control function on switch mRNA. and
  • RNA-binding protein is a protein that specifically recognizes a specific RNA sequence and forms an RNA-protein complex.
  • a specific RNA sequence that specifically recognizes and binds to such an RNA-binding protein is referred to herein as a "binding motif" or "protein-binding motif.” Any RNA-binding protein can be used in the present invention without any particular limitation as long as it can bind to the binding motif.
  • the RNA-binding proteins include, for example, MS2CP, L7Ae, LIN28A, PP7CP, dCas13, variants thereof (for example, in the case of MS2CP, V29I variant, L77P variant, W82R variant, C101R variant, dlFG mutants, etc.), fragments thereof having RNA-binding ability, and the like. Activation and/or repression of translation of target proteins has already been demonstrated using MS2CP, L7Ae and LIN28A.
  • the RNA binding protein is preferably MS2CP or a variant thereof.
  • the RNA-binding protein is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 5, 7 and 9 (nucleotide sequences encoding proteins consisting of each sequence are represented by SEQ ID NOS: 4, 6 and 8, respectively). ), one or several (for example, 2, 3, 4, 5) amino acids are deleted, substituted, inserted and/or 85% or more (e.g., 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) of the added amino acid sequence or the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOS: 5, 7 and 9 A protein containing an amino acid sequence having the identity of .
  • RNA-binding proteins include wild-type RNA-binding proteins, variants thereof, and fragments thereof.
  • the translation activator is not particularly limited as long as it can recruit a translation initiation factor and activate translation.
  • One aspect of the present invention includes a VPg (viral protein genome-linked) protein as a translation activator.
  • VPg is used as an example of the translation activator.
  • VPg should be read as another translation activator.
  • the translation control system of the present invention is capable of activating or repressing protein translation with the above configuration.
  • the VPg protein is not particularly limited as long as it has a protein translation activation function. and fragments thereof having a translation activation function.
  • viruses belonging to the genus Vesivirus include feline calicivirus (NCBI Accession No: NP_783307.1), canine vesivirus (NCBI Accession No: NP_786908.1), porcine vesicle virus (NCBI Accession No: NP_786894.1), Viruses belonging to the Lagovirus genus include rabbit hemorrhagic disease virus VPg (NCBI Accession No: NP_740330.1), and viruses belonging to the Potyvirus genus include Lupinus mosaic virus, Bean yellow mosaic virus, and Papaya leaf distortion mosaic virus.
  • the VPg protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (the nucleotide sequence encoding the protein consisting of this sequence is shown in SEQ ID NO: 2).
  • VPg protein includes VPg protein, VPg protein variants and fragments thereof.
  • the translational control factor that has both translational repression and translational activation functions may be a fusion protein containing an RNA-binding protein and a VPg protein.
  • the translation control factor may be a protein-binding domain such as an SH3 domain, a PDZ domain, a GK domain, or a GB domain and a binding partner thereof fused to an RNA-binding protein and a VPg protein, respectively.
  • the RNA-binding protein may exist on the N-terminal side and the VPg protein may exist on the C-terminal side, or the RNA-binding protein may exist on the C-terminal side and the VPg protein on the N-terminal side. and there may be a linker between them.
  • the translation control factor having both translation repression and translation activation functions is a fusion protein between an RNA-binding protein and a VPg protein, which is the Caliciviral VPg- It may be a based Translational activator (CaVT).
  • the translation control factor has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the sequence is shown in SEQ ID NO: 10), one or several in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (for example, 2, 3, 4, 5) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 and 85% or more (e.g., 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% or more) identity can be used.
  • the translation control factor is divided into an N-terminal domain and a C-terminal domain.
  • the location where the translation control factor is divided into the N-terminal domain and the C-terminal domain is not particularly limited as long as the following conditions are satisfied. That is, each domain before rearrangement does not have the action of translational repression or translation activation independently, the translational regulatory factor is rearranged by the caged intein, and the function of the translational regulatory factor is maintained after rearrangement. is.
  • the translational control element is preferably split into N-terminal and C-terminal domains in the manner in which its essential component, the RNA-binding protein, is split.
  • the three-dimensional structure of the RNA-binding protein is analyzed, it can be divided into an N-terminal domain and a C-terminal domain at a loop portion that does not constitute an ⁇ -helix or a ⁇ -sheet.
  • the N-terminal domain of the translation control factor that has only a translation repressing function contains the N-terminal fragment of the RNA-binding protein
  • the C-terminal domain contains the C-terminal fragment of the RNA-binding protein
  • the N-terminal domain of the translational regulatory factor that has both translational repressive and translational-activating functions includes, in certain embodiments, an N-terminal fragment of an RNA-binding protein, and the C-terminal domain of the translational regulatory factor is an RNA-binding protein. Contains C-terminal fragment and translational activator.
  • the N-terminal domain of the translational regulator comprises an N-terminal fragment of a translational activator and an RNA binding protein
  • the C-terminal domain of the translational regulator comprises a C-terminal fragment of an RNA binding protein.
  • the split point may be between the 45th tyrosine residue and the 46th cysteine residue, for example.
  • the split point may be changed as long as it is within 5 amino acid residues from the split point to the N-terminal side or the C-terminal side, but in that case, it is preferable to select a site that does not constitute an ⁇ -helix or a ⁇ -sheet. . Appropriate division points can be confirmed by prior experiments and simulations by those skilled in the art.
  • caged inteins are proteins that cause rearrangement only when there is an interaction through other domains. Defined as an intein with fused structures.
  • a protein or peptide having a C-intein-like sequence can be used as a cage structure for N intein
  • a protein or peptide having an N-intein-like sequence can be used as a cage structure for C intein.
  • the other domains are the first and second target binding molecules.
  • Any caged intein can be used.
  • caged eNpu N-intein SEQ ID NO: 14
  • the N-terminal domain of caged intein disclosed in Gramespacher J. A. et al., J. Am.
  • the terminal domain caged Npu C-intein (SEQ ID NO: 15) can be used, but is not limited to these.
  • Each sequence is shown in Table 1.
  • the bold letters are the N intein-derived sequence (in SEQ ID NO: 14), the C intein-derived sequence (in SEQ ID NO: 15), the underlined portion is the linker sequence, and the boxed portion is the C intein-like sequence (in SEQ ID NO: 14). ), representing the N intein-like sequence (in SEQ ID NO: 15).
  • the original N-intein-derived sequence is from the 1st residue to the 102nd residue.
  • the 30-residue sequence from the 125th to the 154th residue and the 30-residue sequence from the 160th to the 189th residue are the same and are C-intein-like sequences.
  • a sequence consisting of 22 residues from the 103rd residue to the 124th residue is a linker sequence of the N intein-derived sequence and the C intein-like sequence.
  • a sequence consisting of five residues from the 155th to the 159th residue is a linker sequence between the C-intein-like sequences.
  • the caged eNpu N-intein shown in SEQ ID NO: 14 is a sequence containing two repeats of a C-intein-like sequence, and the types of amino acids in the sequence with one repeat of the C-intein-like sequence, the sequence with three or more repeats, and the linker sequence. can also be used as well as caged eNpu N-inteins.
  • the sequence consisting of 52 residues from the 1st residue to the 52nd residue is an N intein-like sequence, consisting of 22 residues from the 53rd residue to the 74th residue.
  • the sequence is a linker sequence between the N-intein-like sequence and the C-intein-derived sequence, and the sequence consisting of 35 residues from the 75th to the 109th residue is the C-intein-derived sequence.
  • a sequence in which the N-intein-like sequence in caged Npu C-intein has two or three or more repeats, and a sequence in which the type of amino acid in the linker sequence is changed can also be used in the same manner as in caged Npu C-intein.
  • Mutants of caged eNpu N-intein and mutants of caged Npu C-intein can also be used as long as they do not impair the activity of the caged intein.
  • mutants include mutants in which conservative substitutions are made to the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 14 and 15, and one or several (e.g., 2, 3, 4, 5) amino acid sequences. ) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, or amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 14 and 15 and 85% or more (e.g., 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater) amino acid sequence identity.
  • the first and second target-binding molecules are molecules that specifically recognize the first and second sites of the target molecule, particularly the target protein, respectively.
  • the first and second target binding molecules can be selected or designed to match the target protein.
  • the target-binding molecule may be any molecule that has the ability to bind to the target molecule, and when the target molecule is an antigen, antibodies, peptide aptamers, artificial peptides derived from fibronectin, DARPin, and the like can be mentioned. Even when the target molecule is a molecule other than protein, a molecule that specifically binds to the target molecule can be appropriately determined.
  • low-molecular-weight compounds include target-binding molecules that utilize interactions such as rapamycin-mediated binding between FKBP (FK506-binding protein) and FRB (FKBP-rapamycin binding protein).
  • the antibody used in the present invention is not particularly limited in origin, it is preferably mammalian in origin.
  • Antibodies used in the present invention may be full-body antibodies, fragment antibodies (e.g., nanobody antibodies, Fab, F(ab') 2 , etc., or variants thereof (e.g., scFv, etc.).
  • the term "antibody” is used to include these.
  • the peptide aptamer used in the present invention may be a peptide in which amino acid residues or both terminal portions have been modified.
  • Peptide aptamers can be selected using methods well known to those skilled in the art.For example, but not limited to, yeast two-hybrid method can be used.Other molecules are also known per se.
  • the target-binding molecule may be an artificial molecule obtained by modifying a protein other than the antibody to have the same antigen-binding ability as the antibody. , anticalins, and the like.
  • the first and second target-binding molecules are selected from the known target-binding molecules. can be selected.
  • the first site and the second site are different parts, and the first site and the second site are proximal to each other as long as they do not inhibit the binding of the target binding molecule to each other.
  • the interaction between the first site of the target protein and the first target-binding molecule and the interaction between the second site of the target protein and the second target-binding molecule cause rearrangement of the caged intein.
  • the target binding molecule that specifically recognizes the target protein is unknown, or when only one target binding molecule is known, the target protein or its fragment is used as an antigen to immunize camelids such as alpaca. to generate antibodies and obtain the sequences of their antigen-recognition sites.
  • target binding molecules such as two or more Nanobodies, that specifically recognize different sites of the target protein.
  • a full-length translational control factor, the N-terminal domain of the translational control factor, the N-terminal domain of the caged intein, and the first target-binding molecule are selected or designed, the first fusion protein is designed, and the structure is determined.
  • a second target binding molecule, the C-terminal domain of a caged intein, the C-terminal domain of a translational regulator can be selected or designed, and a second fusion protein can be designed and the structure determined.
  • each domain may be directly linked or linked via a linker.
  • the length of the linker is not particularly limited, it may be, for example, about 2 to 30 amino acids long, or about 2 to 15 amino acids long.
  • the first mRNA comprises, in the 5′ to 3′ direction, [5′ UTR containing a Cap structure or Cap analog at the 5′ end], [an open reading frame containing a nucleic acid sequence encoding a first fusion protein ], [3′UTR containing PolyA] may be linked in this order.
  • the 5'UTR of the first mRNA contains a Cap structure or Cap analog at the 5' end.
  • the Cap structure may be a 7-methylguanosine 5' phosphate.
  • the Cap analog is a modified structure recognized by eIF4E, which is a translation initiation factor similar to the Cap structure, and is manufactured by Ambion's Anti-Reverse Cap Analog (ARCA ), m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog from New England Biolabs, CleanCap from TriLink, and the like. Cap analogs may be other modified structures recognized by translation initiation factors.
  • An arbitrary nucleic acid sequence of, for example, about 0 to 500 bases, preferably about 20 to 200 bases, may be contained on the 3' side of the Cap structure or Cap analog and on the 5' side of the initiation codon. These arbitrary nucleic acid sequences are preferably nucleic acid sequences that do not form secondary structures and do not specifically interact with the second mRNA. In addition, it is preferable that AUG, which serves as an initiation codon, does not exist within the 5'UTR.
  • the open reading frame which is the coding region of the first mRNA, includes an initiation codon, a nucleic acid sequence encoding the first fusion protein, and a termination codon.
  • the nucleic acid sequence encoding the first fusion protein comprises, from the 3' side of the initiation codon AUG to the 5' side of the stop codon, the nucleic acid sequence encoding the N-terminal domain of the translational control factor, the N-terminal domain of the caged intein. and a nucleic acid sequence encoding the first target binding molecule, in that order.
  • the nucleic acid sequence encoding each domain can be determined from the structure of the previously designed first fusion protein.
  • the 3'UTR of the first mRNA contains PolyA tail.
  • a PolyA tail may be a sequence of about 50-250 adenine bases attached. However, it is not necessary that about 50 to 250 adenine bases are continuously linked, and other nucleobases may be included between the adenine bases as long as the stability of the mRNA can be maintained.
  • the second mRNA comprises, in the 5′ to 3′ direction, [5′ UTR containing a Cap structure or Cap analog at the 5′ end], [an open reading frame containing a nucleic acid sequence encoding a second fusion protein ], [3′UTR containing PolyA] may be linked in this order. [5'UTR containing Cap structure or Cap analog at 5' end] and [3'UTR containing PolyA] may be the same as the first mRNA.
  • the 5'UTR and 3'UTR nucleic acid base sequences and number of nucleic acid bases may be the same or different between the first mRNA and the second mRNA, but are preferably the same.
  • the open reading frame which is the coding region of the second mRNA, includes an initiation codon, a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein, and a termination codon.
  • the nucleic acid sequence encoding the second fusion protein has a nucleic acid sequence encoding the second target binding molecule, the C-terminal domain of the caged intein, in the direction from 3' to the start codon AUG to 5' to the stop codon.
  • the nucleic acid sequence encoding each domain can be determined from the structure of the previously designed second fusion protein.
  • switch mRNA is an mRNA whose translation is controlled by a translational control factor.
  • Switch mRNAs include on-switch mRNAs that are translationally activated by translational control factors and off-switch mRNAs that are translationally repressed. Both the on-switch mRNA and the off-switch mRNA contain one or more binding motifs that specifically recognize an RNA-binding protein that constitutes a translation control factor, and a nucleic acid sequence that encodes the target protein.
  • a binding motif refers to a nucleic acid sequence that specifically recognizes a particular RNA-binding protein and forms an RNA-protein complex.
  • the off-switch mRNA has a Cap structure or a Cap analogue at the 5' end, and comprises one or more binding motifs that specifically recognize an RNA-binding protein that constitutes a translational control factor, and a nucleic acid sequence that encodes the first target protein. including.
  • the off-switch mRNA of the present invention typically has one or more binding motifs in the 5'UTR, and the binding motifs are stabilized by an RNA scaffold structure.
  • the off-switch mRNA of the present invention preferably has binding motifs for two or more RNA-binding proteins, and at least two of the binding motifs are linked via an RNA scaffold structure.
  • RNA scaffold structure means a structure that is linked to one or more binding motifs and thereby stabilizes the motifs. Structures having one or more stem regions due to base pairing are included. The base pairs of the stem region can be designed according to the desired stability (usually the number of base pairs forming the stem region is believed to improve stability).
  • binding motifs When two or more binding motifs are linked, at least one of them should have a scaffold structure, but from the viewpoint of stability, it is preferable that all the binding motifs are linked. In addition, two or more motifs may be connected via other structures (eg, loop structures, etc.) without including a stem region or not including a stem region.
  • stabilizing the binding motif means that compared to the case without a scaffold structure, fluctuations in the structure of RNA are reduced, and the probability that RNA has the potential secondary structure described below is increased. do.
  • the binding motif for the RNA-binding protein contained in the off-switch mRNA of the present invention is not particularly limited as long as it binds to the protein. Binding of the RNA-binding protein to RNA via the binding motif suppresses translation of the target protein. Taking the case where the RNA-binding protein is MS2CP as an example, it can be designed appropriately by referring to known literature (eg Grahn E et al., RNA. 7(11):1616-1627 (2001)). can be done.
  • At least one of the binding motifs has the following formula (I) (nucleotide sequence shown as SEQ ID NO: 1): (In the formula, N 1 to N 15 each independently represent A, C, G or U; R represents G or A; Y represents U or C; N 1 and N 15 , N 2 and N 14 , N 3 and N 13 , N 4 and N 12 , N 5 and N 11 , N 6 and N 10 , and N 7 and N9 form a base pair or a wobble base pair, respectively.
  • formula (I) nucleotide sequence shown as SEQ ID NO: 1: (In the formula, N 1 to N 15 each independently represent A, C, G or U; R represents G or A; Y represents U or C; N 1 and N 15 , N 2 and N 14 , N 3 and N 13 , N 4 and N 12 , N 5 and N 11 , N 6 and N 10 , and N 7 and N9 form a base pair or a wobble base pair, respectively.
  • N 1 is A
  • N 2 is G or C (preferably G)
  • N 3 is G
  • N 4 is U
  • N 5 is G
  • N 6 is G
  • N 7 is G
  • N 8 is U
  • N9 is C
  • N10 is C
  • N11 is C
  • N12 is A
  • N13 is U
  • N14 is C or G (preferably C)
  • N15 is U
  • R is A
  • Y is C A structure is mentioned.
  • RNA having a potential secondary structure represented by n and m in formula (II) are each independently an integer of typically 1000 or less, preferably 100 or less (eg, 50, 20, 10, etc.).
  • the potential secondary structure such as the structure represented by the above formula (I) or (II) is referred to as the "binding motif of the RNA-binding protein" (sometimes simply abbreviated as “binding motif”). and when the RNA-binding protein is MS2CP, it is also referred to as “MS2CP-binding motif”.
  • Potential secondary structure refers to a secondary structure that stably exists under physiological conditions. & Kiryu, H. Parallel computation of genome-scale RNA secondary structure to detect structural constraints on human genome. BMC Bioinformatics 17, 203 (2016)).
  • Xa and Xb when n and m are different integers, Xa and Xb have a bulge loop. Even when n and m are the same integer, Xa and Xb form The stem structure may have a bulge loop, but from the viewpoint of stability of the MS2CP-binding motif, a stem structure without a bulge loop is preferred.
  • the off-switch of the present invention containing two MS2CP-binding motifs comprises a structure in which n and m are each independently 0 to 5 (e.g., 1) in formula (II) above, and Exemplary structures include structures in which n and m are 1 in formula (II) above, where Xa and Xb are C and G, respectively.
  • n and m are each independently 5 to 10 (e.g., 7). 7, where Xa and Xb are ACGAGCG and CGCUCGU, respectively.
  • RNA switch of the present invention contains two or more binding motifs
  • at least two structures represented by structure (II) above may be linked via a multi-branched loop.
  • the number of nucleotides in the hyperbranched loop is also not particularly limited, but is, for example, 4 to 10, or 5 to 9 (eg, 7).
  • the multibranched loop may have another structure, for example, another multibranched loop (the multibranched loop may further have another structure such as a helix loop structure). For example, it may be linked to 0 to 10 (eg, 2 to 5) stem structures.
  • an integrated structure composed of multiple secondary structures such as a structure having a plurality of structures represented by formula (II) and including a binding motif such as an MS2CP-binding motif, is referred to as an "RNA binding protein It is sometimes referred to as a "binding domain for” (sometimes simply abbreviated as “binding domain”).
  • binding domains are typically formed from at least two types of structures selected from hairpin structures, helix structures, bulge loops, internal loops (inteRNAl-loops), multi-branched loops and pseudoknot structures. be done.
  • binding motif L7Ae binding motif for example, known literature (e.g. Shi X et al., Nat Chem Biol. 12(3): 146-152 (2016)) can be appropriately designed in consideration of Specific examples include those having a structure represented by the following formula (III).
  • the LIN28A binding motif can be appropriately designed in consideration of known literature (e.g., Kawasaki S et al., Nucleic Acids Res. 45(12): e117 (2017)). include those having a stem-loop structure containing the GGGAU sequence.
  • it is also possible to control the degree of activation or repression of translation by appropriately designing the position, sequence, and structure of the binding motif in RNA, modification of nucleotide residues, and the like.
  • N 1 to N 11 each independently represent A, C, G or U; N2 and N10 , and N3 and N9 form a base pair or a wobble base pair, respectively.
  • the length of a binding motif can be any number of bases, and can generally be about 200 nucleotides or less, such as about 100 nucleotides or less, preferably about 50 nucleotides or less, more preferably about 40 nucleotides or less. Nucleotide or less.
  • the length of the binding domain can also be any number of bases, and can typically be about 300 nucleotides or less, such as about 200 nucleotides or less, preferably about 150 nucleotides or less. If the total number of nucleotides is small, mass production is easier, and there is also a large cost advantage.
  • the lower limit of the length of the binding motif and binding domain is not particularly limited as long as it contains the binding motif sequence (eg, the sequence represented by SEQ ID NO: 1). more than a nucleotide.
  • the first target protein may be a protein that is the target of translational control, and the type of protein is not particularly limited.
  • the protein of interest may be a nuclease and may be a Cas protein or variant thereof.
  • the protein of interest may be anti-CRISPR, which inactivates Cas protein.
  • the protein of interest may be a marker protein.
  • a marker protein is a protein that is expressed from an mRNA switch, functions as a marker within a cell, and can identify the cell.
  • a marker protein may be, by way of example, a protein that can be visualized and quantified, such as by fluorescence, luminescence, coloration, or by assisting fluorescence, luminescence or coloration.
  • marker proteins include proteins that directly affect cell function. Examples include cell proliferation proteins, cell death proteins, cell signaling factors, drug resistance genes, transcription control factors, translation control factors, differentiation control factors, reprogramming inducers, RNA binding protein factors, chromatin control factors, and membrane proteins. but not limited to these.
  • a cell proliferation protein functions as a marker by allowing only cells that express it to proliferate and identifying proliferated cells.
  • a cell-killing protein kills the cell itself by inducing cell death of the cell in which it is expressed, and functions as a marker indicating whether the cell is alive or dead.
  • a cell signaling factor is a marker that the cells in which it is expressed emits a specific biological signal, and the identification of this signal serves as a marker.
  • Cell killing proteins are exemplified by, for example, Bax or Bim.
  • the off-switch mRNA is preferably oriented from the 5' end to the 3' end [5'UTR with a Cap structure or Cap analog at the 5' end and containing a binding motif], [encoding the first protein of interest
  • the open reading frame containing the nucleic acid sequence] and the [3'UTR containing PolyA] may be linked in this order.
  • the Cap structure or Cap analog can be selected from the same options as for the first mRNA.
  • the binding motif can be located anywhere on the 3' side of the Cap structure or Cap analog and upstream of the translation initiation codon (ie, 5'UTR). Since the translational activity of the on-switch of the present invention can be changed depending on the position of the binding motif within the 5'UTR, the position can be appropriately adjusted depending on the purpose.
  • a spacer may optionally be included between the Cap structure or Cap analog and the binding motif, and/or between the binding motif and the initiation codon.
  • the nucleic acid sequence of the spacer is not particularly limited as long as it does not form a secondary structure within the switch mRNA and does not interact with the first and second mRNAs.
  • each spacer may be any number of bases, 0 to 800 bases, 0 to 700 bases, 0 to 600 bases, 0 to 500 bases, 0 to 450 bases, 0 to 400 bases, 0 to 350 bases, 0-300 bases, 0-250 bases, 0-200 bases, 0-150 bases, 0-100 bases, 0-50 bases, 0-40 bases, 0-30 bases, 0-20 bases or 0- 10 bases are exemplified.
  • Base sequences such as restriction enzyme sites are also included in the base sequence of the spacer. Translational activity can be adjusted by adjusting the number of bases in the spacer.
  • a specific example of the 5'UTR of the off-switch mRNA is the sequence shown in SEQ ID NO: 12 (AGGUCAGAUCCGCUAGCGGAUCCGGGAGCAGGUGAGGAUCACCCAUCUGCCACGAGCGAGGUGAGGAUCACCCAUCUCGCUCGUGUUCCCACCGGUCGCCCACC), but is not limited to a specific sequence.
  • the 3'UTR containing PolyA of the off-switch mRNA can be designed in the same manner as the 3'UTRs of the first and second mRNAs.
  • the off-switch mRNA functions to suppress the translation of the first target protein by specifically recognizing and binding its binding motif to the RNA-binding protein.
  • the RNA-binding protein is MS2CP
  • the higher the binding strength between MS2CP and the binding motif the lower the translational activity.
  • translational activity is suppressed when a motif that binds to MS2CP is used in .
  • MS2CP also has the function of suppressing translation by binding to the binding motif, and the translation level is mediated by the VPg protein.
  • the off-switch of the present invention includes two or more binding motifs, and at least two of them are linked via a scaffold structure, the sequence of the binding motifs is changed, or the nucleotide residues are subjected to specific modifications. For this reason, it is thought that by increasing the binding ability to RNA-binding proteins to a certain level or higher, the protein's translation-suppressing action is induced without being limited to a specific structure.
  • On-switch mRNA does not have a 7-methylguanosine 5'-phosphate structure at the 5' end, and encodes a binding motif that specifically recognizes an RNA-binding protein that constitutes a translational control factor, and a second target protein. and a nucleic acid sequence that
  • the on-switch mRNA preferably has a modification at the 5' end that has only the former of the RNA degradation suppression effect and the translation activation effect that a normal Cap structure has. That is, any structure may be used as long as it is not recognized by eIF4E, which is a translation initiation factor. More specifically, it is preferable to have a structure that does not have a 7-methylguanosine 5'-phosphate structure at the 5' end. Modifications at the 5' end of on-switch mRNA include, for example, A-Cap (G(5')ppp(5')A).
  • the on-switch mRNA typically has one or more binding motifs in the 5'UTR, and the binding motif is not particularly limited as long as it specifically recognizes and binds to the RNA-binding protein. Binding of the RNA-binding protein to RNA via the binding motif activates translation of the protein encoded by the RNA. Taking the case where the RNA-binding protein is MS2CP as an example, binding motifs include those having the structure represented by the above formula (II).
  • the second target protein is a protein that activates the translation of the on-switch mRNA and increases the amount of translation.
  • the second protein of interest can be selected from the same options as the substances exemplified as the first protein of interest.
  • the first target protein and the second target protein can be appropriately selected according to the desired action.
  • the first protein of interest and the second protein of interest are, for example, a combination of a protein having a positive activity and a protein having a negative activity with respect to the desired activity such as apoptosis activity and nuclease activity. can.
  • Examples thereof include, but are not limited to, a combination of an apoptosis-inducing protein and an apoptosis-inhibiting protein, a combination of Cas protein and anti-CRISPR that inactivates Cas protein, and the like.
  • the on-switch mRNA is preferably oriented from the 5' end to the 3' end [5'UTR without a 7-methylguanosine 5'-phosphate structure and containing a binding motif], [second protein of interest
  • the open reading frame containing the nucleic acid sequence encoding] and [3'UTR containing PolyA] may be linked in this order.
  • the 5'UTR of the on-switch mRNA should have a binding motif on the 3' side of the modified structure at the 5' end.
  • the position of the binding motif in the 5'UTR and the sequence and number of spacers can be the same as those of the off-switch mRNA.
  • a specific example of the 5'UTR of the on-switch mRNA is the sequence shown in SEQ ID NO: 13 (GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUACAUGAGGAUUACCCAUGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACC), but is not limited to a specific sequence.
  • the 3'UTR containing PolyA of the on-switch mRNA can be designed in the same manner as the 3'UTRs of the first and second mRNAs.
  • Each of the first, second, and switch mRNAs described above may be modified at the sugar residue (ribose) of each nucleotide for the purpose of reducing cytotoxicity.
  • Modified sites in the sugar residue include, for example, those in which the 2'-, 3'- and/or 4'-position hydroxy groups or hydrogen atoms of the sugar residue are replaced with other atoms.
  • Types of modifications include, for example, fluorination, alkoxylation (e.g., methoxylation, ethoxylation), O-allylation, S-alkylation (e.g., S-methylation, S-ethylation), S-allylation. , amination (eg —NH 2 ).
  • Such modification of sugar residues can be performed by a method known per se (for example, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).
  • sugar residues of the first, second, and switch mRNAs can also be BNA: Bridged nucleic acid (LNA: Linked nucleic acid) that forms a crosslinked structure at the 2' and 4' positions. Modification of such sugar residues can also be performed by a method known per se (e.g., Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003), Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)).
  • BNA Bridged nucleic acid
  • the first, second, and switch mRNAs may have modified (eg, chemically substituted) nucleobases (eg, purines, pyrimidines).
  • modified nucleobases eg, purines, pyrimidines
  • modifications include, for example, pyrimidine modifications at position 5, purine modifications at positions 6 and/or 8, modifications with exocyclic amines, substitutions with 4-thiouridine, substitutions with 5-bromo or 5-iodo-uracil. mentioned.
  • modified bases such as pseudouridine ( ⁇ ), N1-methylpseudouridine (N1m ⁇ ), and 5-methylcytidine (5mC) are included in place of normal uridine and cytidine. You can stay.
  • the positions of the modified bases can be all or part of them independently, and when they are part, they can be random positions at any ratio.
  • Phosphate groups (eg, terminal phosphate residues) contained in the first, second, and switch mRNAs of the present invention may be modified to enhance resistance to nucleases and hydrolysis, and the like.
  • the P(O)O group serving as a phosphate group is P(O)S (thioate), P(S)S (dithioate), P(O)NR 2 (amidate), P(O)R, R( O) optionally substituted with OR', CO or CH2 (formacetal) or 3'-amine (-NH- CH2 - CH2- ), wherein each R or R' is independently H or substituted or unsubstituted alkyl (eg, methyl, ethyl)].
  • the linking group is exemplified by -O-, -N- or -S-, and can be linked to adjacent nucleotides through these linking groups.
  • the present inventors have confirmed that, depending on the type of RNA modification, there is a difference in the binding strength between the RNA-binding protein and the binding motif for the protein. Therefore, by appropriately changing the type of modification, it is also possible to adjust the binding strength between the RNA-binding protein and the binding motif for the protein. Specific modifications to the above nucleobases, sugar residues and phosphate residues are shown below, but are not limited to these.
  • the first, second, and switch mRNAs can be synthesized by those skilled in the art by any method known in genetic engineering, once the molecular structures and nucleic acid sequences are determined according to the above. For example, it can be obtained as a synthetic mRNA molecule by an in vitro transcription method using a template DNA containing a promoter sequence as a template.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing introduction of first, second, off-switch, and on-switch mRNAs into cells. Introduction of mRNA into cells can be performed in vitro or in vivo, and is not particularly limited.
  • RNA molecules can be introduced directly into cells.
  • Introduction of the first, second, and switch mRNAs into cells in vivo can use any method commonly used to introduce RNA into cells in vivo.
  • Methods for directly introducing RNA molecules into cells include, for example, the lipofection method, the polymer method, the electroporation method, the calcium phosphate coprecipitation method, the DEAE dextran method, the microinjection method, and the gene gun method.
  • RNA molecules can be introduced directly into cells.
  • Introduction of the first, second, and switch mRNAs into cells in vivo can use any method commonly used to introduce RNA into cells in vivo.
  • introduction methods such as intramuscular, subcutaneous, intravenous, and intra-articular injection.
  • the advantage of introducing synthetic RNA molecules is that the introduced mRNA is degraded with a half-life of about several days, so there is no integration into the genome, and the cells after introduction can be easily used for medical applications. be done.
  • the synthetic mRNA since the synthetic mRNA has a high transfection efficiency, it is possible to express a predetermined amount of the first and second fusion proteins in the cell, and to introduce the switch mRNA for expressing the target protein with high efficiency. It is advantageous in that it is possible to
  • the first, second and switch mRNAs are preferably co-introduced into the cell. Since the activity ratio of the proteins expressed from the two or more co-introduced mRNAs becomes constant in the cell, the first fusion protein, the second fusion protein, and the switch mRNA can be introduced at a constant ratio. It's for.
  • DNA constructs such as RNA expression vectors can also be used to introduce the first, second, and switch mRNAs into cells.
  • expression vectors encoding the first, second, and switch mRNAs can be designed separately, and the two expression vectors can be directly introduced into cells by the same introduction method as described above.
  • Expression vectors encoding the sequences of the first mRNA and the second mRNA can be well-known and commonly used in the art. For example, a virus vector, an artificial chromosome vector, a plasmid vector, an expression system using a transposon (sometimes called a transposon vector) and the like.
  • viral vectors examples include retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, Sendai viral vectors and the like.
  • artificial chromosome vectors include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC) and the like.
  • a plasmid vector mammalian plasmids in general can be used, and for example, an episomal vector can be used.
  • transposon vectors include expression vectors using piggyBac transposons. It is also possible to design DNA constructs that express two or more of the first mRNA, the second mRNA, the switch mRNA as separate mRNAs from a single RNA expression vector.
  • the first mRNA and the second mRNA are transcribed from the expression vector and generated by being transcribed in the cell.
  • the mRNA and switch mRNA can function like a directly introduced synthetic mRNA molecule to express the first fusion protein and the second fusion protein.
  • the method of introducing the DNA construct into the cell is advantageous, for example, when integrating into the genome of the cell to prepare a cell stably expressing the first fusion protein, the second fusion protein and the switch mRNA, It is advantageous in selecting or discriminating those that have been pre-incorporated into pluripotent stem cells or transgenic animals and differentiated into specific cell types.
  • the amount of the first, second, and switch mRNAs to be introduced into the cell varies depending on the type of target cell and the structure of the mRNA, and is not limited to a specific amount.
  • the introduction amount that can achieve translational regulation of the desired protein of interest in target cells can be determined by preliminary experiments and the like.
  • the first and second mRNAs introduced into the cell generate the first and second fusion proteins within the cell (Fig. 1 (A)).
  • the first target-binding molecule and the second target-binding molecule specifically recognize and bind to the first site and second site of the target protein, respectively.
  • a complex is formed in which the caged intein N-terminal domain of the first fusion protein and the caged intein C-terminal domain of the second fusion protein are bound (Fig. 1(B)).
  • a complex consisting of the target protein, the first target-binding molecule, the second target-binding molecule, and the bound caged intein is released from the complex in FIG.
  • the rearranged translational control factor acts on the switch mRNA to control translation.
  • the first fusion protein expressed from the mRNA of and the second fusion protein exist in the cell as separate proteins without binding, that is, the translation control factor is not reconstituted.
  • the first fusion protein and the second fusion protein are not reconstituted, they do not control the translation of the switch mRNA, and the expression of the target protein encoded by the switch mRNA is not controlled.
  • the translational control method comprises the step of introducing into a cell at least four types of mRNA, a first mRNA, a second mRNA, an off-switch mRNA, and an on-switch mRNA (Fig. 2 ).
  • a complex of the first and second fusion proteins expressing the first and second mRNAs is produced, and the translation control factor is reconstituted.
  • the translational control factor specifically recognizes and binds to on-switch mRNA and off-switch mRNA by means of RNA-binding proteins. Then, translation of the target protein encoded by the on-switch mRNA can be activated, and translation of the target protein encoded by the off-switch mRNA can be suppressed.
  • the protein translational control system according to the present invention can also be provided as a translational control kit containing the first mRNA, the second mRNA, the switch mRNA, or the DNAs encoding these.
  • the translation control kit includes a medium suitable for culturing cells including target cells, and instructions for handling the first mRNA, the second mRNA, the switch mRNA, or the DNA encoding these.
  • the instructions may include information such as experimental methods for determining the appropriate amount of mRNA to be introduced in a particular cell, and the appropriate amount to be introduced depending on the cell type.
  • a kit comprising the protein translation control system according to this embodiment enables cell-selective protein translation control.
  • the (a) mRNA and the (b) mRNA may be a single mRNA.
  • This single mRNA may be such that one mRNA molecule is capable of expressing the first and second fusion proteins as separate and distinct molecules. More specifically, a single mRNA comprises, in 5' to 3' orientation, a nucleic acid sequence encoding said second fusion protein, a self-cleavage sequence encoding a self-cleavage peptide, and said first fusion. and a nucleic acid sequence that encodes the protein.
  • the 5'UTR and 3'UTR can be designed in the same way as the first or second mRNA above. and the open reading frame is, in the 5′ to 3′ direction, a nucleic acid sequence encoding the second fusion protein, a self-cleavage sequence encoding the self-cleavage peptide, and a nucleic acid encoding the first fusion protein.
  • Arrays can be designed to contain, in that order.
  • the self-cleaving peptide may be a viral 2A peptide or a 2A-like peptide with similar functions. Examples include, but are not limited to, F2A, E2A, T2A, P2A, and the like. Modifications of sugar residues in the design of mRNA molecules may be modified as described in the first embodiment.
  • the translation control method according to the second embodiment also includes the step of introducing a single mRNA expressing the first and second fusion proteins and the switch mRNA into a cell.
  • the translation control system and method according to the second embodiment eliminates the need to separately prepare and introduce the first and second mRNAs, and the possibility that some cells express only either the first or second fusion protein. has the advantage of eliminating
  • Template DNA was prepared by PCR using PrimeSTAR Max DNA Polymerase and purified with Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (New England Biolabs). Using this template DNA as a template, transcription reaction was carried out at 37°C for about 6 hours using MEGAscript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). At this time, 6 mM ATP, CTP, GTP, N1-methylpseudoUTP and 4.8 mM CleanCap Reagnt AG (3'OMe) (TriLink) were used as NTP and Cap analog.
  • RNACleanXP Natural Genetics
  • Quick CIP New England Biolabs
  • RNeasy Mini Kit Qiagen
  • RNA concentration was measured with Nanodrop ONE.
  • the size of the purified mRNA was confirmed using a Bioanalyzer and RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Inc.). Template DNA names and sequence numbers are shown in Table 3 below.
  • ⁇ Introduction of plasmid DNA into cells > 1 ⁇ 10 4 HeLa cells were seeded in each well of a 96-well transparent flat-bottomed white plastic plate and cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for one day. After that, pDNA was transfected into cells in each well with 0.3 ⁇ l of TransIT-X2 (Takara Bio).
  • ⁇ Introduction of messenger RNA into cells > 1 ⁇ 10 4 HeLa cells were seeded in each well of a 96-well transparent flat-bottomed white plastic plate and cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for one day. After that, cells in each well were transfected with mRNA using 0.2 ⁇ l of Lipofectamine MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific).
  • ⁇ Luciferase assay> After culturing the cells in a CO 2 incubator at 37°C for 1-2 days after transfection, luciferase analysis of Luc2 and NanoLuc respectively was performed using the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) and the GloMax Navigator Microplate Luminometer (Promega). Activity was measured. After correcting the luminescence of Luc2 with the luminescence of NanoLuc, which is a transfection control, it was expressed as a relative value with the value of the negative control group in each experiment set to 1.
  • Example 1 eDHFR Sensing-Induced Translational Repression in Plasmid DNA Introduction
  • translational control factors were split into RNA-binding proteins, each was fused with a caged intein and a target-binding molecule, a nanobody (antigen-binding domain of a single-chain antibody).
  • Caliciviral VPg-based translational activator (CaVT, SEQ ID NO: 11), which can be used for both translational repression and translational activation by changing the sequence of the switch mRNA to be controlled, was selected as the translational control factor to be split.
  • both cleaved CaVT fragments bind to the target protein via nanobodies.
  • the caged intein acts to reconstitute full-length CaVT and bind to the switch mRNA (Figs. 1 and 2).
  • Caged intein is based on DnaE intein derived from Nostoc punctiforme (Npu), and reconstruction with Npu DnaE intein requires that the N-terminal amino acid in the C-terminal fragment is cysteine. Since the CaVT RNA-binding protein contains two cysteines, residues 46 and 88, a plasmid that expresses a CaVT split at one of these positions fused with the Npu DnaE intein DNA was constructed (Fig. 4(A)).
  • this plasmid DNA uses the original Npu DnaE intein instead of a caged intein, even if the target protein is not present, CaVT can be reactivated if both the N-terminal and C-terminal CaVT fragments are present. composition occurs.
  • these plasmid DNAs were introduced into HeLa cells together with a Luc2-expressing plasmid DNA with a strong CaVT-binding motif added to the 5' untranslated region so that CaVT would repress translation, the split at residue 46 showed a Luc2 translational repression was observed when both CaVT fragment and C-terminal CaVT fragment were expressed. On the other hand, no clear inhibition of translation was observed in the one split at the 88th residue (Fig. 4(B)).
  • Example 2 Translation repression and translation activation induced by detection of eDHFR in mRNA transfection Since translation repression by detection of eDHFR was confirmed in plasmid DNA, next, split CaVT and its translational control target were introduced by mRNA. We decided to investigate whether it is possible to detect eDHFR and induce translational repression. HeLa cells were transfected with mRNA expressing split CaVT, mRNA expressing eDHFR, and Luc2 mRNA with a strong CaVT-binding motif added to the 5' untranslated region to be subject to translational repression by CaVT. , Luc2 translational repression was induced in response to eDHFR only when both N-terminal and C-terminal fragments of split CaVT were introduced (Figs. 6A and 6B).
  • Non-Patent Document 1 Luc2 mRNA with the structure required for translational activation by CaVT was prepared and introduced into HeLa cells together with split CaVT mRNA and eDHFR mRNA. However, translational activation in response to eDHFR was observed only (Figs. 6A and 6C).
  • Example 3 EGFP detection-induced translational repression and translational activation in mRNA transfection Any protein can be detected and translational repression or translational activation can be induced by altering the site of the nanobody that binds to the target protein.

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Abstract

細胞の種類に応じて、選択的に目的タンパク質の翻訳制御を可能とするシステム。　以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：　（ａ）標的分子の第１部位を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、翻訳制御因子のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、　（ｂ）標的分子の第２部位を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、前記翻訳制御因子のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、　（ｃ）前記翻訳制御因子を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、目的タンパク質をコードする核酸配列とを含むスイッチmRNA、 またはこれらをコードするDNAを含み、　前記翻訳制御因子が、RNA結合タンパク質を含む、タンパク質の翻訳制御システム。

Description

タンパク質の翻訳制御システム
　本発明は、細胞内の分子を指標とした細胞選択的なタンパク質の翻訳制御システム及びこれに用いる翻訳制御方法に関する。
　COVID-19のパンデミックに伴い、mRNAワクチンをはじめとするmRNA医薬に注目が集まっている。天然の真核細胞生物の細胞内において、細胞の核内にある遺伝物質であるDNAが転写されてmRNAを生成し、このmRNAが細胞質内で翻訳されることによりタンパク質が発現される。一方、mRNA医薬は、人工的に合成されたmRNAを外部から投与することにより、核内のDNAを介することなく、ワクチンや疾患治療に役立つタンパク質を発現させることができる。
　mRNA医薬は、世界的に注目される新規創薬モダリティである。mRNA医薬は、分泌タンパク質、細胞内シグナル分子などあらゆるタンパク質の発現に対応可能であることや、DNAとは異なり、ゲノムへの挿入変異によるがん化の危険性が無いこと、細胞質に入るだけでタンパク質を発現し、原理的には非分裂細胞も含めたあらゆる細胞に適応可能であることなど、多くの利点を備えている。
　本発明者らは、タンパク質の翻訳活性化及び翻訳抑制の両方の作用を備える人工翻訳制御因子を開発し、報告してきた（例えば、非特許文献１を参照）。この人工翻訳制御因子は、翻訳活性化因子であるCap模倣ドメインとRNA結合タンパク質とを備える。そして、Cap構造と、人工翻訳制御因子のRNA結合タンパク質に特異的に認識される所定の結合モチーフと、所望のタンパク質をコードする核酸配列とを備えるmRNAに対しては、人工翻訳制御因子が強く結合し、翻訳を抑制することができる。一方、正規のCap構造を有さず、人工翻訳制御因子のRNA結合タンパク質に特異的に認識される別の所定の結合モチーフと、所望のタンパク質をコードする核酸配列とを備えるmRNAに対しては、人工翻訳制御因子が弱く結合し、翻訳を活性化することができる。そのため、単一の人工翻訳制御因子を用いて、あるmRNAの翻訳は抑制し、別のあるmRNAの翻訳は活性化することが可能となる。
H. Nakanishi and H. Saito, Nature Communications, 2020 Mar 10;11(1):1297.doi: 10.1038/s41467-020-15061-x.
　しかし、人工翻訳制御因子を所定の細胞において選択的に機能させることは未だ報告例がない。細胞の種類に応じて、目的タンパク質の選択的な翻訳制御を可能とするシステムの開発が望まれる。
　本発明者らは鋭意検討の結果、翻訳制御因子の断片を細胞に導入し、細胞内の任意の標的分子、例えば標的タンパク質等に応答して、全長の翻訳制御因子を再構成するシステムを構築した。これにより、標的分子を指標として、細胞の種類に応じた選択的なタンパク質の翻訳制御が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を含む。
　［１］　以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
　（ａ）標的分子の第１部位を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、翻訳制御因子のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、
　（ｂ）標的分子の第２部位を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、前記翻訳制御因子のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、
　（ｃ）前記翻訳制御因子を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、目的タンパク質をコードする核酸配列とを含むスイッチmRNA、
またはこれらをコードするDNAを含み、
　前記翻訳制御因子が、RNA結合タンパク質を含む、タンパク質の翻訳制御システム。
　［２］　前記（ａ）のmRNAが、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のmRNAであり、前記（ｂ）のmRNAが、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のmRNAである、［１］に記載のシステム。
　［３］　前記（ａ）のmRNAと、前記（ｂ）のmRNAが、5'から3'の向きに、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む単一のmRNAである、［１］に記載のシステム。
　［４］　前記翻訳制御因子が、RNA結合タンパク質と、翻訳活性化因子とを含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のシステム。
　［５］　前記翻訳制御因子のN末端ドメインが、前記RNA結合タンパク質の第１の部分を含み、前記翻訳制御因子のC末端ドメインが、前記RNA結合タンパク質の第２の部分と、前記翻訳活性化因子とを含む［１］～［４］のいずれか１項に記載のシステム。
　［６］　前記ケージドインテインのN末端ドメインが、ケージドeNpu N-インテインもしくはその変異体であり、前記ケージドインテインのC末端ドメインが、ケージドNpu C-インテインもしくはその変異体である、［１］～［５］のいずれか１項に記載のシステム。
　［７］　前記スイッチmRNAが、
　（Ａ）前記翻訳制御因子により翻訳抑制されるオフスイッチmRNA、および／または
　（Ｂ）前記翻訳制御因子により翻訳活性化されるオンスイッチmRNA
であり、
　前記オフスイッチmRNAが、5’末端にCap構造もしくはCapアナログを備え、前記RNA結合タンパク質を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、第１の目的タンパク質をコードする核酸配列とを含み、
　前記オンスイッチmRNAが、7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、前記RNA結合タンパク質を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、第２の目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む、
　［１］～［６］のいずれか１項に記載のシステム。
　［８］　前記RNA結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、［１］～［７］のいずれか１項に記載のシステム。
　［９］　前記ＭＳ２ＣＰに対する結合モチーフが、下記の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、
　Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
　ＲはＧ又はＡを表し；
　ＹはＵ又はＣを表し；
　Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有する、［８］に記載のシステム。
　［１０］　前記オフスイッチmRNAが、前記ＭＳ２ＣＰを特異的に認識する２以上の結合モチーフを含み、当該２以上の結合モチーフの少なくとも２つが、RNAの足場構造を介して連結されている、［８］または［９］に記載のシステム。
　［１１］　［１］～［１０］のいずれか１項に記載のシステムを、細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳制御方法。
　本発明によれば、所望の標的分子を含有する細胞種に特異的に、翻訳制御因子を再構成することができる。そして、翻訳制御因子を、目的タンパク質をコードするスイッチmRNAに作用させることで、目的タンパク質の翻訳抑制及び／または翻訳活性化が可能になる。また、標的分子に結合する標的結合分子を交換することで、任意の標的分子により、特異的に、翻訳制御因子を再構成することができるため、任意の細胞において、細胞特異的な目的タンパク質の翻訳抑制及び／または翻訳活性化を実現することができる。
図１（Ａ）は、第１及び第２のmRNAが細胞に導入され、第１及び第２のmRNAが翻訳された状態、（Ｂ）は、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質の両者が標的タンパク質に結合した状態、（Ｃ）は再構成された全長の翻訳制御因子（左）と、ケージドインテインの作用により脱離したケージドインテイン、標的結合分子、および標的タンパク質に由来する複合体（右）を示す概念図である。 図２は、第１、第２、オフスイッチ、及びオンスイッチmRNAの細胞への導入を模式的に示す図である。 図３は、再構成された全長の翻訳制御因子が、オンスイッチmRNA（下左）と、オフスイッチmRNA（下右）との両者を制御することを模式的に示す図である。 図４（Ａ）は、Npu DnaEインテインを用いた予備実験において設計したプラスミドDNA構築物を示す図であり、（Ｂ）は、各分割部位における、翻訳抑制因子のＮ末端のみ、Ｃ末端のみ、再構成された翻訳抑制因子による翻訳抑制結果を示すグラフである。 図５（Ａ）は、本発明の実施例１による第１、第２のmRNAをコードするプラスミドDNA構築物（左）及び、オフスイッチmRNAをコードするDNA構築物（右上）、目的タンパク質の発現量を測定するためのコントロールとして使用したNlucをコードするDNA構築物（右中）、標的タンパク質eDHFRをコードするmRNAを示す図であり、（Ｂ）は、それぞれの構築物及びmRNAを細胞に導入した場合の翻訳抑制結果を示すグラフである。 図６Ａは、上から順に、本発明の実施例２による第１のmRNA、第２のmRNA、標的タンパク質eDHFRをコードするmRNA、標的タンパク質のネガティブコントロールであるEGFPをコードするmRNA、Luc2を目的タンパク質とするオフスイッチmRNA、Luc2を目的タンパク質とするオンスイッチmRNA、目的タンパク質の発現量を測定するためのコントロールとして使用したNlucをコードするmRNAを示す図である。 図６Ｂは、それぞれのmRNAを細胞に導入した場合のオフスイッチmRNAの翻訳抑制結果を示すグラフである。 図６Ｃは、それぞれのmRNAを細胞に導入した場合のオンスイッチmRNAの翻訳活性化結果を示すグラフである。 図７Ａは、上から順に、本発明の実施例３による第１のmRNA、第２のmRNA、標的タンパク質EGFPをコードするmRNA、標的タンパク質のネガティブコントロールであるeDHFRをコードするmRNA、Luc2を目的タンパク質とするオフスイッチmRNA、Luc2を目的タンパク質とするオンスイッチmRNA、目的タンパク質の発現量を測定するためのコントロールとして使用したNlucをコードするmRNAを示す図である。 図７Ｂは、それぞれのmRNAを細胞に導入した場合のオフスイッチmRNAの翻訳抑制結果を示すグラフである。 図７Ｃは、それぞれのmRNAを細胞に導入した場合のオンスイッチmRNAの翻訳活性化結果を示すグラフである。
　以下に、本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
　本発明は、タンパク質の翻訳制御システム及び方法に関する。本発明に係るシステムは、
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
　（ａ）標的分子の第１部位を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、翻訳制御因子のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、
　（ｂ）標的分子の第２部位を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、前記翻訳制御因子のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、
　（ｃ）前記翻訳制御因子を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、目的タンパク質をコードする核酸配列とを含むスイッチmRNA、
またはこれらをコードするDNAを含み、
　前記翻訳制御因子が、RNA結合タンパク質を含む。
　本発明の第１実施形態においては、本発明に係るシステムは、（ａ）のmRNAが、標的分子の第１部位を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、翻訳制御因子のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のmRNAであり、（ｂ）のmRNAが、標的分子の第２部位を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、前記翻訳制御因子のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のmRNAである。すなわち、第１実施形態においては、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むmRNAと、第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むmRNAとを別個の分子として含む。
　以下、第１実施形態による、タンパク質の翻訳制御システム及び方法を説明する。本実施形態に係る方法は、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のmRNAまたはこれらをコードするDNAを、細胞に導入する工程を含む。
　本実施形態は、タンパク質の翻訳制御システム及び方法に関し、特には、標的分子を指標として細胞選択的に目的タンパク質の翻訳を制御するシステム及び方法に関する。標的分子を指標として細胞選択的に目的タンパク質の翻訳を制御するとは、標的分子が存在する細胞においてのみ、（ｃ）のスイッチmRNAがコードする目的タンパク質の翻訳を制御可能とすることをいう。より詳細には、翻訳制御因子の非存在下もしくは翻訳制御因子が分割された状態にある対照と比較して、再構成された翻訳制御因子の存在下で、スイッチmRNAがコードする目的タンパク質の翻訳量を増加させること（すなわち、目的タンパク質の翻訳を活性化すること）、または目的タンパク質の翻訳量を減少させること（すなわち、目的タンパク質の翻訳を抑制すること）を意味する。本明細書において、選択的に翻訳制御を生じさせる細胞種を標的細胞とも指称する。また、それ以外の細胞種を総称して非標的細胞とも指称する。
　本明細書においては、標的分子が存在する細胞においてのみ、（ａ）のmRNAが発現する第１の融合タンパク質と、（ｂ）のmRNAが発現する第２の融合タンパク質に基づいて翻訳制御因子を再構成し、再構成された翻訳制御因子が、（ｃ）のスイッチmRNAの翻訳を制御可能にする。
　標的分子とは、本発明に係る方法の実施の時点において標的細胞内に存在する分子をいうものとし、ある実施態様においては、標的細胞の細胞質内もしくは核内に存在する分子をいうことができる。標的分子は、他の分子により特異的に認識可能な、第１の結合部位と、第２の結合部位を持つものであれば特には限定されない。ただし、標的分子上の第１の結合部位と、第２の結合部位は、別個の部位であることが好ましい。標的分子はまた、細胞に対する毒性がないものが好ましい。標的分子の具体例としては、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、及び天然化合物、またはこれらの断片などが例示される。翻訳制御の目的に応じて、適宜標的分子を選択することができ、例えば細胞内状態に応じて目的タンパク質の発現を制御したい場合、検知したい細胞内状態に特異的な分子であれば、タンパク質であってもペプチドであってもよい。また、外部から標的分子を導入して制御したい場合であれば、細胞膜を透過しやすい低分子化合物を選択することができる。さらに、細胞内における、天然もしくは人工的な反応の結果として生じる代謝産物を標的分子とすることもでき、この場合の代謝産物は、低分子化合物等であってもよい。
　以下、本発明においては、主として標的分子がタンパク質またはその断片である場合について説明する。タンパク質またはその断片からなる標的分子を以下、標的タンパク質ともいう。本発明に係る方法においては、標的細胞において目的タンパク質を選択的に発現抑制し、あるいは発現活性化することを目的として、標的タンパク質を選択、決定し、標的タンパク質に基づいて、（ａ）及び（ｂ）のmRNAを設計することができる。標的タンパク質は、例えば、標的細胞と非標的細胞の間で発現量や存在量に大きな差があるタンパク質を選択することが好ましい。標的タンパク質以外の標的分子についても、標的細胞と非標的細胞の間で存在する量に大きな差がある分子を選択することが好ましい。
　標的タンパク質の例としては、特定の細胞に内在するタンパク質が挙げられる。特定の細胞に内在するタンパク質としては、当該細胞の分化の段階に応じて発現されるタンパク質、当該細胞の疾患の状態に応じて発現されるタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。これらの標的タンパク質の存在に応じて翻訳制御因子を再構成することで、各標的タンパク質により特徴づけられる分化段階にある細胞、あるいは疾患状態にある細胞において、スイッチmRNAがコードする目的タンパク質の翻訳制御を行うことができる。標的タンパク質の別の例としては、細胞に外部から導入された物質に起因して生成されるタンパク質が挙げられる。外部から導入された物質に起因して生成されるタンパク質としては、ゲノム編集により修復された遺伝子に起因して当該細胞において生成し得るタンパク質、mRNAワクチン接種やmRNA医薬によって当該細胞において生成され得るタンパク質、プラスミドDNAやウイルスベクターなどによって当該細胞において生成され得るタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。また、標的タンパク質以外の標的分子は、特定の疾患の状態において細胞内で産生される分子や、細胞中で人工的に産生した分子が挙げられ、その種類は限定されない。これらの標的分子、特には標的タンパク質の存在を指標として、翻訳制御因子を再構成することで、標的分子が存在する細胞において、スイッチmRNAがコードする目的タンパク質の翻訳制御を行うことができる。
　本明細書において、「細胞」とは、特に限定されるものではなく任意の細胞であってよい。細胞は、単一の細胞であってもよく、２以上の細胞の集まりである、「細胞集団」であってもよい。「細胞集団」には理論上の数の上限はなく、任意の数の細胞からなる集団をいうものとする。例えば、「細胞集団」は、複数種類の異なる細胞が含まれ得る細胞集団であって、標的細胞と非標的細胞とを含みうる細胞集団であってよい。
　「細胞」は、単細胞生物種もしくは多細胞生物種から採取した細胞であってもよく、さらに人為的な操作を加えた細胞（細胞株を含む）であってもよい。例えば、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられるが、中でも動物細胞が好ましい。動物細胞としては、例えば、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト等）に由来する細胞が挙げられる。哺乳動物に由来する細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（例：HEK293細胞）、ヒト肝癌由来細胞（例：HepG2）、ヒトFL細胞などの細胞株であってもよく、ヒト及び他の哺乳動物の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
　細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、（A）幹細胞、（B）前駆細胞、（C）最終分化した体細胞、（D）そのほかの細胞のいずれであってもよい。（A）幹細胞の例としては、以下のものに限定されないが、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞などが挙げられる。（B）前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。（C）体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、中枢・抹消神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。（D）そのほかの細胞としては、例えば、分化誘導を経た細胞が挙げられ、多能性幹細胞から分化誘導した前駆細胞および体細胞も含まれる。また、体細胞または前駆細胞から未分化な状態を経ることなく直接所望の細胞に分化した、いわゆる「ダイレクトコンバージョン（direct reprogramming、trans-differentiationともいう）」により誘導された細胞であってもよい。
　第１実施形態において、（ａ）の第１のmRNA及び（ｂ）の第２のmRNAは、それぞれ、第１及び第２の融合タンパク質を発現するmRNAである。第１の融合タンパク質は翻訳制御因子のN末端ドメインを含有し、第２の融合タンパク質は翻訳制御因子のC末端ドメインを含有する。そして、細胞内に標的タンパク質が存在する場合に会合して、当該細胞内で、全長の翻訳制御因子を再構成する。
　図１を参照して、細胞内に導入される（ａ）の第１のmRNA及び（ｂ）の第２のmRNAの作用について説明する。図１（A）は、第１及び第２のmRNAが細胞に導入され、第１及び第２のmRNAが翻訳された状態を示す概念図である。図１（A）は、標的タンパク質（左）、第１の融合タンパク質（中）、第２の融合タンパク質（右）を模式的に表す。第１の融合タンパク質は、第１のmRNAが細胞内で翻訳されて生成する物質であり、N末端から、翻訳制御因子のN末端ドメイン、ケージドインテインのN末端ドメイン、および第１の標的結合分子がこの順に結合されている。第２の融合タンパク質は、第２のmRNAが細胞内で翻訳されて生成する物質であり、N末端から、第２の標的結合分子、ケージドインテインのC末端ドメイン、翻訳制御因子のC末端ドメインがこの順に結合されている。
　細胞内に標的タンパク質が存在する場合、第１の融合タンパク質の第１の標的結合分子が標的タンパク質の第１部位を特異的に認識して結合し、第２の融合タンパク質の第２の標的結合分子が標的タンパク質の第２部位を特異的に認識して結合する。図１（B）は、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質の両者が標的タンパク質に結合した状態を示す。これにより、ケージドインテインのN末端ドメインと、ケージドインテインのC末端ドメインが結合する。次いで、ケージドインテインの作用により、翻訳制御因子のN末端ドメインとC末端ドメインが結合し、全長の翻訳制御因子を再構成する。図１（C）は再構成された全長の翻訳制御因子（左）と、ケージドインテインの作用により脱離したケージドインテイン、標的結合分子、および標的タンパク質に由来する複合体（右）を示す。
　第１及び第２の融合タンパク質の設計について説明する。第１及び第２の融合タンパク質の設計においては、再構成される全長の翻訳制御因子を設計する。翻訳制御因子は、一般的には人工翻訳制御因子であって、少なくともRNA結合タンパク質を含む。より詳細には、翻訳抑制に用いられる翻訳制御因子はRNA結合タンパク質を含むか、RNA結合タンパク質からなる。翻訳活性化に用いられる翻訳制御因子は、RNA結合タンパク質と翻訳活性化因子とを含む。本明細書において、全長の翻訳制御因子とは、N末端ドメインとC末端ドメインとが再構成された後の翻訳制御因子であって、スイッチmRNAに対し翻訳制御機能を有する翻訳制御因子をいうものとする。
　RNA結合タンパク質とは、特定のRNA配列を特異的に認識し、RNA－タンパク質複合体形成するタンパク質をいう。本明細書において、このようなRNA結合タンパク質を特異的に認識し、結合する特定のRNA配列を「結合モチーフ」もしくは「タンパク質結合モチーフ」という。RNA結合タンパク質は、結合モチーフと結合できるタンパク質であれば、特に制限なく本発明に用いることができる。具体的には、RNA結合タンパク質としては、例えば、ＭＳ２ＣＰ、Ｌ７Ａｅ、ＬＩＮ２８Ａ、ＰＰ７ＣＰ、ｄＣａｓ１３、これらの改変体（例えば、ＭＳ２ＣＰの場合、V29I変異体、L77P変異体、W82R変異体、C101R変異体、dlFG変異体等）、RNA結合能を有するそれらの断片などが挙げられる。ＭＳ２ＣＰ、Ｌ７Ａｅ、ＬＩＮ２８Ａを用いて、目的タンパク質の翻訳の活性化及び／又は抑制は既に実証されている。RNA結合タンパク質は、好ましくは、ＭＳ２ＣＰ又はその改変体である。本発明の一態様において、RNA結合タンパク質としては、配列番号５、７及び９のいずれかで示されるアミノ酸配列（各配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号４、６及び８で示す。）、配列番号５、７及び９のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号５、７及び９のいずれかで示されるアミノ酸配列と85％以上（例：90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。本明細書において、RNA結合タンパク質には、野生型のRNA結合タンパク質、その改変体やそれらの断片も包含されるものとする。
　アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy =10; gap allowed; matrix=BLOSUM62; filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。
　翻訳活性化因子としては、翻訳開始因子をリクルートして翻訳を活性化できるものであれば特に限定されない。本発明の一態様において、翻訳活性化因子として、ＶＰｇ(viral protein genome-linked)タンパク質を含む。以下では、翻訳活性化因子としてＶＰｇを例に挙げて説明するが、ＶＰｇ以外の翻訳化因子を用いる場合には、「ＶＰｇ」を他の翻訳活性化因子に読み替えるものとする。本発明の翻訳制御システムは、上記の構成により、タンパク質の翻訳を活性化又は抑制することができる。
　ＶＰｇタンパク質としては、タンパク質の翻訳活性化機能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、ベシウイルス属、ラゴウイルス属、又はポティウイルス属に属するウイルス由来のＶＰｇタンパク質、該ＶＰｇタンパク質の改変体や翻訳活性化機能を有するその断片が挙げられる。かかるベシウイルス属に属するウイルスとしては、ネコカリシウイルス(NCBI Accession No:NP_783307.1)、イヌベシウイルス(NCBI Accession No:NP_786908.1)、豚水疱疹ウイルス(NCBI Accession No:NP_786894.1)、ラゴウイルス属に属するウイルスとしては、ウサギ出血病ウイルスのＶＰｇ(NCBI Accession No:NP_740330.1)、ポティウイルス属に属するウイルスとしては、Lupinus mosaic virus、Bean yellow mosaic virus、Papaya leaf distortion mosaic virusなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベシウイルス属に属するウイルス、特にネコカリシウイルスである。本発明の一態様において、ＶＰｇタンパク質としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列（該配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号２で示す。
）、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、2個、3個、4個、5個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と85％以上（例：90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。本明細書において、「ＶＰｇタンパク質」には、ＶＰｇタンパク質、ＶＰｇタンパク質改変体やそれらの断片も包含されるものとする。
　ある実施形態において、翻訳抑制と翻訳活性化の両方の機能をもつ翻訳制御因子は、RNA結合タンパク質とＶＰｇタンパク質とを含む融合タンパク質であってもよい。あるいは、翻訳制御因子は、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＧＫドメイン、ＧＢドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、RNA結合タンパク質と、ＶＰｇタンパク質とにそれぞれ融合させたものであってもよい。
　翻訳制御因子が融合タンパク質である場合、RNA結合タンパク質がN末端側に、ＶＰｇタンパク質がC末端側に存在してもよく、RNA結合タンパク質がC末端側に、ＶＰｇタンパク質がN末端側に存在してもよく、これらの間にリンカーが存在してもよい。
　本発明の好適な態様において、翻訳抑制と翻訳活性化の両方の機能をもつ翻訳制御因子は、RNA結合タンパク質とＶＰｇタンパク質との融合タンパク質であって、非特許文献１に開示されたCaliciviral VPg-based Translational activator（ＣａＶＴ）であってよい。当該翻訳制御因子は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（該配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０で示す。）、配列番号１１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、2個、3個、4個、5個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と85％以上（例：90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。
　第１及び第２の融合タンパク質の設計にあたり、翻訳制御因子をN末端ドメインとC末端ドメインとに分割する。翻訳制御因子をN末端ドメインとC末端ドメインとに分割する箇所は、以下の条件を満たす限りにおいて特に限定されない。すなわち、再構成前の各ドメインが単独で翻訳抑制並びに翻訳活性化の作用を持たないこと、ケージドインテインにより翻訳制御因子が再構成されること、再構成後に翻訳制御因子の機能が維持されることである。例えば、翻訳制御因子は、その必須構成成分であるRNA結合タンパク質が分割される態様にて、N末端ドメインとC末端ドメインとに分割することが好ましい。また、RNA結合タンパク質の三次元構造を解析した場合に、αヘリックスやβシートを構成しないループ部分にてN末端ドメインとC末端ドメインとに分割することができる。
　翻訳抑制機能のみを持つ翻訳制御因子のN末端ドメインは、RNA結合タンパクのN末端断片を含み、C末端ドメインは、RNA結合タンパクのC末端断片を含む。
　翻訳抑制と翻訳活性化の両方の機能を持つ翻訳制御因子のN末端ドメインは、ある実施態様においては、RNA結合タンパクのN末端断片を含み、翻訳制御因子のC末端ドメインは、RNA結合タンパクのC末端断片と翻訳活性化因子を含む。別の実施態様においては、翻訳制御因子のN末端ドメインは、翻訳活性化因子とRNA結合タンパクのN末端断片を含み、翻訳制御因子のC末端ドメインは、RNA結合タンパクのC末端断片を含む。例えば、翻訳制御因子がＣａＶＴである場合に、分割箇所は、例えば、４５残基目のチロシンと４６残基目のシステインの間であってよい。あるいは、この分割箇所からN末端側もしくはC末端側へ５アミノ酸残基以内であれば分割箇所を変更してもよいが、その場合はαヘリックスやβシートを構成しない部位を選択することが好ましい。適切な分割箇所は、当業者による事前実験やシミュレーションにより確認することができる。
　ケージドインテインは、通常のインテインと異なり、他のドメインを介した相互作用がある場合にのみ再構成を引き起こすタンパク質であり、他のドメインを介した相互作用非依存的な再構成を妨げるためのケージ構造が融合されたインテインとして定義される。また、Nインテインに対するケージ構造としてはCインテイン類似配列を有するタンパク質またはペプチドが、Cインテインに対するケージ構造としてはNインテイン類似配列を有するタンパク質またはペプチドがそれぞれ利用可能である。本発明においては、他のドメインは第１及び第２の標的結合分子である。ケージドインテインは、任意のものを用いることができる。例えば、Gramespacher J. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 35, 13708-13712に開示された、ケージドインテインのN末端ドメインであるケージドeNpu N-インテイン（配列番号１４）及びＣ末端ドメインであるケージドNpu C-インテイン（配列番号１５）を用いることができるが、これらには限定されない。各配列を表１に示す。表中、ボールド体は、Nインテイン由来配列（配列番号１４中）、Cインテイン由来配列（配列番号１５中）下線部はリンカー配列、四角で囲んだ部分は、Cインテイン類似配列（配列番号１４中）、Nインテイン類似配列（配列番号１５中）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　配列番号１４中、本来のNインテイン由来の配列は、１残基目から１０２残基目までである。１２５残基目から１５４残基目までの３０残基からなる配列と、１６０残基目から１８９残基目までの３０残基からなる配列は、同一であり、Cインテイン類似配列である。１０３残基目から１２４残基目までの２２残基からなる配列は、Nインテイン由来配列とCインテイン類似配列のリンカー配列である。１５５残基目から１５９残基目までの５残基からなる配列は、Cインテイン類似配列間のリンカー配列である。配列番号１４に示すケージドeNpu N-インテインは、Cインテイン類似配列を２リピート含む配列であるが、Cインテイン類似配列を１リピートにした配列、３リピート以上にした配列、並びにリンカー配列のアミノ酸の種類を変更した配列も、ケージドeNpu N-インテインと同様に用いることができる。同様に、配列番号１５中、１残基目から５２残基目までの５２残基からなる配列は、Nインテイン類似配列であり、５３残基目から７４残基目までの２２残基からなる配列は、Nインテイン類似配列とCインテイン由来配列とのリンカー配列であり、７５残基目から１０９残基目までの３５残基からなる配列は、Cインテイン由来配列である。ケージドNpu C-インテイン中のNインテイン類似配列を２リピート、または３リピート以上にした配列、並びにリンカー配列のアミノ酸の種類を変更した配列も、ケージドNpu C-インテインと同様に用いることができる。
　ケージドインテインの活性を損なわない限り、ケージドeNpu N-インテインの変異体、およびケージドNpu C-インテインの変異体も用いることができる。変異体としては、例えば、配列番号１４、１５のアミノ酸配列に対し、アミノ酸配列に保存的置換を行った変異体、アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１４、１５で示されるアミノ酸配列と８５％以上（例：９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体が挙げられるが、これらには限定されない。
　第１及び第２の標的結合分子は、それぞれ、標的分子、特には標的タンパク質の第１及び第２部位を特異的に認識する分子である。第１及び第２の標的結合分子は、標的タンパク質に適合するように選択し、あるいは設計することができる。標的結合分子は、標的分子に対する結合能を持つ分子であればよく、標的分子が抗原の場合には、抗体やペプチドアプタマー、フィブロネクチン由来の人工ペプチド、DARPinなどが挙げられる。標的分子が、タンパク質以外の分子である場合にも、標的分子に特異的に結合する分子を適宜決定することができる。例えば、低分子化合物に対しては、ラパマイシンを介したFKBP（FK506-binding protein）とFRB（FKBP-rapamycin binding protein）の結合などの相互作用を利用した標的結合分子が挙げられる。
　本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来である。本発明で用いる抗体は、フルボディ抗体であっても、フラグメント抗体（例：ナノボディ抗体、Fab、F(ab')2等であっても、それらの改変体（例：scFv等）であってもよく、本明細書では、これらを包含するものとして、「抗体」との用語を用いる。本発明で用いるペプチドアプタマーは、アミノ酸残基又は両末端部分に修飾が加えられたペプチドであってもよい。ペプチドアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選別することができる。限定はしないが、例えば、酵母のTwo-hybrid法により選別することができる。その他の分子についても、自体公知の方法に基づき、適宜作製することができる。標的結合分子は、抗体とは別種のタンパク質を改変して抗体と同様の抗原結合能を持たせた人工分子であってもよく、モノボディ、アフィボディ、アンチカリンなどが挙げられるが、これらには限定されない。
　例えば、標的タンパク質の異なる箇所を特異的に認識する２以上の標的結合分子が、データベースや文献から既知の場合には、既知の標的結合分子の中から、第１及び第２の標的結合分子を選択することができる。標的タンパク質において、第１部位と、第２部位は異なる部分であり、かつ第１部位と、第２部位とが、それぞれへの標的結合分子の結合を互いに阻害しない限りにおいて近位であることが好ましい。標的タンパク質の第１部位と第１の標的結合分子の相互作用、標的タンパク質の第２部位と第２の標的結合分子の相互作用により、ケージドインテインの再構成を生じさせるためである。
　標的タンパク質を特異的に認識する標的結合分子が未知の場合や、標的結合分子が１つしか知られていない場合には、標的タンパク質またはその断片を抗原として、アルパカなどのラクダ科動物を免疫して抗体を作らせ、その抗原認識部位の配列を入手する。これにより、標的タンパク質の異なる部位を特異的に認識する２以上のナノボディなどの標的結合分子を設計することができる。
　このようにして、全長の翻訳制御因子、翻訳制御因子のＮ末端ドメイン、ケージドインテインのＮ末端ドメイン、第１の標的結合分子を選択もしくは設計し、第１の融合タンパク質を設計し、構造を決定することができる。同様に、第２の標的結合分子、ケージドインテインのＣ末端ドメイン、翻訳制御因子のＣ末端ドメインを選択もしくは設計し、第２の融合タンパク質を設計し、構造を決定することができる。第１及び第２の融合タンパク質において、各ドメイン間は、直接結合されていてもよく、リンカーにより結合されていてもよい。リンカーの長さは特には限定されないが、例えば、２～３０アミノ酸長程度であってよく、２～１５アミノ酸長程度であってよい。
　第１及び第２の融合タンパク質の構造が決定されれば、これらを発現する第１及び第２のmRNAの構造を決定することができる。第１のmRNAは、5’末端から3’末端の向きに、［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む5'UTR］、［第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むオープンリーディングフレーム］、［PolyAを含む3'UTR］が、この順に連結した構造であってよい。
　第１のmRNAの5'UTRは、5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む。Cap構造は、７メチルグアノシン５’リン酸であってよい、CapアナログはCap構造と同様に翻訳開始因子であるeIF4Eによって認識される修飾構造であって、Ambion製のAnti-Reverse Cap Analog(ARCA)、New England Biolabs製のm7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog、TriLink製のCleanCapなどが挙げられるが、これらには限定されない。Capアナログは、翻訳開始因子により認識されるその他の修飾構造であってもよい。Cap構造もしくはCapアナログの3'側であって、開始コドンの5’側には、例えば０～５００塩基程度、好ましくは２０～２００塩基程度の任意核酸配列が含まれていてもよい。これらの任意核酸配列は、二次構造を形成せず、第２のmRNAと特異的に相互作用しない核酸配列であることが好ましい。また、5'UTR内には、開始コドンとなるAUGが存在しないことが好ましい。
　第１のmRNAのコーディング領域であるオープンリーディングフレームは、開始コドン、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列、および終始コドンを含む。第１の融合タンパク質をコードする核酸配列は、開始コドンAUGの3’側から、終止コドンの5’側の向きに、翻訳制御因子のN末端ドメインをコードする核酸配列、ケージドインテインのN末端ドメインをコードする核酸配列、および第１の標的結合分子をコードする核酸配列をこの順に含む。各ドメインをコードする核酸配列は、先に設計した第１の融合タンパク質の構造から決定することができる。
　第１のmRNAの3'UTRは、PolyA tailを含む。PolyA tailは、約５０～２５０のアデニン塩基を結合した配列であってよい。しかし、約５０～２５０のアデニン塩基が連続して結合している必要はなく、mRNAの安定性を保持できる限り、アデニン塩基の間に他の核酸塩基が含まれていてもよい。
　第２のmRNAは、5’末端から3’末端の向きに、［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む5'UTR］、［第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むオープンリーディングフレーム］、［PolyAを含む3'UTR］が、この順に連結した構造であってよい。［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを含む5'UTR］および［PolyAを含む3'UTR］の構成は、第１のmRNAと同じとすることができる。5’UTRおよび3’UTRの核酸塩基配列や核酸塩基数は、第１のmRNAと、第２のmRNAで同一であってもよく、異なっていてもよいが、同一とすることが好ましい。
　第２のmRNAのコーディング領域であるオープンリーディングフレームは、開始コドン、第２の融合タンパク質をコードする核酸配列、および終始コドンを含む。第２の融合タンパク質をコードする核酸配列は、開始コドンAUGの3’側から、終止コドンの5’側の向きに、第２の標的結合分子をコードする核酸配列、ケージドインテインのC末端ドメインをコードする核酸配列、翻訳制御因子のC末端ドメインをコードする核酸配列をこの順に含む。各ドメインをコードする核酸配列は、先に設計した第２の融合タンパク質の構造から決定することができる。
　（ｃ）スイッチmRNA
　スイッチmRNAは、翻訳制御因子により翻訳制御されるmRNAである。スイッチmRNAには、翻訳制御因子により翻訳活性化されるオンスイッチmRNAと、翻訳抑制されるオフスイッチmRNAとがある。オンスイッチmRNAと、オフスイッチmRNAは、いずれも、翻訳制御因子を構成するRNA結合タンパク質を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む。結合モチーフとは、特定のRNA結合タンパク質を特異的に認識し、RNA－タンパク質複合体形成する核酸配列をいう。以下に、オンスイッチmRNAと、オフスイッチmRNAの設計と構造について説明する。
　（Ａ）オフスイッチmRNA
　オフスイッチmRNAは、5’末端にCap構造もしくはCapアナログを備え、翻訳制御因子を構成するRNA結合タンパク質を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、第１の目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む。
　本発明のオフスイッチmRNAは、典型的には、5'UTRに１以上の結合モチーフを備え、結合モチーフがRNAの足場構造により安定化される。本発明の一態様において、本発明のオフスイッチmRNAは、２以上のRNA結合タンパク質に対する結合モチーフを有することが好ましく、該結合モチーフの少なくとも２つが、RNAの足場構造を介して連結される。本明細書において、「RNAの足場（scaffold）構造」とは、１以上の結合モチーフに連結し、それにより該モチーフが安定する構造を意味し、かかる構造としては、特に限定されないが、例えば、塩基対形成により１以上のステム領域を有する構造が挙げられる。所望の安定性によりステム領域の塩基対を設計することができる（通常、ステム領域を形成する塩基対の数に応じて安定性が向上すると考えられる）。また、結合モチーフが２以上連結する場合には、少なくとも一方に足場構造を有していればよいが、安定性の観点からは、全ての結合モチーフに連結していることが好ましい。また、２以上のモチーフは、ステム領域を含み、あるいはステム領域を含まずに他の構造（例えば、ループ構造等）を介して連結されていてもよい。本明細書において、結合モチーフが安定するとは、足場構造がない場合と比較して、RNAの構造のゆらぎが減少して、RNAが下述の潜在的二次構造を有する確率が高くなること意味する。
　本発明のオフスイッチmRNAに含まれる、RNA結合タンパク質に対する結合モチーフとしては、該タンパク質と結合するものであれば特に制限されない。上記結合モチーフを介したRNA結合タンパク質とRNAとの結合により、目的タンパク質の翻訳が抑制される。RNA結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合を例に挙げれば、例えば、既知の文献（例：Grahn E et al., RNA. 7(11):1616-1627 (2001)）を参酌して適宜設計することができる。具体的には、結合モチーフの少なくとも１つが、下記の式（Ｉ）（ヌクレオチド配列を配列番号１として示す。）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、
　Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
　ＲはＧ又はＡを表し；
　ＹはＵ又はＣを表し；
　Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有するRNAが挙げられる。一態様において、Ｎ１がＡ、Ｎ２がＧ又はＣ（好ましくはＧ）、Ｎ３がＧ、Ｎ４がＵ、Ｎ５がＧ、Ｎ６がＧ、Ｎ７がＧ、Ｎ８がＵ、Ｎ９がＣ、Ｎ１０がＣ、Ｎ１１がＣ、Ｎ１２がＡ、Ｎ１３がＵ、Ｎ１４がＣ又はＧ（好ましくはＣ）、Ｎ１５がＵ、ＲがＡ、ＹがＣである構造が挙げられる。
　式（Ｉ）をより安定化した構造として、式（ＩＩ）に示す以下の構造もまた、結合モチーフとして好ましく使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
　（式中、
　Ｎ１～Ｎ１５、Ｒ及びＹの定義は上記に記載の通りであり；；
　Ｘa及びＸbは、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵであり；
　ｎ及びｍは、それぞれ独立して、０以上の整数を表し；
　Ｘaは、Ｘbと共に、バルジループを有していてもよいステム構造を構成する。）
で表される潜在的二次構造を有するRNAが挙げられる。式（ＩＩ）におけるｎ及びｍは、それぞれ独立して、典型的には、１０００以下、好ましくは、１００以下（例：５０、２０、１０等）の整数である。
　本明細書において、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される構造等の潜在的二次構造を「RNA結合タンパク質の結合モチーフ」（単に「結合モチーフ」と略すこともある。）と称することがあり、RNA結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合には、「ＭＳ２ＣＰ結合モチーフ」ともいう。潜在的二次構造とは、生理条件下で安定に存在する二次構造をいい、潜在的二次構造を有するか否かは、実施例に記載された構造予測プログラム（ParasoR）(Kawaguchi, R. & Kiryu, H. Parallel computation of genome-scale RNA secondary structure to detect structural constraints on human genome. BMC Bioinformatics 17, 203 (2016))などによって決定できる。
　上記式（ＩＩ）において、ｎとｍが異なる整数である場合（には、ＸaとＸｂは、バルジループを有することとなる。ｎとｍが同じ整数である場合にも、ＸaとＸｂから形成されるステム構造は、バルジループを有していてもよいが、ＭＳ２ＣＰ結合モチーフの安定性の観点からは、バルジループを有さないステム構造であることが好ましい。
　好ましい態様において、ＭＳ２ＣＰ結合モチーフを２つ含む本発明のオフスイッチは、上記式（ＩＩ）において、ｎ及びｍが、それぞれ独立して、０～５（例えば、１）である構造を含み、さらに具体的な構造として、上記式（ＩＩ）におけるｎ及びｍが１であり、その場合のＸａ及びＸｂがそれぞれＣ及びＧである構造を含む。あるいは、上記式（ＩＩ）において、ｎ及びｍが、それぞれ独立して、５～１０（例えば、７）である構造を含み、さらに具体的な構造として、上記式（ＩＩ）におけるｎ及びｍが７であり、その場合のＸa及びＸｂがそれぞれＡＣＧＡＧＣＧ及びＣＧＣＵＣＧＵである構造を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のRNAスイッチに結合モチーフが２以上含まれる場合、上記構造（ＩＩ）で示される少なくとも２つの構造は、多分岐ループを介して連結されてもよい。前記多分岐ループのヌクレオチド数も特に限定されないが、例えば、４～１０個、又は５～９個（例：７個）である。また、前記多分岐ループには、他の構造、例えば、他の多分岐ループ（該多分岐ループは、さらにヘリックスループ構造等の他の構造を有していてもよい）を有していてもよい、例えば、０～１０個（例えば、２～５個）のステム構造などと連結していてもよい。本明細書において、ＭＳ２ＣＰ結合モチーフなどの結合モチーフを含み、式（ＩＩ）で示される構造を複数有する構造のように、複数の二次構造から構成される一体的な構造を、「RNA結合タンパク質に対する結合ドメイン」（単に「結合ドメイン」と略すこともある。）と称することもある。かかる結合ドメインは、典型的には、ヘアピン構造、ヘリックス構造、バルジループ、内部ループ（inteRNAl-loop）、多分岐ループ（multi-branched loop）及びシュードノット構造から選択される少なくとも２種類の構造から形成される。
　結合モチーフがＭＳ２ＣＰ結合モチーフ以外の場合にも、当業者であれば、対応するRNA結合タンパク質に合わせて、それに対応する結合モチーフやRNAドメインを設計することができる。結合モチーフがＬ７Ａｅ結合モチーフとしては、例えば、既知の文献（例：Shi X et al., Nat Chem Biol. 12(3):146-152 (2016)）を参酌して適宜設計することができ、具体的には、下記式（ＩＩＩ）で示される構造を有するものが挙げられる。結合モチーフがＬＩＮ２８Ａ結合モチーフとしては、例えば、既知の文献（例：Kawasaki S et al., Nucleic Acids Res. 45(12):e117 (2017)）を参酌して適宜設計することができ、具体的には、ＧＧＧＡＵ配列を含むステムループ構造を有するものが挙げられる。また、結合モチーフのRNA内における位置や配列、構造、ヌクレオチド残基の修飾等を適宜設計することで、翻訳の活性化又は抑制の程度を調節することも可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、
　Ｎ１～Ｎ１１は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
　Ｎ２とＮ１０とは、及びＮ３とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
　結合モチーフの長さは、任意の塩基数であってもよく、通常、約200ヌクレオチド以下であり得るが、例えば約100ヌクレオチド以下であり、好ましくは約50ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約40ヌクレオチド以下である。結合ドメインの長さも、任意の塩基数であってもよく、通常、約300ヌクレオチド以下であり得るが、例えば約200ヌクレオチド以下であり、好ましくは約150ヌクレオチド以下である。総ヌクレオチド数が少なければ、大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。結合モチーフ及び結合ドメインの長さの下限は、結合モチーフ配列（例えば、配列番号１で表わされる配列）を含む限り特に制限はないが、例えば15ヌクレオチド以上、好ましくは20ヌクレオチド以上、より好ましくは25ヌクレオチド以上である。
　第１の目的タンパク質は、翻訳制御の目的となるタンパク質であってよく、タンパク質の種類は特には限定されない。例えば、目的タンパク質はヌクレアーゼであってよく、Casタンパク質またはその改変体であってよい。別の実施形態において、目的タンパク質は、Casタンパク質を不活性化する、anti-CRISPRであってもよい。別の実施形態において、目的タンパク質は、マーカータンパク質であって良い。マーカータンパク質は、mRNAスイッチから発現されて、細胞内においてマーカーとして機能し、当該細胞を識別しうるタンパク質である。マーカータンパク質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、または蛍光、発光若しくは呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができるタンパク質であってよい。また、マーカータンパク質の別の例としては、細胞の機能に直接影響を与えるタンパク質類が挙げられる。細胞増殖タンパク質、細胞死滅タンパク質、細胞シグナル因子、薬剤耐性遺伝子、転写制御因子、翻訳制御因子、分化制御因子、リプログラミング誘導因子、RNA結合タンパク質因子、クロマチン制御因子、膜タンパク質を例示することができるが、これらには限定されない。例えば、細胞増殖タンパク質は、それを発現した細胞のみを増殖させ、増殖した細胞を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅タンパク質は、それを発現した細胞の細胞死を引き起こすことで、細胞自体を死滅させ、細胞の生死を示すマーカーとして機能する。細胞シグナル因子は、それを発現した細胞が、特定の生物学的信号を発し、この信号を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅タンパク質として、例えば、BaxまたはBimが例示される。
　オフスイッチmRNAは、好ましくは、5’末端から3’末端の向きに、［5’末端にCap構造もしくはCapアナログを備え、結合モチーフを含む5'UTR］、［第１の目的タンパク質をコードする核酸配列を含むオープンリーディングフレーム］、［PolyAを含む3'UTR］が、この順に連結した構造であってよい。
　Cap構造もしくはCapアナログは、第１のmRNAと同様の選択肢から選択することができる。結合モチーフは、Cap構造もしくはCapアナログの３’側であって、翻訳開始コドンよりも上流（即ち、5’UTR）であれば、どの位置に存在してもよい。5’UTR内における結合モチーフの位置により、本発明のオンスイッチの翻訳活性を変化させることができるため、目的に応じて適宜位置を調節することができる。
　Cap構造もしくはCapアナログと、結合モチーフとの間、及び／または結合モチーフと開始コドンとの間には、任意選択的にスペーサを含んでいてもよい。スペーサの核酸配列は特に限定されないが、スイッチmRNA内部で二次構造を形成せず、かつ第１及び第２のmRNAと相互作用しない配列であればよい。また、各スペーサの長さは、任意の塩基数であってよく、０～８００塩基、０～７００塩基、０～６００塩基、０～５００塩基、０～４５０塩基、０～４００塩基、０～３５０塩基、０～３００塩基、０～２５０塩基、０～２００塩基、０～１５０塩基、０～１００塩基、０～５０塩基、０～４０塩基、０～３０塩基、０～２０塩基または０～１０塩基が例示される。制限酵素サイトなどの塩基配列についてもスペーサの塩基配列に含まれるものとする。スペーサの塩基数を調節することで、翻訳活性を調節することができる。
　オフスイッチmRNAの5’UTRの具体例として、例えば配列番号１２で示される配列（AGGUCAGAUCCGCUAGCGGAUCCGGGAGCAGGUGAGGAUCACCCAUCUGCCACGAGCGAGGUGAGGAUCACCCAUCUCGCUCGUGUUCCCACCGGUCGCCACC）が挙げられるが、特定の配列には限定されない。オフスイッチmRNAのPolyAを含む3'UTRは、第１及び第２のmRNAの3'UTRと同様にして設計することができる。
　オフスイッチmRNAは、その結合モチーフを、RNA結合タンパク質が特異的に認識し、結合することにより、第１の目的タンパク質の翻訳が抑制されるように機能する。RNA結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合、ＭＳ２ＣＰと結合モチーフとの結合力が高いほど、翻訳活性が低くなること、さらにはＭＳ２ＣＰ結合モチーフを２つ有し、かつ特定の足場構造を有することにより、強固にＭＳ２ＣＰと結合するモチーフを用いた場合には、翻訳活性が抑制されることが発明者らの従来の研究により観察されている。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる観察から、ＭＳ２ＣＰには、結合モチーフと結合することで翻訳を抑制する機能も有しており、翻訳レベルは、ＶＰｇタンパク質を介した活性化と、ＭＳ２ＣＰを介した抑制のバランスによって決定され、RNAとＭＳ２ＣＰとの結合が強くなるに従い、ＭＳ２ＣＰを介した抑制作用が増強されるためであると推察される。そして、２つ以上のＭＳ２ＣＰが、例えば２つのＭＳ２ＣＰ結合モチーフが足場構造を介して連結した構造などを有する本発明のオフスイッチに結合することで、本発明の翻訳制御因子が常時RNAに結合している状態になる。このためにＶＰｇタンパク質によりリクルートされたリボソームがRNA上を進むのが阻害される結果、本発明のオフスイッチにコードされたタンパク質翻訳が抑制されると推察される。実際に、ＭＳ２ＣＰとＶＰｇタンパク質とで構成される翻訳制御因子ではなく、Ｌ７ＡｅとＶＰｇタンパク質とで構成される翻訳制御因子を用いた場合にも、Ｌ７Ａｅと強固に結合するモチーフを有するRNAを用いることで、翻訳の抑制効果が認められた。従って、本発明のオフスイッチは、結合モチーフを２つ以上含め、かつ少なくとも２つが足場構造を介して連結することや、結合モチーフの配列を変更すること、あるいはヌクレオチド残基に特定の修飾を施すことなどにより、RNA結合タンパク質との結合性を一定以上にすることにより、特定の構造に限定されることなくタンパク質の翻訳抑制作用が生じると考えられる。
　（Ｂ）オンスイッチmRNA
　オンスイッチmRNAは、5'末端に7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、翻訳制御因子を構成するRNA結合タンパク質を特異的に認識する結合モチーフと、第２の目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む。
　オンスイッチmRNAは、5'末端に、通常のCap構造が持つRNAの分解抑制効果と翻訳活性化効果のうち、前者だけを持つ修飾を備えることが好ましい。すなわち、翻訳開始因子であるeIF4Eによって認識されない構造であればよい。より具体的には、5'末端に、7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さない構造とすることが好ましい。オンスイッチmRNA の5’末端の修飾は、例えば、A-Cap（G(5′)ppp(5′)A）が挙げられる。
　オンスイッチmRNAは、典型的には、5'UTRに１以上の結合モチーフを備え、結合モチーフとしては、RNA結合タンパク質を特異的に認識し、結合するものであれば特に制限されない。上記結合モチーフを介したRNA結合タンパク質とRNAとの結合により、該RNAにコードされたタンパク質の翻訳が活性化される。RNA結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合を例にとれば、結合モチーフとしては、上記式（ＩＩ）で表される構造を有するものが挙げられる。
　第２の目的タンパク質は、オンスイッチmRNAが翻訳活性化されて翻訳量が増加されるタンパク質である。第２の目的タンパク質は、第１の目的タンパク質として例示した物質と同じ選択肢から選択することができる。なお、タンパク質の翻訳制御方法において、オンスイッチmRNAとオフスイッチmRNAとを併用する場合、第１の目的タンパク質と第２の目的タンパク質は、目的とする作用に応じて適宜選択することができる。第１の目的タンパク質と第２の目的タンパク質とは、例えば、アポトーシス活性、ヌクレアーゼ活性など、目的とする活性に対して、正の活性を持つタンパク質と負の活性を持つタンパク質の組み合わせとすることができる。例えば、アポトーシス誘導タンパク質と、アポトーシス抑制タンパク質の組み合わせ、Casタンパク質と、Casタンパク質を不活性化するanti-CRISPRの組み合わせ等が挙げられるが、これらには限定されない。
　オンスイッチmRNAは、好ましくは、5’末端から3’末端の向きに、［7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、結合モチーフを含む5'UTR］、［第２の目的タンパク質をコードする核酸配列を含むオープンリーディングフレーム］、［PolyAを含む3'UTR］が、この順に連結した構造であってよい。
　オンスイッチmRNAの5'UTRは、5'末端の修飾構造の3’側に結合モチーフを設ければよい。5'UTR内の結合モチーフの位置、スペーサの配列や数については、オフスイッチmRNAと同様とすることができる。
　オンスイッチmRNAの5’UTRの具体例として、例えば配列番号１３で示される配列（GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUACAUGAGGAUUACCCAUGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACC）が挙げられるが、特定の配列には限定されない。オンスイッチmRNAのPolyAを含む3'UTRは、第１及び第２のmRNAの3'UTRと同様にして設計することができる。
　以上に説明した第１、第２、及びスイッチmRNAは、いずれも細胞毒性を低減させるため等の目的で、各ヌクレオチドの糖残基（リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位及び／又は4’位のヒドロキシ基または水素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化（例、メトキシ化、エトキシ化）、O-アリル化、S-アルキル化（例、S-メチル化、S-エチル化）、S-アリル化、アミノ化（例、-NH2）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145参照)。
　また、第１、第２、及びスイッチmRNAの糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997);Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003)、Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)など参照）。また、第１、第２、及びスイッチmRNAは、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、5位ピリミジン改変、6及び／又は8位プリン改変、環外アミンでの改変、4-チオウリジンでの置換、5-ブロモ又は5-ヨード－ウラシルでの置換が挙げられる。また、細胞毒性を低減させること等を目的として、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン（Ψ）、N1-メチルシュードウリジン（N1mΨ）、5-メチルシチジン（5mC）等の修飾塩基を含んでいてもよい。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　ヌクレアーゼ及び加水分解に対する耐性等を高めるため、本発明の第１、第２、及びスイッチmRNAに含まれるリン酸基（例えば、末端のリン酸残基）が改変されていてもよい。例えば、リン酸基たるP(O)O基が、P(O)S（チオエート）、P(S)S（ジチオエート）、P(O)NR2（アミデート）、P(O)R、R(O)OR’、CO又はCH2（ホルムアセタール）又は3’-アミン（-NH-CH2-CH2-）で置換されていてもよい〔ここで各々のR又はR’は独立して、Hであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。連結基としては、-O-、-N-又は－Ｓ－が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
　本発明者らは、RNAの修飾の種類により、RNA結合タンパク質と該タンパク質に対する結合モチーフとの結合力に差異が生じることを確認している。従って、修飾の種類を適宜変更することで、RNA結合タンパク質と該タンパク質に対する結合モチーフとの結合力を調節することも可能である。上記核酸塩基、糖残基及びリン酸残基に対する具体的な修飾を以下に示すが、これらに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
　第１、第２、及びスイッチmRNAは、上記に従って、分子構造、核酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。例えば、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro転写法により、合成mRNA分子として得ることができる。
　次に、第１、第２、及びスイッチmRNAの細胞への導入について説明する。本実施形態に係るタンパク質の翻訳制御方法において、スイッチmRNAは、オンスイッチmRNAのみを導入してもよく、オフスイッチmRNAのみを導入してもよく、両者を導入してもよい。意図する翻訳制御作用により、導入するスイッチmRNAは適宜、選択することができる。また、これに応じて、翻訳制御因子の設計も変更し得る。図２は、第１、第２、オフスイッチ、及びオンスイッチmRNAの細胞への導入を模式的に示す図である。mRNAの細胞への導入は、in vitroで行うこともでき、in vivoで行うこともでき、特には限定されない。in vitroでの細胞への第１、第２、及びスイッチmRNAの導入は、in vitroでRNAを細胞に導入する方法として一般に用いられる任意の方法を用いることができる。RNA分子を直接、細胞に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、ポリマー法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などの導入法を用いて、RNA分子を直接、細胞に導入することができる。in vivoでの細胞への第１、第２、及びスイッチmRNAの導入は、in vivoでRNAを細胞に導入する方法として一般に用いられる任意の方法を用いることができる。例えば、哺乳動物に対しては、筋肉注射、皮下注射、静脈内注射、関節内注射などの導入法を用いて、RNA分子を直接、細胞に導入することができる。合成RNA分子の導入による利点は、導入されたmRNAは数日以内程度の半減期で分解されるため、ゲノムへの組み込みがなく、導入した後の細胞を医療応用などに使用しやすいことが挙げられる。また、合成mRNAは、トランスフェクション効率が高いため、細胞内で所定の量の、第１、第２の融合タンパク質を発現させ、また目的タンパク質を発現させるためのスイッチmRNAを高効率で導入することができる点で有利である。
　第１、第２、及びスイッチmRNAは、細胞に共導入することが好ましい。共導入した２以上のmRNAから発現するタンパク質の活性比は、細胞内において一定となるため、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、スイッチmRNAを一定の比率で導入することができるためである。
　細胞への第１、第２、及びスイッチmRNAの導入は、RNA発現ベクター等のDNA構築物を用いることもできる。この場合、第１、第２、及びスイッチmRNAをコードする発現ベクターを別個に設計し、上記と同様の導入法にて、２種の発現ベクターを直接、細胞に導入することができる。第１のmRNA、及び第２のmRNAの配列をコードする発現ベクターは、当該分野において周知慣用のものを用いることができ、例えば、ウイルスベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター、トランスポゾンを用いた発現システム（トランスポゾンベクターと呼ばれる場合がある）等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が例示される。人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、哺乳動物用プラスミド全般を使用することができ、例えば、エピソーマルベクターであってもよい。トランスポゾンベクターとしては、piggyBacトランスポゾンを用いた発現ベクター等が例示される。第１のmRNAと、第２のmRNA、スイッチmRNAのうちの２以上を、単一のRNA発現ベクターから、別個のmRNAとして発現させるDNA構築物を設計することも可能である。
　第１のmRNAと、第２のmRNAと、スイッチmRNAをコードするDNA構築物を細胞に導入することで、発現ベクターから転写され、細胞内で転写されて生成した第１のmRNAと、第２のmRNAと、スイッチmRNAを、直接導入した合成mRNA分子と同様に機能させ、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質を発現させることができる。DNA構築物を細胞に導入する方法は、例えば、細胞のゲノムに組み込んで、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質と、スイッチmRNAを安定的に発現する細胞を調製する場合に有利であり、多能性幹細胞やトランスジェニック動物に予め組込んでおき、特定の細胞種に分化したものを選別または判別する際などに有利である。
　細胞への第１、第２、及びスイッチmRNAの導入量は、標的細胞の種類や、mRNAの構造によっても異なり、特定の量に限定されるものではない。標的細胞における所望の目的タンパク質の翻訳制御を達成可能な導入量を、予備実験等により決定することができる。
　細胞に導入された第１のmRNAと、第２のmRNAは、細胞内で第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質を生成する（図１（A））。そして、細胞内に標的タンパク質が存在する場合、第１の標的結合分子と、第２の標的結合分子がそれぞれ、標的タンパク質の第１部位と、第２部位を特異的に認識して結合する。これにより、第１の融合タンパク質のケージドインテインＮ末端ドメインと、第２の融合タンパク質のケージドインテインＣ末端ドメインが結合した複合体を形成する（図１（B））。次いで、図１（B）の複合体から、標的タンパク質、第１の標的結合分子、第２の標的結合分子、結合されたケージドインテインからなる複合体が脱離して、翻訳制御因子が再構成される（（図１（C））。再構成された翻訳制御因子は、スイッチmRNAに作用し、翻訳制御を行う。一方、細胞内に標的タンパク質が存在しない場合、第１のmRNAと、第２のmRNAから発現する第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質は、結合することなく、別個のタンパク質として細胞内に存在する。すなわち、翻訳制御因子が再構成されることはない。そして、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質は、再構成されない場合は、スイッチmRNAの翻訳制御を行うことはなく、スイッチmRNAがコードする目的タンパク質の発現は制御されない。
　ある実施態様においては、翻訳制御方法は、細胞に、第１のmRNAと、第２のmRNAと、オフスイッチmRNAと、オンスイッチmRNAとの少なくとも４種のmRNAを導入する工程を含む（図２）。図３を参照すると、第１及び第２のmRNAが発現する第１及び第２の融合タンパク質の複合体が生成し、翻訳制御因子が再構成される。翻訳制御因子は、RNA結合タンパク質により、オンスイッチmRNA及びオフスイッチmRNAを特異的に認識して結合する。そして、オンスイッチmRNAがコードする目的タンパク質の翻訳を活性化するとともに、オフスイッチmRNAがコードする目的タンパク質の翻訳を抑制することができる。
　本発明に係るタンパク質の翻訳制御システムは、第１のmRNA及び第２のmRNA、スイッチmRNA、またはこれらをコードするDNAを含む翻訳制御キットとして提供することもできる。この場合、翻訳制御キットは、標的細胞を含む細胞の培養に適した培地や、第１のmRNA及び第２のmRNA、スイッチmRNA、またはこれらをコードするDNAの取り扱いのための説明書を含んでいてもよい。説明書には、特定の細胞における好適なmRNAの導入量を決定するための実験方法や、細胞種による適切な導入量などの情報を含んでいてもよい。本実施形態によるタンパク質の翻訳制御システムを備えるキットによれば、細胞選択的なタンパク質の翻訳制御が可能になる。
　本発明の第２実施形態においては、本発明に係るシステムは、（ａ）のmRNAと、（ｂ）のmRNAとが単一のmRNAであってよい。この単一のmRNAは、１つのmRNA分子が、第１及び第２の融合タンパク質を、分離した別個の分子として発現可能なものであってよい。より具体的には、単一のmRNAは、5'から3'の向きに、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む。
　単一のmRNAにおいても、5'UTR、3'UTRを、先の第１または第２のmRNAと同様に設計することができる。そして、オープンリーディングフレームが、5’末端から3’末端の向きに、第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とをこの順に含むように設計することができる。自己切断ペプチドとしては、ウイルスの２Ａペプチド、またはこれと同様の機能を備える２Ａ様ペプチドであってよい。例えば、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ等が挙げられるが、これらには限定されない。mRNA分子の設計における糖残基の修飾態様などは、第１実施形態において説明した変形態様を備えていてよい。
　第２実施形態による翻訳制御方法も、第１実施形態と同様に、第１及び第２の融合タンパク質を発現する単一のmRNAとスイッチmRNAとを細胞に導入する工程を含み、第１実施形態と同様に実施することができる。第２実施形態による翻訳制御システム及び方法は、第１及び第２のmRNAを別個に調製し、導入する必要がなく、第１または第２いずれか一方の融合タンパク質しか発現しない細胞が出る可能性を排除できるといった利点がある。
　以下に、本発明の実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
　［実験方法］
　〈pDNAの構築〉
　PCRによるインサートの作製はPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて行い、Monarch PCR & DNA Cleanup Kit（New England Biolabs）にて精製した。また、クローニングはIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて行った。pDNAは大腸菌DH5α株またはHST08株にて増幅し、Monarch plasmid miniprep kit （New England Biolabs）を用いて精製した。DNAの濃度測定にはNanodrop ONE（Thermo Fisher Scientific）を用いた。構築したプラスミドの配列はサンガーDNAシーケンシングサービス（Genewiz）にて確認した。プラスミドの名称と配列番号を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　〈mRNAのin vitro転写〉
　テンプレートDNAはPrimeSTAR Max DNA Polymeraseを用いたPCRにて作製し、Monarch PCR & DNA Cleanup Kit（New England Biolabs）にて精製した。このテンプレートDNAを鋳型として、MEGAscript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて37℃の転写反応を約6時間行った。またこの際、6 mMのATP、CTP、GTP、N1-メチルシュードUTPならびに4.8 mMのCleanCap Reagnt AG (3’OMe)（TriLink）をNTPならびにCapアナログとして用いた。反応終了後、RNACleanXP（日本ジェネティクス）にて精製し、Quick CIP（New England Biolabs）にて37℃脱リン酸化反応を30分間行ってから、RNeasy Mini Kit（Qiagen）にて精製した。RNA濃度はNanodrop ONEにて測定した。また、精製後のmRNAのサイズはBioanalyzerとRNA 6000ナノキット（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて確認した。テンプレートDNAの名称と配列番号を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　〈細胞へのプラスミドDNA導入〉
　96ウェル透明平底白色プラスチックプレートの各ウェルに1×104個のHeLa細胞を撒き、37℃のCO2インキュベーターにて一日間培養した。その後、TransIT-X2（タカラバイオ）0.3 μlにて各ウェルの細胞にpDNAをトランスフェクションした。
　〈細胞へのメッセンジャーRNA導入〉
　96ウェル透明平底白色プラスチックプレートの各ウェルに1×104個のHeLa細胞を撒き、37℃のCO2インキュベーターにて一日間培養した。その後、Lipofectamine MessengerMAX（Thermo Fisher Scientific）0.2 μlにて各ウェルの細胞にmRNAをトランスフェクションした。
　〈ルシフェラーゼアッセイ〉
　トランスフェクションから1～2日間37℃のCO2インキュベーターにて細胞を培養した後、Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）とGloMax Navigator Microplate Luminometer（Promega）を用いてLuc2とNanoLucそれぞれのルシフェラーゼ活性を測定した。Luc2の発光はトランスフェクションコントロールであるNanoLucの発光で補正した後、各実験におけるネガティブコントロール群の値を1とする相対値で表した。
　実施例1：プラスミドDNA導入における、eDHFRの検知により誘導される翻訳抑制
　標的タンパク質の存在下でのみスイッチmRNAの翻訳を抑制または活性化するため、翻訳制御因子をRNA結合タンパク質内で分割し、それぞれにケージドインテインと、標的結合分子であるナノボディ（一本鎖抗体の抗原結合ドメイン）を融合させた。分割する翻訳制御因子としては、制御対象のスイッチmRNAの配列を変えることで翻訳抑制にも翻訳活性化にも用いることが可能なCaliciviral VPg-based Translational activator（CaVT、配列番号１１）を選択した。標的タンパク質が存在すると、分割されたCaVTの両断片がナノボディを介して標的タンパク質に結合する。これによりケージドインテインの働きで完全長のCaVTが再構成されてスイッチmRNAに結合するという仕組みである（図１、２）。
　まずはCaVTをどの位置で分割すればケージドインテインによる再構成が可能かを検討した。ケージドインテインはNostoc punctiforme (Npu) 由来DnaEインテインを元にしており、Npu DnaEインテインによる再構成ではC末端側断片におけるN末端のアミノ酸がシステインである必要がある。CaVTのRNA結合タンパク質内に含まれるシステインは46残基目と88残基目の2つであるため、これらのいずれかの位置で分割したCaVTにNpu DnaEインテインを融合させたものを発現するプラスミドDNAを構築した（図４（Ａ））。なお、このプラスミドDNAではケージドインテインではなく元となったNpu DnaEインテインを使用しているため、標的タンパク質が存在していなくてもN末端側とC末端側両方のCaVT断片があればCaVTの再構成が起こる。これらのプラスミドDNAを、CaVTにより翻訳抑制されるよう5’非翻訳領域に強いCaVT結合モチーフを付加したLuc2発現プラスミドDNAとともにHeLa細胞に導入したところ、46残基目で分割した方ではN末端側とC末端側両方のCaVT断片を発現させた場合においてLuc2の翻訳抑制が認められた。一方、88残基目で分割した方では明確な翻訳抑制は認められなかった（図４（Ｂ））。
　次に、標的タンパク質によるCaVTの再構成とそれによる翻訳抑制について検討するため、46残基目、88残基目それぞれで分割したCaVTにケージドインテインとナノボディを融合させたものの発現プラスミドDNAを構築した（図５（Ａ））。ここでは、ナノボディとして大腸菌由来ジヒドロ葉酸レダクターゼ（eDHFR）に結合するナノボディであるNb113ならびにCA1698をそれぞれ用いた。図2の場合と同様、これらのプラスミドDNAをCaVTにより翻訳抑制されるよう設計したLuc2発現プラスミドDNAとともにHeLa細胞に導入した。この際、eDHFRを発現するmRNAも同時に導入した。その結果、46残基目で分割したものにおいては、eDHFRにより翻訳抑制が誘導された。一方、88残基目で分割したものでは、eDHFRによる翻訳抑制の誘導は認められなかった（図５（Ｂ））。
　実施例2：mRNA導入における、eDHFRの検知により誘導される翻訳抑制と翻訳活性化
　プラスミドDNAではeDHFR検知による翻訳抑制が確認できたため、次に、分割CaVTやその翻訳制御対象をmRNAで導入した場合もeDHFRを検知して翻訳抑制を引き起こせるかを検討することにした。図3と同じ構成の分割CaVTを発現するmRNA、eDHFRを発現するmRNA、ならびにCaVTにより翻訳抑制を受けるよう5’非翻訳領域に強いCaVT結合モチーフを付加したLuc2 mRNAをともにHeLa細胞に導入したところ、分割CaVTのN末端側とC末端側両断片を導入した場合にのみ、eDHFRに応答してLuc2の翻訳抑制が誘導された（図６Ａ、６Ｂ）。
　次に、この分割CaVTによりeDHFRに応答しての翻訳活性化も誘導可能であるかを検討した。5’非翻訳領域に弱いCaVT結合モチーフを持ち、なおかつ5’-Cap構造を翻訳不活性な類似体であるA-Capを用いたmRNAは、CaVTにより翻訳活性化されることを以前に報告している（非特許文献１）。このCaVTによる翻訳活性化に必要な構造を有するLuc2 mRNAを作製し、これを分割CaVT mRNAならびにeDHFR mRNAとともにHeLa細胞に導入したところ、分割CaVTのN末端側、C末端側両断片がある場合にのみ、eDHFRに応答しての翻訳活性化が認められた（図６Ａ、６Ｃ）。
　実施例3：mRNA導入における、EGFPの検知により誘導される翻訳抑制と翻訳活性化
　標的タンパク質に結合するナノボディの部位を変更すればどのようなタンパク質でも検知して翻訳抑制または翻訳活性化を誘導できるという本システムの汎用性を示すため、分割CaVTのナノボディ部分をeDHFRに結合するNb113とCA1698からEGFPに結合するLag16とGFP enhancer Nbに変更したものを構築した。このEGFP検知用に設計した分割CaVTのmRNAを、EGFP mRNAならびに強いCaVT結合モチーフを持つLuc2 mRNAとともにHeLa細胞に導入したところ、実施例2の場合と同様に、標的タンパク質によりLuc2の翻訳抑制が誘導された（図７Ａ、７Ｂ）。また、Luc2 mRNAとして弱いCaVT結合モチーフとA-Capを持つものを用いた場合も、実施例2と同様に標的タンパク質依存的に翻訳活性化が引き起こされた（図７Ａ、７Ｃ）。以上の結果より、本システムの汎用性が示されたといえる。

Claims (11)

  1. 　以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
    　（ａ）標的分子の第１部位を特異的に認識する第１の標的結合分子と、ケージドインテインのN末端ドメインと、翻訳制御因子のN末端ドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現するmRNA、
    　（ｂ）標的分子の第２部位を特異的に認識する第２の標的結合分子と、ケージドインテインのC末端ドメインと、前記翻訳制御因子のC末端ドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現するmRNA、
    　（ｃ）前記翻訳制御因子を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、目的タンパク質をコードする核酸配列とを含むスイッチmRNA、
    またはこれらをコードするDNAを含み、
    　前記翻訳制御因子が、RNA結合タンパク質を含む、タンパク質の翻訳制御システム。
  2. 　前記（ａ）のmRNAが、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のmRNAであり、前記（ｂ）のmRNAが、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のmRNAである、請求項１に記載のシステム。
  3. 　前記（ａ）のmRNAと、前記（ｂ）のmRNAが、5'から3'の向きに、前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列と、自己切断ペプチドをコードする自己切断配列と、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む単一のmRNAである、請求項１に記載のタンパク質の翻訳制御システム。
  4. 　前記翻訳制御因子が、RNA結合タンパク質と、翻訳活性化因子とを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
  5. 　前記翻訳制御因子のN末端ドメインが、前記RNA結合タンパク質の第１の部分を含み、前記翻訳制御因子のC末端ドメインが、前記RNA結合タンパク質の第２の部分と、前記翻訳活性化因子とを含む請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
  6. 　前記ケージドインテインのN末端ドメインが、ケージドeNpu N-インテインもしくはその変異体であり、前記ケージドインテインのC末端ドメインが、ケージドNpu C-インテインもしくはその変異体である、請求項１～５のいずれか１項に記載のシステム。
  7. 　前記スイッチmRNAが、
    　（Ａ）前記翻訳制御因子により翻訳抑制されるオフスイッチmRNA、および／または
    　（Ｂ）前記翻訳制御因子により翻訳活性化されるオンスイッチmRNA
    であり、
    　前記オフスイッチmRNAが、5’末端にCap構造もしくはCapアナログを備え、前記RNA結合タンパク質を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、第１の目的タンパク質をコードする核酸配列とを含み、
    　前記オンスイッチmRNAが、7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、前記RNA結合タンパク質を特異的に認識する１以上の結合モチーフと、第２の目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む、
    　請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
  8. 　前記RNA結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、請求項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
  9. 　前記ＭＳ２ＣＰに対する結合モチーフが、下記の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
    　ＲはＧ又はＡを表し；
    　ＹはＵ又はＣを表し；
    　Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
    で表される潜在的二次構造を有する、請求項８に記載のシステム。
  10. 　前記オフスイッチmRNAが、前記ＭＳ２ＣＰを特異的に認識する２以上の結合モチーフを含み、当該２以上の結合モチーフの少なくとも２つが、RNAの足場構造を介して連結されている、請求項８または９に記載のシステム。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のシステムを、細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳制御方法。
     
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