CN113383081A - 基质附着区和促进基因表达的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新鉴定的基质附着区（MAR）和嵌合序列。本发明还公开了核苷酸构建体，所述核苷酸构建体在相对于蛋白质编码序列的合适的位置包含MAR，以用于蛋白质的最佳表达。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. §119(e)要求2018年12月7日提交的美国临时申请序列号62/776,643的利益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
基因序列的转录（即mRNA的生成）在许多不同的水平受到控制。转录起始位点或启动子具有不同的强度，并且给定基因的转录起始频率也可以通过增强子序列增加。转录过程中的暂停可以影响转录速率，从而影响在给定时间段内产生的转录物的量。前体mRNA剪接、聚腺苷酸化和切割的速率也可以影响由转录单位产生的mRNA的水平。此外，mRNA分子内的序列可以调节其从细胞核到细胞质的转运、以及其转换率（即其细胞质稳定性）。
体外的多肽（例如治疗性抗体、生长因子）的表达对于制药工业而言是重要的，并且使蛋白表达最大化的方法是有需要的。
概述
本发明描述了一种用于评估基质附着区（MAR）的强度的新技术，并且表明了该技术可用于鉴定以前未知的新的MAR序列。本发明还描述了嵌合MAR序列。
本发明还描述了核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包括顺式MAR位置（placement）和相关的其他序列，以用于感兴趣的基因（GOI）的最佳表达。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种重组多核苷酸，其包含：编码序列；启动子，其被配置为启动编码序列的转录；以及基质附着区（MAR）核心，其选自SEQ ID NO:1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中任何一个具有至少75%序列同一性（sequenceidentity）的核酸序列，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
另一个实施方案提供了一种将编码序列转染到细胞的方法，其包含：在用于将第一和第二多核苷酸转染到细胞中的条件下，将细胞与包含编码序列和用于启动编码序列的转录的启动子的第一多核苷酸和包含选自SEQ ID NO: 1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列的基质附着区（MAR）核心的不连接的（unlinked）第二多核苷酸接触，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
本发明还提供了嵌合基质附着区（MAR），其包含：（a）MAR核心，其选自SEQ ID NO:1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质；（b）5’侧翼区，其选自SEQ ID NO: 2、6、10、14、18、22、26、30和34和与SEQ ID NO: 2、6、10、14、18、22、26、30和34中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列；以及（c）3’侧翼区，其选自SEQ ID NO: 3、7、11、15、19、23、27、31和35和与SEQ ID NO: 3、7、11、15、19、23、27、31和35中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中MAR核心、5’侧翼区和3’侧翼区不是来自相同的天然MAR。
附图说明
图1比较了两种MAR序列（作为对照的MAR X29（一种已知的MAR），以及通过本发明的技术鉴定的MAR斑马鱼（Zebrafish））的强度。
图2展示了使用不包含任何MAR序列的构建体作为对照，MAR斑马鱼核心的强度。
图3是实施例2中所描述的含有MAR核心的构建体的载体图。
图4是如实施例2中所描述的不包含MAR核心元件的对照构建体的载体图。
详细描述
I. 定义
所有的数字标示（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度和分子质量，都是近似值，其通过0.1的增量变化（+）或（-）。应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但术语“约”位于所有的数字标示之前。还应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物是本领域已知的。
如说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文中明确地规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“所述”包含复数形式。例如术语“一种/一个多核苷酸”包括多种多核苷酸，包括其混合物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸还是其类似物。多核苷酸可以包括被修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可以在组装多核苷酸之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。在聚合之后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分偶联。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
II. 新的基质附着区（MAR）序列
本发明描述了一种经由电脑（in silico）量化MAR元件的强度的方法，以及使用该方法量化从序列数据库中鉴定的新的MAR序列的强度。
通过序列比较和结构-活性分析，本发明人发现MAR元件可以由中央富含AT的核心区和含有转录因子结合基序的5'和3'侧翼区组成。
核心区可以富含(ATAT)n微卫星。结合基序可以靶向SATB1、NMP4、CEBP、Fast和Hox转录因子。MAR可以结合的其他细胞核基质蛋白包括：ARBP蛋白（附着区结合蛋白），其识别MAR中的共有序列ATTTCAC/GTTGTAAAA；NMP-2蛋白，仅定位于细胞核基质中；Sp1、ATF、CCAAT、C/EBP和AP-1转录因子；酵母ACBP蛋白（ARS共有结合蛋白），其与ARS元件相互作用；组织特异性人SATB1蛋白，其主要在胸腺中表达，其与特殊的一类一条链上有A、T或C，但没有G的富含AT的MAR的小沟结合；Matrin 3蛋白（一种人和大鼠细胞的内部细胞核基质网络的酸性蛋白），matrin F/G；转录蛋白因子RFP。
分析结果帮助发明人寻找新的MAR序列，从而发现了与阳性对照MAR X29相比在促进基因表达方面高效的四个新的MAR序列（Arope et al. (2013) PLoS ONE 8(11):e79262）。
本发明进一步证明，这些新鉴定的MAR序列的核心可以与来自其他MAR的5’和3’侧翼区形成功能性MAR，提供另外的有用的嵌合MAR序列。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种重组多核苷酸，其包含：编码序列；启动子，其被配置为启动编码序列的转录；以及本文所述的基质附着区（MAR）核心及其变体。这种新的MAR核心的实施例列于表1中。参见，例如，SEQ ID NO: 1、5、9和13。
基质附着区或MAR是真核生物的染色体的DNA中细胞核基质附着的序列。作为将真核生物的基因组在细胞核内组织成功能单元的结构DNA组件，MAR可以在细胞核内介导染色质的结构组织。这些元件构成染色质支架的DNA的锚点，并且用于将染色质组织成结构域。由MAR元件介导的染色质的动态和复杂组织在基因表达的调节中起着重要作用。
MAR核心的变体是与参考MAR核心（例如，SEQ ID NO: 1、5、9和13）具有一定序列同一性（例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%）并具有预期的MAR功能（例如，附着到哺乳动物核基质的能力）的核酸序列。
在一些实施方案中，MAR核心的变体富含AT，例如在序列中具有至少75%、80%、85%、90%或95%的A或T。
MAR核心能够与MAR的5’侧翼区（例如SEQ ID NO: 2、6、10、14和18中的任何一个或其变体（与SEQ ID NO: 2、6、10、14和18中的任何一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列））一起存在。在一些实施方案中，5’侧翼区位于MAR核心的5’侧，并距离MAR核心100个核苷酸之内。
在一些实施方案中，MAR核心能够与MAR的3’侧翼区（例如SEQ ID NO: 3、7、11、15和19中的任何一个或其变体（与SEQ ID NO: 3、7、11、15和19中的任何一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列））一起存在。在一些实施方案中，3’侧翼区位于MAR核心的3’侧，并距离MAR核心100个核苷酸之内。
包括MAR核心、5’侧翼区和3’侧翼区的非限制性MAR序列包括SEQ ID NO: 4、8、12和16和与SEQ ID NO: 4、8、12和16中的任何一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
III. 嵌合MAR序列
正如所提供的，这些新鉴定的MAR序列的核心能够与来自其他MAR的5’和3’侧翼区形成功能性MAR，提供另外的有用的嵌合MAR序列。
在一个实施方案中，本发明的嵌合MAR包括如本文所公开的MAR核心，其在5’侧具有5’侧翼区。在一个实施方案中，本发明的嵌合MAR包括如本文所公开的MAR核心，其在3’侧具有3’侧翼区。在一个实施方案中，本发明的嵌合MAR包括如本文所公开的MAR核心，其在5’侧具有5’侧翼区且在3’侧具有3’侧翼区。
5’侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何5’侧翼区或3’侧翼区。在一些实施方案中，5’侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何5’侧翼区。
3’侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何5’侧翼区或3’侧翼区。在一些实施方案中，5’侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何3’侧翼区。
MAR核心、MAR 5’侧翼区和MAR 3’侧翼区中的每一个也能够被核酸变体（例如，与参考序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性）取代。
本文公开的MAR核心包括SEQ ID NO：1、5、9和13。本文公开的5’侧翼区包括SEQ IDNO：2、6、10、14、18、22、26、30和34。本文公开的3’侧翼区包括SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31和35。
在一些实施方案中，本文新鉴定的MAR侧翼序列也能够与本文新发现的或已知的其他核心序列融合以产生新的嵌合MAR序列。在一些实施方案中，嵌合MAR序列包括表1的MAR核心区中的任何一个、表1的MAR 5’侧翼序列中的任何一个、以及表1的MAR 3’侧翼序列中的任何一个。
IV. 基因表达
本文公开的MAR序列和构建体能够被用于促进细胞中的基因表达。当感兴趣的基因被包含在含有MAR（单独的或具有5’和/或3’侧翼区的MAR）的构建体中时，可以将构建体导入宿主细胞中以表达感兴趣的基因。
本文公开的MAR序列还能够作为反式作用元件被用于以反式来促进基因表达。例如，可以将包含本文公开的任何MAR序列（单独的或具有5’和/或3’侧翼区的野生型或嵌合型MAR）的构建体导入到用包含感兴趣基因（GOI，或转基因）的构建体进一步转染（或已转染）的细胞中，使得MAR序列能够帮助GOI的表达。
因此，根据本文公开的一个实施方案，提供了一种将编码序列转染至细胞的方法，其包含：在用于将第一和第二多核苷酸转染到细胞中的条件下，将细胞与包含编码序列和用于启动编码序列的转录的启动子的第一多核苷酸和包含如本文所公开的基质附着区（MAR）核心的不连接的第二多核苷酸接触。在一些实施方案中，MAR核心选自SEQ ID NO: 1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含5’侧翼区，所述5’侧翼区选自SEQID NO: 2、6、10、14和18和与SEQ ID NO: 2、6、10、14和18中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，5’侧翼区位于MAR核心的5’侧，并距离MAR核心100个核苷酸之内。
在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含3’侧翼区，所述3’侧翼区选自SEQID NO: 3、7、11、15和19和与SEQ ID NO: 3、7、11、15和19中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，3’侧翼区位于MAR核心的3’侧，并距离MAR核心100个核苷酸之内。
在一些实施方案中，完整的MAR序列选自SEQ ID NO: 4、8、12和16和与SEQ ID NO:4、8、12和16中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中MAR能够附着到哺乳动物细胞核基质。
本发明还提供了通过本发明公开的方法制备的转染细胞。
在本发明公开的任何构建体或载体中，能够包括另外的转录调控序列和/或转录后调控序列。转录调控序列能够包括例如启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。转录后调控序列包括例如内含子和PRE。
在某些实施方案中，在载体中存在多克隆位点（MCS）（也被称为“多接头（polylinker）”），以便于插入异源序列。例如，可以将MCS置于启动子和聚腺苷酸化信号之间，以促进转基因序列的插入。在含有转基因序列的载体中，含有启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号的载体的部分被称为“表达盒（expression cassette）”。
在真核生物的细胞中有活性的启动子是本领域已知的。示例性的真核生物的启动子包括例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒（CMV）启动子、巨细胞病毒主要立即早期（CMV-MIE）启动子、EF1-α（翻译延长因子-1α子单元）启动子、Ubc（泛素C）启动子、PGK（磷酸甘油酸激酶）启动子、肌动蛋白启动子等。还可参见Boshart et al., GenBankAccession No.K03104; Uetsuki et al. (1989) J. Biol. Chem.264:5791-5798;Schorpp et al. (1996) Nucleic Acids Res.24:1787-1788; Hamaguchi et al. (2000)J. Virology74:10778-10784; Dreos et al. (2013) Nucleic Acids Res.41(D1):D157-D164以及http://epd.vital-it.ch（在2014年7月16日登入）的真核生物的启动子数据库。
载体上还可以包含增强子。非限制性实施例包括在CMV启动子和内含子A序列中的增强子。先前显示五种胚胎干细胞（ESC）转录因子占据了超增强子（Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和Esrrb），并且还有许多另外的转录因子有助于ESC的控制。另外的六种转录因子（Nr5a2、Prdm14、Tcfcp2l1、Smad3、Stat3和Tcf3）占据了典型的增强子和超级增强子，并且所有这些都富含超级增强子。这些中的任一种或本领域中进一步已知的都可以在本发明中使用。
在真核生物的细胞中有活性的聚腺苷酸化信号是本领域已知的，包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素（BGH）聚腺苷酸化信号和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号指导前体mRNA的3’末端切割、在切割位点处前体mRNA的聚腺苷酸化、和聚腺苷酸化信号下游的转录终止。核心序列AAUAAA通常存在于聚腺苷酸化信号中。还可参见Cole et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113。
可以被用在本发明的载体中的示例性的内含子包括人类/小鼠/大鼠/其他物种巨细胞病毒主要立即早期（MIE）基因的β-珠蛋白（globin）内含子和第一内含子（也称为“内含子A”）。
可以被包括在本发明的载体中的另外的转录后调控元件包括但不限于CMV MIE的5’-非翻译区、人Hsp70基因、来自血管内皮生长因子（VEGF）基因的SP163序列、以及与腺病毒晚期mRNA相关的三联前导序列。参见例如Mariati et al. (2010) Protein Expression and Purification69:9-15。
在某些实施方案中，本文公开的载体含有编码在真核生物的细胞中起作用的选择标记物（即真核生物的选择标记物）的核苷酸序列，使得当施加适当的选择时，不含有该选择标记物的细胞死亡或者比含有该选择标记物的细胞明显慢得多地生长。在真核生物的细胞中起作用的示例性的选择标记物是谷氨酰胺合成酶（GS）基因；通过在缺乏谷氨酰胺的培养基中培养细胞、或者用L-蛋氨酸亚砜亚胺（L-Methioniene Sulfoximine）进行选择、或同时使用上述两者来施加选择。在真核生物的细胞中起作用的另一个示例性的选择标记物是编码对新霉素（neo）的抗性的基因；通过在含有新霉素、遗传霉素或G418的培养基中培养细胞而施加选择。另外的选择标记物包括二氢叶酸还原酶（DHFR，赋予对氨甲喋呤的抗性）、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶（提供对嘌呤霉素的抗性）和潮霉素激酶（提供对潮霉素B的抗性）。在真核生物的细胞中起作用的另外的选择标记物是在本领域已知的。
编码上述选择标记物的序列被可操作地连接至启动子和聚腺苷酸化信号。如上所述，在真核生物的细胞中起作用的启动子和聚腺苷酸化信号是在本领域已知的。
在某些实施方案中，本文公开的载体可以含有两个或更多个表达盒。例如，含有两个表达盒（其中一个编码抗体重链，另一个编码抗体轻链）的载体可以被用于产生功能性抗体分子。
本文公开的载体还含有在原核细胞中起作用的复制起点（即原核复制起点）。在原核细胞中起作用的复制起点在本领域中是已知的，并且包括但不限于大肠杆菌的oriC起点；质粒起点，例如pSC101起点、pBR322起点（rep）和pUC起点；以及病毒（即噬菌体）复制起点。用于鉴定原核复制起点的方法被提供在例如Sernova & Gelfand (2008) Brief. Bioinformatics9(5):376-391。
本文公开的载体还含有在原核细胞中起作用的选择标记物（即原核选择标记物）。在原核细胞中起作用的选择标记物是在本领域中已知的，并且包括例如编码赋予对氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素中的任何一种的抗性的多肽的序列。赋予对氨苄青霉素（和其他β-内酰胺抗生素）的抗性的多肽的实施例是β-内酰胺酶（bla）酶。卡那霉素抗性可以由新霉素磷酸转移酶基因的活性产生；而氯霉素抗性是由氯霉素乙酰转移酶介导的。
示例性的转基因包括任何重组蛋白或例如激素（例如生长激素）、促红细胞生成素、抗体、多克隆、单克隆抗体（例如利妥昔单抗）、抗体缀合物、融合蛋白（例如IgG-融合蛋白）、白细胞介素、CD蛋白、MHC蛋白、酶和凝血因子。抗体重链和抗体轻链可以由单独的载体或由含有两个表达盒的相同载体表达。
本发明提供了用于在细胞中表达重组多肽的方法。所述方法包括将如本文所述的载体导入细胞中，并在其中载体被瞬时地或稳定地保持在细胞中的条件下培养细胞。细胞可以是原核生物的或真核生物的，例如通过与CRISP/Cas9的靶向整合而产生的稳定细胞系。可以被用于表达重组多肽的经培养的真核生物的细胞是在本领域中已知的。这样的细胞包括真菌细胞（例如酵母）、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。相应地，本发明提供了包含如本文所述的载体的细胞。
示例性的酵母细胞包括但不限于木霉属菌种（Trichoderma sp.）、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombae）和酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。示例性的昆虫细胞系包括但不限于Sf9、Sf21和果蝇（Drosophila）S2细胞。示例性的植物细胞包括但不限于拟南芥（Arabidopsis）细胞和烟草BY2细胞。
可用于表达重组多肽的经培养的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、人胚胎肾（HEK）细胞、病毒转化的HEK细胞（例如HEK293细胞）、NS0细胞、SP20细胞、CV-1细胞、幼仓鼠肾（BHK）细胞、3T3细胞、Jurkat细胞、HeLa细胞、COS细胞、PERC.6细胞、CAP®细胞和CAP-T®细胞（后两种细胞系可从德国科隆的Cevec Pharmaceuticals公司商业地获得）。CHO细胞的许多衍生物也是可用的，例如CHO-DXB11、CHO-DG-44、CHO-K1、CHO-S或工程化的CHO细胞，例如CHO-M、CK1 SV CHO和CHOZN。也可以使用哺乳动物原代细胞。
在某些实施方案中，在无血清培养基中培养细胞。例如，为了制造施用于患者的治疗性蛋白，表达细胞必须在无血清培养基中生长。在另外的实施方案中，在用于多肽表达之前，细胞已经预先适应无血清培养基中的生长。
可以使用本领域已知的方法将如本文所述的载体引入上述细胞中的任一个中。这样的方法包括但不限于聚乙二醇（PEG）介导的方法、电穿孔、生物射弹输送（即粒子轰击）、原生质体融合、DEAE-葡聚糖介导的方法、以及磷酸钙共沉淀。还可参见Sambrook et al.“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 第三版, Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001；以及Ausubel et al., “Current Protocols in MolecularBiology,” John Wiley & Sons, New York, 1987以及定期的更新。
用于细胞培养的标准方法在本领域中是已知的。参见例如R. I. Freshney“Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,” 第五版, Wiley, NewYork, 2005。
实施例
通过参考以下实施例进一步理解本发明，这些实施例旨在纯粹是本发明的示例。本发明的范围不受限于示例性的实施例，其仅意图作为本发明的单个方面的说明。任何功能上等同的方法都在本发明的范围内。根据前面的描述和附图，除本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这些修改落入所附权利要求的范围内。
实施例1.寻找新的MAR
该实施例开发了一种经由电脑量化基质附着区（MAR）元件的强度的方法，以及使用该方法量化一些示例性MAR序列的强度。
基于基序的MAR鉴定
进行文献检索以识别与MAR鉴定相关的所有基序，特别是寻找MAR特异性转录因子、染色质结合域、DNA弯曲和DNA解旋序列。总结了潜在有用的特征并用于进一步的MAR评估。
MAR元件可以由中央富含AT的核心区和含有转录因子结合基序的5’和3’侧翼区组成。核心区可能富含(ATAT)n微卫星。
MAR可以包含“MAR识别特征”并通常通过包含“MAR识别特征”进行分类。二重（bipartite）元件由两个不同的序列AATAAYAA和AWRTAANNWWGNNNC组成。其他MAR指示序列由各种转录因子和DNA结构基序组成。示例性序列包括DNA解旋基序、AP-1、A-box和T-box、NMP-2、SATB1、Hox4D、TEF、Pit1和Fast。
通过检索鉴定出4个新的MAR元件，分别命名为MAR斑马鱼、MAR鲤鱼（CyprinusCarpio）、MAR 12-RP13和MAR 17XX_fos。它们以及一些已知元件（MAR 1-68、MAR S4、MARX29、小鼠c-myc 5MAR和SPR2A-MAR）的完整序列、核心以及核心的5’和3’侧翼区列于表1中。
表1. MAR序列
注意：在全长序列中，核心区用粗体和下划线表示，侧翼区用下划线表示。
实施例2. MAR斑马鱼的测试
对鉴定的MAR元件中的一个（MAR斑马鱼）进行实验测试，并与来自文献的最强的已知的MAR进行比较，其示出高两倍的效力。
体外比较MAR斑马鱼（新鉴定的MAR元件）与MAR X29（对照，参考Arope et al.(2013) PLoS ONE 8(11): e79262）。
然后对不包括全长MAR斑马鱼的侧翼区的MAR斑马鱼核心进行实验测试，与不包含任何MAR序列的构建体进行比较。
材料与方法
Neon 转染是用CT MCB细胞进行的。使用BalanCD + 4 mM Gln 培养基用于转染。通过Bio-Rad（Gene Pulser II设置为900 uF，300 v，电阻0）进行的瞬时转染。细胞在转染的24小时前分裂。第0天生存力和VCD以百万个细胞/ml表示。使用5 μg重链和轻链DNA进行转染。10 μg GFP DNA被用作外部对照以检查转染效率。通过将甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）在导致有利于表达感兴趣的重组蛋白（利妥昔单抗轻链）的细胞生长的选择性压力的水平维持14天产生稳定的库（pool）。在14天补料分批（fed batch）定量分析中比较所得的重组库。通过生物层干涉仪或ELISA分析在收获当天和整个培养过程中的滴度。使用仅一种浓度的MSX（80 mM）重复上述库生成的实验方法以生成用于测试MAR斑马鱼核心的库。
结果
MAR X29和MAR斑马鱼的体外比较结果如图1所示。在两种选择标记物浓度（80 mM和100 mM的甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX））下，MAR斑马鱼的表现均明显优于MAR X29。因此，该实施例验证了实施例1中开发的检索和经由电脑的方法。
在进一步的实验中，与没有任何MAR元件的构建体相比，测试了单独的MAR核心序列的效力。如图2所示，MAR斑马鱼核心序列比无MAR对照产生显著更高的滴度。
应该理解的是，虽然已经结合上述实施方案描述了本发明，但是前面的描述和实施例旨在进行说明而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员来说将是显而易见的。
序列表
<110> 赛尔希恩公司
<120> 基质附着区和促进基因表达的用途
<130> 21F-1869-CNP
<150> 62/776643
<151> 2018-12-07
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<400> 12
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cagcactgcc ctggggggct ctcttccagc tctcagcccc tccctgcaca gctctggtgc 2400
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<223> 合成的
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agactctgtc tcaaatatat atatatttat atatatatat tttatattta atatatataa 60
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aatatatatt atatatatta tatgttatat atatttatta catataatat ataatatata 180
tttattatat ataatatata tttattatat attatatatt atatatttta tattttatat 240
atattatata attttatatt ttatatatat tatataatta atatttaata tatattatat 300
atatatatat aatatatatt tattatatat aatatatatt tattatatat tatatattat 360
atatttatat tttatatata ttatatattt atattttata tatattatat atttatattt 420
tatatatatt atatataata tatatattat atattttata tataatatat atttattata 480
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tatatatata tttatatata tatattttat atttaatata tataatatat attatatata 600
aatttattat atataatata tattatatat aaatttatta tatataatat atattatata 660
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atatattaat tatatataat atatatatta tatatatatt atatataata cgtaatatat 1020
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tactatatat aatatatatt ttatacatta tataatatat attttatata ttatataata 1380
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<212> DNA
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<212> DNA
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tatatataat atatatatat ttatatatat atattttata tttaatatat ataatatata 2400
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atatgtatat atgtatatat gtatatatgt atatatgtat atatgtatat atgtatatat 60
gtatatatgt atatatgtat atatgtatat atgtatatat gtatatatgt atatatgtat 120
atatgtatat atgtatatat gtatatatgt atatatgtat atatgtatat atgtatatat 180
gtatatatgt atatatgtat atatgtatat atgtatatat gtatatatgt atatatgtat 240
atatgtatat atgtatatac gtatatatgc atatacgtat atatgtatat atgtatatat 300
gtatatatgt atatatgtat atatgtatat atgtatatat gtatatatgt atgtatgtat 360
gtatgtatgt atatatgtat atatgtatgt atgtatgtat gtatgtatgt atgtatatat 420
gtatatatat atgtatgtat gtatgtatgt atgtatgtat atgtgtatat gtgtatatgt 480
gtatatgtgt atatgtgtat atatgtatat atgtatatat gtatatatgt atatgtgtat 540
atgtgtatat gtgtatatat gtatatatgt atatatgtat atatgtatat atataacat 599
<210> 22
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
gctctttcct ttagttaagc ttatgaaata gtgtttctct catgtttcct ctatattctc 60
tcttttgcct tcctgtttct tcctgttgat tccatcccat tggagtgaaa tcttatgatc 120
ttttggcatc aacaaagtga tctgcatcca aataattcca catctcattc catgttgact 180
gtggatctat atatatatat atgta 205
<210> 23
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
agtattaaat tatatataca tatataagtg aaatgtcaca atcttctaga acttgctctg 60
tatgtccact taacatggta gagtgagcta tgtcagcatt ttctatttcc tgtgaatcat 120
tctgtgtgtt gccaagaaga aatatgatat attctgaggt tatgaaatga tattttggtc 180
atcatgtttc tcatcctatt ttcatattac ctaaatactt ttgcttttaa aattattatt 240
attaataata atataattat ttatacaata atatttaaat aatatattta tttaatataa 300
ttattatatt tcacataaaa gcaatagttc cagtgttaca aattgtaggc aa 352
<210> 24
<211> 5460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
ctcgaggtct caagataaga atgactgctg taactcaaat ccaccaaagc tatttgtgtt 60
agaatgcttt cctttggtaa taacataata ccacagagtg agtgaatgta tcaagcaaag 120
tactcactca taatctctcc acccaaatga ctttgtcttc taaaattaaa cccttcccag 180
aggcctctcc ccttaatacc atattgggct cttcacactt cttccaacat cgccttccat 240
cctggccctt ccaacctccc ttctgtttgt gctaggaaca gctcaaggcc tcctatctac 300
cacagagtta catggcttgc cccttgccaa ccccccagta ccacacagtg agtgcaaaat 360
ctcaccacat tcagaaccca gtcactattc aaatcatatt ttaacctttg cagtactgac 420
tacttttgat tcatctaaac attactgaac tttattctag aaaacattta agaaatttgt 480
agttaggttc atcctttgag accttacatt taatttcttt ctatgtaaac ggaaagcatt 540
gttcagtccc acgctcatta tggcaaccca cttccaagta cttcgtttac tacgtgggct 600
ggaatcatac agttttctgt tgtgcttgtg ggagcagatc cccctaacct ctgctgattt 660
ttctcaccac ttatcataca tttattacat gcatgcactg ctgtgtgagt ttctaaatac 720
ttgggtagca attctctact attactttaa ttttcctact tgtctgcaaa tacgaaaagt 780
agcttgaaag aacttcagat ctttgttgtt atctgttgca aacactccat ttttctgttg 840
tagcaaaaaa aaaaaaaaag acatccatag ttgtcaatga gaatgcaaga tacatacatt 900
ctgcacctgt gtgctaacat aagtggctgc cctgtgactc agagattgct tgtccttctc 960
ctaagcctat ccttttttgt tactttggat acttttgttc aatgaatcca gaaaaagtgt 1020
ttttcagatt caccatgtga ccctcattta aaacctgtaa tccccctatg gttaagttcc 1080
tgcttttgtt tctgttttct ttctttcagt aaaaggaatt gaacccagtc cttccactta 1140
ctatctgagc atatggctct tttagattat gatgttggtg gtgttcattg gtctcaccaa 1200
aatgctaaag aagccttcat cttctacttg tgggtagtct ttacattcat tactgcaagt 1260
ttagtttatg tggtagtacc agatcctttg cttcttttga cttcatgcct acctaacagc 1320
gctctttcct ttagttaagc ttatgaaata gtgtttctct catgtttcct ctatattctc 1380
tcttttgcct tcctgtttct tcctgttgat tccatcccat tggagtgaaa tcttatgatc 1440
ttttggcatc aacaaagtga tctgcatcca aataattcca catctcattc catgttgact 1500
gtggatctat atatatatat atgtaatatg tatatatgta tatatgtata tatgtatata 1560
tgtatatatg tatatatgta tatatgtata tatgtatata tgtatatatg tatatatgta 1620
tatatgtata tatgtatata tgtatatatg tatatatgta tatatgtata tatgtatata 1680
tgtatatatg tatatatgta tatatgtata tatgtatata tgtatatatg tatatatgta 1740
tatatgtata tatgtatata tgtatatatg tatatatgta tatacgtata tatgcatata 1800
cgtatatatg tatatatgta tatatgtata tatgtatata tgtatatatg tatatatgta 1860
tatatgtata tatgtatgta tgtatgtatg tatgtatata tgtatatatg tatgtatgta 1920
tgtatgtatg tatgtatgta tatatgtata tatatatgta tgtatgtatg tatgtatgta 1980
tgtatatgtg tatatgtgta tatgtgtata tgtgtatatg tgtatatatg tatatatgta 2040
tatatgtata tatgtatatg tgtatatgtg tatatgtgta tatatgtata tatgtatata 2100
tgtatatatg tatatatata acatagtatt aaattatata tacatatata agtgaaatgt 2160
cacaatcttc tagaacttgc tctgtatgtc cacttaacat ggtagagtga gctatgtcag 2220
cattttctat ttcctgtgaa tcattctgtg tgttgccaag aagaaatatg atatattctg 2280
aggttatgaa atgatatttt ggtcatcatg tttctcatcc tattttcata ttacctaaat 2340
acttttgctt ttaaaattat tattattaat aataatataa ttatttatac aataatattt 2400
aaataatata tttatttaat ataattatta tatttcacat aaaagcaata gttccagtgt 2460
tacaaattgt aggcaatggg ctgttctgat tatctaagtt gggcccagga tatgtgctga 2520
atagttaaag cacatgccca gcatgtatga gggtaaaagg atgggtggat gtagtgaccc 2580
atttgtaatt taagccttag caggcagagg tgtgacccat agtgcaaagt acatagtcat 2640
tataaggtca tctatatcac aatctctgga ttagattgat tgaacctgct cagtgaccaa 2700
tgtgttagca atatacagga ggatgataac atcaacgtca gaagacacat tgaagggctt 2760
acaaatagtg cccatttact ttaatacaga aaaattcaat gtaccctcta ggcaatttca 2820
acttttagtc tcttggtagg atagtctaca tttagaatgg ctaattcata aattagaaag 2880
cttcttcacc ccctactttt ctggttattt ctctatgaat gtggtaggca tgagttagta 2940
cacatgtttc catgtacatg tgtttctatg tgtctgcatg catatggtag aatgtactca 3000
tattctatgt acagttagaa caatatttat attgtcaaag aaatcaaaag gagtattata 3060
agcttcagaa ataaggataa gtttgaaata ttcattgttt tattttttac agtatttttt 3120
cctttgagaa ttctatgtaa agtactttga acatatttgc cttcaactcc tccctcactt 3180
tcaccctctc ttcattcctc cctttccttt ccactcaaag ttgagattcc tttatttatt 3240
tatttatcct tcaaatatca ctggtactat ccacatgatc tcaggattga ggtctgctct 3300
gacgtgtcat cctgctttca tgcaatggcc ttataggtgg aacaacatta tgaactaacc 3360
agtaccccgg agctcttgac tctagctgca tatatatcaa aagatggcct agtcggccat 3420
cactggaaag agaggctcat tggacttgca aactttatat gccccagtac aggggaacac 3480
cagggccaaa aagggggagt gggtgggcag gggagtgggg gtgggtggat atgggggact 3540
tttggtatag cattggaaat gtaaatgagt taaataccta ataaaaaatg gaaaaaaaaa 3600
gtttctaatg tgtgtttcta gaaacttcct ctcttaaagc aacaacatgt ccatgagcaa 3660
tatagaattg aagatcacca tcaaatcctc tttattcctc attgtttcca tcatgtacta 3720
ccagacctct ttaaagtgta gtacagtgtg ttaggaaatg agcagattat cctgggtatg 3780
tgctaaatta gctactgagt caaaatacat tttttgctga acattaagtg tttggtcatt 3840
tctgggcaaa agaaagaaag aaagaaagaa aagaaagaaa gaaaggaagg aaggaaggaa 3900
ggaaggaagg aaggaaggaa agaaggaagg aaagaaaaaa tggatgtaaa ttgttctgac 3960
agcatctgtc tgagtcaggc agtggaatga aggaggaatc ctagagaatg cacaggaaag 4020
cagcccaagg agagtgtggg ctgaaaggca tcatgttaga aacatgcact cgatgacaga 4080
accttgagaa aaaggaactc aagcaaaagc acttatttaa aattgtaaaa cgcactttat 4140
tcatagccat gggggatgtc aatattccaa gcataagaat gatcagtttc caatcactgt 4200
gaacccccaa aacacaaagt gaaaacccac tactttattt gatgagattt ggggttgctc 4260
tattaattta taaaatcaga gtaagacacg atataaatga aacgattgta gttctaaagc 4320
agcggcactt ccctgaacag tgtcattttg acaagtaact gctaacatct tcaggtcaca 4380
gcgactgaag aaaaagtagg gaaagaaggc tggctgtgct gtttgacatt ttcttttctt 4440
atctggtgac atgaagagaa gctctgggtc cccctactct tgttcatata tctgttgctt 4500
ttatgctgca tcctgaggtt tgaagaaatg catttggcac tgagaaaaga tgaggagaga 4560
atgccttgga catggtccta acatgctttg gtactgagaa aagagagcag aggagatgac 4620
atagaatagg agagataatt tggcctattt tggccttcat ctgagtgata gattttactt 4680
aacaaataga aacaaagttt tacttataaa cagaaccaat gacctgtgtc atctctgata 4740
tattgagctt tgaattcagt gaaattatga actaaatata tcactccata attttctaag 4800
agggctattt gtatagtttc agtgatagtg tgacaaagtg taatctaaat ttctaaaaag 4860
taaaataagt agataaaata gtaggtagaa tagtataata atagaataag tataggtatg 4920
gactagaata aatagacaaa atagtagata aaatgctaat gattttgttg acagggtaat 4980
catgaatatt tttattattt agctaaagaa ccaatgttca tgtactcaag aagtgtattg 5040
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gccaccttcc ggaccggagg acaggtgccc gcccggctgg ggaggcgacc taagccacag 5220
cagcagcggt cgccatcttg gtccgggacc cgccgaactt aggaaattag tctgaacagg 5280
tgagagggtg cgccagagaa cctgacagct tctggaacag gcagaagcac agaggcgctg 5340
aggcagcacc ctgtgtgggc cggggacagc cggccacctt ccggaccgga ggacaggtgc 5400
ccacccggct ggggaggcgg cctaagccac agcagcagcg gtcgccatct tggtcccggg 5460
<210> 25
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
taggcaacag agtgagatca tgtgtcatat atatatatat atatatatat atatatatat 60
atatatacac acacacacac atatatatat acacatatat atacgtatat atatatatgt 120
atatatatac atatatatac atatatatat atacgtatat atatacgtat atatatatca 180
atgtaaatta tttgggaaat ttggtatgaa tagtcttccc 220
<210> 26
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
aaatacaaaa attagccagg tgtggtggca tgtgcctgta gtcctaccta ctcgggaggc 60
tgaggcacaa gaatcgcttg aatgtgggag gtggaggttg cagtgacctg agatcgtgcc 120
actgcactcc agcc 134
<210> 27
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
tgtgaacaca gatcataaaa tcatatatca agcagacaaa taagtagtag tcacttatat 60
gcttatactt gtaacttaaa gtaaaagaat tacaaaagca tatgacaaag actaatttta 120
agatatccta atttaaattg ttttctaaaa gtgtgtatac cattttacct atcatatgaa 180
taatttagaa acatgtttat aaaattaatg tccaaatcca ttcaaaagtt ttgtaatgca 240
gatcac 246
<210> 28
<211> 3361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
agcgccgaat tcgatccctt tataaaacca caatataatg gagtgctata atttcaaaca 60
gtgtttggtc tgctggcaga gtggtcattc taacagcagt cacagtagag tagaaataag 120
actgcagtat atctaaggca aaaagctgag gtttcaggag cttgaaggta aagaggaaga 180
aagaaatggg aatgggaatt ggaaagacaa atatcgttaa gagaaaattg cttttaggag 240
aggggaaaga atctatgtgt acttaagact atggaatcaa tcccatttaa gctgggaaac 300
tagtttcata tataactaat aaattttatt tacagaatat ctatttacct gatctaggct 360
tcaagccaaa gggactgtgt gaaaaaccat cagttctgtc atattcctaa aaaaaaatta 420
aaaagttaaa aataaataaa taataaaact tcttttcttt caaaataatc aaggtgctta 480
ttcacatcca ttccaatttg gggaaatact tattttccta tgattagcga agagaaaagt 540
aacttgcatt tcaattcaag ttgatacatg tcacttttaa gaggtcaact aatatttgct 600
agttgagcta accatatagg ctttaaatac tttcatagta gaaagaaaat gaaaatcatt 660
agtgaactgt ataaaataga tcatactttt tgaaagaatc agactgaagt ttccgaaaaa 720
aagaagtaag cttcaatgaa aaggtaagtg aatttagcat ttactcagca tctactatgg 780
acttaacacc taacagtaga taatctgaag gcaaacatat ttgtataggg actgcagaat 840
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cagtggtttg ctatggaaag atttgtagta cattaaacaa atctgaagat ggagttagaa 960
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tagcagcacc ttatttaatc tgtgcaacaa ctctgtgaag tgagtagggc tcagcttcag 1140
tcacttctct gccatttatt aactaagata gtttggaaag ttacccatct cttcagctgt 1200
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aaattaatgt aatcagaatt ctgtagatta cctaaatctt ctgttaacac gtgatatgca 1380
gttcaggtta aatgtcagtt gagttaccaa agcacataca tactcaccac cctatccaaa 1440
tctacaagcc tcccagtttg tcttcactat tttggttaaa ttaatatgaa ttcctagatg 1500
aaaatttcac tgatccaaat gaaataaaaa atatattaca aaactcacac ctgtaatctc 1560
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gtgcctgtag tcctacctac tcgggaggct gaggcacaag aatcgcttga atgtgggagg 1740
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tcatgtgtca tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata cacacacaca 1860
cacatatata tatacacata tatatacgta tatatatata tgtatatata tacatatata 1920
tacatatata tatatacgta tatatatacg tatatatata tcaatgtaaa ttatttggga 1980
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aaataagtag tagtcactta tatgcttata cttgtaactt aaagtaaaag aattacaaaa 2100
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taccatttta cctatcatat gaataattta gaaacatgtt tataaaatta atgtccaaat 2220
ccattcaaaa gttttgtaat gcagatcacc cacaacaaca aagaatccta gcctattaaa 2280
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agtgaatttg ggccatccaa cactttgagc aaagtgttga attcatcaaa tgaatgtgta 2400
atcatttact tactaatgcc aatacacttt aaggtaatct taagtagaag agatagagtt 2460
tagaattttt taaatttatc tcttgttgta aagcaataga cttgaataaa taaattagaa 2520
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atacccattc tcccaaaaac gtgtaacctc ctgtcgatag gaacaaccca ctgcagggat 2640
gtttctcgtg gaaaaaggaa atttcttttg cattggtttc agacctaact ggttacaaga 2700
aaaaccaaag gccattgcac aatgctgaag tacttttttc aaatttaaaa tttgaaagtt 2760
gttcttaaaa tctatcattt attttaaaat acggatgaat gagaaagcat agatttgata 2820
aagtgaattc ttttctgcaa tctacagaca cttccaaaaa tcactacaga cactacagac 2880
actacagaaa atcataaata aacaagtgct agtatcaata tttttaccaa aaaatggcat 2940
tcttagaatt ttttataggc tagaaggttt gtacaaacta atctgccacg gattttaaaa 3000
tatgagtgaa taaattatat tgcaaaaaaa atcaggttac agagaactgg caaggaagac 3060
tcttatgtaa aacacagaaa acatacaaaa cgtattttta agacaaataa aaacagaact 3120
tgtacctcag atgatactgg agattgtgtt gacatattag cattatcact gtcttgctaa 3180
aacataaaaa taaaaagatg gaagatgaaa ttacaataca aatgatgatt taaacatata 3240
aaaggaaaat aaaaattgtt ctgaccaact actaaaggaa gacctactaa agatatgcca 3300
tccagcacat tgccactcta catgtggtct gtaaaccagc agcataggcg gccgcattag 3360
c 3361
<210> 29
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
attcaacagc tgaatcctaa attgcaaact cagtggctaa taacaacttt gaacaatgag 60
caccttatac acgctactgt attttctttt ctttcttttt tttttttttt ttttttttta 120
aaccgggtag cagtgagaga ggt 143
<210> 30
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
tgtagtcatt ttgcaatcct taaagctgaa ttgtgcaatg agctcgatga aggaagatac 60
tatc 64
<210> 31
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
ttctttaagt gccttggggc gaggagtccg gaataagaag acttctttgg gttttaaagt 60
gtaggataag caa 73
<210> 32
<211> 1697
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
agccctgccc ccatccgacc tccgccctcg ttggcttcgc aacgctgtgg tctctgtggc 60
cagtagaggg cacacttact ttactttcac aaatccgaga gccacaaccc gggtggtggg 120
gggtgagggg gcggggaaag agtctctgca gcaaaacgca gactagggat tggtggctct 180
tggtgtttga ggcaaaatcc tagaggctgt agtcattttg caatccttaa agctgaattg 240
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tcagtggcta ataacaactt tgaacaatga gcaccttata cacgctactg tattttcttt 360
tctttctttt tttttttttt tttttttttt aaaccgggta gcagtgagag aggtttcttt 420
aagtgccttg gggcgaggag tccggaataa gaagacttct ttgggtttta aagtgtagga 480
taagcaaatc ccgagggaat atgcattata taataaatct agaaccaatg cacagagcaa 540
aagactcatg tttctggttg gttaataagc tagattatcg tgtatatata aagtgtgtat 600
gtatacgttt ggggattgta cagaatgcac agcgtagtat tcaggaaaaa ggaaactggg 660
aaattaatgt ataaattaaa atcagctttt aattagctta acacacacat acgaaggcaa 720
aaatgtaacg ttactttgat ctgatcaggg ccgacttttt tttttaagtg cataattacg 780
attccagtaa taaaagggga aagcttgggt ttgtcctggg aggaaggggt taacggtttt 840
ctttattcta gggtctctgc aggctcccca gatctgggtt ggcaattcac tcctccccct 900
ttctgggaag tccgggtttt ccccaacccc ccaattcatg gcatattctc gcgtctagcg 960
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taagtggctc tccaagtata cgtggcagtg agttgctgag caattttaat aaaattccag 1440
acatcgtttt tcctgcatag acctcatctg cggttgatca ccctctatca ctccacacac 1500
tgagcggggg ctcctagata actcattcgt tcgtccttcc ccctttctaa attctgtttt 1560
ccccagcctt agagagacgc ctggccgccc gggacgtgcg tgacgcggtc cagggtacat 1620
ggcgtattgt gtggagcgag gcagctgttc cacctgcggt gactgatata cgcagggcaa 1680
gaacacagtt cagccga 1697
<210> 33
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
tcacagacac tacagaatgt tttggagatt atgtaatatt taaaatattc aaattatact 60
aaaaatgtat gtaaaatgta ttgaacatag gcaagtttca atacatagat tttgagtgaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
tctgactctg cactctgcaa cctactctaa tattacatat gataacatga gtctatgcag 60
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<210> 35
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
ctacttcctt aaggtggtgt ccaagagtac atttttataa ataaaaagtt atagtacact 60
cctaagggca gcaagtagaa aacgtgctag ggagactcga tctcactttg 110
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<211> 2195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
aagcttcctt ggaattaatg gtcagataag gagctctagc aatatcactt taaatgctta 60
atatacaata tttagaaaac cttatgattg taaagagctt aaaaaagatg tgaaagaaca 120
atcactaaag cattgacaac atatgtgtgt tagtgaacaa tatgtaccaa aatggacaga 180
tgagaggtgt acattggggt gtgagttgat aatccagcag actgtgggac tagagggtct 240
acgaaaaaca aaggaagaac atacaaacaa attttaaaac actgtctttc aacactaaaa 300
ctgttggaat agagagcaag aatacatatt ggattcacat tcagtttatt tctcagattc 360
agactagtgc tctgactctg cactctgcaa cctactctaa tattacatat gataacatga 420
gtctatgcag ctgttctcta tagatattca cagacactac agaatgtttt ggagattatg 480
taatatttaa aatattcaaa ttatactaaa aatgtatgta aaatgtattg aacataggca 540
agtttcaata catagatttt gagtgaatgc ttgcaacttt ggttccattc tctctacttc 600
cttaaggtgg tgtccaagag tacattttta taaataaaaa gttatagtac actcctaagg 660
gcagcaagta gaaaacgtgc tagggagact cgatctcact ttggaatcta tcctgggaga 720
caaatgcctc tacaaatgga ttagagaaga cagttttaaa gaggaagata atcaggtaaa 780
atctggggtt ttatgagaga aagaaagagg tagaagaaaa aatttcaagc tcgaacatcg 840
gatcaggtgg cacaatgcgg tcaatgcctg caaactcagg gtaagtatta ttctccctgt 900
ttacagttcc gtggaggaga agtgacttgc ctgtggtcat acaacagagc aaagaaaagg 960
cttgagctag aactcaggcc tttgttaggt ctccccttcc tcctagcaca ttggcaaatt 1020
gcatgaggaa agtagaggta cagttgagtt catgtacaac aataaggcat tcaggtaaag 1080
tgaatgaggg cagaagtttt atgatttagg gaaggtgtaa gacaggaaaa tatctttgtt 1140
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cataagtcac tgaaactgag atccaaggca tggcttctgt gagtcaggag agcttaaccc 1260
agaggagaga tttcagaaca ggatatttcc tattttgagt atcctgctca tgccagtcat 1320
ggataaattt gcatctggct taagaaatta ctggatcagc attgttttgg gtagtttcac 1380
ttcctgctgg gtggggtagc aggctctata aagagatcct ctgctgcacg actcttaaac 1440
ccctggtacc tgagcactga tctgccttgg agaacctggt gagtcggctt ccttgagttc 1500
ctctgttctt tgtgccctga aatgttgagt ttaatctgaa tatggcaagt ttggtggatc 1560
caatcctatg aaaattgact tgatgctact tagtggatga aaatttaaga ttagagcaca 1620
attatatgct attttagctt tcttttgtta tacaggtagg tatccatatg gacagagaag 1680
ttaaggggta acctttgata tgaagaagaa aaaagaacaa agtatttttc tttattctct 1740
tgctttctag tgtcctttac aaaggtttgt gtcttagcag gtgtgaaaga ctacaattct 1800
ccctgagcag ccctttgctc tatgcccaag tcagcccact tggactttat aacagataat 1860
gatgatagga atagcatatt agattgccca gggtgtctga acttgtgact gcctttcttg 1920
aattggttat tttcagggaa ataagatgct tgattcttta taacagagat aatttatttg 1980
gaaaaattgt atgagaaaac acaggatttc ctagggacaa tgaagcaatt tgttaaagtg 2040
gaagggagaa accagaaagt cttgaaaagg taattaagaa tttaaataat ttcttggaga 2100
ttggagaaat aatatgccat ggtattacac aagctttggc ttctctctct ggaggattcc 2160
cttcccacga acactgttgt atcatttctt tcaga 2195
Claims (15)
1.一种重组多核苷酸，其包含：编码序列；启动子，其被配置为启动所述编码序列的转录；以及基质附着区（MAR）核心，其选自SEQ ID NO: 1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中任何一个具有至少90%序列同一性的核酸序列，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其进一步包含5’侧翼区，所述5’侧翼区选自SEQ IDNO: 2、6、10和14和与SEQ ID NO: 2、6、10和14中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述5’侧翼区位于MAR核心的5’侧，并距离所述MAR核心100个核苷酸之内。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的多核苷酸，其进一步包含3’侧翼区，所述3’侧翼区选自SEQ ID NO: 3、7、11和15和与SEQ ID NO: 3、7、11和15中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述3’侧翼区位于MAR核心的3’侧，并距离所述MAR核心100个核苷酸之内。
6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含MAR，所述MAR选自SEQ ID NO: 4、8、12和16和与SEQ ID NO: 4、8、12和16中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中所述MAR能够附着到哺乳动物细胞核基质。
7.一种包含如权利要求1至6中的任一项所述的多核苷酸的细胞。
8.一种将编码序列转染到细胞的方法，其包含：在用于将第一和第二多核苷酸转染到细胞中的条件下，将所述细胞与包含所述编码序列和用于启动所述编码序列的转录的启动子的第一多核苷酸和包含选自SEQ ID NO: 1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中的任何一个具有至少90%序列同一性的核酸序列的基质附着区（MAR）核心的不连接的第二多核苷酸接触，其中MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二多核苷酸进一步包含5’侧翼区，所述5’侧翼区选自SEQ ID NO: 2、6、10和14和与SEQ ID NO: 2、6、10和14中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述5’侧翼区位于所述MAR核心的5’侧，并距离所述MAR核心100个核苷酸之内。
11.根据权利要求8至10中的任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸进一步包含3’侧翼区，所述3’侧翼区选自SEQ ID NO: 3、7、11和15和与SEQ ID NO: 3、7、11和15中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述3’侧翼区位于所述MAR核心的3’侧，并距离所述MAR核心100个核苷酸之内。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二多核苷酸进一步包含MAR，所述MAR选自SEQ ID NO: 4、8、12和16和与SEQ ID NO: 4、8、12和16中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中所述MAR能够附着到哺乳动物细胞核基质。
14.一种通过权利要求8至13中的任一项所述的方法制备的转染细胞。
15.一种嵌合基质附着区（MAR），其包含：
（a）MAR核心，其选自SEQ ID NO: 1、5、9和13和与SEQ ID NO: 1、5、9和13中任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中所述MAR核心能够附着到哺乳动物细胞核基质，
（b）5’侧翼区，其选自SEQ ID NO: 2、6、10、14、18、22、26、30和34和与SEQ ID NO: 2、6、10、14、18、22、26、30和34中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，以及
（c）3’侧翼区，其选自SEQ ID NO: 3、7、11、15、19、23、27、31和35和与SEQ ID NO: 3、7、11、15、19、23、27、31和35中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，
其中所述MAR核心、所述5’侧翼区和所述3’侧翼区不是来自相同的天然MAR。
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