JPS63273481A - 増幅された外来遺伝子の発現を促進する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡ技術を用いた真核細胞におけるタ
ンパクの生産に関する。より詳細には、薬剤耐性遺伝子
を同時増幅することによって誘導される遺伝子増幅によ
る高いレベルのこれらタンパクの生産に関する。

（従来の技術） Ｓｃｈｉ＋ａｋｅ、Ｒ，Ｔ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　　
（１９７８）　２０２　：１０５１の独創的な論文には
、メトトレキセート（ＭＴＸ）のようなある種の代謝拮
抗薬剤に対して耐性を与えるジヒドロ葉酸リダクターゼ
（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子の増幅によって、かな
りの長さの周辺のＤＮＡ配列が同時に増幅されることが
開示された。この性質は組換えＤＮＡによる哺乳類形質
転換体において外来遺伝子の発現レベルを増大させる際
に利用された０発現レベルの増大は、外来タンパクをコ
ードする配列をＤＨＦＲに対する遺伝子に連結し１次い
でこの連結した配列で形質転換した哺乳動物細胞を、増
量したメトトレキセートの存在下で培養することによっ
て行われた。メトトレキセート耐性を獲得したコロニー
は、明らかにＤＨＦＲ遺伝子のコピー数と、連結された
外来タンパクをコードする配列とを同時に増幅すること
によって、ますます高いレベルで生存する０例えば、　
Ａｘｅｌの米国特許第４，３９９，２１６号を参照され
たい。

哺乳動物細胞の培養物における外来遺伝子の発現自体は
、知られるようになってからかなり長い。

歴史的には、もちろん、この発現は組換えウィルスを利
用することによって達成された（例えば。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１
９７９）　２７７　：１０８−１１４を参照されたい。

該文献には、　ＳＶ４０ゲノムのプロモーターおよび他
の制御配列の制御下で、サルの培養細胞においてウサギ
のβグロビンを合成することが記載されている。しかし
、′哺乳動物細胞をトランスフェクトするための他の技
術（リン酸カルシウム沈Ｈ，ＤＩ！ＡＨデキストラン処
理、またはマイクロインジェクシッンを含む）により、
ウィルスベクターに限定されることなく、ＤＮＡ自身を
使用することが可能になっている。例えば、　Ｃａｐｐ
ｅｃｃｈＬＭ、Ｒ，、並旦（１９８０）冊：４７９−４
８８を参照されたい。

これらの技術を用いて、ウィルスおよび哺乳動物の両方
の遺伝子、そして実際に細菌の遺伝子が発現されている
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，ら、　５ｃｉｅｎｃｅ
　　（１９８０）２０９　：　１４２２−１４２７　　
（Ｅ、ｃｏｌｔのキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ、　ＸＧＰＲＴ　）　；Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ、　Ｓ、ら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、
　　（１９８１）土：８５４−８６４（マウスのジヒド
ロ葉酸リダクターゼ）：および５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ
、Ｊ、ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　　Ｉ、Ｇｅｎｅｔ、　（
１９８２）土；３２７−３４１　（Ｇ４１８耐性を与え
るバクテリアのホスホトランスフェラーゼ）　、　０Ｒ
ＰＲを欠りｃｌＩｏ細胞において、アデノウィルス後期
プロモーターの制御下で。

Ｄ　Ｉ（Ｆ　Ｒをコードする遺伝子自身を発現させるこ
とも報告されている（Ｍａｕｆｍａｎ、　　Ｒ，Ｊ、ら
、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

（１９８２）　　２　：１３０４−１３１９）。ＤＨＦ
Ｒを欠＜　ＣＩＯ細胞におけるＤＨＦＲの発現、および
この発現の増幅（この発現はマウスのＤＨＦＲ遺伝子自
身のプロモーターの制御下にある）は、　　Ｇａ５５ｅ
ｒ、Ｃ，Ｓ、ら、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８２）　ｌ［：６５
２２−６５２６に記載されている。

ＤＨＦＲ増幅を使用してＤＨＦＲを欠く細胞において組
換えタンパクの生産を増大させる特別な応用も報告され
ている。

例えば、　ＥＰＯ出願公報第１１７．０５９号（１９８
４年８月２９日公開）には、　ＤＨＦＲおよび組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の両方のコード配列
を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされた。

Ｄ　ＨＰ　Ｒを欠く宿主細胞におけるｔＰＡの増幅され
た生産が記載されている。各コード配列は、各々の場合
に、それぞれプロモーター、特にＳＶ４０初期プロモー
ターに結合される。欧州特許出願第１１７．０６０号（
１９８４年８月２９日公開）は、やはりＳＶ４０初期プ
ロモーターによって制御された。　ｔＦＡと、プラスミ
ド上に存在する変異型ＤＨＦＲとを含むプラスミドによ
るトランスフェクションを包含する同様の研究について
記載している。同じベクターは１発行された英国特許Ｇ
Ｂ　２１１９８０４Ｂにも記載されている。

これらの場合すべてにおいて、　ＤＨＦＲ発現はＤ）［
ＦＲを欠く細胞における選択可能なマーカーとして役立
つか；あるいは変異型Ｄ　ＩＩ　Ｐ　Ｒは正常な型のＤ
Ｉ（ＰＲを含む細胞において同様に選択可能なマーカー
として働き得る。メトトレキセートの存在下でＤＨＦＲ
が増幅する能力は、この遺伝子を同時に増幅することに
よってタンパク生産量を増加させるの利用される。

出願人が知るすべての場合（付加的なりＮＡ配列の同時
増幅および発現を包含する）には、所望の異種タンパク
をコードするＤＮＡおよびＤ　Ｉｔ　Ｆ　Ｒをコードす
るＤＮＡは２強力なプロモーター（例えば、　ＳＶ４０
初期プロモーターまたは後期プロモーターあるいはアデ
ノウィルスプロモーター）の制御下に配置されている。

このようなプロモーターの下におけるＤＨＦＲの発現が
非常に効果的であるので、増幅を刺激するのに用いられ
る薬剤メトトレキセートに対して細胞を保護するために
は、比較的低い遺伝子増幅しか必要としない。ＤＨＦＲ
の生産効率を制限することによって９本発明の発現系は
、すでに当該分野に開示されている系で得られるものよ
りも高い遺伝子増幅を与える。

（発明の要旨） 本発明は、動物細胞、特に叶ＦＲを欠く細胞において所
望の組換え遺伝子を発現させるための発現系を提供する
。該発現系によれば、コードされた所望のタンパクの高
生産レベルが得られる。該発現系は、所望のタンパクお
よびＤＨＦＲの生産レベルを平衡させることを利用して
、該発現系を有する細胞がこれら両方の遺伝子を非常に
高レベルに増幅するのを促進する。

ある局面では９本発明は、異種、すなわち外部から導入
された遺伝子の、それを含むように改変された動物細胞
における発現レベルを増大または制御するのに有用な発
現系に関する。この発現系は別々の染色体外プラスミド
上に保持され得るが。

より一般的には、宿主細胞の染色体内に一体化される。

この系自身は、　ＤＮＡ配列、または一対のＤＮＡ配列
であって、染色体内に一体化された場合に。

同−領土のＤＮＡ配列となるものである。この系は。

宿主細胞において機能し得る強い制御配列に作動可能か
つ至適に連結した異種遺伝子を含み、そしてまた同−領
土にある場合には１合理的な距離内に、同じ宿主におい
て機能し得る比較的弱い発現カセット中に含まれるＤ）
ＩＦＲまたは他の増幅可能な遺伝子に対するコード配列
をも含む。

他の局面では１本発明は、このような発現系を含む細胞
；これらの細胞を用いてタンパクを生産する方法；およ
びこのように生産されたタンパクに関する。

本発明の概念は、増幅可能な遺伝子に対する発現カセッ
トを、所望のタンパクに対する発現カセットと共に、こ
れら発現カセットの相対的な強さを平衡させることによ
って、同時に増幅することにあると理解されるべきであ
る。従って、増幅可能な遺伝子の性質は本発明にとって
重要ではなく。

ＤＨＦＲは単に便宜的な例としてここに例示される。

適当な別の増幅可能な遺伝子配列に対して遺伝子を含む
他の発現カセットも決して除外されるものではない。

動物宿主細胞において異種遺伝子を発現させるのに有用
な本発明の発現系は、以下の２つの発現カセットを含む
： 該宿主に対して和合性を有する制御配列に作動可能なよ
うに連結された該異種遺伝子からなる第１の発現カセッ
ト；および 該宿主゛に対して和合性を有する制御配列に作動可能な
ように連結された増幅可能な遺伝子のコード配列からな
る第２の発現カセット。

ここで、上記第１のカセットは上記第２のカセットに比
べて、宿主において発現を行うのに少なくとも２倍有効
である。

動物宿主細胞における異種遺伝子の発現レベルを増大さ
せる本発明の方法は、上記増幅可能な遺伝子がジヒドロ
葉酸リダクターゼ（ＤｔｌＦＲ）である発現系でトラン
スフェクトされた宿主動物細胞を有効レベルのメトトレ
キセート存在下で培養することを包含する。

（発明の構成） Ａ、」 ここで用いられているように、「増幅可能な遺伝子配列
」とは、少なくとも一部は多数の遺伝子コピーの合成ま
たは増幅によって、外界の刺激に応答してタンパクの生
産レベルが増大するような代謝機能を有する。タンパク
をコードするＤＮＡを意味する。ＤＨＦＲは最もよく知
られた例であり、他のものも利用可能であるか、あるい
は利用可能であり得る。

「ジヒドロ葉酸レダクターゼ」または「Ｄ旺ＲＪとは１
文脈から明らかなように、タンパクまたはこのタンパク
をコードする（イントロンを有するかまたは有さない）
遺伝子を意味する。ＤＨＦＲタンパクには、ジヒドロ葉
酸を還元する触媒反応に対する標準的な分析において活
性を有するタンパクを含んでおり、「野性型」および「
変異型」の両方を包含する。

ＤＨＦＲの変異型は、メトトレキセートのような薬剤に
対する結合能力が低下していることが知られている。こ
れらの変異体は、特に定義内に含まれるものである。し
かし、一般に、野性型の配列の方が増幅に有用である。

変異型ＤＨＦＲはメトトレキセートに弱くしか結合しな
いので、細胞はこの薬剤に対して本質的に抵抗性を有し
、該薬剤の存在下では増幅はそれほど促進されない、他
方、変異型のＤＨＦＲは、　ＤＩＩＰＲが欠乏していな
い細胞へ形質転換するための選択可能なマーカーとして
使用するのに有用である。このような状況下、すなわち
細胞中に変異型および非変異型のＤＨＦＲが両方存在す
るような状況下でさえ９強く結合していない（変異型）
　ＤＨＦＲをコードする遺伝子は、あまり多くは増幅さ
れない。しかし２本発明の発現系において使用する場合
には、野性型ＤＨＦＲをコードする配列を、　ＤＨＦＲ
を欠く細胞内で使用することが大いに好ましい。

ＤＨＦＲは、よ（知られ、広く使用されている増幅可能
な遺伝子系であるが１本発明は他の増幅可能な遺伝子（
例えば、アデノシンデアミナーゼ）も同様に使用し得る
。

「発現系」とは、少なくとも１つの「発現カセッ）Ｊを
含むＤＮＡ部分を意味する。このカセットには１発現さ
れるべきコード配列と、該コード配列に作動可能なよう
に連結され、該コード配列の発現を可能にする制御配列
とが含まれる。本発明の発現系は、少な（とも２つのこ
のような発現カセットを含む。一方は所望のタンパクに
対する強い発現カセットであり、他方はＤＨＦＲに対す
る弱い発現カセットである。各カセットは、別々のＩＩ
ＮＡ配列ベクター、好ましくは同じベクター上に与えら
れ得る。この系は、ゲノム中に一体化された場合に、同
−領土に存在する。

「強い」および「弱い」という用語は、もちろん相対的
なものであって、以下にさらに定義する。

他方のカセットを含むＤＨＦＲ配列を増幅するためには
、もちろん２つのカセットが互いに充分に近接しており
、増幅刺激に応答して同様に挙動しなければならない。

この両方のカセットは、共に宿主細胞の染色体に一体化
されるか、あるいは共に染色伊から離れて、プラスミド
上に保持され得る。

必要とされるカセット間の距離は、特に短い必要はない
。５０〜２ｏｏｋｂ程度の距離以内に２つのカセットが
最終的に互いに位置すれば機能し得る。２つのカセット
の方向性は同一であっても逆であってもよい。もちろん
、トランスフェクトした際に。

２つのカセットがより近ければ近いほど、染色体内の同
−積上に一体化され易いか、あるいは複製の間に互いに
同−積上に保持され易い。

増幅は、このように長いＤＮＡ距離に及んでいるので、
別々のベクター上の発現カセットで宿主細胞を同時に形
質転換することができるが、単一のベクターの方が効率
的には好ましい。こうすることによって、同じ染色体上
に同時に一体化される確率が大きくなる。しかし、２つ
のベクターを用いた場合に充分な効率が得られるのであ
れ゛ば、この方法も本発明の範囲内にあると考えなけれ
ばならない。従って９本発明の「発現系」は、同じ形質
転換混合物中に２つの発現カセットを含み、これらの発
現カセットは、同じプラスミドまたはベクター上に存在
するか、あるいは混合物中の別々のＤＮＡ断片に存在す
る。

「制御配列」というのは、関連したコード配列と同じオ
リゴヌクレオチド分子上に存在し、該コード配列の発現
に必要かつ充分であって、ある特定の発現カセットの一
部であるようなりＮＡ部分を意味する。このような制御
配列は、典型的には。

プロモーターと、１またはそれ以上の転写ターミネータ
−と、ポリアデニル化シグナルとを含み。

さらにエンハンサ−、スプライスシグナルなどを含む場
合もある。本発明の発現系に関する重要な要素は発現カ
セットの相対的な強さである。この強さは、これら発現
カセットの相対的な位置およびコード配列に対する位置
だけでなく、これら発現カセットの各々および全体の性
質の関数である。

「異種」タンパクというのは、このタンパクをコードす
る遺伝子が外部から導入された宿主細胞によって生産さ
れるタンパクを意味する。このタンパクは、実際、宿主
によってそれ自身のゲノム遺伝子から生産されるタンパ
クと同一であり得る。

しかし、ここで用いられているように、「異種」という
のは、タンパク自身の性質よりも、むしろ遺伝子の起源
を意味する。従って、宿主細胞は。

例えば正常な全タンパクの成分としてウロキナーゼを生
産し得るが、「天然」の材料に加えて、宿主がウロキナ
ーゼをコードするＤＮＡ部分を含む発現系を受は取り、
そしてこの外部から導入された遺伝子を有効に発現し得
る場合に、このウロキナーゼをここでは「異種」のタン
パクと呼ぶ。

「強い」発現系および「弱い」発現系は定量するのが困
難である。しかし、ある制御配列がコード配列に対して
適当な配置にある場合には、他の場合よりも転写および
それに続くタンパクへの翻訳に対してより効果的であり
得ることは一般に理解されている。発現レベルに影響を
与える要因には以下のものがある：プロモーター配列本
来の強さ；メツセージの開始に関するこれらのプロモー
ター配列と、コード配列の開始コドンとの配置；適切な
コドン選択そしておそらくイントロン配列を反映する。

その２次構造に関するメツセージの性質；ポリアデニル
化シグナルの有効性など。一般に９発現が全く効果的で
はないほど低下していない限り、所望のタンパクを生産
するための発現カセットを強め得るどのような因子も、
そして増幅可能な遺伝子（例えば、　ＤＨＦＲ）を発現
させるために設計されたカセットを弱め得るどのような
因子も１本発明の範囲内にある。

（以下余白） Ｂ０発ｊ茂ソ」吸 本発明の発現系の構築には、　　ＤＮＡ断片の“切断お
よび接着”について当該技術分野で公知の標準的方法が
採用される。通常、プラスミドベクターは２つのカセッ
トについての制御配列、２つのコード配列、および便宜
上、細菌細胞内での複製起点を包含する種々の断片から
形づくられる。あるいは、形質転換のための混合に先立
って、それぞれのカセットは別々のベクター上に置かれ
得る。

もちろん、ウィルスのベクターも同様に用いることがで
き、この２つの発現カセットは、これらの組換え体ＤＮ
Ａを担うように改変されているウィルスゲノム上に置か
れ得る。

異種タンパクをコードするＤＮＡは、当該技術分野で公
知の多くの配列から選択され得る。あるいは、このタン
パクをコードするＤＮＡが始めてクローン化されるもの
であってもよい。動物細胞系で発現するように宿主を選
ぶ場合、正確なスプライシングのシグナルが含まれてい
る限り、イントロンの存在はタンパクの生産の妨げとは
ならない。

それゆえ、イントロンを有するゲノム配列、またはイン
トロンを欠＜　ｃＤＮＡ配列のいずれかが用いられる。

あるいは、異種遺伝子は種々のゲノム、　ｃＤＮ＾。

または合成したＤＮ＾の任意の組み合わせであり得る。

もちろん、ゲノム配列内のイントロンは本来の遺伝子内
に存在するようなイントロンに正確に一致する必要はな
く、コードの重複は自然に存在する配列における多くの
変異を可能としている。

異種遺伝子によってコードされるタンパクは。

遺伝子組換え技術によって生産が望まれるいずれのタン
パクでもあり得る。このタンパクは、ここで例示する組
織プラスミノーゲン活性化因子；ウロキナーゼ、肺界面
活性アポタンパクおよびプロテアーゼネキシンのような
他の酵素；インターフェロンのような免疫調節剤；バソ
プレッシン、ヒト成長ホルモン、他の哺乳動物の動物成
長ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン９黄体形成ホルモン
。

八ＣＴＨ，などのようなホルモン；　ＩＬ−１，ＩＬ−
２，およびＩＬ−３のようなリンホカイン；種々のコロ
ニー刺激因子；種々の抑制因子；線維芽細胞成長因子。

表皮成長因子、神経成長因子、インシュリン様成長因子
、および骨形成成長因子などのような成長因子；抗菌性
ペプチド；および、要するに高レベルの生産が望まれる
あらゆるタンパクを包含するが、これに限定されない。

ある状況では、生産されたタンパクはそれ自体が最終産
物であるように意図され得ないが、その代謝のある面に
おいて宿主細胞を援助し得る。あるいは、他の化学的変
換を触媒するのに必要とされ得る。特に、これらのタン
パクは２例えば、ステロイドデヒドロゲナーゼのような
、有効な非タンパク製品の生産をもたらす変換が可能な
酵素であり得る。これらの酵素は、容易に入手しうる出
発材料をより高価な製品に変換する。さらに、または換
言すれば、このタンパクは、細胞に永久増殖性を与える
。または細胞がエネルギー源を使用する効率を向上させ
る。といった一般に望まれる効果を有し得る。このよう
に、所望のタンパク生成物それ自体をコードする遺伝子
だけでなく、外来性のタンパクをコードするいずれのＤ
ＮＡも本発明の方法に適用しうる。

本発明は、最も効果的な相対的強さを得るための２発現
カセットの適切な選択および設計に関する。この設計に
おける重要な要因は、それぞれの発現カセットにおける
プロモーターおよび他の制御配列の選択；コード配列に
対するカセットの配置およびカセットの相対的な配置の
選択；およびコード配列におけるコドンの選択さえ包含
する。

増幅可能な遺伝子配列の発現のためのカセットは。

異種タンパクをコードする遺伝子発現のためのカセット
に比べて著しく弱いということが１本発明の概念の中心
である。

本発明の系に対して効果的であるためには、所望のタン
パクのカセットの強さが、　ＤＨＦＲをコードする配列
のような増幅可能な遺伝子に関連するカセットよりも約
２倍強くあるべきである。もちろん、これは任意の比率
であり９本発明の効果は相対的な強さの割合による。こ
のように、外来遺伝子の発現カセットは、好適には増幅
可能な遺伝子発現カセットよりも少なくとも２倍強く、
好ましくは５倍強く、そして最も好ましくは１０倍強い
。

ということが恐らくより正確である。゛より強い”は、
同一の試験条件下で関連するタンパクを生産する相対的
な能力を意味する。すなわち、タンパクの生産または発
現により効果的であるということを意味する。

補乳動吻細胞における発現の強さに対する標準的分析法
のいくつかが利用可能であり、ある面での測定に適して
いる。このような分析法としては。

ＣＡＴ　（クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）の生成を利用するといった。簡単に評価しうる
酵素活性が利用される。ＣＡＴ分析は、制御配列の選択
およびそれらの相対的な配置による発現カセットの状況
を評価するのに用いられ得る。

もちろん２発現すべき遺伝子におけるコドン選択の効果
を評価するのは有効ではない。しかし、これは場合によ
っては、　ＤＨＦＲのような増幅可能な遺伝子の生産物
あるいは所望のタンパクのいずれかの生産のためにそれ
ぞれのカセットで別々に宿主細胞を形質転換させて試験
することにより、簡単な方法でなされ得る。このように
、所望のタンパクの生産のためのカセットの発現の相対
的効率が。

増幅可能な遺伝子の生産物生産カセットの効率の２倍を
上回るか否かを試験することは簡単なことである。

（以下余白） 典型的には、異種タンパクの生産を行なわせるための適
切なプロモーターは、ウィルスのプロモーターのような
強いプロモーターである。それには例えば２次のプロモ
ーターがある：哺乳動物細胞におけるＳＶ４０初期プロ
モーター、またはアデノウィルスの主要後期プロモータ
ー；鳥類細胞におけるラウス肉腫ウィルスのプロモータ
ー；およびネズミレトロウイルスＬＴＲ（ハーベイ肉腫
ウィルス）。

もしＤＨＦＲが増幅可能な遺伝子ならば、　ＤＨＦＲカ
セットのための適切な弱いプロモーターは、哺乳動物種
由来のＤＨＦＲ配列に通常ともなうプロモーター。

ＳＶ４０後期プロモーター（Ｔ抗原がないため°）、お
よびほとんどの細胞性プロモーターが包含される。

増幅可能な遺伝子生産物のレベルに関連する所望のタン
パクの発現のレベルも増大し得る。これは、同−積上に
配置された制御配列に関して、より良いまたはより悪い
位置に配列を配置することによって転写終結信号を操作
することにより、および１例えばＤＨＦＲをコードする
ｍＲＮＡの２次構造よりも安定である２次構造を、所望
のタンパクをコードするｍＲＮＡに与えるコドンを適切
に選択することにより行い得る。これらの方法は特定の
タンパクをコードする遺伝子の発現力に影響を与える因
子を利用しており、多くの方法における発現カセット間
のこの設計の相違は、当該技術分野で公知である。

発現系の構築は、用いられるＤＮＡ断片の起源に従って
設計される。そして便宜上、細菌系で複製可能な複製起
点を用いる。それには９例えば、　ｐＢＲ３２２系のプ
ラスミドまたはバクテリオファージにおいて見い出され
るようなｔ！、　ｃｏｌｉの複製起点がある。

発現系は、ひとたび構築されると、当該技術分野で公知
の宿主に合った形質転換および培養法を用いて真核細胞
系で都合よく増幅され得る。そして。

プラスミドまたはファージＤＮＡは、動物の培養細胞で
用いるために単離される。

本発明の発現系は、遺伝子組換え技術により所望のタン
パクを生産するように設計されている。

タンパクを生産する起源細胞と大体類似した特徴を有す
る細胞内でこれらのタンパクを生産すると。

最も効力のある形でタンパクを生産するのに有効な翻訳
後修飾が確実となる。そのため、そのタンパクが通常見
い出される細胞に類似の動物細胞が好ましい宿主である
。関心がもたれる多くのタンパクはヒトまたは他の哺乳
動物のタンパクであるので、それらをコードする遺伝子
を哺乳動物細胞内で発現することが非常に好ましい。哺
乳動物以外のタンパクに対しては、他のタイプの細胞が
より有利であり得る０例えば、鳥類のタンパクには鳥類
起源の細胞が有利である。

本発明で用いるのに適している動物細胞は、　ＤＮ八へ
成および増殖がＤＨＦＲのような増幅可能な遺伝子生産
物に依存する。いずれの細胞でもあり得る。

本発明に特に有利なのは、自分自身のＤＨＦＲタンパク
を欠いている細胞である。なぜならば、これらの細胞は
本発明の発現系によって生産されるＤＨＦＲにほとんど
依存するからである。しかし９本来ＤＨＦＲを生産する
細胞も用いられ得る。なぜならば２発現系によって与え
られる異種配列が、メトトレキセートの効果を克服する
ようにも配置され得るがらである。哺乳動物細胞は、そ
れらが通常生産するタンパクの重要性という点で非常に
関心がもたれるが２本発明においては他の動物細胞もま
た有用である。鳥類の種から得られる細胞を含むを椎動
物細胞が特に好適である。しかし、哺乳動物細胞が最も
好適である。

細胞は、　ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂの
リン酸カルシウム沈澱法を種々改変した方法、マイクロ
インジェクシッン、エレクトロポレーション、プロトプ
ラスト融合、などのような標準的方法に従って形質転換
あるいはトランスフェクションされる。

トランスフェクション混合物は、単一プラスミドまたは
ベクターに発現カセットを含有し得る。

または、カセットを有する別々のベクターの混合物を含
有し得る。これは特に必要とはされないが。

トランスフェクションおよび染色体への一体化の効率は
、いずれのプラスミドベクターでもまず線状化すること
によって一般に向上する。そして。

増幅に用いられている細菌由来の配列を欠失するように
、適当な制限酵素で上記ベクターを処理することにより
さらに効率は向上する。このように。

特に好ましい方法では、プラスミドベクターをまず線状
化し、バクテリア由来の配列を欠失させる酵素で処理し
、そしてトランスフェクションのための所望の発現カセ
ットを取り出して精製する；この後者の操作により、特
に染色体ＤＮＡとの組換えが助長される。２つのカセッ
トが５０〜２００ｋｂの距離内で同じ染色体上に一体化
される場合、同時増幅が効果的である。それゆえ、宿主
をトランスフェクションするために用いられる単一ベク
ター上のカセット同士の距離は、事実上無関係である。

上述のように１分離した発現カセットもまた用いられ得
る。

次いで２発現系を有する細胞を宿主および増幅可能な遺
伝子の増幅に適した条件下で培養する。

もちろん、これらの条件は宿主の栄養要求性１選択に用
いるマーカーの性質、および増幅可能な遺伝子の性質に
依存する。

例えば、ある１つの実施態様においては、マーカーおよ
び増幅可能な遺伝子の両方がＤＨＦＲであり得る。この
場合、　ＤＨＦＲを欠いた細胞がトランスフェクション
され１次いで、この細胞はＤＨＦＲを増幅させる培地中
で培養される。典型的な培地は、細胞にとって非常に有
害な薬剤であるメトトレキセートを少量含有する。しか
し、薬剤の効果は過剰１７）　ＤＨＦＲタンパクにより
打ち消される。通常、メトトレキセート抵抗性コロニー
の選択は、薬剤の濃度を増加させても生存する個々のコ
ロニーまたはプールを選び出すことにより行われる；こ
のような高いメトトレキセート抵抗性を示す個々の培養
物を選択する方法は、当該技術分野に公知である。

通常、メトトレキセートの初期濃度はｎＭの範囲であり
、μ阿の範囲で生存するよう十分に増幅された配列を有
する細胞を最終的に得ることができる。

しかし、遺伝子の増幅を維持するのに通常必要であるメ
トトレキセートを高レベルで維持することは、異種タン
パクにとっ゛て通常望ましくない。なぜならば、この薬
剤に対する補償作用として細胞の代謝のバランスが失わ
れるからである。細胞は。

メトトレキセートに対する抵抗性についての選択圧を増
大させることに加えて、異種タンパク生産能力について
評価され得る。そして、最適にタンパク生産を伴うメト
トレキセートのレベルが、所望のタンパクを生産するた
めの細胞培養に採用される。

もちろん、　ＤＨＦＲを増幅可能な遺伝子として用いる
場合１代謝に同じ効果を与えるメトトレキセート以外の
薬剤も用いられ得る。しかし、メトトレキセートは容易
に入手できて便利である。

異種タンパク生産の至適レベルにより判断される。メト
トレキセートの至適レベルが一度決定されると、細胞は
確認されたレベルのメトトレキセートを含有する培地で
タンパク生産のために特別に培養される。異種タンパク
の生産のために、細胞は数回培地に継代接種することに
より対数増殖期にまで増殖される。もし、コードされる
タンパク生産物の生産が望ましい結果であるならば、生
産されたタンパクは培養物から直接単離される（あるい
は溶解した細胞から単離される。これは。

外来配列が分泌に影響する操作可能なシグナルを有する
かどうかによる）。もしタンパクが細胞の代謝を変える
ために生産される場合は、もちろん。

その単離は必要でないか、または望ましくない。

あるいは、細胞を増殖させ１次いで静止維持反応器（ｓ
ｔａｔｉｃ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｒｅａｃｔｏｒ
；ＳＭＲ）培養系に移す、この培養系は長期間にわたっ
て細胞の非増殖性を維持し、これらの細胞に所望のタン
パク生産を続行させるが、増殖のために代謝産物の添加
を必要としない。このような反応器系は１例えば。

米国特許第４．５３７，８６０号に記載されており、参
照文献としてここに引用する。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例は本発明を例証することを意図したもので
あり、限定するためのものではない。

プラスミドｐＳＴＨ−ＭＤＩ　（その特徴を第１図に示
す）は１本発明の発現系の典型的な実施態様である。

このプラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの制御下に
あるｔＰＡをコードするｃＤＮＡを含み、Ｂ型肝炎ウィ
ルス由来のポリアデニル化シグナルがその後に続いてい
る。このプラスミドはまた。ネズミのＤＨＦＲ遺伝子（
これはそれ自身のプロモーターの制御下にある）を含み
、そしてまた、　　ＨＢＶ由来のポリアデニル化シグナ
ルがその後に続いている。このプラスミドはさらにｐＭ
Ｌプラスミド由来のＥ、　ｃｏｌｔの複製開始点、およ
びアンピシリン耐性遺伝子を含む。

従って、プラスミドｐｓＴＨ−ＭＤＩは、単一のプラス
ミドに存在する本発明の発現系を例示する。２つの発現
カセットが別々のベクターに存在するような他のベクタ
ーを構築した。これらの各プラスミドの構築は以下に示
される。

主皿生互撓至 本発明の発現カセットの種々の要素を含み、そして発現
ベクターの中でそれらの構築に有用であるいくつかの中
間ベクターを次のように調製した。

ｐｓＶｏｒｉＨＢＶ３°は、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の
３゛末末端列の上流にＳＶ４０の複製開始点と、初期お
よび後期プロモーターとを含み、そしてそれらの間に外
来遺伝子のための挿入部位を有する。　ｐＳＶｏｒｉＨ
ＢＶ３゜はｐＭＬ、　ＳＶ４０およびＨＢＶから構築す
る。　ｐＭＬをＥｃｏＲＩで分解し、クレノーで平滑化
し２次いで旧ｎｄｌ［Ｉで分解する。　Ｅ、　ｃｏｌｉ
の複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子とを含むベクタ
ー断片を単離し、そしてＳＶ４０の初期、後期プロモー
ターと複製開始点（旧ｎｄｌｌＩと旧ｎｃＩＩとにより
ＳＶ４０　ＯＮＡを分解することにより得られる）とを
含む、単離された５４０ｂｐの断片に連結する。得られ
たベクター（これをｐｓＶｏｒｉと命名する）を１次に
、　Ｂａｆｆ１旧で分解し、　ＨＢＶ　ＤＮ＾（表面抗
原遺伝子の３°末末端列を含む）のＢａｗｌ　Ｉ　／Ｂ
ｇｌ　　ＩＩ分解物から単離された５８５ｂｐ断片を受
容できるようにする。正しい方向を制御酵素による分析
により以下のように確認する。ＨｔｎｄＩＩＩとＢａｍ
Ｈ１とによる分解により、正しいベクターからは、３５
０ｂｐの断片が得られる。従って、得られた連結ベクタ
ー、　ｐｓＶｏｒｉＨＢＶ３°はＨＢＶターミネータ−
の上流にＳＶ４０のプロモーターと複製開始配列とを含
み。

そしてそれらの間にコード配列が都合よく挿入される。

ｐｔＰＡ−ＢＡＬ１７の調製もまた２行なった。このｐ
　ｔＰＡ−ＢＡＬ１７は、細菌の複製ベクター中のｔＰ
Ａ遺伝子の加工された上流部分を含む。ｔＰＡ　ｃＤＮ
Ａは、゛ベクターｐ？ｌ０Ｎ−１０６８により供給され
る。このｐ？１ＯＮ−１０６８は、　Ｐｅｎｎ１ｃａ、
　ｏ、　　ら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）　３０１：
２１４−２２１に述べられているように、　　ｔＰＡに
対して得られた完全なｃＤＮＡ配列である挿入物を含む
細菌のベクターである。もちろん、このコード配列を含
むいかなる細菌の複製ベクターを使用することも可能で
あった。そして、以下に示される制限部位は。

Ｎａ　ｔｕｒｅで述べられているｔＰＡ　ｃＤＮＡの開
示された配列の中にある。ｐＭＯＮ−１０６８を、まず
Ｂａｍ１目で分解して、　　ｔＰＡをコードするｃＤＮ
Ａを除去し１次に。

ＢＡＬ−３１で処理し、遺伝子の各々の末端を削った。

ＢＡＬ−３１を用いた分解は、線状の断片の長さと配列
の分析により、該断片の５゛末端がＡＴＧ開始コドンの
１７ｂｐ以内にあることが示されるまで続けた。削除し
た正確な距離は２発現カセット内にあるプロモーターか
ら作動可能な距離にＡＴＧを配置するのに充分短い距離
内である限り重要ではない。実際には、この断片の５゛
末端がＡＴＧから約１０ｂｐの距離にあることが好まし
い。選択された線状の断片を次に、　　Ｓａｃ　Ｉ　（
ｔＰＡ遺伝子のコード配列の内部を切断する）で分解し
た。そして得られた平滑化／５ａｃＩ断片を単離した。

この断片は、この遺伝子を適当に加工した５゛末端を含
んでおり、　　５ａｃｋ／旧ｎｃＩ［分解したｐＬＩｃ
１３に連結させることによって中間体プラスミドｐｔＰ
Ａ−ＢＡＬ１７を得た。

ｐｔｌｃ−ＤＩＲをＤＨＦＲコード配列用のクローニン
グベクターとして用いた。このクローニングベクターに
は、これらのコード配列に関連する制御配列が存在しな
い。ｐＵｃ−ＤＨＦＲを次のように構築した。つまり、
まずｐＤＨＦＲ−１１（Ｓｔｍｏｎｓｅｎ、　Ｃ，Ｃ，
ら、匡。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８３）８
０　：　２４９５−２４９９）をＦｎｕ４Ｈｒで分解し
、クレノーで平滑化し２次いでＢｇｌｍで分解して６６
０ｂｐの断片を単離する（これは上記文献に述べられて
いる）。そしてこの断片を、　ＨｉｎｃＩＩとＢａｍＨ
Ｉとで分解したｐ［Ｉｃ／１３に連結させることにより
構築した。従って、　ｐＵｃ−ＤＨＦＲはＤＨＦＲのた
めの単純なりローニングベクター（これは、上記ｔＰＡ
遺伝子の５”部分に対して記載されたｐｔＰＡ−ＢＡＬ
１７ベクターに類似している）であることを意味する。

結局、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子由来の末端配列のための
別のクローニングベクターであるｐＵＣ−ＨＢＶ３’は
、上記のようにＨＢＶ　ＤＮＡをＢａｍＨＩとＢｇｌＩ
Ｉとで分解し、　　５８５ｂｐ断片を単離し、この断片
をＢａｍＨＩ分解したｐｔｌｃ１３に連結することによ
り構築された。

上記ベクター中間体の構築は第２図に要約されている。

ベクターの 上記中間ベクターを、当該分野で入手し得る他の成分と
ともに使用し、第３図に概略を示すようなプラスミドベ
クターに含まれる発現カセットを構築した。

ｐＳＶ−ｔＰＡ１７（コれはＳＶ４０プロモーターの制
御下にある完全長のｔＰＡコード配列と、　　ＨＢＶの
末端配列とを含む）を、３つのベクター断片の連結物と
して調製した。これらのベクター断片は５次のとおりで
ある：Ｈｉｎｄｌ［ＩとＢａｍＨＩとで分解したｐＳＶ
ｏｒｉＨＢＶ３’（これはベクター配列とともにプロモ
ーターおよびターミネータ−を与える）　；ｐＭＯＮ−
１０６８のＳａｃ　Ｉ　／ＢｇｌｌＩ分解により得られ
るｔＰＡの３゛部分；そしてｔＰＡコード配列の加工さ
れた５゛部分（ｐｔＰＡ−ＢＡＬＬ７の旧ｎｄ　ｍ　／
　Ｓａｃ　Ｉ分解物として得られる）。

得られた連結混合物をｔ！、　ｃｏｌｉにトランスフエ
クトシ、形質転換体をアンピシリン耐性について選択し
、そして所望のｐｓｖ−ｔＰＡ１７を含むプラスミドＤ
ＮＡを単離した。

Ｄ　ＩＩ　Ｆ　Ｒ発現のための相手方ベクター（ｐＳＶ
−ＤＨＦＲと命名した）もまた、３断片の連結により調
製した。

再び、　ｐＳＶｏｒｉ）ＩＢＶ３’　の旧ｎｄ　ＩＩＩ
　／　ＢａｍＨＩ分解により得られたベクター断片を用
いて制御配列を与えた。

そして、　ＤＩＩＦＲコード配列の５′部分および３″
部分は。

それぞれｐＵＣ−ＤＨＦＲを旧ｎｄＩ［［とＴａｑｌ（
部分分解）とで分解すること、およびＢｇｌＩＩとＴａ
ｑｌ（部分分解）とで分解することにより得た。その連
結混合物をＥ、　ｃｏｌｔを形質転換するために用い、
アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、　ｐＳＶ−Ｄ
ＨＦＲと命名されたプラスミドＤＮＡを単離した。

前記２つの発現ベクターはもちろん、　　ｔＰＡおよび
ＤＨＦＲのＤＮＡ配列に対して同等の強さの発現カセッ
トを含む。これらの発現系を同様のプラスミドｐＳＴＨ
−ＳＤＲに、３断片連結法により結合させた。この３断
片連結法には１次の断片が用いられる：　ｐＳＶ−ｔＰ
Ａ１７のＳａｃ　ＩＩ　／　Ｓａｌ　１分解により得ら
れる適当な断片、　ｐＵｃ−ＨＢＶ３’　のＳａｃ　Ｉ
［／　Ｓｍａ　１分解により得られる断片；そしてｐＳ
Ｖ−ＤＩＩＰＲのＰｖｕ　ＩＩ　／　Ｓａｌ　ＩＩ断片
。上述のように連結混合物を処理し、所望のプラスミド
ｐＳＴＨ−ＳＤＩを単離した。

Ｄ　ＩＩ　Ｐ　Ｒコード配列に対する弱い発現系を含む
単一のプラスミドもまた。調製した。このプラスミド。

ρ？ＩＤＩ＋は３断片連結法により得た。この方法には
。

ｐＤＲ３４のＥｃｏＲＩ　／　Ｔａｑ　Ｉ　（部分分解
）により得られたＩｋｂ断片；　ＥｃｏＲＩ　／　Ｓａ
ｔ　Ｉ分解されたｐＭＬがらのベクター断片；およびＴ
ａｑＩ（部分分解）／５ａｌＩ５ａｌｌたｐＳＶ−ＤＨ
ＦＲから単離した遺伝子の３゛末端。（ｐＤＲ３４ベク
ターはＧａ５５ｅｒ＋　Ｃ，Ｓ、　　ら、紅匹。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８２）７
９：６５２２−６５２６．（前出）により述べられてい
る。そしてこれは、それ自身に連結したマウスＤＩＩＰ
Ｒ遺伝子を含む。）得られたベクター（ｐＭＤＨ）は、
　ＤＨＦＲ遺伝子がマウスのＤＨＦＲプロモーターの制
御下にあること以外は、　ｐＳＶ−ＤＩＩＦＲと同様で
ある。ｐＭＤＨに存在する弱い発現カセット。

およびｐｓｖ−ｔＰＡ１７に存在する強い発現カセット
は。

それらがＤＨＦＲを欠く適当な細胞をトランスフェクト
するために混合して用いられる場合には１本発明の発現
系の１つの実施態様を構成する。

結局、　ｐＳＴＨ−ＭＤＩ＋　（これは１本発明の発現
系を単一ノヘクター上ニ含ム）　ハ、　ｐＳＶ−ｔＰＡ
１７．　ｐＭＤＨ，およびｐＵｃ−ＨＢＶ３’　の単離
された適当な断片がら３断片連結法により構築した。ｐ
ＳＶ−ｔＰＡ１７はＳａｃ　ＩＩおよび５ａｌｌで、　
ｐＭＤＨはＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉで、そしてｐＵ
Ｃ−ＨＢＶ３’　はＳａｃ　ＩＩおよびＥｃｏＲＩで分
解した。

この連結により第１図に示される構築物が得られる。こ
の構築物においては、ひとつのベクターが２つの発現カ
セット（所望のｔＰＡ配列に対する強いカセットと、増
幅可能なりＨＰＲ遺伝子に対するより弱いカセット）を
包含している。

災脂班又 実施例１の発現ベクターを、　ＤＨＦＲを欠くチャイニ
ーズハムスターの卵巣細胞を形質転換させるために使用
した。この形質転換は、　Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、　ら。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９
８０）７７：３５６７−３５７０により改変されたＧｒ
ａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂの方法を用いて行
われた。宿主細胞系は公に容易に入手可能であり、そし
てそれはＵｒｌａｕｂ、Ｇ、およびＣｈａｓｉｎ＋Ｌ、
＋　　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　八ｃａｄ　　Ｓｃｉ　
　ＵＳＡ（１９８０）ヱヱ：４２１６−４２２０に記載
されている。

成功裏に得られた形質転換体を選択し、そしてメトトレ
キセートを含む培地（メトトレキセートのレベルを１０
ｎＭから順次高めてゆく）で増幅した。

ＤＨＦＲ遺伝子の増幅を行い、さらに選択を行なうこと
を、メトトレキセートのレベルを１０μ門まで上げなが
ら行なった０組換えｔＰＡの生産についてはまた。　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｇｒｅｅ
ｎｗｉｃｈ、　ＣＮにより発売されている市販のｒＥＬ
ＩｓＡ法」を用いて。

細胞溶解物中において監視した。

表１は、形質転換の効率、およびｔＰＡ生成についての
いくつかの実験の結果を平均値として示している。上記
ｔＰＡの生産は、形質転換混合物において使用した種々
のプラスミドに対してメトトレキセート（ＭＴＸ）のレ
ベルを種々に変化させて行なった。

（以下余白） 表１に示すように、　ｐＳＶ−ｔＰＡを形質転換ベクタ
ーとして単独に用いる場合には（採用した選択システム
のため）結果を得ることができない。ＤＨＦＲが有効な
発現カセットの存在下で発現するとき。

最も効果的な形質転換が認められる。このことは。

ｐＳＶ−ＤＩＩＰＲを単独で、もしくはｐＳＴＨ−５Ｄ
Ｉと組みあわせて用いると９形質転換された細胞１０’
個当り比較的多数のコロニーが得られることにより証明
される。しかし、これらの系をｔＰＡ発現系〔同一のベ
ク９−　（ｐＳＴＨ−ＳＤＩ）またはベクターの混合物
（ｐＳＶ−ｔＰＡおよびｐＳＶ−ＤＨＦＲ）上にある〕
と共にコトランフェクションした場合には、生産される
ｔＰＡのレベルが、試験したメトトレキセートレベルの
すべてにおいて極めて低い。他方９弱いＭＤＩカセット
を含むベクターおよびその混合物についての形質転換頻
度は低いがｔＰＡ生産のレベルは一貫して高かった。こ
のｔＰＡ生産のレベルは、同一のベクター　（ｐＳＴＨ
−ＭＤＩ）または異なルヘクター　（ｐＳＶ−ｔＰＡお
よびｐＭＤＨ）上のｔＰＡカセットの位置にかかわりな
く高かった。

細胞当りピコグラムオーダーのｔＰＡ生産のレベルは、
メトトレキセートのレベル２５０ｎＭにおいて最適な値
に達するようであった。これはおそらく。

１０μ台メトトレキセートである場合よりも上記レベル
である場合のほうが、細胞がより健全であるためと考え
られる（３および４４Ｉｊｉを比較されたい）。

表に示されている生産レベル（細胞当り５〜２０ｐｇ）
は、採用した培養条件下においては、細胞培養物あたり
２０〜４０μｇｏｄであることを示す。

ｐｓＴＩＩ−ＭＤＩでトランスフェクトし、そして増幅
して得られた典型的な細胞系は、プラスミドｐＳＶ−ｔ
ＰＡ１７およびｐＳＶ−ＤＨＦＲを用いて得られる細胞
に比べて倍加時間が短い、ｐｓＴ！（−ＭＯ）ｌで形質
転換されたひとつの系をＩＢＤＩと命名し、潅流式反応
器でｔＰＡを生産させるのに用いた。ｔＰＡが高レベル
で生産された。

（発明の要約） 異種タンパクの生産を増大させる本発明の方法は、該タ
ンパクに対する強い発現カセットを、増幅可能な遺伝子
に対する弱い発現カセットと組み合わせて用いる。その
後の増幅は、増幅可能な遺伝子がを効に設計された発現
系にも存在する場合に得られる生産レベルと比較して２
強いカセットから高レベルの生産を達成するのに効果的
である。

４、　′　　の　　　な量日 第１図は本発明の発現系の１つの実施態様を含むプラス
ミドｐｓＴＦＩ−ＭＤＨの重要な特徴を示す図；第２図
は本発明に有用な中間ベクターの構築を表す概略図；第
３図はＤＨＦＲ，ｔＰＡおよびその両方に対する発現ベ
クターの構築を表す概略図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物宿主細胞において異種遺伝子を発現させるのに
   有用な発現系であって、 以下の２つの発現カセットを含む発現系： 該宿主に対して和合性を有する制御配列に作動可能なよ
   うに連結された該異種遺伝子からなる第１の発現カセッ
   ト；および 該宿主に対して和合性を有する制御配列に作動可能なよ
   うに連結された増幅可能な遺伝子のコード配列からなる
   第２の発現カセット、 ここで、該第１のカセットは該第２のカセットに比べて
   、該宿主において発現を行なうのに少なくとも２倍有効
   である。 ２、前記第１のカセットが前記第２のカセットに比べて
   発現を行なうのに少なくとも５倍有効である特許請求の
   範囲第１項に記載の発現系。 ３、前記第１のカセットが前記第２のカセットに比べて
   発現を行なうのに少なくとも１０倍有効である特許請求
   の範囲第１項に記載の発現系。 ４、前記第１のカセットおよび前記第２のカセットが同
   一鎖上に存在する特許請求の範囲第１項に記載の発現系
   。 ５、前記増幅可能な遺伝子がジヒドロ葉酸リダクターゼ
   （ＤＨＦＲ）である特許請求の範囲第１項に記載の発現
   系。 ６、前記制御配列がを脊椎動物細胞に対して和合性を有
   する特許請求の範囲第１項に記載の発現系。 ７、前記制御配列が哺乳動物細胞に対して和合性を有す
   る特許請求の範囲第１項に記載の発現系。 ８、前記第１のカセットが、ＳＶ４０前期プロモーター
   およびアデノウィルス主後期プロモーターでなる群から
   選択されるプロモーターを用いる特許請求の範囲第１項
   に記載の発現系。 ９、前記増幅可能な遺伝子がＤＨＦＲであり、前記第２
   のカセットが天然のＤＨＦＲプロモーターを用いる特許
   請求の範囲第１項に記載の発現系。 １０、前記異種遺伝子が組織プラスミノーゲン活性化因
   子をコードする特許請求の範囲第１項に記載の発現系。 １１、特許請求の範囲第１項に記載の発現系でトランス
   フェクトされた宿主動物細胞。 １２、特許請求の範囲第５項に記載の発現系でトランス
   フェクトされた宿主動物細胞。 １３、ＤＨＦＲを欠くトランスフェクト型の細胞である
   特許請求の範囲第１２項に記載の細胞。 １４、哺乳動物細胞である特許請求の範囲第１３項に記
   載の細胞。 １５、チャイニーズハムスター卵巣細胞である特許請求
   の範囲第１４項に記載の細胞。 １６、動物宿主細胞における異種遺伝子の発現レベルを
   増大させる方法であって、 有効レベルのメトトレキセート存在下で特許請求の範囲
   第１２項に記載の細胞を培養することを包含する方法。 １７、前記メトトレキセートのレベルが５ｎＭ〜５００
   ｎＭの範囲内である特許請求の範囲第１６項に記載の方
   法。 １８、特許請求の範囲第１６項に記載の方法によって生
   産される異種タンパク。