JPS63267288A - 増幅された遺伝子によつて蛋白質を生産する方法およびそのための遺伝子 - Google Patents
増幅された遺伝子によつて蛋白質を生産する方法およびそのための遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の目的
産業上の利用分野
近年の遺伝子工学の急速な発展は、インシュリン等の各
種のホルモン、インターフェロン、インターロイキン−
■、組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｔ Ｐ Ａ）等
の医療上極めて重要な物質を遺伝子工学の手法を用いた
組換えＤＮＡ技術により微生物細胞または動物細胞で生
産することを可能にしつつある。
種のホルモン、インターフェロン、インターロイキン−
■、組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｔ Ｐ Ａ）等
の医療上極めて重要な物質を遺伝子工学の手法を用いた
組換えＤＮＡ技術により微生物細胞または動物細胞で生
産することを可能にしつつある。
本発明はこのような遺伝子工学の手法特に動物細胞の培
養によって有用物質を生産することに関するものである
。
養によって有用物質を生産することに関するものである
。
従来の技術
γ−インターフェロン等の有用な物質を遺伝子工学の手
法を用いて作成した組換え体ＤＮＡによって産生させる
に際し、最も簡単には例えばγ−インターフェロンをコ
ードする遺伝子を発現に必要な塩基配列をもったプラス
ミドベクターにクローニングし、それにより大腸菌等の
宿主を形質転換し得られた形質転換株を培養することに
よって大腸菌等にγ−インターフェロンを産生させる方
法がある。しかし、γ−インターフェロンはもともと哺
乳動物のみが産生ずるものであり、遺伝子組み換えによ
ってγ−インターフェロン産生能を付与した大腸菌等が
産生ずるγ−インターフェロンは糖鎖付加等の動物細胞
に特有の蛋白質の修飾がない為にその生物学的活性や安
定性が低いとされている。したがって、γ−インターフ
ェロンであれば、それを本来産生ずる動物細胞に産生さ
せることにより、より活性の高いγ−インターフェロン
を得る工夫がなされている。
法を用いて作成した組換え体ＤＮＡによって産生させる
に際し、最も簡単には例えばγ−インターフェロンをコ
ードする遺伝子を発現に必要な塩基配列をもったプラス
ミドベクターにクローニングし、それにより大腸菌等の
宿主を形質転換し得られた形質転換株を培養することに
よって大腸菌等にγ−インターフェロンを産生させる方
法がある。しかし、γ−インターフェロンはもともと哺
乳動物のみが産生ずるものであり、遺伝子組み換えによ
ってγ−インターフェロン産生能を付与した大腸菌等が
産生ずるγ−インターフェロンは糖鎖付加等の動物細胞
に特有の蛋白質の修飾がない為にその生物学的活性や安
定性が低いとされている。したがって、γ−インターフ
ェロンであれば、それを本来産生ずる動物細胞に産生さ
せることにより、より活性の高いγ−インターフェロン
を得る工夫がなされている。
動物細胞を用いてγ−インターフェロンを産生させるた
めには、γ−インターフェロンをコードする塩基配列と
動物細胞で発現するのに必要な塩基配列を含んだプラス
ミドを動物細胞に導入する。
めには、γ−インターフェロンをコードする塩基配列と
動物細胞で発現するのに必要な塩基配列を含んだプラス
ミドを動物細胞に導入する。
しかし、このままでは、産生されるγ−インターフェロ
ンの量が極めて少ない。このため、そのγ−インターフ
ェロンの産生能を大きくするためにγ−インターフェロ
ンの遺伝子のコピー数を増幅させることが必要である。
ンの量が極めて少ない。このため、そのγ−インターフ
ェロンの産生能を大きくするためにγ−インターフェロ
ンの遺伝子のコピー数を増幅させることが必要である。
通常、この目的のためにはｄｈｆ’ｒ遺伝子を用いた次
の方法が用いられる。γ−インターフェロンをコードす
る遺伝子をもつプラスミドと、核酸の生合成に必要な酵
素のひとつであるジヒドロ葉酸リダクターゼ（以下ｄｈ
ｆｒという）遺伝子をもつプラスミドの両者をｄｈｆｒ
−である（ｄｈｆｒを産生ずることの出来ない）動物細
胞に同時にトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆ
’ｅｃｔｌｏｎ） Ｌ、ついでこれらの細胞を核酸を含
まない培地で培養する。ｄｈｆ’ｒ遺伝子を獲得した細
胞は増殖しコロニーを形成する。生育したコロニーのう
ち約半数はγ−インターフェロンを産生ずる。それらの
形質転換株はｄｈｒｒの阻害剤であるメソトレキセート
を段階的に増加して培養することによりコピー数を増幅
させることができる。ところが、この方法は（１）目的
物質の発現を十分うながすような細胞株を得る為には、
その遺伝子の増幅に約１年位の期間が必要であり（２）
ｄｈｆｒ″″の細胞で実用的に利用できる動物細胞は
現在のところ事実上チャイニーズ／％ムスター卵巣細胞
株（Ｃｈｌｎｅｓｅ ｈａｉｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃ
ｅｌｌｓ、 ＣＨＯｅｅｌ Ｉｓ）のみであるという欠
点がある。
の方法が用いられる。γ−インターフェロンをコードす
る遺伝子をもつプラスミドと、核酸の生合成に必要な酵
素のひとつであるジヒドロ葉酸リダクターゼ（以下ｄｈ
ｆｒという）遺伝子をもつプラスミドの両者をｄｈｆｒ
−である（ｄｈｆｒを産生ずることの出来ない）動物細
胞に同時にトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆ
’ｅｃｔｌｏｎ） Ｌ、ついでこれらの細胞を核酸を含
まない培地で培養する。ｄｈｆ’ｒ遺伝子を獲得した細
胞は増殖しコロニーを形成する。生育したコロニーのう
ち約半数はγ−インターフェロンを産生ずる。それらの
形質転換株はｄｈｒｒの阻害剤であるメソトレキセート
を段階的に増加して培養することによりコピー数を増幅
させることができる。ところが、この方法は（１）目的
物質の発現を十分うながすような細胞株を得る為には、
その遺伝子の増幅に約１年位の期間が必要であり（２）
ｄｈｆｒ″″の細胞で実用的に利用できる動物細胞は
現在のところ事実上チャイニーズ／％ムスター卵巣細胞
株（Ｃｈｌｎｅｓｅ ｈａｉｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃ
ｅｌｌｓ、 ＣＨＯｅｅｌ Ｉｓ）のみであるという欠
点がある。
本発明が解決しようとする問題点
本発明は蛋白質の生産能力の高い遺伝子を動物細胞に導
入し目的とする蛋白質を高収率で生産しようとするもの
である。蛋白質の生産能力の高い遺伝子を提供し、さら
にその遺伝子を作成するための補助的手段をも提供する
。
入し目的とする蛋白質を高収率で生産しようとするもの
である。蛋白質の生産能力の高い遺伝子を提供し、さら
にその遺伝子を作成するための補助的手段をも提供する
。
発明の構成
本発明者等は、蛋白質の発現に必要なＤＮＡを多数個同
一方向に結合させた遺伝子を動物細胞宿主に導入した場
合は、従来行なわれていたメントレキセートによる増幅
を行なうことなしに、直接的に高い蛋白生産能を有する
動物細胞が得られることを見出した。
一方向に結合させた遺伝子を動物細胞宿主に導入した場
合は、従来行なわれていたメントレキセートによる増幅
を行なうことなしに、直接的に高い蛋白生産能を有する
動物細胞が得られることを見出した。
本発明は、蛋白質の発現に必要なＤＮＡが多数個同一方
向に結合した遺伝子を動物細胞宿主にトランスフェクシ
ョンして得られた宿主細胞を培養して蛋白質を製造する
方法およびそのための遺伝子に関する。さらにその遺伝
子を作成するためのＤＮＡ断片の結合方法にも関する。
向に結合した遺伝子を動物細胞宿主にトランスフェクシ
ョンして得られた宿主細胞を培養して蛋白質を製造する
方法およびそのための遺伝子に関する。さらにその遺伝
子を作成するためのＤＮＡ断片の結合方法にも関する。
本発明において、蛋白質の発現に必要なＤＮＡを多数連
結させるに当って、同一方向に連結させるのは、ある一
方向からの転写と逆方向からの転写が互いに阻害し合い
、転写及び翻訳等の遺伝子の発現効率を低下させること
を防ぐためであり、同一方向に多数個連結させることに
よってはじめて高収率の蛋白質生産能力を有する遺伝子
群が得られる。
結させるに当って、同一方向に連結させるのは、ある一
方向からの転写と逆方向からの転写が互いに阻害し合い
、転写及び翻訳等の遺伝子の発現効率を低下させること
を防ぐためであり、同一方向に多数個連結させることに
よってはじめて高収率の蛋白質生産能力を有する遺伝子
群が得られる。
蛋白質の発現に必要なＤＮＡとは、蛋白質をコードする
構造遺伝子に、発現のための機能領域が結合したものを
指す。
構造遺伝子に、発現のための機能領域が結合したものを
指す。
蛋白質をコードする遺伝子としては、インシュリン等の
ホルモン、インターフェロン、インターロイキン■、組
織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ） 、その他あ
らゆる蛋白質をコードする遺伝子を用いることができる
。
ホルモン、インターフェロン、インターロイキン■、組
織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ） 、その他あ
らゆる蛋白質をコードする遺伝子を用いることができる
。
発現のための機能領域とは、通常は構造遺伝子の上流に
ある転写開始に必要な領域（プロモーター）と、下流に
ある終結に必要な領域（ポリＡシグナル）を指す。プロ
モーターとしては、例えば５Ｖ４０７−ＩＪ−ブｏ−ｔ
−−ター（Ｓ Ｖ２Ｏｅａｒｌｙｐｒｏｍｏｔｅｒ）
、ショウジヨウバエ熱シヨツク蛋白プロモーター（ｄｒ
ｏｓｏｐｈｌｌａ ｈｅａｔ ５ｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅ
ｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒ） 、マウスマンマリーチュモー
ルウィルスプロモーター（ｍｏｕｓｅ ｍａｍａ＋ａｒ
ｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｐｒｏｍｏｔｅｒ） 、メ
タロチオネインプロモーター（ＩＩｌｅｔｈａｌｏｔｈ
ｉｏｎｅｌｎ ｐｒｏＬＩｌｏｔｅｒ）のような１動物
細胞でのあらゆるプロモーターが用いられる。
ある転写開始に必要な領域（プロモーター）と、下流に
ある終結に必要な領域（ポリＡシグナル）を指す。プロ
モーターとしては、例えば５Ｖ４０７−ＩＪ−ブｏ−ｔ
−−ター（Ｓ Ｖ２Ｏｅａｒｌｙｐｒｏｍｏｔｅｒ）
、ショウジヨウバエ熱シヨツク蛋白プロモーター（ｄｒ
ｏｓｏｐｈｌｌａ ｈｅａｔ ５ｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅ
ｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒ） 、マウスマンマリーチュモー
ルウィルスプロモーター（ｍｏｕｓｅ ｍａｍａ＋ａｒ
ｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｐｒｏｍｏｔｅｒ） 、メ
タロチオネインプロモーター（ＩＩｌｅｔｈａｌｏｔｈ
ｉｏｎｅｌｎ ｐｒｏＬＩｌｏｔｅｒ）のような１動物
細胞でのあらゆるプロモーターが用いられる。
さらに原核細胞で用いる場合には、原核細胞で働くトリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（（！
ａＣ）プロモーター等が用いられる。この場合、転写終
結に必要な領域としてはターミネータ−が用いられる。
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（（！
ａＣ）プロモーター等が用いられる。この場合、転写終
結に必要な領域としてはターミネータ−が用いられる。
以下本明細書においては、［蛋白質の発現に必要なＤＮ
ＡＪを「発現単位」と略称する。この発現単位は、しか
しながら、いわゆるエンハンサ−等の遺伝子発現に必須
ではないが、効率のよい発現に有効な要素を排除するも
のではない。
ＡＪを「発現単位」と略称する。この発現単位は、しか
しながら、いわゆるエンハンサ−等の遺伝子発現に必須
ではないが、効率のよい発現に有効な要素を排除するも
のではない。
発現単位を多数同一方向に結合させる方法には、次のよ
うな方法が挙げられる。
うな方法が挙げられる。
■１発現単位の両端に結合させた非対称性粘着性末端に
よって結合させる方法。
よって結合させる方法。
２、発現単位の両端に結合させた異なった制限酵素に由
来する同一の粘着性末端であってその発現単位が同一方
向に結合した時にそれらの制限酵素部位が消失するよう
な粘着性末端によって結合させる方法。
来する同一の粘着性末端であってその発現単位が同一方
向に結合した時にそれらの制限酵素部位が消失するよう
な粘着性末端によって結合させる方法。
以下これらの方法について順次説明する。
１、非対称性粘着性末端による方法
まず原理について説明する。
一般に遺伝子を複数連結させるには、その遺伝子の両端
を同じ制限酵素で切断してそれをＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合させる。しがしＥｃｏＲＩのような、切断片が認識
部位の中心点がらみて、点対称性のある制限酵素で切断
した場合には、同じ方向に結合したものと反対方向に結
合したものとは５０％ずつの確率で生ずることになり、
例えば遺伝子を２０個つなげたとすると２０個金石が同
じ方向に結合したものの生ずる確率は２ Ｘ （１／２
）２０ということになる。したがって、ＥｃｏＲＩのよ
うな制限酵素を用いたのでは同じ方向に全ての遺伝子を
繰返し連結させることは不可能である。
を同じ制限酵素で切断してそれをＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合させる。しがしＥｃｏＲＩのような、切断片が認識
部位の中心点がらみて、点対称性のある制限酵素で切断
した場合には、同じ方向に結合したものと反対方向に結
合したものとは５０％ずつの確率で生ずることになり、
例えば遺伝子を２０個つなげたとすると２０個金石が同
じ方向に結合したものの生ずる確率は２ Ｘ （１／２
）２０ということになる。したがって、ＥｃｏＲＩのよ
うな制限酵素を用いたのでは同じ方向に全ての遺伝子を
繰返し連結させることは不可能である。
そこで本発明はＢｓｔＸＩのような認識部位と切断部位
の異なる制限酵素を利用する。ＢｓｔＸｌは任意な６個
の塩基のそれぞれ両側３個のある特定の塩基配列を認識
して、その内側で切断するというものであり、この酵素
のほかに認識部位と切断部位の異なるものとして、Ｂｇ
ｊ７ ｌ５ＦｏｋＩ。
の異なる制限酵素を利用する。ＢｓｔＸｌは任意な６個
の塩基のそれぞれ両側３個のある特定の塩基配列を認識
して、その内側で切断するというものであり、この酵素
のほかに認識部位と切断部位の異なるものとして、Ｂｇ
ｊ７ ｌ５ＦｏｋＩ。
ＨｇａＩ等が知られている。
ＢｓｔＸＩは
（ＮはＡＣＧＴ塩基のいずれかを表わす）なる塩基配列
の存在を認識して実線で示したように切断する。したが
って、目的とする物質をコードする遺伝子の両端にこの
ような制限酵素の認識部位を設け、その隙間にはさまれ
る塩基を適当に選択しておくと、必ず同じ方向に結合さ
せることが可能になる。例えば、ＢｓｔＸＩの認識切断
部位を５′・Φ・ＣＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧＧ・・・３′
３′・・・ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＣ・・・５′なる塩
基配列とし、遺伝子の両端にその塩基配列部分を同じ方
向で結合させてＢｓｔＸＩで消化すれば なる断片が得られる。これを連結するときは必ず同じ方
向にしか連結されないのである。
の存在を認識して実線で示したように切断する。したが
って、目的とする物質をコードする遺伝子の両端にこの
ような制限酵素の認識部位を設け、その隙間にはさまれ
る塩基を適当に選択しておくと、必ず同じ方向に結合さ
せることが可能になる。例えば、ＢｓｔＸＩの認識切断
部位を５′・Φ・ＣＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧＧ・・・３′
３′・・・ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＣ・・・５′なる塩
基配列とし、遺伝子の両端にその塩基配列部分を同じ方
向で結合させてＢｓｔＸＩで消化すれば なる断片が得られる。これを連結するときは必ず同じ方
向にしか連結されないのである。
この他切断面が非対称的な粘着性末端を有する制限酵素
として 等が知られており、これらも同様に用いることができる
。
として 等が知られており、これらも同様に用いることができる
。
この方法は本発明者等が案出した全く新しい方法であっ
て、発現単位のみならずあらゆるＤＮＡを同じ方向に結
合させるために用いることができる。
て、発現単位のみならずあらゆるＤＮＡを同じ方向に結
合させるために用いることができる。
つぎに発現単位の両端に非対称性粘着性末端が結合した
断片を作成する手法を説明する。
断片を作成する手法を説明する。
発現単位の一端に制限酵素ａの認識部位が結合し、他端
に制限酵素すの認識部位が結合しており、それらの部位
でプラスミドに組み込まれている場合について説明する
。制限酵素ａで切断された断面に結合するような塩基の
配列をＡとし、結合させようとする非対称性粘着性末端
を生ずるＸなる制限酵素認識部位に相当する塩基の配列
をＸとし、発現単位中及び発現単位が組み込まれている
ベクター等に存在しない新たな制限酵素ｎ１及びｎ２に
よる断面に相当する塩基配列をそれぞれＮ１及びＮ２と
する。→は塩基配列の方向を表わす。発現単位が組み込
まれているプラスミドを制限酵素ａで消化し、化学合成
したＤＮＡＮＡ 断片 Ｘ Ｎｔ をライゲートする。ライゲート産物を制限酵素ｎ１で消
化することによって反復して結合した余分の合成ＤＮＡ
断片を除いた後、再びライゲートする。ａによって切断
した部位には Ａ−Ｘ−（Ｎ１）−Ｘ−Ａ なる塩基が入ってプラスミドが閉環したものが得られる
。上記において（Ｎ１）はライゲートによって再生する
制限酵素ｎ１の認識部位である。これと同じ方法を他端
の制限酵素すのサイトで繰り返すと、ｂによって切断し
た部位には Ｂ−Ｘ−（Ｎ２）−Ｘ−Ｂ なる塩基が入る。上記において（Ｎ２）はライゲートに
よって再生する制限酵素ｎ２の認識部位である。すなわ
ち、発現単位は、 なる形で合成ＤＮＡ断片由来の塩基ではさまれることに
なる。これを制限酵素Ｘで消化してやれば、発現単位の
両端に非対称性粘着性末端が結合したＤＮＡ断片が得ら
れる。発現単位の両端が異なる断面を持つように切断さ
れている場合は、両端に非対称性粘着性末端が生ずるよ
うな２種の合成ＤＮＡ断片をそれぞれの両端に直接ライ
ゲートして目的のＤＮＡ断合が得られることは当業者に
とって自明である。
に制限酵素すの認識部位が結合しており、それらの部位
でプラスミドに組み込まれている場合について説明する
。制限酵素ａで切断された断面に結合するような塩基の
配列をＡとし、結合させようとする非対称性粘着性末端
を生ずるＸなる制限酵素認識部位に相当する塩基の配列
をＸとし、発現単位中及び発現単位が組み込まれている
ベクター等に存在しない新たな制限酵素ｎ１及びｎ２に
よる断面に相当する塩基配列をそれぞれＮ１及びＮ２と
する。→は塩基配列の方向を表わす。発現単位が組み込
まれているプラスミドを制限酵素ａで消化し、化学合成
したＤＮＡＮＡ 断片 Ｘ Ｎｔ をライゲートする。ライゲート産物を制限酵素ｎ１で消
化することによって反復して結合した余分の合成ＤＮＡ
断片を除いた後、再びライゲートする。ａによって切断
した部位には Ａ−Ｘ−（Ｎ１）−Ｘ−Ａ なる塩基が入ってプラスミドが閉環したものが得られる
。上記において（Ｎ１）はライゲートによって再生する
制限酵素ｎ１の認識部位である。これと同じ方法を他端
の制限酵素すのサイトで繰り返すと、ｂによって切断し
た部位には Ｂ−Ｘ−（Ｎ２）−Ｘ−Ｂ なる塩基が入る。上記において（Ｎ２）はライゲートに
よって再生する制限酵素ｎ２の認識部位である。すなわ
ち、発現単位は、 なる形で合成ＤＮＡ断片由来の塩基ではさまれることに
なる。これを制限酵素Ｘで消化してやれば、発現単位の
両端に非対称性粘着性末端が結合したＤＮＡ断片が得ら
れる。発現単位の両端が異なる断面を持つように切断さ
れている場合は、両端に非対称性粘着性末端が生ずるよ
うな２種の合成ＤＮＡ断片をそれぞれの両端に直接ライ
ゲートして目的のＤＮＡ断合が得られることは当業者に
とって自明である。
また非対称性粘着性末端はターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼ（Ｔ ｄ Ｔ）等の修飾酵素
を用いて作成することも可能である。
チジルトランスフェラーゼ（Ｔ ｄ Ｔ）等の修飾酵素
を用いて作成することも可能である。
このようにして得た発現単位の両端に非対称性粘着性末
端を結合させた断片は、適当な制限酵素で切り出し、プ
ラスミドベクターに組み込んで大腸菌等にトランスフェ
クションして培養することによって、大量に増やすこと
ができる。
端を結合させた断片は、適当な制限酵素で切り出し、プ
ラスミドベクターに組み込んで大腸菌等にトランスフェ
クションして培養することによって、大量に増やすこと
ができる。
前記の例の場合は、制限酵素ｎ１とｎ２で消化するか、
Ｘで消化して断片を切り出すことが適当である。
Ｘで消化して断片を切り出すことが適当である。
２、異なった制限酵素に由来する同一の粘着性末端であ
ってその発現単位が同一方向に結合した時それらの制限
酵素認識部位が消失するような粘着性末端によって結合
する方法 Ｂａｏ＋ＨＩとＢｇ、９１１の認識部位を例として説明
する。ＢａｍＨＩとＢｇｆＩＩＩの認識部位は、それぞ
れ であり、同一の粘着性末端を生ずる。したがって発現単
位の一端にＢａｍＨＩに由来する粘着性末端を結合させ
、他端にＢｇｇｎに由来する粘着性末端を結合させた なるＤＮＡをライゲートした場合、ＢａｍＨＩに由来す
る粘着性末端が、Ｂｇｆｌｎに由来する粘着性末端と結
合した場合、すなわち発現単位が同一方向に結合した場
合は、その結合部位はＢａｍＨＩのサイトでもなくＢｇ
ＩＩＩＩのサイトでもなくなる。
ってその発現単位が同一方向に結合した時それらの制限
酵素認識部位が消失するような粘着性末端によって結合
する方法 Ｂａｏ＋ＨＩとＢｇ、９１１の認識部位を例として説明
する。ＢａｍＨＩとＢｇｆＩＩＩの認識部位は、それぞ
れ であり、同一の粘着性末端を生ずる。したがって発現単
位の一端にＢａｍＨＩに由来する粘着性末端を結合させ
、他端にＢｇｇｎに由来する粘着性末端を結合させた なるＤＮＡをライゲートした場合、ＢａｍＨＩに由来す
る粘着性末端が、Ｂｇｆｌｎに由来する粘着性末端と結
合した場合、すなわち発現単位が同一方向に結合した場
合は、その結合部位はＢａｍＨＩのサイトでもなくＢｇ
ＩＩＩＩのサイトでもなくなる。
この性質を利用して、リゲート産物をＢａｍＨＩ及びＢ
ｇｇｍで消化した後、アガロースゲル電気泳動等でサイ
ズフラクショネーションして、高分子量のＤＮＡ部分を
採取すれば多数の発現単位が多数同一方向に結合した遺
伝子を得ることができる。
ｇｇｍで消化した後、アガロースゲル電気泳動等でサイ
ズフラクショネーションして、高分子量のＤＮＡ部分を
採取すれば多数の発現単位が多数同一方向に結合した遺
伝子を得ることができる。
これは発現単位が逆方向に結合した場合は、ＢａｍＨＩ
もしくはＢｇ、９Ｉ［のサイトが再生し、消化により切
断されてしまうからである。
もしくはＢｇ、９Ｉ［のサイトが再生し、消化により切
断されてしまうからである。
このようにして得られる断片は、適当なプラスミドベク
ターに組み込み、これにより大腸菌等を形質転換して培
養することにより大量に増やすことが可能である。
ターに組み込み、これにより大腸菌等を形質転換して培
養することにより大量に増やすことが可能である。
このような制限酵素の組み合せの例としては、ＢａＩＩ
ＨＩとＢｇｇＩＩの他、ＢａｍＨＩとＢｃρＩ、Ｂｇｇ
ｎとＢｃｌ Ｉ、５ａ（ｌ ＩとＸ ｈｏ Ｉ等がある
。この結合方法の基本的な考え方は、Ｐ、 Ｊ、 Ｒｏ
ｓｅｎｆ’ｅｌｄらがＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＣｈｅｒＡｌｓｔｒｙ、 ２８１
（３） ＋）＋）、１３９８−１４０８（１９８Ｂ）
に発表している。しかし、蛋白質の生産能力の高い遺伝
子を作ることに関しては何ら記載されていない。
ＨＩとＢｇｇＩＩの他、ＢａｍＨＩとＢｃρＩ、Ｂｇｇ
ｎとＢｃｌ Ｉ、５ａ（ｌ ＩとＸ ｈｏ Ｉ等がある
。この結合方法の基本的な考え方は、Ｐ、 Ｊ、 Ｒｏ
ｓｅｎｆ’ｅｌｄらがＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＣｈｅｒＡｌｓｔｒｙ、 ２８１
（３） ＋）＋）、１３９８−１４０８（１９８Ｂ）
に発表している。しかし、蛋白質の生産能力の高い遺伝
子を作ることに関しては何ら記載されていない。
発現単位が同一方向で多数結合された遺伝子をそのまま
動物細胞にトランスフェクションして、形質転換株を培
養して蛋白質を生産させることも不可能ではない。
動物細胞にトランスフェクションして、形質転換株を培
養して蛋白質を生産させることも不可能ではない。
しかし、通常は、目的の遺伝子がトランスフェクション
された形質転換株のみを選択した上で培谷する方がはる
かに効率が良い。この選択のためこ、選択マーカーとな
る遺伝子を結合させることが望ましい。
された形質転換株のみを選択した上で培谷する方がはる
かに効率が良い。この選択のためこ、選択マーカーとな
る遺伝子を結合させることが望ましい。
このとき選択マーカーは、動物細胞における選択マーカ
ーとしてのみだけでなく、微生物細胞における選択マー
カーとしても利用できるものが望ましい。というのは、
蛋白質をコードする遺伝子を動物細胞にトランスフェク
ションするに先立ち、大腸菌を用いて特定の大きさの遺
伝子を取ることがある（組換え体コスミドＤＮＡの作成
）が、この際にも選択マーカーとして働くことが望まれ
るからである。この観点から特に望ましい選択マーカー
はネオ遺伝子（ｎｅｏ ｇｅｎｅ）である。ネオ遺伝子
は大腸菌の中ではカナマイシン耐性（ＫｍＲ）を示し、
真核細胞の中ではＧ４Ｌ８ （ジエネテイシンと呼ば
れる抗生物質）耐性を示す。通常、動物細胞はこの耐性
を示さないので、どのような動物細胞においても選択マ
ーカーとして用いられる。
ーとしてのみだけでなく、微生物細胞における選択マー
カーとしても利用できるものが望ましい。というのは、
蛋白質をコードする遺伝子を動物細胞にトランスフェク
ションするに先立ち、大腸菌を用いて特定の大きさの遺
伝子を取ることがある（組換え体コスミドＤＮＡの作成
）が、この際にも選択マーカーとして働くことが望まれ
るからである。この観点から特に望ましい選択マーカー
はネオ遺伝子（ｎｅｏ ｇｅｎｅ）である。ネオ遺伝子
は大腸菌の中ではカナマイシン耐性（ＫｍＲ）を示し、
真核細胞の中ではＧ４Ｌ８ （ジエネテイシンと呼ば
れる抗生物質）耐性を示す。通常、動物細胞はこの耐性
を示さないので、どのような動物細胞においても選択マ
ーカーとして用いられる。
大腸菌等の選択マーカーとしても働く。
選択マーカーとなる遺伝子を結合するに当っても発現単
位とマーカー遺伝子の転写方向が同一になるよう結合さ
せることが望ましい。このためには、選択マーカーの遺
伝子に発現単位を結合させたと同じ非対称性粘着性末端
を結合させて両遺伝子を結合させる。この非対称性粘着
性末端の選択マーカー遺伝子への結合は、発現単位への
非対称性粘着性末端の結合と全く同じ方法によって行う
ことができる。選択マーカーは、発現単位のみを同一方
向に結合させたあとで結合させることもできる。また、
発現単位のＤＮＡ断片と選択マーカーのＤＮＡ断片を、
発現単位のＤＮＡ断片が過剰の条件、例えば２０〜１０
０ ： １の割合で混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ処理す
れば、多数の発現単位と少数の選択マーカーが同一方向
で結合した遺伝子が得られる。
位とマーカー遺伝子の転写方向が同一になるよう結合さ
せることが望ましい。このためには、選択マーカーの遺
伝子に発現単位を結合させたと同じ非対称性粘着性末端
を結合させて両遺伝子を結合させる。この非対称性粘着
性末端の選択マーカー遺伝子への結合は、発現単位への
非対称性粘着性末端の結合と全く同じ方法によって行う
ことができる。選択マーカーは、発現単位のみを同一方
向に結合させたあとで結合させることもできる。また、
発現単位のＤＮＡ断片と選択マーカーのＤＮＡ断片を、
発現単位のＤＮＡ断片が過剰の条件、例えば２０〜１０
０ ： １の割合で混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ処理す
れば、多数の発現単位と少数の選択マーカーが同一方向
で結合した遺伝子が得られる。
このようにして得られた発現単位が同一方向で多数結合
した遺伝子は宿主となる動物細胞にトランスフェクショ
ンされる。トランスフェクションされた形質転換株は、
選択マーカーによって目的として遺伝子が導入されたも
ののみを選択した後、蛋白質を生産する目的で培養され
る。
した遺伝子は宿主となる動物細胞にトランスフェクショ
ンされる。トランスフェクションされた形質転換株は、
選択マーカーによって目的として遺伝子が導入されたも
ののみを選択した後、蛋白質を生産する目的で培養され
る。
動物細胞にトランスフェクションする発現単位が多数個
同一方向で結合した遺伝子としては次にあげるものが用
いられる。
同一方向で結合した遺伝子としては次にあげるものが用
いられる。
■、発現単位を多数個同一方向にライゲートさせて得た
直鎖状の遺伝子 ２、上記１の遺伝子を閉環状の組み換え体コスミドＤＮ
Ａとしたもの ３、上記２の組み換え体コスミドＤＮＡをファージゲノ
ム（ｇｅｎｏｍｅ）として直鎖状（ｌ １ｎｅａｒ）な
形で調製し、そのＣＯＳサイトにより更に同一方向にラ
イゲートしたもの つぎに上記２及び３の組み換え体コスミドＤＮＡ及びそ
れをＣＯＳサイトによりライゲート・ したものの製法
について説明する。
直鎖状の遺伝子 ２、上記１の遺伝子を閉環状の組み換え体コスミドＤＮ
Ａとしたもの ３、上記２の組み換え体コスミドＤＮＡをファージゲノ
ム（ｇｅｎｏｍｅ）として直鎖状（ｌ １ｎｅａｒ）な
形で調製し、そのＣＯＳサイトにより更に同一方向にラ
イゲートしたもの つぎに上記２及び３の組み換え体コスミドＤＮＡ及びそ
れをＣＯＳサイトによりライゲート・ したものの製法
について説明する。
発現単位を多数個同一方向にライゲートして得られた直
鎖状の遺伝子はＣＯＳサイトを持っていない。その場合
には、直鎖状の遺伝子をコスミドベクターにクローニン
グする。ＣＯＳサイトを有している、その直鎖状の遺伝
子を、ファージ粒子でインビトロパッケージングし、大
腸菌に感染させる。これをカナマイシン耐性等の選択マ
ーカーを利用して選択し、得られたコロニーから目的の
組み換え体コスミドＤＮＡをもったものを選択する。こ
のようにして得られた組み換え体コスミドＤＮＡは大腸
菌によって大量に調製することができる。
鎖状の遺伝子はＣＯＳサイトを持っていない。その場合
には、直鎖状の遺伝子をコスミドベクターにクローニン
グする。ＣＯＳサイトを有している、その直鎖状の遺伝
子を、ファージ粒子でインビトロパッケージングし、大
腸菌に感染させる。これをカナマイシン耐性等の選択マ
ーカーを利用して選択し、得られたコロニーから目的の
組み換え体コスミドＤＮＡをもったものを選択する。こ
のようにして得られた組み換え体コスミドＤＮＡは大腸
菌によって大量に調製することができる。
閉環状の組み換え体コスミドＤＮＡをＣＯＳサイトによ
って同一方向にライゲートするためには、まずそのＣＯ
Ｓサイトで切断して直鎖状となす必要がある。この目的
のためには、大腸画然誘発変異株に組み換え体コスミド
ＤＮＡを導入して培養した後熱誘発する。この時インビ
ボでのバッケッジングが行なわれて、組み換え体ラムダ
ファージが得られる。このラムダファージからＤＮＡを
調製し得られた直鎖状ＤＮＡをラムダファージのＣＯＳ
サイトを用いてＴ４ＤＮＡリガーゼでインビトロでライ
ゲートする。このＣＯＳサイトの開裂断面もまた非対称
性粘着性末端を有しているので直鎖状の組み換え体コス
ミドＤＮＡもまた同一方向にのみ連結される。組み換え
体コスミドＤＮＡのＣＯＳサイトにおける切断には、Ｃ
Ｏ８サイトで切断するためのあらゆる方法が、応用可能
である。
って同一方向にライゲートするためには、まずそのＣＯ
Ｓサイトで切断して直鎖状となす必要がある。この目的
のためには、大腸画然誘発変異株に組み換え体コスミド
ＤＮＡを導入して培養した後熱誘発する。この時インビ
ボでのバッケッジングが行なわれて、組み換え体ラムダ
ファージが得られる。このラムダファージからＤＮＡを
調製し得られた直鎖状ＤＮＡをラムダファージのＣＯＳ
サイトを用いてＴ４ＤＮＡリガーゼでインビトロでライ
ゲートする。このＣＯＳサイトの開裂断面もまた非対称
性粘着性末端を有しているので直鎖状の組み換え体コス
ミドＤＮＡもまた同一方向にのみ連結される。組み換え
体コスミドＤＮＡのＣＯＳサイトにおける切断には、Ｃ
Ｏ８サイトで切断するためのあらゆる方法が、応用可能
である。
１の直鎖状遺伝子を動物細胞にトランスフェクションす
る方法は、コスミドクローニングを必要としないため最
も簡単であるが、ＤＮＡの長さが不均一であるため、高
い発現量を有する形質転換株を得るためには多数の株を
スクリーニングする必要がある。
る方法は、コスミドクローニングを必要としないため最
も簡単であるが、ＤＮＡの長さが不均一であるため、高
い発現量を有する形質転換株を得るためには多数の株を
スクリーニングする必要がある。
２の組み換え体コスミドＤＮＡをトランスフェクション
する方法は、ＤＮＡの長さが均一であるため常に一定の
発現量を有する形質転換株が得やすい。またこれは閉環
状であるために高濃度でも粘性が低いため直鎖状のもの
より扱い易い。この反面、コスミドＤＮＡの分子量は全
体で５０Ｋｂ程度であるため、結合しうる発現単位の量
が全体で５０Ｋｂ以上となる保障はない。
する方法は、ＤＮＡの長さが均一であるため常に一定の
発現量を有する形質転換株が得やすい。またこれは閉環
状であるために高濃度でも粘性が低いため直鎖状のもの
より扱い易い。この反面、コスミドＤＮＡの分子量は全
体で５０Ｋｂ程度であるため、結合しうる発現単位の量
が全体で５０Ｋｂ以上となる保障はない。
３の組み換え体コスミドＤＮＡがＣＯＳサイトでライゲ
ートされているものは最も多数の発現単位を結合しうる
と考えられ、きわめて高い発現量が期待できる。しかし
、遺伝子の調製が容易でなく、またトランスフェクショ
ンにも高度の技術が必要とされる。トランスフェクショ
ン、形質転換株の培養、生産された蛋白質の採取は従来
のあるいは今後改良されるあらゆる方法が応用できる。
ートされているものは最も多数の発現単位を結合しうる
と考えられ、きわめて高い発現量が期待できる。しかし
、遺伝子の調製が容易でなく、またトランスフェクショ
ンにも高度の技術が必要とされる。トランスフェクショ
ン、形質転換株の培養、生産された蛋白質の採取は従来
のあるいは今後改良されるあらゆる方法が応用できる。
本発明は次のような効果をもたらす。
■。有用蛋白質の発現量の高い動物細胞宿主を容易にか
つ短期間に作成できる。
つ短期間に作成できる。
２、 ｄＭｒ遺伝子を用いたコピー数の増幅を必要とし
ないので、宿主として用いる動物細胞の選択の幅が広い
。
ないので、宿主として用いる動物細胞の選択の幅が広い
。
本発明は以上説明したように遺伝子の増幅をインビトロ
で行うものであるが、この方法は必要に応じて従来のイ
ンビボにおける遺伝子の増幅と組み合せて行うことも可
能である。
で行うものであるが、この方法は必要に応じて従来のイ
ンビボにおける遺伝子の増幅と組み合せて行うことも可
能である。
そのためには、選択マーカーを含むコスミドベクターの
中にｄｈｆ’ｒ遺伝子等の従来のインビボにおける遺伝
子増幅に用いられてきた遺伝子及びその上流に強いプロ
モーターを挿入する。本発明の方法によってインビトロ
での遺伝子増幅を行った後、増幅された遺伝子を動物細
胞にトランスフェクションし、ついでメソトレキセート
によってインビボにおいて遺伝子増幅を行う。両方法に
よって遺伝子は相乗的に増幅され高い発現量の動物細胞
を得ることが期待できる。
中にｄｈｆ’ｒ遺伝子等の従来のインビボにおける遺伝
子増幅に用いられてきた遺伝子及びその上流に強いプロ
モーターを挿入する。本発明の方法によってインビトロ
での遺伝子増幅を行った後、増幅された遺伝子を動物細
胞にトランスフェクションし、ついでメソトレキセート
によってインビボにおいて遺伝子増幅を行う。両方法に
よって遺伝子は相乗的に増幅され高い発現量の動物細胞
を得ることが期待できる。
更に、本発明は先に説明した
のような、任意の遺伝子の両端に非対称性粘着性末端を
有するＤＮＡ断片を容易に製造することができるプラス
ミドをも提供する。
有するＤＮＡ断片を容易に製造することができるプラス
ミドをも提供する。
すなわち、
非対称性粘着性末端を生ずる制限酵素認識部位に相当す
る塩基配列２個がプラスミド中に離れて同一方向に存在
し、該２個の塩基配列の間の一方にはポリリンカーが他
の一方にはｏｒｌ領域と選択マーカーが存在するプラス
ミドベクター。
る塩基配列２個がプラスミド中に離れて同一方向に存在
し、該２個の塩基配列の間の一方にはポリリンカーが他
の一方にはｏｒｌ領域と選択マーカーが存在するプラス
ミドベクター。
ポリリンカークローニング部位の一端に転写開始に必要
な領域、他端に転写終結に必要な領域の１つもしくは両
方の領域を含むことを特徴とするプラスミドベクターで
ある。本明細書においては、これらのプラスミドベクタ
ーを便宜上カセットベクターと称する。かかるカセット
ベクターは第４図及び第５図にそれぞれ模式的に示され
ている。
な領域、他端に転写終結に必要な領域の１つもしくは両
方の領域を含むことを特徴とするプラスミドベクターで
ある。本明細書においては、これらのプラスミドベクタ
ーを便宜上カセットベクターと称する。かかるカセット
ベクターは第４図及び第５図にそれぞれ模式的に示され
ている。
第４図及び第５図において、ポリリンカークローニング
部位とは、外来遺伝子を挿入するための制限酵素の認識
部位を通常複数含有する部分である。Ｘは非対称性粘着
性末端を生ずるＸなる制限酵素認識部位に相当する塩基
の配列である。−はその塩基配列の方向を表わす。
部位とは、外来遺伝子を挿入するための制限酵素の認識
部位を通常複数含有する部分である。Ｘは非対称性粘着
性末端を生ずるＸなる制限酵素認識部位に相当する塩基
の配列である。−はその塩基配列の方向を表わす。
第４図は挿入される遺伝子の両端に非対称性粘着性末端
が直接的に結合したＤＮＡ断片を製造するためのもので
ある。第５図は、蛋白質をコードする構造遺伝子のみを
挿入して、発現単位の両端に非対称性粘着性末端が結合
したＤＮＡ断片を一挙に製造するためのものである。ポ
リリンカーを構成する制限酵素の部位としては、Ｂａｍ
ＨＩ。
が直接的に結合したＤＮＡ断片を製造するためのもので
ある。第５図は、蛋白質をコードする構造遺伝子のみを
挿入して、発現単位の両端に非対称性粘着性末端が結合
したＤＮＡ断片を一挙に製造するためのものである。ポ
リリンカーを構成する制限酵素の部位としては、Ｂａｍ
ＨＩ。
ＥｃｏＲＩ、 Ｈｌｎｄ ｍ、 ＰｓｔＩ、 ＳａｇＩ
、 Ｘｂａｌ等のような遺伝子組換えに汎用されるあら
ゆる部位を用いることができる。それらの部位は、適宜
組合せてポリリンカーを構成するが、その数には制限が
ない。ポリリンカーのＤＮＡ鎖は化学合成によって容易
に作られる。マーカー遺伝子は、トランスフォーマント
の選択に用いられるあらゆる薬剤耐性遺伝子が用いられ
る。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレ
プトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カ
ナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、
等が挙げられる。
、 Ｘｂａｌ等のような遺伝子組換えに汎用されるあら
ゆる部位を用いることができる。それらの部位は、適宜
組合せてポリリンカーを構成するが、その数には制限が
ない。ポリリンカーのＤＮＡ鎖は化学合成によって容易
に作られる。マーカー遺伝子は、トランスフォーマント
の選択に用いられるあらゆる薬剤耐性遺伝子が用いられ
る。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレ
プトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カ
ナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、
等が挙げられる。
第５図のプロモーター及びポリＡシグナルにはエンハン
サ−やイントロンを追加することが可能である。プロモ
ーター及びポリＡシグナルの一方を削除したり、両方も
しくは一方を別のものと置き換えることも可能である。
サ−やイントロンを追加することが可能である。プロモ
ーター及びポリＡシグナルの一方を削除したり、両方も
しくは一方を別のものと置き換えることも可能である。
例えばＳＶ４０アーリープロモーターをショウジヨウバ
エ熱シヨツク蛋白プロモーターに置き換えたりすること
も可能である。もし蛋白質の発現単位が２Ｋｂ程度の大
きさとなる場合には制限酵素Ｘで消化して両断片をサイ
ズフラクショネーションで分離し易いように、ｏｒｉ領
域もしくはマーカー遺伝子の近くに適当なＤＮＡ断片を
組み込んでｏｒｉ領域とマーカー遺伝子を含む断片が他
の断片の２倍以上としておくことが望ましい。
エ熱シヨツク蛋白プロモーターに置き換えたりすること
も可能である。もし蛋白質の発現単位が２Ｋｂ程度の大
きさとなる場合には制限酵素Ｘで消化して両断片をサイ
ズフラクショネーションで分離し易いように、ｏｒｉ領
域もしくはマーカー遺伝子の近くに適当なＤＮＡ断片を
組み込んでｏｒｉ領域とマーカー遺伝子を含む断片が他
の断片の２倍以上としておくことが望ましい。
このカセットベクターを用いて、両端に非対称性粘着性
末端を有するＤＮＡ断片を製造する方法は次のとおりで
ある。ＤＮＡ断片をカセットベクターのポリリンカーク
ローニング部位を介して挿入し、得られるプラスミドを
大腸菌等にトランスフォーメーションする。これを選択
マーカーを用いて選択し大量培養する。得られたプラス
ミドを制限酵素Ｘで消化し、目的とする断片をサイズフ
ラクショネーションして分離する。
末端を有するＤＮＡ断片を製造する方法は次のとおりで
ある。ＤＮＡ断片をカセットベクターのポリリンカーク
ローニング部位を介して挿入し、得られるプラスミドを
大腸菌等にトランスフォーメーションする。これを選択
マーカーを用いて選択し大量培養する。得られたプラス
ミドを制限酵素Ｘで消化し、目的とする断片をサイズフ
ラクショネーションして分離する。
以下に実施例によって本発明を説明するが、これらは本
発明を制限するものではない。
発明を制限するものではない。
実施例 １ ヒトプロティンＣの発現単位に非対称性粘
着性末端を結合させた ＤＮＡ断片の作成 ヒトプロティンＣをコードする遺伝子の上流にＳＶ４０
アーリープロモーターが結合するプラスミドｐＣｓ １
をＥｅＯＲＩで消化した。ｐＣｓ １の制限酵素地図は
第１図に示され、またｐＣｓ １は大腸菌に一１２株０
ｍ２２５に組み込んで工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第９１１１（ＦＥＲＮ Ｐ−９１１１）と
して寄託されている。
着性末端を結合させた ＤＮＡ断片の作成 ヒトプロティンＣをコードする遺伝子の上流にＳＶ４０
アーリープロモーターが結合するプラスミドｐＣｓ １
をＥｅＯＲＩで消化した。ｐＣｓ １の制限酵素地図は
第１図に示され、またｐＣｓ １は大腸菌に一１２株０
ｍ２２５に組み込んで工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第９１１１（ＦＥＲＮ Ｐ−９１１１）と
して寄託されている。
ＥｃｏＲＩで消化した断片に、化学的に合成された下記
の二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。
の二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。
↓
↑
〔ｐはライゲーションのために５′末端に結合したリン
酸基、口はＢｓｔＸＩの認識部位、↓は同酵素の切断部
位を示す。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたｐＣｓ １の
ＥｃｏＲＩによる切断面と結合するが、ＥｃｏＲＩサイ
トが再生しない塩基配列としである。
酸基、口はＢｓｔＸＩの認識部位、↓は同酵素の切断部
位を示す。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたｐＣｓ １の
ＥｃｏＲＩによる切断面と結合するが、ＥｃｏＲＩサイ
トが再生しない塩基配列としである。
これは次の工程で生ずるＥｃｏＲＩサイトがユニークサ
イトとなるようにするためである。右側はＸｈｏｌによ
る断面と結合する部分である。
イトとなるようにするためである。右側はＸｈｏｌによ
る断面と結合する部分である。
ライゲーション産物をＸｈｏＩで消化した後再びライゲ
ートした。ＥｃｏＲＩで切断されたｐｃｓｌの両端に各
１個の合成オリゴヌクレオチドが結合し、その両端でラ
イゲートされて（この際Ｘｈｏｌサイトが生成する）環
状のプラスミドとなる。
ートした。ＥｃｏＲＩで切断されたｐｃｓｌの両端に各
１個の合成オリゴヌクレオチドが結合し、その両端でラ
イゲートされて（この際Ｘｈｏｌサイトが生成する）環
状のプラスミドとなる。
つぎに、生じたプラスミドをＰｖｕｎで部分消化する。
ｐＣｓ ｌ中には２つのＰｖｕｌｌサイトがあるので、
両方で切断されたもの、どちらか一方において切断され
たもの、及び全く切断されなかったものの混合物が得ら
れるので、アガロースゲルを用いた電気泳動法によりサ
イズフラクショネーションして、ＳＶ４０アーリープロ
モーターの上流に位置するＰｖｕＩＩのみが切断された
ものを単離する。単離されたＤＮＡ鎖に、化学的に合成
された下記の化学構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチ
ドをライゲートした。
両方で切断されたもの、どちらか一方において切断され
たもの、及び全く切断されなかったものの混合物が得ら
れるので、アガロースゲルを用いた電気泳動法によりサ
イズフラクショネーションして、ＳＶ４０アーリープロ
モーターの上流に位置するＰｖｕＩＩのみが切断された
ものを単離する。単離されたＤＮＡ鎖に、化学的に合成
された下記の化学構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチ
ドをライゲートした。
↓
〔記号は上記に同じ。右側はＥｃｏＲＩによる切断面と
結合する部分である。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたプラスミドＤ
ＮＡ鎖のＰｖｕＩＩにサイトと結合し、Ｐｖｕ■サイト
は再生しない塩基配列としである。ライゲーション産物
をＥｃｏＲＩで消化した後、再びライゲートした。Ｐｖ
ｕＩＩで切断されたプラスミドＤＮＡ鎖の両端に各１個
の合成オリゴヌクレオチドが結合し、この両端でライゲ
ートして（この際ＥｃｏＲＩサイトが生成する）環状の
プラスミドとなる。得られたプラスミドをＸｈｏＩ及び
ＥｅｏＲＩで切断し、その断片をｐＨＳ Ｇ３９Ｂ（宝
酒造■から購入。クロラムフェニコール耐性のマーカー
を持つ）をＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで切断したものにク
ローニングする。このようにして得られたクロラムフェ
ニコール耐性のプロティンＣ発現ベクタープラスミドを
ｐＣｓ４と命名した。その制限酵素地図を第２図に示し
た。これを大腸菌にトランスフォーメーションして大量
培養し、得られたプラスミドをＢｓｔＸＩて消化した。
結合する部分である。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたプラスミドＤ
ＮＡ鎖のＰｖｕＩＩにサイトと結合し、Ｐｖｕ■サイト
は再生しない塩基配列としである。ライゲーション産物
をＥｃｏＲＩで消化した後、再びライゲートした。Ｐｖ
ｕＩＩで切断されたプラスミドＤＮＡ鎖の両端に各１個
の合成オリゴヌクレオチドが結合し、この両端でライゲ
ートして（この際ＥｃｏＲＩサイトが生成する）環状の
プラスミドとなる。得られたプラスミドをＸｈｏＩ及び
ＥｅｏＲＩで切断し、その断片をｐＨＳ Ｇ３９Ｂ（宝
酒造■から購入。クロラムフェニコール耐性のマーカー
を持つ）をＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで切断したものにク
ローニングする。このようにして得られたクロラムフェ
ニコール耐性のプロティンＣ発現ベクタープラスミドを
ｐＣｓ４と命名した。その制限酵素地図を第２図に示し
た。これを大腸菌にトランスフォーメーションして大量
培養し、得られたプラスミドをＢｓｔＸＩて消化した。
消化した産物を電気泳動法によってサイズフラクショネ
ーションして下記のフラグメントを大量に生産した。
ーションして下記のフラグメントを大量に生産した。
（以下余白）
箇 い
０ ・
０番
０・
Ｏ
Ｑ
Ｑ
いｍ
このフラグメントは約２．ＯＫｂである。
実施例 ２ 選択マーカーに非対称性粘着性末端を結合
させたＤＮＡ断片の作成 大腸菌の中ではカナマイシン耐性を示し、真核細胞中で
は０４１ｇ（ジェネテイシン）耐性を示すネオ遺伝子が
組み込まれているコスミドベクターであって、ＡＴＣＣ
に３７３０１として寄託されているｐＨＳ Ｇ ２７４
をＢｓｔＸＩで消化すると次のように切断される。
させたＤＮＡ断片の作成 大腸菌の中ではカナマイシン耐性を示し、真核細胞中で
は０４１ｇ（ジェネテイシン）耐性を示すネオ遺伝子が
組み込まれているコスミドベクターであって、ＡＴＣＣ
に３７３０１として寄託されているｐＨＳ Ｇ ２７４
をＢｓｔＸＩで消化すると次のように切断される。
（以下余白）
（＾ い
Ｌｌ”ｌ 箇
上記合成オリゴヌクレオチドの右側がコスミドベクター
のＢｓｔＸＩによる切断面と結合する。ついでＨｌｎｄ
ｍで消化すると、コスミドベクターに含まれているＨｌ
ｎｄ ｍ −ＢｓｔＸ Ｉ部分及び反復結合した余分の
合成フラグメントが除去される。
のＢｓｔＸＩによる切断面と結合する。ついでＨｌｎｄ
ｍで消化すると、コスミドベクターに含まれているＨｌ
ｎｄ ｍ −ＢｓｔＸ Ｉ部分及び反復結合した余分の
合成フラグメントが除去される。
このようにして得られたものをライゲートした。
合成オリゴヌクレオチドの左側がコスミドベクター中の
ＨｉｎｄＩＩＩで切断された切断面と結合した環状プラ
スミドが得られる。このプラスミドをｐＨＳ Ｇ ２９
３と命名した。その制限酵素地図は第３図に示されてい
る。
ＨｉｎｄＩＩＩで切断された切断面と結合した環状プラ
スミドが得られる。このプラスミドをｐＨＳ Ｇ ２９
３と命名した。その制限酵素地図は第３図に示されてい
る。
ｐＨＳ Ｇ ２９３を大腸菌にトランスフォーメーショ
ンし大量培養し、得られたベクターＤＮＡをＢｓｔＸＩ
で消化することにより、選択マーカーとしてのネオ遺伝
子を持ち両端に非対称性粘着性末端を結合したＤＮＡフ
ラグメントを得た。このフラグメントは３．８ Ｋｂで
ある。
ンし大量培養し、得られたベクターＤＮＡをＢｓｔＸＩ
で消化することにより、選択マーカーとしてのネオ遺伝
子を持ち両端に非対称性粘着性末端を結合したＤＮＡフ
ラグメントを得た。このフラグメントは３．８ Ｋｂで
ある。
なお、合成オリゴヌクレオチド中のＸｂａｌはｐＨＳ
Ｇ ２７４とｐＨＳ Ｇ２９３を分別するために導入さ
れたものである。合成オリゴヌクレオチド中のＨｌｎｄ
ｕとＸｂａｌの間はＱａａオペレーターであり、コスミ
ドバッケージング後にカナマイシンによる選択と同時に
、Ｘ −ｇａｐの存在下にブルーコロニーとなる形質転
換株を識別することを可能とする。
Ｇ ２７４とｐＨＳ Ｇ２９３を分別するために導入さ
れたものである。合成オリゴヌクレオチド中のＨｌｎｄ
ｕとＸｂａｌの間はＱａａオペレーターであり、コスミ
ドバッケージング後にカナマイシンによる選択と同時に
、Ｘ −ｇａｐの存在下にブルーコロニーとなる形質転
換株を識別することを可能とする。
実施例 ３ プロティンＣの発現単位と選択マーカーが
多数個同一方向に結合 された遺伝子の作成 実施例１及び実施例２のＤＮＡ断片は、いずれも同じ組
み合せの非対称性粘着性末端が結合しており、同じ方向
にのみ結合する。
多数個同一方向に結合 された遺伝子の作成 実施例１及び実施例２のＤＮＡ断片は、いずれも同じ組
み合せの非対称性粘着性末端が結合しており、同じ方向
にのみ結合する。
実施例１と実施例２のＤＮＡを、分子比２０；１で混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲートし、多数のプロテ
ィンＣの発現単位と少数の選択マーカーが同一方向で結
合している長鎖のＤＮＡ鎖を得た。これをアガｂ−スゲ
ルで電気泳動して、約１００Ｋｂ以上であることが確認
された。このＤＮＡ鎖をライゲートされたＤＮＡという
。
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲートし、多数のプロテ
ィンＣの発現単位と少数の選択マーカーが同一方向で結
合している長鎖のＤＮＡ鎖を得た。これをアガｂ−スゲ
ルで電気泳動して、約１００Ｋｂ以上であることが確認
された。このＤＮＡ鎖をライゲートされたＤＮＡという
。
（以下余白）
実施例 ４ ライゲートされたＤＮＡから組み換え体コ
スミドＤＮＡの作成 実施例３で得られたライゲートされたＤＮＡには既にＣ
ＯＳサイトが組み込まれているので、そのままラムダフ
ァージにパッケージングすることが可能である。実施例
３で得られたライゲートされたＤＮＡを宝酒造−から購
入したインビトロパッケージングキットを用いてラムダ
ファージ粒子でパッケージングした。パッケージされた
組み換え体ラムダファージを大腸菌に感染させた。
スミドＤＮＡの作成 実施例３で得られたライゲートされたＤＮＡには既にＣ
ＯＳサイトが組み込まれているので、そのままラムダフ
ァージにパッケージングすることが可能である。実施例
３で得られたライゲートされたＤＮＡを宝酒造−から購
入したインビトロパッケージングキットを用いてラムダ
ファージ粒子でパッケージングした。パッケージされた
組み換え体ラムダファージを大腸菌に感染させた。
大腸菌としては、実施例５におけるインビボパッケージ
ングの便宜を考慮し、０ｍ２０Ｂ （ＤＨ１株のλＣＩ
１ｍｍ ４３４ ｔｓ、 ｒｅｄ 、 ｂ ２．
Ｓａｍ７の溶原化したもの。工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第９１１０号（ＦＥＰＮ Ｐ−９
１１０）として寄託されいてる）を用いた。ネオ遺伝子
にもとずくカナマイシン耐性を選択マーカーとして培養
した。
ングの便宜を考慮し、０ｍ２０Ｂ （ＤＨ１株のλＣＩ
１ｍｍ ４３４ ｔｓ、 ｒｅｄ 、 ｂ ２．
Ｓａｍ７の溶原化したもの。工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第９１１０号（ＦＥＰＮ Ｐ−９
１１０）として寄託されいてる）を用いた。ネオ遺伝子
にもとずくカナマイシン耐性を選択マーカーとして培養
した。
生育したコロニーから、プロティンＣ発現単位の比率の
高い組み換え体コスミドを次のようにして分離した。
高い組み換え体コスミドを次のようにして分離した。
各コロニーの大腸菌に含まれている組み換え体コスミド
をＢｓｔＸＩで切断してプロティンＣ発現単位とｐＨ５
Ｇ２９３ベクタ一単位とに分け、両者の分子比をデンシ
トメーターで測定した。その結果をもとにし、組み換え
体コスミドＤＮＡの大きさを４５Ｋｂと仮定して両者の
構成分子数を計算した。その結果を第１表に示した。
をＢｓｔＸＩで切断してプロティンＣ発現単位とｐＨ５
Ｇ２９３ベクタ一単位とに分け、両者の分子比をデンシ
トメーターで測定した。その結果をもとにし、組み換え
体コスミドＤＮＡの大きさを４５Ｋｂと仮定して両者の
構成分子数を計算した。その結果を第１表に示した。
第 １ 表
クローンごとのプロティンＣ発現単位及びｐＨ３Ｇ２９
３ベクターの比率この結果にもとづき、プロティンＣ発
現単位が最も多く含まれているクローン番号２０及び４
６の組み換え体コスミドＤＮＡを精製採取した。それぞ
れをコスミド−ＤＮＡＩおよびコスミドーＤＮＡ２とい
う。
３ベクターの比率この結果にもとづき、プロティンＣ発
現単位が最も多く含まれているクローン番号２０及び４
６の組み換え体コスミドＤＮＡを精製採取した。それぞ
れをコスミド−ＤＮＡＩおよびコスミドーＤＮＡ２とい
う。
実施例 ５ 組み換え体コスミドＤＮＡのＣＯＳサイト
におけるライゲー ション 実施例４で得られた大腸菌細胞は温度感受性の誘発を行
なうラムダファージで溶原化されている。
におけるライゲー ション 実施例４で得られた大腸菌細胞は温度感受性の誘発を行
なうラムダファージで溶原化されている。
したがってその大腸菌細胞内にある環状ＤＮＡを細胞内
でファージ粒子の中にパッケージすることができる。こ
の性質を利用して、実施例４のクローン番号２０の大腸
菌を加熱誘発し、ファージ粒子にパッケージされた後両
末端にＣＯＳサイトをもつ直鎖状のＤＮＡを調製した。
でファージ粒子の中にパッケージすることができる。こ
の性質を利用して、実施例４のクローン番号２０の大腸
菌を加熱誘発し、ファージ粒子にパッケージされた後両
末端にＣＯＳサイトをもつ直鎖状のＤＮＡを調製した。
その直鎖状ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートす
ることより、そのＤＮＡが同一方向に結合した高分子Ｄ
ＮＡを得た。これを高分子ファージＤＮＡという。この
高分子ファージＤＮＡをアガロースゲル電気泳動したと
ころ約１００ Ｋｂ以上であることが確認された。これ
は鎖状のコスミドーＤＮＡが２゜３個以上鎖状に結合し
たものと解釈される。
ることより、そのＤＮＡが同一方向に結合した高分子Ｄ
ＮＡを得た。これを高分子ファージＤＮＡという。この
高分子ファージＤＮＡをアガロースゲル電気泳動したと
ころ約１００ Ｋｂ以上であることが確認された。これ
は鎖状のコスミドーＤＮＡが２゜３個以上鎖状に結合し
たものと解釈される。
実施例 ６ プロティンＣの発現
実施例３．４及び５で作成したライゲートされたＤＮＡ
、コスミド−ＤＮＡ１、コスミドＤＮＡ２、及び高分子
ファージＤＮＡ各々５μｇを用いてＤＮＡトランスフェ
クションを行った。まず常法に従いリン酸カルシウムと
の共沈を作成した。
、コスミド−ＤＮＡ１、コスミドＤＮＡ２、及び高分子
ファージＤＮＡ各々５μｇを用いてＤＮＡトランスフェ
クションを行った。まず常法に従いリン酸カルシウムと
の共沈を作成した。
このＤＮＡ溶液を１×１０６個のＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓ
ｅＨａｍｓｔｅｒ ０ｖａｒｙ）細胞にさらすことによ
り、遺伝子を導入した。Ｇ ４１８耐性（ｎｅｏ）遺伝
子を獲得した細胞は４００μｇ ／ ｍｌの濃度の０４
１８で選択され、コロニーを形成した。得られたコロニ
ーの数は各々２４個、９１個、１０７個及び６１個であ
った。各々のコロニーの内、約２０個をクローニング（
分離培養）し、各クローン（分離株）の１×１０６個の
細胞が産生ずるプロティンＣの産生量を抗プロティンＣ
抗体を使用し、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ （Ｅｎｚｙｍｅ
ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅｎＬ Ａｓ５ａ
ｙ）法により測定した。その結果をまとめたものを第２
表に示した。ｄｈｒｒ遺伝子を用いた従来の方法により
得られた形質転換株（メソトレキセートで増幅していな
いもの）の例を対照の欄に記載した。
ｅＨａｍｓｔｅｒ ０ｖａｒｙ）細胞にさらすことによ
り、遺伝子を導入した。Ｇ ４１８耐性（ｎｅｏ）遺伝
子を獲得した細胞は４００μｇ ／ ｍｌの濃度の０４
１８で選択され、コロニーを形成した。得られたコロニ
ーの数は各々２４個、９１個、１０７個及び６１個であ
った。各々のコロニーの内、約２０個をクローニング（
分離培養）し、各クローン（分離株）の１×１０６個の
細胞が産生ずるプロティンＣの産生量を抗プロティンＣ
抗体を使用し、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ （Ｅｎｚｙｍｅ
ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅｎＬ Ａｓ５ａ
ｙ）法により測定した。その結果をまとめたものを第２
表に示した。ｄｈｒｒ遺伝子を用いた従来の方法により
得られた形質転換株（メソトレキセートで増幅していな
いもの）の例を対照の欄に記載した。
第 ２ 表
プロティンＣの生産量ごとのクローンの数＋
４ ２ ９２１３丑
５ １２ ．６
６ １− ： １．４ ｎｇ／ｍ１以下 ＋
： １．４〜５０ｎｇ／ｍｌ廿：５０〜３５０ ｎｇ
／ｍｌ −）ｆ） ： ４００〜９００ ｎｇ／ｍ１
ｄｈｆｒ遺伝子を用いた従来の方法ではほんどが５０ｎ
ｇ／ｍｌ以下の産生量しがないのに対し、この新しい方
法を用いたものではライゲートＤＮＡ、コスミドＤＮＡ
−１、コスミドＤＮＡ−２及び高分子ファージＤＮＡで
４００ ｎｇ／ｍｌがら９００ ｎｇ／ｍｌの産生量を
もつものが各々７．１％、 ３９．１％、 ２０．８％
及び３８．９％であり、従来の方法と比較して明らかに
高い産生】をもつものが高い頻度で得られることがわか
った。
４ ２ ９２１３丑
５ １２ ．６
６ １− ： １．４ ｎｇ／ｍ１以下 ＋
： １．４〜５０ｎｇ／ｍｌ廿：５０〜３５０ ｎｇ
／ｍｌ −）ｆ） ： ４００〜９００ ｎｇ／ｍ１
ｄｈｆｒ遺伝子を用いた従来の方法ではほんどが５０ｎ
ｇ／ｍｌ以下の産生量しがないのに対し、この新しい方
法を用いたものではライゲートＤＮＡ、コスミドＤＮＡ
−１、コスミドＤＮＡ−２及び高分子ファージＤＮＡで
４００ ｎｇ／ｍｌがら９００ ｎｇ／ｍｌの産生量を
もつものが各々７．１％、 ３９．１％、 ２０．８％
及び３８．９％であり、従来の方法と比較して明らかに
高い産生】をもつものが高い頻度で得られることがわか
った。
実施例 ７ ＳＶ４０プロモーターを有するカセット
ベクターの作成 実施例１で作成したｐＣｓ４をＳａｇ４及びＢａａ＋Ｈ
Ｉで完全に消化し、クロラムフェニコール耐性マーカー
を持つｐＨＳ Ｇ３９Ｇ由来のプラスミドベクター及び
ＳＶ４０アーリープロモーターを持つ断片を精製した。
ベクターの作成 実施例１で作成したｐＣｓ４をＳａｇ４及びＢａａ＋Ｈ
Ｉで完全に消化し、クロラムフェニコール耐性マーカー
を持つｐＨＳ Ｇ３９Ｇ由来のプラスミドベクター及び
ＳＶ４０アーリープロモーターを持つ断片を精製した。
この断片はポリＡシグナルを含まない。一方、ＳＶ４０
ゲノム中のポリＡシグナルを含むＨｐａｌ −ＢａｍＨ
Ｉフラグメント（２５８８番目から２４５２番目、Ｒｅ
ｄｄｙ ｅｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２００゜４９
４、１９７８）のＨｐａｌの上流にＸｂａｌサイトと５
ａｉｌサイトを付けた１４６ｂｐの５ａｊｌｌ・Ｘｂａ
Ｉ −Ｂａａ＋ＨＩフラグメントを化学合成した。
ゲノム中のポリＡシグナルを含むＨｐａｌ −ＢａｍＨ
Ｉフラグメント（２５８８番目から２４５２番目、Ｒｅ
ｄｄｙ ｅｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２００゜４９
４、１９７８）のＨｐａｌの上流にＸｂａｌサイトと５
ａｉｌサイトを付けた１４６ｂｐの５ａｊｌｌ・Ｘｂａ
Ｉ −Ｂａａ＋ＨＩフラグメントを化学合成した。
このフラグメントと先に調整したＢａｍＨＩ−５ａｊ７
１フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、得られ
たカセットベクターをｐＨＳ Ｇ ７３７と命名した。
１フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、得られ
たカセットベクターをｐＨＳ Ｇ ７３７と命名した。
その制限酵素地図を第６図に示した。
このカセットベクターの＝ＰｓｔＩ、５ａ１１もしくは
Ｘｂａｌサイトのいずれか１つのサイトと蛋白質をコー
ドする遺伝子を挿入することにより、本発明に用いる両
側に非対称性粘着性末端を有する発現ユニットフラグメ
ントを簡単に調製することが出来る。さらにベクタ一部
分に存在するＥｃｏＲＩサイトもしくはＸｈｏＩサイト
に適当な大きさのＤＮＡ断片を挿入することによりベク
タ一部分を含むＢ ５ｔＸＩフラグメントを他方の発現
ユニットを含むフラグメントと比較して、より大きくす
ることにより口約の発現ユニットフラグメントのみを精
製し易くすることも可能である。
Ｘｂａｌサイトのいずれか１つのサイトと蛋白質をコー
ドする遺伝子を挿入することにより、本発明に用いる両
側に非対称性粘着性末端を有する発現ユニットフラグメ
ントを簡単に調製することが出来る。さらにベクタ一部
分に存在するＥｃｏＲＩサイトもしくはＸｈｏＩサイト
に適当な大きさのＤＮＡ断片を挿入することによりベク
タ一部分を含むＢ ５ｔＸＩフラグメントを他方の発現
ユニットを含むフラグメントと比較して、より大きくす
ることにより口約の発現ユニットフラグメントのみを精
製し易くすることも可能である。
第１図はｐＣｓ １の制限酵素地図を示す。
第２図はｐＣｓ４の制限酵素地図を示す。
第３図はｐＨ３Ｇ２９３の制限酵素地図を示す。
第４図はは挿入される遺伝子（この場合プロモーター及
びポリＡシグナルもしくはターミネータ−をすでに有し
ている遺伝子）の両端に非対称性粘着性末端が直接的に
結合したＤＮＡ断片を製造するためのカセットベクター
の模式図である。 第５図は蛋白質をコードする構造遺伝子のみを挿入して
発現単位の両端に非対称性粘着性末端が結合したＤＮＡ
断片を製造するためのカセットベクターの模式図である
。 第６図はｐＨＳ Ｇ ７３７の制限酵素地図を示す。 特許出願人 へキストジャパン株式会社第２図 第３図 第４図 オー０リリ〉フ（１゛− グローニンク杏阻
びポリＡシグナルもしくはターミネータ−をすでに有し
ている遺伝子）の両端に非対称性粘着性末端が直接的に
結合したＤＮＡ断片を製造するためのカセットベクター
の模式図である。 第５図は蛋白質をコードする構造遺伝子のみを挿入して
発現単位の両端に非対称性粘着性末端が結合したＤＮＡ
断片を製造するためのカセットベクターの模式図である
。 第６図はｐＨＳ Ｇ ７３７の制限酵素地図を示す。 特許出願人 へキストジャパン株式会社第２図 第３図 第４図 オー０リリ〉フ（１゛− グローニンク杏阻
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）蛋白質の発現に必要なＤＮＡが多数個同一方向に結
合した遺伝子を動物細胞宿主にトランスフェクションし
て得られた宿主細胞を培養して蛋白質を製造する方法。 ２）選択マーカーとなる遺伝子が同一方向に追加的に結
合されている遺伝子を用いることを特徴とする特許請求
の範囲第１項の方法。 ３）蛋白質の発現に必要なＤＮＡが多数個同一方向にラ
イゲートされて結合した遺伝子を用いることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項の方法。 ４）蛋白質の発現に必要なＤＮＡが多数個同一方向にラ
イゲートされて結合した遺伝子の組み換え体コスミドＤ
ＮＡを用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項の
方法。 ５）蛋白質の発現に必要なＤＮＡが多数個同一方向にラ
イゲートされて結合した遺伝子の組み換え体コスミドＤ
ＮＡを、そのＣＯＳサイトによりライゲートしたものを
用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項の方法。 ６）プロテインＣを製造することを特徴とする特許請求
の範囲第１項乃至第５項のいずれかの項に記載の方法。 ７）蛋白質の発現に必要なＤＮＡが多数同一方向に結合
した遺伝子。 ８）選択マーカーとなる遺伝子が同一方向に追加的に結
合されていることを特徴とする特許請求の範囲第７項の
遺伝子。 ９）蛋白質の発現に必要なＤＮＡがその両端に結合する
非対称性粘着性末端によって結合されているものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第７項の遺伝子。 １０）蛋白質の発現に必要なＤＮＡがその両端に結合す
る異なった制限酵素の粘着性末端であって、そのＤＮＡ
が同一方向に結合した時それらの制限酵素部位が消失す
るような粘着性末端によって同一方向に結合されている
遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第７項記
載の遺伝子。 １１）ＤＮＡ断片の両端に結合する非対称性粘着性末端
を結合させることより成るＤＮＡ断片を同一方向に多数
結合させる方法。 １２）非対称性粘着性末端を生ずる制限酵素認識部位に
相当する塩基配列２個がプラスミド中に離れて同一方向
に存在し、該２個の塩基配列の間の一方にはポリリンカ
ークローニング部位が他の一方にはｏｒｉ領域と選択マ
ーカーが存在するプラスミドベクター。 １３）ポリリンカークローニング部位の一端に転写開始
に必要な領域と、他端に転写終結に必要な領域のどちら
か１つもしくは両方の領域を含むことを特徴とする特許
請求の範囲第１２項記載のプラスミドベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62096340A JPS63267288A (ja) | 1986-12-26 | 1987-04-21 | 増幅された遺伝子によつて蛋白質を生産する方法およびそのための遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30839686 | 1986-12-26 | ||
| JP61-308396 | 1986-12-26 | ||
| JP62096340A JPS63267288A (ja) | 1986-12-26 | 1987-04-21 | 増幅された遺伝子によつて蛋白質を生産する方法およびそのための遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63267288A true JPS63267288A (ja) | 1988-11-04 |
Family
ID=26437556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62096340A Pending JPS63267288A (ja) | 1986-12-26 | 1987-04-21 | 増幅された遺伝子によつて蛋白質を生産する方法およびそのための遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63267288A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009073551A3 (en) * | 2007-11-30 | 2010-01-14 | Scarab Genomics Llc | Lac expression system |
| US8530188B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-09-10 | Fujifilm Diosynth Biotechnologies (UK) Limited | Expression system |
-
1987
- 1987-04-21 JP JP62096340A patent/JPS63267288A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8530188B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-09-10 | Fujifilm Diosynth Biotechnologies (UK) Limited | Expression system |
| US9677103B2 (en) | 2006-02-03 | 2017-06-13 | Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Limited | Expression system |
| US11098335B2 (en) | 2006-02-03 | 2021-08-24 | Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Limited | Expression system |
| WO2009073551A3 (en) * | 2007-11-30 | 2010-01-14 | Scarab Genomics Llc | Lac expression system |
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