FI94425B - Menetelmä ihmisen antitrombiini III:n (ATIII:n) valmistamiseksi nisäkässoluviljelmässä sekä tähän soveltuvia vektoreita ja nisäkäsisäntäsoluja - Google Patents

Description

1 '94425

Menetelmä ihmisen antitrombiini III:n (ATIII:n) valmistamiseksi nisäkässoluviljelmässä sekä tähän soveltuvia vektoreita ja nisäkäsisäntäsoluja 5 Keksintö koskee menetelmää ihmisen antitrombiini III:n (ATIII:n) valmistamiseksi nisäkässoluviljelmässä ilmentymisvektorin avulla, joka sisältää ATIII-cDNA:ta. Keksintö koskee lisäksi tähän tarkoitukseen soveltuvia vektoreita ja nisäkäsisäntäsoluja.

10 EP-hakemusjulkaisussa 90 505 kuvataan ATIII:a koo- daavan cDNA:n valmistusta ja karakterisointia samoin kuin ihmis-ATIII:n valmistusta E. colissa. Mainitussa hakemus-julkaisussa on myös ohjeita ATIIIrn valmistamiseksi nisä-kässoluviljelmissä. Soveltuvana vektorina esitetään 15 pBR322-johdannainen, joka sisältää E. coli -valikointi- markkerin ja E. coli -replikaatioaloituskohdan. Vektorin tulee sisältää lisäksi SV40-replikaatioaloituskohta (peräisin 342 ep:n PvuII-Hindlll -fragmentista).

Tämä keksintö sitä vastoin koskee erityisen edul-20 lista menetelmää, jossa isäntäsoluna toimii nisäkässolu, joka ei pysty tuottamaan dihydrofolaattireduktaasia ollenkaan tai riittävässä määrin, ja jossa tämä isäntäsolu transfektoidaan samanaikaisesti kahdella ilmentymisvekto-rilla, joista toinen sisältää ATIII-geenin ja toinen saa : 2*5 aikaan dihydrofolaattituotannon.

Keksintö koskee siten menetelmää ihmisen antitrombiini III:n (ATIII:n) valmistamiseksi nisäkässoluviljelmässä ilmentymisvektorin avulla, joka sisältää ATIII-cDNA-:ta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 30 että nisäkässoluna käytetään dhfr -solua, joka rinnakkais- transfektoidaan toisella vektorilla, jossa on DHFR-geeni, joka on heikkotehoisen promoottorin säätelyn alaisena. Keksinnön muita puolia ja sen edullisia suoritusmuotoja valaistaan tarkemmin seuraavassa ja ne määritellään pa- 35 tenttivaatimuksissa.

2 94425

Keksinnön mukaisessa rinnakkaistransfektointijärjestelmässä käytetään siis kahta ilmentymisvektoria, jolloin ensimmäinen vektori on valittavissa oleva vektori, esimerkiksi pBR322-johdannainen, jossa ATIII-geeni on si-5 nänsä tunnetulla tavalla eukaryoottisissa soluissa tehokkaan promoottorin ohjauksen alaisena, kun taas toisessa vektorissa, joka koodaa dihydrofolaattireduktaasia ja antaa siten mahdollisuuden myös geenin amplifiointiin, DHFR-geenin ilmentymistä ohjaa pBR322-ori-alueen DNA-sekvenssi.

10 Kuvioissa esitetään esimerkkejä keksinnön erityisen edullisista suoritusmuodoista:

Kuviossa 1 ja sen jatko-osassa, kuviossa la, kuvataan vektorin pSVA STOP 1 konstruointia, joka vektori sisältää pBR322:n EcoRI-PvuII -fragmentin, Hindlll-PvuII -15 fragmentin, jossa on replikaatioaloituskohta ja promoottori aikaisia ja myöhäisiä transskriptejä varten, samoin kuin SV40-genomin BamHI-Hpal -fragmentista peräisin olevan polyadenylaatiokohdan ja lisäksi plasmidista pUC12 STOP peräisin olevan translaation lopetuskohdan.

20 Kuvio 2 esittää ATIIIia koodaavan DNA-sekvenssin sisällyttämistä vektoriin pSVA STOP 1.

Kuvio 3 esittää vektorien pMTVAdhfr (joka sisältää MMTV-LTR -promoottorin) ja pSVOAdhfr (joka ei sisällä eu-karyoottista eikä viruspromoottoria) konstruointia.

« •25 Kuvio 4 esittää ATIII-ilmentymisarvoja, joita saa tiin solulinjoilla, jotka sisälsivät jompaa kumpaa edellä mainituista vektoreista ja joita saatiin tekemällä geeni-amplifikaatio metotreksaatilla.

On tarkoituksenmukaista muodostaa ensimmäisen vek-30 torin, joka sisältää ATIII-geenin, lisäksi myös toinen DHFR-geenin sisältävä vektori pBR322-johdannaisena. Näiden vektorien etuna on se, että ne amplifioituvat E. colissa ja niitä voidaan käyttää samanaikaisesti "heilurivektorei-na" eukaryoottisissa soluissa. Valikointimarkkerina toimii 35 edullisesti ampisilliiniresistenssigeeni, jonka pBR322:n 3 '94425

EcoRI-PvuII -fragmentti sisältää. On itsestään selvää, että muita tai lisämarkkereita voidaan sisällyttää sinänsä tunnetulla tavalla ja muuntaa tai poistaa alueita, jotka eivät ole oleellisen tärkeitä.

5 Vektorien eräänä muuna edullisena piirteenä on se, että rakennegeenin päätepistettä seuraa translaation lope-tussekvenssi, joka on peräisin pUC12 STOPista [M. Broker ja E. Amann, Appi. Microbiol. Biotechnol. 23 (1986) 294- 296], Tässä DNA-segmentissä on kaikkien kolmen lukukehyk-10 sen translaation lopetuskodonit, mikä antaa mahdollisuuden muunnettujen geenien, joilla ei ole omaa translaation lo-petussignaalia, ilmentymiseen.

Nisäkässolut, jotka eivät tuota ollenkaan tai riittävässä määrin dihydrofolaattireduktaasia (dhfr-), ja so-15 pivat vektorit, jotka pystyvät korjaamaan tämän puutteen, ovat yleisesti tunnettuja (Ernst-L. Winnacker, Gene und Klone, eine Einfuhrung in die Gentechnologie, VCH Verlags-gesellschaft Weinhein 1984, s. 267-269, 282 ja 289) . Niinpä G. Urlaub ja L. A. Casin [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 20 (1980) 4216-4220] ovat kuvanneet esimerkiksi sellaisten CHO-mutanttien eristämistä, joiden dihydrofolaattireduk-taasiaktiivisuus on puutteellinen. Siten saadaan dhfr -tyyppiä olevia solulinjoja. Vastaavasti voidaan valmistaa muitakin nisäkässolulinjoja toistettavalla tavalla. Mutan-25 tit ovat kolminkertaisesti auksotrofisia ja tarvitsevat kasvaakseen glysiiniä, puriininukleotidia, kuten hypoksan-tiinia, ja tymidiiniä.

Vektoreita, jotka pystyvät viemään dihydrofolaatti-reduktaasigeenin eläinsoluihin, ovat kuvanneet esimerkiksi ?0 F. Lee et ai. [Nature 294 (1981) 228]. Tässä käytetään cDNArta, joka koodaa hiiren dihydrofolaattireduktaasia [A.

C. Y. Chang et ai., Nature 275 (1978) 617-624]. Vastaavalla tavalla voitaisiin käyttää muita nisäkässoluissa toimivia dihydrofolaattireduktaasigeenejä.

4 '94425

Edullinen on CHO-dhfr”-soluista ja hiiren dhfr-gee-nistä muodostuva järjestelmä.

Edullisissa ATIII-ilmentymisvektoreissa käytetään aikaista promoottoria, joka on peräisin SV40:n replikaa-5 tioaloituskohdan DNA-alueelta, ihmisen metallotioneiini II -promoottoria [M. Karin ja R. I. Richards, Nature 299 (1982) 797-802], HCMV:n "immediate early" -geenin edistä-jäpromoottorialuetta [ihmisen sytomegalovirus, M. Boshart et ai., Cell 41 (1985) 521-530], tai Drosophilan lämpö- 10 shokkiproteiini 70 -promoottoria (hsp 70 -promoottoria) [Holmgren et ai., Cell 18 (1979) 1359-1370]. Dihydrofo- laattireduktaasituotanto voi tapahtua nisäkässolulinjassa heikkotehoisen promoottorin, kuten MMTV-LTR:n (mouse mammary tumor virus-long terminal repeat, F. Lee et al., 15 ibid), ohjauksessa tai - keksinnön erään erityissuoritus-muodon mukaisesti - myös ilman eukaryoottista promoottoria. Viimeksi mainitussa tapauksessa on välittömästi ennen dhfr-geeniä pBR322:sta peräisin oleva DNA-sekvenssi, joka todennäköisesti tunnistetaan nisäkässoluissa heikoksi pro-20 moottoriksi [K.-D. Langner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 83 (1986) 1598-1602].

Soveltuvia ilmentymisjärjestelmiä kuvataan myös US-patenttijulkaisuissa 4 399 216 ja 4 576 821 samoin kuin EP-hakemusjulkaisuissa 100 521 ja 117 058 - 117 060.

‘25 Keksinnön erään muun suoritusmuodon mukaisesti käy tetään vektoreita, jotka eivät sisällä introneja eli "silmuko itumiskohtia" ("splice sites"). Oli yllättävää, että tällaiset vektorit ovat niin hyvin toimivia, sillä EP-hakemus julkaisun 90 505 mukaan RNA-silmukoitumiskohdat ovat 30 välttämättömiä vektoreissa ATIIIrn tuottamiseksi soluvil-·- jelmissä.

On tunnettua, että dihydrofolaattireduktaasi voidaan inhiboida metotreksaatilla. Solut, jotka kasvavat glysiiniä, hypoksantiinia ja tymidiiniä sisältämättömissä 35 alustoissa, estetään siten kasvamasta tai tapetaan meto- 5 '94425 treksaatilla. Vaihtelemalla alustan metotreksaattipitoi-suutta ja solutiheyttä voidaan valikoida soluja, jotka kasvavat metotreksaatin läsnä ollessa. Nämä solut ovat DHFR-geenin amplifioitumisen ja siihen liittyvän DHFR-ent-5 syymin kohonneen tuotannon ansiosta resistenttejä valitulle metotreksaattipitoisuudelle. Henkiin jääneet solut voidaan altistaa uudelleen kohonneille metotreksaattipitoi-suuksille, mikä johtaa tällöin solulinjoihin, joissa DHFR-geenien lukumäärä on vielä suurempi.

10 Geenien amplifiointi voidaan toteuttaa kahdella erilaisella menetelmällä: 1. Soluja amplifioidaan tekemällä yksinkertaisia siirrostuksia kohoaviin metotreksaattipitoisuuksiin. Tällöin muodostuu geneettisesti heterologinen solupopulaatio, 15 jossa on amplifikaatioasteeltaan erilaisia soluja.

2. Eristetään jokaisessa metotreksaattipitoisuus-vaiheessa vain geneettisesti yhdenmukaisia soluklooneja ja analysoidaan ne, jolloin kunkin vaiheen parhaiten tuottavat solulinjat siirretään seuraavaan vaiheeseen.

20 On osoittautunut, että keksinnön mukaisten rinnak- kaistransformoitujen solulinjojen ollessa kyseessä meto-treksaatilla tehtävä geeniamplifikaatio johtaa DHFR-geenin lisääntymisen lisäksi myös ATIII-geenin amplifioitumiseen.

Eläinsolujen lisäämiseksi viljelmässä tarvitaan '25 yleensä seerumin läsnäoloa kasvualustassa. Nyt on havaittu, että ATIII:a tuottavia solulinjoja voidaan pitää vuorotellen seerumia sisältävässä ja seerumittomassa alustassa havaitsematta useahkojen siirrostusten aikana ATIII-tuotantomäärien alenemista. Tämän keksinnön mukaisen me- 30 netelmän suoritusmuoto ei ole edullinen pelkästään siitä syystä, että voidaan säästää kallista seerumia, vaan myös siksi, että se helpottaa huomattavasti ATIII:n erottamista, jos viimeinen tuotantovaihe toteutetaan seerumittomassa ympäristössä.

6 94425

Keksinnön mukaisesti tuotetulla yhdistelmä-ATIII-:11a on täysi biologinen aktiivisuus. Se stimuloituu -täsmälleen ihmisplasmasta eristetyn luontaisen tuotteen kaltaisesti - hepariinin vaikutuksesta. Siksi se soveltuu 5 luonnontuotteen kanssa samalla tavalla lääkkeiden valmistukseen .

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä. Vektorien konstruointia havainnollistetaan lisäksi kuvioilla 1-3, joissa merkinnät eivät yleensä ole oi-10 keassa mittakaavassa. Erityisesti pienet fragmentit ja mo-nikytkijäsekvenssit esitetään yleensä "venytettyinä".

Esimerkki 1 a) Eläinsoluille tarkoitetun iImentyrnisvektorin konstruointi 15 Plasmidi pSV2dhfr (kuvio 1, Lee et ai., ibid.) pil kottiin HindIII:lla ja EcoRI:llä ja eristettiin 2,65 ke:n vektorifragmentti, joka sisältää SV40:n "aikaisen" promoottorin. Siten esikäsiteltyyn vektoriin ligatoitiin 67 ep:n Hindlll-EcoRI -fragmentti pUC12 STOPista (Broker ja 20 Amann, ibid.), jolloin saadaan plasmidi pSV2 STOP. pUC12 STOPista peräisin olevassa 67 ep:n fragmentissa on translaation lopetuskodonit kaikille kolmelle lukukehykselle. pSV2 STOP linearisoitiin Saclrllä ja poistettiin jäljelle jäänyt 3'-häntä DNA-polymeraasi l:n 3'-+5'-eksonukleaasi-125 aktiivisuuden avulla. Sen jälkeen tehtiin pilkkominen Eco-RI:llä. Kun oli tehty ligatointi pBB3:sta peräisin olevan 133 ep:n suuruisen EcoRI-Hpal -fragmentin kanssa [kuvio la, B. Bourachot et ai., Embo J. 1 (1982) 895-900], joka sisältää SV40:n polyadenylaatiosignaalin aikaista trans-30 skriptiä varten, saatiin ilmentymisenvektori pSVA STOP1.

Polyadenylaatiokohdat voidaan eristää myös vektorista pIG6 (Bourachot et ai., ibid.). Samoin voidaan eristää SV40-genomista 133 ep:n BamHI-Hpal -fragmentti, täydentää BamHI-katkaisukohta ja lisätä EcoRI-kytkijä.

7 94425 pSVA ST0P1 sisältää siten SV40:n "aikaisen" promoottorin ja SV40:n aikaisten transskriptien polyadeny-laatiosignaalin välissä kloonausmonikytkijän, jossa on kolme yksittäistä restriktiokohtaa (Hindlll-Sall-Xbal), ja 5 sekvenssin, jossa on translaation lopetuskodoni kaikille kolmelle lukukehykselle.

b) ATIII-ilmentymisvektorin konstruointi ATIII-cDNA:ta kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 90 505 ja se voidaan valmistaa mainitussa julkaisussa kulo vatulla tavalla tai syntetisoida tavanomaisin menetelmin. DE-patenttihakemuksessa P 36 18 638.4 ehdotetaan plasmidia ρβΑΤ6 (kuvio 1) , joka sisältää ATIII-cDNA:n plasmidin pUC13 Smal-pilkkoutumiskohdassa.

ATIII-cDNA-alakloonausplasmidi, pBAT6 (kuvio 2) 15 linearisoitiin katkaisemalla se ainoasta EcoRI-kohdastaan. Jäljelle jäänyt 5'-häntä tehtiin tylpäksi täydentämällä vastinsäie DNA-polymeraasi I:llä (Klenow-fragmentti), ja tehtiin sitten ligatointi Sali-kytkijän 5' d (pGGTCGACC) 3' 20 avulla. Tekemällä sitten Xbal-pilkkominen voitiin eristää noin 1400 ep:n pituinen DNA-fragmentti, joka koodaa koko pre-ATIII:a. pSVATIII saatiin ligatoimalla tämä fragmentti Sall:llä ja Xbal:llä pilkotun ilmestymisvektorin pSVASTOPl:n kanssa. pSVATIII:ssa oleva ATIII-transskrip--25 tioyksikkö ei sisällä mRNA-silmukoitumiskohtia.

c) DHFR-ilmentymisvektorien konstruointi rinnak-kaistransfektiota varten

Rinnakkaistransfektointiin käytettyjen DHFR-vektorien lähtökohtana oli plasmidi pMTVdhfr (Lee et ai., 30 ibid.). pMTVdhfr pilkottiin (kuvio 3) Bglllrlla, ja täydennettiin yksisäikeiset 5'-päät DNA-polymeraasi I:n (Klenow-fragmentti) avulla. Kun oli tehty pilkkominen EcoRI:-llä, eristettiin 4,47 kp:n fragmentti ja ligatoitiin se 133 ep:n EcoRI-Hpal -fragmentin kanssa, joka oli peräisin 35 pBB3:sta (Bourachot et ai., ibid.). Uusi plasmidi β 94425 pMTVAdhfr sisältää hiiren DHFR-cDNA:n, jota reunustavat MMTV-LTR ja SV40:n polyadenylaatiokohta aikaisia trans-skriptejä varten.

pSVOAdhfr saatiin pMTVAdhfr:stä deletoimalla 1450 5 ep:n Hindlll-fragmentti, jokä sisältää MMTV-LTR:n.

pMTVAdhfr ja pSVOAdhfr eivät kumpikaan sisällä mRNA-silmukoitumiskohtia.

Esimerkki 2

Plasmideilla pSVATIII ja pMTVAdhfr tai pSVOAdhfr 10 rinnakkaistransfektoidaan CHO-dhfr -solut kalsiumfosfaat-tisaostusmenetelmällä [Graham ja von der Eb, Virology 52 (1973) 456-467]. 20 μq plasmidia pSVATIII sekoitettiin 5 μq:n kanssa DHFR-ilmentymisplasmidia pMTVAdhfr, ja tehtiin rinnakkaissaostus. Plasmidiseossakalla transfektoitiin 15 edellä kuvatulla tavalla (0,5 x 106 solua 25 cm2:n vilje-lypullossa) CHO-dhfr~-solut. Solut trypsinisoitiin 3 vrk:n kuluttua, siirrostettiin useisiin 60 mm:n petrimaljoihin, ja lisättiin seulonta-alustaa (ilman glysiiniä, hypoksan-tiinia ja tymidiiniä). Näissä olosuhteissa jäävät henkiin 20 vain ne solut, jotka ovat stabiilisti transfektoituneet DHFR-geenillä.

1-3 viikon kuluttua petrimaljoissa oli havaittavissa transfektoituneista soluista koostuvia pesäkkeitä. Tällöin päästiin seuraaviin transfektoitumisasteisiin: Ϊ25 pMTVAdhfr 5 x 10^ pSVOAdhfr 1 x 10’5

Eristettiin yksittäisiä pesäkkeitä ja lisättiin niitä glysiiniä, hypoksantiinia ja tymidiiniä sisältämättömässä alustassa.

30 Näiden uusien solulinjojen (CHO SVAT III) viljel- mäsupernatantit tutkittiin spesifisellä ELISAlla ihmis-ATIII:n osoittamiseksi yhdistelmä-ATIII:ssa. Tällöin havaittiin, että 20 % tutkituista CHO-dhfr+-solulinjoista erittää havaittavissa olevia määriä ihmis-ATIII:a alus-35 taan. ATIII:a tuottavien linjojen tuotantomäärien määrit- 9 94425 tämiseksi kvantitatiivisesti tehtiin seuraava standardi-testimenettely: 0,5 x 106 solua siirrostettiin 5 ml:aan alustaa, joka oli 25 cm2:n viljelypullossa. Alusta vaihdettiin (5 ml) 24 tunnin kuluttua. Kun oli kulunut vielä 24 5 tuntia, otettiin alusta talteen ELISAa varten, ja solut trypsinisoitiin ja laskettiin. Annetut luvut ovat vähintään kolmen siirrostuksen keskiarvoja, jolloin tuotantomäärät pysyvät vakioina vaihtelun ollessa ± 25 %. Kaikkien seuraavassa annettavien tuotantomäärien yhteydessä (μς/106 10 solua 24 tunnissa) oli solumäärä 25 cm2:n pulloa kohden kokeen lopussa 1 ± 0,25 x 106 solua. Seuraavassa yhteenvedossa annetaan kuvatulla tavalla tutkittujen kantakloonien tuotantomäärät: CHO SVAT III-MTVAdhfr klooni 1: 0,14 Mg/106 solua 15 24 tunnissa klooni 2: 0,11 μg/106 solua 24 tunnissa CHO SVAT III-SVOAdhfr klooni 1: 0,08 μ9/ΐθ6 solua 24 tunnissa 20 klooni 2: 0,14 μg/l06 solua 24 tunnissa

Esimerkki 3

Integroituneiden ATIII-sekvenssien amplifiointi a) Amplifiointi eristämättä yksittäisklooneja *25 CHO SVAT III-MTVAdhfr (kloonit 1 ja 2) ja CHO SVAT

III-SVOAdhfr (kloonit 1 ja 2) saatettiin vaiheittain kasvavan metotreksaattipitoisuuden (Mtx) alaiseksi. Edellä kuvatulla standardimenetelmällä määritettiin seuraavat tuotantomäärät (μq/106 solua 24 tunnissa) : • 10 94425

Mtx CHO SVAT III-PMTVAdhfr CHO SVAT III-SVOAdhfr

Klooni 1 Klooni 2 Klooni 1 Klooni 2 0 0,14 0,11 0,08 0,14 0,05 0,34 0,54 5 0,15 - 0,60 0,64 2,7 0,3 0,55 1,15 - 3,3 0,6 1,18 2,00 0,86 1 1,5 5 μιηοΐ/l - 4,00 - 8,5 10 b) Amplifointi eristmällä yksittäiskloonit Mtx-pitoisuutena käytettiin pitoisuuksia 0,1 μιηοΐ/ΐ ja 1 μιηοΐ/ΐ. Käyttämällä lähtöaineena CHO SVAT III-MTVA-dhfr:ää (klooni 2) eristettiin 8 ("B" kuviossa 4) ja CHO 15 SVAT III-SVOAdhfr:ää (klooni 1) 11 ("A" kuviossa 4) Mtx-pitoisuudelle 0,1 μιηοΐ/ΐ resistenttiä kloonia ja määritettiin niiden tuotantonopeudet (kuvio 4); oordinaatta osoittaa ATIII-saannon μ9/106 solua 24 tunnissa). Kaikki nämä kloonit tuottavat enemmän ATIII:a kuin vastaava lähtöaine-20 klooni (katso edellä). Mtx-pitoisuudessa 0,1 μιηοΐ/ΐ kasvavien kloonien, joissa lähtöaineena on CHO SVAT III-MTV-Adhfr (klooni 2), tuotantomäärä on 0,15 - 0,8 μ9/106 solua 24 tunnissa (vastaa määrän lisään tyrnistä 1,4 - 7-kertai-seksi), ja käytettäessä lähtöaineena CHO SVAT III-SVO-25 Adhfrtää (klooni 1) 0,35 - 3,2 μg/106 solua 24 tunnissa (vastaa lisääntymistä 4 - 40-kertaiseksi). "Southern blot" -analyyseillä [Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503] voitiin osoittaa, että kaikissa analysoiduissa Mtx-pitoisuudessa 0,1 μιηοΐ/ΐ kasvavissa klooneissa amplifioituu spesi- 30 finen 1400 ep:n pituinen, transfektoin tiin käytetystä • .

ATIII-cDNA:sta peräisin oleva BamHI-Hindlll -fragmentti.

Parhaiten tuottavalle, Mtx-pitoisuudelle 0,1 μιηοΐ/ΐ resistentille solulinjalle (CHO SVAT III-SVOAdhfr, klooni 1 A2; 2,2 μg/106 solua 24 tunnissa; kuviossa 4 "A2") teh-35 tiin toinen amplifiointisykli Mtx-pitoisuudessa 1 μιηοΐ/ΐ.

11 94425 Tällöin pystyttiin 9 uudelleen testatusta kloonista eristämään yksi solulinja (CHO SVAT III-SVOAdhfr klooni 1A27), joka tuottaa noin 10 Mg/106 solua 24 tunnissa.

Esimerkki 4 5 ATIII-synteesi seerumittomassa alustassa CHO SVAT III-SVOAdhfr -kloonia 1A27 (1 μιηοΐ/ΐ Mtx) kasvatettiin 175 cm2:n viljelypulloissa HamF12-seulonta-alustassa (ei sisällä glysiiniä, tymidiiniä eikä hypoksan-tiinia) naudan sikiöseerumin läsnä ollessa (10 til-%) kon-10 fluenssiin noin 80 %, sitten solut pestiin seerumittomalla Iskoven alustalla ja sitten niitä pidettiin 48 tuntia tässä alustassa ATIII:n tuottamiseksi. Tämän ajan kuluttua alusta sisälsi ATIII:a pitoisuutena 5-6 /ig/ml. Soluja pidettiin sen jälkeen 24 - 48 tuntia seerumia sisältävässä 15 alustassa, ja aloitettiin sitten taas toinen 48 tuntia kestävä tuotantojakso seerumittomassa alustassa. Kuvattu tuotantosykli voitiin toistaa useasti ATIII-tuotantonopeu-den alenematta.

Esimerkki 5 20 Eläinsoluista saatavan ATIII:n puhdistus ja karak terisointi ATIII:a rikastettiin affiniteettikromatografisesti , ... ® hepamni-SEPHAROSE :11a [Miller-Anderssen et ai., Thromb.

Res. 5 (1974) 439-452] sekä seerumipitoisesta että myös 25 seerumittomasta alustasta. Rikastettu materiaali oli Ouch-terlonyn mukaisessa immuunidiffuusiotestissä [Prog. Allergy 5 (1958) 1] immunologisesti identtistä ihmiseerumista talteenotetun ATIII:n kanssa. Myös "Western blot" -analyysissä, jossa käytettiin ATIII-spesifisiä vasta-aineita, 30 olivat ihmisplasmasta eristetty ATIII ja CHO-soluista eri-stetty yhdistelmä-ATIII identtisiä.

CHO-solujen erittämällä ATIII:11a oli täysmääräisenä sekä hepariinikofaktoriaktiivisuus [Hensen ja Loeling-er, Thromb. Diath. haemah. 9 (1963) Suppl. 1. 18-29] että 35 progressiivi-inhibiittoriaktiivisuus [Schrader et ai., Ärtztl. Lab. 29 (1983) 35-39].

Claims (20)

12 94425

1. Menetelmä ihmisen antitrombiini III:n (ATIII:n) valmistamiseksi nisäkässoluviljelmässä ilmentymisvektorin 5 avulla, joka sisältää ATIII-cDNA:ta, tunnettu siitä, että nisäkässoluna käytetään dhfr -solua, joka rin-nakkaistransfektoidaan toisella vektorilla, jossa on DHFR-geeni, joka on heikkotehoisen promoottorin säätelyn alaisena.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DHFR-geeniä ei edellä mikään eukaryoottinen eikä viruspromoottori.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DHFR-geeni on alavirtaan 15 liittyneenä pBR322-ori -alueeseen.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DHFR-geeni on alavirtaan liittyneenä valikointimarkkerin sisältävän pBR322-segmentin ori-alueeseen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valikointimarkkeri on ampi-silliiniresistenssigeeni.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pBR322-segmenttinä käytetään

2. EcoRI-Pvu II -fragmenttia.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ATIII-geeni on vi-ruspromoottorin säätelyn alaisena.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen me- 30 netelmä, tunnettu siitä, että vektorit eivät si- * säilä silmukoitumiskohtia.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DHFR-geeniä ampli-fioidaan yhdessä ATIII-geenin kanssa metotreksaatilla. 13 94425

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ATIII-tuotanto tapahtuu seerumittomassa alustassa. 11. pBR322-sekvenssejä ja ATIII-cDNA:ta sisältävä 5 ilmentysmisvektori, tunnettu siitä, että siinä on SV40-promoottorisekvenssi ja SV40-polyadenylaatiokohta ja siitä puuttuvat silmukoitumiskohdat.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen ilmentymisvek-tori, tunnettu siitä, että polyadenylaatiokohta 10 on SV 40:n 133 ep:n BamHI-Hpal -fragmentti.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen ilmenty-misvektori, tunnettu siitä, että siinä on pUC12 STOPista peräisin oleva translaation lopetussekvenssi.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen ilmentymisvek- 15 tori, tunnettu siitä, että se on plasmidi pSVATIII (kuvio 2).

15. Patenttivaatimuksen 11 mukaisen ilmentymisvektorin valmistuksessa käyttökelpoiset plasmidit pSV2 STOP (kuvio 1) ja pSVA STOP1 (kuvio la).

16. Hiiren DHFR-geenin sisältävä vektori, tun nettu siitä, että DHFR-geeni on heikkotehoisen promoottorin säätelyn alaisena ja että vektori ei sisällä silmukoitumiskohtaa.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen vektori, « *25 tunnettu siitä, että siinä on SV4O-polyadenylaati okoht a.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi pMTVAdhfr tai pSVOAdhfr (kuvio 3). ?0 19. Nisäkässolu, tunnettu siitä, että se on transfektoitu samanaikaisesti patenttivaatimuksien 11 -14 mukaisella vektorilla ja patenttivaatimuksen 16 - 18 mukaisella vektorilla.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen solu, t u n - 35. e t t u siitä, että se valikoidaan metotreksaatin avulla. . 94425