DK174993B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller - Google Patents

Description

i DK 174993 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller.

Fra europæisk patentansøgning med offentliggørelsesnr.

5 0.090.505 er fremstillingen og karakteriseringen af det for ATIII kodende cDNA bekendt, samt fremstillingen af et humant ATIII i E. coli. I denne ansøgning findes der ligeledes anvisninger til, hvordan man kan fremstille ATIII i pattedyrscellekulturer. Som egnet vektor anføres et pBR322-deri-10 vat, som indeholder en markør til selektion i E. coli samt en E. coli-replikationsstart. Vektoren skal endvidere indeholde SV40-replikationsstarten (afledt af et 342bp PvuII-Hindlll-fragment).

Overfor det angår den foreliggende fremgangsmåde en 15 særlig fordelagtig fremgangsmåde, ved hvilken en pattedyrscelle tjener som værtscelle, hvilken celle ikke eller ikke i tilstrækkelig grad kan producere dihydrofolatreduktase, og hvorved denne værtscelle kotransficeres med to ekspressionsvektorer, af hvilke den ene bærer ATIII-genet, og den 20 anden bevirker produktion af dihydrofolatreduktase.

Opfindelsen angår følgelig en fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) i pattedyrscellekulturer ved hjælp af en ekspressionsvektor, som indeholder ATIII-cDNA'et, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, 25 at man som pattedyrcelle anvender en dhfr-celle, som kotrans-ficeres med yderligere en vektor, som har et DHFR-gen, der kontrolleres af en svag promotor.

Opfindelsen angår også vektorer og værtsceller egnet til fremgangsmåden.

30 Opfindelsen angår således en ekspressionsvektor med pBR322-sekvenser og ATIII-cDNA’et, som er ejendommelig ved en SV40-promotorsekvens, et SV40-polyadenyleringssted og fravær af "splice sites", og endvidere en vektor med muse-DHFR-genet, som er ejendommelig ved, at DHFR-genet kontrolle-35 res af en svag promotor, og at vektoren ikke indeholder nogen "splice sites".

DK 174993 B1 2

Opfindelsen angår herudover en pattedyrcelle, som er kotransficeret med to vektorer som ovenfor defineret.

Foretrukne udførelsesformer for opfindelsen belyses nedenfor.

5 Kotransfektionssystemet ifølge opfindelsen anvender altså to ekspressionsvektorer, idet den første er en vilkårlig vektor, eksempelvis et pBR322-derivat, i hvilket ATIII-genet på i for sig kendt måde er under kontrol af en i euka-riotiske celler virksom promotor, medens ekspressionen i 10 forbindelse med den anden vektor, som koder for dihydrofolat-reduktasen og dermed også giver mulighed for genamplifika-tion, af DHFR-genet kontrolleres af en DNA-sekvens i pBR322-ori-området.

På tegningen vises i figurerne som eksempler særligt 15 foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.

I figur 1 og fortsættelsen deraf, figur la, er beskrevet konstruktionen af vektoren pSVA STOP 1, som indeholder pBR322-EcoRI-PvuII-fragmentet, Hindlll-PvuII-fragmentet med replikationsstarten og promotoren for de tidligere og 20 sene transkripter samt polyadenylierungsstedet fra BamHI-Hpal-fragmentet fra SV40-Genomet og endvidere indeholder translationsstoppet fra plasmidet pUC12 STOP.

I figur 2 vises således indbygningen af den for ATIII kodende DNA-sekvens i vektoren pSVA STOP 1.

25 I figur 3 er beskrevet konstruktionen af vektorerne PMTVAdhfr (som indeholder MMTV-LTR-promotoren) og psvOAdhfr (som ikke har nogen eukariotisk eller viral promotor).

I figur 4 er vist ATIII-ekspressionshastigheden af cellelinier, som hver indeholder en af de to sidstnævnte 30 vektorer, og som fås via en genamplifikation med methotrexat.

Hensigtsmæssigt udstyres ikke kun den første vektor, som indeholder ATIlI-genet, men også den anden vektor med DHFR-gen som pBR322-derivat. Sådanne vektorer har den fordel, at de amplificerer sig i E. coli og samtidig kan anvendes 35 som "pendulvektorer" i eukariotiske celler. Som selektionsmarkør tjener fordelagtigt ampicillinresistensgenet, som DK 174993 B1 3

er indeholdt i EcoRI-PvuII-pBR322-fragmentet. Naturligvis kan andre eller yderligere markører indbygges på i og for sig kendt vis, og uvæsentlige områder kan varieres eller fj ernes. I

5 En yderligere foretrukken udførelsesform for vek torerne består i, at i tilslutning til strukturgenerne følger translationsstop-sekvensen fra pUC12 STOP (M. Broker og E.

Amann, Appl. Microbiol. Biotechnol. 23 (1986) 294-296). På dette DNA-segment befinder der sig translationsstopkodoner 10 for alle tre læserammmer, hvilket tillader ekspressionen af modificerende gener, som ikke har noget eget translationsstopsignal .

Pattedyrceller, som ikke eller ikke i tilstrækkelig grad producerer dihydrofolatreduktase (dhfr), og egnede 15 vektorer, som kan kompensere for denne defekt, er alment kendte (Ernst-L. Vinnacker, Gene und Klone, eine Einfdhrung in die Gentechnologie, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, 1984, s. 267/268, 282,289). Således er eksempelvis beskrevet isoleringen af CHO-cellemutanter, som mangler dihydro-folat-20 reduktase-aktivitet, af G. Urlaub og L.A. Chasin, Proc.

Natl. Acad.Sci. USA 77 (1980), 4216-4220). Man får således cellelinier af dhfr-typen. Analogt kan man ligeledes på reproducerbar måde fremstille andre pattedyrcellelinier.

Mutanterne er tredobbelt auxotrofe og har for at vokse brug 25 for glycin, et purinucleotid, såsom hypoxanthin, og thymidin.

Vektorer, som kan indføre dihydrofolatreduktase-genet i animalske celler, er eksempelvis beskrevet af F. Lee et al., Nature 294 (1981) 288. Hertil gøres der brug af det cDNA, som koder for muse-dihydrofolatreduktase (A.C.Y. Chang 30 et al., nature 275 (1978) 617-624). På analog måde kan andre i animalske celler funktionelle gener for dihydrofolatreduktase anvendes.

Man foretrækker CHO-dhfr-celle/muse-dhfr-gensystemet.

Foretrukne ekspressionsvektorer for ATIII anvender 35 den tidligere promotor fra DNA-området af SV40-replikations-starten, den humane metallothionein-II-promotor (M. Karin DK 174993 B1 4 og R.I. Richards, Nature 299 (1982) 797-802), enhancer-pro-motor-området fra et H immediate early"-gen fra HCMV (human cytemegalovirus, M. Boshart et al., Cell 41 (1985) 521-530), eller Drosophhila heat shock protein 70 (hsp 70)-promotor 5 (Holmgren et al., Cell 18 (1979) 1359-1370). Ekspressionen af dihydrofolatreduktase sker under kontrol af en i pattedyrcellelinien svagt virksom promotor, såsom MMTV-LTR (mouse mammary tunmor virus-long terminal repeat, F. Lee et al., se ovenfor) eller - svarende til en særlig udformning af 10 opfindelsen - også uden eukariotisk eller viral promotor. I det sidstnævnte tilfælde er der umiddelbart foran dhfr-genet indkoblet en DNA-sekvens fra pBR322, som åbenbart i pattedyrceller opfattes som svagere promotor (K.-D. Langner et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 1598-1602).

15 Egnede ekspressionssystemer er ligeledes beskrevet i US-patentskrifterne nr. 4.399.216 og 4.576.821 samt i de europæiske patentansøgninger nr. 0.100.521 og 0.117.058 til 0.117.060.

En yderligere udformning af opfindelsen består i, at 20 der anvendes vektorer, som ikke indeholder nogle introns eller "splice sites". Fordelen ved vektorer uden "splice sites" ligger i, et forkert ("aberrant") splejsning af mRNA for DHFR og det heterologe protein, som kan føre til uønskede fejlagtige genprodukter, udelukkes. Herved forøges effekti-25 viteten af den omhandlede fremgangsmåde yderligere.

Det er kendt, at dihydrofolatreduktasen inhiberes af methotrexat. Celler, som vokser i medier uden glycin, hy-poxanthin og thymidin, hæmmes derfor af methotrexat i deres vækst eller dræbes. Ved at variere methotrexat-koncentrati-30 onen i mediet og celletætheden kan man udvælge celler, som vokser i nærværelse af methotrexat. Disse celler er på grund af en amplifikation af DHFR-generne og en dermed forbundet øget produktion af enzymet DHFR resistente overfor den valgte methotrexat-koncentration. Overlevende celler kan atter 35 udsættes for forøgede methotrexat-koncentrationer, hvilket derpå leder til cellelinier med et endnu højere antal DHFR- gener.

DK 174993 B1 5

Genamplifikationen kan gennemføres ved hjælp at to forskellige fremgangsmåder: 1. Cellerne amplificeres ved hjælp af simple passager 5 i stigende methotrexat-koncentrationer. Herved dannes en genetisk heterolog cellepopulation, hvori der foreligger celler med forskellige amplifikationsgrad.

2. Ved hvert methotrexat-koncentrationstrin isoleres 10 og analyseres genetisk ensartede cellekloner, idet kun de bedst eksprimerende cellelinier fra et trin overføres til det nærmeste højere trin.

Det har vist sig, at genampl i fikat ionen med metho-trexat ved kotransficerede cellelinier ifølge opfindelsen 15 ikke kun fører til en formering af DHFR-generne, men også til en amplifikation af ATIII-genet.

Til formering af animalske celler i kultur anvender man almindeligvis tilstedeværelsen af serum i vækstmediet.

Det har nu vist sig, at man med afbrydelser kan holde ATIII-20 producerende cellelinier i serumholdigt og serumfrit medium, hvorved der over flere passager ikke viser sig noget fald i ATIII-ekspressionhastighederne. Denne udformning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ikke kun fordelagtig fordi man kan spare dyrt serum, men den letter også fraskillelsen 25 af ATIII betydeligt, når det sidste produktionstrin sker uden serum.

Det ifølge opfindelsen tilvejebragte rekombinante ATIII har fuld biologisk aktivitet. Det stimuleres - ligesom naturprodukt isoleret fra humanplasma - af heparin. Det 30 egner sig derfor ligesom det naturlige produkt til fremstilling af lægemidler.

I de følgende eksempler belyses opfindelsen nærmere. Vektorkonstruktionerne anskueliggøres yderligere ved hjælp af figurerne 1-3, idet tegningerne almindeligvis ikke er i 35 korrekt målestoksforhold. Især er små fragmenter og poly-linker-sekvenser som regel angivet ’'udstrakt”.

DK 174993 B1 6

Eksempel 1 a) Konstruktion af en ekspressionvektor for animalske celler.

Plasmidet pSV2dhfr (figur 1) (Lee et al. se ovenfor) 5 skæres med Hindlll og EcoRI, og det 2,65 kb store vektorfragment, som har SV40-"early"-promotoren, isoleres. Til den således forbehandlede vektor ligeres der et 67 bp Hindlll-EcoRI-fragment fra pUC12 STOP (Broker og Amann, se ovenfor) , hvilket fører til dannelse af plasmidet pSV2 STOP. På 10 67 bp-fragmentet af pUC12 STOP befinder der sig translations- stopkodons i alle tre læserammer. pSV2 STOP lineariseres med SacI og den dannede fremspringende 3'-gruppe fjernes ved hjælp af DNA-polymerase I's 3'-*5'-exonukleaseaktivitet.

Derpå fordøjes der med EcoRI. Efter ligering med et 133 bp 15 stort EcoRI-Hpal-fragment fra pBB3 (figur la) (B. Bourachot et al., Embo J. 1 (1982) 895-900), som bærer SV40-polyade-nyleringssignalet for tidligere transkripter, kan man få ekspressionsvektoren pSVA ST0P1.

Polyadenyleringsstedet kan ligeledes isoleres fra 20 vektoren pIG6 (Bourachot et al., se ovenfor). Ligesådan kan man af SV40-genet isolere det 133 bp BamHI-Hpal-fragment, udfylde BamHI-brudstedet og tilføje en EcoRI-1inker.

pSVA ST0P1 har følgelig mellem SV40-,,early,,-prorootoren og SV40-polyadenyleringssignalet fra tidlige transkripter 25 en koningspolylinker med tre singulære restriktionssteder (Hindlll-Sall-Xbal) og en sekvens med translationsstop i alle tre læserammer.

b) Konstruktion af en ATIII-ekspressionsvektor ATIII-cDNA'en er kendt fra EP-A2 0.090.505 og kan

30 fremstilles som der beskrevet eller syntetiseres ved hjælp af gængse fremgangsmåder. I den tyske patentansøgning nr. P

3.618.638.4 er foreslået plasmidet p/3AT6 (figur 1), som indeholder ATIII-cDNA'en i Smal-brudstedet i plasmidet pUC13.

Subkloningsplasmidet ATIII-cDNA, p/9AT6 (figur 2) , 35 lineariseres ved klipning ved det singulære EcoRI-sted. Den fremspringende 5'-gruppe får ved udfyldning af modstrengen DK 174993 B1 7 med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) stumpe ender og ligeres derpå med Sall-linker 5'd(pGGTCGACC)31.

Ved en derpå følgende Xbal-nedbrydning kan man isolere et 5 ca. 1400 bp stort DNA-fragment, som koder for det fuldstændige præ-ATIII. pSVATIII fås ved ligering af dette fragment til den med Sall og Xbal klippede ekspressionsvektor pSVASTOPl. ATIII-transkriptionsenheden på pSVATIII har ikke nogle m-RNA-"splice sites”.

10 c) Udgangspunkt for de til kotransfektion anvendte DHFR-vektorer er plasmidet pMTVdhfr (Lee et al., se ovenfor). pMTVdhfr (figur 3) skæres med Bglll, og de fremspringende 5'-ender i DNA fyldes ud ved hjælp af DNA-polymerase I (Kle-now-fragment). Efter fordøjelse med EcoRI isoleres et 4,47 15 kb stort fragment, og der ligeres med et 133 bp stort EcoRI-Hpal-fragment fra pBB3 (Bourachot et al., se ovenfor). Det nye plasmid pMTVAdhfr bærer muse-DHFR-cDNA * et, flankeret af MMTV-LTR og SV40-polyadenyleringsstedet for tidlige tran-skripter.

20 pSVOAdhfr fås af pMTVAdhfr ved fjernelse af et 1450 bp stort Hindlll-fragment, som bærer MMTV-LTR. Hverken pMTVAdhfr eller pSVOAdhfr har m-RNA-"splice sites".

Eksempel 2 25 Plasmiderne pSVATIII og pMTVAdhfr eller pSVOAdhfr kotransficeres ved hjælp af calciumphosphatpræcipitationsmetoden (Graham og von der Eb, Virology 52 (1973) 456-467) i CHO-dhfr"-celler. 20 μg af plasmidet pSVATIII blandes og kopræcipiteres herved sammen med 5 /ig af DHFR-ekspressions-30 plasmiderne pMTVAdhfr eller pSVOAdhfr. Kopræcipitatet af plasmidblandingen transficeres som ovenfor beskrevet (0,5 x 106 celler i 25 cm* dyrkningskolbe) , i CHO-dhfr“-celler.

EFter 3 dages forløb trypsineres cellerne, overføres til flere 60 mm petriskåle, og der tilsættes selektionsmedium 35 (uden glycin, hypoxanthin og thymidin). Under disse betingelser overlever kun de celler, som er stabilt transficerede 8 DK 174993 B1 med DHFR-genet.

Efter 1-3 ugers forløb bliver kolonier, bestående af transficerede celler, synlige i petriskålene. Følgende transfektionsrater kan herved opnås: 5 pMTVAdhfr 5 x lo”6 pSVOAdhfr 1 x 1θ“5

Enkelte kolonier isoleres og formeres i medium uden glycin, hypoxanthin og thymidin.

Kultursupernatanter fra disse nye cellelinier (CHO 10 SVAT III) testes ved hjælp af specifik ELISA til påvisning af menneskeligt ATIII i rekombinant ATIII. Herved viser det sig, at hver gang 20 % af de afprøvede CHO-dhfr+-celle-linier udskiller påviseligt menneskeligt ATIII for mediet.

For at bestemme ekspressionshastigheden af de linier, der 15 producerer ATIII, kvantitativt, gennemføres følgende standardtestprocedure: 0,5 x 106 celler udplateres i 5 ml medium i 25 cm2 dyrkningskolber. 24 timer efter udskiftes mediet (5 ml). Yderligere 24 timer senere opsamles mediet til ELISA, og cellerne trypsineres og tælles. De angivne værdier er 20 middelværdier for mindst tre passager, hvorved ekspressionshastighederne forbliver konstante indenfor en svingning på ±25 %. Ved alle i det følgende angivne ekspressionshastigheder (pq/io6 celler pr. 24 timer) ligger celleantallet pr.

25 cm2 kolbe ved slutningen af afprøvningen på 1±0,25 x 25 io6 celler. Den følgende oversigt giver ekspressionshas-tighedeme af på den beskrevne måde afprøvende basiskloner: CHO SVAT III-MTVAdhfr Klon 1: 0,14 μg/106 celler/24 t

Klon 2: 0,11 Mg/106 celler/24 t CHO SVAT III-SVOAdhfr Klon 1: 0,08 Mg/106 celler/24 t 30 Klon 2: 0,14 Mg/106 celler/24 t 35 DK 174993 B1 9

Eksempel 3

Amplifikation af de integrerede ATIII-sekvenser a) Amplifikation uden isolering af enkeltkloner CHO SVAT III-MTVAdhfr (klon 1 og 2) og CHO SVAT III-5 SVOAdhfr (klon 1 og 2) omsættes succesivt i stigende metho-trexat-(Mtx)-koncentration. Ved den ovenfor beskrevne standardmetode bestemmes følgende ekspressionshastigheder (μg/106 celler pr. 24 timer):

MtX CHO SVAT III-pMTVAdhfr CHO SVAT III-SVOAdhfr 10 Klon 1 Klon 2 Klon 1 Klon 2 0 0,14 0,11 0,08 0,14 0,05 0,34 0,54 0,15 - 0,60 0,64 2,7 15 0,3 0,55 1,15 - 3,3 0,6 1,18 2,00 0,86 1 - 1,5 5 μΜ - 4,00 - 8,5 20 b) Amplifikation under isolering af enkeltkloner

Som Mtx-koncentrationstrin anvendes 0,1 μΜ og ΙμΜ.

Idet man går ud fra CHO SVAT III-MTVAdhfr (klon 2) isoleres 8 ("BM i figur 4) og idet man udgår fra CHO SVAT III-SVOAdhfr (klon 1) 11 ("A" i figur 4) i forhold til 0,1 μΜ Mtx resi-25 stente kloner og karakteriseres med hensyn til deres ekspressionshastigheder (figur 4); ordinaten viser udbyttet af ATIII i mg/106 celler pr. 24 timer). Alle disse kloner producerer en større mængde ATIII end den tilsvarende udgangsklon (s.o.). Ekspressionshastighederne af de kloner, der 30 vokser ved 0,1 μΜ Mtx, ligger, idet man går ud fra CHO SVAT

III-MTVAdhfr (klon 2) på mellem 0,15 og 0,8 μg pr. 106 celler pr. 24 timer (svarende til en øgning med en faktor 1,4-7), og idet man går ud fra CHO SVAT III-SVOAdhfr (klon 1) , på mellem 0,35 og 3,2 μg pr. 106 celler pr. 24 timer (svarende 35 til en øgning med faktoren 4-40). I "Southern blots" (Southern, J.Mol.Biol. 98 (1975) 503) kan det påvises, at der i DK 174993 B1 10 alle analyserede, ved 0,1 μΝ Mtx voksende kloner amplificeres et specifikt 1400 bp BamHI-Hindlll-fragment fra det trans» ficerede ATIII-cDNA.

Med den bedst producerende, ved 0,1 μΗ Mtx resistente 5 cellelinie (CHO SV AT III-SVOAdbfr, klon 1 A2: 2,2 Mg/106 celler/24 t; indtegnet i figur 4 som "A2") gennemføres yderligere en amplifikationsrunde ved 1 μΜ Mtx. Herved kan man ved atter 9 afprøvede kloner isolere en cellelinie (CHO SVAT III-SVOAdhfr klon 1A27) , som producerer ca. 10 μg pr.

10 106 celler pr. 24 timer.

Eksempel 4

Synthese af ATIII i serumfrit medium CHO SVAT III-SVOAdhfr klon 1 A27 (1 μΜ Mtx) dyrkes i 15 175 cm2 dyrkningskolber i HamF12 selektionsmedium (uden glycin, thymidin og hypoxanthin) i nærværelse af 10 volumen% føtal kalveserum til ca. 80% konfluens, cellerne vaskes derpå med serumfrit Iskoves-medium og holdes derpå i 48 timer i dette medium til produktion af ATIII. Efter dette tidsrum 20 foreligger ATIII i en koncentration på 5-6 μg/ml i mediet. Cellerne holdes derpå i 24-48 timer i det serumholdige medium, indtil der begynder en yderligere 48 timer lang produkt ionssrunde i serumfrit medium. Den beskrevne produktionscyklus kan gentages flere gange uden fald i ATIII-eks-25 pressionshastighederne.

Eksempel 5

Rensning og karakterisering af ATIII fra animalske celler 30 ATIII opkoncentreres ved hjælp af affinitetschromato- grafi på heparin-SEPHAROSE^ (Miller-Anderssen et al., Thromb. Res. 5 (1974) 439-452), såvel fra serumholdigt og fra serumfrit medium. Det opkoncentrerede materiale viser ved immundiffusionstest ifølge Ouchterlony (Prog. Allergy 35 5, (1958) 1) immunologisk identitet med fra humanserum ud vundet ATIII. Også ved "Western blot" med ATIII-specifikke DK 174993 B1 11 antistoffer foreligger der identitet mellem det fra humanplasma og det fra CHO-celler udvundne rekombinante ΑΤΙΪΙ.

Det af CHO-celler udsondrede ΆΤΙΙΙ har både heparin-kofaktor (Hensen og Loeliger, Thromb. Diath. Haemah. (1963) 5 Suppl. i, 18-29) og progressivinhibitoraktivitet (Schrader et al., Årztl. Lab. 29 (1983) 35-39) i fuld udstrækning.

Claims (20)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af humant ant i thrombin III (ATlii) i pattedyrcellekulturer ved hjælp af en 5 ekspressionsvektor, som indeholder ATIII-cDNA'et kendetegnet ved, at man som pattedyrcelle anvender en dhfr'-celle, som kotransf iceres med yderligere en vektor, som har et DHFR-gen, der kontrolleres af en svag promotor.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved, at der foran DHFR-genet ikke er koblet nogen eu- kariotisk eller viral promotor.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at DHFR-genet forbindes efter pBR322-ori-regionen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, ken detegnet ved, at DHFR-genet forbindes efter ori-regi-onen i et pBR322-segment, som indeholder en selektionsmarkør.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at selektionsmarkøren er ampicillinresistens- 2. genet.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at der som pBR322-segment anvendes EcoRI-PvuII-fragmentet.

7. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 25 1-6, kendetegnet ved, at ATIII-genet står under kontrol af en viral promotor.

8. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-7, kendetegnet ved, at vektorerne ikke indeholder nogen "splice sites".

9. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-8, kendetegnet ved, at DHFR-genet sammen med ATIII-genet ampiificeres med methotrexat.

10. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-9, kendetegnet ved, at ATIII-produktionen 35 sker i serumfrit medium. DK 174993 B1 13

11. Ekspressionsvektor med pBR322-sekvenser og ATIII-cDNA'et, kendetegnet ved en SV40-promotorsekvens, et SV40-polyadenyleringssted og fraværet af "splice sites".

12. Vektor ifølge krav li, kendetegnet 5 ved, at polyadenyleringsstedet i det væsentlige er det 133 bp store BamHI-Hpal-fragment.

13. Vektor ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved translationsstopsekvensen fra pUC12 STOP.

14. Plasmiderne pSV2 STOP (figur 1) og pSVA ST0P1 10 (figur la).

15. Plasmidet pSVATIII (figur 2).

16. Vektor med muse-DHFR-genet, kendetegnet ved, at DHFR-genet kontrolleres af en svag promotor, og at vektoren ikke indeholder nogen "splice sites".

17. Vektor ifølge krav 16, kendetegnet ved et SV40-polyadenyleringssted.

18. Plasmiderne pMTVAdhfr og pSVOAdhfr (figur 3).

19. Pattedyrcelle, kotransficeret med en vektor ifølge krav 11-15 og med en vektor ifølge krav 16-18.

20. Celle ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den er selektioneret ved hjælp af methotrexat.