JP2826114B2 - 遺伝子産物の製法 - Google Patents
遺伝子産物の製法Info
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- JP2826114B2 JP2826114B2 JP63283072A JP28307288A JP2826114B2 JP 2826114 B2 JP2826114 B2 JP 2826114B2 JP 63283072 A JP63283072 A JP 63283072A JP 28307288 A JP28307288 A JP 28307288A JP 2826114 B2 JP2826114 B2 JP 2826114B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は遺伝子工学的に種々の物質を生産する方法等
に関する。
に関する。
（従来技術） クローン化された遺伝子を動物細胞で発現させてその
機能をみる場合、その遺伝子の発現が細胞の増殖に干渉
し、形質転換細胞を得ることが困難なことがある。これ
を避けるためには、非誘導状態での発現レベルが低く、
かつ良く誘導がかかる発現系が必要である。
機能をみる場合、その遺伝子の発現が細胞の増殖に干渉
し、形質転換細胞を得ることが困難なことがある。これ
を避けるためには、非誘導状態での発現レベルが低く、
かつ良く誘導がかかる発現系が必要である。
マウス乳癌ウイルス（mouse mammary tumor virus、M
MTV）のロング・ターミナル・リピート・（long termin
al repeat、以下LTR）を用い、外来遺伝子をグルココル
チコイドで誘導的に発現させる系については知られてい
る（Nature 294 228〜232（1981））。
MTV）のロング・ターミナル・リピート・（long termin
al repeat、以下LTR）を用い、外来遺伝子をグルココル
チコイドで誘導的に発現させる系については知られてい
る（Nature 294 228〜232（1981））。
MMTVはRNAウイルスであるレトロウイルスの一種であ
り、感染細胞内ではその宿主細胞の染色体DNAに組込ま
れてDNAの形（プロウイルス）で存在している。その組
込まれた状態のDNAの両端には、それぞれU3−Ｒ−U5の
三つの領域からなっている約1.3kbpのLTRが同方向に入
っている。
り、感染細胞内ではその宿主細胞の染色体DNAに組込ま
れてDNAの形（プロウイルス）で存在している。その組
込まれた状態のDNAの両端には、それぞれU3−Ｒ−U5の
三つの領域からなっている約1.3kbpのLTRが同方向に入
っている。
LTRはプロモーターの機能と転写のターミネーターの
機能を併せもっており、そのU3中にはグルココルチコイ
ドリセプター蛋白質（GR）と結合する領域があり、これ
がRNA合成を調節している。すなわち、GRが該領域に結
合するとLTRのプロモーターが働き、RNA合成が始り、蛋
白が生成する。ところが、リセプター（GR）だけでは結
合できず、グルココルチコイドと結合した活性型GRだけ
がU3のリセプター結合部位に結合しLTRを稼動させる。
機能を併せもっており、そのU3中にはグルココルチコイ
ドリセプター蛋白質（GR）と結合する領域があり、これ
がRNA合成を調節している。すなわち、GRが該領域に結
合するとLTRのプロモーターが働き、RNA合成が始り、蛋
白が生成する。ところが、リセプター（GR）だけでは結
合できず、グルココルチコイドと結合した活性型GRだけ
がU3のリセプター結合部位に結合しLTRを稼動させる。
（発明の構成） 本発明は、MMTVのLTRと（以下単にLTRと示すことがあ
る）の下流に外来遺伝子（種々の生理活性物質生産用の
遺伝子）を繋いだプラスミド並びにLTRの下流にGR遺伝
子を繋いだプラスミドの二種を用いて動物細胞を形質転
換するか、LTRの下流にグルココルチコイド・リセプタ
ー蛋白質遺伝子を有し、さらに別のLTRとその下流に生
理活性物質生産用遺伝子を有するプラスミドで動物細胞
を形質転換させて生理活性物質生産用感染細胞を製造す
る方法を提供することを目的とし、また、LTRとその下
流に外来遺伝子を有し、さらにLTRとその下流にGR遺伝
子を有する染色体を持った動物細胞の培養をおこない、
その際グルココルチコイドによる制御（誘導）を行なっ
て生理活性物質を効率よく生産するスーパーインダクシ
ョン法を提供することを目的とするものである。本発明
はさらに上記の方法に有用なプラスミド類および動物細
胞を提供することを目的とする。
る）の下流に外来遺伝子（種々の生理活性物質生産用の
遺伝子）を繋いだプラスミド並びにLTRの下流にGR遺伝
子を繋いだプラスミドの二種を用いて動物細胞を形質転
換するか、LTRの下流にグルココルチコイド・リセプタ
ー蛋白質遺伝子を有し、さらに別のLTRとその下流に生
理活性物質生産用遺伝子を有するプラスミドで動物細胞
を形質転換させて生理活性物質生産用感染細胞を製造す
る方法を提供することを目的とし、また、LTRとその下
流に外来遺伝子を有し、さらにLTRとその下流にGR遺伝
子を有する染色体を持った動物細胞の培養をおこない、
その際グルココルチコイドによる制御（誘導）を行なっ
て生理活性物質を効率よく生産するスーパーインダクシ
ョン法を提供することを目的とするものである。本発明
はさらに上記の方法に有用なプラスミド類および動物細
胞を提供することを目的とする。
本発明者はグルココルチコイドの一種であるデキサメ
サゾンで誘導のかかるMMTVのLTRの下流に、グルココル
チコイド・リセプターの遺伝子（K.R.Yamamoto博士より
分与されたラット・グルココルチコイド・リセプター遺
伝子、（Cell 46 389〜399（1986）参照）を繋いだプラ
スミド（pMMGR）と、大腸菌β−gal遺伝子を繋いだプラ
スミド（pMMgal）の二種のプラスミドを構築した。この
二種のプラスミドを哺乳動物の培養細胞の一種であるマ
ウスLtk-にトランスフェクトし、β−galの一時的発現
を調べたところ、pMMgalだけを移入したものと比べて、
デキサメサゾン非存在下で同程度に低く、デキサメサゾ
ン存在下で100倍以上高く発現していることを認めた。
サゾンで誘導のかかるMMTVのLTRの下流に、グルココル
チコイド・リセプターの遺伝子（K.R.Yamamoto博士より
分与されたラット・グルココルチコイド・リセプター遺
伝子、（Cell 46 389〜399（1986）参照）を繋いだプラ
スミド（pMMGR）と、大腸菌β−gal遺伝子を繋いだプラ
スミド（pMMgal）の二種のプラスミドを構築した。この
二種のプラスミドを哺乳動物の培養細胞の一種であるマ
ウスLtk-にトランスフェクトし、β−galの一時的発現
を調べたところ、pMMgalだけを移入したものと比べて、
デキサメサゾン非存在下で同程度に低く、デキサメサゾ
ン存在下で100倍以上高く発現していることを認めた。
また、β−gal遺伝子の代わりにインターフェロンα
遺伝子を組込んだプラスミド（pMMifα）を用い、一時
的発現でなく安定に遺伝子を組込ませた系としても発現
を確かめて本発明を完成した。
遺伝子を組込んだプラスミド（pMMifα）を用い、一時
的発現でなく安定に遺伝子を組込ませた系としても発現
を確かめて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、 （１）マウス乳癌ウイルス（MMTV）のロング・ターミ
ナル・リピート（LTR）の下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で動物細胞を形質転換させることを特徴とする生理活性
物質生産用細胞の製造法 （２）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で形質転換させることを特徴とする生理活性物質生産用
細胞の製造法 （３）MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド・リセ
プター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で形質転換された動物細胞 （４）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で形質転換された動物細胞 （５）染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞 （６）MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド・リセ
プター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法 （７）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法 （８）染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞を増殖させて生理活性物質を生産させ
る方法 （９）MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド・リセ
プター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 （10）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 （11）染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞を増殖させて生理活性物質を生産させ
る方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 （12）プラスミドpMMGRおよびプラスミドpMMifα （13）大腸菌（E.coli）MMGR（FERM BP−2052）および
大腸菌（E.coli）MMifα（FERM BP−2053）に関する。
ナル・リピート（LTR）の下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で動物細胞を形質転換させることを特徴とする生理活性
物質生産用細胞の製造法 （２）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で形質転換させることを特徴とする生理活性物質生産用
細胞の製造法 （３）MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド・リセ
プター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で形質転換された動物細胞 （４）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で形質転換された動物細胞 （５）染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞 （６）MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド・リセ
プター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法 （７）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法 （８）染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞を増殖させて生理活性物質を生産させ
る方法 （９）MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド・リセ
プター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 （10）MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・
リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 （11）染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞を増殖させて生理活性物質を生産させ
る方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 （12）プラスミドpMMGRおよびプラスミドpMMifα （13）大腸菌（E.coli）MMGR（FERM BP−2052）および
大腸菌（E.coli）MMifα（FERM BP−2053）に関する。
本発明で生産する遺伝子産物とは種々の生理活性物
質、例えばリンホカイン類、ホルモン類、抗原蛋白質、
tPA類等のペプチド、糖ペプチドなどがあり、それらの
遺伝子は良く知られた方法および今後知られる方法で入
手し利用できる。
質、例えばリンホカイン類、ホルモン類、抗原蛋白質、
tPA類等のペプチド、糖ペプチドなどがあり、それらの
遺伝子は良く知られた方法および今後知られる方法で入
手し利用できる。
MMTVのLTRについては既に知られており多くの研究者
が実験に用いている（J.Virol.37 226〜238（1981）、N
atuire 294 228〜232（1981）等）。
が実験に用いている（J.Virol.37 226〜238（1981）、N
atuire 294 228〜232（1981）等）。
グルココルチコイドリセプター蛋白質およびそれをコ
ードする遺伝子についても良く知られている（Cell 46
389〜399（1986）等）。
ードする遺伝子についても良く知られている（Cell 46
389〜399（1986）等）。
本発明で用いるプラスミドの構築は、通常の方法で行
えばよく、二種のプラスミドを利用する方法の一例を後
に示す。
えばよく、二種のプラスミドを利用する方法の一例を後
に示す。
誘導プラスミド（LTR−GR遺伝子を有す）と生産用プ
ラスミド（LTR−目的物遺伝子を有す）で細胞をトラン
スフェクトするとその細胞の染色体にLTR−GR遺伝子とL
TR−目的物遺伝子が組込まれる。二種のプラスミドは同
時にトランスフェクトしてもよいし、別々に用いてトラ
ンスフェクトしてもよい。勿論、上記の二種の遺伝子を
一つのプラスミドに組込んで形質転換を行なってもよ
い。
ラスミド（LTR−目的物遺伝子を有す）で細胞をトラン
スフェクトするとその細胞の染色体にLTR−GR遺伝子とL
TR−目的物遺伝子が組込まれる。二種のプラスミドは同
時にトランスフェクトしてもよいし、別々に用いてトラ
ンスフェクトしてもよい。勿論、上記の二種の遺伝子を
一つのプラスミドに組込んで形質転換を行なってもよ
い。
この形質転換細胞をグルココルチコイド含有培地で培
養すると、 グルココルチコイドは僅かに存在する細胞質内のリセ
プター蛋白質（GR）と結合して活性型のリセプターを生
ずる。
養すると、 グルココルチコイドは僅かに存在する細胞質内のリセ
プター蛋白質（GR）と結合して活性型のリセプターを生
ずる。
この活性型リセプターは細胞内部に入り、核に行き、
染色体上のMMTVのLTRのU3のリセプター結合部位に結合
する。
染色体上のMMTVのLTRのU3のリセプター結合部位に結合
する。
そうすると、LTRのプロモーターが働きはじめ、その
下流の遺伝子が発現してGR蛋白質が生産される（目的の
蛋白質）も僅かに生産される）。
下流の遺伝子が発現してGR蛋白質が生産される（目的の
蛋白質）も僅かに生産される）。
生産されたGR蛋白質はグルココルチコイドと結合して
更に活性型リセプターを形成し、〜が繰返されてGR
蛋白質が系内により多く生産され、これが目的の蛋白質
も大量に生産することになる。
更に活性型リセプターを形成し、〜が繰返されてGR
蛋白質が系内により多く生産され、これが目的の蛋白質
も大量に生産することになる。
プラスミドによる細胞のトランスフェクトはリン酸カ
ルシウム法等の一般的方法で行えばよく、二種のプラス
ミドを用いるときはGR遺伝子含有プラスミドと物質生産
用プラスミドは通常は１対１乃至10モル程度で使用する
のが適当である。
ルシウム法等の一般的方法で行えばよく、二種のプラス
ミドを用いるときはGR遺伝子含有プラスミドと物質生産
用プラスミドは通常は１対１乃至10モル程度で使用する
のが適当である。
細胞としては、種々の目的で作られ入手し得る各種の
培養細胞を用いればよく、例えば、BHK 21（ベイビーハ
ムスター腎由来フィブロブラスト様株細胞）、CV−１
（サル腎由来フィブロブラスト様株細胞）、HeLa tk
-（ヒト子宮頚癌由来株細胞）等がある。細胞の培養も
それぞれの細胞について知られた培地および方法で行え
ばよい。
培養細胞を用いればよく、例えば、BHK 21（ベイビーハ
ムスター腎由来フィブロブラスト様株細胞）、CV−１
（サル腎由来フィブロブラスト様株細胞）、HeLa tk
-（ヒト子宮頚癌由来株細胞）等がある。細胞の培養も
それぞれの細胞について知られた培地および方法で行え
ばよい。
目的の遺伝子等が組込まれた細胞を選択するには、こ
の分野で利用されている一般的な選択方法でよいが、例
えば次の様なものがある。抗生物質不活化酵素遺伝子を
SV40のプロモーターの下流に繋いだプラスミドをセレク
ションマーカーとして目的のプラスミドと混合してトラ
ンスフェクトし、該抗生物質含有培地で耐性株を選択す
ると、プラスミドが染色体が組込まれている株が得られ
る。勿論、目的のプラスミドのどちらかにセレクション
用の遺伝子を入れることによって選択しても良い。
の分野で利用されている一般的な選択方法でよいが、例
えば次の様なものがある。抗生物質不活化酵素遺伝子を
SV40のプロモーターの下流に繋いだプラスミドをセレク
ションマーカーとして目的のプラスミドと混合してトラ
ンスフェクトし、該抗生物質含有培地で耐性株を選択す
ると、プラスミドが染色体が組込まれている株が得られ
る。勿論、目的のプラスミドのどちらかにセレクション
用の遺伝子を入れることによって選択しても良い。
誘導に使用するグルココルチコイドとしては、デキサ
メサゾン、コルチゾン類、ヒドロコルチゾン類、テヒド
ロコルチゾン類など文献上公知のもの等を適宜選択すれ
ばよい。
メサゾン、コルチゾン類、ヒドロコルチゾン類、テヒド
ロコルチゾン類など文献上公知のもの等を適宜選択すれ
ばよい。
実施例1:発現用ベクターpMMExの構築 プラスミド Ki−MSVクローン４（N.Tsuchida et al.
J.Virol. 38 720（1981））をSma Iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動でプロモーターを含む約0.6kbpのフラグ
メントを分離した。これをSma Iで切断したpCU9（ファ
ルマシア社）とT4リガーゼを用いて、結合させ、生じた
組換えプラスミドで大腸菌HB101を形質転換した。得ら
れたプラスミドをpki−LTRとした。
J.Virol. 38 720（1981））をSma Iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動でプロモーターを含む約0.6kbpのフラグ
メントを分離した。これをSma Iで切断したpCU9（ファ
ルマシア社）とT4リガーゼを用いて、結合させ、生じた
組換えプラスミドで大腸菌HB101を形質転換した。得ら
れたプラスミドをpki−LTRとした。
pki−LTRをSma Iで切断し、５′末端をリン酸化したH
ind IIIリンカーをT4リガーゼで結合後Hind IIIで切断
した。アガロースゲル電気泳動で、U3（プロモーター）
を含むフラグメントを分離し、Hind IIIで切断したpUC9
とT4リガーゼで結合させた。大腸菌HB101を形質転換し
てプラスミドを得た。このプラスミドをAva I及びEcoR
Iで切断したものと、pki−LTRをAva I及びHea IIIで切
断しEcoR Iリンカーを付加後EcoR Iで切断することによ
ってHea III未満（平滑末端）をEcoR I末端に変えたポ
リＡ付加領域（U5）を含む約0.25kbpのフラグメントをT
4リガーゼで結合させた。このもので大腸菌HB101を形質
転換し、プラスミドpKIExを得た。
ind IIIリンカーをT4リガーゼで結合後Hind IIIで切断
した。アガロースゲル電気泳動で、U3（プロモーター）
を含むフラグメントを分離し、Hind IIIで切断したpUC9
とT4リガーゼで結合させた。大腸菌HB101を形質転換し
てプラスミドを得た。このプラスミドをAva I及びEcoR
Iで切断したものと、pki−LTRをAva I及びHea IIIで切
断しEcoR Iリンカーを付加後EcoR Iで切断することによ
ってHea III未満（平滑末端）をEcoR I末端に変えたポ
リＡ付加領域（U5）を含む約0.25kbpのフラグメントをT
4リガーゼで結合させた。このもので大腸菌HB101を形質
転換し、プラスミドpKIExを得た。
pMDSG（F.Lee et al.Nature 294 228 （1981）をHind
IIIで切断後、アガロースゲル電気泳動でMMTVのプロモ
ーターを含む約1.4kbpのフラグメントを分離した。これ
と、pKIExをHind IIIで切断しpki−LTR由来のプロモー
ターを取除いた大きい方のフラグメントとをT4ガーゼで
結合した。生じた組換プラスミドで大腸菌HB101を形質
転換し、正しい方向にMMTVプロモーターフラグメントの
挿入されたプラスミドpMMExを得た。
IIIで切断後、アガロースゲル電気泳動でMMTVのプロモ
ーターを含む約1.4kbpのフラグメントを分離した。これ
と、pKIExをHind IIIで切断しpki−LTR由来のプロモー
ターを取除いた大きい方のフラグメントとをT4ガーゼで
結合した。生じた組換プラスミドで大腸菌HB101を形質
転換し、正しい方向にMMTVプロモーターフラグメントの
挿入されたプラスミドpMMExを得た。
実施例2:発現ベクターpMMGR及びpMMifαの構築 pRBal 117（R.Miesfeid et al. Cell46389（198
6）をBamH Iで切断し、アガロースゲル電気泳動で、ラ
ットグルココチコイドリセプター遺伝子を含む約2.8kbp
のフラグメントを分離した。これと、BamH Iで切断した
pMMExとをT4リガーゼで結合し、大腸菌HB101を形質転換
し、正しい方向にリセプター遺伝子の挿入されたプラス
ミドpMMGRを得た。このプラスミドを有するE.coli MMG
Rの微生物工業技術研究所の受託番号はFERM BP−2052
である。
6）をBamH Iで切断し、アガロースゲル電気泳動で、ラ
ットグルココチコイドリセプター遺伝子を含む約2.8kbp
のフラグメントを分離した。これと、BamH Iで切断した
pMMExとをT4リガーゼで結合し、大腸菌HB101を形質転換
し、正しい方向にリセプター遺伝子の挿入されたプラス
ミドpMMGRを得た。このプラスミドを有するE.coli MMG
Rの微生物工業技術研究所の受託番号はFERM BP−2052
である。
インターフェロンα遺伝子（if α）を含有するプラ
スミドpBP011をNco I及びXba Iで切断し、0.5kbpのifα
遺伝子を含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
分離した。これをdNTPs存在下DNAポリメラーゼＩクレノ
ーフラグメントによって平滑末端とした後、Hinc IIで
切断したpMMExと結合し、正しい方向に遺伝子の挿入さ
れたプラスミドpMMifαを得た。このプラスミドを有す
るE.coli MMifαの微生物工業技術研究所の受託番号は
EEVM BP−2053である。
スミドpBP011をNco I及びXba Iで切断し、0.5kbpのifα
遺伝子を含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
分離した。これをdNTPs存在下DNAポリメラーゼＩクレノ
ーフラグメントによって平滑末端とした後、Hinc IIで
切断したpMMExと結合し、正しい方向に遺伝子の挿入さ
れたプラスミドpMMifαを得た。このプラスミドを有す
るE.coli MMifαの微生物工業技術研究所の受託番号は
EEVM BP−2053である。
実施例3:L細胞でのインターフェロンαの発現 マウス線維芽細胞様株であるLtk-細胞を、MEM（Eeagl
e′ｓ Minimum Essential Medium）に10％FCS（牛胎
児血清）を添加した培地でほぼ１×106/シャーレにまで
生育させ、トランスフェクションの４時間前に新鮮な培
地で更新しておく。
e′ｓ Minimum Essential Medium）に10％FCS（牛胎
児血清）を添加した培地でほぼ１×106/シャーレにまで
生育させ、トランスフェクションの４時間前に新鮮な培
地で更新しておく。
（モル比） pSV2neo（ATCC 37149） 0.5μｇ（ 1） pMMGR 33 μｇ（50） pMMif α ５ μｇ（10） 上記３種のプラスミドの混合液を作り（pSV2neoはセ
レクションマーカーのネオマイシン不活化酵素遺伝子含
有プラスミド。ATCCより入手）、これにキャリアDNA
（牛胸線DNA）11.5μｇを加える。全量が2.2mlになるよ
うに水を加えた後、2M塩化カルシウム液300μｌを加
え、Ｉ液とする。II液の組成は次の通りである。
レクションマーカーのネオマイシン不活化酵素遺伝子含
有プラスミド。ATCCより入手）、これにキャリアDNA
（牛胸線DNA）11.5μｇを加える。全量が2.2mlになるよ
うに水を加えた後、2M塩化カルシウム液300μｌを加
え、Ｉ液とする。II液の組成は次の通りである。
２×HBS（HEPES 10g/塩化ナトリウム16g/） 2ml 100×リン酸緩衝液（70mM Na2HPO4−70mM NaH2P
O4） 50μｌ Ｉ液とII液をゆっくり混合し懸濁液とする。30分放置し
た後、その1mlを取り、上記Ltk-細胞の生育しているシ
ャーレに加える。
O4） 50μｌ Ｉ液とII液をゆっくり混合し懸濁液とする。30分放置し
た後、その1mlを取り、上記Ltk-細胞の生育しているシ
ャーレに加える。
12時間後、培地を更新し、更に２日後より0.4g（力
価）／のネオマイシン類似抗生物質G418（ギブコ社）
を含む培地で、３〜４日毎に培地を更新しながら培養し
た。DNA導入２週間後に生じてきたコロニーを取り、96
穴マイクロウエルプレートに移したウエル中の細胞がほ
ぼいっぱい（コンフルエント）になった時、11×10-6M
デキサメサゾンを含む培地と更新し、その２日後インタ
ーフェロン活性を測定した。この中から活性の高い６ク
ローンを選択した。これらのクローンを35mmシャーレに
移し、ほぼいっぱいに生育させた後、新たに２枚の35mm
シャーレでほぼいっぱいに生育させた。そのうち１枚に
１×10-6Mデキサメサゾンを加えた。添加48時間後、デ
キサメサゾン添加・非添加の両者より培地中のインター
フェロン活性を測定した。
価）／のネオマイシン類似抗生物質G418（ギブコ社）
を含む培地で、３〜４日毎に培地を更新しながら培養し
た。DNA導入２週間後に生じてきたコロニーを取り、96
穴マイクロウエルプレートに移したウエル中の細胞がほ
ぼいっぱい（コンフルエント）になった時、11×10-6M
デキサメサゾンを含む培地と更新し、その２日後インタ
ーフェロン活性を測定した。この中から活性の高い６ク
ローンを選択した。これらのクローンを35mmシャーレに
移し、ほぼいっぱいに生育させた後、新たに２枚の35mm
シャーレでほぼいっぱいに生育させた。そのうち１枚に
１×10-6Mデキサメサゾンを加えた。添加48時間後、デ
キサメサゾン添加・非添加の両者より培地中のインター
フェロン活性を測定した。
51個のクローンのうち×104U/ml以上のものが５株
で、約1/5の頻度であった。最も頻度の高かったのは103
〜５×103U/mlの間であった（25クローン）。104U/mlを
越えたクローンについて、デキサメサゾンの存在下（＋
dex）と非存在下（−dex）で測定した数値を表に示す。
で、約1/5の頻度であった。最も頻度の高かったのは103
〜５×103U/mlの間であった（25クローン）。104U/mlを
越えたクローンについて、デキサメサゾンの存在下（＋
dex）と非存在下（−dex）で測定した数値を表に示す。
なお、クローンLif10とLif41の染色体DNAを取り、Bam
HIやBamHI＋PstI,EcoRIで切断後アガロースゲル電気泳
動を行ない、ニトロセルロースにブロッティングして、
ハイブリダイゼーションを行ない、染色体中に挿入され
ているコピー数を調べたところ、クローンのGR遺伝子お
よびインターフェロンα遺伝子共に約100コピーであっ
た。
HIやBamHI＋PstI,EcoRIで切断後アガロースゲル電気泳
動を行ない、ニトロセルロースにブロッティングして、
ハイブリダイゼーションを行ない、染色体中に挿入され
ているコピー数を調べたところ、クローンのGR遺伝子お
よびインターフェロンα遺伝子共に約100コピーであっ
た。
本発明のスーパーインダクション法の利点を次に挙げ
る。
る。
（ｉ） 誘導をかけない状態での発現量が極めて低い、
これは、その物質が細胞にとって毒となるような場合に
有利な性質である。従来の高発現系のように、持続的に
産生する系では、細胞に遺伝子を移入すると、この物質
が発現して細胞が増殖できなくなったり死んでしまい、
細胞をクローニングしてくることができない。ところ
が、スーパーインダクションの系では、誘導をかけなけ
れば発現レベルが極めて低いので、細胞にダメージを与
えないでクローニングし、大量培養を行なった後に誘導
をかけることができる。従って大量に目的物質を生産す
るのに適している。
これは、その物質が細胞にとって毒となるような場合に
有利な性質である。従来の高発現系のように、持続的に
産生する系では、細胞に遺伝子を移入すると、この物質
が発現して細胞が増殖できなくなったり死んでしまい、
細胞をクローニングしてくることができない。ところ
が、スーパーインダクションの系では、誘導をかけなけ
れば発現レベルが極めて低いので、細胞にダメージを与
えないでクローニングし、大量培養を行なった後に誘導
をかけることができる。従って大量に目的物質を生産す
るのに適している。
（ii）誘導比が一万倍以上のクローンを得ることができ
る。従来誘導のかかる遺伝越発現系で最高なのは、おそ
らくMMTVで、細胞クローンによっては1000倍近くmRNAの
レベルで誘導のかかるものがある。ただし、これはウイ
ルスとして組込ませた場合でMMTVの下流にマーカー遺伝
子を繋ぎ細胞にトランスフェクトした場合には、細胞に
もよるが高々数十倍程度である。本発明のスーパーイン
ダクションの系ではMMTVの下流に目的の遺伝子をつない
トランスフェクトするのであるから後者と同じである
が、非常に高く誘導をかけることが可能である。誘導率
が高ければマキシマムレベルも高く、大量生産に有利で
ある
る。従来誘導のかかる遺伝越発現系で最高なのは、おそ
らくMMTVで、細胞クローンによっては1000倍近くmRNAの
レベルで誘導のかかるものがある。ただし、これはウイ
ルスとして組込ませた場合でMMTVの下流にマーカー遺伝
子を繋ぎ細胞にトランスフェクトした場合には、細胞に
もよるが高々数十倍程度である。本発明のスーパーイン
ダクションの系ではMMTVの下流に目的の遺伝子をつない
トランスフェクトするのであるから後者と同じである
が、非常に高く誘導をかけることが可能である。誘導率
が高ければマキシマムレベルも高く、大量生産に有利で
ある
第１図および第２図はプラスミド構築の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/85 C12P 21/00 C12N 5/06 C12N 1/21 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】マウス乳癌ウイルス（MMTV）のロング・
ターミナル・リピート（LTR）の下流にグルココルチコ
イド・リセプター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、お
よび MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミドで動物細胞を形質転換させることを特徴と
する生理活性物質生産用細胞の製造法 - 【請求項２】MMTVのLTRとその下流にグルココルチコ
イド・リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で形質転換させることを特徴とする生理活性物質生産用
細胞の製造法 - 【請求項３】MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド
・リセプター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミドで形質転換された動物細胞 - 【請求項４】MMTVのLTRとその下流にグルココルチコ
イド・リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で形質転換された動物細胞 - 【請求項５】染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流の生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞 - 【請求項６】MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド
・リセプター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミドで動物細胞を形質転換させ、得られた形質
転換細胞を増殖させて生理活性物質を生産させる方法 - 【請求項７】MMTVのLTRとその下流にグルココルチコ
イド・リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法 - 【請求項８】染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞を増殖させて生理活性物質を生産させ
る方法 - 【請求項９】MMTVのLTRの下流にグルココルチコイド
・リセプター蛋白質遺伝子を有するプラスミド、および MMTVのLTRの下流に生理活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミドで動物細胞を形質転換させ、得られた形質
転換細胞を増殖させて生理活性物質を生産させる方法に
おいて、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 - 【請求項１０】MMTVのLTRとその下流にグルココルチ
コイド・リセプター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有するプラスミド で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転換細胞を増
殖させて生理活性物質を生産させる方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 - 【請求項１１】染色体上に、 MMTVのLTRとその下流にグルココルチコイド・リセプ
ター蛋白質遺伝子を有し、更に 別のMMTVのLTRとその下流に生理活性物質生産用遺伝
子 を有する動物細胞を増殖させて生理活性物質を生産させ
る方法において、 培地中のグルココルチコイドの量によりmRNAへの転写の
調節を行うことを特徴とする遺伝子産物の生産法 - 【請求項１２】大腸菌（E.coli）MMGR（FERM BP−205
2）に含有されるプラスミドで、図面第１図と第２図で
示されるプラスミドpMMGRおよび大腸菌（E.coli）MMif
α（FERM BP−2053）に含有されるプラスミドで、図面
第１図と第２図で示されるプラスミドpMMifα - 【請求項１３】大腸菌（E.coli）MMGR（FERM BP−205
2）および大腸菌（E.coli）MMifα（FERM BP−2053）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63283072A JP2826114B2 (ja) | 1987-11-09 | 1988-11-09 | 遺伝子産物の製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-282893 | 1987-11-09 | ||
| JP28289387 | 1987-11-09 | ||
| JP63283072A JP2826114B2 (ja) | 1987-11-09 | 1988-11-09 | 遺伝子産物の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02466A JPH02466A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2826114B2 true JP2826114B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=26554824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63283072A Expired - Fee Related JP2826114B2 (ja) | 1987-11-09 | 1988-11-09 | 遺伝子産物の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2826114B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005179801A (ja) | 2003-12-17 | 2005-07-07 | Hideyuki Hayashi | タフティングマシンの給糸装置 |
-
1988
- 1988-11-09 JP JP63283072A patent/JP2826114B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02466A (ja) | 1990-01-05 |
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|---|---|---|---|
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