JPH02466A - 遺伝子産物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用上１ 本発明は遺伝子工学的に種々の物質を生産する方法等に
関する。

（従来技術） クローン化された遺伝子を動物細胞で発現させてその機
能をみる場合、その遺伝子の発現が細胞の増殖に干渉し
、形質転換細胞を得ることが困難なことがある。これを
避けるためには、非誘導状態での発現レベルが低く、か
つ良く誘導がかかる発現系が必要である。

マウス乳癌ウィルス　（ｍｏｕｓｅ　ｍａｍｍａｒｙ　
ｔｕｍｏｒｖｉｒｕｓ　、　ＭＭＴＶ）のロング・ター
ミナル・リピート（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅ
ｐｅａｔ　、以下ＬＴＲ）を用い、外来遺伝子をグルコ
コルチコイドで誘導的に発現させる系については知られ
ている（　ＮａＬｕｒ＝。

２９４　２２８〜２３２　（１９８１））。

ＭＭＴＶはＲＮＡウィルスであるレトロウィルスの一種
であり、感染細胞内ではその宿主細胞の染色体ＤＮＡに
組込まれてＤＮＡの形（プロウィルス）で存在している
。その組込まれた状態のＤＮＡの両端には、それぞれ１
１３−　Ｒ−１１５の三つの領域からなっている約１．
３ｋｂｐのＬＴＲが同方向に入っている。

ＬＴＲはプロモーターの機能と転写のターミネータ−の
機能を併せもっており、そのＵ３中にはグルココルチコ
イドリセブター蛋白（ＧＲ）と結合する領域があり、こ
れがＲＮＡ合成を調節している。すなわち、ＯＲが該領
域に結合するとＬＴＲのプロモーターが働き、ＲＮＡ合
成が始り、蛋白が生成する。ところが、リセブタ−（Ｇ
Ｒ）だけでは結合できず、グルココルチコイドと結合し
た活性型ＧＲだけがＵ３のりセブター結合部位に結合し
ＬＴＲを稼動させる。

（発明の構成） 本発明は、ＭＭＴＶ（Ｆ）ＬＴＲ（以下車にＬＴＲと示
すことがある）の下流に外来遺伝子（種々の活性物質生
産用の遺伝子）を繋いだプラスミド並びにＬＴＲの下流
にＧＲ遺伝子を繋いだプラスミドの二種を用いて動物細
胞を形質転換するか、ＬＴＲの下流にグルココルチコイ
ド・リセプター蛋白遺伝子を有し、さらにＬＴＲとその
下流に活性物質生産用遺伝子を有するプラスミドで動物
細胞を形質転換させて活性物質生産用感染細胞を製造す
る方法を提供することを目的とし、また、ＬＴＲとその
下流に外来遺伝子を有し、さらにＬＴＲとその下流にＧ
Ｒ遺伝子を有する染色体を持った動物細胞の培養をおこ
ない、その際グルココルチコイドによる制御（誘導）を
行なって活性物質を効率よく生産するスーパーインダク
ション法を提供することを目的とするものである。本発
明はさらに上記の方法に有用なプラスミド類および動物
細胞を提供することを目的とする。

本発明者はグルココルチコイドの一種であるデキサメサ
ゾンで誘導のかかるＭ　Ｍ　Ｔ　ＶのＬＴＲの下流に、
グルココルチコイド・リセプターの遺伝子（に、Ｒ，ｖ
ａｍａｍｏｔｏ博士より分与されたラット・グルココル
チコイド・リセプター遺伝子、（Ｃｅｌｌ　４６３８９
〜３９９　（１９８Ｂ）参照）を繋いだプラスミド（ｐ
ＭＭＧｌｌ）　　と、大腸菌β−ｇａ１遺伝子を繋いだ
プラスミド（ｐＭＭｇａｌ）の二種のプラスミドを構築
した。この二種のプラスミドを哺乳動物の培養細胞の一
種であるマウスＬｔ、に’″にトランスフェクトし、β
−ｇａｌの一時的発現を調べたところ、ｐＭＭｇａｌだ
けを移入したものと比べて、デキサメサゾン非存在下で
同程度に低く、デキサメサゾン存在下で１００倍以上高
く発現していることを認めた。

また、β−ｇａｌ遺伝子の代わりにインターフェロンα
遺伝子を組込んだプラスミド（ｐＭＭｉｆα）を用い、
−時的発現でなく安定に遺伝子を組込ませた系としても
発現を確かめて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、 （１）マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）のロングターミ
ナルリピート（ＬＴＲ）の下流にグルココルチコイドリ
セブター蛋白遺伝子を有するプラスミド （２）ＬＴＲの下流にグルココルチコイドリセブター蛋
白遺伝子を有し、さらにＬＴＲとその下流に活性物質生
産用遺伝子を有するプラスミド（３）ＬＴＲの下流にグ
ルココルチコイドリセブター蛋白遺伝子を有するプラス
ミド並びにＬＴＲの下流に活性物質生産用遺伝子を有す
るプラスミドで動物細胞を形質転換させて活性物質生産
用細胞を製する方法 （４）ＬＴＲの下流にグルココルチコイドリセブター蛋
白遺伝子を有し、さらにＬＴＲとその下流に活性物質生
産用遺伝子を有するプラスミドで動物細胞を形質転換さ
せて活性物質生産用細胞を製造する方法 （５）ＬＴＲの下流にグルココルチコイドリセブター蛋
白遺伝子を有するプラスミド並びにＬＴＲの下流に活性
物質生産用遺伝子を有するプラスミドで形質転換された
動物細胞 （６）染色体上に、ＬＴＲおよびその下流にグルココル
チコイドリセブター蛋白遺伝子を有し、さらにＬＴＲお
よびその下流に活性物質生産用遺伝子を有する動物細胞 （７）ＬＴＲの下流にグルココルチコイドリセブター蛋
白遺伝子を有し、さらにＬＴＲとその下流に活性物質生
産用遺伝子を有するプラスミドで形質転換された動物細
胞 （８）ＬＴＲの下流にグルココルチコイドリセブター蛋
白遺伝子を有するプラスミド並びにＬＴＲの下流に活性
物質生産用遺伝子を有するプラスミドで動物細胞を形質
転換させ、得られた形質転換細胞を増殖させて活性物質
を生産させる方法において、培地中のグルココルチコイ
ドの量によりａ＋ＲＮ＾への転写の調節を行なう遺伝子
産物の生産法（９）染色体上に、ＬＴＲおよびその下流
にグルココルチコイドリセブター蛋白遺伝子を有し、さ
らにＬＴＲおよびその下流に活性物質生産用遺伝子を有
する動物細胞を増殖させて活性物質を生産させる方法に
おいて、培地中のグルココルチコイドの量によりｍＲＮ
Ａへの転写の調節を行なうことを特徴とする遺伝子産物
の生産法に関する。

本発明で生産する遺伝子産物とは種々の生理活性物質、
例えばリンホカイン類、ホルモン類、抗原蛋白類、ｔＰ
Ａ類等のペプチド、糖ペプチドなどがあり、それらの遺
伝子は良く知られた方法および今後知られる方法で人手
し利用できる。

ＭＭＴＶのＬＴＲについては既に知られており多くの研
究者が実験に用いている　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３７２
２６〜２３８　（１９８１）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９４
２２８〜２３２　（１９８１）等）。

グルココルチコイドリセプター蛋白およびそれをコード
する遺伝子についても良く知られている（Ｃｅｌｌ　４
６３８９〜３９９　（１９８６）等）。

本発明で用いるプラスミドの構築は、通常の方法で行え
ばよく、二種のプラスミドを利用する方法の一例を後に
示す。

誘導プラスミド（ＬＴＲ−ＧＲ遺伝子を有す）と生産用
プラスミド（ＬＴＲ−目的物遺伝子を有す）で細胞をト
ランスフェクトするとその細胞の染色体にＬＴＲ−ＧＲ
遺伝子とＬＴＲ−目的物遺伝子が組込まれる。二種のプ
ラスミドは同時にトランスフェクトしてもよいし、別々
に用いてトランスフェクトしてもよい、勿論、上記の二
種の遺伝子を一つのプラスミドに組込んで形質転換を行
なってもよい。

この形質転換細胞をグルココルチコイド含有培地で培養
すると、 ■グルココルチコイドは僅かに存在する細胞質内のりセ
ブター蛋白（ＧＲ）と結合して活性型のりセブターを生
ずる。

■この活性型リセブターは細胞内部に入り、核に行き、
染色体上のＭＭＴＶのＬＴＲのｕ３のリセブター結合部
位に結合する。

■そうすると、ＬＴＲのプロモーターが働きはじめ、そ
の下流の遺伝子が発現してＧＲ蛋白が生産される（目的
の蛋白も僅かに生産される）。

■生産されたＧＲ蛋白はグルココルチコイドと結合して
更に活性型リセブターを形成し、■〜■が繰返されてＧ
Ｒ蛋白が系内により多く産生され、これが目的蛋白も大
量に生産することになる。

プラスミドによる細胞のトランスフェクトはリン酸カル
シウム法等の一般的方法で行えばよく、二種のプラスミ
ドを用いるときはＧＲ遺伝子含有プラスミドと物質生産
用プラスミドはｉｆｆ！常は１対１乃至１０モル程度で
使用するのが適当である。

細胞としては、種々の目的で作られ入手し得る各種の培
養細胞を用いればよく、例えば、ＢＨに２１（ベイビー
ハムスター腎由来フィブロブラスト様株細胞）、ＣＶ−
１（サル腎由来フィブロブラスト様株細胞）、ＨｅＬａ
　ｔＰ（ヒト子宮頚癌由来株細胞）等がある。ｍ胞の培
養もそれぞれの細胞について知られた培地および方法で
行えばよい。

目的の遺伝子等が組込まれた細胞を選択するには、この
分野で利用されている一般的な選択方法でよいが、例え
ば次の様なものがある。抗生物質不活化酵素遺伝子をＳ
Ｖ４０のプロモーターの下流に繋いだプラスミドをセレ
クションマーカーとして目的のプラスミドと混合してト
ランスフエフ１へし、該抗生物質含有培地で耐性株を選
択すると、プラスミドが染色体に組込まれている株が得
られる。勿論、目的のプラスミドのどちらかにセレクシ
ョン用の遺伝子を入れることによって選択しても良い。

誘導に使用するグルココルチコイドとしては、デキサメ
サゾン、コルチゾン類、ヒドロコルチゾン類、デヒドロ
コルチゾン類など文献上公知のもの等を適宜選択すれば
よい。

実施例１：発現用ベクターｐＭＭＥＸの構築プラスミド
に１−Ｍ５Ｖクローン４　（Ｎ、Ｔｓｕｃｈｉｄａ　ｅ
Ｌａｌ、　Ｊ、νｔｒｏｔ、　３８７２０（１９８１）
）を５ａＩａ　ｒで切断し、アガロースゲル電気泳動で
プロモーターを含む約ｏ、ｉｂｐのフラグメントを分離
した。これをＳｍａ　Ｉで切断したｐｌＪｃ！ｌ　（フ
ァルマシア社）とＴ４リガーゼを用いて結合させ、生じ
た組換えプラスミドで大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した
。得られたプラスミドをｐに１−ＬＴＲとした。

ｐＫｉ−ＬＴＲをＳｉ＋ａ　Ｉで切断し、５゛末端をリ
ン酸化した旧ｎ　ｄ　ＩＩＩリンカ−をＴ４リガーゼで
結合復旧ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断した。アガロースゲル電
気泳動で、１１３（プロモーター）を含むフラグメント
を分離し、旧口ｄＩＦＦで切断したｐｔｌｃ！ｌとＴ４
リガーゼで結合させた。これで大腸菌ＨＢＩＯＩを形質
転換してプラスミドを得た。このプラスミドを八ｖａｌ
及びＥｃｏＲＩで切断したものと、ｐＫｉ−ＬＴＲを＾
ｖａｌ及びＨａ　ｅ　ＩＩＩで切断しＥｃｏＲＩリンカ
−を付加後ＥｃｏＲＩで切断することによってＨａ　ｅ
　ＩＩＩ末８ｉ４（平滑末端）をＥｃｏＲＩ末端に変え
たポリＡ付加領域（ＵＳ）を含む約０．２５ｋｂｐのフ
ラグメントをＴ４リガーゼで結合させた。このもので大
腸菌１（Ｂｌｏｔを形質転換し、プラスミドｐＫｉＥＸ
を得た。

ｐＭＤｓＧ　　（Ｆ、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒ
ｅ　２９４２２８　（１９８１）を旧ｎ　ｄ　ＩＩＩで
切断後、アガロースゲル電気泳動でＭＭＴＶのプロモー
ターを含む約１．４ｋｌｌｌ）のフラグメントを分離し
た。これと、ｐにＩＥｘを旧ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断シｐ
Ｋｉ−ＬＴＲ由来のプロモーターを取除いた大きい方の
フラグメントとをＴ４ガーゼで結合した。生じた組換プ
ラスミドで大腸菌ＨＢ　ｌ　０１を形質転）＾し、正し
い方向にＭＭＴＶプロモーターフラグメントの挿入され
たプラスミドｐＭＭＥｘを得た。

実施例２：発現ベクターｐＭＭ（ｉＲ及びｐＭＭｉｆα
の構築 ｐＲＢａｌ　　１１７　　（Ｒ，Ｍｉｅｓｆｅｌｄ　ｅ
ｔ　ａｔ、　　Ｃｅ１ｌ　　４６　３８９（１９８６）
をＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で、ラ
ットグルココチコイドリセブター遺伝子を含む約２．８
ｋｂｐのフラグメントを分離した。これと、ＢａｍＨＩ
で切断したｐｋｌＭＥＸとをＴ４リガーゼで結合し、大
腸菌１（ＢＩＯＩを形質転換し、正しい方向にリセブタ
ー遺伝子の挿入されたプラスミドｐＭＭＧＲをｔりた。

このプラスミドを有するＥ、ｅｏｌｉ　　ＭＭＧＢの微
生物工業技術研究所の受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ−２０
５２である。

インターフェロンα遺伝子（ｉｆα）を含有するプラス
ミドｐＢＰＯ１１をＮｃｏ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで切断し
、０．５ｋｂｐのｉｆα遺伝子を含むフラグメントをア
ガロースゲル電気泳動で分葱した。これをｄＮＴＰｓ存
在下ＤＮ＾ポリメラーゼ■クレノーフラグメントによっ
て平滑末端とした後、旧ｎｃｌｌで切断したｐＭＭＥＸ
と結合し、正しい方向に遺伝子の挿入されたプラスミド
ｐＭＭｉｆαを得た。このプラスミドを有するＥ、ｃｏ
ｌｉ　　ＭＭｉｆαの微生物工業技術研究所の受託番号
はＦＥＲＭ　ＢＰ−２０５３である。

実施例３：Ｌ細胞でのインターフェロンαの発現マウス
線維芽細胞様株であるＬｔｋ−細胞を、　ＭＥＭ（Ｅｅ
ａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　
Ｍｅｄｉｕａ＋）にｌ０ｔＦｃｓ（牛胎児血清）を添加
した培地でほぼｌＸｌ０’／シヤーレにまで生育させ、
トランスフェクションの４時間前に新鮮な培地で更新し
ておく。

（モル比） ｐＭ旧ｆα　　　　　　　　　　５　　μｇ　　（１０
）上記３ｆ！のプラスミドの混合液を作り（ｐＳＶ２ｎ
ｅ。

はセレクションマーカーのネオマイシン不活化酵素遺伝
子含有プラスミド。ＡＴＣＣより人手）、これにキャリ
アＤＮＡ（牛胸腺ＤＮＡ）１１．５ｇｇを加える。

全量が２．２１になるように水を加えた後、２Ｍ塩化カ
ルシウム液３００μｍを加え、■液とする。

ＩＩ　液の組成は次の通りである。

２ｘｌｌＢＳ（ＨＥＰＥＳ　１０ｇ＃！塩化ナトリウム
１６ｇ／ρ）　２．５＋ａ１１００×リン酸Ｕ街液 （７０１１１Ｍ　ＮａＪＰＯ＜−７０１Ｍ　ＮａＨ２Ｐ
θ、）５０ｕＩＩ液とｎ液をゆっくり混合し懸濁液とす
る。３０分放置した後、その１＋＋１を取り、上記Ｌｔ
ｋ−細胞の生育しているシャーレに加える。

１２時間後、培地を更新し、更に２日後より０．４ｇ（
力価）／１のネオマイシン類似抗生物質Ｇ４１８（ギブ
コ社）を含む培地で、３〜４日毎に培地を更新しながら
培養した。　　ＤＮＡ導入２週間後に生じてきたコロニ
ーを取り、９６穴マイクロウエルプレートに移した。ウ
ェル中の細胞がほぼいっばい（コンフルエント）になっ
た時、１ｘ１０″″６Ｍデキサメサゾンを含む培地と更
新し、その２８後インターフェロン活性を測定した。こ
の中から活性の高い６クローンを選択した。これらのク
ローンを３５ｍｌ１１シヤーレに移し、はぼいっばいに
生育させた後、新たに２枚の３５ａ＋ａシヤーレでほぼ
いっばいに生育させた。そのうち１枚にＩＸ】Ｄ−”Ｍ
デキサメサゾンを加えた。添加４８時間後、デキサメサ
ゾン添加・非添加の両者より培地中のインターフェロン
活性を測定した。

５１個のクローンのうち１０’Ｕ／ａ＋１以上のものが
５株で、約１７５の頭皮であった。最も頭皮の高がった
のは１０’〜５　Ｘ　１０３Ｕ／ｍｌの間であった（２
５クローン）。１０’Ｕ／ｍｌを越えたクローンについ
て、デキサメサゾンの存在下　（＋　ｄｅｘ）と非存在
下（ｄｅｘ−）で測定した数値を表に示す。

ｔｔ　オ、）ｙｏ−ンＬｉｆｌｏとＬｉｆ４１（Ｄ染色
体ＤＮＡを取り、８ｇｍＨＩやＢａＩＩ）ＩＩ　＋　Ｐ
ｓｔｌ、ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気泳動を
行ない、ニトロセルロースにブロッティングして、パイ
プリダイゼーションを行ない、染色体中に挿入されてい
るコピー数を調べたところ、両クローンのＧＲ遺伝子お
よびインターフェロンα遺伝子共に約１００コピーであ
った。

〈２は検出限度以下である。

本発明のスーパーインダクション法の利点を次に挙げる
。

（ｉ）　　ＨＡ導をかけない状態での発現量が極めて低
い。これは、その物質が細胞にとって毒となるような場
合に有利な性質である。従来の高発現系のように、持続
的に産生ずる系では、細胞に遺伝子を６人すると、この
物質が発現してｍ胞が増殖できなくなったり死んでしま
い、細胞をクローニングしてくることができない、とこ
ろが、スーパーインダクションの系では、誘導をかけな
ければ発現レベルが極めて低いので、細胞にダメージを
与えないでクローニングし、大量培養を行なった後に誘
導をかけることができる。従って大量に目的物質を生産
するのに通している。

（ｉ　ｊ）Ｍｊ＝導比が一万倍以上のクローンを得るこ
とができる。従来誘導のかかる遺伝子発現系で最高なの
は、おそら＜ＭＭＴＶで、Ｎｉ胞クローンによっては＋
（１００倍近＜　５ＲＮＡのレベルで誘導のかかるもの
がある。ただし、これはウィルスとして組込ませた場合
でＭＭＴＶの下流にマーカー遺伝子を繋ぎ細胞にトラン
スフェクトした場合には、細胞にもよるが高々数十倍程
度である０本発明のスーパーインダクションの系ではＭ
ＭＴＶの下流に目的の遺伝子をつないトランスフェクト
するのであるから後者と同じであるが、非常に高く誘導
をかけることが可能である。誘導率が高ければマキシマ
ムレベルも高く、大量生産に有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はプラスミド構築の概略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）のロング・ター
   ミナル・リピート（ＬＴＲ）の下流にグルココルチコイ
   ド・リセプター蛋白遺伝子を有するプラスミド （２）ＭＭＴＶのＬＴＲの下流にグルココルチコイド・
   リセプター蛋白遺伝子を有し、さらにＭＭＴＶのＬＴＲ
   とその下流に活性物質生産用遺伝子を有するプラスミド （３）ＭＭＴＶのＬＴＲの下流にグルココルチコイド・
   リセプター蛋白遺伝子を有するプラスミド並びにＭＭＴ
   ＶのＬＴＲの下流に活性物質生産用遺伝子を有するプラ
   スミドで動物細胞を形質転換させることを特徴とする活
   性物質生産用細胞の製法（４）ＭＭＴＶのＬＴＲの下流
   にグルココルチコイド・リセプター蛋白遺伝子を有し、
   さらにＭＭＴＶのＬＴＲとその下流に活性物質生産用遺
   伝子を有するプラスミドで動物細胞を形質転換させるこ
   とを特徴とする活性物質生産用細胞の製造法（５）ＭＭ
   ＴＶのＬＴＲの下流にグルココルチコイド・リセプター
   蛋白遺伝子を有するプラスミド並びにＭＭＴＶのＬＴＲ
   の下流に活性物質生産用遺伝子を有するプラスミドで形
   質転換された動物細胞 （６）染色体上に、ＭＭＴＶのＬＴＲおよびその下流に
   グルココルチコイド・リセプター蛋白遺伝子を有し、さ
   らにＭＭＴＶのＬＴＲおよびその下流に活性物質生産用
   遺伝子を有する動物細胞 （７）ＭＭＴＶのＬＴＲの下流にグルココルチコイド・
   リセプター蛋白遺伝子を有し、さらにＭＭＴＶのＬＴＲ
   とその下流に活性物質生産用遺伝子を有するプラスミド
   で形質転換された動物細胞（８）ＭＭＴＶのＬＴＲの下
   流にグルココルチコイド・リセプター蛋白遺伝子を有す
   るプラスミド並びにＭＭＴＶのＬＴＲの下流に活性物質
   生産用遺伝子を有するプラスミドで動物細胞を形質転換
   させ、得られた形質転換細胞を増殖させて活性物質を生
   産させる方法において、培地中のグルココルチコイドの
   量によりｍＲＮＡへの転写の調節を行なうことを特徴と
   する遺伝子産物の生産法 （９）染色体上に、ＭＭＴＶのＬＴＲおよびその下流に
   グルココルチコイド・リセプター蛋白遺伝子を有し、さ
   らにＭＭＴＶのＬＴＲおよびその下流に活性物質生産用
   遺伝子を有する動物細胞を増殖させて活性物質を生産さ
   せる方法において、培地中のグルココルチコイドの量に
   よりｍＲＮＡへの転写の調節を行なうことを特徴とする
   遺伝子産物の生産法 （１０）プラスミドｐＭＭＧＲおよびプラスミドｐＭＭ
   ｉｆα（１１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＭＧＲ（ＦＥ
   ＲＭＢＰ−２０５２）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍ
   Ｍｉｆα（ＦＥＲＭＢＰ−２０５３）