JPH09103296A - 安定化配列を有するベクターおよび真核宿主細胞 - Google Patents
安定化配列を有するベクターおよび真核宿主細胞Info
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- JPH09103296A JPH09103296A JP8118837A JP11883796A JPH09103296A JP H09103296 A JPH09103296 A JP H09103296A JP 8118837 A JP8118837 A JP 8118837A JP 11883796 A JP11883796 A JP 11883796A JP H09103296 A JPH09103296 A JP H09103296A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 所望のタンパク質の連続的生産を可能とする
発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。 【解決手段】 プロモーターの下流、かつ所望の異種タ
ンパク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流
にある安定化配列；該安定化配列の下流に配置された、
所望の異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
ＤＮＡ；および下流側が転写終止部位となっているポリ
アデニル化配列をコードしているＤＮＡを含んでなるベ
クターを構築し、該ベクターで真核生物を形質転換す
る。
発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。 【解決手段】 プロモーターの下流、かつ所望の異種タ
ンパク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流
にある安定化配列；該安定化配列の下流に配置された、
所望の異種タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
ＤＮＡ；および下流側が転写終止部位となっているポリ
アデニル化配列をコードしているＤＮＡを含んでなるベ
クターを構築し、該ベクターで真核生物を形質転換す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、所望のタンパク質
の連続的生産を可能とする発現可能なベクターを構築す
る為の組換えＤＮＡ法の応用に関する。さらに、本発明
は、所望のタンパク質を連続的に製造するための、安定
な細胞質mＲＮＡを生成しうる発現ベクターの構築に関
する。換言すると、本発明は、所望のタンパク質をコー
ドしているＤＮＡの５'側に配置された特異的な安定化
配列を有する発現ベクターに関する。また、本発明は、
このようなベクターで真核生物細胞を形質転換し、宿主
細胞を選択し、そして、該細胞セルラインを用いて所望
のタンパク質を連続的に製造する方法に関する。
の連続的生産を可能とする発現可能なベクターを構築す
る為の組換えＤＮＡ法の応用に関する。さらに、本発明
は、所望のタンパク質を連続的に製造するための、安定
な細胞質mＲＮＡを生成しうる発現ベクターの構築に関
する。換言すると、本発明は、所望のタンパク質をコー
ドしているＤＮＡの５'側に配置された特異的な安定化
配列を有する発現ベクターに関する。また、本発明は、
このようなベクターで真核生物細胞を形質転換し、宿主
細胞を選択し、そして、該細胞セルラインを用いて所望
のタンパク質を連続的に製造する方法に関する。
【０００２】先行技術 近年、組換え法が真核生物細胞に応用されるところとな
り、特に、哺乳動物細胞が選択可能な表現型をコードし
ている異種ＤＮＡで形質転換されるようになった[ウィ
グラー等(Wigler,M.,et al.,Cell,11,223-232(197
7))]。また、真核生物細胞を形質転換して、異種ＤＮＡ
を真核生物細胞核の染色体ＤＮＡ中に組込んで含有して
いる形質転換体を得ることができることが示された。
り、特に、哺乳動物細胞が選択可能な表現型をコードし
ている異種ＤＮＡで形質転換されるようになった[ウィ
グラー等(Wigler,M.,et al.,Cell,11,223-232(197
7))]。また、真核生物細胞を形質転換して、異種ＤＮＡ
を真核生物細胞核の染色体ＤＮＡ中に組込んで含有して
いる形質転換体を得ることができることが示された。
【０００３】成功裏に行なわれた真核生物細胞培養物の
形質転換および所望のタンパク質をコードしているＤＮ
Ａ配列の発現が開示されている[たとえば、欧州特許出
願公開Ｎo.73,659および73,656]。これらの成功裏に行
なわれた形質転換は、ベクターを用いて相補ＤＮＡ(cＤ
ＮＡ)を発現させるものであり、５'コントロールシグナ
ル、たとえばエンハンサー[グルズマンおよびシェンク
編(Gluzman,Y and Shenk,T.,Enhancers and Eukaryotic
Gene Expression,Cold Spring Harbor Laboratory(198
3))]、プロモーター[ハーマー等(Hamer,D.H.,et al.,Ce
ll,21,697(1980))]および３'ポリアデニル化部位[プロ
ードフットおよびブラウンリー(Proudfoot,N.J. and Br
ownlee,G.G.,Nature,263,211(1976))]だけを必要とする
ものであった。
形質転換および所望のタンパク質をコードしているＤＮ
Ａ配列の発現が開示されている[たとえば、欧州特許出
願公開Ｎo.73,659および73,656]。これらの成功裏に行
なわれた形質転換は、ベクターを用いて相補ＤＮＡ(cＤ
ＮＡ)を発現させるものであり、５'コントロールシグナ
ル、たとえばエンハンサー[グルズマンおよびシェンク
編(Gluzman,Y and Shenk,T.,Enhancers and Eukaryotic
Gene Expression,Cold Spring Harbor Laboratory(198
3))]、プロモーター[ハーマー等(Hamer,D.H.,et al.,Ce
ll,21,697(1980))]および３'ポリアデニル化部位[プロ
ードフットおよびブラウンリー(Proudfoot,N.J. and Br
ownlee,G.G.,Nature,263,211(1976))]だけを必要とする
ものであった。
【０００４】真核生物では、細胞質mＲＮＡがＤＮＡと
必ずしも共直線性であるとは限らないことが１９７７年
に見い出された。タンパク質をコードしているＤＮＡ配
列はある長さの非コード化ＤＮＡによって遮断されてい
ることがわかった。遺伝子のＤＮＡ中には、最終的なm
ＲＮＡには見い出されない長い塩基配列が存在する。一
次mＲＮＡ転写体が「スプライス」され、非コード化配
列、すなわちタンパク質をコードしていない配列が除去
されることがわかった。ＤＮＡ中のこれら非コード化配
列は通常イントロンと呼ばれ(以前は介在配列と呼ばれ
ていた)、一方、コード化配列はエキソンと呼ばれる。
ＲＮＡポリメラーゼは、完全なＤＮＡ、すなわちエキソ
ンとイントロンの両者の、一次転写体を生成する。この
転写体はプロセッシングされ、イントロンが除去される
一方で同時にすべてのエキソンが正しい順序で結合され
る。この結果を生み出す機序は「スプライシング」と称さ
れている。
必ずしも共直線性であるとは限らないことが１９７７年
に見い出された。タンパク質をコードしているＤＮＡ配
列はある長さの非コード化ＤＮＡによって遮断されてい
ることがわかった。遺伝子のＤＮＡ中には、最終的なm
ＲＮＡには見い出されない長い塩基配列が存在する。一
次mＲＮＡ転写体が「スプライス」され、非コード化配
列、すなわちタンパク質をコードしていない配列が除去
されることがわかった。ＤＮＡ中のこれら非コード化配
列は通常イントロンと呼ばれ(以前は介在配列と呼ばれ
ていた)、一方、コード化配列はエキソンと呼ばれる。
ＲＮＡポリメラーゼは、完全なＤＮＡ、すなわちエキソ
ンとイントロンの両者の、一次転写体を生成する。この
転写体はプロセッシングされ、イントロンが除去される
一方で同時にすべてのエキソンが正しい順序で結合され
る。この結果を生み出す機序は「スプライシング」と称さ
れている。
【０００５】分割された、即ち継ぎ合わされた遺伝子が
多数発見されている。実際のところ、イントロンはほと
んどすべての哺乳動物および脊椎動物の遺伝子中に存在
し、真核微生物の遺伝子中にも存在する。イントロンは
メッセンジャーのコード化領域に限定されない。たとえ
ば、あるイントロンは、プラスミノーゲン活性化因子m
ＲＮＡのコード化配列の前にあるリーダー領域中にも見
い出された[この遺伝子の他の位置に存在する多数のス
プライス部位に加えて;フィッシャー等(Fisher,R. et a
l.,J.Biol.Chem.,260,1122(1985))]。何故イントロンが
生み出され、真核生物遺伝子に一般的な特徴となってい
るのかについてはかなり考察が為されている[クリック
(Crick,F.,Science,204,264(1976));およびシャープ(Sh
arp,P.A.,Cell,23,643-646(1981))]。
多数発見されている。実際のところ、イントロンはほと
んどすべての哺乳動物および脊椎動物の遺伝子中に存在
し、真核微生物の遺伝子中にも存在する。イントロンは
メッセンジャーのコード化領域に限定されない。たとえ
ば、あるイントロンは、プラスミノーゲン活性化因子m
ＲＮＡのコード化配列の前にあるリーダー領域中にも見
い出された[この遺伝子の他の位置に存在する多数のス
プライス部位に加えて;フィッシャー等(Fisher,R. et a
l.,J.Biol.Chem.,260,1122(1985))]。何故イントロンが
生み出され、真核生物遺伝子に一般的な特徴となってい
るのかについてはかなり考察が為されている[クリック
(Crick,F.,Science,204,264(1976));およびシャープ(Sh
arp,P.A.,Cell,23,643-646(1981))]。
【０００６】イントロンの遍在性が示されたことによ
り、組換え法に関連してスプライシングが研究されたの
は別に驚くにはあたらない。たとえば、ウサギβ-グロ
ビンcＤＮＡ、転写の開始および終止に関係している領
域、β-グロビンcＤＮＡ配列の５'側に位置する多数の
部分からなるリーダー配列からのスプライス部位、およ
びポリアデニル化配列を含んでいるＳＶ４０ベクターが
構築された[ムリガン等(Mulligan,R.C. et al.,Nature,
277,108-114(1979))]。この組換えゲノムは、サル腎細
胞に感染させたとき、β-グロビンコード化配列ならび
に１６Ｓおよび１９Ｓ後期ＲＮＡのためのリーダー領域
を含有するハイブリッドmＲＮＡを産生することが示さ
れた。このハイブリッドmＲＮＡは、かなりの量のウサ
ギβ-グロビンポリペプチドを産生した。ムリガン等
は、スプライシング能力を欠く突然変異体が独立したm
ＲＮＡを産生しなかった実験について議論している。
り、組換え法に関連してスプライシングが研究されたの
は別に驚くにはあたらない。たとえば、ウサギβ-グロ
ビンcＤＮＡ、転写の開始および終止に関係している領
域、β-グロビンcＤＮＡ配列の５'側に位置する多数の
部分からなるリーダー配列からのスプライス部位、およ
びポリアデニル化配列を含んでいるＳＶ４０ベクターが
構築された[ムリガン等(Mulligan,R.C. et al.,Nature,
277,108-114(1979))]。この組換えゲノムは、サル腎細
胞に感染させたとき、β-グロビンコード化配列ならび
に１６Ｓおよび１９Ｓ後期ＲＮＡのためのリーダー領域
を含有するハイブリッドmＲＮＡを産生することが示さ
れた。このハイブリッドmＲＮＡは、かなりの量のウサ
ギβ-グロビンポリペプチドを産生した。ムリガン等
は、スプライシング能力を欠く突然変異体が独立したm
ＲＮＡを産生しなかった実験について議論している。
【０００７】遺伝子発現においてＲＮＡスプライシング
が演ずる生理学的な役割を確かめようとして、ハーマー
およびレーダー[Hamer,D.H. and Leder,P.,Cell,18,129
9-1302(1979)]は、サル細胞にトランスフェンクション
したＳＶ４０組換え体中のスプライス部位の存在および
／または位置を操作した。ハーマーおよびレーダーは、
所望のタンパク質をコードしている遺伝子内に位置する
１つのスプライス部位を用いるか、または１つが所望の
タンパク質をコードしている遺伝子の５'側に、第２の
ものが該遺伝子内に位置している２つのスプライス部位
配列を用いた。彼等は、少なくとも１つの機能的なスプ
ライス結合を保持しているウィルスのすべてがＲＮＡを
一時的に産生することを見い出した。そして、スプライ
シングが、安定なＲＮＡ生成に前もって必要なものであ
ると結論づけた。この結果を裏づけるように、グラス等
[Gruss,P. et al.,PNAS(USA),76,4317-4321(1979)]は、
介在配列を欠くＳＶ４０突然変異体を構築してもカプシ
ドタンパク質が全く検出されないことを見い出した。こ
のグラスの論文は、スプライス部位配列数個を有する多
くの部分からなるリーダーを利用するものであった。３
つの論文は全て、種々の位置に多数のスプライス部位を
有するウィルス性ベクターの利用について論じている。
これらのウィルス性ベクターは、本発明の非ウィルス性
ベクターといくつかの点で異なっている。第１に、ウィ
ルス性イントロンは、コード化配列それ自身内、ならび
に転写ユニットの５'および３'の両方に位置している。
本発明においては、安定化配列は、所望のタンパク質を
コードしている遺伝子の５'側に位置している。ウィル
ス性ベクターは、宿主ＤＮＡとは別個に複製し続け、組
込まれず、そして分解性である。最後に、多くのウィル
ス性ベクターは、正しいスプライシングが起こるために
初期遺伝子機能を必要としている。
が演ずる生理学的な役割を確かめようとして、ハーマー
およびレーダー[Hamer,D.H. and Leder,P.,Cell,18,129
9-1302(1979)]は、サル細胞にトランスフェンクション
したＳＶ４０組換え体中のスプライス部位の存在および
／または位置を操作した。ハーマーおよびレーダーは、
所望のタンパク質をコードしている遺伝子内に位置する
１つのスプライス部位を用いるか、または１つが所望の
タンパク質をコードしている遺伝子の５'側に、第２の
ものが該遺伝子内に位置している２つのスプライス部位
配列を用いた。彼等は、少なくとも１つの機能的なスプ
ライス結合を保持しているウィルスのすべてがＲＮＡを
一時的に産生することを見い出した。そして、スプライ
シングが、安定なＲＮＡ生成に前もって必要なものであ
ると結論づけた。この結果を裏づけるように、グラス等
[Gruss,P. et al.,PNAS(USA),76,4317-4321(1979)]は、
介在配列を欠くＳＶ４０突然変異体を構築してもカプシ
ドタンパク質が全く検出されないことを見い出した。こ
のグラスの論文は、スプライス部位配列数個を有する多
くの部分からなるリーダーを利用するものであった。３
つの論文は全て、種々の位置に多数のスプライス部位を
有するウィルス性ベクターの利用について論じている。
これらのウィルス性ベクターは、本発明の非ウィルス性
ベクターといくつかの点で異なっている。第１に、ウィ
ルス性イントロンは、コード化配列それ自身内、ならび
に転写ユニットの５'および３'の両方に位置している。
本発明においては、安定化配列は、所望のタンパク質を
コードしている遺伝子の５'側に位置している。ウィル
ス性ベクターは、宿主ＤＮＡとは別個に複製し続け、組
込まれず、そして分解性である。最後に、多くのウィル
ス性ベクターは、正しいスプライシングが起こるために
初期遺伝子機能を必要としている。
【０００８】これら２つの論文は、ＲＮＡスプライシン
グが組換えの環境において重要となるのであろうことを
示唆している。しかし、他の研究ではスプライシングを
放棄し、３'ポリアデニル化部位、プロモーター、およ
びエンハンサーなどの５'コントロールシグナルだけを
用いてタンパク質を発現させている。事実、レディー等
[Reddy,U.B. et al.,Transcriptional Control Mechani
sms,J.Cell.Biochem.Suppl.,10D,154(1986)]の最近の研
究により、発現ベクターにイントロンを含有させると発
現される所望のタンパク質量が実際に減少することがわ
かった。この著者等は、イントロンは所望のタンパク質
発現のためのベクターの必須部分ではないと結論づけて
いる。また、ハル等(Hall et al.)は、イントロンの含
有がタンパク質の発現に有害であることを観察した。受
容配列を欠失させると、スプライスされていない細胞質
ウィルスmＲＮＡが一時的に産生されることがわかった
[トレイスマン等(Treismann,R. et al.,Nature,292,595
-600(1981))]。これらの結果は、スプライシングが必須
ではないという考えを支持するものである。
グが組換えの環境において重要となるのであろうことを
示唆している。しかし、他の研究ではスプライシングを
放棄し、３'ポリアデニル化部位、プロモーター、およ
びエンハンサーなどの５'コントロールシグナルだけを
用いてタンパク質を発現させている。事実、レディー等
[Reddy,U.B. et al.,Transcriptional Control Mechani
sms,J.Cell.Biochem.Suppl.,10D,154(1986)]の最近の研
究により、発現ベクターにイントロンを含有させると発
現される所望のタンパク質量が実際に減少することがわ
かった。この著者等は、イントロンは所望のタンパク質
発現のためのベクターの必須部分ではないと結論づけて
いる。また、ハル等(Hall et al.)は、イントロンの含
有がタンパク質の発現に有害であることを観察した。受
容配列を欠失させると、スプライスされていない細胞質
ウィルスmＲＮＡが一時的に産生されることがわかった
[トレイスマン等(Treismann,R. et al.,Nature,292,595
-600(1981))]。これらの結果は、スプライシングが必須
ではないという考えを支持するものである。
【０００９】エンハンサー、プロモーターおよび３'ポ
リアデニル化部位などの通常の組換えコントロールシグ
ナルを用いる直接発現は、常に達成可能という訳ではな
い。スプライス部位を有さないＳＶ４０プロモーターが
多数のcＤＮＡの直接発現に用いられていた[β-ガラク
トシダーゼ、ハル等(Hall,C.V. et al.,J.Mol.Applied
Genetics,2,);ヒト・インターフェロン、グレイ等(Gra
y,P.W. et al.,Nature,295,503(1982));赤血球凝集素、
ゲシング等(Gething, et al.,Nature,293,620(1981));
ヒト・レシチン-コレステロール・アシルトランスフェ
ラーゼ、マクリーン等(McLean,J. et al.,PNAS,33,2335
(1986));ＤＨＦＲ、シモンセン等(Simonsen,C.C. et a
l.,PNAS,80,2495(1983));ヒト・インターロイキン-２、
レオナルド等(Leonard,W.T. et al.,Nature,311,626(19
84));ras-２、カポン等(Capon,D.J.et al.,Nature,304,
1983);src、スニダー等(Snyder,M.A. et al.,Cell,32,8
91(1983));および肝炎Ｂ表面抗原、クロウリー等(Crowl
ey,C.W. et al.,Mol.Cell Biol.,3,44-55(1983))]。し
かし、因子VIIIをコードしているcＤＮＡにライゲート
されたＳＶ４０プロモーターを含有している発現ベクタ
ーを用いて種々の細胞中にトランスフェクションして
も、正しい大きさの独立した因子VIIIメッセージは全く
検出されなかった。このプラスミド上に存在する他の遺
伝子、たとえばＤＨＦＲが転写されると、正しいメッセ
ージが産生した。ＳＶ４０プロモーターは、ある種のタ
ンパク質用のmＲＮＡを発現しうるが因子VIIIを発現す
ることができなかったので、この問題は、連続的な発現
を可能にするであろうmＲＮＡの転写／スプライシン
グ、または単なる因子VIIIメッセージの蓄積の欠如のい
ずれかに関係しているものと認められた。この前者の問
題は、mＲＮＡの「安定性」の問題として本明細書中で言
及する。
リアデニル化部位などの通常の組換えコントロールシグ
ナルを用いる直接発現は、常に達成可能という訳ではな
い。スプライス部位を有さないＳＶ４０プロモーターが
多数のcＤＮＡの直接発現に用いられていた[β-ガラク
トシダーゼ、ハル等(Hall,C.V. et al.,J.Mol.Applied
Genetics,2,);ヒト・インターフェロン、グレイ等(Gra
y,P.W. et al.,Nature,295,503(1982));赤血球凝集素、
ゲシング等(Gething, et al.,Nature,293,620(1981));
ヒト・レシチン-コレステロール・アシルトランスフェ
ラーゼ、マクリーン等(McLean,J. et al.,PNAS,33,2335
(1986));ＤＨＦＲ、シモンセン等(Simonsen,C.C. et a
l.,PNAS,80,2495(1983));ヒト・インターロイキン-２、
レオナルド等(Leonard,W.T. et al.,Nature,311,626(19
84));ras-２、カポン等(Capon,D.J.et al.,Nature,304,
1983);src、スニダー等(Snyder,M.A. et al.,Cell,32,8
91(1983));および肝炎Ｂ表面抗原、クロウリー等(Crowl
ey,C.W. et al.,Mol.Cell Biol.,3,44-55(1983))]。し
かし、因子VIIIをコードしているcＤＮＡにライゲート
されたＳＶ４０プロモーターを含有している発現ベクタ
ーを用いて種々の細胞中にトランスフェクションして
も、正しい大きさの独立した因子VIIIメッセージは全く
検出されなかった。このプラスミド上に存在する他の遺
伝子、たとえばＤＨＦＲが転写されると、正しいメッセ
ージが産生した。ＳＶ４０プロモーターは、ある種のタ
ンパク質用のmＲＮＡを発現しうるが因子VIIIを発現す
ることができなかったので、この問題は、連続的な発現
を可能にするであろうmＲＮＡの転写／スプライシン
グ、または単なる因子VIIIメッセージの蓄積の欠如のい
ずれかに関係しているものと認められた。この前者の問
題は、mＲＮＡの「安定性」の問題として本明細書中で言
及する。
【００１０】転写開始シグナルと因子VIIIをコードして
いるcＤＮＡの種々の組み合わせを用いて多数の実験が
行なわれた。このようなベクターでトランスフェクショ
ンされた細胞が、ノーザン分析により因子VIIIメッセー
ジについて調べられた。正しい大きさの独立したメッセ
ージは全く見い出されなかった。 また、ベクター中に
存在するスプライス部位およびイントロンを用いて実験
が行なわれた。オカヤマおよびベルグ[Okayama,H. and
Berg,P.,Mol. and Cell.Biol.,3(2),280-289(1983)]
は、ＳＶ４０初期領域プロモーター、１つの供与部位お
よび２つの受容部位を含むＳＶ４０後期領域イントロ
ン、cＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含有する
プラスミドベクター、pcＤを用いた。因子VIIIをコード
しているcＤＮＡ、および３つのスプライス部位を有す
る、３つに分かれたリーダー、およびアデノウィルスの
主後期プロモーターを含有しているベクターが、欧州特
許出願公開Ｎo.160,457に記載のようにして構築され
た。このベクターが調べられ、完全な長さの因子VIIIの
発現が成功したりしなかったりランダムであることがわ
かった。このことの、ある部分は、クリプティックな
(あいまいな)スプライシングによって説明することがで
きる。３つに分かれたリーダー領域は多数のコード化領
域でスプライスされ、最終的なメッセージが得られる。
このスプライシングパターンの複雑さは、４つの一次転
写体が別異にスプライスされて１４の別個のメッセージ
が得られることから明らかである[ネビンズおよびウィ
ルソン(Nevins,J. and Wilson,M.,Nature,290,113(198
1))]。コード化配列の下流のスプライス選択のためのコ
ントロールは、よくわかっていない。しかし、適切なポ
リアデニル化部位の選択および転写終止が最終的なスプ
ライシングに先行し、これが３'スプライス部位を選択
させているのかもしれない。この理由から、およびエキ
ソン-イントロン結合点における塩基配列の情報内容が
比較的少ないことから、スプライシングが時には正しく
ない、すなわちクリプティックであるのは驚くには当た
らない[ハーマー等(Hamer et al.,Cell,21,697-708(198
0))およびマンソアー等(Mansour et al.,Mol.Cell.Bio
l.,6,2684(1986))]。このクリプティックなスプライシ
ングは、アデノ主後期プロモーターおよび３つに分かれ
たリーダーを用いる完全長さの因子VIIIの発現におい
て、その成功がランダムであるのを説明することができ
る。
いるcＤＮＡの種々の組み合わせを用いて多数の実験が
行なわれた。このようなベクターでトランスフェクショ
ンされた細胞が、ノーザン分析により因子VIIIメッセー
ジについて調べられた。正しい大きさの独立したメッセ
ージは全く見い出されなかった。 また、ベクター中に
存在するスプライス部位およびイントロンを用いて実験
が行なわれた。オカヤマおよびベルグ[Okayama,H. and
Berg,P.,Mol. and Cell.Biol.,3(2),280-289(1983)]
は、ＳＶ４０初期領域プロモーター、１つの供与部位お
よび２つの受容部位を含むＳＶ４０後期領域イントロ
ン、cＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含有する
プラスミドベクター、pcＤを用いた。因子VIIIをコード
しているcＤＮＡ、および３つのスプライス部位を有す
る、３つに分かれたリーダー、およびアデノウィルスの
主後期プロモーターを含有しているベクターが、欧州特
許出願公開Ｎo.160,457に記載のようにして構築され
た。このベクターが調べられ、完全な長さの因子VIIIの
発現が成功したりしなかったりランダムであることがわ
かった。このことの、ある部分は、クリプティックな
(あいまいな)スプライシングによって説明することがで
きる。３つに分かれたリーダー領域は多数のコード化領
域でスプライスされ、最終的なメッセージが得られる。
このスプライシングパターンの複雑さは、４つの一次転
写体が別異にスプライスされて１４の別個のメッセージ
が得られることから明らかである[ネビンズおよびウィ
ルソン(Nevins,J. and Wilson,M.,Nature,290,113(198
1))]。コード化配列の下流のスプライス選択のためのコ
ントロールは、よくわかっていない。しかし、適切なポ
リアデニル化部位の選択および転写終止が最終的なスプ
ライシングに先行し、これが３'スプライス部位を選択
させているのかもしれない。この理由から、およびエキ
ソン-イントロン結合点における塩基配列の情報内容が
比較的少ないことから、スプライシングが時には正しく
ない、すなわちクリプティックであるのは驚くには当た
らない[ハーマー等(Hamer et al.,Cell,21,697-708(198
0))およびマンソアー等(Mansour et al.,Mol.Cell.Bio
l.,6,2684(1986))]。このクリプティックなスプライシ
ングは、アデノ主後期プロモーターおよび３つに分かれ
たリーダーを用いる完全長さの因子VIIIの発現におい
て、その成功がランダムであるのを説明することができ
る。
【００１１】アデノ主後期プロモーターを含有している
ベクターの分析がさらに行なわれた。アデノベクターを
用いて他のタンパク質が発現させられた(しかし、限定
された発現パターンを有しており、これはアデノのコン
トロール領域が限定された細胞種において機能しうるこ
とを示唆している)[レビン等(Levine,A.S. et al., Vir
ol., 11, 672-681(1973))およびグロッドジッカー等(Gr
odzicker,T.J. et al., J.Virol.,9, 559-571(197
6))]。欧州特許出願公開Ｎo.160,457の記載と同一の５'
および３'コントロール領域を有する、ＤＨＦＲまたはt
-ＰＡなどの他のタンパク質からのcＤＮＡを用いてベク
ターが構築された。これらのプラスミドがＣos、２９
３、ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞中にトランスフェクション
され、次いでこのトランスフェクション体が、免疫ペル
オキシダーゼ染色によるt-ＰＡ発現、またはメトトレキ
セイトを用いるＤＨＦＲ発現のいずれかについてモニタ
ーされた。まとめると、これらアデノ後期ベクターはい
ずれも、２９３またはＣos細胞以外のすべての細胞種に
おいて、t-ＰＡまたはＤＨＦＲを全く発現することがで
きないことがわかった。t-ＰＡの一時的な発現が２９３
およびＣos細胞において再現して見られたが、しかし同
じ条件下での因子VIIIの発現はランダムであった。これ
らの結果は、ウィルス性の多数に分かれたリーダー配列
の一部を用いても所望のタンパク質が発現されなかった
という３つの論文で裏づけられた。第１の論文では、カ
ウフマンおよびシャープ[Kaufman,R.J. and Sharp,P.
A.,Mol.Cell.Biol., 2(11), 1304(1982)]は、ＤＨＦＲ
のコード化領域および免疫グロブリンの可変領域遺伝子
から単離された２つの３'スプライス部位受容配列と結
合させた、アデノウィルスの３つに分かれたmＲＮＡリ
ーダー配列の５'スプライス供与部位および最初のリー
ダーを含む、アデノ主後期プロモーターを含有するベク
ターを構築した。ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞中にトランスフ
ェクションされたこのベクターは、極めて低頻度のＤＨ
ＦＲ+細胞を産生した。第２の論文で、カウフマンおよ
びシャープ[Kaufman,R.J. and Sharp,P.A.,J.Mol.Bio
l.,159,601-621(1982)]は、同じプラスミドを記載し、
ＤＨＦＲの発現が得られなかったことを示している。ウ
ォン等[Wong,G.C. et al.,Science,228,810-815(1985)]
は、ＳＶ４０エンハンサー;アデノウィルスの主後期プ
ロモーターおよび３つに分かれたリーダー配列;３つに
分かれたリーダーの最初のエキソンからの５'スプライ
ス部位およびマウス免疫グロブリン遺伝子からの３'ス
プライス部位からなるハイブリッド(雑種)イントロン;
第１のものが所望のタンパク質、コロニー刺激因子を、
第２のものがＤＨＦＲをコードしている２つのcＤＮＡ;
ＳＶ４０ポリアデニル化配列;およびＶＡ遺伝子を有す
る発現ベクターを用いた。この多シストロン性ベクター
は、一時的にだけ作動することがわかり(前掲、８１０
頁)、翻訳能を増加させるためにＶＡ ＲＮＡの存在を必
要とし(前掲、８１１頁)、mＲＮＡの安定性を増加させ
るために第２のcＤＮＡ、すなわちＤＨＦＲのそれを必
要とした(前掲、８１１頁)。従って、アデノウィルスの
主後期ベクター(ある種のタンパク質のための、完全
な、３つに分かれたリーダーを含有する)によって、限
定された一時的な発現能力が見られるが、ある種のタン
パク質は、連続的な発現を成功裏に行うためにはさらに
別の要件を必要としている。
ベクターの分析がさらに行なわれた。アデノベクターを
用いて他のタンパク質が発現させられた(しかし、限定
された発現パターンを有しており、これはアデノのコン
トロール領域が限定された細胞種において機能しうるこ
とを示唆している)[レビン等(Levine,A.S. et al., Vir
ol., 11, 672-681(1973))およびグロッドジッカー等(Gr
odzicker,T.J. et al., J.Virol.,9, 559-571(197
6))]。欧州特許出願公開Ｎo.160,457の記載と同一の５'
および３'コントロール領域を有する、ＤＨＦＲまたはt
-ＰＡなどの他のタンパク質からのcＤＮＡを用いてベク
ターが構築された。これらのプラスミドがＣos、２９
３、ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞中にトランスフェクション
され、次いでこのトランスフェクション体が、免疫ペル
オキシダーゼ染色によるt-ＰＡ発現、またはメトトレキ
セイトを用いるＤＨＦＲ発現のいずれかについてモニタ
ーされた。まとめると、これらアデノ後期ベクターはい
ずれも、２９３またはＣos細胞以外のすべての細胞種に
おいて、t-ＰＡまたはＤＨＦＲを全く発現することがで
きないことがわかった。t-ＰＡの一時的な発現が２９３
およびＣos細胞において再現して見られたが、しかし同
じ条件下での因子VIIIの発現はランダムであった。これ
らの結果は、ウィルス性の多数に分かれたリーダー配列
の一部を用いても所望のタンパク質が発現されなかった
という３つの論文で裏づけられた。第１の論文では、カ
ウフマンおよびシャープ[Kaufman,R.J. and Sharp,P.
A.,Mol.Cell.Biol., 2(11), 1304(1982)]は、ＤＨＦＲ
のコード化領域および免疫グロブリンの可変領域遺伝子
から単離された２つの３'スプライス部位受容配列と結
合させた、アデノウィルスの３つに分かれたmＲＮＡリ
ーダー配列の５'スプライス供与部位および最初のリー
ダーを含む、アデノ主後期プロモーターを含有するベク
ターを構築した。ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞中にトランスフ
ェクションされたこのベクターは、極めて低頻度のＤＨ
ＦＲ+細胞を産生した。第２の論文で、カウフマンおよ
びシャープ[Kaufman,R.J. and Sharp,P.A.,J.Mol.Bio
l.,159,601-621(1982)]は、同じプラスミドを記載し、
ＤＨＦＲの発現が得られなかったことを示している。ウ
ォン等[Wong,G.C. et al.,Science,228,810-815(1985)]
は、ＳＶ４０エンハンサー;アデノウィルスの主後期プ
ロモーターおよび３つに分かれたリーダー配列;３つに
分かれたリーダーの最初のエキソンからの５'スプライ
ス部位およびマウス免疫グロブリン遺伝子からの３'ス
プライス部位からなるハイブリッド(雑種)イントロン;
第１のものが所望のタンパク質、コロニー刺激因子を、
第２のものがＤＨＦＲをコードしている２つのcＤＮＡ;
ＳＶ４０ポリアデニル化配列;およびＶＡ遺伝子を有す
る発現ベクターを用いた。この多シストロン性ベクター
は、一時的にだけ作動することがわかり(前掲、８１０
頁)、翻訳能を増加させるためにＶＡ ＲＮＡの存在を必
要とし(前掲、８１１頁)、mＲＮＡの安定性を増加させ
るために第２のcＤＮＡ、すなわちＤＨＦＲのそれを必
要とした(前掲、８１１頁)。従って、アデノウィルスの
主後期ベクター(ある種のタンパク質のための、完全
な、３つに分かれたリーダーを含有する)によって、限
定された一時的な発現能力が見られるが、ある種のタン
パク質は、連続的な発現を成功裏に行うためにはさらに
別の要件を必要としている。
【００１２】サイトメガロウィルスのプロモーターおよ
びエンハンサー、因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、
および３'終止配列を含有し、イントロンまたは構築さ
れたスプライス部位を含まないベクターが構築された。
試験したすべての細胞種において、因子VIIIの一時的
な、または安定な発現はいずれも観察されなかった。
びエンハンサー、因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、
および３'終止配列を含有し、イントロンまたは構築さ
れたスプライス部位を含まないベクターが構築された。
試験したすべての細胞種において、因子VIIIの一時的
な、または安定な発現はいずれも観察されなかった。
【００１３】イントロンまたは構築されたスプライス部
位を欠き、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、因子VIIIをコ
ードしているcＤＮＡ、およびプロモーターおよびエン
ハンサーを含むＳＶ４０初期転写配列を含有している別
のベクターは、一時的な、または安定な発現をどちらも
生じなかった。
位を欠き、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、因子VIIIをコ
ードしているcＤＮＡ、およびプロモーターおよびエン
ハンサーを含むＳＶ４０初期転写配列を含有している別
のベクターは、一時的な、または安定な発現をどちらも
生じなかった。
【００１４】ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサ
ー、完全なアデノ主後期３分離リーダー(すなわち、適
当な供与および受容部位を有する３つのイントロン)、
因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、および３'肝炎表面
抗原ポリアデニル化部位を含有するベクターは、ＣＯＳ
細胞でだけ因子VIIIを一時的に発現し、その他の細胞種
では発現しなかった。
ー、完全なアデノ主後期３分離リーダー(すなわち、適
当な供与および受容部位を有する３つのイントロン)、
因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、および３'肝炎表面
抗原ポリアデニル化部位を含有するベクターは、ＣＯＳ
細胞でだけ因子VIIIを一時的に発現し、その他の細胞種
では発現しなかった。
【００１５】ＳＶ４０エンハンサーおよびプロモータ
ー、アデノ主後期３分離リーダーの最初のイントロン、
免疫グロブリン(Ｉg)可変領域受容部位、因子VIIIをコ
ードしているcＤＮＡ、およびＳＶ４０ポリアデニル化
部位を含有しているベクターは、ＣＯＳ細胞において因
子VIIIを一時的に発現したが、その他の細胞種では発現
しなかった。
ー、アデノ主後期３分離リーダーの最初のイントロン、
免疫グロブリン(Ｉg)可変領域受容部位、因子VIIIをコ
ードしているcＤＮＡ、およびＳＶ４０ポリアデニル化
部位を含有しているベクターは、ＣＯＳ細胞において因
子VIIIを一時的に発現したが、その他の細胞種では発現
しなかった。
【００１６】ＳＶ４０エンハンサーおよびプロモータ
ー、アデノ主３分離リーダーの最初の供与部位およびイ
ントロン、Ｉg可変領域受容配列のコンセンサス配列、
因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、および肝炎表面抗
原の３'ポリアデニル化部位を含有しているベクターが
構築された。このベクターは、因子VIIIを一時的または
安定に発現しなかった。
ー、アデノ主３分離リーダーの最初の供与部位およびイ
ントロン、Ｉg可変領域受容配列のコンセンサス配列、
因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、および肝炎表面抗
原の３'ポリアデニル化部位を含有しているベクターが
構築された。このベクターは、因子VIIIを一時的または
安定に発現しなかった。
【００１７】ＳＶ４０エンハンサーおよびプロモータ
ー、因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、供与および受
容配列が備わった、cＤＮＡの３'側のＳＶ４０の小さい
t-抗原イントロン、およびＳＶ４０初期領域ポリアデニ
ル化部位を含有している、さらに別のベクターが構築さ
れた。このベクターは、どの様なタイプの細胞種におい
ても、因子VIIIを一時的または安定的に発現することは
なかった。
ー、因子VIIIをコードしているcＤＮＡ、供与および受
容配列が備わった、cＤＮＡの３'側のＳＶ４０の小さい
t-抗原イントロン、およびＳＶ４０初期領域ポリアデニ
ル化部位を含有している、さらに別のベクターが構築さ
れた。このベクターは、どの様なタイプの細胞種におい
ても、因子VIIIを一時的または安定的に発現することは
なかった。
【００１８】本明細書中に記載した実験により、ある種
のタンパク質の安定な発現には安定化配列、すなわち供
与-イントロン-受容配列または加工されたスプライス配
列のいずれかが必要であることが確かめられた。さら
に、これらの実験によって、安定化配列の位置が安定か
つ連続的な発現に重要であることが確かめられた。本発
明は、発現させることが困難なある種のタンパク質をコ
ードしているＤＮＡの５'側に配置された特異的な安定
化配列を有しているベクターを構築し、これを利用する
ことに関する。選択した宿主細胞中にトランスフェクシ
ョンしたとき、本発明の発現ベクターは、該宿主細胞
を、所望のタンパク質(たとえば、因子VIII)を連続的に
産生する細胞に形質転換するであろう。また、本発明
は、適切な細胞セルラインの選択、および該宿主細胞を
トランスフェクションして所望のタンパク質を連続的に
製造するためのセルラインを確立することに関する。
のタンパク質の安定な発現には安定化配列、すなわち供
与-イントロン-受容配列または加工されたスプライス配
列のいずれかが必要であることが確かめられた。さら
に、これらの実験によって、安定化配列の位置が安定か
つ連続的な発現に重要であることが確かめられた。本発
明は、発現させることが困難なある種のタンパク質をコ
ードしているＤＮＡの５'側に配置された特異的な安定
化配列を有しているベクターを構築し、これを利用する
ことに関する。選択した宿主細胞中にトランスフェクシ
ョンしたとき、本発明の発現ベクターは、該宿主細胞
を、所望のタンパク質(たとえば、因子VIII)を連続的に
産生する細胞に形質転換するであろう。また、本発明
は、適切な細胞セルラインの選択、および該宿主細胞を
トランスフェクションして所望のタンパク質を連続的に
製造するためのセルラインを確立することに関する。
【００１９】発明の該要 本発明は、組換え発現ベクターを用いてある種のタンパ
ク質を連続的に産生させるためには、所望のタンパク質
をコードしているＤＮＡの５'側に配置される、特別に
配置された安定化配列が必要であるという発見に基づい
ている。さらに、本発明は、所望のタンパク質をコード
しているＤＮＡの５'側に配置された安定化配列を用い
ることによって得られる、安定な細胞質mＲＮＡに関す
る。換言すると、本発明は、上記のようにして構築し
た、所望の異種タンパク質をコードしている遺伝子を発
現する、発現ベクターに関する。
ク質を連続的に産生させるためには、所望のタンパク質
をコードしているＤＮＡの５'側に配置される、特別に
配置された安定化配列が必要であるという発見に基づい
ている。さらに、本発明は、所望のタンパク質をコード
しているＤＮＡの５'側に配置された安定化配列を用い
ることによって得られる、安定な細胞質mＲＮＡに関す
る。換言すると、本発明は、上記のようにして構築し
た、所望の異種タンパク質をコードしている遺伝子を発
現する、発現ベクターに関する。
【００２０】さらに別の態様では、本発明は、本発明の
新規ベクターでトランスフェクションするのに適した宿
主細胞を選択することに関し、さらに、宿主細胞を形質
転換して所望の異種タンパク質を製造するための安定な
セルラインを確立することに関する。
新規ベクターでトランスフェクションするのに適した宿
主細胞を選択することに関し、さらに、宿主細胞を形質
転換して所望の異種タンパク質を製造するための安定な
セルラインを確立することに関する。
【００２１】図面の説明 図１、図２及び図３：因子VIIIを産生するセルラインを
樹立するために用いられる因子VIII発現ベクター、pＦ
８ＣＩＳの構築を示す。 図４：因子VIIIを産生するセルラインを樹立するために
用いられる因子VIII発現ベクター、pＦ８ＳＣＩＳの構
築を示す。 図５：トランスフェクション後の細胞の免疫ペルオキシ
ダーゼ染色を示す。(Ａ)はpＦ８ＣＩＳでトランスフェ
クションしたのちの発現を示し、(Ｂ)はpＦ８ＳＣＩＳ
でトランスフェクションしたのちの発現を示す。 図６：増幅を１回行った、pＦ８ＣＩＳでトランスフェ
クションしたＣＨＯ細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を
示す。 図７：pＦ８ＣＩＳでトランスフェクションし、増幅を
３回行ったＣＨＯ細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示
す。
樹立するために用いられる因子VIII発現ベクター、pＦ
８ＣＩＳの構築を示す。 図４：因子VIIIを産生するセルラインを樹立するために
用いられる因子VIII発現ベクター、pＦ８ＳＣＩＳの構
築を示す。 図５：トランスフェクション後の細胞の免疫ペルオキシ
ダーゼ染色を示す。(Ａ)はpＦ８ＣＩＳでトランスフェ
クションしたのちの発現を示し、(Ｂ)はpＦ８ＳＣＩＳ
でトランスフェクションしたのちの発現を示す。 図６：増幅を１回行った、pＦ８ＣＩＳでトランスフェ
クションしたＣＨＯ細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を
示す。 図７：pＦ８ＣＩＳでトランスフェクションし、増幅を
３回行ったＣＨＯ細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示
す。
【００２２】図８及び図９：因子VIIIの変異体を産生す
るセルラインを樹立するために用いられる因子VIII変異
体発現ベクター、pＦ８ＣＩＳ９０８０の構築を示す。 図１０：因子VIIIの変異体すなわち融合タンパク質をコ
ードしているベクターpＦ８ＣＩＳ９０８０でトランス
フェクションした細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示
す。 図１１：連続的な増幅を行った、pＦ８ＣＩＳでトラン
スフェクションしたＣＨＯ細胞の免疫ペルオキシダーゼ
染色を示す。 図１２：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIをコードしている
cＤＮＡを含有している発現ベクター、pＦ８ＣＩＳ-３
３６Ｅの構築を示す。 図１３：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIの融合タンパク質
をコードしているcＤＮＡを含有している発現ベクタ
ー、pＦ８９０８０-３３６Ｅの構築を示す。
るセルラインを樹立するために用いられる因子VIII変異
体発現ベクター、pＦ８ＣＩＳ９０８０の構築を示す。 図１０：因子VIIIの変異体すなわち融合タンパク質をコ
ードしているベクターpＦ８ＣＩＳ９０８０でトランス
フェクションした細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色を示
す。 図１１：連続的な増幅を行った、pＦ８ＣＩＳでトラン
スフェクションしたＣＨＯ細胞の免疫ペルオキシダーゼ
染色を示す。 図１２：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIをコードしている
cＤＮＡを含有している発現ベクター、pＦ８ＣＩＳ-３
３６Ｅの構築を示す。 図１３：活性化タンパク質Ｃによるタンパク質加水分解
的な切断に対して耐性である因子VIIIの融合タンパク質
をコードしているcＤＮＡを含有している発現ベクタ
ー、pＦ８９０８０-３３６Ｅの構築を示す。
【００２３】図１４：精製した９０kd＋１４２aa＋８０
kd融合体のＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
分析を示す。約８μｇの９０kd＋１４２aa＋８０kd融合
体をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分けた。次いで、タンパク質
を、クーマシーブルーによる染色で検出するか(Ａ)、ま
たはニトロセルロースに移動させてウェスタンブロット
分析にかけた(Ｂ)。血漿由来の因子VIIIに対して生成し
たウサギポリクローナル抗体を用いて、ニトロセルロー
スに結合した９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体を検出し
た。 図１５：９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体のトロンビン
活性化を示す。０.１５Ｍ ＮaＣｌ、２.５mＭ ＣaＣｌ2
および５％グリセリンを含有する０.０５Ｍトリス(pＨ
７.４)中の、精製した９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体
約１１μｇを、トロンビン５５nｇといっしょにして３
７℃で０.１〜６０分間インキュベートした。図に示し
た時間にその一部を取り出し、０.０１％ＢＳＡを含有
する０.０５Ｍトリス(pＨ７.４)中、１／２,０００〜１
／１０,０００に希釈し、凝結分析によって検定した。
試料の残りにＳＤＳ緩衝液を加え、これを５分間、９０
℃に加熱した後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた(挿入図)。 図１６：９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体のvＷＦへの
結合が示されている。０.０５Ｍ トリス(pＨ７.４)、１
５０nＭ ＮaＣｌ2、２.５mＭ ＣaＣｌ2および５％グリ
セリン中の９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体(２７５単
位)をvＷＦ-セファロースカラムにかけ、次いでこのカ
ラムを３倍カラム容量の上記緩衝液で洗浄した。９０kd
＋１４２aa＋８０kd融合体を０.２５Ｍ ＣaＣｌ2で溶離
した。このvＷＦ-セファロースカラムは、製造元の指定
に従い、純vＷＦをアフィゲル１０(Affigel;Bio Rad)に
カップリングさせて調製した。 図１７及び図１８：プロリラキシンを産生するセルライ
ンを樹立するために用いられるプロリラキシン発現ベク
ター、pＣＩＨＲＸの構築を示す。 図１９：プロリラキシンを産生するセルラインを樹立す
るために用いられるプロリラキシン発現ベクター、pＣ
ＩＳＲＸの構築を示す。
kd融合体のＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
分析を示す。約８μｇの９０kd＋１４２aa＋８０kd融合
体をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分けた。次いで、タンパク質
を、クーマシーブルーによる染色で検出するか(Ａ)、ま
たはニトロセルロースに移動させてウェスタンブロット
分析にかけた(Ｂ)。血漿由来の因子VIIIに対して生成し
たウサギポリクローナル抗体を用いて、ニトロセルロー
スに結合した９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体を検出し
た。 図１５：９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体のトロンビン
活性化を示す。０.１５Ｍ ＮaＣｌ、２.５mＭ ＣaＣｌ2
および５％グリセリンを含有する０.０５Ｍトリス(pＨ
７.４)中の、精製した９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体
約１１μｇを、トロンビン５５nｇといっしょにして３
７℃で０.１〜６０分間インキュベートした。図に示し
た時間にその一部を取り出し、０.０１％ＢＳＡを含有
する０.０５Ｍトリス(pＨ７.４)中、１／２,０００〜１
／１０,０００に希釈し、凝結分析によって検定した。
試料の残りにＳＤＳ緩衝液を加え、これを５分間、９０
℃に加熱した後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた(挿入図)。 図１６：９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体のvＷＦへの
結合が示されている。０.０５Ｍ トリス(pＨ７.４)、１
５０nＭ ＮaＣｌ2、２.５mＭ ＣaＣｌ2および５％グリ
セリン中の９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体(２７５単
位)をvＷＦ-セファロースカラムにかけ、次いでこのカ
ラムを３倍カラム容量の上記緩衝液で洗浄した。９０kd
＋１４２aa＋８０kd融合体を０.２５Ｍ ＣaＣｌ2で溶離
した。このvＷＦ-セファロースカラムは、製造元の指定
に従い、純vＷＦをアフィゲル１０(Affigel;Bio Rad)に
カップリングさせて調製した。 図１７及び図１８：プロリラキシンを産生するセルライ
ンを樹立するために用いられるプロリラキシン発現ベク
ター、pＣＩＨＲＸの構築を示す。 図１９：プロリラキシンを産生するセルラインを樹立す
るために用いられるプロリラキシン発現ベクター、pＣ
ＩＳＲＸの構築を示す。
【００２４】図２０及び図２１：t-ＰＡを産生するセル
ラインを樹立するために用いられるt-ＰＡ発現ベクタ
ー、pＣＩＨt-ＰＡの構築を示す。 図２２及び図２３：pＦ８ＣＩＳの配列の一部を示す。
この発現ベクターのＤＮＡ配列は、サイトメガロウィル
スのエンハンサー、プロモーター(ヌクレオチド１〜７
３２)、安定化配列、すなわちスプライス供与イントロ
ン配列、Ｉg可変領域イントロンおよびスプライス受容
配列(ヌクレオチド７３３〜９００)を含んでいる。 図２４及び図２５：pＦ８ＳＣＩＳの一部の配列を示
す。この発現ベクターのＤＮＡ配列は、ＳＶ４０のエン
ハンサーおよびプロモーター(ヌクレオチド１〜３６
０)、サイトメガロウィルスの供与およびイントロン配
列、Ｉg可変領域イントロンおよびスプライス受容配列
を含む安定化配列(ヌクレオチド３６１〜５８０)を含有
している。 図２６及び図２７：pＦ８ＣＳＳＳの配列の一部を示
す。この発現ベクターのＤＮＡ配列は、サイトメガロウ
ィルスのエンハンサープロモーターおよびリーダー(ヌ
クレオチド１〜７３２)、加工されたスプライス供与お
よび受容配列を含む安定化配列(ヌクレオチド７３３〜
７３６)、残りのリーダーを含有している。 図２８：t-ＰＡを産生するセルラインを樹立するために
用いられるt-ＰＡ発現ベクター、pＣＩＳt-ＰＡの構築
を示す。
ラインを樹立するために用いられるt-ＰＡ発現ベクタ
ー、pＣＩＨt-ＰＡの構築を示す。 図２２及び図２３：pＦ８ＣＩＳの配列の一部を示す。
この発現ベクターのＤＮＡ配列は、サイトメガロウィル
スのエンハンサー、プロモーター(ヌクレオチド１〜７
３２)、安定化配列、すなわちスプライス供与イントロ
ン配列、Ｉg可変領域イントロンおよびスプライス受容
配列(ヌクレオチド７３３〜９００)を含んでいる。 図２４及び図２５：pＦ８ＳＣＩＳの一部の配列を示
す。この発現ベクターのＤＮＡ配列は、ＳＶ４０のエン
ハンサーおよびプロモーター(ヌクレオチド１〜３６
０)、サイトメガロウィルスの供与およびイントロン配
列、Ｉg可変領域イントロンおよびスプライス受容配列
を含む安定化配列(ヌクレオチド３６１〜５８０)を含有
している。 図２６及び図２７：pＦ８ＣＳＳＳの配列の一部を示
す。この発現ベクターのＤＮＡ配列は、サイトメガロウ
ィルスのエンハンサープロモーターおよびリーダー(ヌ
クレオチド１〜７３２)、加工されたスプライス供与お
よび受容配列を含む安定化配列(ヌクレオチド７３３〜
７３６)、残りのリーダーを含有している。 図２８：t-ＰＡを産生するセルラインを樹立するために
用いられるt-ＰＡ発現ベクター、pＣＩＳt-ＰＡの構築
を示す。
【００２５】詳細な説明 定義および一般的な方法を以下に記述する。本明細書中
で用いる「ヌクレオチド配列」なる語句は、５'から３'に
リン酸ジエステル結合された一連のヌクレオチドからな
る核酸を指し、これはＲＮＡあるいはＤＮＡ配列のいず
れであってもよい。ＤＮＡである場合、このヌクレオチ
ド配列は、１本鎖あるいは２本鎖のいずれであってもよ
い。同様に、「ＤＮＡ配列」なる語句は、１本鎖および２
本鎖の両方を指す。
で用いる「ヌクレオチド配列」なる語句は、５'から３'に
リン酸ジエステル結合された一連のヌクレオチドからな
る核酸を指し、これはＲＮＡあるいはＤＮＡ配列のいず
れであってもよい。ＤＮＡである場合、このヌクレオチ
ド配列は、１本鎖あるいは２本鎖のいずれであってもよ
い。同様に、「ＤＮＡ配列」なる語句は、１本鎖および２
本鎖の両方を指す。
【００２６】「所望の異種タンパク質」なる語句は、宿主
細胞中で発現することが望まれているタンパク質を指す
(このタンパク質は、該宿主細胞によっては通常産生さ
れないか、または少量しか産生されず、通常はこの細胞
の存在に必要ではない)。このようなタンパク質には、
プレあるいは成熟アミノ酸配列を有するすべての分子、
および該所望の異種タンパク質と同等の生物学的活性を
示しうるアミノ酸あるいはグリコシル化変異体(天然の
アレル遺伝子を含む)が含まれる。
細胞中で発現することが望まれているタンパク質を指す
(このタンパク質は、該宿主細胞によっては通常産生さ
れないか、または少量しか産生されず、通常はこの細胞
の存在に必要ではない)。このようなタンパク質には、
プレあるいは成熟アミノ酸配列を有するすべての分子、
および該所望の異種タンパク質と同等の生物学的活性を
示しうるアミノ酸あるいはグリコシル化変異体(天然の
アレル遺伝子を含む)が含まれる。
【００２７】「スプライシング」なる語句は、一次転写体
のプロセッシング中に、ＲＮＡの内部の１またはそれ以
上のある長さ部分が除かれることによって１つの機能的
なＲＮＡ分子が生成する機序を指す。スプライシング
は、イントロンが外へ環状化してイントロンの５'末端
(供与部と呼ばれる)がイントロンの３'末端(受容部と呼
ばれる)に並列することから始まると考えられている。
イントロン-エキソン連結部の塩基配列の比較により、
各イントロンの５'末端の最初の２塩基がＧＴであり、
３'末端の最後の２塩基がＡＧである、コンセンサス配
列が明らかになっている。
のプロセッシング中に、ＲＮＡの内部の１またはそれ以
上のある長さ部分が除かれることによって１つの機能的
なＲＮＡ分子が生成する機序を指す。スプライシング
は、イントロンが外へ環状化してイントロンの５'末端
(供与部と呼ばれる)がイントロンの３'末端(受容部と呼
ばれる)に並列することから始まると考えられている。
イントロン-エキソン連結部の塩基配列の比較により、
各イントロンの５'末端の最初の２塩基がＧＴであり、
３'末端の最後の２塩基がＡＧである、コンセンサス配
列が明らかになっている。
【００２８】「スプライスされたmＲＮＡ」とは、ＲＮＡ
の内部の１またはそれ以上のある長さ部分を除去するこ
とにより産生されるか、または、スプライシングにかけ
られたがヌクレオチド配列が実際上除去されなかったm
ＲＮＡと同じ性質を有するmＲＮＡを転写により産生す
るＤＮＡを構築することによって得られるmＲＮＡを指
す。
の内部の１またはそれ以上のある長さ部分を除去するこ
とにより産生されるか、または、スプライシングにかけ
られたがヌクレオチド配列が実際上除去されなかったm
ＲＮＡと同じ性質を有するmＲＮＡを転写により産生す
るＤＮＡを構築することによって得られるmＲＮＡを指
す。
【００２９】「安定化配列」とは、得られるmＲＮＡが、
スプライスされたmＲＮＡと機能的に類似しているよう
に、供与／受容連結部の適当なヌクレオチドおよび供与
および受容配列のための完全なコンセンサス配列あるい
はその一部を含有する配列をコードすることによって、
またはスプライス供与−イントロン−受容配列をコード
することによって、スプライスされたmＲＮＡを生成す
るＤＮＡ配列を指す。この安定化配列は、所望の異種タ
ンパク質をコードしている遺伝子のリーダー配列中に配
置される。「リーダー配列」とは、ＣＡＰ部位とＡＵＧ翻
訳開始シグナルの間の５'非翻訳化領域中にあるmＲＮＡ
の領域を指す。
スプライスされたmＲＮＡと機能的に類似しているよう
に、供与／受容連結部の適当なヌクレオチドおよび供与
および受容配列のための完全なコンセンサス配列あるい
はその一部を含有する配列をコードすることによって、
またはスプライス供与−イントロン−受容配列をコード
することによって、スプライスされたmＲＮＡを生成す
るＤＮＡ配列を指す。この安定化配列は、所望の異種タ
ンパク質をコードしている遺伝子のリーダー配列中に配
置される。「リーダー配列」とは、ＣＡＰ部位とＡＵＧ翻
訳開始シグナルの間の５'非翻訳化領域中にあるmＲＮＡ
の領域を指す。
【００３０】本明細書中で用いる「コンセンサス配列」と
は、エキソン−イントロンの境界部(または供与配列)に
現われることがわかっている配列
は、エキソン−イントロンの境界部(または供与配列)に
現われることがわかっている配列
【化４】 およびイントロン−エキソンの境界部(または受容配列)
に現われることがわかっている配列
に現われることがわかっている配列
【化５】 を指す[マウント(Mount,S.M.,Nucleic Acids Research,
10(2),459-472(1982))を参照]。個々の塩基が特定の位
置に現われる頻度を分析すると、供与および受容配列の
コンセンサス配列が得られた。また、イントロンがＧＴ
で始まり、ＡＧで終わることが知られている[ブリース
ナッハ等(Breathnach,R. et al.,PNAS(USA),75,4853-48
57(1978))]。さらに、ある種の、多数に分かれたリーダ
ー配列(多数のスプライシングが起こる)は、適切なプロ
セッシングが行なわれるため、初期遺伝子機能の別の因
子を必要とすることもあることがわかっている[バビス
等(Babiss,L.E. et al.,Mol. and Cell.Biol.,5(10),25
52-2558(1985))を参照]。当分野で通常の知識を有する
者は、本発明に従い、コンセンサス スプライス配列の
規則、多数に分かれたリーダー配列(初期遺伝子機能を
必要とし、多数のスプライシングが起こる)、ならびに
供与および受容コンセンサス配列の知識を用いて、所望
のタンパク質のための特定の安定化配列を選択すること
ができるであろう。
10(2),459-472(1982))を参照]。個々の塩基が特定の位
置に現われる頻度を分析すると、供与および受容配列の
コンセンサス配列が得られた。また、イントロンがＧＴ
で始まり、ＡＧで終わることが知られている[ブリース
ナッハ等(Breathnach,R. et al.,PNAS(USA),75,4853-48
57(1978))]。さらに、ある種の、多数に分かれたリーダ
ー配列(多数のスプライシングが起こる)は、適切なプロ
セッシングが行なわれるため、初期遺伝子機能の別の因
子を必要とすることもあることがわかっている[バビス
等(Babiss,L.E. et al.,Mol. and Cell.Biol.,5(10),25
52-2558(1985))を参照]。当分野で通常の知識を有する
者は、本発明に従い、コンセンサス スプライス配列の
規則、多数に分かれたリーダー配列(初期遺伝子機能を
必要とし、多数のスプライシングが起こる)、ならびに
供与および受容コンセンサス配列の知識を用いて、所望
のタンパク質のための特定の安定化配列を選択すること
ができるであろう。
【００３１】「コントロール領域」とは、転写または翻訳
のいずれかのコントロールに関与しているであろう、真
核生物性遺伝子の５'および３'末端に位置している特異
的な配列を指す。ほとんどすべての真核生物性遺伝子
は、転写が開始される部位の上流側の約２５〜３０塩基
のところにＡＴに富む領域を有している。転写開始部位
の上流側７０〜８０塩基のところに観察される他の配列
は、ＣＸＣＡＡＴ領域である(Ｘはどんなヌクレオチド
であってもよい)。ほとんどの真核生物性遺伝子の３'末
端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、この配列は、転写された
mＲＮＡの３'末端にポリアデニル化の尾部が付加するた
めのシグナルとなっているのであろう。
のいずれかのコントロールに関与しているであろう、真
核生物性遺伝子の５'および３'末端に位置している特異
的な配列を指す。ほとんどすべての真核生物性遺伝子
は、転写が開始される部位の上流側の約２５〜３０塩基
のところにＡＴに富む領域を有している。転写開始部位
の上流側７０〜８０塩基のところに観察される他の配列
は、ＣＸＣＡＡＴ領域である(Ｘはどんなヌクレオチド
であってもよい)。ほとんどの真核生物性遺伝子の３'末
端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、この配列は、転写された
mＲＮＡの３'末端にポリアデニル化の尾部が付加するた
めのシグナルとなっているのであろう。
【００３２】「プロモーター」とは、ＲＮＡの合成を開始
するＲＮＡポリメラーゼ分子によって認識されるヌクレ
オチドセグメントをいう。哺乳動物宿主細胞中のベクタ
ーからの転写をコントロールするプロモーターは、種々
の供給源、たとえばウィルス[たとえば、ポリオーマ、
サルウィルス４０(ＳＶ４０)、アデノウィルス、レトロ
ウィルス、肝炎-Ｂウィルス、最も好ましくはサイトメ
ガロウィルス]のゲノムまたは異種哺乳動物のプロモー
ター(たとえば、βアクチンプロモーター)から得ること
ができる。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモー
ターは、ＳＶ４０ウィルスの複製起源をも含有するＳＶ
４０制限フラグメントとして都合よく得られる[フィア
ーズ等(Fiers et al.,Nature,273,113(1978))]。ヒトサ
イトメガロウィルスの即時型プロモーターは、ＨindIII
Ｅ 制限フラグメントとして都合よく得られる[グリー
ンアウェイ等(Greenaway,P.J. et al.,Gene,18,355-360
(1982))]。もちろん、宿主細胞あるいは関連の種からの
プロモーターも本発明に有用である。
するＲＮＡポリメラーゼ分子によって認識されるヌクレ
オチドセグメントをいう。哺乳動物宿主細胞中のベクタ
ーからの転写をコントロールするプロモーターは、種々
の供給源、たとえばウィルス[たとえば、ポリオーマ、
サルウィルス４０(ＳＶ４０)、アデノウィルス、レトロ
ウィルス、肝炎-Ｂウィルス、最も好ましくはサイトメ
ガロウィルス]のゲノムまたは異種哺乳動物のプロモー
ター(たとえば、βアクチンプロモーター)から得ること
ができる。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモー
ターは、ＳＶ４０ウィルスの複製起源をも含有するＳＶ
４０制限フラグメントとして都合よく得られる[フィア
ーズ等(Fiers et al.,Nature,273,113(1978))]。ヒトサ
イトメガロウィルスの即時型プロモーターは、ＨindIII
Ｅ 制限フラグメントとして都合よく得られる[グリー
ンアウェイ等(Greenaway,P.J. et al.,Gene,18,355-360
(1982))]。もちろん、宿主細胞あるいは関連の種からの
プロモーターも本発明に有用である。
【００３３】「エンハンサー」とは、ＤＮＡのシス作用性
の要素を指し、通常約１０〜３００bpであり、プロモー
ターに作用してその転写を増加させる。所望の異種タン
パク質をコードしているＤＮＡの高等真核生物による転
写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することに
よって増加する。このエンハンサーは、比較的配向およ
び位置に依存せず、転写単位の５'[ライミンズ等(Laimi
ns,L. et al.,PNAS,78,993(1981))]および３'[ラスキー
等(Lusky,M.L. et al.,Mol.Cell Bio.,3,1108(198
3))]、イントロン内[バネルジ等(Banerji,J.L. et al.,
Cell,33,729(1983))]、ならびにコード化配列それ自身
内[オスボーン等(Osborne,T.F. et al.,Mol.Cell Bio.,
4,1293(1984))]に見い出されていた。現在では、哺乳動
物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フ
ェトタンパク質およびインスリン)由来の多数のエンハ
ンサー配列が知られている。しかし、通常は真核生物細
胞ウィルスからのエンハンサーが用いられる。これらの
例には、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー(bp
１００〜２７０)、サイトメガロウィルスの初期プロモ
ーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエ
ンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが含ま
れる。
の要素を指し、通常約１０〜３００bpであり、プロモー
ターに作用してその転写を増加させる。所望の異種タン
パク質をコードしているＤＮＡの高等真核生物による転
写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することに
よって増加する。このエンハンサーは、比較的配向およ
び位置に依存せず、転写単位の５'[ライミンズ等(Laimi
ns,L. et al.,PNAS,78,993(1981))]および３'[ラスキー
等(Lusky,M.L. et al.,Mol.Cell Bio.,3,1108(198
3))]、イントロン内[バネルジ等(Banerji,J.L. et al.,
Cell,33,729(1983))]、ならびにコード化配列それ自身
内[オスボーン等(Osborne,T.F. et al.,Mol.Cell Bio.,
4,1293(1984))]に見い出されていた。現在では、哺乳動
物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フ
ェトタンパク質およびインスリン)由来の多数のエンハ
ンサー配列が知られている。しかし、通常は真核生物細
胞ウィルスからのエンハンサーが用いられる。これらの
例には、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー(bp
１００〜２７０)、サイトメガロウィルスの初期プロモ
ーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエ
ンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが含ま
れる。
【００３４】また、真核生物宿主細胞(酵母、菌類、昆
虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞系生物からの
有核細胞)中で用いられる発現ベクターは、転写の終止
に必要な配列(mＲＮＡの発現に影響することもある)を
含有しているであろう。これらの領域は、所望の異種タ
ンパク質をコードしているmＲＮＡの非翻訳化部分中の
ポリアデニル化セグメントとして転写される。また、こ
の３'非翻訳化領域は転写終止部位をも含有している。
虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞系生物からの
有核細胞)中で用いられる発現ベクターは、転写の終止
に必要な配列(mＲＮＡの発現に影響することもある)を
含有しているであろう。これらの領域は、所望の異種タ
ンパク質をコードしているmＲＮＡの非翻訳化部分中の
ポリアデニル化セグメントとして転写される。また、こ
の３'非翻訳化領域は転写終止部位をも含有している。
【００３５】発現ベクターは、選択遺伝子(選択マーカ
ーとも呼ばれる)を含有していてもよい。選択遺伝子
は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または成
長に必要なタンパク質(時には、第２のタンパク質と称
される)をコードしている。哺乳動物細胞に適する選択
マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)、チ
ミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このような
選択マーカーを哺乳動物宿主細胞中にうまく転移させる
と、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置か
れたときに生存することができる。広く用いられている
選択処方には、２つの別個のカテゴリーがある。第１の
カテゴリーのものは、細胞の代謝に基づくものであり、
追加培地とは無関係に成長する能力を欠いている突然変
異セルラインを使用するものである。例を２つ挙げる
と、これらはＣＨＯ ＤＨＦＲ-細胞およびマウスＬＴＫ
-細胞である。これらの細胞は、チミジンあるいはヒポ
キサンチンなどの栄養素の追加がないところで成長する
能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチ
ド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているので、
失われたヌクレオチドが追加培地に与えられなければ生
存することができない。培地に追加を行うことの代わり
は、無傷のＤＨＦＲあるいはＴＫ遺伝子を、それぞれの
遺伝子を欠いている細胞中に導入することであり、こう
してそれらの成長要求を変えることである。ＤＨＦＲあ
るいはＴＫ遺伝子で形質転換されていない個々の細胞
は、追加が為されていない培地中で生存することができ
ないであろう。従って、これらの細胞を直接選択するた
めには、追加栄養素のないところで細胞を成長させるこ
とが必要である。
ーとも呼ばれる)を含有していてもよい。選択遺伝子
は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または成
長に必要なタンパク質(時には、第２のタンパク質と称
される)をコードしている。哺乳動物細胞に適する選択
マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)、チ
ミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このような
選択マーカーを哺乳動物宿主細胞中にうまく転移させる
と、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置か
れたときに生存することができる。広く用いられている
選択処方には、２つの別個のカテゴリーがある。第１の
カテゴリーのものは、細胞の代謝に基づくものであり、
追加培地とは無関係に成長する能力を欠いている突然変
異セルラインを使用するものである。例を２つ挙げる
と、これらはＣＨＯ ＤＨＦＲ-細胞およびマウスＬＴＫ
-細胞である。これらの細胞は、チミジンあるいはヒポ
キサンチンなどの栄養素の追加がないところで成長する
能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチ
ド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているので、
失われたヌクレオチドが追加培地に与えられなければ生
存することができない。培地に追加を行うことの代わり
は、無傷のＤＨＦＲあるいはＴＫ遺伝子を、それぞれの
遺伝子を欠いている細胞中に導入することであり、こう
してそれらの成長要求を変えることである。ＤＨＦＲあ
るいはＴＫ遺伝子で形質転換されていない個々の細胞
は、追加が為されていない培地中で生存することができ
ないであろう。従って、これらの細胞を直接選択するた
めには、追加栄養素のないところで細胞を成長させるこ
とが必要である。
【００３６】第２のカテゴリーのものは、すべての細胞
種で用いられる選択法である優性選択であり、突然変異
セルラインの使用を必要としない。この方法は通常薬物
を用いて宿主細胞の成長を抑制する。新規遺伝子を有す
るこれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発
現し、選択体を生存させるであろう。このような優性選
択に用いられる薬物の例は、ネオマイシン[サザーンお
よびベルグ(Southern P. and Berg,P.,J.Molec.Appl.Ge
net.,1,327(1982))]、マイコフェノール酸[ムリガンお
よびベルグ(Mulligan,R.C. Berg,P.,Science,209,1422
(1980))]またはハイグロマイシン[サジェン等(Sugden,
B. et al.,Mol.Cell.Biol.,5,410-413(1985))]である。
上に挙げた３つの例は、真核生物性コントロール下の細
菌性遺伝子を用いて、適当な薬物ネオマイシン[Ｇ４１
８あるいはジェネチシン(geneticin)]、xgpt(マイコフ
ェノール酸)またはハイグロマイシンへの耐性をそれぞ
れ伝達するものである。後記の実施例では、選択剤は、
特にＣＨＯ ＤＨＦＲ-細胞と記載されているのでなけれ
ば、Ｇ４１８ジェネチシンを用いることが多い。この場
合、ＤＨＦＲ産生の直接選択を用いた。
種で用いられる選択法である優性選択であり、突然変異
セルラインの使用を必要としない。この方法は通常薬物
を用いて宿主細胞の成長を抑制する。新規遺伝子を有す
るこれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発
現し、選択体を生存させるであろう。このような優性選
択に用いられる薬物の例は、ネオマイシン[サザーンお
よびベルグ(Southern P. and Berg,P.,J.Molec.Appl.Ge
net.,1,327(1982))]、マイコフェノール酸[ムリガンお
よびベルグ(Mulligan,R.C. Berg,P.,Science,209,1422
(1980))]またはハイグロマイシン[サジェン等(Sugden,
B. et al.,Mol.Cell.Biol.,5,410-413(1985))]である。
上に挙げた３つの例は、真核生物性コントロール下の細
菌性遺伝子を用いて、適当な薬物ネオマイシン[Ｇ４１
８あるいはジェネチシン(geneticin)]、xgpt(マイコフ
ェノール酸)またはハイグロマイシンへの耐性をそれぞ
れ伝達するものである。後記の実施例では、選択剤は、
特にＣＨＯ ＤＨＦＲ-細胞と記載されているのでなけれ
ば、Ｇ４１８ジェネチシンを用いることが多い。この場
合、ＤＨＦＲ産生の直接選択を用いた。
【００３７】「増幅」とは、細胞の染色体ＤＮＡ内のある
隔離した領域の増加または複製を指す。増幅は、選択剤
[たとえば、ＤＨＦＲを不活性化するメトトレキセイト
(ＭＴＸ)]を用いて行う。増幅、すなわちＤＨＦＲ遺伝
子の連続コピーの生成により、ＭＴＸ量が多くなればな
るほどさらに大量のＤＨＦＲが産生されることになる。
さらに多量のＭＴＸを培地に加えることによって、内生
ＤＨＦＲが存在するにもかかわらず増幅圧がかけられ
る。同時組込みが起こりうるように、所望のタンパク質
をコードしているＤＮＡおよびＤＨＦＲあるいは増幅遺
伝子を有するプラスミドで哺乳動物宿主細胞を同時トラ
ンスフェクションすることによって、所望の遺伝子の増
幅を達成することができる。順次連続的に高くしていっ
たＭＴＸ濃度中で成長することができる細胞だけを選択
することによって、細胞がさらに多量ＤＨＦＲを要求す
るのを確実なものにする(この要求は選択遺伝子の複製
によって満たされる)。所望の異種タンパク質をコード
している遺伝子が増幅しうる遺伝子と同時組込みする限
り、この遺伝子の複製によって所望のタンパク質をコー
ドしている遺伝子の複製が得られる。この結果、所望の
異種タンパク質をコードしている遺伝子のコピー数の増
加、すなわち遺伝子の増幅により、さらに多量の所望の
異種タンパク質が発現されることになる。
隔離した領域の増加または複製を指す。増幅は、選択剤
[たとえば、ＤＨＦＲを不活性化するメトトレキセイト
(ＭＴＸ)]を用いて行う。増幅、すなわちＤＨＦＲ遺伝
子の連続コピーの生成により、ＭＴＸ量が多くなればな
るほどさらに大量のＤＨＦＲが産生されることになる。
さらに多量のＭＴＸを培地に加えることによって、内生
ＤＨＦＲが存在するにもかかわらず増幅圧がかけられ
る。同時組込みが起こりうるように、所望のタンパク質
をコードしているＤＮＡおよびＤＨＦＲあるいは増幅遺
伝子を有するプラスミドで哺乳動物宿主細胞を同時トラ
ンスフェクションすることによって、所望の遺伝子の増
幅を達成することができる。順次連続的に高くしていっ
たＭＴＸ濃度中で成長することができる細胞だけを選択
することによって、細胞がさらに多量ＤＨＦＲを要求す
るのを確実なものにする(この要求は選択遺伝子の複製
によって満たされる)。所望の異種タンパク質をコード
している遺伝子が増幅しうる遺伝子と同時組込みする限
り、この遺伝子の複製によって所望のタンパク質をコー
ドしている遺伝子の複製が得られる。この結果、所望の
異種タンパク質をコードしている遺伝子のコピー数の増
加、すなわち遺伝子の増幅により、さらに多量の所望の
異種タンパク質が発現されることになる。
【００３８】所望の異種タンパク質をコードしている本
発明のベクターを高等真核生物中で発現させるのに適し
た宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶＩ
セルライン(ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒ
ト胚腎セルライン[２９３、グラハム等(Graham,F.L. et
al.,J.Gen Virol.,36,59(1977))];ハムスター新生児腎
細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０);チャイニーズ・
ハムスター卵巣細胞-ＤＨＦＲ[ウルラウブおよびチャー
ジン(Urlaub and Chasin,PNAS(USA),77,4216(1980))];
マウス・セルトリー細胞[ＴＭ４、マザー(Mather,J.P.,
Biol.Reprod.,23,243-251(1980))];サル腎細胞(ＣＶＩ
ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０);アフリカミドリザル腎細胞(Ｖ
ＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７);ヒト頚管
ガン細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２);イヌ腎細胞
(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４);バッファロー・ラ
ット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２);
ヒト肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５);ヒト肝
細胞(Ｈep Ｇ２、ＨＢ８０６５);マウス乳腫瘍(ＭＭＴ
０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１);ラット肝腫瘍細
胞[ＨＴＣ、Ｍ１.５４、バウマン等(Baumann,H. et a
l.,J.Cell Biol.,85,1-8(1980))];およびＴＲＩ細胞[マ
ザー等(Mather,J.P. et al.,Annals N.Y. Acad.Sci.,38
3,44-68(1982)]が含まれる。
発明のベクターを高等真核生物中で発現させるのに適し
た宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶＩ
セルライン(ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒ
ト胚腎セルライン[２９３、グラハム等(Graham,F.L. et
al.,J.Gen Virol.,36,59(1977))];ハムスター新生児腎
細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０);チャイニーズ・
ハムスター卵巣細胞-ＤＨＦＲ[ウルラウブおよびチャー
ジン(Urlaub and Chasin,PNAS(USA),77,4216(1980))];
マウス・セルトリー細胞[ＴＭ４、マザー(Mather,J.P.,
Biol.Reprod.,23,243-251(1980))];サル腎細胞(ＣＶＩ
ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０);アフリカミドリザル腎細胞(Ｖ
ＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７);ヒト頚管
ガン細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２);イヌ腎細胞
(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４);バッファロー・ラ
ット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２);
ヒト肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５);ヒト肝
細胞(Ｈep Ｇ２、ＨＢ８０６５);マウス乳腫瘍(ＭＭＴ
０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１);ラット肝腫瘍細
胞[ＨＴＣ、Ｍ１.５４、バウマン等(Baumann,H. et a
l.,J.Cell Biol.,85,1-8(1980))];およびＴＲＩ細胞[マ
ザー等(Mather,J.P. et al.,Annals N.Y. Acad.Sci.,38
3,44-68(1982)]が含まれる。
【００３９】「形質転換」とは、染色体外成分として、ま
たは染色体に組込むことによって、ＤＮＡの複製が可能
なように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。他
に記載がなければ、本明細書中で用いる、宿主細胞の形
質転換法はグラハムおよびイブ[Graham,F. and van der
Eb,A.,Virology,52,456-457(1973)]の方法である。
たは染色体に組込むことによって、ＤＮＡの複製が可能
なように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。他
に記載がなければ、本明細書中で用いる、宿主細胞の形
質転換法はグラハムおよびイブ[Graham,F. and van der
Eb,A.,Virology,52,456-457(1973)]の方法である。
【００４０】宿主細胞を、本発明の発現ベクターで形質
転換し、プロモーターの誘起、形質転換体の選択、また
は遺伝子の増幅に適しているように修飾した通常の栄養
培地で培養することができる。温度、pＨなどの培養条
件は、発現用に選択した宿主細胞に以前から用いられて
いた条件であり、当分野では明白であろう。
転換し、プロモーターの誘起、形質転換体の選択、また
は遺伝子の増幅に適しているように修飾した通常の栄養
培地で培養することができる。温度、pＨなどの培養条
件は、発現用に選択した宿主細胞に以前から用いられて
いた条件であり、当分野では明白であろう。
【００４１】「トランスフェクション」とは、コード化配
列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞による
発現ベクターの取り込みを指す。多数のトランスフェク
ション法、たとえばＣaＰＯ4法およびエレクトロポレー
ション(electroporation)法が当分野で知られている。
成功裏のトランスフェクションは、通常、このベクター
の作用の指標が宿主細胞内に現れたときに認定される。
しかし、本発明に関しては、成功裏のトランスフェクシ
ョンとは、多世代にわたって宿主培養物が所望の異種タ
ンパク質を安定かつ連続して発現することをいう。
列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞による
発現ベクターの取り込みを指す。多数のトランスフェク
ション法、たとえばＣaＰＯ4法およびエレクトロポレー
ション(electroporation)法が当分野で知られている。
成功裏のトランスフェクションは、通常、このベクター
の作用の指標が宿主細胞内に現れたときに認定される。
しかし、本発明に関しては、成功裏のトランスフェクシ
ョンとは、多世代にわたって宿主培養物が所望の異種タ
ンパク質を安定かつ連続して発現することをいう。
【００４２】産生宿主細胞の選択は、本発明の方法を用
い、一時的な発現、次いで増幅されていない発現をスク
リーニングすることによって行なわれる。ベクターを一
時的な発現についてスクリーニングし、どのベクターを
用いて所望の異種タンパク質を発現させることができる
かを決定した。一時的な発現は、取り込まれた特定のプ
ラスミドが機能するかどうか、すなわち転写および翻訳
されて所望のタンパク質を産生するかどうかについての
指標を与える。この間に、細胞に入ったプラスミドＤＮ
Ａは核に移動する。このＤＮＡは組込まれていない状態
にあり、核内で遊離している。細胞によって取り込まれ
たプラスミドの転写はこの期間中に起こる。次いで、所
望の異種タンパク質を一時的に産生しうると同定された
ベクターを用いて安定かつ連続的な産生細胞を樹立し
た。一時的な発現とは、トランスフェクション後の短期
間(１２〜７２時間)のものを指す。トランスフェクショ
ン後のこの最初の期間が過ぎると、プラスミドＤＮＡは
細胞分裂によって減少または希釈される。細胞クロマチ
ン内でランダムな組込みが起こる。増幅されていない発
現の２〜３週間後に細胞をスクリーニングすると、永久
的なセルラインに導く組換えＤＮＡを保持している細胞
が示される。
い、一時的な発現、次いで増幅されていない発現をスク
リーニングすることによって行なわれる。ベクターを一
時的な発現についてスクリーニングし、どのベクターを
用いて所望の異種タンパク質を発現させることができる
かを決定した。一時的な発現は、取り込まれた特定のプ
ラスミドが機能するかどうか、すなわち転写および翻訳
されて所望のタンパク質を産生するかどうかについての
指標を与える。この間に、細胞に入ったプラスミドＤＮ
Ａは核に移動する。このＤＮＡは組込まれていない状態
にあり、核内で遊離している。細胞によって取り込まれ
たプラスミドの転写はこの期間中に起こる。次いで、所
望の異種タンパク質を一時的に産生しうると同定された
ベクターを用いて安定かつ連続的な産生細胞を樹立し
た。一時的な発現とは、トランスフェクション後の短期
間(１２〜７２時間)のものを指す。トランスフェクショ
ン後のこの最初の期間が過ぎると、プラスミドＤＮＡは
細胞分裂によって減少または希釈される。細胞クロマチ
ン内でランダムな組込みが起こる。増幅されていない発
現の２〜３週間後に細胞をスクリーニングすると、永久
的なセルラインに導く組換えＤＮＡを保持している細胞
が示される。
【００４３】トランスフェクションされた細胞の免疫ペ
ルオキシダーゼ染色に基づく検定が開発され、所望の異
種タンパク質が発現されたかどうかが素早く評価された
[ゴーマン等(Gorman,C.M. et al.,Cell,42,519-522(198
5))]。所望の異種タンパク質に特異的なモノクローナル
抗体がこの検定に用いるためにスクリーニングされた。
特異的なタンパク質を産生する細胞をスクリーニングす
るため、ベクターを含有する宿主細胞を染色し、親セル
ラインと比較した。最小のバックグラウンドで最も強い
シグナルを与えるモノクローナル抗体を選別した。一時
的なトランスフェクションを行って、所望のタンパク質
を産生する能力についてベクターを試験した。ＣaＰＯ4
法を用いて細胞(Ｃos、２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＴＭ
４)をトランスフェクションした[ゴーマン等(Gorman,C.
M. et al.,Science,221,551-553(1983))の修飾によるグ
ラハムおよびイブ(Graham and van der Eb)]。試験しよ
うとする特異的なタンパク質ベクターの沈澱物を１０μ
ｇ／ｍｌ用いた。この沈澱物を細胞上に３〜４時間置い
た。次いで、平均して１分間、細胞をグリセリンショッ
クにかけた。トランスフェクションの３６時間後に細胞
をアセトン−メタノール(５０:５０)で固定し、リン酸
緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗浄した。希釈されていないモノ
クローナル抗体上清または１０％ウシ胎児血清を含むＰ
ＢＳ中、１:３０００に希釈した精製抗体を用いて染色
を行った。この最初の抗体を２時間細胞上に置いた。こ
の期間中、プレートを穏やかな振盪器上に置いた。１０
分間に５回、細胞を洗浄した。用いた第２の抗体はウサ
ギ抗−マウスＩgＧ[ダコパッツ(Dakopatts)]であり、こ
れを、ＰＢＳ＋ウシ胎児血清中、１:１５０に希釈し
た。２時間インキュベートした後、一連の洗浄を行っ
た。ペルオキシダーゼ試薬を現像するためオルソ−ジア
ンシジンを基質として用いた。エタノール飽和したオル
ソ−ジアンシジンの溶液を、過酸化水素を１:１０,００
０に希釈したＰＢＳ中、１:１００に希釈した。この基
質を、室温で２時間または４℃で一晩、細胞上に置い
た。
ルオキシダーゼ染色に基づく検定が開発され、所望の異
種タンパク質が発現されたかどうかが素早く評価された
[ゴーマン等(Gorman,C.M. et al.,Cell,42,519-522(198
5))]。所望の異種タンパク質に特異的なモノクローナル
抗体がこの検定に用いるためにスクリーニングされた。
特異的なタンパク質を産生する細胞をスクリーニングす
るため、ベクターを含有する宿主細胞を染色し、親セル
ラインと比較した。最小のバックグラウンドで最も強い
シグナルを与えるモノクローナル抗体を選別した。一時
的なトランスフェクションを行って、所望のタンパク質
を産生する能力についてベクターを試験した。ＣaＰＯ4
法を用いて細胞(Ｃos、２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＴＭ
４)をトランスフェクションした[ゴーマン等(Gorman,C.
M. et al.,Science,221,551-553(1983))の修飾によるグ
ラハムおよびイブ(Graham and van der Eb)]。試験しよ
うとする特異的なタンパク質ベクターの沈澱物を１０μ
ｇ／ｍｌ用いた。この沈澱物を細胞上に３〜４時間置い
た。次いで、平均して１分間、細胞をグリセリンショッ
クにかけた。トランスフェクションの３６時間後に細胞
をアセトン−メタノール(５０:５０)で固定し、リン酸
緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗浄した。希釈されていないモノ
クローナル抗体上清または１０％ウシ胎児血清を含むＰ
ＢＳ中、１:３０００に希釈した精製抗体を用いて染色
を行った。この最初の抗体を２時間細胞上に置いた。こ
の期間中、プレートを穏やかな振盪器上に置いた。１０
分間に５回、細胞を洗浄した。用いた第２の抗体はウサ
ギ抗−マウスＩgＧ[ダコパッツ(Dakopatts)]であり、こ
れを、ＰＢＳ＋ウシ胎児血清中、１:１５０に希釈し
た。２時間インキュベートした後、一連の洗浄を行っ
た。ペルオキシダーゼ試薬を現像するためオルソ−ジア
ンシジンを基質として用いた。エタノール飽和したオル
ソ−ジアンシジンの溶液を、過酸化水素を１:１０,００
０に希釈したＰＢＳ中、１:１００に希釈した。この基
質を、室温で２時間または４℃で一晩、細胞上に置い
た。
【００４４】この方法により、所望のタンパク質をコー
ドしている多種多様のベクターを、タンパク質の発現能
力について素早くスクリーニングした。
ドしている多種多様のベクターを、タンパク質の発現能
力について素早くスクリーニングした。
【００４５】コーテスト(Ｃoatest)因子VIIIをヘレナ・
ラボラトリーズ[Helena Laboratories,Beaumont,TX(Ca
t. No. 5293)]から購入した。５％以下のタンパク質を
含有している試料用の「終点法」について製造元が提供し
ている方法を実質的に用いた。
ラボラトリーズ[Helena Laboratories,Beaumont,TX(Ca
t. No. 5293)]から購入した。５％以下のタンパク質を
含有している試料用の「終点法」について製造元が提供し
ている方法を実質的に用いた。
【００４６】多種多様の細胞中で一時的に機能すること
が示された本発明のプラスミドを用いて産生セルライン
を樹立した。発現ベクターを多数のセルライン中にトラ
ンスフェクションした。このトランスフェクション用に
は、合計１０μｇ ＤＮＡ／ｍｌの沈澱物を用いた。上
記のような選択マーカーを用いて、これら細胞中での発
現の選択を可能にした。カルシウムに対して感受性であ
ることがわかったＢＲＬ細胞を除き、改良型ＣaＰＯ4法
を用いてすべての細胞をトランスフェクションした。こ
れらの細胞についてエレクトロポレーションを用いた。
既述のようにして適当な宿主細胞からトランスフェクシ
ョンされた細胞を選別した。
が示された本発明のプラスミドを用いて産生セルライン
を樹立した。発現ベクターを多数のセルライン中にトラ
ンスフェクションした。このトランスフェクション用に
は、合計１０μｇ ＤＮＡ／ｍｌの沈澱物を用いた。上
記のような選択マーカーを用いて、これら細胞中での発
現の選択を可能にした。カルシウムに対して感受性であ
ることがわかったＢＲＬ細胞を除き、改良型ＣaＰＯ4法
を用いてすべての細胞をトランスフェクションした。こ
れらの細胞についてエレクトロポレーションを用いた。
既述のようにして適当な宿主細胞からトランスフェクシ
ョンされた細胞を選別した。
【００４７】産生細胞セルラインを樹立するために用い
たプロトコールは、主として上記の染色法によってい
る。トランスフェクション後の２日間、細胞を選択培地
中で継代培養した。選択に必要とされる特定の物質の適
切な量について培地を滴定した。細胞をトランスフェク
ションして産生細胞セルラインを樹立すると同時に、そ
れぞれの細胞種の皿を一時的な発現について検定した。
たプロトコールは、主として上記の染色法によってい
る。トランスフェクション後の２日間、細胞を選択培地
中で継代培養した。選択に必要とされる特定の物質の適
切な量について培地を滴定した。細胞をトランスフェク
ションして産生細胞セルラインを樹立すると同時に、そ
れぞれの細胞種の皿を一時的な発現について検定した。
【００４８】後記実施例を簡略化するため、頻繁に出て
くる方法および／または語句のいくつかを以下に説明す
る。
くる方法および／または語句のいくつかを以下に説明す
る。
【００４９】「プラスミド」は、小文字pを前にし、そし
て／または大文字および／または数字をこれに続けて表
す。本発明で用いる出発プラスミドは、市販品あるいは
制限されていない供給源から一般的に入手可能である
か、または公表されている方法に従って利用可能なプラ
スミドから構築することができる。さらに、本明細書中
に記載したプラスミドの等価物が当分野で知られている
が、これらは当業者には明白であろう。
て／または大文字および／または数字をこれに続けて表
す。本発明で用いる出発プラスミドは、市販品あるいは
制限されていない供給源から一般的に入手可能である
か、または公表されている方法に従って利用可能なプラ
スミドから構築することができる。さらに、本明細書中
に記載したプラスミドの等価物が当分野で知られている
が、これらは当業者には明白であろう。
【００５０】ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある配列
(制限部位)にだけ作用する制限酵素によってＤＮＡを触
媒的に切断することを指す。本発明で用いる種々の制限
酵素は市販品から入手可能であり、その反応条件、補助
因子およびその他必要なものは、当分野で知られている
ものを用いた。分析用には、通常、プラスミドまたはＤ
ＮＡフラグメント１μｇを、緩衝溶液約２０μｌ中、酵
素約２単位とともに用いる。プラスミド構築用のＤＮＡ
フラグメントを単離するためには、通常、ＤＮＡ５〜１
０μｇを、より大きな容量中、酵素２０〜４０単位で消
化する。特定の制限酵素用の適切な緩衝液および基質量
は製造元によって指定されている。通常、インキュベー
ト時間は３７℃で約１時間を用いたが、これは供給元の
指示に従って変えてもよい。消化の後、反応物を直接ゲ
ルにかけ、所望のフラグメントを単離する。
(制限部位)にだけ作用する制限酵素によってＤＮＡを触
媒的に切断することを指す。本発明で用いる種々の制限
酵素は市販品から入手可能であり、その反応条件、補助
因子およびその他必要なものは、当分野で知られている
ものを用いた。分析用には、通常、プラスミドまたはＤ
ＮＡフラグメント１μｇを、緩衝溶液約２０μｌ中、酵
素約２単位とともに用いる。プラスミド構築用のＤＮＡ
フラグメントを単離するためには、通常、ＤＮＡ５〜１
０μｇを、より大きな容量中、酵素２０〜４０単位で消
化する。特定の制限酵素用の適切な緩衝液および基質量
は製造元によって指定されている。通常、インキュベー
ト時間は３７℃で約１時間を用いたが、これは供給元の
指示に従って変えてもよい。消化の後、反応物を直接ゲ
ルにかけ、所望のフラグメントを単離する。
【００５１】「脱ホスホリル化」とは、細菌性アルカリホ
スファターゼ(ＢＡＰ)で処理することによって末端部の
５'リン酸を除去することを指す。この操作によって、
制限切断されたＤＮＡフラグメントの末端２つが「環
化」、すなわち制限部位における別のＤＮＡフラグメン
トの挿入を妨げる閉じた環を生成すること、が防止され
る。脱ホスホリル化のための方法および試薬は通常のも
のである[マニアティス等(Maniatis,T. et al.,Molecul
ar Cloning,133-134(1982))]。ＢＡＰを用いる反応を５
０mＭトリス中、６８℃で行って、酵素調製物中に存在
するであろうすべてのエキソヌクレアーゼの活性を抑制
する。反応は１時間行う。反応後にＤＮＡフラグメント
をゲル精製する。
スファターゼ(ＢＡＰ)で処理することによって末端部の
５'リン酸を除去することを指す。この操作によって、
制限切断されたＤＮＡフラグメントの末端２つが「環
化」、すなわち制限部位における別のＤＮＡフラグメン
トの挿入を妨げる閉じた環を生成すること、が防止され
る。脱ホスホリル化のための方法および試薬は通常のも
のである[マニアティス等(Maniatis,T. et al.,Molecul
ar Cloning,133-134(1982))]。ＢＡＰを用いる反応を５
０mＭトリス中、６８℃で行って、酵素調製物中に存在
するであろうすべてのエキソヌクレアーゼの活性を抑制
する。反応は１時間行う。反応後にＤＮＡフラグメント
をゲル精製する。
【００５２】「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法で
化学的に合成し、次いでポリアクリルアミドゲルで精製
した、短い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオ
チドを指す。
化学的に合成し、次いでポリアクリルアミドゲルで精製
した、短い１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオ
チドを指す。
【００５３】「ライゲート」とは、２つの２本鎖核酸フラ
グメントの間でホスホジエステル結合が生成する過程を
いう(マニアティス等、上記、１４６頁)。他に記載がな
ければ、既知の緩衝液および条件を用い、ほぼ等モル量
のライゲートしようとするＤＮＡフラグメント ０.５μ
ｇあたりＴ４ ＤＮＡリガーゼ１０単位を用いてライゲ
ートを行う。
グメントの間でホスホジエステル結合が生成する過程を
いう(マニアティス等、上記、１４６頁)。他に記載がな
ければ、既知の緩衝液および条件を用い、ほぼ等モル量
のライゲートしようとするＤＮＡフラグメント ０.５μ
ｇあたりＴ４ ＤＮＡリガーゼ１０単位を用いてライゲ
ートを行う。
【００５４】「充填」または「平滑化」とは、制限酵素で切
断された核酸の接着性末端にある１本鎖末端を２本鎖に
変換する過程をいう。これによって接着性末端が除去さ
れ、平滑末端が生成する。この過程は、１つだけあるい
はいくつかの他の制限酵素によって創製された末端と接
着性である制限切断末端を、平滑に切断するいずれかの
制限エンドヌクレアーゼによる末端、あるいはその他の
充填された接着性末端と適合しうる末端に変換するため
の万能の手段である。通常、標的ＤＮＡ２〜１５μｇ
を、１０mＭ ＭgＣｌ2、１mＭジチオトレイトール、５
０mＭ ＮaＣｌ、１０mＭトリス(pＨ７.５)緩衝液中、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント８単位およ
び４種のデオキシヌクレオシド三リン酸それぞれ２５０
μＭの存在下、約３７℃でインキュベートすることによ
って平滑化を行う。通常、３０分後のフェノールおよび
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によってインキ
ュベートを停止させる。
断された核酸の接着性末端にある１本鎖末端を２本鎖に
変換する過程をいう。これによって接着性末端が除去さ
れ、平滑末端が生成する。この過程は、１つだけあるい
はいくつかの他の制限酵素によって創製された末端と接
着性である制限切断末端を、平滑に切断するいずれかの
制限エンドヌクレアーゼによる末端、あるいはその他の
充填された接着性末端と適合しうる末端に変換するため
の万能の手段である。通常、標的ＤＮＡ２〜１５μｇ
を、１０mＭ ＭgＣｌ2、１mＭジチオトレイトール、５
０mＭ ＮaＣｌ、１０mＭトリス(pＨ７.５)緩衝液中、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント８単位およ
び４種のデオキシヌクレオシド三リン酸それぞれ２５０
μＭの存在下、約３７℃でインキュベートすることによ
って平滑化を行う。通常、３０分後のフェノールおよび
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によってインキ
ュベートを停止させる。
【００５５】「ノーザン」ブロットとは、既知の、ラベル
したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとハ
イブリダイズさせることによって細胞mＲＮＡの存在を
確認する方法をいう。本明細書中では、他に記載がなけ
れば、ノーザン分析は、マニアティス等(上記、２０２
頁)の記載のようにして、変性剤(ホルムアルデヒド ７
％)の存在下、１％アガロースでmＲＮＡを電気泳動分離
し、ニトロセルロースに移し、ラベルしたフラグメント
とハイブリダイズさせることを意味する。
したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとハ
イブリダイズさせることによって細胞mＲＮＡの存在を
確認する方法をいう。本明細書中では、他に記載がなけ
れば、ノーザン分析は、マニアティス等(上記、２０２
頁)の記載のようにして、変性剤(ホルムアルデヒド ７
％)の存在下、１％アガロースでmＲＮＡを電気泳動分離
し、ニトロセルロースに移し、ラベルしたフラグメント
とハイブリダイズさせることを意味する。
【００５６】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、これらは本発明の最良の態様を例示する
ものであって本発明を限定しようとするものではない。
く説明するが、これらは本発明の最良の態様を例示する
ものであって本発明を限定しようとするものではない。
【実施例】実施例１ 因子VIIIの発現ベクター １.発現ベクターの構築 ヒト因子VIIIをコードしているcＤＮＡを、トランスフ
ェクションされた哺乳動物細胞において因子VIIIタンパ
ク質を発現するであろうプラスミドの構築に用いた[ウ
ッド等(Wood,W. et al.,Nature(Lond.),312,330-337(19
84))]。これらの形質転換された哺乳動物細胞は約０.１
４mＵ／ｍｌの因子VIIIを分泌した。本方法によって、
かなり大きい収量での因子VIIIの連続製造が得られる。
ェクションされた哺乳動物細胞において因子VIIIタンパ
ク質を発現するであろうプラスミドの構築に用いた[ウ
ッド等(Wood,W. et al.,Nature(Lond.),312,330-337(19
84))]。これらの形質転換された哺乳動物細胞は約０.１
４mＵ／ｍｌの因子VIIIを分泌した。本方法によって、
かなり大きい収量での因子VIIIの連続製造が得られる。
【００５７】a) pＦ８ＣＩＳ サイトメガロウィルスのエンハンサー[ボシャート等(Bo
shart,M. et al.,Cell,41,520(1985))]およびプロモー
ター[トムセン等(Thomsen,D.R. et al.,PNAS,81,659-66
3(1984))]、サイトメガロウィルスのスプライス供与部
位およびイントロンの一部[スターンベルグ等(Sternber
g,R.M. et al.,T. of Virol.,49,190-199(1984))]、Ｉg
可変領域イントロンおよびスプライス受容部位、因子VI
IIをコードしているcＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位を含有するベクターpＦ８ＣＩＳを構築した。
shart,M. et al.,Cell,41,520(1985))]およびプロモー
ター[トムセン等(Thomsen,D.R. et al.,PNAS,81,659-66
3(1984))]、サイトメガロウィルスのスプライス供与部
位およびイントロンの一部[スターンベルグ等(Sternber
g,R.M. et al.,T. of Virol.,49,190-199(1984))]、Ｉg
可変領域イントロンおよびスプライス受容部位、因子VI
IIをコードしているcＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位を含有するベクターpＦ８ＣＩＳを構築した。
【００５８】図１、図２及び図３は、因子VIIIの製造セ
ルラインを樹立するために用いる因子VIII発現ベクター
を構築するための工程を示すものである。以下、構築の
３つの部分を詳細に記述する。
ルラインを樹立するために用いる因子VIII発現ベクター
を構築するための工程を示すものである。以下、構築の
３つの部分を詳細に記述する。
【００５９】１)最終ベクターの複製起源およびアンピ
シリン耐性マーカーを、出発プラスミドpＵＣ１３pＭ
Ｌ、すなわちプラスミドpＭＬの変異体から得た[ラスキ
ーおよびボッチェン(Lusky,M. and Botchen,M.,Nature,
293,79(1981))]。pＵＣ１３[ベイラおよびメシング(Vei
ra,J. and Messing,J.,Gene,19,259(1982))]のポリリン
カーをpＭＬのＥcoＲＩおよびＨindIII部位に移すこと
によってpＵＣ１３pＭＬを構築した。第２の出発プラス
ミドpＵＣ８ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサー、プロモー
ターおよびスプライス供与配列の供給源である。図２２
及び図２３に示されている、ＣＭＶエンハンサー、プロ
モーターおよびスプライス供与配列のためのヌクレオチ
ド１〜７３２を、pＵＣ８の平滑にしたＰstＩおよびＳp
hＩ部位に挿入することによってpＵＣ８ＣＭＶを構築し
た(ベイラおよびメシング、上記)。合成ＢamＨＩ−Ｈin
dIIIリンカー[ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ne
wEngland Biolabs)からの市販品を利用できる]を接着性
ＢamＨＩ末端にライゲートしてＨindIII部位を創製し
た。このライゲートの後、ＨindIII−ＨincII消化を行
った。この消化によって、ＣＭＶエンハンサー、プロモ
ーターおよびスプライス供与部位を含有する約８００bp
のフラグメントが得られた。ゲル単離した後、この８０
０bpのフラグメントをpＵＣ１３pＭＬの２９００bp片に
ライゲートした。この中間体プラスミドをＳalＩおよび
ＨindIIIで消化することによってpＦ８ＣＩＳの構築に
必要なフラグメントを得た。この３１２３bp片は、アン
ピシリン耐性マーカー、pＵＣ１３pＭＬからの複製起源
ならびにエンハンサー、プロモーターおよびスプライス
供与部位を含むＣＭＶのコントロール配列を含有してい
た。
シリン耐性マーカーを、出発プラスミドpＵＣ１３pＭ
Ｌ、すなわちプラスミドpＭＬの変異体から得た[ラスキ
ーおよびボッチェン(Lusky,M. and Botchen,M.,Nature,
293,79(1981))]。pＵＣ１３[ベイラおよびメシング(Vei
ra,J. and Messing,J.,Gene,19,259(1982))]のポリリン
カーをpＭＬのＥcoＲＩおよびＨindIII部位に移すこと
によってpＵＣ１３pＭＬを構築した。第２の出発プラス
ミドpＵＣ８ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサー、プロモー
ターおよびスプライス供与配列の供給源である。図２２
及び図２３に示されている、ＣＭＶエンハンサー、プロ
モーターおよびスプライス供与配列のためのヌクレオチ
ド１〜７３２を、pＵＣ８の平滑にしたＰstＩおよびＳp
hＩ部位に挿入することによってpＵＣ８ＣＭＶを構築し
た(ベイラおよびメシング、上記)。合成ＢamＨＩ−Ｈin
dIIIリンカー[ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ne
wEngland Biolabs)からの市販品を利用できる]を接着性
ＢamＨＩ末端にライゲートしてＨindIII部位を創製し
た。このライゲートの後、ＨindIII−ＨincII消化を行
った。この消化によって、ＣＭＶエンハンサー、プロモ
ーターおよびスプライス供与部位を含有する約８００bp
のフラグメントが得られた。ゲル単離した後、この８０
０bpのフラグメントをpＵＣ１３pＭＬの２９００bp片に
ライゲートした。この中間体プラスミドをＳalＩおよび
ＨindIIIで消化することによってpＦ８ＣＩＳの構築に
必要なフラグメントを得た。この３１２３bp片は、アン
ピシリン耐性マーカー、pＵＣ１３pＭＬからの複製起源
ならびにエンハンサー、プロモーターおよびスプライス
供与部位を含むＣＭＶのコントロール配列を含有してい
た。
【００６０】２)図１、図２及び図３の中央部に示され
ているような合成オリゴマーを用いて、Ｉg可変領域イ
ントロンおよびスプライス受容配列を構築した。ＩgＧ
イントロンおよびスプライス受容部位用の以下の配列
[ボスウェル等(Bothwell et al.,1981)]:
ているような合成オリゴマーを用いて、Ｉg可変領域イ
ントロンおよびスプライス受容配列を構築した。ＩgＧ
イントロンおよびスプライス受容部位用の以下の配列
[ボスウェル等(Bothwell et al.,1981)]:
【化１】 を有する９９merおよび３０merを化学的に合成した。
【００６１】ＤＮＡポリメラーゼＩ(クレノウフラグメ
ント)によってこの合成片を充填し、２本鎖のフラグメ
ントを創製した[ワーテルおよびレツニコフ(Wartell,R.
M. andW.S. Reznikoff,Gene,9,307(1980))]。次いで、
これをＰstＩおよびＨindIIIで２重消化した。この合成
リンカーをpＵＣ１３[ベイラおよびメシング(Veira,J.a
nd Messing,J.,Gene,19,259(1982))]のＰstＩおよびＨi
ndIII部位にクローンした。合成オリゴヌクレオチドを
含有しているクローン(pＵＣＩg.１０と命名した)をＰs
tＩで消化した。ＰstＩ−ＣlaＩリンカーを用いて、こ
のフラグメントにＣlaＩ部位を付加した。ＨindIIIで消
化した後、Ｉg可変領域スプライス受容部およびＩgイン
トロンの一部を含有している１１８bp片をゲル単離し
た。
ント)によってこの合成片を充填し、２本鎖のフラグメ
ントを創製した[ワーテルおよびレツニコフ(Wartell,R.
M. andW.S. Reznikoff,Gene,9,307(1980))]。次いで、
これをＰstＩおよびＨindIIIで２重消化した。この合成
リンカーをpＵＣ１３[ベイラおよびメシング(Veira,J.a
nd Messing,J.,Gene,19,259(1982))]のＰstＩおよびＨi
ndIII部位にクローンした。合成オリゴヌクレオチドを
含有しているクローン(pＵＣＩg.１０と命名した)をＰs
tＩで消化した。ＰstＩ−ＣlaＩリンカーを用いて、こ
のフラグメントにＣlaＩ部位を付加した。ＨindIIIで消
化した後、Ｉg可変領域スプライス受容部およびＩgイン
トロンの一部を含有している１１８bp片をゲル単離し
た。
【００６２】３)構築工程の第３部で、肝炎表面抗原３'
末端をＳＶ４０初期領域の転写終止部位およびポリアデ
ニル化部位に置き換えた。ＳＶ４０配列を含有している
ベクターpＵＣ.ＳＶ４０を、pＵＣ８のＢamＨＩ部位[ビ
エラおよびメシング(上記)]に挿入した。次いで、pＵ
Ｃ.ＳＶ４０をＥcoＲＩおよびＨpaＩで消化した。この
消化物から、ＳＶ４０のポリアデニル化部位だけを含有
している１４３bpフラグメントをゲル単離した。pＳＶ
Ｅ.８c１Ｄを消化して２つの付加的なフラグメントをゲ
ル単離した(欧州特許出願公開Ｎo.160,457)。ＥcoＲＩ
およびＣlaＩ消化によって生成した４.８kbフラグメン
トは、ＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニット、pＭＬの複製
起源およびアンピシリン耐性マーカーを含有している。
ＣlaＩおよびＨpaＩで消化した後に得られる７.５kbフ
ラグメントは因子VIIIのcＤＮＡを含有している。３成
分ライゲートによりpＳＶＥ.８c２４Ｄが得られる。こ
の中間体プラスミドをＣlaＩおよびＳalＩで消化して、
ＳＶ４０ポリアデニル化部位および転写終止部位、これ
に続くＳＶ４０ ＤＨＦＲ転写ユニットとともに、因子V
IIIのcＤＮＡを含有している９６１１bpのフラグメント
を得た。
末端をＳＶ４０初期領域の転写終止部位およびポリアデ
ニル化部位に置き換えた。ＳＶ４０配列を含有している
ベクターpＵＣ.ＳＶ４０を、pＵＣ８のＢamＨＩ部位[ビ
エラおよびメシング(上記)]に挿入した。次いで、pＵ
Ｃ.ＳＶ４０をＥcoＲＩおよびＨpaＩで消化した。この
消化物から、ＳＶ４０のポリアデニル化部位だけを含有
している１４３bpフラグメントをゲル単離した。pＳＶ
Ｅ.８c１Ｄを消化して２つの付加的なフラグメントをゲ
ル単離した(欧州特許出願公開Ｎo.160,457)。ＥcoＲＩ
およびＣlaＩ消化によって生成した４.８kbフラグメン
トは、ＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニット、pＭＬの複製
起源およびアンピシリン耐性マーカーを含有している。
ＣlaＩおよびＨpaＩで消化した後に得られる７.５kbフ
ラグメントは因子VIIIのcＤＮＡを含有している。３成
分ライゲートによりpＳＶＥ.８c２４Ｄが得られる。こ
の中間体プラスミドをＣlaＩおよびＳalＩで消化して、
ＳＶ４０ポリアデニル化部位および転写終止部位、これ
に続くＳＶ４０ ＤＨＦＲ転写ユニットとともに、因子V
IIIのcＤＮＡを含有している９６１１bpのフラグメント
を得た。
【００６３】pＦ８ＣＩＳを得るための最終的な３成分
ライゲートには次の成分を用いた:a)複製起源、アンピ
シリン耐性マーカー、ならびにＣＭＶエンハンサー、プ
ロモーターおよびスプライス供与部を含有している３１
２３bpのＳalＩ−ＨindIIIフラグメント;b)Ｉgイントロ
ンおよびスプライス受容部を含有している１１８bpのＨ
indIII−ＣlaＩフラグメント;およびc)因子VIIIのcＤＮ
Ａ、ＳＶ４０のポリアデニル化部位およびＳＶ４０のＤ
ＨＦＲ転写ユニットを含有している９６１１bpのＣlaＩ
−ＳalＩフラグメント。発現ベクターpＦ８ＣＩＳの配
列の一部を図２２及び図２３に示す。
ライゲートには次の成分を用いた:a)複製起源、アンピ
シリン耐性マーカー、ならびにＣＭＶエンハンサー、プ
ロモーターおよびスプライス供与部を含有している３１
２３bpのＳalＩ−ＨindIIIフラグメント;b)Ｉgイントロ
ンおよびスプライス受容部を含有している１１８bpのＨ
indIII−ＣlaＩフラグメント;およびc)因子VIIIのcＤＮ
Ａ、ＳＶ４０のポリアデニル化部位およびＳＶ４０のＤ
ＨＦＲ転写ユニットを含有している９６１１bpのＣlaＩ
−ＳalＩフラグメント。発現ベクターpＦ８ＣＩＳの配
列の一部を図２２及び図２３に示す。
【００６４】b)pＦ８ＣＳＳＳ サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモータ
ー、加工した安定化配列、因子VIIIをコードしているc
ＤＮＡ、およびＳＶ４０のポリアデニル化部位を含有し
ているベクターpＦ８ＣＳＳＳを構築した。供与および
受容配列を含む完全なイントロン領域を削除し、加工し
た安定化配列で置き換えた。この安定化配列は、スプラ
イシング後の完熟mＲＮＡの配列を有する合成２本鎖オ
リゴマーである。この安定化配列をpＦ８ＣＩＳの１つ
しかないＳacII−ＣlaＩ部位間に挿入した。この合成オ
リゴマーの配列を以下に示す:
ー、加工した安定化配列、因子VIIIをコードしているc
ＤＮＡ、およびＳＶ４０のポリアデニル化部位を含有し
ているベクターpＦ８ＣＳＳＳを構築した。供与および
受容配列を含む完全なイントロン領域を削除し、加工し
た安定化配列で置き換えた。この安定化配列は、スプラ
イシング後の完熟mＲＮＡの配列を有する合成２本鎖オ
リゴマーである。この安定化配列をpＦ８ＣＩＳの１つ
しかないＳacII−ＣlaＩ部位間に挿入した。この合成オ
リゴマーの配列を以下に示す:
【００６５】
【化２】
【００６６】この合成オリゴマーは、供与および受容コ
ンセンサス・スプライス配列の適切なヌクレオチドを含
有している。スプライス供与配列のスプライス受容配列
に対する対置を下線で示す。このベクターは、イントロ
ン部分の削除および加工した安定化配列による置換を除
くと、上記のpＦ８ＣＩＳベクターに類似している。こ
の構築により、現に転写されたmＲＮＡからの非コード
化領域の実際のスプライシングが省かれる。この加工さ
れた安定化配列を含有している発現ベクターpＦ８ＣＳ
ＳＳの配列の一部を図２６及び図２７に示す。
ンセンサス・スプライス配列の適切なヌクレオチドを含
有している。スプライス供与配列のスプライス受容配列
に対する対置を下線で示す。このベクターは、イントロ
ン部分の削除および加工した安定化配列による置換を除
くと、上記のpＦ８ＣＩＳベクターに類似している。こ
の構築により、現に転写されたmＲＮＡからの非コード
化領域の実際のスプライシングが省かれる。この加工さ
れた安定化配列を含有している発現ベクターpＦ８ＣＳ
ＳＳの配列の一部を図２６及び図２７に示す。
【００６７】c)pＦ８ＳＣＩＳ ＳＶ４０のエンハンサーおよびプロモーター、サイトメ
ガロウィルスのスプライス供与部位およびイントロンの
一部、Ｉgイントロンおよびスプライス受容部位、因子V
IIIをコードしているcＤＮＡ、およびＳＶ４０ポリアデ
ニル化および転写終止部位を含有するベクターpＦ８Ｓ
ＣＩＳを構築した。
ガロウィルスのスプライス供与部位およびイントロンの
一部、Ｉgイントロンおよびスプライス受容部位、因子V
IIIをコードしているcＤＮＡ、およびＳＶ４０ポリアデ
ニル化および転写終止部位を含有するベクターpＦ８Ｓ
ＣＩＳを構築した。
【００６８】図４にpＦ８ＳＣＩＳの構築を示す。この
ベクターは３成分ライゲートを用いて構築した。このラ
イゲートに用いた３種のＤＮＡフラグメントそれぞれの
調製を以下に述べる。
ベクターは３成分ライゲートを用いて構築した。このラ
イゲートに用いた３種のＤＮＡフラグメントそれぞれの
調製を以下に述べる。
【００６９】第１のフラグメントには、プラスミドpＭ
Ｌから得られるアンピシリン耐性マーカーの半分および
ＳＶ４０初期領域プロモーターおよびエンハンサーを含
有させた。３種のフラグメントの第１のものの出発プラ
スミドはpＡＭＬ３Ｐ.８Ｃ１である(欧州特許出願公開
Ｎo.160,457)。このプラスミドをＳacＩで切断した。全
酵素ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、このＳacＩで創製
された出っ張り部分を平滑にした。この反応の後、プラ
スミドをＰvuＩで切断した。所望の４３４bpフラグメン
トをアクリルアミドゲルで単離した。
Ｌから得られるアンピシリン耐性マーカーの半分および
ＳＶ４０初期領域プロモーターおよびエンハンサーを含
有させた。３種のフラグメントの第１のものの出発プラ
スミドはpＡＭＬ３Ｐ.８Ｃ１である(欧州特許出願公開
Ｎo.160,457)。このプラスミドをＳacＩで切断した。全
酵素ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、このＳacＩで創製
された出っ張り部分を平滑にした。この反応の後、プラ
スミドをＰvuＩで切断した。所望の４３４bpフラグメン
トをアクリルアミドゲルで単離した。
【００７０】本構築に用いる第２および第３のフラグメ
ントは、上記のようにしてプラスミドpＦ８ＣＩＳから
単離した。
ントは、上記のようにしてプラスミドpＦ８ＣＩＳから
単離した。
【００７１】第２のフラグメントには、ＣＭＶ中間体の
初期遺伝子からのスプライス供与部位およびイントロン
の一部を含有させた(イントロンおよびスプライス受容
部位は上記のように合成して調製した)。pＦ８ＣＩＳを
ＳacIIで切断し、得られた３'側の出っ張りをＤＮＡポ
リメラーゼＩを用いて平滑にし、次いでＣlaＩで切断し
た。pＦ８ＣＩＳ中のＣlaＩ部位の周辺配列は、このプ
ラスミドをメチル化陽性株中で増殖させたときには切断
を妨げるので、pＦ８ＣＩＳをdam-株ＧＭ４８から調製
した[マリヌスおよびマリス(Marinus,M.G. and Maris,
N.R.,Bacteriol.,114,1143-1150(1973))、およびゲイア
ーおよびマドリッド(Geier,G.E. and Madrid,P.,J.Bio
l.Chem.,254,1408-1413(1979))]。このベクター中にＳa
cIIおよびＣlaＩの両部位は１つしかないので、２３１b
pフラグメントはアガロースゲルから容易に単離され
る。
初期遺伝子からのスプライス供与部位およびイントロン
の一部を含有させた(イントロンおよびスプライス受容
部位は上記のように合成して調製した)。pＦ８ＣＩＳを
ＳacIIで切断し、得られた３'側の出っ張りをＤＮＡポ
リメラーゼＩを用いて平滑にし、次いでＣlaＩで切断し
た。pＦ８ＣＩＳ中のＣlaＩ部位の周辺配列は、このプ
ラスミドをメチル化陽性株中で増殖させたときには切断
を妨げるので、pＦ８ＣＩＳをdam-株ＧＭ４８から調製
した[マリヌスおよびマリス(Marinus,M.G. and Maris,
N.R.,Bacteriol.,114,1143-1150(1973))、およびゲイア
ーおよびマドリッド(Geier,G.E. and Madrid,P.,J.Bio
l.Chem.,254,1408-1413(1979))]。このベクター中にＳa
cIIおよびＣlaＩの両部位は１つしかないので、２３１b
pフラグメントはアガロースゲルから容易に単離され
る。
【００７２】第３のフラグメントは、因子VIIIのcＤＮ
Ａ、ＳＶ４０の初期領域ポリアデニル化部位、ＳＶ４０
−ＤＨＦＲ転写ユニット、pＭＬの複製起源およびアン
ピシリン遺伝子の半分を含有している。pＦ８ＣＩＳ(da
m-)をＣlaＩおよびＰvuＩで消化することによって１１
３０８bpフラグメントを調製した。
Ａ、ＳＶ４０の初期領域ポリアデニル化部位、ＳＶ４０
−ＤＨＦＲ転写ユニット、pＭＬの複製起源およびアン
ピシリン遺伝子の半分を含有している。pＦ８ＣＩＳ(da
m-)をＣlaＩおよびＰvuＩで消化することによって１１
３０８bpフラグメントを調製した。
【００７３】pＦ８ＳＣＩＳを創製する３成分ライゲー
トにより、ＳacＩおよびＳacII部位が破壊され、ＣlaＩ
部位が保持され、ＰvuＩ部位にampr遺伝子が再構築され
る。この発現ベクターpＦ８ＳＣＩＳのヌクレオチド配
列の一部を図２４及び図２５に示す。
トにより、ＳacＩおよびＳacII部位が破壊され、ＣlaＩ
部位が保持され、ＰvuＩ部位にampr遺伝子が再構築され
る。この発現ベクターpＦ８ＳＣＩＳのヌクレオチド配
列の一部を図２４及び図２５に示す。
【００７４】実施例２ 発現の分析 １.一時的な発現 トランスフェクションされた細胞の免疫ペルオキシダー
ゼ染色に基づいて因子VIIIの発現を検定した[ゴーマン
等(Gorman et al.,Cell,42,519-526(1985))]。この検定
を用いて因子VIIIの発現ベクターを試験した。因子VIII
に特異的な１２のモノクローナル抗体をこの検定に用い
るためにスクリーニングした。ＢＨＫ３１Ａ３Ｂ細胞
(欧州特許出願公開Ｎo.160,457)を染色し、親のＢＨＫ
細胞セルラインと比較して、因子VIIIを産生する細胞を
スクリーニングした。モノクローナル抗体ＢＨ６は、最
小のバックグラウンドを有する最強のシグナルを与える
ことがわかった。トランスフェクションを行い、因子VI
IIの一時的な発現を評価した。ＣaＰＯ4法を用いて細胞
(Ｃos、２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＴＭ４)をトランスフ
ェクションした。因子VIIIのベクター沈澱物を１０μｇ
／ｍｌ用いた。この沈澱物を３〜４時間細胞に付与し、
次いで平均１分間、細胞にグリセリンショックを与え
た。トランスフェクションの３６時間後に細胞をアセト
ン−メタノール(５０:５０)で固定し、リン酸緩衝食塩
水(ＰＢＳ)で洗浄した。１０％ウシ胎児血清を含有する
ＰＢＳで１:３０００に希釈した精製ＢＨ６抗体または
希釈していないＢＨ６上清のどちらかを用いて細胞を染
色した。この第１の抗体を２時間細胞に付与した。この
期間中、プレートを穏やかな振盪器上に置いた。細胞を
１０分間で５回洗浄した。第２の抗体であるウサギ抗−
マウスＩgＧ(ダコパッツ)をＰＢＳ＋ウシ胎児血清中、
１:１５０に希釈した。２時間インキュベートした後、
一連の洗浄を行った。ペルオキシダーゼ試薬を現像する
ための基質としてオルソ−ジアンシジン[シグマ(Sigm
a)]を用いた。オルソ−ジアンシジンのエタノール飽和
溶液を、過酸化水素を１:１０,０００希釈したＰＢＳで
１:１００に希釈した。この基質を、室温で２時間また
は４℃で一晩、細胞に付与した。
ゼ染色に基づいて因子VIIIの発現を検定した[ゴーマン
等(Gorman et al.,Cell,42,519-526(1985))]。この検定
を用いて因子VIIIの発現ベクターを試験した。因子VIII
に特異的な１２のモノクローナル抗体をこの検定に用い
るためにスクリーニングした。ＢＨＫ３１Ａ３Ｂ細胞
(欧州特許出願公開Ｎo.160,457)を染色し、親のＢＨＫ
細胞セルラインと比較して、因子VIIIを産生する細胞を
スクリーニングした。モノクローナル抗体ＢＨ６は、最
小のバックグラウンドを有する最強のシグナルを与える
ことがわかった。トランスフェクションを行い、因子VI
IIの一時的な発現を評価した。ＣaＰＯ4法を用いて細胞
(Ｃos、２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＴＭ４)をトランスフ
ェクションした。因子VIIIのベクター沈澱物を１０μｇ
／ｍｌ用いた。この沈澱物を３〜４時間細胞に付与し、
次いで平均１分間、細胞にグリセリンショックを与え
た。トランスフェクションの３６時間後に細胞をアセト
ン−メタノール(５０:５０)で固定し、リン酸緩衝食塩
水(ＰＢＳ)で洗浄した。１０％ウシ胎児血清を含有する
ＰＢＳで１:３０００に希釈した精製ＢＨ６抗体または
希釈していないＢＨ６上清のどちらかを用いて細胞を染
色した。この第１の抗体を２時間細胞に付与した。この
期間中、プレートを穏やかな振盪器上に置いた。細胞を
１０分間で５回洗浄した。第２の抗体であるウサギ抗−
マウスＩgＧ(ダコパッツ)をＰＢＳ＋ウシ胎児血清中、
１:１５０に希釈した。２時間インキュベートした後、
一連の洗浄を行った。ペルオキシダーゼ試薬を現像する
ための基質としてオルソ−ジアンシジン[シグマ(Sigm
a)]を用いた。オルソ−ジアンシジンのエタノール飽和
溶液を、過酸化水素を１:１０,０００希釈したＰＢＳで
１:１００に希釈した。この基質を、室温で２時間また
は４℃で一晩、細胞に付与した。
【００７５】この方法は、因子VIIIを発現させる因子VI
IIベクターのスクリーニング法を与えた。この方法によ
って一時的な因子VIIIの発現が測定される。トランスフ
ェクションの３６時間後の染色によって、ベクターが転
写され、mＲＮＡが翻訳されたかどうかの指標が得られ
る。
IIベクターのスクリーニング法を与えた。この方法によ
って一時的な因子VIIIの発現が測定される。トランスフ
ェクションの３６時間後の染色によって、ベクターが転
写され、mＲＮＡが翻訳されたかどうかの指標が得られ
る。
【００７６】pＦ８ＣＩＳは、少なくとも５つの異種セ
ルライン(ＣＯＳ、２９３、ＣＨＯ、ＴＭ４およびＢＨ
Ｋ)において因子VIIIを一時的に発現させた。ＣＨＯ細
胞でのベクターpＦ８ＣＩＳの一時的な発現を図５のＡ
に示す。
ルライン(ＣＯＳ、２９３、ＣＨＯ、ＴＭ４およびＢＨ
Ｋ)において因子VIIIを一時的に発現させた。ＣＨＯ細
胞でのベクターpＦ８ＣＩＳの一時的な発現を図５のＡ
に示す。
【００７７】pＦ８ＳＣＩＳは、pＦ８ＣＩＳと同じ効率
で因子VIIIを一時的に発現させることがわかった。ＣＨ
Ｏ細胞でのベクターpＦ８ＳＣＩＳの一時的な発現を図
５のＢに示す。ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター
は類似のＳＶ４０エンハンサーおよびプロモーターで完
全に置き換えることができるので、因子VIIIの産生は特
異的な転写開始シグナルに依存するのではなく、むしろ
ベクター中の安定化配列部位などのコントロール領域の
他の部分に依存している。
で因子VIIIを一時的に発現させることがわかった。ＣＨ
Ｏ細胞でのベクターpＦ８ＳＣＩＳの一時的な発現を図
５のＢに示す。ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター
は類似のＳＶ４０エンハンサーおよびプロモーターで完
全に置き換えることができるので、因子VIIIの産生は特
異的な転写開始シグナルに依存するのではなく、むしろ
ベクター中の安定化配列部位などのコントロール領域の
他の部分に依存している。
【００７８】細胞をトランスフェクションして産生細胞
セルラインが樹立されたときに、それぞれの細胞種の皿
を一時的な発現について検定した。因子VIIIの一時的な
発現のスクリーニング結果から２種類の細胞群、すなわ
ちトランスフェクションの３６時間後、因子VIIIについ
て陽性に染色された細胞種の群(カテゴリー１)、および
検出可能な因子VIIIの一時的発現が認められなかった細
胞種の群(カテゴリー２)、が得られた。それぞれのカテ
ゴリーを構成している宿主細胞を以下に示す:
セルラインが樹立されたときに、それぞれの細胞種の皿
を一時的な発現について検定した。因子VIIIの一時的な
発現のスクリーニング結果から２種類の細胞群、すなわ
ちトランスフェクションの３６時間後、因子VIIIについ
て陽性に染色された細胞種の群(カテゴリー１)、および
検出可能な因子VIIIの一時的発現が認められなかった細
胞種の群(カテゴリー２)、が得られた。それぞれのカテ
ゴリーを構成している宿主細胞を以下に示す:
【００７９】カテゴリー１ カテゴリー２ ＣＨＯ ＭＤＣＫ ２９３ ＢＲＬ ＢＨＫ Ｈela ＴＭ４ Ｖero ＨＴＣ Ｗ１３８ ＣＯＳ ＣＶ１ ＨepＧ２ ＴＲ１
【００８０】上に述べたように、Ｉg可変領域イントロ
ンおよび供与および受容部位を削除すると(他のコント
ロール領域を維持しながら)、因子VIIIの一時的な発現
がなくなる。このデータから、少なくとも１つのスプラ
イス供与−イントロン−受容配列が発現に必要であると
思われる。
ンおよび供与および受容部位を削除すると(他のコント
ロール領域を維持しながら)、因子VIIIの一時的な発現
がなくなる。このデータから、少なくとも１つのスプラ
イス供与−イントロン−受容配列が発現に必要であると
思われる。
【００８１】さらに別の実験は、安定化配列の位置が重
要であることを示している。たとえば、因子VIIIをコー
ドしているcＤＮＡの３'にイントロンを配置しても因子
VIIIは発現されなかった。また、天然の因子VIIIのスプ
ライス部位、すなわちコード化領域内のスプライス部位
を含んで構築されたベクターもうまく行かないことがわ
かった。受容部および合成Ｉg可変領域イントロンおよ
びＣＭＶ配列を含有しているキメライントロンおよびＣ
ＭＶスプライス供与配列を含有しているスプライス供与
−受容配列は、因子VIIIの連続産生を与えるセルライン
の樹立に導く安定化配列の例である。
要であることを示している。たとえば、因子VIIIをコー
ドしているcＤＮＡの３'にイントロンを配置しても因子
VIIIは発現されなかった。また、天然の因子VIIIのスプ
ライス部位、すなわちコード化領域内のスプライス部位
を含んで構築されたベクターもうまく行かないことがわ
かった。受容部および合成Ｉg可変領域イントロンおよ
びＣＭＶ配列を含有しているキメライントロンおよびＣ
ＭＶスプライス供与配列を含有しているスプライス供与
−受容配列は、因子VIIIの連続産生を与えるセルライン
の樹立に導く安定化配列の例である。
【００８２】２.連続産生 安定化配列を含有し、多種多様の細胞中で一時的に機能
することが示されたプラスミドを、多数のセルライン中
にトランスフェクションすることによって産生細胞セル
ラインを樹立した。これらのトランスフェクション用
に、全量１０μｇＤＮＡ／ｍｌの沈澱物を用いた。ＣＨ
Ｏ ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクションには、４μｇ
の因子VIIIプラスミドを６μｇのサケ精子ＤＮＡ(これ
は担体として働く)に加えた[ウィグラー等(Wigler,M. e
t al.,)、上記]。ＤＨＦＲ遺伝子の発現の直接選択がこ
れらの細胞において可能であった。他の細胞種のすべて
は、ネオマイシン遺伝子を発現するプラスミドとの同時
トランスフェクションを必要とした[ダビエスおよびジ
ェニング(Davies,J. and Jenning,A., Am.J.Trop.Med.H
yg., 29(5), 1089-92(1980))]。pＳＶＥＮeoＢa１６(欧
州特許出願公開Ｎo.160,457)またはpＲＳＶneo[ゴーマ
ン等(Gorman,et al.,Science,221,551-553(1983))]のど
ちらかを用いた。これらのトランスフェクション用に、
因子VIIIプラスミド４μｇ、ネオマイシン含有プラスミ
ド１μｇおよびサケ精子担体５μｇを用いた。上に記し
たように、ＢＲＬ以外は、改良型ＣaＰＯ4法を用いてす
べての細胞をトランスフェクションした。トランスフェ
クションした細胞には、ＢＫＨ、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ、Ｃ
Ｖ１、Ｖero、ＷＩ３８、２９３、ＴＭ４、Ｈela、ＭＤ
ＣＫ、ＨＴＣ、ＢＲＬ、ＴＲ１およびＨepＧ２が含まれ
る。
することが示されたプラスミドを、多数のセルライン中
にトランスフェクションすることによって産生細胞セル
ラインを樹立した。これらのトランスフェクション用
に、全量１０μｇＤＮＡ／ｍｌの沈澱物を用いた。ＣＨ
Ｏ ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクションには、４μｇ
の因子VIIIプラスミドを６μｇのサケ精子ＤＮＡ(これ
は担体として働く)に加えた[ウィグラー等(Wigler,M. e
t al.,)、上記]。ＤＨＦＲ遺伝子の発現の直接選択がこ
れらの細胞において可能であった。他の細胞種のすべて
は、ネオマイシン遺伝子を発現するプラスミドとの同時
トランスフェクションを必要とした[ダビエスおよびジ
ェニング(Davies,J. and Jenning,A., Am.J.Trop.Med.H
yg., 29(5), 1089-92(1980))]。pＳＶＥＮeoＢa１６(欧
州特許出願公開Ｎo.160,457)またはpＲＳＶneo[ゴーマ
ン等(Gorman,et al.,Science,221,551-553(1983))]のど
ちらかを用いた。これらのトランスフェクション用に、
因子VIIIプラスミド４μｇ、ネオマイシン含有プラスミ
ド１μｇおよびサケ精子担体５μｇを用いた。上に記し
たように、ＢＲＬ以外は、改良型ＣaＰＯ4法を用いてす
べての細胞をトランスフェクションした。トランスフェ
クションした細胞には、ＢＫＨ、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ、Ｃ
Ｖ１、Ｖero、ＷＩ３８、２９３、ＴＭ４、Ｈela、ＭＤ
ＣＫ、ＨＴＣ、ＢＲＬ、ＴＲ１およびＨepＧ２が含まれ
る。
【００８３】産生セルラインを樹立するために用いたプ
ロトコールは、主として上記の染色法によっていた。ト
ランスフェクションに続く２日間、Ｇ４１８含有培地、
またはＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞についてはグリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジンを欠く選択培地で細胞を継代
培養した。Ｇ４１８のレベルは、選択に必要とされる適
切な量について滴定を行った。
ロトコールは、主として上記の染色法によっていた。ト
ランスフェクションに続く２日間、Ｇ４１８含有培地、
またはＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞についてはグリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジンを欠く選択培地で細胞を継代
培養した。Ｇ４１８のレベルは、選択に必要とされる適
切な量について滴定を行った。
【００８４】選択開始から３〜４週間後に、因子VIIIの
安定な発現について細胞をスクリーニングした。クロー
ンの皿を染色して因子VIIIを発現するクローンの割合
(％)を測定した。この測定の後、それぞれの細胞種の１
２のクローンを染色用に採取した。次いで、安定な発現
を示し、この時点で陽性と評価されたクローンについて
は、コーテスト(Coatest)検定による定量検定をも行っ
た。
安定な発現について細胞をスクリーニングした。クロー
ンの皿を染色して因子VIIIを発現するクローンの割合
(％)を測定した。この測定の後、それぞれの細胞種の１
２のクローンを染色用に採取した。次いで、安定な発現
を示し、この時点で陽性と評価されたクローンについて
は、コーテスト(Coatest)検定による定量検定をも行っ
た。
【００８５】一時的な発現を示さなかった細胞はこの時
点で安定な発現を示さなかった(たとえば、Ｖero、Ｈe
Ｌa)。因子VIIIの安定な発現は、２つのカテゴリーの細
胞群で観察された:１)因子VIIIを一時的に発現し、安定
な発現のこの第１回目で陰性と評価された細胞群(たと
えば、ＣＨＯおよびＢＨＫ細胞は染色するのに十分な高
レベルでは安定な発現を示さなかった);２)一時的な段
階および増幅されていない段階の両方で陽性に染色され
たセルライン(たとえば、後に潜在的な産生細胞セルラ
インと称されるＴＭ４、ＨＴＣおよび２９３)。
点で安定な発現を示さなかった(たとえば、Ｖero、Ｈe
Ｌa)。因子VIIIの安定な発現は、２つのカテゴリーの細
胞群で観察された:１)因子VIIIを一時的に発現し、安定
な発現のこの第１回目で陰性と評価された細胞群(たと
えば、ＣＨＯおよびＢＨＫ細胞は染色するのに十分な高
レベルでは安定な発現を示さなかった);２)一時的な段
階および増幅されていない段階の両方で陽性に染色され
たセルライン(たとえば、後に潜在的な産生細胞セルラ
インと称されるＴＭ４、ＨＴＣおよび２９３)。
【００８６】
【００８７】ＣＨＯ細胞での低レベルの因子VIIIをコー
テスト法で検定した。コーテスト検定の結果を以下に示
す:増幅されていない細胞での因子VIIIレベル 宿主細胞 mＵ／１０4細胞／日 ＴＭ４ １.８ ＨＴＣ ０.５ ２９３ ２.５ ＣＨＯ ＜０.１５ ＢＨＫ ＜０.１５
テスト法で検定した。コーテスト検定の結果を以下に示
す:増幅されていない細胞での因子VIIIレベル 宿主細胞 mＵ／１０4細胞／日 ＴＭ４ １.８ ＨＴＣ ０.５ ２９３ ２.５ ＣＨＯ ＜０.１５ ＢＨＫ ＜０.１５
【００８８】上記検定の結果は、産生宿主細胞の種類内
で因子VIIIの産生レベルが変わることを示している。ト
ランスフェクションした細胞を免疫ペルオキシダーゼ染
色し(３６〜４８時間での一時的な発現について)、次い
でその３〜４週間後に増幅されていない細胞を染色した
ときの結果は、特定の細胞種を因子VIIIの産生細胞とし
て用いることについて、予想を与えるものであった。細
胞が陽性に染色されず、一時的および増幅されていない
段階で因子VIIIが発現されないことを示したときは、こ
の宿主細胞は因子VIIIの産生セルラインとして働きそう
もない。この結論は、数回の増幅を行った後の因子VIII
の発現について、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＴＣ、ＴＭ４およ
び２９３細胞を染色したときの結果によって支持され
る。
で因子VIIIの産生レベルが変わることを示している。ト
ランスフェクションした細胞を免疫ペルオキシダーゼ染
色し(３６〜４８時間での一時的な発現について)、次い
でその３〜４週間後に増幅されていない細胞を染色した
ときの結果は、特定の細胞種を因子VIIIの産生細胞とし
て用いることについて、予想を与えるものであった。細
胞が陽性に染色されず、一時的および増幅されていない
段階で因子VIIIが発現されないことを示したときは、こ
の宿主細胞は因子VIIIの産生セルラインとして働きそう
もない。この結論は、数回の増幅を行った後の因子VIII
の発現について、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＴＣ、ＴＭ４およ
び２９３細胞を染色したときの結果によって支持され
る。
【００８９】１回目の増幅(ＭＴＸ:１００nＭ)の後、も
う一度、上記の形質転換細胞種からクローンを単離し、
因子VIIIの産生について分析した。この第１回目の増幅
後の因子VIIIの発現の結果は次のようである:増幅を１回行った後の因子VIIIレベル 宿主細胞 mＵ／１０4細胞／日 ＴＭ４ ３.０ ＨＴＣ ２.３ ＣＨＯ ０.１mＵ／ｍｌ ＢＨＫ ０.１mＵ／ｍｌ
う一度、上記の形質転換細胞種からクローンを単離し、
因子VIIIの産生について分析した。この第１回目の増幅
後の因子VIIIの発現の結果は次のようである:増幅を１回行った後の因子VIIIレベル 宿主細胞 mＵ／１０4細胞／日 ＴＭ４ ３.０ ＨＴＣ ２.３ ＣＨＯ ０.１mＵ／ｍｌ ＢＨＫ ０.１mＵ／ｍｌ
【００９０】クローンおよび母集団の両者を、さらに増
幅を行うために維持した。ＣＨＯおよびＢＨＫの両細胞
においては因子VIIIが一時的にモニターされるが、ＭＴ
Ｘ増幅を１回行った後にはわずかのクローンしか同定さ
れず、さらに継続すると低レベルの因子VIIIは消失し
た。これらのクローンについて不均質性が見られた(図
６)。因子VIIIを産生するＣＨＯ細胞は、倍加時間が４
５〜５２時間と大きく増加し、倍加時間が２８時間であ
る母集団中の非発現細胞が繁殖した。注意深く検討する
と、因子VIIIを連続的に発現するＣＨＯクローンを樹立
するのが困難であることがわかった。以下に示したデー
タは、増幅されていない段階および増幅を１回行った後
の両者における、ＤＨＦＲ陽性ＣＨＯクローン中の、因
子VIIIを発現するクローンの頻度を示すものである。因
子VIIIに対して陽性に染色されたクローンの数を、トラ
ンスフェクションに次いで得られる安定なクローンの数
の割合(％)で表す。
幅を行うために維持した。ＣＨＯおよびＢＨＫの両細胞
においては因子VIIIが一時的にモニターされるが、ＭＴ
Ｘ増幅を１回行った後にはわずかのクローンしか同定さ
れず、さらに継続すると低レベルの因子VIIIは消失し
た。これらのクローンについて不均質性が見られた(図
６)。因子VIIIを産生するＣＨＯ細胞は、倍加時間が４
５〜５２時間と大きく増加し、倍加時間が２８時間であ
る母集団中の非発現細胞が繁殖した。注意深く検討する
と、因子VIIIを連続的に発現するＣＨＯクローンを樹立
するのが困難であることがわかった。以下に示したデー
タは、増幅されていない段階および増幅を１回行った後
の両者における、ＤＨＦＲ陽性ＣＨＯクローン中の、因
子VIIIを発現するクローンの頻度を示すものである。因
子VIIIに対して陽性に染色されたクローンの数を、トラ
ンスフェクションに次いで得られる安定なクローンの数
の割合(％)で表す。
【００９１】
【００９２】２回目または３回目の増幅(通常、約１μ
Ｍのメトトレキセイト)を行ったときにも、ＣＨＯ細胞
において因子VIIIが検出可能であった。この高レベルの
増幅時でも、因子VIIIの活性は低く、６３mＵ／ｍｌで
あった。連続的な増幅によってＣＨＯセルラインにおけ
る産生の増加が導かれなかった。別個に得られた３つの
ＣＨＯセルラインを形態学的に分析すると、因子VIIIに
ついて染色される細胞は大きくなり、平たくなることが
わかる(図７)。１０μＭまで増幅した形質転換ＣＨＯ細
胞は、２００mＵ／ｍｌ産生するにすぎない。これらの
結果は、因子VIIIの産生細胞システムの樹立において
は、宿主細胞の選択が重要な工程となることを示してい
る。ここでは、ＴＭ４、ＨＴＣおよび２９３を用いて、
因子VIIIを連続的に産生する永久的な細胞セルラインを
樹立し、こうして産生細胞セルラインとみなした。
Ｍのメトトレキセイト)を行ったときにも、ＣＨＯ細胞
において因子VIIIが検出可能であった。この高レベルの
増幅時でも、因子VIIIの活性は低く、６３mＵ／ｍｌで
あった。連続的な増幅によってＣＨＯセルラインにおけ
る産生の増加が導かれなかった。別個に得られた３つの
ＣＨＯセルラインを形態学的に分析すると、因子VIIIに
ついて染色される細胞は大きくなり、平たくなることが
わかる(図７)。１０μＭまで増幅した形質転換ＣＨＯ細
胞は、２００mＵ／ｍｌ産生するにすぎない。これらの
結果は、因子VIIIの産生細胞システムの樹立において
は、宿主細胞の選択が重要な工程となることを示してい
る。ここでは、ＴＭ４、ＨＴＣおよび２９３を用いて、
因子VIIIを連続的に産生する永久的な細胞セルラインを
樹立し、こうして産生細胞セルラインとみなした。
【００９３】実施例３ 因子VIIIの凝結活性 ＴＭ４細胞からの活性な因子VIIIの発現および分泌を、
凝結分析によって測定した。pＦ８ＣＩＳでトランスフ
ェクションしたＴＭ４細胞によって４８時間調整を行っ
た血清不含培地を、因子VIIIについて検定した。第１表
に示したように、ＴＭ４培養培地は血友病患者の血漿の
凝固時間を短縮した。この凝固活性の大部分は、ＴＭ４
培地がヒト因子VIIIに対するポリクローナル抗体ととも
に予めインキュベートされたときに中和された。
凝結分析によって測定した。pＦ８ＣＩＳでトランスフ
ェクションしたＴＭ４細胞によって４８時間調整を行っ
た血清不含培地を、因子VIIIについて検定した。第１表
に示したように、ＴＭ４培養培地は血友病患者の血漿の
凝固時間を短縮した。この凝固活性の大部分は、ＴＭ４
培地がヒト因子VIIIに対するポリクローナル抗体ととも
に予めインキュベートされたときに中和された。
【００９４】
【表１】
【００９５】第１表はＴＭ４細胞からの活性因子VIIIの
分泌を示すものである。ヒト因子VIIIのポリクローナル
抗体１０μｇを添加して、または添加せずに、３７℃で
３０分間、ＴＭ４培地を予めインキュベートした。次い
で、０.０１％ＢＳＡを含有する０.０５Ｍトリス(pＨ
７.５)でこの培地を１:１に希釈し、凝結分析で検定し
た。精製した血漿由来の因子VIII(pd VIII)を同様に処
理した。
分泌を示すものである。ヒト因子VIIIのポリクローナル
抗体１０μｇを添加して、または添加せずに、３７℃で
３０分間、ＴＭ４培地を予めインキュベートした。次い
で、０.０１％ＢＳＡを含有する０.０５Ｍトリス(pＨ
７.５)でこの培地を１:１に希釈し、凝結分析で検定し
た。精製した血漿由来の因子VIII(pd VIII)を同様に処
理した。
【００９６】実施例４ 因子VIII変異体の発現ベクター さらに効率的なタンパク質を得るためのアプローチの１
つは、タンパク質を加工することである。すなわち、Ｄ
ＮＡレベルで遺伝子内に変異を導入することによって、
細胞培養物中で変異体を産生させることができ、タンパ
ク質機能の特異的な修飾を行うことができる。３種の変
異体を設計した。天然因子VIIIの１本鎖３００,０００
ダルトンのタンパク質を９０,０００および８０,０００
ダルトンのサブユニットに切断し、次いで５０,００
０、４３,０００および７３,０００ダルトンの活性サブ
ユニットに切断する。アミノ酸７４２から１６４８の間
のＢ領域は定義された機能を有していない[ベーハー等
(Vehar,G.A. et al.,Nature,312,330-337(1984))]。完
全な長さの組換え因子VIIIタンパク質の発現について記
載したのと同じ細胞システムを用いて突然変異体を発現
させた。
つは、タンパク質を加工することである。すなわち、Ｄ
ＮＡレベルで遺伝子内に変異を導入することによって、
細胞培養物中で変異体を産生させることができ、タンパ
ク質機能の特異的な修飾を行うことができる。３種の変
異体を設計した。天然因子VIIIの１本鎖３００,０００
ダルトンのタンパク質を９０,０００および８０,０００
ダルトンのサブユニットに切断し、次いで５０,００
０、４３,０００および７３,０００ダルトンの活性サブ
ユニットに切断する。アミノ酸７４２から１６４８の間
のＢ領域は定義された機能を有していない[ベーハー等
(Vehar,G.A. et al.,Nature,312,330-337(1984))]。完
全な長さの組換え因子VIIIタンパク質の発現について記
載したのと同じ細胞システムを用いて突然変異体を発現
させた。
【００９７】pＦ８ＣＩＳ９０８０ 因子VIIIの融合タンパク質を発現させるために用いられ
る真核生物性発現ベクターには、ヒトサイトメガロウィ
ルス(ＣＭＶ)の即時型遺伝子のエンハンサー(ボシャー
ト等、上記)、およびプロモーター(トムセン等、上記);
この遺伝子の転写開始部位の３'側に配置されたスプラ
イス供与配列(ボシャート等; 上記、ステンベルグ等、
上記);およびマウスの免疫グロブリン可変領域からの合
成スプライス受容部位(ボスウェル等、上記)を含有させ
た。新しいコード化領域は、その３'末端が、ＳＶ４０
初期ポリアデニル化配列および転写終止部位で区切られ
ている(フィアーズ等、上記)。このベクターは増幅可能
なマーカー、すなわちＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニット
を含んでいる。
る真核生物性発現ベクターには、ヒトサイトメガロウィ
ルス(ＣＭＶ)の即時型遺伝子のエンハンサー(ボシャー
ト等、上記)、およびプロモーター(トムセン等、上記);
この遺伝子の転写開始部位の３'側に配置されたスプラ
イス供与配列(ボシャート等; 上記、ステンベルグ等、
上記);およびマウスの免疫グロブリン可変領域からの合
成スプライス受容部位(ボスウェル等、上記)を含有させ
た。新しいコード化領域は、その３'末端が、ＳＶ４０
初期ポリアデニル化配列および転写終止部位で区切られ
ている(フィアーズ等、上記)。このベクターは増幅可能
なマーカー、すなわちＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニット
を含んでいる。
【００９８】因子VIIIの融合タンパク質９０kd＋１４２
aa＋８０kdをコードしている発現ベクターpＦ８ＣＩＳ
９０８０の構築を図８及び図９に示す。プラスミドpＳ
ＶＥ.８cＩＤ(欧州特許出願公開Ｎo.160,457)から始
め、ＳstIIで切断し、接着性末端をＳ１で平滑にし、Ｈ
paＩでさらに切断し、２つの平滑末端を再ライゲートす
ることによって、３'非翻訳化領域中に短い欠失を作成
し、pＳＶＥ.８c９を得た。このプラスミドをＣlaＩお
よびＳalＩで切断し、１００３１bpフラグメントをＳal
Ｉ、ＣlaＩ中にクローンした。６７６１bpのプロモータ
ーはpＡＭＬ３Ｐ.Ｄ２２(欧州特許出願公開Ｎo.160,45
7)のフラグメントを含有している。因子VIII遺伝子内の
充填Ｔth111 ＩおよびＢamＨＩ(アミノ酸１５６３)をラ
イゲートすることによって、因子VIII遺伝子中の融合を
作成した。図８及び図９には、pＡＭＬ３Ｐ.８c１(欧州
特許出願公開Ｎo.160,457)の２５１６bpフラグメントと
pＡＭＬ３Ｐ.８c９の１１９９１bpフラグメントをライ
ゲートすることによる、融合領域含有のpＡＭＬ３Ｐ.８
Ｌ１９の構築が示されている。この融合をＤＮＡ配列で
確認した。融合領域を含有している４７２２bpのＣlaＩ
−ＸbaＩフラグメントを、ＣＭＶプロモーター−エンハ
ンサーを含有しているpＦ８ＣＩＳ発現ベクターの５８
２８bpのＣlaＩ−ＸbaＩフラグメントにクローンした。
メチル化がＣlaＩ部位での切断を妨げないＥ.coliのdam
-株からＣＭＶフラグメントを得た。
aa＋８０kdをコードしている発現ベクターpＦ８ＣＩＳ
９０８０の構築を図８及び図９に示す。プラスミドpＳ
ＶＥ.８cＩＤ(欧州特許出願公開Ｎo.160,457)から始
め、ＳstIIで切断し、接着性末端をＳ１で平滑にし、Ｈ
paＩでさらに切断し、２つの平滑末端を再ライゲートす
ることによって、３'非翻訳化領域中に短い欠失を作成
し、pＳＶＥ.８c９を得た。このプラスミドをＣlaＩお
よびＳalＩで切断し、１００３１bpフラグメントをＳal
Ｉ、ＣlaＩ中にクローンした。６７６１bpのプロモータ
ーはpＡＭＬ３Ｐ.Ｄ２２(欧州特許出願公開Ｎo.160,45
7)のフラグメントを含有している。因子VIII遺伝子内の
充填Ｔth111 ＩおよびＢamＨＩ(アミノ酸１５６３)をラ
イゲートすることによって、因子VIII遺伝子中の融合を
作成した。図８及び図９には、pＡＭＬ３Ｐ.８c１(欧州
特許出願公開Ｎo.160,457)の２５１６bpフラグメントと
pＡＭＬ３Ｐ.８c９の１１９９１bpフラグメントをライ
ゲートすることによる、融合領域含有のpＡＭＬ３Ｐ.８
Ｌ１９の構築が示されている。この融合をＤＮＡ配列で
確認した。融合領域を含有している４７２２bpのＣlaＩ
−ＸbaＩフラグメントを、ＣＭＶプロモーター−エンハ
ンサーを含有しているpＦ８ＣＩＳ発現ベクターの５８
２８bpのＣlaＩ−ＸbaＩフラグメントにクローンした。
メチル化がＣlaＩ部位での切断を妨げないＥ.coliのdam
-株からＣＭＶフラグメントを得た。
【００９９】実施例５ 発現の結果 実施例２に記載した方法を、ヌクレオチド７９６から１
５６２までを欠失した因子VIII変異体、pＦ８ＣＩＳ９
０８０の発現に応用した。９０kd＋１４２aa＋８０kdの
融合タンパク質は、完全な長さのタンパク質より高レベ
ルで発現された。しかし、融合タンパク質の発現能力に
ついては細胞種の間でかなりの変動が見られる。
５６２までを欠失した因子VIII変異体、pＦ８ＣＩＳ９
０８０の発現に応用した。９０kd＋１４２aa＋８０kdの
融合タンパク質は、完全な長さのタンパク質より高レベ
ルで発現された。しかし、融合タンパク質の発現能力に
ついては細胞種の間でかなりの変動が見られる。
【０１００】次のデータは、適切な宿主細胞を選択する
ことによって、所望の融合タンパク質の連続製造(商業
的に使用しうる量で)が得られるであろうことを示して
いる。pＦ８ＣＩＳ９０８０でトランスフェクションし
たＴＭ４細胞は、融合タンパク質の一時的な発現および
安定な発現を示した。pＦ８ＣＩＳ９０８０でトランス
フェクションしたＴＭ４細胞は、完全な長さの因子VIII
と比べると、融合タンパク質のレベルで５倍の増加を示
した。１００nＭのメトトレキセイトでプールされた融
合因子VIIIのクローンは、１２mＵ／１０4細胞／日で産
生した。ＨＴＣ細胞は、完全な長さの因子VIIIと比べ
て、融合因子VIIIの発現において同等の増強を示した。
ことによって、所望の融合タンパク質の連続製造(商業
的に使用しうる量で)が得られるであろうことを示して
いる。pＦ８ＣＩＳ９０８０でトランスフェクションし
たＴＭ４細胞は、融合タンパク質の一時的な発現および
安定な発現を示した。pＦ８ＣＩＳ９０８０でトランス
フェクションしたＴＭ４細胞は、完全な長さの因子VIII
と比べると、融合タンパク質のレベルで５倍の増加を示
した。１００nＭのメトトレキセイトでプールされた融
合因子VIIIのクローンは、１２mＵ／１０4細胞／日で産
生した。ＨＴＣ細胞は、完全な長さの因子VIIIと比べ
て、融合因子VIIIの発現において同等の増強を示した。
【０１０１】２９３細胞での融合タンパク質因子VIIIの
発現は、完全な長さの因子VIIIの発現と比べると相当に
高い。融合タンパク質ベクターpＦ８ＣＩＳ９０８０で
形質転換された２９３細胞においては、通常、増幅され
ていない母集団レベル８５mＵ／１０4細胞／日が常法に
よって達成される。完全な長さの因子VIIIの発現レベル
は、融合因子VIIIのものより低く、２.５mＵ／１０4細
胞／日である。コントロールシグナルはpＦ８ＣＩＳお
よびpＦ８ＣＩＳ９０８０で同一であるので、発現レベ
ルでの差異は、完全な長さのメッセージおよび／または
タンパク質を産生する細胞の能力に基づいているにちが
いない。
発現は、完全な長さの因子VIIIの発現と比べると相当に
高い。融合タンパク質ベクターpＦ８ＣＩＳ９０８０で
形質転換された２９３細胞においては、通常、増幅され
ていない母集団レベル８５mＵ／１０4細胞／日が常法に
よって達成される。完全な長さの因子VIIIの発現レベル
は、融合因子VIIIのものより低く、２.５mＵ／１０4細
胞／日である。コントロールシグナルはpＦ８ＣＩＳお
よびpＦ８ＣＩＳ９０８０で同一であるので、発現レベ
ルでの差異は、完全な長さのメッセージおよび／または
タンパク質を産生する細胞の能力に基づいているにちが
いない。
【０１０２】融合タンパク質は完全な長さのもの(１０
００nＭ)より比較的早い増幅時点(１００nＭ)で検出さ
れるが、図１０に示したように、これらの細胞は融合タ
ンパク質の発現によって負担がかけられる。１００nＭ
で９０kd＋１４２aa＋８０kdを発現するＣＨＯ細胞は、
０.５μＵ／１０4細胞／日を産生する。連続的な増幅
は、図１１で観察される混合母集団のゆえに困難であっ
た。１μＭのＭＴＸおよび５μＭのＭＴＸで選択された
クローンは、０.１μＭのＭＴＸでのセルラインより高
いレベルの発現を示さなかった。まとめると、ある種の
宿主細胞は因子VIIIまたはその変異体の発現を特にうま
く行った(たとえば、ＴＭ４)。他の宿主細胞は中間の性
質であり、変異体は発現するが、完全な長さの因子VIII
の発現は低レベルであるか、または全く発現されなかっ
た(たとえば、２９３細胞)。宿主細胞の最後の群は、製
造用の十分な因子VIIIを産生しそうもなかった(たとえ
ば、ＴＲＩ)。
００nＭ)より比較的早い増幅時点(１００nＭ)で検出さ
れるが、図１０に示したように、これらの細胞は融合タ
ンパク質の発現によって負担がかけられる。１００nＭ
で９０kd＋１４２aa＋８０kdを発現するＣＨＯ細胞は、
０.５μＵ／１０4細胞／日を産生する。連続的な増幅
は、図１１で観察される混合母集団のゆえに困難であっ
た。１μＭのＭＴＸおよび５μＭのＭＴＸで選択された
クローンは、０.１μＭのＭＴＸでのセルラインより高
いレベルの発現を示さなかった。まとめると、ある種の
宿主細胞は因子VIIIまたはその変異体の発現を特にうま
く行った(たとえば、ＴＭ４)。他の宿主細胞は中間の性
質であり、変異体は発現するが、完全な長さの因子VIII
の発現は低レベルであるか、または全く発現されなかっ
た(たとえば、２９３細胞)。宿主細胞の最後の群は、製
造用の十分な因子VIIIを産生しそうもなかった(たとえ
ば、ＴＲＩ)。
【０１０３】実施例６ 融合タンパク質の精製および特
徴づけ 完全な長さの組換え因子VIIIについて上記した方法を用
いて、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体を２９３培地か
ら精製した[イートン等(Eaton,D.E. et al.,Biochemist
ry,25,505-512(1986))]。この精製融合体は４,０００〜
６,０００ユニット／ｍｇの比活性を有し、これは血漿
由来の因子VIIIの比活性に匹敵する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかけたとき、この融合体はＭｒが１１５,０００およ
び８０,０００の２つの主なバンドに分かれた。また、
Ｍｒが１８０,０００のバンドも観察されるが、これは
融合体の１本鎖型を示すのであろう。このＭｒが１８
０,０００、１１５,０００および８０,０００であるタ
ンパク質はすべて、ウェスタンブロットにおける因子VI
IIポリクローナル抗体によって検出される(図１４)。
徴づけ 完全な長さの組換え因子VIIIについて上記した方法を用
いて、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体を２９３培地か
ら精製した[イートン等(Eaton,D.E. et al.,Biochemist
ry,25,505-512(1986))]。この精製融合体は４,０００〜
６,０００ユニット／ｍｇの比活性を有し、これは血漿
由来の因子VIIIの比活性に匹敵する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかけたとき、この融合体はＭｒが１１５,０００およ
び８０,０００の２つの主なバンドに分かれた。また、
Ｍｒが１８０,０００のバンドも観察されるが、これは
融合体の１本鎖型を示すのであろう。このＭｒが１８
０,０００、１１５,０００および８０,０００であるタ
ンパク質はすべて、ウェスタンブロットにおける因子VI
IIポリクローナル抗体によって検出される(図１４)。
【０１０４】９０kd＋１４２aa＋８０kdの融合体の凝結
活性は、トロンビンによって１０〜２０倍に活性化され
た(図１５)。この活性化は、Ｍｒが５０,０００、４３,
０００および７３,０００のサブユニットの生成と関係
していた(同上)。また、因子VIIIは血漿中を循環してフ
ォン・ビレブランズ因子(von Willebrands factor、vＷ
Ｆ)と結合するので、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体
のvＷＦへの結合をも試験した。精製した９０kd＋１４
２aa＋８０kd融合体をvＷＦ−セファロースカラムに通
すと、カラムに定量的に結合した(図１６)。次いで、
０.２５Ｍ ＣaＣｌ2(因子VIII−vＷＦの複合体を解離す
ることが知られている)を用いて、融合体をカラムから
溶離した。
活性は、トロンビンによって１０〜２０倍に活性化され
た(図１５)。この活性化は、Ｍｒが５０,０００、４３,
０００および７３,０００のサブユニットの生成と関係
していた(同上)。また、因子VIIIは血漿中を循環してフ
ォン・ビレブランズ因子(von Willebrands factor、vＷ
Ｆ)と結合するので、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体
のvＷＦへの結合をも試験した。精製した９０kd＋１４
２aa＋８０kd融合体をvＷＦ−セファロースカラムに通
すと、カラムに定量的に結合した(図１６)。次いで、
０.２５Ｍ ＣaＣｌ2(因子VIII−vＷＦの複合体を解離す
ることが知られている)を用いて、融合体をカラムから
溶離した。
【０１０５】上のデータは、２９３細胞から発現され分
泌された９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体が血漿由来の
因子VIIIと機能的に同等であることを示した。９０kd＋
１４２aa＋８０kd融合体は血友病患者の血漿の凝固時間
を短縮し、その活性は因子VIIIの抗体によって中和され
た。この融合体は、血漿由来の因子VIIIと同様、トロン
ビンによって活性化され、プロセッシングされた。ま
た、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体はセファロースに
固定されたvＷＦにも結合し、因子VIII−vＷＦの複合体
を解離することが知られている条件下でvＷＦから解離
した。
泌された９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体が血漿由来の
因子VIIIと機能的に同等であることを示した。９０kd＋
１４２aa＋８０kd融合体は血友病患者の血漿の凝固時間
を短縮し、その活性は因子VIIIの抗体によって中和され
た。この融合体は、血漿由来の因子VIIIと同様、トロン
ビンによって活性化され、プロセッシングされた。ま
た、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合体はセファロースに
固定されたvＷＦにも結合し、因子VIII−vＷＦの複合体
を解離することが知られている条件下でvＷＦから解離
した。
【０１０６】実施例７ 融合タンパク質の凝結活性 pＦ８ＣＩＳ９０８０でトランスフェクションした２９
３細胞によって４８時間調整した血清不含培地を、凝結
分析により、因子VIIIの凝結活性について検定した。培
地を１／５０に希釈した後、検定を行い、１２０秒から
５８.９秒まで(５.５ユニット／ｍｌの因子VIIIの凝結
活性に対応する)血友病患者の血漿の凝固時間を短縮す
ることがわかった。この活性は、血漿由来の因子VIIIに
対するポリクローナル抗体によって中和された(表２)。
３細胞によって４８時間調整した血清不含培地を、凝結
分析により、因子VIIIの凝結活性について検定した。培
地を１／５０に希釈した後、検定を行い、１２０秒から
５８.９秒まで(５.５ユニット／ｍｌの因子VIIIの凝結
活性に対応する)血友病患者の血漿の凝固時間を短縮す
ることがわかった。この活性は、血漿由来の因子VIIIに
対するポリクローナル抗体によって中和された(表２)。
【０１０７】
【表２】 *希釈されていない培地中 表２は２９３培地における凝結活性を示すものである。
【０１０８】血友病患者の血漿(５０μｌ)を、プラテリ
ン[platelin;ゼネラル・ジアグノスティックス(General
Diagnostics)]５０μｌとともに、３７℃で８分間、イ
ンキュベートした。次いで、０.０１％ＢＳＡを含有す
る０.０５Ｍトリス(pＨ７.４)緩衝液で１／５０に希釈
した培地５０μｌを加え、３０秒間インキュベートし
た。２５mＭのＣaＣｌ2を５０μｌ加え、凝固時間を測
定した。トランスフェクションされていない親セルライ
ンから得た培地は希釈しなかった。抗体中和の実験は、
室温で３０分間、希釈されていない培地(１００μｌ)を
因子VIIIのポリクローナル抗体１０μｇで予めインキュ
ベートすることによって行った。次いで、培地を希釈
し、検定した。
ン[platelin;ゼネラル・ジアグノスティックス(General
Diagnostics)]５０μｌとともに、３７℃で８分間、イ
ンキュベートした。次いで、０.０１％ＢＳＡを含有す
る０.０５Ｍトリス(pＨ７.４)緩衝液で１／５０に希釈
した培地５０μｌを加え、３０秒間インキュベートし
た。２５mＭのＣaＣｌ2を５０μｌ加え、凝固時間を測
定した。トランスフェクションされていない親セルライ
ンから得た培地は希釈しなかった。抗体中和の実験は、
室温で３０分間、希釈されていない培地(１００μｌ)を
因子VIIIのポリクローナル抗体１０μｇで予めインキュ
ベートすることによって行った。次いで、培地を希釈
し、検定した。
【０１０９】実施例８ 活性化されたタンパク質Ｃに耐
性な因子VIII変異体の発現ベクター 活性化されたタンパク質Ｃ(ＡＰＣ)、すなわち血漿タン
パク質は、限定されたタンパク質加水分解によってヒト
因子VIIIを不活性化することがわかっていた。この不活
性化切断が可能な部位の１つは、位置３３６のアルギニ
ンである。この位置３３６のアルギニンを他のアミノ
酸、たとえばリジンまたはグルタミン酸に変えることが
できる。２種類のベクター、pＦ８ＣＩＳ３３６Ｅおよ
びpＦ８ＣＩＳ９０８０−３３６Ｅを構築して、位置３
３６が不活性化の部位であるかどうかを調べた。インビ
トロでの突然変異誘発[ノリス等(Norris,K. et al.,Nuc
leic Acids Research,11,5103-5112(1983))]を用いて、
位置３３６のアルギニンをグルタミン酸に変えた(図１
２)。突然変異誘発のために、pＦ８ＣＩＳからの７９２
bpのＨindIII−ＫpnＩフラグメントを、m１３のＨindII
I−ＫpnＩ部位に挿入した。以下に示す１８bpのオリゴ
マーを用いてこのフラグメントを突然変異させた。
性な因子VIII変異体の発現ベクター 活性化されたタンパク質Ｃ(ＡＰＣ)、すなわち血漿タン
パク質は、限定されたタンパク質加水分解によってヒト
因子VIIIを不活性化することがわかっていた。この不活
性化切断が可能な部位の１つは、位置３３６のアルギニ
ンである。この位置３３６のアルギニンを他のアミノ
酸、たとえばリジンまたはグルタミン酸に変えることが
できる。２種類のベクター、pＦ８ＣＩＳ３３６Ｅおよ
びpＦ８ＣＩＳ９０８０−３３６Ｅを構築して、位置３
３６が不活性化の部位であるかどうかを調べた。インビ
トロでの突然変異誘発[ノリス等(Norris,K. et al.,Nuc
leic Acids Research,11,5103-5112(1983))]を用いて、
位置３３６のアルギニンをグルタミン酸に変えた(図１
２)。突然変異誘発のために、pＦ８ＣＩＳからの７９２
bpのＨindIII−ＫpnＩフラグメントを、m１３のＨindII
I−ＫpnＩ部位に挿入した。以下に示す１８bpのオリゴ
マーを用いてこのフラグメントを突然変異させた。
【化３】
【０１１０】鎖の延長に次いで、２本鎖の突然変異Ｍ１
３クローンをＡccＩおよびＫpnＩで切断した。７７８bp
のフラグメントをゲル精製した。プラスミドpＦ８ＣＩ
Ｓを、Ｅ.coliのdam-株、ＧＭ４８中で増殖した。図１
で示されるＰstＩ−ＣlaＩリンカー配列により、このプ
ラスミドを上記のようなメチル化陽性の細菌株中で増殖
させるときには、pＦ８ＣＩＳのＣlaＩ部位は切断され
ないであろう。dam- pＦ８ＣＩＳ ＤＮＡから２種類の
フラグメント、１０kbのＫpnＩ部分−ＣlaＩフラグメン
トおよび１１０８bpのＣlaＩ−ＡccＩフラグメントを単
離した。３成分ライゲートは、天然の因子VIII配列を突
然変異配列に置換することを必要とした(図１２参照)。
３クローンをＡccＩおよびＫpnＩで切断した。７７８bp
のフラグメントをゲル精製した。プラスミドpＦ８ＣＩ
Ｓを、Ｅ.coliのdam-株、ＧＭ４８中で増殖した。図１
で示されるＰstＩ−ＣlaＩリンカー配列により、このプ
ラスミドを上記のようなメチル化陽性の細菌株中で増殖
させるときには、pＦ８ＣＩＳのＣlaＩ部位は切断され
ないであろう。dam- pＦ８ＣＩＳ ＤＮＡから２種類の
フラグメント、１０kbのＫpnＩ部分−ＣlaＩフラグメン
トおよび１１０８bpのＣlaＩ−ＡccＩフラグメントを単
離した。３成分ライゲートは、天然の因子VIII配列を突
然変異配列に置換することを必要とした(図１２参照)。
【０１１１】pＦ８９０８０−３３６Ｅの構築は、図１
３に示したような別の３成分ライゲートによって行っ
た。pＦ８ＣＩＳ９０８０から単離した８５６４bpのＢg
lII−ＳacIIフラグメントおよび８９１bpのＳacII−Ｓp
eＩフラグメントにライゲートすることによって、３３
６Ｅ変異アミノ酸を含有する１１１５bpのＳpeＩ−Ｂgl
IIフラグメントを移して、別の変異融合タンパク質を創
製した。
３に示したような別の３成分ライゲートによって行っ
た。pＦ８ＣＩＳ９０８０から単離した８５６４bpのＢg
lII−ＳacIIフラグメントおよび８９１bpのＳacII−Ｓp
eＩフラグメントにライゲートすることによって、３３
６Ｅ変異アミノ酸を含有する１１１５bpのＳpeＩ−Ｂgl
IIフラグメントを移して、別の変異融合タンパク質を創
製した。
【０１１２】これらタンパク質変異体の両者とも２９３
細胞中で発現した。この突然変異を有する完全な長さの
因子VIIIは２.８mＵ／１０4細胞／日で発現し、一方、
融合変異体は１５mＵ／１０4細胞／日で発現した。
細胞中で発現した。この突然変異を有する完全な長さの
因子VIIIは２.８mＵ／１０4細胞／日で発現し、一方、
融合変異体は１５mＵ／１０4細胞／日で発現した。
【０１１３】実施例９ 活性化されたタンパク質Ｃに耐
性な因子VIIIの活性 pＦ８ＣＩＳ−３３６Ｅでトランスフェクションされた
２９３細胞から得られた培地は、血友病患者の血漿の凝
固時間を短縮した。この活性は、因子VIIIのポリクロー
ナル抗体によって中和された(表３)。しかし、位置３３
６にグルタミン酸を含有する組換え因子VIIIは、活性化
されたタンパク質Ｃによって不活化されなかった(表
３)。
性な因子VIIIの活性 pＦ８ＣＩＳ−３３６Ｅでトランスフェクションされた
２９３細胞から得られた培地は、血友病患者の血漿の凝
固時間を短縮した。この活性は、因子VIIIのポリクロー
ナル抗体によって中和された(表３)。しかし、位置３３
６にグルタミン酸を含有する組換え因子VIIIは、活性化
されたタンパク質Ｃによって不活化されなかった(表
３)。
【０１１４】
【表３】試料 凝固時間 ユニット/ｍｌ 293ー336E 70.4 0.8 rVIII 65.8 1.1 293ー336E培地＋APC 68.5 0.9 rVIII＋APC 85.0 0.28 293ー336E培地(因子VIIIの ポリクローナルで予め インキュベートした) 95.0 ＜0.1
【０１１５】表３は、活性化されたタンパク質Ｃに対す
る完全な長さの因子VIII／３３６Ｅの安定性を示すもの
である。完全な長さの因子VIII／３３６Ｅを産生する、
トランスフェクションされた２９３細胞で４８時間調整
した血清不含培地(表中、「293ー336E」で表す)を２７倍に
濃縮した。この培地１００μｌに、ウサギ脳セファリン
１０μｌおよびＡＰＣ１０.０nｇを加えた。対照群には
ＡＰＣを加えなかった。試料を３７℃で４０分間インキ
ュベートした。同様に、位置３３６にアルギニンを含有
する精製した組換え因子VIII(rVIII)を、０.０５Ｍトリ
ス(pＨ７.５)、１５０mＭ ＮaＣｌ、２.５mＭ ＣaＣｌ2
で〜１ユニット／ｍｌに希釈し、ウサギ脳セファリンお
よびＡＰＣとともにインキュベートした。また、完全な
長さの因子VIII／３３６Ｅ(２６λ)を産生する、トラン
スフェクションされた２９３細胞からの培地を、３７℃
で４０分間、因子VIIIのポリクローナル抗体(ＩgＧ調製
物１μｌ)で予めインキュベートした。インキュベート
の後、凝結分析によって試料を検定した。
る完全な長さの因子VIII／３３６Ｅの安定性を示すもの
である。完全な長さの因子VIII／３３６Ｅを産生する、
トランスフェクションされた２９３細胞で４８時間調整
した血清不含培地(表中、「293ー336E」で表す)を２７倍に
濃縮した。この培地１００μｌに、ウサギ脳セファリン
１０μｌおよびＡＰＣ１０.０nｇを加えた。対照群には
ＡＰＣを加えなかった。試料を３７℃で４０分間インキ
ュベートした。同様に、位置３３６にアルギニンを含有
する精製した組換え因子VIII(rVIII)を、０.０５Ｍトリ
ス(pＨ７.５)、１５０mＭ ＮaＣｌ、２.５mＭ ＣaＣｌ2
で〜１ユニット／ｍｌに希釈し、ウサギ脳セファリンお
よびＡＰＣとともにインキュベートした。また、完全な
長さの因子VIII／３３６Ｅ(２６λ)を産生する、トラン
スフェクションされた２９３細胞からの培地を、３７℃
で４０分間、因子VIIIのポリクローナル抗体(ＩgＧ調製
物１μｌ)で予めインキュベートした。インキュベート
の後、凝結分析によって試料を検定した。
【０１１６】実施例１０ プロリラキシンの発現ベクタ
ー １.pＣＩＨＲＸ ベクターpＣＩＨＲＸに、サイトメガロウィルスのエン
ハンサーおよびプロモーター、サイトメガロウィルスの
スプライス供与部位、Ｉg可変領域スプライス受容部
位、Ｈ２プレプロリラキシンをコードしているcＤＮ
Ａ、ならびに肝炎表面抗原のポリアデニル化および転写
終止部位を含有させた。図１７及び図１８にプロリラキ
シンベクター構築の工程を示す。Ｉg可変領域からの、
前記と同じイントロンおよびスプライス受容配列を保持
させた。６７７bpのプレプロリラキシンcＤＮＡを、こ
れら５'プロセッシングシグナルに続けた。この５'コン
トロールシグナルはpＦ８ＣＩＳのものと同じである
が、ポリアデニル化領域および終止配列シグナルは、Ｓ
Ｖ４０の代わりに肝炎表面抗原遺伝子から得た。
ー １.pＣＩＨＲＸ ベクターpＣＩＨＲＸに、サイトメガロウィルスのエン
ハンサーおよびプロモーター、サイトメガロウィルスの
スプライス供与部位、Ｉg可変領域スプライス受容部
位、Ｈ２プレプロリラキシンをコードしているcＤＮ
Ａ、ならびに肝炎表面抗原のポリアデニル化および転写
終止部位を含有させた。図１７及び図１８にプロリラキ
シンベクター構築の工程を示す。Ｉg可変領域からの、
前記と同じイントロンおよびスプライス受容配列を保持
させた。６７７bpのプレプロリラキシンcＤＮＡを、こ
れら５'プロセッシングシグナルに続けた。この５'コン
トロールシグナルはpＦ８ＣＩＳのものと同じである
が、ポリアデニル化領域および終止配列シグナルは、Ｓ
Ｖ４０の代わりに肝炎表面抗原遺伝子から得た。
【０１１７】始めに、中間体プラスミドpＣlaＲＸを構
築した。プラスミドpＳＶＥＲＸ[同時継続の米国特許出
願 U.S.S.N.06/907,197(１９８６年９月１２日出願)を
参照]をＨindIIIで切断して、プレ−プロリラキシンcＤ
ＮＡ、続いて肝炎Ｂ表面抗原(ＨＢsＡg)３'ポリアデニ
ル化部位を含有する１７００bpのフラグメントを単離し
た。ＫpnＩ部位は、このベクターにおいてＤＨＦＲ cＤ
ＮＡの発現のために用いられる、ＳＶ４０初期プロモー
ターの始まりの５'側、かつＨＢsＡgポリアデニル化部
位の３'側にある。
築した。プラスミドpＳＶＥＲＸ[同時継続の米国特許出
願 U.S.S.N.06/907,197(１９８６年９月１２日出願)を
参照]をＨindIIIで切断して、プレ−プロリラキシンcＤ
ＮＡ、続いて肝炎Ｂ表面抗原(ＨＢsＡg)３'ポリアデニ
ル化部位を含有する１７００bpのフラグメントを単離し
た。ＫpnＩ部位は、このベクターにおいてＤＨＦＲ cＤ
ＮＡの発現のために用いられる、ＳＶ４０初期プロモー
ターの始まりの５'側、かつＨＢsＡgポリアデニル化部
位の３'側にある。
【０１１８】プレプロリラキシンＤＮＡは、ＨpaIIで完
全消化し、続いてＨinfＩで部分消化することによっ
て、ハドソン等[Hudson,P. et al.,The EMBO Journal,
3,2333-2339]が開示したクローニングベクターから切り
出すことができる。配列 5'-ATGCCTCGCCTGTTT-3' の１
本鎖ＤＮＡプライマー(ＡＴＧプライマー)を合成し、プ
レプロリラキシンのＤＮＡセグメントと混合し、プレプ
ロリラキシンセグメントの鎖を分けるために混合物を煮
沸し、そして冷却してＡＴＧ-プライマーをプレプロリ
ラキシンのアンチセンスＤＮＡ鎖とアニーリングさせ
た。
全消化し、続いてＨinfＩで部分消化することによっ
て、ハドソン等[Hudson,P. et al.,The EMBO Journal,
3,2333-2339]が開示したクローニングベクターから切り
出すことができる。配列 5'-ATGCCTCGCCTGTTT-3' の１
本鎖ＤＮＡプライマー(ＡＴＧプライマー)を合成し、プ
レプロリラキシンのＤＮＡセグメントと混合し、プレプ
ロリラキシンセグメントの鎖を分けるために混合物を煮
沸し、そして冷却してＡＴＧ-プライマーをプレプロリ
ラキシンのアンチセンスＤＮＡ鎖とアニーリングさせ
た。
【０１１９】次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ
フラグメントを用いて、ＡＴＧ-プライマーを、プレプ
ロリラキシンＤＮＡセグメントの末端近くまで３'方向
に延長した。さらに、クレノウフラグメントの３'→５'
エキソヌクレアーゼ加水分解的な活性は、プレプロリラ
キシンのアンチセンス鎖の３'末端を、ＡＴＧ-プライマ
ーの５'末端「Ａ」の対の塩基であるヌクレオチドまで正
確に分解し、こうしてこの末端を平滑末端にした。この
新しい２本鎖プレプロリラキシンセグメントを、プレプ
ロリラキシンセグメントの３'非翻訳化領域中のＡvaII
部位のところで消化し、このＡvaII末端をクレノウフラ
グメント酵素で充填してこの末端を平滑末端にした。
フラグメントを用いて、ＡＴＧ-プライマーを、プレプ
ロリラキシンＤＮＡセグメントの末端近くまで３'方向
に延長した。さらに、クレノウフラグメントの３'→５'
エキソヌクレアーゼ加水分解的な活性は、プレプロリラ
キシンのアンチセンス鎖の３'末端を、ＡＴＧ-プライマ
ーの５'末端「Ａ」の対の塩基であるヌクレオチドまで正
確に分解し、こうしてこの末端を平滑末端にした。この
新しい２本鎖プレプロリラキシンセグメントを、プレプ
ロリラキシンセグメントの３'非翻訳化領域中のＡvaII
部位のところで消化し、このＡvaII末端をクレノウフラ
グメント酵素で充填してこの末端を平滑末端にした。
【０１２０】次いで、このフラグメントを、ＥcoＲＩで
切断してその末端をクレノウフラグメント酵素で充填し
ておいたプラスミドtrp２０７−１＊tetxap[グレイ等(G
ray,G.L. et al.,Gene,39,247-254(1985))]中に平滑末
端ライゲートした。グレイ等(上記)が開示したこのプラ
スミドは、ＡvaＩ−ＰvuIIセグメントが削除されてお
り、trpプロモーターの５'側のＥcoＲＩ部位が除かれて
いる。正しい配向でプレプロリラキシンセグメントを含
有しているプラスミドを選択した後、このプレプロリラ
キシンのtrp２０７−１＊tetxapプラスミドをＣlaＩで
消化し、その末端をクレノウで充填した。この直線化し
たプラスミドをＸbaＩでさらに消化し、プレプロリラキ
シンのセグメントをゲル電気泳動で単離した。
切断してその末端をクレノウフラグメント酵素で充填し
ておいたプラスミドtrp２０７−１＊tetxap[グレイ等(G
ray,G.L. et al.,Gene,39,247-254(1985))]中に平滑末
端ライゲートした。グレイ等(上記)が開示したこのプラ
スミドは、ＡvaＩ−ＰvuIIセグメントが削除されてお
り、trpプロモーターの５'側のＥcoＲＩ部位が除かれて
いる。正しい配向でプレプロリラキシンセグメントを含
有しているプラスミドを選択した後、このプレプロリラ
キシンのtrp２０７−１＊tetxapプラスミドをＣlaＩで
消化し、その末端をクレノウで充填した。この直線化し
たプラスミドをＸbaＩでさらに消化し、プレプロリラキ
シンのセグメントをゲル電気泳動で単離した。
【０１２１】真核生物性発現ベクターp３４２Ｅ[クロウ
リー等(Crowley,C.W. et al.,Mol.Cell.Biol.,3,44-55
(1983))]をＢamＨＩで消化し、その末端をクレノウで充
填し、このベクターをさらにＸbaＩで消化し、このベク
ターのフラグメントをゲル電気泳動で単離した。パッツ
ァー等[Patzer,E.J. et al.,J.Virol.,51,346-353(198
4)]の開示のようにして、ＤＨＦＲをコードしているＤ
ＮＡを付加することによってp３４２Ｅプラスミドを修
飾した。クロウリー等(上記)が開示したプラスミドは、
合成ポリリンカー[ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ(New England Biolabs)からの市販品を利用すること
ができる]を用いて、ＳＶ４０初期プロモーターに続け
て付加したＸbaＩ部位を有している。このプラスミドを
pＳＶＣＶ２０２と命名した。次いで、このベクターフ
ラグメントをＸbaＩ-ＣlaＩプレプロリラキシンフラグ
メントにライゲートし、真核生物性発現プラスミドpＳ
Ｖプレプロリラキシン１５７(「pＳＶＥＲＸ」とも称され
る)を得た。
リー等(Crowley,C.W. et al.,Mol.Cell.Biol.,3,44-55
(1983))]をＢamＨＩで消化し、その末端をクレノウで充
填し、このベクターをさらにＸbaＩで消化し、このベク
ターのフラグメントをゲル電気泳動で単離した。パッツ
ァー等[Patzer,E.J. et al.,J.Virol.,51,346-353(198
4)]の開示のようにして、ＤＨＦＲをコードしているＤ
ＮＡを付加することによってp３４２Ｅプラスミドを修
飾した。クロウリー等(上記)が開示したプラスミドは、
合成ポリリンカー[ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ(New England Biolabs)からの市販品を利用すること
ができる]を用いて、ＳＶ４０初期プロモーターに続け
て付加したＸbaＩ部位を有している。このプラスミドを
pＳＶＣＶ２０２と命名した。次いで、このベクターフ
ラグメントをＸbaＩ-ＣlaＩプレプロリラキシンフラグ
メントにライゲートし、真核生物性発現プラスミドpＳ
Ｖプレプロリラキシン１５７(「pＳＶＥＲＸ」とも称され
る)を得た。
【０１２２】プラスミドpＳＶＥＲＸをＨindIII切断し
て得たフラグメントを、ＨindIII部位で直線化したpＭ
Ｌ中に挿入した。細菌性アルカリホスファターゼ(ＢＡ
Ｐ)で処理して再閉環を最小にした。アンピシリン耐性
コロニーをスクリーニングして、プレ−プロリラキシン
遺伝子の５'末端がpＭＬのＣlaＩ部位の次に来るように
挿入されたクローンを単離した。
て得たフラグメントを、ＨindIII部位で直線化したpＭ
Ｌ中に挿入した。細菌性アルカリホスファターゼ(ＢＡ
Ｐ)で処理して再閉環を最小にした。アンピシリン耐性
コロニーをスクリーニングして、プレ−プロリラキシン
遺伝子の５'末端がpＭＬのＣlaＩ部位の次に来るように
挿入されたクローンを単離した。
【０１２３】中間体プラスミドpＣlＡＲＸをＣlaＩおよ
びＫpnＩで切断して、プレ−プロリラキシン遺伝子、続
いて肝炎表面抗原３'ポリアデニル化配列を含有してい
る１３６０bpのフラグメントを単離した。このフラグメ
ントを、pＦ８ＣＩＳ dam-をＣlaＩおよびＫpnＩで切断
することによって創製した５１４３bpのフラグメントに
ライゲートした。
びＫpnＩで切断して、プレ−プロリラキシン遺伝子、続
いて肝炎表面抗原３'ポリアデニル化配列を含有してい
る１３６０bpのフラグメントを単離した。このフラグメ
ントを、pＦ８ＣＩＳ dam-をＣlaＩおよびＫpnＩで切断
することによって創製した５１４３bpのフラグメントに
ライゲートした。
【０１２４】２.pＣＩＳＲＸ ポリアデニル化配列の選択はメッセンジャーＲＮＡの
５'プロセッシングに影響することが知られているので
[ウィルソンおよびネビンズ(Wilson & Nevins)、上
記]、pＣＩＨＲＸ中の３'肝炎ポリアデニル化配列をpＳ
Ｖ４０ポリアデニル化配列に置き換えた。この構築物を
pＣＩＳＲＸと命名した。この構築のための２種類の出
発ベクターはpＣＩＨＲＸおよびpＦ８ＣＩＳである。後
者のベクターはpＣＩＨＲＸと同じ５'コントロールを有
しているが、因子VIIIのcＤＮＡおよびＳＶ４０のポリ
アデニル化部位を含有している。ＳacIIを用いてこのc
ＤＮＡの３'を切断した。得られた３'側の出っ張り部分
をＴ４ポリメラーゼで平滑にした。次いで、pＣＩＨＲ
ＸをＢamＨＩで切断した。この部位は、キメライントロ
ンとリラキシン遺伝子の５'末端を分けている。８６１b
pのフラグメントをＢamＨＩ処理物からゲル単離した。
ＳＶ４０のポリアデニル化部位、ＤＨＦＲ、転写ユニッ
ト、細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにＣＭ
Ｖのエンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス
供与部をpＦ８ＣＩＳから単離した。これらの成分を２
つのフラグメント、すなわち２５２５bpのＳalＩ−Ｂam
ＨＩフラグメントおよび３１１３bpのＨpaＩ−ＳalＩフ
ラグメントとして単離した。ＢamＨＩ−ＳacII(平滑)フ
ラグメントと、ＨpaＩ−ＳalＩフラグメントおよびＳal
Ｉ−ＢamＨＩフラグメントとの３成分ライゲートによっ
てpＣＩＳＲＸを得た。
５'プロセッシングに影響することが知られているので
[ウィルソンおよびネビンズ(Wilson & Nevins)、上
記]、pＣＩＨＲＸ中の３'肝炎ポリアデニル化配列をpＳ
Ｖ４０ポリアデニル化配列に置き換えた。この構築物を
pＣＩＳＲＸと命名した。この構築のための２種類の出
発ベクターはpＣＩＨＲＸおよびpＦ８ＣＩＳである。後
者のベクターはpＣＩＨＲＸと同じ５'コントロールを有
しているが、因子VIIIのcＤＮＡおよびＳＶ４０のポリ
アデニル化部位を含有している。ＳacIIを用いてこのc
ＤＮＡの３'を切断した。得られた３'側の出っ張り部分
をＴ４ポリメラーゼで平滑にした。次いで、pＣＩＨＲ
ＸをＢamＨＩで切断した。この部位は、キメライントロ
ンとリラキシン遺伝子の５'末端を分けている。８６１b
pのフラグメントをＢamＨＩ処理物からゲル単離した。
ＳＶ４０のポリアデニル化部位、ＤＨＦＲ、転写ユニッ
ト、細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにＣＭ
Ｖのエンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス
供与部をpＦ８ＣＩＳから単離した。これらの成分を２
つのフラグメント、すなわち２５２５bpのＳalＩ−Ｂam
ＨＩフラグメントおよび３１１３bpのＨpaＩ−ＳalＩフ
ラグメントとして単離した。ＢamＨＩ−ＳacII(平滑)フ
ラグメントと、ＨpaＩ−ＳalＩフラグメントおよびＳal
Ｉ−ＢamＨＩフラグメントとの３成分ライゲートによっ
てpＣＩＳＲＸを得た。
【０１２５】実施例１１ プロリラキシンの発現 ２種類のリラキシン発現ベクターpＣＩＨＲＸおよびpＣ
ＩＳＲＸの発現能力を、前記の免疫ペルオキシダーゼ法
で、数種の抗−リラキシン抗体を用いて検定した。３種
のウサギポリクローナル抗体および３種のマウスモノク
ローナル抗体を、pＳＶＥＲＸでトランスフェクション
したＣＯＳ細胞について試験した。モノクローナルＲＸ
−Ｉはバックグラウンドのない強い染色を与えることが
わかった。本発明の２つのベクターpＣＩＨＲＸおよびp
ＣＩＳＲＸをプロリラキシンの発現について試験し、p
ＳＶＥＲＸと比較した。pＣＩＨＲＸおよびpＣＩＳＲＸ
ベクターはポリアデニル化配列が異なっている。pＣＩ
ＨＲＸには肝炎表面抗原のポリアデニル化配列を含有さ
せたが、pＣＩＳＲＸにはＳＶ４０初期領域のポリアデ
ニル化配列を含有させた。
ＩＳＲＸの発現能力を、前記の免疫ペルオキシダーゼ法
で、数種の抗−リラキシン抗体を用いて検定した。３種
のウサギポリクローナル抗体および３種のマウスモノク
ローナル抗体を、pＳＶＥＲＸでトランスフェクション
したＣＯＳ細胞について試験した。モノクローナルＲＸ
−Ｉはバックグラウンドのない強い染色を与えることが
わかった。本発明の２つのベクターpＣＩＨＲＸおよびp
ＣＩＳＲＸをプロリラキシンの発現について試験し、p
ＳＶＥＲＸと比較した。pＣＩＨＲＸおよびpＣＩＳＲＸ
ベクターはポリアデニル化配列が異なっている。pＣＩ
ＨＲＸには肝炎表面抗原のポリアデニル化配列を含有さ
せたが、pＣＩＳＲＸにはＳＶ４０初期領域のポリアデ
ニル化配列を含有させた。
【０１２６】２９３、ＴＭ４およびＣＨＯ細胞を、pＲ
ＳＶneo １μｇ、サケ精子担体 ５μｇならびにプラス
ミドpＳＶＥＲＸ、pＣＩＨＲＸおよびpＣＩＳＲＸ ４μ
ｇを含有する全量１０μｇのＤＮＡでトランスフェクシ
ョンした。前記のようにして細胞にグリセリンショック
を与えた。トランスフェクションの３６時間後に、細胞
を固定し、ＩＨ６で染色してプロリラキシンを産生する
形質転換細胞を同定した。pＣＩＨＲＸおよびpＣＩＳＲ
Ｘでトランスフェクションした２９３およびＴＭ４細胞
において、陽性に染色される細胞が観察された。ＣＨ
Ｏ、２９３およびＴＭ４細胞の複製プレートを分割し、
前記の染色プロトコールにかけてプロリラキシン産生細
胞をスクリーニングした。
ＳＶneo １μｇ、サケ精子担体 ５μｇならびにプラス
ミドpＳＶＥＲＸ、pＣＩＨＲＸおよびpＣＩＳＲＸ ４μ
ｇを含有する全量１０μｇのＤＮＡでトランスフェクシ
ョンした。前記のようにして細胞にグリセリンショック
を与えた。トランスフェクションの３６時間後に、細胞
を固定し、ＩＨ６で染色してプロリラキシンを産生する
形質転換細胞を同定した。pＣＩＨＲＸおよびpＣＩＳＲ
Ｘでトランスフェクションした２９３およびＴＭ４細胞
において、陽性に染色される細胞が観察された。ＣＨ
Ｏ、２９３およびＴＭ４細胞の複製プレートを分割し、
前記の染色プロトコールにかけてプロリラキシン産生細
胞をスクリーニングした。
【０１２７】発現の結果を次表に示すが、プロリラキシ
ンをコードしているＤＮＡの５'に安定化配列を含有す
るベクターは、対照プラスミドpＳＶＥＲＸよりかなり
高レベルでプロリラキシンを産生することがわかる。安
定な発現の場合、プロリラキシンの培地検定は、細胞の
全集団で行った。
ンをコードしているＤＮＡの５'に安定化配列を含有す
るベクターは、対照プラスミドpＳＶＥＲＸよりかなり
高レベルでプロリラキシンを産生することがわかる。安
定な発現の場合、プロリラキシンの培地検定は、細胞の
全集団で行った。
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】実施例１２ t-ＰＡの発現ベクター １.pＣＩＨt-ＰＡ サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモータ
ー、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位および
イントロン、Ｉg可変領域スプライス受容部位、t-ＰＡ
をコードしているcＤＮＡ[ペニカ等(Pennica et al.,Na
ture,301,214(1983))]、ならびに肝炎表面抗原ポリアデ
ニル化および転写終止部位を含有するベクターpＣＩＨt
-ＰＡを構築した。このt-ＰＡベクター構築の工程を図
２０及び図２１に示す。
ー、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位および
イントロン、Ｉg可変領域スプライス受容部位、t-ＰＡ
をコードしているcＤＮＡ[ペニカ等(Pennica et al.,Na
ture,301,214(1983))]、ならびに肝炎表面抗原ポリアデ
ニル化および転写終止部位を含有するベクターpＣＩＨt
-ＰＡを構築した。このt-ＰＡベクター構築の工程を図
２０及び図２１に示す。
【０１３１】始めに、t-ＰＡのcＤＮＡをpＭＬ中にクロ
ーンしてこの遺伝子の５'末端にＣlaＩ部位を得た。こ
れを行うため、pＳＶpa−ＤＨＦＲ(これ以外に、英国特
許 2,119,804 BではpＥＴＰＦＲと呼ばれる)からの３２
３８bpのＨindIIIフラグメントをpＭＬのＨindIII部位
に挿入した。ＣlaＩ部位に並列してcＤＮＡの５'末端を
有するクローンについてコロニーをスクリーニングし
た。このpＣＬＡt-ＰＡと命名した中間プラスミドを図
２０及び図２１に示す。３'側にポリアデニル化領域が
続くt-ＰＡのcＤＮＡを、２８７０bpのＣlaＩ−ＫpnＩ
フラグメントとして単離した。このフラグメントをpＦ
８ＣＩＳの５１４６bpフラグメントにライゲートした。
このＣＩＳベクターのＣlaＩ−ＫpnＩフラグメントは、
５'コントロール領域、ＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニッ
ト、アンピシリン耐性遺伝子およびpＭＬ由来の起源領
域を与えた。pＣＩＨt-ＰＡは、所望の異種遺伝子をコ
ードしているcＤＮＡを除いて、前述したpＣＩＨＲＸに
類似している。
ーンしてこの遺伝子の５'末端にＣlaＩ部位を得た。こ
れを行うため、pＳＶpa−ＤＨＦＲ(これ以外に、英国特
許 2,119,804 BではpＥＴＰＦＲと呼ばれる)からの３２
３８bpのＨindIIIフラグメントをpＭＬのＨindIII部位
に挿入した。ＣlaＩ部位に並列してcＤＮＡの５'末端を
有するクローンについてコロニーをスクリーニングし
た。このpＣＬＡt-ＰＡと命名した中間プラスミドを図
２０及び図２１に示す。３'側にポリアデニル化領域が
続くt-ＰＡのcＤＮＡを、２８７０bpのＣlaＩ−ＫpnＩ
フラグメントとして単離した。このフラグメントをpＦ
８ＣＩＳの５１４６bpフラグメントにライゲートした。
このＣＩＳベクターのＣlaＩ−ＫpnＩフラグメントは、
５'コントロール領域、ＳＶ４０−ＤＨＦＲ転写ユニッ
ト、アンピシリン耐性遺伝子およびpＭＬ由来の起源領
域を与えた。pＣＩＨt-ＰＡは、所望の異種遺伝子をコ
ードしているcＤＮＡを除いて、前述したpＣＩＨＲＸに
類似している。
【０１３２】ＣＨＯおよび２９３細胞をpＳＶpaＤＨＦ
Ｒ、pＣＭＶt-ＰＡおよびpＣＩＨt-ＰＡでトランスフェ
クションすることによってt-ＰＡの発現レベルを比較し
た。前２つのベクターは安定化配列を含有していないの
で、本発明に従って構築された、t-ＰＡをコードしてい
るcＤＮＡを含有するベクターpＣＩＨt-ＰＡの対照とし
て働く。培養した形質転換２９３細胞それぞれからの培
地を検定し、次の結果を得た:pＳＶpaＤＨＦＲ、３０n
ｇ／ｍｌ;pＣＭＶt-ＰＡ、２００nｇ／ｍｌのt-ＰＡ;お
よびpＣＩＨt-ＰＡ、４２０nｇ／ｍｌのt-ＰＡ。
Ｒ、pＣＭＶt-ＰＡおよびpＣＩＨt-ＰＡでトランスフェ
クションすることによってt-ＰＡの発現レベルを比較し
た。前２つのベクターは安定化配列を含有していないの
で、本発明に従って構築された、t-ＰＡをコードしてい
るcＤＮＡを含有するベクターpＣＩＨt-ＰＡの対照とし
て働く。培養した形質転換２９３細胞それぞれからの培
地を検定し、次の結果を得た:pＳＶpaＤＨＦＲ、３０n
ｇ／ｍｌ;pＣＭＶt-ＰＡ、２００nｇ／ｍｌのt-ＰＡ;お
よびpＣＩＨt-ＰＡ、４２０nｇ／ｍｌのt-ＰＡ。
【０１３３】２.pＣＩＳt-ＰＡ サイトメガロウィルスのエンハンサーおよびプロモータ
ー、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位および
イントロン、Ｉg可変領域スプライス受容部位、t-ＰＡ
をコードしているcＤＮＡならびにpＳＶ４０ポリアデニ
ル化配列を含有するベクターpＣＩＳt-ＰＡを構築し
た。
ー、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位および
イントロン、Ｉg可変領域スプライス受容部位、t-ＰＡ
をコードしているcＤＮＡならびにpＳＶ４０ポリアデニ
ル化配列を含有するベクターpＣＩＳt-ＰＡを構築し
た。
【０１３４】この構築の出発ベクターはpＣＩＨt-ＰＡ
およびpＦ８ＣＩＳである(図２８参照)。後者ベクター
はpＣＩＨt-ＰＡと同じ５'コントロールを有している
が、因子VIIIのcＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化
部位を含有している。ＳacIIを用いてt-ＰＡ cＤＮＡの
３'を切断した。得られた３'側の出っ張り部分をＴ４ポ
リメラーゼで平滑にした。次いで、pＣＩＨt-ＰＡをＣl
aＩで切断した。この部位は、キメライントロンとt-Ｐ
Ａ遺伝子の５'末端とを分けている。このＣlaＩ処理物
から２８７０bpのフラグメントをゲル単離した。ＳＶ４
０ポリアデニル化部位、ＤＨＦＲ、転写コントロール、
細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにＣＭＶエ
ンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス供与部
をpＦ８ＣＩＳから単離した。これらの成分を、２５２
５bpのＳalＩ−ＣlaＩフラグメントおよび３１１３bpの
ＨpaＩ−ＳalＩフラグメントとして単離した。ＳacII
(平滑)−ＣlaＩフラグメントと、ＨpaＩ−ＳalＩフラグ
メントおよびＳalＩ−ＣlaＩフラグメントとの３成分ラ
イゲートによってpＣＩＳt-ＰＡを得た。
およびpＦ８ＣＩＳである(図２８参照)。後者ベクター
はpＣＩＨt-ＰＡと同じ５'コントロールを有している
が、因子VIIIのcＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化
部位を含有している。ＳacIIを用いてt-ＰＡ cＤＮＡの
３'を切断した。得られた３'側の出っ張り部分をＴ４ポ
リメラーゼで平滑にした。次いで、pＣＩＨt-ＰＡをＣl
aＩで切断した。この部位は、キメライントロンとt-Ｐ
Ａ遺伝子の５'末端とを分けている。このＣlaＩ処理物
から２８７０bpのフラグメントをゲル単離した。ＳＶ４
０ポリアデニル化部位、ＤＨＦＲ、転写コントロール、
細菌性の複製起源およびampr遺伝子、ならびにＣＭＶエ
ンハンサーおよびプロモーターおよびスプライス供与部
をpＦ８ＣＩＳから単離した。これらの成分を、２５２
５bpのＳalＩ−ＣlaＩフラグメントおよび３１１３bpの
ＨpaＩ−ＳalＩフラグメントとして単離した。ＳacII
(平滑)−ＣlaＩフラグメントと、ＨpaＩ−ＳalＩフラグ
メントおよびＳalＩ−ＣlaＩフラグメントとの３成分ラ
イゲートによってpＣＩＳt-ＰＡを得た。
【０１３５】２９３およびＣＨＯ細胞をpＣＩＨt-ＰＡ
およびpＣＩＳt-ＰＡでトランスフェクションすること
によってt-ＰＡの発現レベルを比較した。培養した形質
転換細胞それぞれからの培地を検定し、次の結果を得
た:
およびpＣＩＳt-ＰＡでトランスフェクションすること
によってt-ＰＡの発現レベルを比較した。培養した形質
転換細胞それぞれからの培地を検定し、次の結果を得
た:
【０１３６】
【図１】 図１は、因子VIII発現ベクターpＦ８ＣＩＳ
の構築を示す工程図である。
の構築を示す工程図である。
【図２】 図２は、因子VIII発現ベクターpＦ８ＣＩＳ
の構築を示す工程図である。
の構築を示す工程図である。
【図３】 図３は、因子VIII発現ベクターpＦ８ＣＩＳ
の構築を示す工程図である。
の構築を示す工程図である。
【図４】 図４は、因子VIII発現ベクターpＦ８ＳＣＩ
Ｓの構築を示す工程図である。
Ｓの構築を示す工程図である。
【図５】 図５は、pＦ８ＣＩＳ(Ａ)およびpＦ８ＳＣＩ
Ｓ(Ｂ)でトランスフェクションした細胞を免疫ペルオキ
シダーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図であ
る。
Ｓ(Ｂ)でトランスフェクションした細胞を免疫ペルオキ
シダーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図であ
る。
【図６】 図６は、pＦ８ＣＩＳでトランスフェクショ
ンし、増幅を１回行ったＣＨＯ細胞を免疫ペルオキシダ
ーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図である。
ンし、増幅を１回行ったＣＨＯ細胞を免疫ペルオキシダ
ーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図である。
【図７】 図７は、pＦ８ＣＩＳでトランスフェクショ
ンし、増幅を３回行ったＣＨＯ細胞を免疫ペルオキシダ
ーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図である。
ンし、増幅を３回行ったＣＨＯ細胞を免疫ペルオキシダ
ーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図である。
【図８】 図８は、因子VIII変異体の発現ベクターpＦ
８ＣＩＳ９０８０の構築を示す工程図である。
８ＣＩＳ９０８０の構築を示す工程図である。
【図９】 図９は、因子VIII変異体の発現ベクターpＦ
８ＣＩＳ９０８０の構築を示す工程図である。
８ＣＩＳ９０８０の構築を示す工程図である。
【図１０】 図１０は、ベクターpＦ８ＣＩＳ９０８０
でトランスフェクションした細胞を免疫ペルオキシダー
ゼ染色したときの結果を示す写真の模写図である。
でトランスフェクションした細胞を免疫ペルオキシダー
ゼ染色したときの結果を示す写真の模写図である。
【図１１】 図１１は、pＦ８ＣＩＳでトランスフェク
ションし、連続的な増幅を行ったＣＨＯ細胞を免疫ペル
オキシダーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図で
ある。
ションし、連続的な増幅を行ったＣＨＯ細胞を免疫ペル
オキシダーゼ染色したときの結果を示す写真の模写図で
ある。
【図１２】 図１２は、発現ベクターpＦ８ＣＩＳ-３３
６Ｅの構築を示す工程図である。
６Ｅの構築を示す工程図である。
【図１３】 図１３は、発現ベクターpＦ８９０８０-３
３６Ｅの構築を示す工程図である。
３６Ｅの構築を示す工程図である。
【図１４】 図１４は、精製した９０kd＋１４２aa＋８
０kd融合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分け、クーマシーブル
ー染色(Ａ)およびウェスタンブロット分析(Ｂ)にかけた
ときの結果を示す写真の模写図である。
０kd融合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分け、クーマシーブル
ー染色(Ａ)およびウェスタンブロット分析(Ｂ)にかけた
ときの結果を示す写真の模写図である。
【図１５】 図１５は、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合
体のトロンビン活性化を示すグラフ、およびＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥにかけたときの結果を示す写真の模写図(挿入図)
である。
体のトロンビン活性化を示すグラフ、およびＳＤＳ-Ｐ
ＡＧＥにかけたときの結果を示す写真の模写図(挿入図)
である。
【図１６】 図１６は、９０kd＋１４２aa＋８０kd融合
体のvＷＦへの結合を示すグラフである。
体のvＷＦへの結合を示すグラフである。
【図１７】 図１７は、プロリラキシン発現ベクターp
ＣＩＨＲＸの構築を示す工程図である。
ＣＩＨＲＸの構築を示す工程図である。
【図１８】 図１８は、プロリラキシン発現ベクターp
ＣＩＨＲＸの構築を示す工程図である。
ＣＩＨＲＸの構築を示す工程図である。
【図１９】 図１９は、プロリラキシン発現ベクターp
ＣＩＳＲＸの構築を示す工程図である。
ＣＩＳＲＸの構築を示す工程図である。
【図２０】 図２０は、t-ＰＡ発現ベクターpＣＩＨt-
ＰＡの構築を示す工程図である。
ＰＡの構築を示す工程図である。
【図２１】 図２１は、t-ＰＡ発現ベクターpＣＩＨt-
ＰＡの構築を示す工程図である。
ＰＡの構築を示す工程図である。
【図２２】 図２２は、発現ベクターpＦ８ＣＩＳのＤ
ＮＡ配列の一部を示す配列図である。
ＮＡ配列の一部を示す配列図である。
【図２３】 図２３は、発現ベクターpＦ８ＣＩＳのＤ
ＮＡ配列の一部を示す配列図である。
ＮＡ配列の一部を示す配列図である。
【図２４】 図２４は、発現ベクターpＦ８ＳＣＩＳの
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
【図２５】 図２５は、発現ベクターpＦ８ＳＣＩＳの
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
【図２６】 図２６は、発現ベクターpＦ８ＣＳＳＳの
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
【図２７】 図２７は、発現ベクターpＦ８ＣＳＳＳの
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
ＤＮＡ配列の一部を示す配列図である。
【図２８】 図２８は、t-ＰＡ発現ベクターpＣＩＳt-
ＰＡの構築を示す工程図である。
ＰＡの構築を示す工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (17)
- 【請求項１】 真核宿主細胞培養物中で所望の異種タン
パク質を連続的に発現させるのに適したベクターであっ
て、プロモーターの下流、かつ所望の異種タンパク質の
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流にある安定
化配列；該安定化配列の下流に配置された、所望の異種
タンパク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；お
よび下流側が転写終止部位となっているポリアデニル化
配列をコードしているＤＮＡを含んでなるベクター。 - 【請求項２】 安定化配列が、少なくとも１つの、２つ
を越えないスプライス供与−イントロン−受容配列を含
有する請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】 スプライス供与−イントロン−受容配列
のスプライス供与配列がヒト・サイトメガロウィルスの
即時型遺伝子からのものである請求項２に記載のベクタ
ー。 - 【請求項４】 スプライス供与−イントロン−受容配列
のイントロンがヒト・サイトメガロウィルスおよび免疫
グロブリン可変領域からのものである請求項２に記載の
ベクター。 - 【請求項５】 スプライス供与−イントロン−受容配列
のスプライス受容配列が免疫グロブリン受容配列に対応
している請求項２に記載のベクター。 - 【請求項６】 ポリアデニル化部位をコードしているＤ
ＮＡがサルウィルス４０(ＳＶ４０)からのものである請
求項１に記載のベクター。 - 【請求項７】 安定化配列が、スプライシングにはかけ
られたがヌクレオチド配列が実際上全く除去されなかっ
たmＲＮＡと同じ性質を有するmＲＮＡをコードしている
加工されたＤＮＡを含有する請求項１に記載のベクタ
ー。 - 【請求項８】 プロモーターがヒト・サイトメガロウィ
ルスの即時型遺伝子からのものである請求項１に記載の
ベクター。 - 【請求項９】 エンハンサーを含んでいる請求項１に記
載のベクター。 - 【請求項１０】 エンハンサーがプロモーターの上流に
配置されている請求項９に記載のベクター。 - 【請求項１１】 サルウィルス(ＳＶ４０)からのプロモ
ーターおよびエンハンサーを含んでいる請求項１に記載
のベクター。 - 【請求項１２】 真核宿主細胞培養物中で所望の異種タ
ンパク質を連続的に発現させるのに適したベクターであ
って、プロモーターの下流、かつ所望の異種タンパク質
のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流にある安
定化配列；該安定化配列の下流に配置された、所望の異
種タンパク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；
および下流側が転写終止部位となっているポリアデニル
化配列をコードしているＤＮＡを含んでなるベクターで
形質転換したＴＭ４細胞。 - 【請求項１３】 安定化配列が、スプライシングにはか
けられたがヌクレオチド配列が実際上全く除去されなか
ったmＲＮＡと同じ性質を有するmＲＮＡをコードしてい
る、加工されたＤＮＡを含有する請求項１２に記載のＴ
Ｍ４細胞。 - 【請求項１４】 真核宿主細胞培養物中で所望の異種タ
ンパク質を連続的に発現させるのに適したベクターであ
って、プロモーターの下流、かつ所望の異種タンパク質
のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流にある安
定化配列；該安定化配列の下流に配置された、所望の異
種タンパク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；
および下流側が転写終止部位となっているポリアデニル
化配列をコードしているＤＮＡを含んでなるベクターで
形質転換したＨＴＣ細胞。 - 【請求項１５】 安定化配列が、スプライシングにはか
けられたがヌクレオチド配列が実際上全く除去されなか
ったmＲＮＡと同じ性質を有するmＲＮＡをコードしてい
る、加工されたＤＮＡを含有する請求項１４に記載のＨ
ＴＣ細胞。 - 【請求項１６】 真核宿主細胞培養物中で所望の異種タ
ンパク質を連続的に発現させるのに適したベクターであ
って、プロモーターの下流、かつ所望の異種タンパク質
のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流にある安
定化配列；該安定化配列の下流に配置された、所望の異
種タンパク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；
および下流側が転写終止部位となっているポリアデニル
化配列をコードしているＤＮＡを含んでなるベクターで
形質転換した２９３細胞。 - 【請求項１７】 安定化配列が、スプライシングにはか
けられたがヌクレオチド配列が実際上全く除去されなか
ったmＲＮＡと同じ性質を有するmＲＮＡをコードしてい
る、加工されたＤＮＡを含有する請求項１６に記載の２
９３細胞。
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