ES2252070T3 - Vectores y procedimientos para la expresion de proteinas recombinantes. - Google Patents
Vectores y procedimientos para la expresion de proteinas recombinantes.Info
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Abstract
Un vector de expresión que comprende, en el orden siguiente, una secuencia promotora, una primera secuencia codificante, un sitio de poliadenilación y una segunda secuencia codificante, en el que no se encuentra ninguna secuencia promotora entre el sitio de poliadenilación y la secuencia codificante.
Description
Vectores y procedimientos para la expresión de
proteínas recombinantes.
La presente invención se refiere a la expresión
de proteínas recombinantes en células eucariotas.
El desarrollo de sistemas de expresión para la
producción de proteínas recombinantes es importante para
proporcionar una fuente de una proteína dada para su uso en
investigación o terapia. Se han desarrollado sistemas de expresión
para células procariotas, como la E. coli, y células
eucariotas, como la levadura (es decir Saccharomyces, Pichia
y Kluyveromyces spp) y células de mamíferos. La expresión en
células de mamíferos se prefiere con frecuencia para la fabricación
de proteínas terapéuticas, ya que las modificaciones
postraduccionales en estos sistemas de expresión tienen más
probabilidades de asemejarse a las que ocurren en proteínas
endógenas en un mamífero que las modificaciones postraduccionales
que ocurren en sistemas de expresión microbianos.
Hay varios vectores disponibles para la expresión
en hospedadores de mamíferos, conteniendo cada uno varias
combinaciones de elementos cis- y a veces trans- reguladores para
lograr altos niveles de proteína recombinante en un período de
tiempo mínimo. Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de muchos
de estos vectores, el nivel de expresión de una proteína
recombinante que se logra en los sistemas de mamíferos es con
frecuencia inferior al obtenido con un sistema de expresión
microbiano. Además, dado que solo un pequeño porcentaje de células
de mamíferos clonadas y transfectadas expresan altos niveles de la
proteína de interés, a menudo puede llevar mucho más tiempo
desarrollar líneas de células de mamíferos útiles transfectadas
establemente que el tiempo que lleva en sistemas microbianos.
El uso de un vector de expresión dicistrónico en
el que un primer marco de lectura abierto codifica un polipéptido de
interés y un segundo marco de lectura abierto codifica un marcador
seleccionable es un procedimiento que se ha usado para obtener
proteínas recombinantes. Un marcador preferido para usar en estos
sistemas es la dihidrofolato reductasa (DHFR), que tiene la ventaja
de ser un gen amplificable, que permite la selección de células con
altos números de copias del ADN insertado mediante su cultivo en
niveles cada vez mayores de metotrexato (MTX). Sin embargo, la
traducción del gen marcador seleccionable es hasta 100 veces menos
eficiente que la traducción del gen de interés, lo que reduce la
eficacia del proceso de selección. Además, los vectores de expresión
dicistrónicos tienden a sufrir deleción o reordenamiento en
condiciones de amplificación, de manera incontrolada, aumentando las
posibilidades de que las células amplificadas ya no expresen la
proteína de interés.
Los sitios internos de entrada de ribosomas
(IRES) son un tipo de elemento regulador que se encuentra en varios
virus y ARN celular (descrito en McBratney y col., Current Opinión
in Cell Biology 5:961, 1993). Los IRES aumentan la eficacia de la
traducción del gen marcador seleccionable, y son por tanto útiles
para mejorar los procesos de selección y amplificación (Kaufman R.J.
y col., Nucleic Acid Res., 19:4485, 1991). Sin embargo, las pruebas
disponibles indican que los ARNm dicistrónicos se acumulan a niveles
más bajos que los ARNm monocistrónicos, posiblemente por la
estabilidad reducida del ARNm del mensaje más largo. Kaufman y col.,
Nucleic Acid Res., 19:4485, 1991 se refiere a los vectores de
expresión dicistrónicos mejorados de ARNm mediante el uso de IRES
putativos aislados del virus de la encefalomiocarditis.
Debido a que la cantidad de proteína recombinante
producida por una célula transfectada es en general proporcional a
la cantidad de ARNm disponible para la traducción de la proteína, el
uso de vectores de expresión dicistrónicos puede traer como
consecuencia niveles bajos de producción de la proteína recombinante
deseada. Del mismo modo, existe la necesidad en la técnica de
desarrollar procedimientos mejorados para mantener la utilidad de un
marcador seleccionable y amplificable como el DHFR, mientras se
aumenta la proporción de ARNm que codifican la proteína recombinante
deseada. Además, existe la necesidad de desarrollar procedimientos
que faciliten la selección de esos transfectantes que se integran
en sitios más activos en cuanto a la transcripción, y que permiten
la producción de niveles útiles de proteína recombinante a partir de
células de mamíferos en un período de tiempo relativamente
corto.
En una realización de la invención, un vector de
expresión comprende un ADN que codifica una primera proteína
enlazado operativamente a un ADN que codifica una segunda proteína,
en la que un ADN que codifica un sitio de poliadenilación (poliA) se
inserta entre el ADN que codifica la primera proteína de interés y
el ADN que codifica la segunda proteína, de modo que el ADN que
codifica el sitio de poliadenilación está enlazado operativamente al
ADN que codifica la primera. Una segunda proteína preferida es un
marcador seleccionable, con preferencia dihidrofolato reductasa
(DHFR); otros marcadores amplificables también son adecuados para su
uso en los vectores de expresión de la invención.
Con preferencia, la señal de poliadenilación
usada para proporcionar el sitio interno de poliadenilación es una
señal de poliadenilación del SV40, con más preferencia, la señal
tardía de poliadenilación del SV40 y, con más preferencia, los
residuos 80 a 222 de la secuencia ID SEC Nº 1. Las señales de
poliadenilación preferidas se presentan en la Lista de Secuencias y
se describen más adelante. En otra realización de la invención, la
señal de poliadenilación es inducible.
El vector de expresión puede además comprender
una secuencia IRES entre el ADN que codifica la primera proteína y
el ADN que codifica la segunda proteína, enlazado operativamente a
ambos y en dirección 3' del sitio de poliadenilación. Como
alternativa, el vector de expresión puede comprender sitios donantes
o aceptantes de un empalme de ARNm esencialmente como se describe en
Lucas y col. infra.
Otro aspecto de la invención comprende un vector
de expresión en el que se inserta un ADN que codifica una proteína.
Este vector de expresión comprende un sitio en el que puede
insertarse un ADN que codifica una proteína recombinante y
heteróloga (llamado sitio de clonación), de modo que esté
operativamente enlazado a un sitio de poliadenilación y a un ADN que
codifica una segunda proteína (como un marcador seleccionable).
Optativamente, pueden incluirse otros elementos reguladores, por
ejemplo una secuencia IRES en dirección 3' del sitio de
poliadenilación, o sitios donantes o aceptantes de empalmes ARNm
esencialmente como se describen en Lucas y col. infra, enlazados
operativamente al sitio de poliadenilación y al ADN que codifica la
segunda proteína. Un elemento de secuencia que aumenta la expresión
(EASE) puede también incluirse en dirección 5' del sitio de
clonación, enlazado a él operativamente.
Las células hospedadoras pueden transfectarse con
los vectores de expresión de la invención. Del mismo modo, otra
realización de la invención proporciona una célula hospedadora
transfectada. También se proporcionan líneas de células clonadas de
células hospedadoras. Las células hospedadoras preferidas son las
células de mamíferos. En la realización más preferida, las células
hospedadoras son células CHO.
La invención también proporciona un procedimiento
para obtener una proteína recombinante, que comprende la
transfección de una célula hospedadora con un vector de expresión de
la invención, cultivando la célula hospedadora transfectada en
condiciones que promueven la expresión de la proteína y la
recuperación de la proteína. En una aplicación preferida de esta
invención, las líneas de células hospedadoras transfectadas se
seleccionan con dos etapas de selección, la primera para seleccionar
las células que expresan el marcador amplificable dominante, y la
segunda etapa para los niveles altos de expresión y/o amplificación
del gen marcador así como del gen de interés. En la realización más
preferida, el agente de selección o amplificación es el metotrexato,
un inhibidor de DHFR que ha demostrado causar la amplificación de
genes DHFR endógenos y secuencias DHFR transfectadas.
La figura 1 es un diagrama de constructos
preparados en el ejemplo 1. El constructor en que se incluyó la
señal temprana de poliadenilación del SV40 se indica como SPA6; y
aquel en el que se incluyó la señal tardía de poliadenilación se
indica como SPA4. Un constructor de control se indica como BGH.
Por la presente se proporcionan vectores de
expresión que conservan la utilidad de un marcador seleccionable y
amplificable como el DHFR, al tiempo que aumentan la proporción de
ARNm que codifica una proteína recombinante deseada. Los vectores de
expresión de la invención comprenden una señal de poliadenilación
insertada entre una primera secuencia de codificación y una segunda
o ulterior secuencia de codificación (llamada sitio interno de
poliadenilación). En los vectores de la invención, los transcritos
originados en el promotor pueden estar poliadenilados después de la
primera secuencia de codificación (mensaje monocistrónico) o después
de la segunda o ulterior secuencia de modificación (mensaje
multicistrónico). En una realización de la invención, la primera
secuencia de codificación codifica una proteína de interés, y la
segunda (o ulterior) secuencia de codificación codifica un marcador
seleccionable. En otra realización, un segundo sitio de
poliadenilación sigue a la segunda o ulterior secuencia de
codificación, y está enlazado a ella operativamente. En esta
realización, el sitio interno de poliadenilación se convierte en el
primer sitio de poliadenilación.
Debido a que muchos transcritos codifican solo el
gen de interés y no el marcador seleccionable, los vectores de la
invención producen menos proteína marcadora seleccionable, y solo
aquellos transfectantes que se integran en sitios más activos en
cuanto a la transcripción sobreviven al proceso de selección. Del
mismo modo, el uso de vectores de expresión de la invención facilita
el aislamiento de los conjuntos transfectados y los clones que
expresan altos niveles de proteína recombinante usando menores
niveles de un agente de selección de lo que es posible en ausencia
de la señal interna de poliadenilación.
Un beneficio adicional de usar los vectores de
expresión de la invención es que los mensajes monocistrónicos pueden
ser más estables y procesarse con más eficacia que los mensajes
dicistrónicos, lo que potencialmente lleva a una acumulación
incrementada del mensaje que codifica la proteína de interés, y por
lo tanto a niveles más altos de producción de proteína. El uso del
sitio interno de poliadenilación de la invención facilitará así la
producción de niveles útiles de proteína recombinante por células
transfectadas en un período de tiempo relativamente corto.
Los vectores y procedimientos de la invención
también serán útiles para desarrollar vectores multicistrónicos. Los
vectores de expresión multicistrónicos permiten la expresión
coordinada de dos o más genes (ver, por ejemplo, Fussenegger y col.,
Biotechnol Prog 13:733; 1997). Insertar un sitio de poliadenilación
después de un primer cistrón traería como consecuencia un alto nivel
de expresión del primer cistrón y un nivel menor de expresión de
cualquiera de los cistrones siguientes. Las aplicaciones potenciales
de esta tecnología serían facilitar la expresión de grandes
cantidades de una proteína terapéutica (u otras proteínas
recombinantes deseadas) y menores cantidades de otras proteínas
como marcadores seleccionables, factores de transcripción, enzimas
que participan en el plegado de proteínas y otras proteínas que
regulan el metabolismo y la expresión celular.
En otra realización, el sitio de poliadenilación
se inserta después del segundo o tercer (o ulterior) cistrón. Esto
permitiría una alta expresión de los dos (o tres o más) primeros
cistrones, seguidos por una expresión más baja del cistrón siguiente
al sitio interno de poliadenilación. Esta realización tendrá
aplicación, por ejemplo, en la síntesis de anticuerpos recombinantes
en que las cadenas pesadas y ligeras se sintetizan
independientemente a niveles altos. Un vector tricistrónico se
construye con las cadenas pesadas y ligeras codificadas por los dos
primeros cistrones. El sitio de poliadenilación se inserta a
continuación del segundo cistrón, lo que permite un alto nivel de
expresión de los dos primeros cistrones. Un marcador seleccionable
se expresa desde el tercer cistrón (es decir, después del sitio de
poliadenilación) y se expresaría a niveles más bajos.
Como se usa en la presente, el término "vector
de expresión" se refiere a un vector que comprende varios
elementos reguladores, descritos en detalle más adelante, necesarios
para la expresión de proteínas recombinantes y heterólogas en
células. El vector de expresión puede incluir señales adecuadas para
el mantenimiento en células procariotas o eucariotas, y/o el vector
de expresión puede estar integrado en un cromosoma.
Los vectores de expresión recombinantes pueden
incluir una secuencia codificante que codifica una proteína de
interés (o fragmento de ella), ribozimas, ARNm ribosómicos, ARN no
codificante y similares. Con preferencia, la secuencia de
codificación codifica una proteína o un péptido. La secuencia de
codificación puede ser sintética, un fragmento de ácido nucleico
derivado de ADNc o un fragmento de ácido nucleico aislado por
reacción en cadena de polimerasa (PCR). La secuencia de codificación
está enlazada operativamente a elementos reguladores de
transcripción o traducción adecuados derivados de genes de
mamíferos, virus o insectos. Dichos elementos reguladores incluyen
un promotor de transcripción, una secuencia que codifica sitios de
enlace de ARNm ribosómicos adecuados, y secuencias que controlan la
terminación de la transcripción y traducción (es decir, una señal de
poliadenilación) como se describe en detalle más adelante.
Los vectores de expresión también pueden
comprender elementos no transcritos como un promotor adecuado y/o un
potenciador enlazado al gen que debe expresarse, otras secuencias no
transcritas adyacentes a los extremos 5' ó 3', secuencias no
traducidas 5' ó 3' como sitios de enlace de ribosomas, un sitio de
poliadenilación, sitios donantes o aceptantes de empalmes y
secuencias de terminación de transcripción. También puede
incorporarse un origen de replicación que confiere la capacidad de
replicarse en un hospedador, y un gen seleccionable para facilitar
el reconocimiento de los transfectantes.
Las regiones de ADN están enlazadas
operativamente cuando están vinculadas funcionalmente entre sí. Por
ejemplo, el ADN para un péptido señal (líder de secreción) está
enlazado operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa
como un precursor que participa en la secreción del polipéptido;
así, en el caso del ADN que codifica líderes de secreción, enlazado
operativamente quiere decir contiguo y en el marco de lectura. Un
promotor está enlazado operativamente a una secuencia de
codificación si controla la transcripción de la secuencia; y un
sitio de enlace de ribosoma está enlazado operativamente a una
secuencia de codificación si se coloca de modo que permita la
traducción.
Los vectores de expresión dicistrónicos usados
para la expresión de múltiples transcritos se han descrito con
anterioridad (Kim S.K. y Wold B.J., Cell 42:129, 1985; Kaufman y
col., 1991, supra). Los vectores de expresión dicistrónicos
comprenden dos cistrones, o marcos de lectura abiertos, capaces de
codificar dos proteínas, por ejemplo, una recombinante de interés y
un marcador seleccionable. Un ejemplo de dicho vector de expresión
dicistrónico es pCAVDHFR, un derivado de pCD302 (Mosley y col., Cell
1989) que contiene la secuencia codificante para el ratón DHFR
(Subramani y col., Mol. Cell. Bio. 1:854, 1981). Otro ejemplo de
dicho vector de expresión dicistrónico es el vector pCDE, un
derivado de pCAVDHFR que contiene el sitio interno de entrada
ribosómico del virus de la encefalomiocarditis murino (nucleótidos
260 a 824; Jang and Wimmer, Genes and Dev. 4:1560, 1990) clonado
entre el líder tripartito del adenovirus y la secuencia de ADNc
codificante del DHFR. Otros tipos de vectores de expresión también
resultarán útiles en combinación con la invención, por ejemplo, los
descritos en las patentes estadounidenses 4.634.665 (Axel y col.) y
4.656.134 (Ringold y col.).
Las secuencias de control de transcripción y
traducción en los vectores de expresión que se usarán para la
transfección de células pueden proporcionarse a partir de fuentes
virales. Por ejemplo, algunos promotores y potenciadores usados
comúnmente se derivan del Polioma, Adenovirus 2, Virus del mono 40
(SV40) y el citomegalovirus humano. Los promotores genómicos
virales, las secuencias de control y/o de señal pueden usarse para
impulsar la expresión, siempre que dichas secuencias de control sean
compatibles con la célula hospedadora elegida. Pueden construirse
ejemplos de dichos vectores como se desvelan en Okayama y Berg (Mol.
Cell. Biol. 3:280, 1983). Los promotores celulares no virales
también pueden usarse (es decir, los promotores de
beta-globina y EF-1alfa), según el
tipo de célula en que se va a expresar la proteína recombinante.
Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral
del SV40 por ejemplo, origen del SV40, promotor temprano y tardío,
potenciador, empalme y sitios de poliadenilación, pueden usarse para
proporcionar los otros elementos genéticos necesarios para la
expresión de una secuencia de ADN heterólogo. Los promotores
tempranos y tardíos son especialmente útiles porque se obtienen
fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el
origen viral de replicación del SV40 (Fiers y col., Nature 273:113,
1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 mayores o menores,
siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se
extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio BgII ubicado en el
origen viral de la replicación.
En los vectores de expresión dicistrónicos, un
sitio de poliadenilación insertado hacia el extremo 3' de un segundo
cistrón (normalmente, un ADN que codifica un marcador
seleccionable), y vinculado operativamente a este, se usa con
frecuencia para regular la transcripción y traducción. Se conocen
muchas señales de poliadenilación de este tipo (ver por ejemplo la
Tabla 1 abajo). La presente invención usa una señal interna de
poliadenilación, por ejemplo, una que se inserta entre dos cistrones
de un vector de expresión dicistrónico, además de una señal de
poliadenilación u otro elemento regulador adecuado en dirección al
extremo 3' del segundo cistrón.
Las señales de poliadenilación tempranas y
tardías del SV40 son útiles en esta invención. Estas secuencias se
codifican dentro del fragmento de 237 pares de bases entre el sitio
BamHI en el nucleótido 2533 y el sitio BclI en el nucleótido 2770
del genoma del SV40 (Carswell y Alwine, Mol. Cell. Biol. 9:4248;
1989). Carswell y Alwine llegaron a la conclusión de que, de las dos
señales de poliadenilación del SV40, la señal tardía era más
eficiente, sobre todo porque comprende tanto los elementos de
secuencia en dirección al extremo 3' como al extremo 5' que
facilitan un corte y poliadenilación eficientes.
Muchas señales de poliadenilación se conocen en
la técnica, y resultarán también útiles para esta invención. Algunos
ejemplos incluyen los que se muestran en la Tabla 1 a
continuación.
- poliA tardía del SV40 y sus mutantes de deleción.
- Schek, N, Cooke, C., y J.C. Alwine (\underline{992}): Definition of the upstream efficiency element of the simian virus 40 late polyadenylation signal by using in vitro analysis. Mol. Cell Biol. 12:5386-5393.
- poliA del VIH-1
- Klasens, B.I.F., Das, A.T., y B. Berkhout (\underline{1998}): Inhibition of polyadenylation by stable RNA secondary structure. Nucleic Acids Res. 26:1870-1876.
- poliA de \beta-globina
- Gil, A., y N.J. Proudfoot. (\underline{1987}): position-dependent sequence elements downstream of AAUAAA are required for efficient rabbit \beta-globin mRNA formation. Cell 49:399-406.
- poliA del HSV TK
- Cole, C.N. y T.P. Stacy (\underline{1985}): Identification of sequence in the herpes simplex virus thymidine kinase gene required for efficient processing and polyadenylation. Mol. Cell Biol. 5:2104-2113
- poliA del poliomavirus
- Batt, D.B. y G.G. Carmichael (\underline{1995}): Characterization of the polyomavirus late polyadenylation signal. Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790.
- Hormona del crecimiento bovino
- Gimmi, E.R., Reff., M.E., y I.C. Deckman (\underline{1989}): Alterations in pre-mRNA topology of the bovine growth hormone polyadenylation región decrease polyA site efficiency. Nucleic Acids Res. 17:6983-6998.
Otros sitios de poliadenilación adicionales
pueden identificarse o construirse usando procedimientos conocidos
en la técnica. Un sitio de poliadenilación mínimo está compuesto de
AAUAAA y una segunda secuencia de reconocimiento, en general una
secuencia rica en G/U, que se encuentra aproximadamente a 30
nucleótidos hacia el extremo 3'. En la Lista de Secuencias, las
secuencias se presentan como ADN, en vez de ARN, para facilitar la
preparación de ADN adecuados para incorporarlos en vectores de
expresión. Cuando se presenta como ADN, el sitio de poliadenilación
está compuesto de AATAAA con, por ejemplo, una región rica en G/U en
dirección al extremo 3' (ver por ejemplo los nucleótidos 123 a 128 y
151 a 187, respectivamente, de ID SEC Nº 1).
Ambas secuencias deben estar presentes para
formar un sitio de poliadenilación eficiente. El objetivo de estos
sitios es atraer proteínas específicas enlazantes de ARN al ARN. El
AAUAAA enlaza el factor de especificidad de corte de la
poliadenilación (CPSF; Murthy K.G., y Manley J.L. (1995), Genes Dev
9:2672-2683), y el segundo sitio, con frecuencia una
secuencia G/U, enlaza al factor estimulante de corte (CstF; Takagaki
Y. y Manley J.L. (1997) Mol Cell Biol 17:3907-3914).
El CstF está compuesto de varias proteínas, pero la proteína
responsable del enlace de ARN es CstF-64, un miembro
de la familia de proteínas del dominio de ribonucleoproteínas
(Takagaki y col. (1992) Proc Natl Acad Sci USA
89:1403-1407).
Se ha demostrado que la concentración de proteína
CstF-64 es importante para regular el uso de
diferentes sitios de poliadenilación en células B (Takagaki Y,
Manley JL (1998) Moll Cell 2:761-771). Del mismo
modo, puede construirse un sitio de poliadenilación inducible basado
sobre esta regulación que ocurre naturalmente del uso de la
poliadenilación en la célula B, mediante el control de la
interacción entre CstF-64 con un ARNm de elección
para inducir la poliadenilación. Por ejemplo, el
CstF-64 puede fundirse con el dominio de enlace de
ARN de la proteína de la cápside del fago MS2, que enlaza a una
secuencia ARN específica (ACAUGAGGAUUACCCAUGU; ID SEC Nº 4)
diferente del elemento rico en G/U (Lowary y Uhlenbeck (1987)
Nucleic Acid Res. 15:10483+10493). El ARNm diana contendría una
secuencia AAUAAA y una secuencia de reconocimiento de ARN de la
proteína de la cápside del MS2 . Al regular el nivel de la proteína
de fusión MS2-CstF-64 en cuanto a la
transcripción usando sistemas de expresión normales inducibles (por
ejemplo, un sistema de expresión en mamíferos inducible con ecdisona
descrito por No y col. (1996) Proc Natl Aca Sci USA
93:3346-3351), el uso del sitio poliA inducible
podría controlarse.
La poliadenilación también puede regularse
mediante el desarrollo de mutantes del dominio de enlace de ARN del
MS2 sensibles a la temperatura. Los mutantes del dominio de enlace
de ARN del MS2 pueden generarse usando mutagénesis aleatoria, y
filtrarse según su sensibilidad a la temperatura. Cuando se usa como
socio de fusión con el CstF-64 arriba descrito, la
proteína de la cápside del MS2 sensible a la temperatura sería
inactiva y no enlazaría el ARN a 37ºC; así, el sitio poliA interno
no funcionaría a esta temperatura. Sin embargo, a una temperatura
reducida, por ejemplo 32ºC, la proteína del cápside del MS2 estaría
activa, reconocería la diana de la secuencia de ARN, y el mensaje
se haría poliadenilado. La regulación de la temperatura sería
especialmente útil para la expresión de proteínas recombinantes, ya
que la reducción de la temperatura de los cultivos de expresión se
usa típicamente para aumentar la expresión de proteína.
Una técnica adicional que puede usarse junto con
los vectores de la invención se describe en Lucas y col. (Nucleic
Acids Res. 24:1774; 1996). Para aumentar la producción de una
proteína deseada, Lucas y col. usaron sitios donantes y aceptantes
de empalmes de ARNm para desarrollar clones estables que producían
un marcador seleccionable y proteínas recombinantes. Según estos
investigadores, los vectores que prepararon tuvieron como
consecuencia la transcripción de una gran proporción del ARNm que
codifica la proteína deseada, y un nivel fijo y relativamente bajo
del marcador de selección que permitió la selección de
transfectantes estables.
Las células hospedadoras transfectadas son
células que se han transfectado (a veces se dice
"transformado") con ADN heterólogo. Se conocen muchas técnicas
para transfectar células; una de ellas consiste en transfectar
células con vectores de expresión construidos usando técnicas de ADN
recombinante y que contienen secuencias que codifican proteínas
recombinantes. Las proteínas expresadas con preferencia se secretan
en el sobrenadante del cultivo, pero pueden estar asociadas con la
membrana de la célula, según el polipéptido específico que se
exprese. Las células hospedadoras de mamíferos se prefieren para
esta invención. Pueden emplearse varios sistemas de cultivo de
células de mamíferos para expresar la proteína recombinante.
Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos adecuadas
son las líneas COS-7 de células de riñón del mono,
descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), CV-1/EBNA
(ATCC CRL 10478), células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino
(CHO), líneas de células HeLa y BHK.
Una línea de células usada con frecuencia son
células DHFR- CHO que son auxotróficas para la glicina, timidina e
hipoxantina, y pueden transformarse al fenotipo DHFR+ usando ADNc de
DHFR como marcador dominante amplificable. Una de estas líneas de
células DHFR- CHO, DXB11, fue descrita por Urlaub y Chasin (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980). Otro ejemplo de una línea de
células DHFR- CHO es DG44 (ver, por ejemplo, Kaufman, R.J., Meth.
Enzymology 185:537 (1988)). Otras líneas de células desarrolladas
para esquemas de selección o amplificación específicos serán útiles
con la invención.
Muchas otras células eucariotas serán útiles en
la presente invención, incluso células de otros vertebrados y de
insectos. Los expertos en la materia podrán seleccionar vectores,
elementos reguladores, esquemas de transfección y cultivo adecuados
según las necesidades del sistema de cultivo que prefieran.
Se conocen varios protocolos de transfección en
la técnica que se analizan en Kaufman, R.J., supra. El
protocolo de transfección elegido dependerá del tipo de célula
hospedadora y la naturaleza de la proteína de interés, y su elección
puede basarse sobre la experimentación de rutina. Los requerimientos
básicos de cualquier protocolo de este tipo son: primero introducir
ADN codificante de la proteína de interés en una célula hospedadora
adecuada, y luego identificar y aislar las células hospedadoras que
tengan incorporado el ADN heterólogo en una manera estable y
expresable.
Un procedimiento usado con frecuencia para
introducir ADN heterólogo es la precipitación de fosfato de calcio,
por ejemplo, como se describe en Wigler y col. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77:3567, 1980). El ADN introducido en una célula
hospedadora con este procedimiento con frecuencia sufre un
reordenamiento, lo que hace a este procedimiento útil para la
cotransfección de genes independientes.
La fusión inducida por polietileno de
protoplastos bacterianos con células de mamíferos (Schaffner y col.,
Proc. Natl. acad. Sci. USA 77:2163, 1980) es otro procedimiento útil
para introducir el ADN heterólogo. Los protocolos de fusión de
protoplastos con frecuencia producen múltiples copias del ADN
plásmido integradas en el genoma de la célula hospedadora de
mamífero. Esta técnica requiere que el marcador de selección y
amplificación esté en el mismo plásmido que el gen de interés.
También puede usarse la electroporación para
introducir ADN directamente en el citoplasma de una célula
hospedadora, como se describe en Potter y col. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:7161, 1988) o Shigekawa y Dower (BioTechniques 6:742,
1988). A diferencia de la fusión de protoplasto, la electroporación
no exige que el marcador de selección y el gen de interés estén en
el mismo plásmido.
Más recientemente, se han descrito varios
reactivos útiles para introducir ADN heterólogo en una célula de
mamífero. Estos incluyen Lipofectin® Reagent y Lipfectamine^{TM}
Reagent (Gibco BGL, Gaithersburg, MD). Ambos reactivos son reactivos
disponibles en el mercado que se usan para formar complejos de
lípidos - ácidos nucleicos (o liposomas) que, cuando se aplican a
células cultivadas, facilitan la entrada de ácido nucleico en las
células.
La transfección de células con ADN heterólogo y
la selección de células que han absorbido el ADN heterólogo y
expresan el marcador seleccionable produce un conjunto de células
transfectadas. Las células individuales en estos conjuntos varían en
cuanto al ADN incorporado y la ubicación cromosómica del ADN
transfectado. Después de pases repetidos, los conjuntos con
frecuencia pierden la capacidad de expresar la proteína heteróloga.
Para generar líneas de células estables, las células individuales
pueden aislarse de los conjuntos y cultivarse (un proceso llamado
clonación), un procedimiento trabajoso y que exige mucho tiempo. Sin
embargo, en algunos casos, los conjuntos pueden ser estables (es
decir, la producción de la proteína heteróloga recombinante
permanece estable). La capacidad de seleccionar y cultivar dichos
conjuntos estables de células sería deseable porque permitiría una
producción rápida de cantidades relativamente grandes de proteína
recombinante en células de mamíferos.
Un procedimiento para amplificar el gen de
interés también es deseable para la expresión de la proteína
recombinante, y típicamente implica el uso de un marcador de
selección (analizado en Kaufman, R.J., supra). La resistencia
a sustancias citotóxicas es la característica más frecuentemente
usada de un marcador de selección, y puede traer como consecuencia
un rasgo dominante (es decir, puede usarse sin importar el tipo de
célula hospedadora) o un rasgo recesivo (es decir, útil en tipos de
células hospedadoras específicos que son deficientes en la
actividad para la que se están seleccionando). Muchos marcadores
amplificables son adecuados para su uso en los vectores de expresión
de la invención (por ejemplo, los descritos en Maniatis,
Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, NY, 1989; páginas 16.9-16.14).
Algunos marcadores seleccionables útiles para la
amplificación de genes en células de mamíferos resistentes a
sustancias se muestran en la Tabla 1 de Kaufman, R.J., supra,
e incluyen la resistencia DHFR-MTX,
P-glicoproteína y resistencia a múltiples fármacos
(MDR) - varios agentes lipofílicos citóxicos (es decir adriamicina,
colchicina, vincristina) y adenosina deaminasa
(ADA)-Xyl-A o adenosina y
2'-deoxicoformicina. Ejemplos específicos de genes
que codifican marcadores seleccionables son los que codifican la
resistencia antimetabolito como la proteína DHFR, que confiere
resistencia al metotrexato (Wigler y col., 1980, Proc. Natl. Acad.
Sci USA 77:3567; O'Hare y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:1527); la proteína GPT, que confiere resistencia al ácido
micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2072), el marcador de resistencia a la neomicina, que confiere
resistencia al aminoglucósido G-418
(Colberre-Garapin y col., 1981, J. Mol. Biol.
150:1), la proteína Higro, que confiere resistencia a la higromicina
(Santerre y col., 1984, Gene 30:147); y el marcador de resistencia a
Zeocin^{TM} (disponible comercialmente de Invitrogen). Además, los
genes de la timidina quinasa del virus simple del herpes (Wigler y
col., 1977, Cell 11:223), la hipoxantina-guanina
fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 48:2026) y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y
col., 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk-, hgprt- y
aprt- respectivamente.
Otros marcadores dominantes seleccionables son
los genes de resistencia a antibióticos derivados de microbios, por
ejemplo resistencia a la neomicina, kanamicina o higromicina. Sin
embargo, estos marcadores de selección no han demostrado ser
amplificables (Kaufman, R.J., supra). Existen varios sistemas
de selección adecuados para hospedadores de mamíferos (Maniatis
supra, págs. 16.9-16.15). Los protocolos de
cotransfección que emplean dos marcadores seleccionables dominantes
también se han descrito (Okayama y Berg, Mol Cell Biol 5:1136,
1985).
Un esquema de selección y amplificación
especialmente útil usa resistencia a DHFR-MTX. MTX
es un inhibidor de DHFR que ha demostrado causar amplificación de
los genes endógenos de DHFR (Alt F.W., y col., J Biol Chem 253:1357,
1978) y secuencias transfectadas de DHFR (Wigler M., y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980). Las células se transfectan con
ADN que comprende el gen de interés y ADN que codifica DHFR en una
unidad de expresión dicistrónica (Kaufman y col., 1991 supra
y Kaufman R.J. y col., EMBO J 6:187, 1987). Las células
transfectadas se hacen crecer en medios que contienen cantidades
cada vez mayores de MTX, lo que causa una mayor expresión del gen
DHFR, así como del gen de interés.
Los elementos reguladores útiles, descritos
anteriormente, también pueden incluirse en los plásmidos o vectores
de expresión que se usan para transfectar células de mamíferos. Los
protocolos de transfección elegidos y los elementos seleccionados
para su uso en ellos dependerán del tipo de célula hospedadora
usado. Los expertos en la materia son conscientes de los múltiples
protocolos diferentes y células hospedadoras, y pueden seleccionar
un sistema adecuado para la expresión de una proteína deseada, a
partir de los requerimientos de sus sistemas de cultivo de células
seleccionados.
Los vectores y procedimientos de la invención
resultarán útiles en la expresión de una amplia variedad de
polipéptidos recombinantes. Ejemplos de estos polipéptidos son las
citoquinas y factores de crecimiento, como Interleucinas 1 a 18,
interferones, RANTES, linfotoxina-\beta, ligando
Fas, ligando flt-3, ligando para el receptor
activador de NF-kappa B (RANKL), ligando relacionado
con TNF inductor de apoptosis (TRAIL), ligando CD40, ligando Ox40,
ligando 4-1BB (y otros miembros de la familia TNF),
linfopoyetina tímica derivada de estroma, factor estimulante de
colonia de granulocitos, factor estimulante de granulocitos
macrófagos, factor de crecimiento de mastocitos, factor de
crecimiento de células madre, factor de crecimiento epidérmico,
hormona del crecimiento, factor de necrosis de tumores, factor
inhibitorio de leucemia, factores de oncostatina-M y
hematopoyéticos como la eritropoyetina y trombopoyetina.
También se incluyen factores neurotróficos como
el factor neurotrófico derivado del cerebro, factor neurotrófico
ciliar, factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales
y varios ligandos para moléculas superficiales de células Elk y Hek
(como los ligandos de quinasas relacionadas con eph-, o LERKS).
Pueden encontrarse descripciones de las proteínas que pueden
expresarse según los procedimientos de la invención en, por ejemplo,
Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Vol.
II (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge MA,
1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh,
eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993) y The
Cytokine Handbook (A W Thompson ed., Academic Press, San Diego
CA; 1991).
Los receptores de cualquiera de las proteínas
antes mencionadas pueden también expresarse usando los vectores y
procedimientos de la invención, incluso ambas formas del receptor
del factor de necrosis de tumores (llamado p55 y p75), receptores de
interleucina-I (tipo 1 y 2), receptor de
interleucina-4, receptor de
interleucina-15, receptor de
interleucina-17, receptor de
interleucina-18, receptor del factor estimulante de
colonias de granulocitos macrófagos, receptor del factor estimulante
de colonias de granulocitos, receptores de
oncostatina-M y factor inhibitorio de leucemia,
receptor activador de NF-kappa B (RANK), receptores
de TRAIL y receptores que comprenden dominios de muerte, como el
receptor Fas o inductor de apoptosis (AIR).
Otras proteínas que pueden expresarse usando los
vectores y procedimientos de la invención son los antígenos de
diferenciación (llamados proteínas CD), por ejemplo, los desvelados
en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International
Workshop and Conference; Kishimoto, Kikutani y col., eds.; Kobe,
Japan, 1996) o moléculas CD desveladas en talleres subsiguientes.
Ejemplos de estas moléculas son CD27, CD30, CD39, CD40; y ligandos
de ellas (ligando CD27, ligando CD30 y ligando CD40). Varias de
estas son miembros de la familia de receptores TNF, que también
incluye 41BB y OX40; los ligandos son con frecuencia miembros de la
familia TNF (igual que el ligando 4-1BB y el ligando
OX40); del mismo modo, los miembros de las familias TNF y TNFR
pueden también expresarse usando la presente invención.
Las proteínas que son enzimáticamente activas
pueden también expresarse según esta invención. Ejemplos son los
miembros de la familia de
metaloproteinasa-disintegrina, varias quinasas
(incluso estreptoquinasa y activador plasminogénico de tejido así
como la quinasa asociada a la muerte que contiene repeticiones de
anquirina, e IKR 1 y 2), enzima conversora de
TNF-alfa, y muchas otras enzimas. Los ligandos para
proteínas enzimáticamente activas también pueden expresarse con
aplicación de la presente invención.
Los vectores y procedimientos de la invención
también son útiles para expresar otros tipos de proteínas
recombinantes, incluso moléculas de inmunoglobulinas o porciones de
ellas, y anticuerpos quiméricos (es decir, un anticuerpo que tiene
una región constante humana se acopla a una región enlazante de
antígeno murino) o fragmentos de ellos. Se conocen varias técnicas
por las que el ADN que codifica moléculas de inmunoglobulina puede
manipularse para producir ADN capaz de codificar proteínas
recombinantes como anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos con
afinidad mejorada, u otros polipéptidos basados en anticuerpos (ver,
por ejemplo, Larrick y col., Biotechnology
7:934-938, 1989; Reichmann y col., Nature
332:323-327, 1988; Roberts y col., Nature
328:731-734, 1987; Verhoeyen y col., Science
239:1534-1536, 1988; Chaudhary y col., Nature
339:394-397, 1989).
Varias proteínas de fusión pueden también
expresarse usando los procedimientos y vectores de expresión de la
invención. Ejemplos de estas proteínas de fusión son proteínas
expresadas como fusión con una porción de una molécula de
inmunoglobulina, proteínas expresadas como proteínas de fusión con
una porción de cremallera, y proteínas noveles polifuncionales como
las proteínas de fusión de una citoquina y un factor de crecimiento
(es decir, GM-CSF y IL-3, MGF y
IL-3). Los documentos WO 93/08207 y WO 96/40918
describen la preparación de varias formas solubles oligoméricas de
una molécula llamada CD40L, que incluye una proteína de fusión de
inmunoglobulina y una proteína de fusión de cremallera,
respectivamente; las técnicas descritas en ella son aplicables con
facilidad a otras proteínas.
Como ejemplos adicionales, pueden prepararse ADN
basados en una o más etiquetas de secuencia expresada (EST) de una
biblioteca de EST, insertarse en un vector de la invención y
expresarse para obtener polipéptido recombinante. Además, los ADN
aislados usando EST (por ejemplo, con PCR o la aplicación de otras
técnicas de clonación) también pueden expresarse aplicando la
presente invención. Puede obtenerse información sobre los
polipéptidos arriba mencionados, así como muchos otros, de varias
fuentes públicas, incluso bases de datos electrónicas como GenBank.
Un sitio especialmente útil es el sitio web del National Center for
Biotechnology Information/National Library of Medicine/ National
Institutes of Health (www.ncbi.nlm.nih.gov). Quienes tienen
conocimientos medios en la técnica son capaces de obtener
información necesaria para expresar un polipéptido deseado y aplicar
las técnicas descritas en la presente mediante experimentación de
rutina.
Sin embargo, para el objeto de esta aplicación,
la definición de una proteína de interés excluye los genes que
codifican proteínas que típicamente se usan como marcadores
seleccionables en cultivos de células como marcadores auxotróficos,
antimetabolitos y/o antibióticos. Sin embargo, la invención incluye
el uso de un marcador seleccionable como auxiliar para seleccionar
células y/o amplificar clones modificados genéticamente para
expresar un gen de interés. Con preferencia, el gen marcador
seleccionable se coloca adyacente al gen de interés de modo que la
selección y/o amplificación del gen marcador seleccione y/o
amplifique el gen adyacente.
Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar
realizaciones específicas de la invención. Las personas con
conocimientos medios en la técnica reconocerán con facilidad que la
invención abarca realizaciones adicionales.
Ejemplo
1
Este ejemplo describe la preparación de varios
vectores de expresión para la expresión de una forma soluble de un
receptor de Interleucina-4 humano, llamado
sIL-4R. El ADNc y proteína de IL-4R
humano se desvelan en las patentes estadounidenses 5.840.869 emitida
el 24 de noviembre de 1998; 5.599.905 emitida el 4 de febrero de
1997 y 5.856.296 emitida el 5 de enero de 1999. Las secuencias ID
SEC Nº 5 y 6 presentan la secuencia de nucleótidos y aminoácidos
(respectivamente) de IL-4R humano. Los aminoácidos
-25 a -1 comprenden el líder péptido putativo; se ha encontrado que
el corte ocurre entre los aminoácidos -1 y 1, y entre los
aminoácidos -3 y -2. Los aminoácidos 208 a 231 forman la región
transmembrana. El ADN que codifica sIL-4R del
aminoácido -25 al aminoácido 207 se usó en los vectores de
expresión.
El vector de expresión original, pCAVDHFR es un
derivado de pCD302 (Mosley y col., Cell 89:335-348;
1989) que contiene la secuencia que codifica el DHFR del ratón
(Subramani y col., Mol. Cell. Biol. 1:854, 1981). El vector pCDE es
un derivado de pCAVDHFR que contiene el virus de la
encefalomiocarditis murino (nucleótidos 260 a 824; Jang y Wimmer,
Genes and Dev. 4:1560, 1990) clonado entre el líder tripartito del
adenovirus y la secuencia de ADNc codificante del DHFR. Un elemento
de secuencia aumentador de la expresión (EASE) se incluyó hacia la
dirección 5' del líder CMV. El EASE se describe en la patente
estadounidense 6.027.915, emitida el 22 de febrero de 2000, y en
USSN 09/435.377, presentada el 5 de noviembre de 1999 y ahora
autorizada.
Para permitir la poliadenilación del mensaje
dicistrónico, el sitio de poliadenilación de la hormona del
crecimiento bovino se colocó en el extremo 3' del gen DHFR. El
plásmido pBGH es un vector dicistrónico normal y sirve como control.
Los vectores alternativos de poliadenilación de la presente
invención se construyeron insertando varios sitios de
poliadenilación entre el IL-4R y el IRES. Los
plásmidos pSPA4, pSPA6 y pMLPA se construyeron mediante la inserción
del sitio poliA tardío del SV40, el sitio poliA temprano del SV40 y
un mutante de deleción del sitio poliA tardío del SV40,
respectivamente. El mutante de deleción del sitio poliA tardío del
SV40 se construyó usando PCR para aislar un fragmento del poliA
tardío del SV40, nucleótidos 80 a 222 del ID SEC Nº 1. Un diagrama
de los varios constructos se muestra en la figura 1; las secuencias
de nucleótidos de varios sitios poliA se muestran en la Lista de
Secuencias (SV40 tardío: ID SEC Nº 1; BGH: ID SEC Nº 2; SV40
temprano ID SEC Nº 3).
Los plásmidos se usaron en transfecciones
normales para preparar células transfectadas que expresen
IL-4R. Las células de ovario de hámster chino (CHO)
deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR), células DXB11 (Chasin
y Urlaub, supra) se adaptaron a un medio sin suero basado en
DMEM:F12 suplementado con L-glutamina 2 mM, timidina
90 mM, hipoxantina 90 mM, glicina 120 mM, peptona
Hy-soy (de soja) 5%, y factor de crecimiento 1
similar a la insulina 100 mg/L (Rassmussen y col., Cytotechnology
28:31-42, 1998). Para la selección de DHFR y
amplificaciones de metotrexato, las células se cultivaron en el
mismo medio carente de timidina hipoxantina y glicina. Para la
selección de metotrexato, se agrega metotrexato (MTX; Lederle
Laboratories, Pearl River, NY) al medio de selección en
concentraciones adecuadas. Si se usa selección de neomicina, se
incluye G418 400 mg/ml (Gibco, Grand Island, NY) en el medio. Las
células se transfectan usando transfección de fosfato de calcio
(Wigler y col. supra) o transfección con Lipofectamine^{TM}
como lo recomienda el proveedor (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). El
reactivo Lipofectamine^{TM} es un reactivo disponible en el
mercado para formar complejos de lípidos - ácidos nucleicos (o
liposomas) que, cuando se aplican a células cultivadas, facilitan
la entrada de ácido nucleico a las células.
Ejemplo
2
Este ejemplo describe una técnica de reacción en
cadena de polimerasa (PCR) semicuantitativa que se usó para
confirmar que los mensajes de IL-4R y DHFR
codificados por los plásmidos descritos arriba se realizaron y
proporcionar información sobre los niveles relativos de varios ARNm.
Las células se transfectaron y cultivaron como se describió, y se
obtuvo ARNm usando el equipo de aislamiento de ARN llamado RNeasy
total (Quiagen, Chatsworth, CA) y se trató con ADNsa libre de ARNsa
para reducir la contaminación de ADN. Los cebadores
Oligo-dT se usaron para preparar la primera cadena
ADNc; un cebador de control para la actina se incluyó para facilitar
la cuantifica-
ción.
ción.
La primera cadena se amplificó y la cantidad de
ARN de entrada se determinó usando GeneAmp 5700 de PE Biosystems
(Foster City, CA). Se realizaron 30 ciclos de PCR y se logró la
cuantificación en tiempo real de los productos PCR usando la tinta
de enlace de ADN de doble cadena SYBR Green I (PE Biosystems, Foster
City, CA). Se preparó una curva normal usando cantidades de actina
ADNc, IL-4R ADNc y ADNc de DHFR. La cantidad de ADNc
en cada muestra se normalizó usando la cantidad de actina ADNc. Las
cantidades relativas de IL-4R y DHFR en cada muestra
se muestran en la tabla 2.
| Constructor | IL-4R/Actina | DHFR/Actina |
| pBGH | 4,2 | 7,4 |
| pMPLA | 32,5 | 2,0 |
Estos datos demuestran que las células
transfectadas con el vector de poliadenilación alternativo tienen 8
veces más del mensaje específico IL-4R que el
control, y la cantidad de DHFR se reduce 3,5 veces con respecto al
control. Esta técnica puede usarse para evaluar señales adicionales
de poliadenilación para su uso en los vectores de expresión de la
invención.
Ejemplo
3
Este ejemplo describe un ensayo inmunosorbente
enlazado a enzimas (ELISA) que puede usarse para controlar la
producción de proteínas recombinantes. El ELISA se conoce bien en la
técnica; se han usado adaptaciones de las técnicas desveladas en
Engvall y col., Immunochem. 8:871, 1971 y en la patente
estadounidense 4.703.004 para observar la producción de varias
proteínas recombinantes. En este ensayo, un primer anticuerpo
específico de una proteína de interés (en general un anticuerpo
monoclonal) se inmoviliza a un sustrato (con más frecuencia, una
placa de 96 pocillos), luego se agrega una muestra que contiene la
proteína y se incuba. Una serie de soluciones de una concentración
conocida de la proteína se agregan también y se incuban, para
producir una curva normal. Después de una etapa de lavado para
extraer las proteínas no enlazadas y otros materiales, se agrega un
segundo anticuerpo de la proteína. El segundo anticuerpo se dirige
contra un epitopo de la proteína, y puede ser un anticuerpo
monoclonal o un anticuerpo policlonal.
Un reactivo conjugado que comprende un anticuerpo
que enlaza al segundo anticuerpo conjugado con una enzima como la
peroxidasa de rábano silvestre (HRP) se agrega, sea después de una
segunda etapa de lavado para eliminar la proteína no enlazada, o al
mismo tiempo que se agrega el segundo anticuerpo. Tras un período de
incubación adecuado, el reactivo conjugado no enlazado se extrae
mediante lavado, y una solución en desarrollo que contiene el
sustrato para el conjugado de enzima se agrega a la placa, lo que
causa el desarrollo del color. Las lecturas de densidad ópticas en
una longitud de onda correcta dan valores numéricos para cada
pocillo. Los valores de la muestra se comparan con los valores de
la curva normal, lo que permite que se cuantifiquen los niveles de
la proteína deseada.
Para cuantificar sIL-4R, se
desarrolló un ELISA que usa dos anticuerpos monoclonales (MAb)
dirigidos a diferentes epitopos de IL-4R. El primer
MAb (llamado M10) se absorbió en las placas durante la noche, y la
peroxidasa (HRP) conjugada del segundo anticuerpo (llamado
HRP-M8) se agregó después de una etapa de
lavado.
Ejemplo
4
Este ejemplo describe la transfección de células
CHO con varios constructos y compara la producción de
sIL-4R con conjuntos de células transfectadas. Los
varios plásmidos de expresión sIL-4R se
transfectaron en células CHO usando Lipofectamine^{TM} . Las
células se seleccionaron primero por el fenotipo DHFR+, después se
reunieron y seleccionaron en diferentes concentraciones de MTX. Los
conjuntos de células se hicieron crecer durante dos a tres días, el
fluido sobrenadante se recogió y analizó con ELISA como se describe
en el ejemplo 3, y se determinó la productividad específica
(definida como mg de proteína producida por día por 10^{4}
células). Los resultados de un experimento representativo se
muestran en la tabla 3 siguiente.
| Constructor | Células/ml x 10^{6} | % Viable | ELISA (\mug de proteína) | Productividad específica |
| \mug/10^{6} células/día | ||||
| BGH, control | 1,98 | 94 | 0,3 | 0,12 |
| SPA4, SV40 tardío | 1,57 | 89 | 2,3 | 1,11 |
| SPA6, SV40 temprano | 2,42 | 91 | 3,2 | 1,10 |
| MLPA | 1,81 | 92 | 2,5 | 1,08 |
| PY, virus polioma | 2,4 | 93 | 0,4 | 0,14 |
Estos resultados demostraron que la inserción de
sitios internos poliA entre un ADN que codifica una proteína
recombinante deseada y un ADN que codifica un marcador seleccionable
puede mejorar la expresión de la proteína recombinante deseada a
partir de conjuntos de células transfectadas.
Ejemplo
5
Este ejemplo ilustra la producción de
sIL-4R por conjuntos de células CHO transfectadas
con el transcurso del tiempo. Un alto nivel de expresión fue estable
durante muchos pases. Cuatro transfecciones independientes con el
plásmido MLPA se realizaron esencialmente como se describió antes, y
se pasaron por 20 generaciones. La expresión se observó en cada
cultivo individualmente, y se promediaron los resultados de
productividad específica; los promedios se muestran en la tabla
4.
| Número de pase | Productividad específica | Desviación estándar |
| \mug/10^{6} células/día | ||
| 5 | 1,22 | 0,41 |
| 10 | 1,26 | 0,39 |
| 15 | 1,18 | 0,55 |
| 18 | 1,09 | 0,49 |
| 20 | 1,02 | 0,62 |
Como puede verse en los datos de la Tabla 4, la
expresión permaneció estable durante más de 20 pases. Las células
del pase 20 de dos de los conjuntos se amplificaron en metotrexato 5
nm y se observó su expresión IL-4R; los resultados
se muestran en la Tabla 5. Los conjuntos amplificados demostraron
una expresión aumentada cuando se comparan con conjuntos no
amplificados.
| Número de pase | Productividad específica | Productividad específica |
| Conjunto Nº1 | Conjunto Nº2 | |
| 27 | 1,95 | 1,37 |
| 29 | 2,10 | 1,58 |
| 33 | 2,08 | 1,42 |
Ejemplo
6
Este ejemplo ilustra el efecto de los sitios
poliA internos en los clones de células derivadas de conjuntos
transfectados. Se clonaron células BGH, SPA4 y SPA6 limitando la
solución en presencia de MTX. Se seleccionaron y filtraron varias
colonias según la productividad específica de sIL-4R
como se describió para los conjuntos. Los resultados se muestran en
la Tabla 6.
| Constructor | Nº Clon | Concentración | Células/ml | % Viable | ELISA | Productividad específica |
| MTX | (\mug proteína) | \mug/10^{6} células/día | ||||
| BGH | 3 | 200 | 1,84 | 69 | 14,6 | 4,25 |
| SPA4 | 2 | 50 | 2,26 | 89 | 16,2 | 3,99 |
| SPA6 | 10 | 100 | 1,82 | 94 | 1,6 | 0,47 |
| Constructor | Nº Clon | Concentración | Células/ml | % Viable | ELISA | Productividad específica |
| MTX | (\mug proteína) | \mug/10^{6} células/día | ||||
| SPA6 | 11 | 100 | 1,46 | 83 | 7 | 2,44 |
| SPA6 | 13 | 100 | 0,96 | 67 | 9,3 | 4,40 |
| SPA6 | 16 | 100 | 1,02 | 73 | 0 | 0 |
Estos resultados demuestran que las colonias
tomadas de los conjuntos transfectados con vectores de expresión que
comprenden un sitio poliA interno pueden expresar altos niveles de
la proteína recombinante deseada. Para el objeto de producir grandes
cantidades de proteína recombinante para su uso como fármacos, a
menudo se reamplifican los clones en metotrexato. Para evaluar el
efecto de un sitio poliA interno en el proceso de reamplificación,
el clon 2 del conjunto SPA4 se reamplificó mediante el cultivo de
células para varios pases en concentraciones cada vez mayores de
metotrexato. Cuando las células se recuperaron de la amplificación
con metotrexato con viabilidades de aproximadamente 90%, la
productividad específica se determinó mediante el cultivo de células
durante dos o tres días, recogiendo el fluido sobrenadante y
ensayando el fluido sobrenadante con ELISA para
IL-4R, los resultados se muestran en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
| Constructor | Concentración | Células/ ml | % Viable | ELISA | Productividad específica |
| de metotrexato | (\mug proteína) | \mug/10^{6} células/día | |||
| SPA4-2 | 50 nM | 2,32 | 94 | 18,7 | 4,58 |
| SPA4-2 | 100 nM | 1,66 | 91 | 21,1 | 6,83 |
| SPA4-2 | 150 nM | 1,95 | 90 | 27,7 | 7,86 |
| SPA4-2 | 200 nM | 1,93 | 91 | 28,8 | 8,24 |
Estos resultados demostraron que los clones de
células transfectadas con vectores de expresión que comprenden un
sitio poliA interno pueden reamplificarse, y se esperará que
evidencien una productividad específica más alta.
Ejemplo
7
Este ejemplo describe la preparación de varios
vectores de expresión para la expresión de proteínas recombinantes.
Un vector de expresión que codifica una proteína marcadora
(fosfatasa alcalina secretada o SEAP; Berger y col., Gene 66:1,
1988) se prepara esencialmente como se describió antes, usando el
sitio poliA MLPA internamente; un sitio poliA diferente de BGH puede
usarse como sitio poliA terminal. Se hacen varios cambios a la
secuencia IRES dentro de los vectores de expresión. Como se describe
en Davies y Kaufman (J. Virology 66:1924; 1992), la eficacia de la
traducción de un segundo gen puede manipularse alterando la
secuencia de la IRES en o cerca del punto de unión de la IRES con el
segundo gen, en este caso DHFR. La tabla 8 muestra la secuencia de
nucleótidos agregados a la IRES; la primera base indicada en la
tabla está directamente después del nucleótido 566 del EMCV IRES (ID
SEC Nº 7). Los sitios de comienzo de traducción (ATG) están
subrayados; el ATG 3' es el primer ATG de muDHFR.
\vskip1.000000\baselineskip
| Constructor | Secuencia de ADN en la unión de IRES y DHFR |
| IX-312 | ATTGCTCGAGATCCGTGCCATCATG (ID SEC Nº 8) |
| IXED-1 | ATGATAATATG (ID SEC Nº 9) |
| IXED-3 | ATGATAATATGGCCACAACCATG (ID SEC Nº 10) |
Al agregar secuencias de nucleótidos a IRES se
modula la expresión de DHFR de manera bastante para aumentar el
porcentaje de células transfectadas sin reducir de manera importante
los niveles de la proteína recombinante deseada. Los vectores
(incluso los de control) se usan en las transfecciones normales para
preparar células transfectadas que expresan SEAP esencialmente como
se describe en la presente. Los niveles de expresión de la proteína
marcadora, SEAP, se determinan usando un ensayo cuantitativo como el
disponible de CLONTECH Laboratories (Palo Alto, CA, USA; Yang y
col., Biotechniques 2:1110, 1997)
<110> Immunex Corporation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTORES Y PROCEDIMIENTOS PARA LA
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2902-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> -- a asignar--
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-10-12
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/159,177
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-10-13
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SV40
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bovino
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SV40
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia de reconocimiento de
ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaugaggau uacccaugu
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(1)..(2478)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(76)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(1)..(75)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 826
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> EMCV
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> EMCV
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgctcgag atccgtgcca tcatg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> EMCV
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgataatat g
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> EMCV
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgataatat ggccacaacc atg
\hfill23
Claims (17)
1. Un vector de expresión que comprende, en el
orden siguiente, una secuencia promotora, una primera secuencia
codificante, un sitio de poliadenilación y una segunda secuencia
codificante, en el que no se encuentra ninguna secuencia promotora
entre el sitio de poliadenilación y la secuencia codificante.
2. El vector de expresión de la reivindicación 1,
en el que la segunda secuencia codificante codifica un marcador
seleccionable.
3. El vector de expresión de la reivindicación 2,
en el que el marcador seleccionable es dihidrofolato reductasa.
4. El vector de expresión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que el sitio de
poliadenilación comprende una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en el sitio de poliadenilación tardío del SV40 (ID SEC Nº
1), el sitio de poliadenilación temprano del SV40 (ID SEC Nº 3) y
residuos 80 a 222 de ID SEC Nº 1.
5. El vector de expresión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, en el que un sitio interno
de entrada de ribosoma (IRES) se inserta entre el sitio de
poliadenilación y la segunda secuencia codificante de modo que el
IRES está enlazado operativamente a la segunda secuencia
codificante.
6. El vector de expresión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende un segundo sitio de
poliadenilación a continuación de la segunda secuencia de
codificación y enlazado operativamente a ella.
7. Una célula hospedadora que contiene el vector
de expresión según la reivindicación 6.
8. La célula hospedadora de la reivindicación 7
que comprende una célula hospedadora de mamífero.
9. La célula hospedadora de mamífero de la
reivindicación 8 en la que la primera secuencia codificante codifica
una proteína recombinante.
10. Un procedimiento para obtener una proteína
recombinante, que comprende el cultivo de la célula hospedadora de
mamífero según la reivindicación 9 en condiciones que promueven la
expresión de la proteína recombinante, y recuperar la proteína
recombinante.
11. Un vector de expresión que comprende, en el
orden siguiente, una secuencia promotora, una primera secuencia
codificante, un sitio de poliadenilación que consiste en nucleótidos
80 a 222 de ID SEC Nº 1, y una segunda secuencia de codificación, en
el que no se encuentra ninguna secuencia promotora entre el sitio de
poliadenilación y la segunda secuencia codificante.
12. Una célula hospedadora que contiene el vector
de expresión según la reivindicación 11.
13. La célula hospedadora de la reivindicación 12
que comprende una célula hospedadora de mamífero.
14. La célula hospedadora de mamífero de la
reivindicación 13, en la que la primera secuencia de codificación
codifica una proteína recombinante.
15. Un procedimiento para obtener una proteína
recombinante, que comprende el cultivo de la línea de células de
mamíferos según la reivindicación 14 en condiciones que promueven la
expresión de la proteína recombinante, y recuperar la proteína
recombinante.
16. El vector de expresión de la reivindicación
10, que además comprende un segundo sitio de poliadenilación a
continuación de la segunda secuencia codificante y enlazado
operativamente a ella.
17. Una célula hospedadora de mamífero que
contiene un vector de expresión según la reivindicación 16.
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