KR20090034269A

KR20090034269A - 증강된 유전자 발현능을 갖는 신규 발현 벡터 및 이의 사용방법

Info

Publication number: KR20090034269A
Application number: KR1020080074799A
Authority: KR
Inventors: 칭-타이 린
Original assignee: 진타이 인코포레이티드
Priority date: 2007-10-02
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2009-04-07
Also published as: EP2045330A1; EP2045330B1; CN101402970B; JP2009082130A; CN101402970A; AU2008227056A1; KR101530366B1; US20090087883A1; SG151159A1; JP5554907B2; US8530233B2

Abstract

본 발명은 해당 유전자, 핵 고정 요소 및 적어도 하나의 역반복요소, 바람직하게는 두 개의 역반복요소를 포함하는 신규 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터는 포유류 세포를 형질감염시킬 수 있는 에피좀 벡터이다. 본 발명은 발현 벡터를 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포에 형질감염시킴으로써 유전자 발현을 증강시키는 방법도 제공한다.

발현 벡터, 핵 고정 요소, 역반복요소, 형질감염, 인간 세포

Description

증강된 유전자 발현능을 갖는 신규 발현 벡터 및 이의 사용 방법{NOVEL EXPRESSION VECTOR WITH ENHANCED GENE EXPRESSION CAPACITY AND METHOD FOR USING THE SAME}

본 발명은 포유류 세포에서 유전자 발현을 증강시킬 수 있는 신규 발현 벡터에 관한 것이다. 상기의 발현 벡터는 발현될 유전자 외에도, 핵 고정 요소(a nuclear anchoring element) 및 적어도 하나의 역반복요소(inverted repeat element), 바람직하게는 두 개의 역반복요소를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 발현 벡터를 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포에 형질감염시킴으로써 유전자 발현을 증강시키는 방법에 관한 것이기도 하다.

원핵 발현계에서 인간 재조합 단백질을 발현시키는데에는 통상적인 유전자 발현 방법이 사용된다. 대부분의 인간 재조합 단백질은 글리코실화, g-카르복실화, 또는 g-하이드록실화와 같은 해독후-변형(post-translational modifications) 및/또는 해독중-변형(peri-translational modifications)을 필요로 한다. 그러므로, 원핵 발현계에 대해 잘 알려져 있는 문제점은, 원핵 세포 발현계가 포유류 발현계처럼 해독후 변형 및/또는 해독중 변형을 수행하지 않는다는 점이다. 정상적인 기 능을 위해서 해독후 변형 및/또는 해독중 변형을 필요로 하는 단백질은 원핵 발현계에서 적당하게 발현될 수 없다.

상기의 인간 재조합 단백질을 발현시키는 데 널리 사용되는 또다른 통상적인 유전자 발현 방법은 포유류 발현계이다. 포유류 발현계는 포유류 세포의 해독후 변형 및 해독중 변형을 거칠 수 있는 능력 때문에 포유류 세포를 사용한다.

구체적으로, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary (CHO)) 세포를 사용하는 포유류 발현계는 치료 및 진단 용도를 위한 생약학적(biopharmaceutical) 단백질을 발현시키기 위한 보통의 통상적인 발현계로 대두되었다.

포유류 세포에서 유전자 발현을 증강시키기 위한 통상적인 방법은, 농도가 증가되는 선별제(selection agent)에 대해 단계별로 선별함에 의한, 유전자를 증폭시키는 단계를 포함한다. 포유류 세포에서 유전자 발현을 증강시키기 위한 통상적인 방법의 구체예에서는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하고, 메토트렉세이트(methotrexate (MTX))에 대하여 단계별로 선별하여 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate recuctase (DHFR)) 유전자를 증폭시킨다. 참조: Omasa, 2002, J. Biosci. Bioeng. 94: 600-605.

그렇지만, 단계별 선별은 복잡하고 시간이 소요되는 작업이다. 이 방법을 통해 고수준으로 유전자를 발현시키는 세포를 완성시키기 위해서는 수개월의 시간이 소요되고, 인간이 아닌 포유류 세포에서의 해독후 변형은 인간 세포에서의 변형과 동일하지 않다. 더구나, 이러한 통상적인 유전자 증폭을 통한 유전자 발현 증강 방법은 치료 및 진단 용도를 위한 생약학적 단백질의 제조에서 인간 세포내에 널리 사용되어 오지 않았다. 일반적으로, 인간 세포에서 생성된 인간 단백질은 인간이 아닌 발현계에서 생성된 대응물(counterpart)과 비교하여 유리한 특성을 가질 것이다.

인간 세포내의 미스매치 복구(mismatch repair (MMR)) 시스템은 유전자 증폭을 강하게 억제한다는 것이 관찰된 바 있다. 참조: Lin et al., 2001, Nucleic Acids Res 29, 3304-3310; Chen et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98, 13802- 13807. 그러므로 유전자 증폭에 의해 증강된 유전자 발현은 MMR⁺ (MMR-정상(normal)/MMR-풍부(proficient)) 세포에서 강하게 억제된다. HCT116 세포는 hMLH1 유전자내의 돌연변이로 인하여 MMR^- (MMR-결핍(deficient))이다. HCT116 세포는 유전자 증폭을 통해 유전자 발현을 증강시키도록 한다는 것이 증명된 바 있다. 반대로, HCT116+Ch3 (야생형 hMLH1 유전자를 운반하는 3번 염색체의 도입에 기인한 MMR⁺) 또는 HCT116+hMLH1 (야생형 hMLH1 유전자를 운반하는 cDNA의 도입에 기인한 MMR⁺)는 유전자 증폭에 의해 증강된 약물 내성 유전자 발현을 억제한다.

포유류 세포(특히 인간 세포)에서 기존의 유전자 발현 방법 및 기존의 유전자 발현을 증강시키기 위한 방법의 단점을 극복하기 위해서, 본 발명은, 상기 언급한 문제점을 경감시키고 제거하기 위한 방법을 제공하고자 한다.

발명의 개요

본 발명의 하나의 측면은, 적어도 하나의 유전자; 핵 고정 요소; 및 서로에 대해 상보적인 두 개의 외측 핵산 서열(lateral nucleic acid sequence)을 포함하는 적어도 하나의 역반복(IR) 요소;를 포함하는, 발현 벡터를 제공하는 것이다. 상기 발현 벡터는 에피좀(episomal) 벡터이고, 포유류 세포를 형질감염시킬 수 있는 것을 또 하나의 특징으로서 가진다. 바람직하게는, IR 요소는 두 개의 외측 핵산 서열 사이에 삽입되고 두 개의 외측 핵산 서열 각각과는 서로 상이한 중심 서열(central sequence)을 함유한다. 또한 바람직하게는 발현 벡터는 가령 pGT02-GFP와 같이 하나의 IR 요소를, 더욱 바람직하게는 가령 pGT03-GFP 및 pGT04-ID와 같이 두 개의 IR 요소를 함유한다. 발현 벡터가 두 개의 IR 요소를 함유하는 경우에는, 이러한 두 개의 IR 요소는 동일하거나 상이할 수 있다.

발현 벡터내의 유전자는 단백질을 코딩하거나, 그렇지 않으면 코딩하지 않는(non-coding) RNA로 전사될 수 있다. 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 시그널 펩티드, 성장인자, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 뉴로펩티드, 항원, 항체, 효소, 응고인자, 항-혈관신생 인자(anti-angiogenic factor), 전-혈관신생 인자(pro-angiogenic factor), 수송 단백질, 수용체, 리간드, 조절 단백질, 구조 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 리보자임, 융합 단백질, 및 약물 내성 단백질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 단백질은 천연 유래의 것이거나 인공적으로 변형된 것, 예를 들면 EGFP(즉, 녹색 형광 증강 단백질(enhanced green fluorescent protein))일 수 있는데, 상기 EGFP는 리포터 단백질이다.

코딩하지 않는 RNA는 tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 마이크로-RNA, 및 이중 가닥 RNA를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

포유류 세포는 바람직하게는 인간 세포, 예컨대 미스매치 복구-결핍(MMR^-) 세포 또는 미스매치 복구-풍부(MMR⁺) 세포이다. MMR^- 세포의 예에는 HCT116 (hMLH1^-) 세포 또는 DLD-1(hMSH6^-) 세포가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. MMR⁺ 세포의 예에는 HCT116+ch3 또는 HCT116+hMLH1 세포가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.

핵 고정 요소는 바람직하게는 EBV 핵 단백질 EBNA-1을 코딩하는 EBV (엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus)) 유전자 및 EBV 리플리콘(replicon) oriP이다.

발현 벡터는 포유류 세포에서 유전자의 발현을 증강시킬 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은, 역 이량체(ID, inverted dimer)로서 구성되는, 발현 벡터를 제공하는 것이다. 발현 벡터는 두 개의 역반복(IR) 요소에 의해 구분되는(separated) 두 개의 긴 핵산 서열들을 갖는 환형 핵산 분자이다. 두 개의 긴 핵산 서열 각각은 서로에 대해 상보적이고, 각각은 적어도 하나의 유전자 및 핵 고정 요소를 함유하며; 두 개의 IR 요소의 각각은 두 개의 외측의 핵산 서열을 포함하고; 각각은 서로 상보적이다. 두 개의 IR 요소는 서로 동일하거나 상이하다. ID는 에피좀 벡터이다.

마지막으로, 본 발명은, 포유류 세포에 발현 벡터를 형질감염시켜서 형질감염된 세포를 생성하는 단계; 형질감염된 세포를 배양하여, 형질감염된 세포가 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산하도록 하는 단계; 및 포유류 세포로부터 단백질을 수확하는 단계에 의해 포유류 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 방법을 제공한다.

발현 벡터는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 포유류 세포로 형질감염된다.

본 발명의 기타의 목적, 이점 및 신규의 기술적 특징은, 첨부되는 도면과 함께, 본 발명의 상세한 설명을 보면 더욱 분명히 이해될 것이다.

본 발명은 본 발명의 발현 벡터가 치료용 단백질을 다량 생산하고, 단백질 생산을 위한 최상의 발현계나 세포주를 스크리닝하기 위해서 사용될 수 있음을 증명하였다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

정의

본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 벡터, 특히 에피좀 벡터를 말하는 것이다. 벡터는 일반적으로 특정한 유전자를 표적 세포로 도입한 후 이를 발현시키는데 사용되는 플라스미드이다. 발현 벡터는, 다량의 안정한 mRNA를 생산할 수 있도록 해 준다. 일단 발현 벡터가 세포 내부에 들어가면, 세포내 전사 및 해독 기작에 의해 유전자에 의해 코딩된 단백질이 생산된다. 플라스미드는 다량의 mRNA가 생산될 수 있도록 유발하는 매우 활성인 프로모터를 함유하도록 조작된다. 에피좀 벡터는 숙주 세포내에서 자동적으로 자가 복제할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유전자"는 전사 과정을 통해서, 제어되는 방식으로, 기능적인 RNA 산물을 생산하는 데 필요한 정보를 함유하는 핵산 절편 한 세트를 말하는 것이다. 이러한 RNA는 그 다음에 직접적으로 사용될 수 있거나(예컨대 tRNA, rRNA, snRNA 및 기타의 비-코딩 RNA(예를 들어 SRP RNA), 안티-센스 RNA, 또는 마이크로-RNA), 단백질로 합성될 수 있다. 어구 "단백질을 코딩하는 유전자" 또는 "단백질은 유전자에 의해 코딩된다"가 사용되는 경우, 유전자가 mRNA로 전사되고 난 다음에, 포유류 세포에서 일어나는 후-해독 및 동시-해독을 비롯하여, 단백질로 해독되는 것을 의미한다.

증강된 발현 벡터의 복제계를 통해서 포유류 세포에서 발현될 수 있는 단백질의 예에는 시그널 펩티드, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 뉴로펩티드, 항원, 항체, 효소, 응고인자, 항-혈관신생 인자, 전-혈관신생 인자, 수송 단백질, 수용체, 리간드, 조절 단백질, 구조 단백질, 리포터 유전자, 전사 인자, 리보자임, 융합 단백질, 및 약물 내성 단백질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 단백질은 천연 유래의 것이거나 인공적으로 변형된 것이다.

본원에 사용된 용어 "리포터 유전자"는 세포 배양액, 동물 또는 식물내의 리포터 유전자 외의 해당 유전자에 부착되는 "유전자"를 말하는 것이다. 어떠한 유전 자는 쉽게 동정되고 측정되거나, 선별가능한 마커이기 때문에 리포터로서 선택된다. 리포터 유전자는 일반적으로 해당 유전자가 세포 또는 생물체 집단 내에서 흡수(take up)되거나 발현되는지 여부를 측정하기 위하여 사용된다. 보통 사용되는 리포터 유전자에는 해파리 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 유전자(이는, 세포가 UV 아래에서 녹색으로 빛나도록 유발한다); 효소 루시페라아제(이는, 루시페린과의 반응을 촉매하여 빛을 발생시킨다); lacZ 유전자(이는 유전자가 발현되면 숙주 세포를 푸른색으로 보이게 하는 β-갈락토시다아제 단백질을 코딩한다); 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자(이는 항생제 클로람페니콜에 대한 내성을 부여한다)가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 리포터 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 본원에서는 "리포터 단백질"이라고 부른다.

본원에 사용된 용어 "역반복요소"(이하, "IR"이라고 칭함)는 2개의 외측 핵산 서열 및 선택적인 요소로서 중심 서열을 갖는 핵산 분자를 말하는 것이다. 각 외측 핵산 서열은 서로에 대해 상보적이다. 두 개의 외측 핵산 서열은 회문서열(palindrome)을 형성할 수 있다. 중심 서열은, 두 개의 각 외측 핵산 서열과는 상이한 짧은 핵산 서열로서, 두 개의 외측 핵산 서열 사이에 삽입되어 있으며, 두 개의 외측 핵산 서열로서 형성되어 있는 회문 서열을 파괴한다. 예를 들면, "5'-taatccgga tt tccggatta-3'" 서열을 가진 핵산에서, 두 개의 외측 핵산 서열은 "5'-taatccgga -3'" 및 "5'-tccggatta-3'"이고, 중심 서열은 "5'-tt-3'"이다.

각종 IR은 인간 게놈의 여러가지 상이한 부위에서 발견될 수 있다. 인간 게놈 IR 정보는 공중이 입수가능하다. 예를 들어, 보스턴 대학은 역반복서열 데이터 베이스(Inverted Repeats Database (IRDB))에 대한 공중 리포지터리(public repository)를 보유하고 있는데, 이는 게노믹 DNA내의 IR에 대한 정보를 제공하고, 이들의 분석을 위한 각종 툴을 함유한다. 참조:http://tandem.bu.edu/cgi-bin/ irdb/ irdb . exe. 이들은 현재, Inverted Repeats Finder 알고리즘, 해당 반복 서열을 찾기 위한 퀴어리(query) 및 필터링(filtering) 능력, 서열 유사성에 근거한 반복 클러스터링 알고리즘, PCR 프라이머 선택, 및 각종 포맷으로 다운로드되는 데이터를 포함하고 있다. 뿐만 아니라, IRDB는 집중적인 연구조사 작업장(centralized research workbench)으로서도 기여한다. 이는, 분석 결과를 위한 저장 공간을 제공하고 데이터 및 분석을 개인적으로 소장하기 위한 공동제작자(collaborators)도 허용한다. 기타, IR에는 Lyu, Lin 및 Liu(Lyu et al., 1999, J. Mol. Biol., 285:1485-1501)가 기술한 것들도 포함된다. IR은 또한 인공적으로 디자인될 수도 있다.

본원에 사용된 용어 "역 이량체(inverted dimer)"(이하, "ID"로 칭함)는 두 개의 IR 요소에 의해 구분되는 두 개의 긴 핵산 서열을 함유하는 환형의 핵산 분자를 말하는 것이다. 두 개의 긴 핵산 서열 각각은 서로에 대해 상보적이고, 각각 적어도 하나의 유전자 및 핵산 고정 요소를 함유한다. ID는 두 개의 말단 IR을 함유하는 선형 DNA 기질로부터 생성된다. 이론적으로는 두 개의 말단 IR을 함유하는 선형 DNA 기질은, 세포내에서 엑소뉴클레아제 또는 헬리카아제/뉴클레아제(helicase/nuclease)에 의해 진행되는 것을 통해 아령모양 DNA 중간체로 전환된다. 두 가지 유형의 환형 ID가 엑소뉴클레아제/헬리카아제의 특이성에 따라 생성될 수 있다. 첫번째 유형에서, 이중 가닥의 5'→3' 또는 3'→5' 엑소뉴클레아제는 반대 방향 DNA 가닥 상의 튀어나온 단일 가닥 DNA로서 두 개의 말단 IR을 노출시킬 수 있다. 역반복 자리(site)에서 말단 헤어핀 루프(terminal hairpin loops)가 형성되면, 이는 DNA를 말단 루프를 갖는 아령 모양 중간체로 전환시킨다. 이어지는 DNA 복제를 통해, 아령 모양 DNA는 환형 역 이량체로 전환된다. 두번째 유형에서, 동일하거나 상이한 엑소뉴클레아제/헬리카아제는 선형 DNA 기질을 단일 가닥 DNA로 전환시킬 수 있다. 이것은 한쪽 끝으로부터 차례대로 진행되는 하나의 엑소뉴클레아제 또는 헬리카제에 의해 달성될 수 있다. 단일 가닥 DNA 상에 IR이 어닐링되면 말단 루프를 갖는 아령 모양의 DNA가 형성된다. 추후에 DNA 복제가 되면 아령 모양 DNA는 환형 역 이량체로 전환된다. 참조: Lin et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 3529-3538(이 문헌은 본원에 참조로서 인용된다).

용어 "핵 고정 요소(nuclear anchoring element)"는 세포의 핵에 함유된, 특히 인간 세포의 핵에 함유된 핵산 분자의 핵산 서열을 말하는 것이다. 이 핵산 분자는 벡터이고, 핵 고정 요소를 가지면서, 핵의 핵 기질에 고정된다. 대표적인 핵 고정 요소에는 EBV 핵 단백질(예를 들면, 핵 항원-1 [EBNA-1])을 코딩하는 EBV 유전자 및 EBV 오리진(즉 EBV 리플리콘, oriP); 파포바바이러스(papovavirus)의 복제 오리진 및 파포바바이러스 라지 T 항원(large T antigen); 또는 폴리오마바이러스(polyomavirus (Py)) 오리진(PyOri) 및 라지 T(LT) 항원 유전자(PyLT)가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 참조: Heffernan and Dennis, 1991, Nucleic Acids Res. 19:85-92.

바람직한 핵 고정 요소는 EBV 유전자 및 EBV 오리진이다. EBV 유전자 및 EBV 오리진의 고정 효과는 oriP 서열이 고친화도를 가지고 기질에 부착되는 것(Jankelevich et al., 1992, EMBO J., 11, 1165-1176; Mattia et al., 1999, Virology 262, 9-17)과, 오리진 결합 단백질인 EBNA-1과 oriP가 상호작용하는 것(Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell Biol. 5, 2533-2542; Polvino-Bodnar and Schaffer, 1992, Virology 187, 591-603; Yates et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3806-3810)으로부터 기인하는 것으로 증명된 바 있다.

본 발명에 따르면, 적어도 하나의 역반복요소를 포함하거나 역 이량체로서 구성된 발현 벡터가 제작된다. 이들 벡터는 유전자 발현을 현저하게 증가시키기 위해서 선별될 것으로 증명되었다. 선별 제제에 대해서 내성인 유전자를 발현시키는 경우에, 세포는 하나의 단계로 고농도의 선별 제제를 사용하여 선별될 수 있다. 발현 벡터에 의해 발현되는 단백질은 MMR⁺ 인간 세포에서도 신속하고 효과적으로 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 세포내에서 적어도 하나의 단백질을 제조하기 위한 방법이고, 하기의 (a) 내지 (d) 단계를 포함한다:

(a) 적어도 하나의 핵 고정 요소, 적어도 하나의 유전자; 및 적어도 하나의 역반복요소를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

(b) 발현 벡터를 포유류 세포에 형질감염시켜서 형질감염된 세포를 생성시키 는 단계;

(c) 형질감염된 세포를 배양하여, 형질감염된 세포가 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산할 수 있도록 하는 단계; 및

(d) 단백질을 수확하는 단계.

발현 벡터에 의해 운반되는 유전자를 발현시키는데 사용될 바람직한 포유류 세포에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(human embryonic kidney (HEK293)) 세포, hMLH1^-/- 의 인간 직장결장 암종 세포(HCT116, HCT116+ch3, 및 HCT116+hMLH1), 인간 결장암 세포(DLD-1 (hMSH6^-))가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다.

하기의 실험은 예시적인 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 당업자에 의하여 일어날 수 있는 것과 같은 합리적인 변형은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 일어날 수 있다.

실시예 1

발현 벡터의 제작 및 형질감염

도 1a를 참조로 하여 설명하면, 시판되는 pEGFP-N1 플라스미드(Clontech, CA), 시판되는 pDR2(Clontech, CA) 플라스미드에서 유래한 EBV-계(based) p220.2 플라스미드 및 시판되는 pMAMneo 플라스미드(Clontech, CA)를 사용하여 pGT01-GFP 플라스미드를 제작하였다.

pEGFP-N1 플라스미드는 BglII 및 BamHI 및 XhoI 제한 자리를 포함하여 여러 개의 클로닝 자리를 가진다.

pEGFP-N1 플라스미드를 BglII 및 BamHI 제한 효소로 분해하여(digested), 여러개의 클로닝 자리로부터 XhoI 제한 자리를 제거하고, 선형 pEGFP-N1 DNA를 얻었다. 선형 pEGFP-N1 DNA는 아가로스 겔 정제 후 스스로 연결되었다(underwent self-ligation). XhoI 자리가 제거되었는지는 EcoRI에 의한 분해로 확인하였다. XhoI이 제거된 pEGFP-N1 플라스미드가 얻어졌다. AflII 및 ApaLI 제한 효소로, XhoI가 제거된 pEGFP-N1 플라스미드를 분해시킴으로써, EGFP 단백질을 코딩하는 EGFP 코딩 서열(CDS)을 갖는 EGFP 유전자와 EGFP CDS를 유도하는(driving) CMV 프로모터가 얻어졌다.

도 1a, 1b, 및 1c를 참조로 하여 설명하면, 플라스미드 pGT01-GFP는 핵 고정 요소, 하이그로마이신 B 내성에 대한 유전자, 앰피실린 내성에 대한 유전자, HindIII 제한 자리, AflII 제한 자리, PvuII 제한 자리, XhoI 제한 자리 및 BamHI 제한 자리를 가진다. EGFP 유전자는 유전자로서, BamHI 제한 자리로 삽입될 수 있다. 핵 고정 요소는 EBV 핵 단백질 EBNA-1을 코딩하는 EBV 유전자 및 EBV 리플리콘 oriP를 포함한다.

플라스미드 pGT01-GFP는 pMAMneo 플라스미드의 BamHI-HindIII 단편과 함께, p220.2 플라스미드로부터 주로 수득되었다.

두 개의 H 절편을 외측 핵산 서열로서 포함하고, 역반복요소의 중심 서열로서 P 절편을 포함하는, 역반복요소인 HPH 단편을 pHPH 플라스미드로부터 수득하였다. pHPH 플라스미드를 pBR322로부터 생성시켰다(Bi and Liu, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 819-823). HPH 단편은 pHPH 플라스미드에서 HPH/tet 카세트(cassette)로서 형성되었고, P 절편의 방향에 따라 의존하여 작동하는, 기능적인 테트라사이클린 유전자의 전사를 조절하는 유전자 스위치(genetic switch)였다.

짧아진 HPH 단편은 NruI 분해에 의해 pHPH 플라스미드(Lin et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3009-3016)로부터 수득되었다.

플라스미드 pGT02-GFP은, 첫번째 역반복요소로서 HPH 단편을 블런트 말단(blunted) BamHI 자리에 클로닝하고, AflII 제한 자리에 EGFP 유전자를 클로닝함으로써 생성되었다.

플라스미드 pGT03-GFP은 두번째 역반복요소로서 HPH 단편을 첫번째 역반복요소의 P의 방향과 반대 방향으로 pGT02-GFP의 PvuII 제한 자리에 추가로 클로닝시킴으로써 생성되었다. 첫번째 역반복요소와 두번째 역반복요소의 서로 다른 방향은 제한 효소 분해에 의해 결정하였다.

도 2를 참조로 하여 설명하면, pGT03-GFP를 XhoI 효소로 분해하고, 겔 정제하여, 선형 pGT03-GFP DNA를 얻었다.

선형 pGT03-GFP DNA는 두 개의 말단을 가졌고, 첫번째 역반복요소 및 두번째 역반복요소는 각각 말단 근처에 위치한다.

선형 pGT03-GFP DNA를 변성시켜(denatured) 단일 가닥의 선형 pGT03-GFP DNA를 함유하는 중성화된(neutralized) DNA 용액을 수득하였다. 선형 pGT03-GFP DNA의 변성은 소정의 부피의(a volume of) 0.1 N NaOH로 알칼리 변성처리함으로써 달성하 였다.

동부피의 0.1N HCl과 1/10의 부피의 1M Tris (pH 7.8)를 중화된 용액에 첨가하고, 이에 의해 DNA 용액을 냉각시켰다(quench). 중화된 DNA 용액을 37℃에서 10분동안 간단히 인큐베이션한 다음에 얼음에서 보관하였다.

첫번째 역반복요소의 외측 핵산 서열 각각(H 절편)을 서로 어닐링되게 하였고; 또한 두번째 역반복요소의 외측 핵산 서열도 서로 어닐링되게 하였다.

헤어핀 모양의 구조가 단일 가닥 선형 pGT03-GFP DNA의 각 두 개의 양쪽 말단 근처에서 형성되어, 스스로 어닐링되는 단일 가닥의 선형 pGT03-GFP DNA가 수득되었다. 도 2를 참조로 하여 설명하면, 스스로 어닐링되는 단일 가닥 선형 pGT03-GFP DNA의 말단 사이에는 갭(gap)이 형성되었다. 스스로 어닐링되는 단일 가닥 선형 pGT03-GFP DNA에 처리하여, 갭을 채우고 아령 모양의 DNA를 수득하기 위해, DNA 플리머라아제 및 리가아제를 사용할 수 있다(Lin et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3009-3016; Lin et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 3529-3538).

스스로 어닐링되는 단일 가닥의 선형 pGT03-GFP DNA를 E. coli DH5α(RecA^-)에 도입하여, DNA가 복제되게 하였고, 도 2에 보이는 바와 같이 아령 모양의 DNA로부터 이중 가닥 DNA 플라스미드가 생성되게 하였다. 이중 가닥 DNA 플라스미드를 HindIII/NotI 분해로 선별하여, 역 이량체 pGT04/ID를 얻었다.

제작된 pGT01-GFP, pGT02-GFP, pGT03-GFP 및 pGT04/ID는 발현 벡터로서 사용되었고, 이들을 시판되는 Nuleofector system(Amaxa, Germany)을 사용하여, 제조업 자의 지침에 따라, 일렉트로포레이션을 통해 세포로 형질감염시키는 데 사용하였다. 형질감염된 세포는 24-48시간 동안 배양시킨 다음에, 안정한 클론을 선별하기 위해서 50 ㎍/ml의 하이그로마이신 B를 첨가하였다.

본 발명에 따른 주요 목표는, 형질감염된 세포의 유전자 발현을 증강시키는 것이다. 이를 위해서, 인간 세포에서 복제될 수 있는 발현 벡터는, 핵 고정 요소를 함유시킴으로써, 연장된 배양 기간 동안에 분자를 유지하게 하도록 디자인되었다. 이 실시예에서, 핵 고정 요소는 EBNA-1 및 oriP를 포함한다. EBNA-1 및 oriP를 함유하는 벡터 또는 발현 벡터는 또한 EBV 벡터라고도 알려져 있다. EBV 벡터는 oriP 서열을 함유하는 고친화도로 기질에 부착되는 영역을 통해서, 핵 기질에 고정되는 것으로 증명된 바 있다(Jankelevich et al., 1992, EMBO J., 11, 1165-1176; Mattia et al., 1999, Virology, 262, 9-17). 뿐만 아니라, 오리진 결합 단백질인 EBNA-1과 oriP의 상호작용이, 영장류 세포(primate cells)에서의 EBV 벡터 복제, 분리(segregation) 및 보유(retention)를 위해 요구된다(Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell Biol. 5, 2533-2542; Polvino-Bodnar and Schaffer, 1992, Virology 187, 591-603; Yates et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3806-3810). 도 1a, 1b, 및 1c를 추가로 참조하여 설명하면, 적어도 하나의 역반복요소에 의해 매개되는 DNA 재배열이, 증가된 약물 선별을 통한 유전자 발현 및 유전자 카피를 추가로 증강시킬 수 있는지를 증명하기 위하여, EBV 요소 및 적어도 하나의 역반복(IR) 요소를 함유하는 발현 벡터를 상기에 기술된 바와 같이 제작하였다. CMV 프로모터에 의해 유도되는 EGFP 단백질을 코딩하는 EGFP 유전자는, 유전자로서 발현 벡터 각각으로 클로닝되었다. 도 2를 참조하여 설명하면, 역 이량체인 pGT04/ID는 IR-매개 재배열을 통해 pGT03-GFP로부터 생성된 DNA 산물이었다.

실시예 2

세포의 제조

HCT116 (hMLH1^-/-의 인간 직장결장 암종) 세포를 C. R. Boland 박사(UCSD, CA)로부터 입수하였다(Koi et al., 1994, Cancer Res. 54, 4308-4312; ATCC#CCL-247).

야생형 hMLH1 cDNA를 포함하는(harboring) 플라스미드 pC9MLHWT(CMV 프로모터의 제어 하에 있는 것)를 B. Vogelstein 박사로부터 입수하였다.

플라스미드 pC9MLHWT를 미스매치 복구 기능을 회복시키기 위하여 일렉트로포레이션에 의해 HCT116 세포를 형질감염시키는 데 사용하였다(Lin et al., Nucleic Acids Res. 29, 3304-3310). hMLH1 단백질을 발현하는 생성된 G418-내성 클론은 HCT116+hMLH1로 명명하였다. HCT116+hMLH1 세포는 100 ㎍/ml의 G418의 존재하에 배양하였다.

다른 직장암 세포주 DLD-1 (hMSH6^-) (ATCC#CCL-221)를 Thomas A. Kunkel 박사 (NIEHS, NC)로부터 입수하였다. DLD-1 세포는 10% 송아지 혈청이 보충된 RPMI 완전 배지에서 배양하였다.

실시예 3

인리치먼트 어세이( Enrichment assay )

약 1x10⁴ 서브컨플루언트(subconfluent) 세포를, RPMI-1640 완전 배지 또는 시판되는 10% 송아지 혈청(Gibco)이 보충된 DMEM 배지가 함유된 100 x 20 mm 배양 접시에 시딩하고(seeded), 24시간 후에 약물 선별하였다. 배지의 영양분이 소모됨에 따라 세포 폐기물도 축적되었으며, 사용한 배지는 일정 기간 후 새 배지로 갈아주었다. 배지를 새로 갈아준 후, 하이그로마이신 B를 정해진 농도로 각 플레이트에 첨가하였다. 배양 접시를 5% CO₂가 보충된 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 하이그로마이신 B에 의해 유도된 세포독성에 따라, 세포를 처리 2 내지 4일 후에, 새 배지로 갈아주었다. 생존한 콜로니를 생장 10-14일 후에 관찰하였다. 100 x 20 mm 배양 접시에 500개 세포를 시딩하고, 생장 10일 후 콜로니를 계수함으로써 세포주의 플레이팅 효율을 측정하였다.

실시예 4

(1) 녹색 형광 증강 단백질( EGFP ) 생산의 측정

세포를 PBS로 1회 세척한 후, 트립신처리한 다음에 PBS에서 재현탁시켰다. EGFP의 녹색 형광을 480 nm의 여기 파장 및 525 nm의 방출 파장에서 FACS Vantage cell sorter (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 측정하였다.

(2) 증강된 재조합 유전자 발현

인간 결장암 세포 DLD-1, HCT116, 및 HCT116+hMLH1를 발현 벡터 각각에 형질감염시킨 다음에, 하이그로마이신 B 50 ㎍/ml로 안정한 클론을 선별하였다. 각 안정한 클론 중 여러개의 안정한 클론 세포를 배양하였다. 각 인간 결장암 세포 중의 1 x 10⁴ 안정한 클론 세포를 시딩하고, 400 ㎍/ml 또는 1000 ㎍/ml의 하이그로마이신 B를 함유하는 배지에서 추가로 배양하였다.

도 3a, 3b, 3c 및 3d를 참조로 설명하면, pGT04/ID로 형질감염된 결장암 세포주 DLD-1 (MMR^-) 및 HCT116 (MMR^-) 세포는 하이그로마이신 B 1000 ㎍/ml로 선별하였을 때 적어도 하나의 역반복요소를 가진 세포보다 50배 이상 더 콜로니를 만들었다. 도 4a를 참조로 하여 설명하면, 하이그로마이신 B 400 ㎍/ml 또는 1000 ㎍/ml에서 배양했을 때, 유동세포계수기를 통해, 증가된 수율의 EGFP가 세포에서 관찰되었다.

실시예 5

웨스턴 블롯팅

프로테아제 억제제의 칵테일(cocktail)은 세린, 시스테인, 아스파르트산 프로테아제 및 아미노펩티다아제와 같은 프로테아제의 억제에 대한 폭넓은 특이성을 가진 프로테아제 억제제의 혼합물이다. 프로테아제 억제제의 칵테일은 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(AEBSF), pepstatinA, E-64, bestatin, leupeptin, 및 aprotinin을 함유할 수 있다. 프로테아제 억제제의 칵테일은 금속 킬레이터를 함유하지 않을 수 있다. 프로테아제 억제제의 칵테일은 시판되는 것일 수 있다.

세포 추출물을 프로테아제 억제제의 칵테일(Sigma)을 함유하는 용균완충액(50 mM HEPES pH 7.6, 0.5% SDS, 1% 나트륨 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 5 mM EDTA) 중에서 제조하였다. 동일한 양의 단백질 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Amersham)으로 일렉트로블롯팅하였다. GFP에 대한 항체(Chemicon International) 및 액틴에 대한 항체(1-19; Santa Cruz Biotechnology)를 웨스턴 블롯팅을 수행하기 위하여 사용하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제(Sigma)에 컨쥬게이팅된 2차 항체 및 증강된 화학발광제(ECL; Amersham)를 검출을 위해 사용하였다.

도 4b를 참조로 하여 설명하면, 웨스턴 블롯팅에 의해, 하이그로마이신 B 50 ㎍/ml, 400 ㎍/ml, 또는 1000 ㎍/ml에서 배양시에 세포에서 증가된 수율의 EGFP가 관찰되었다.

결과

상기의 실시예는 핵 고정 요소 및 IR 요소를 모두 함유하는 발현 벡터는 MMR^- 및 MMR⁺세포 모두에서 유전자의 트랜스진(transgene) 발현을 증강시킨다는 것을 명백히 증명하였다.

본 발명의 실험은 핵 고정 요소, 하나 또는 두 개의 IR 요소, 두 개의 약물 내성 유전자(즉, 하이그로마이신 B-내성 유전자 및 앰피실린 유전자) 및 리포터 유 전자(즉, EGFP 유전자)를 함유하는 발현 벡터를 인간 세포에 형질감염시킴으로써 수행되었다. 도 3에서 보이는 것처럼, 하이그로마이신 1000 ㎍에서 더 많은 클론이 생존되었다는 발견에 의해 증명되는 바와 같이, 형질감염된 세포는 약물 내성(즉, 하이그로마이신 B-내성) 면에서의 현저한 개선을 증명하였다. 또한, 도 4에서 보이는 것처럼, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 EGFP의 형광 광도가 더 높고, 염색도 더 많이 된 것에서 증명되는 바와 같이, 더 높은 농도의 하이그로마이신 B에서 생존된 클론에서의 EGFP 농도는, 더 낮은 농도의 하이그로마이신 B 및 대조군(발현 벡터에 의해 형질감염되지 않은 것)에서 생존된 것보다 유의하게 더 많았다. 상기 결과는 형질감염된 세포에서 유전자 증폭 및 발현이 증강되었음을 확인해주는 것이다. 가장 중요한 것은, 이러한 개선은 MMR-결핍 세포(유전자 증폭 및 발현이 억제되지 않은 것) 뿐만 아니라, MMR-풍부 세포(이는 유전자 증폭 및 발현을 억제하는 효과를 가질 것이다)에서도 발견되었다는 점이다.

본 발명에서 제작되는 각종 벡터 중에서, 환형 역 이량체("ID")로서 제작된 pGT04/ID 발현 벡터가, 숙주 세포에서 가장 높은 약물 내성 효과 및 EGFP 농도를 제공하였다.

당업자라면, 본원에 사용된 바와 같은 약물 내성 유전자 및 EGFP 유전자는 다른 단백질, 예컨대 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 뉴로펩티드, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 항-혈관신생 인자, 전-혈관신생 인자, 수송 단백질, 수용체, 리간드, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 및 리보자임을 코딩하는 유전자로 치환될 수 있음을 잘 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 발 현 벡터가 치료용 단백질을 다량 생산하기 위해서, 그리고 단백질 생산을 위한 최상의 발현계 또는 세포주를 스크리닝하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 증명하였다.

본 발명의 다양한 특징 및 이점을 본 발명의 구조 및 기술적 특징의 상세한 기술과 함께, 전술한 발명의 상세한 설명에 제공하였지만, 이러한 개시는 단지 예시적인 것에 불과한 것이다. 상세한 내용의 변화, 특히 본 발명의 원칙을 이루는 것의 형태, 크기, 및 배열은 본 발명의 정의의 가장 넓은 일반적 의미에 의해 나타내어지는 범위에까지 변화가 이루어질 수 있고, 이러한 것은 첨부되는 청구항에 나타내어져 있다.

도 1a는 본 발명에 따른 발현 벡터 pGT01-GFP의 지도(map)이다.

도 1b는 본 발명에 따른 발현 벡터 pGT02-GFP의 지도이다.

도 1c는 본 발명에 따른 발현 벡터 pGT03-GFP의 지도이다.

도 2는 도 1c에서의 발현 벡터 pGT03-GFP로부터 발현 벡터 pGT04/ID를 생성시키기 위한 흐름도이다.

도 3a는 pGT03-GFP 또는 pGT04/ID로 형질감염된 DLD-1 (hMSH6^-) 세포의 사진인데, 여기에서 형질감염된 세포는 400 ㎍/ml 또는 1000 ㎍/ml의 하이그로마이신 B로 처리된 것이다.

도 3b는 pGT02-GFP, pGT03-GFP 또는 pGT04/ID로 형질감염된 HCT116(hMLH1^-) 세포 또는 HCT116+hMLH1 세포의 사진인데, 여기에서 형질감염된 세포는 1000 ㎍/ml의 하이그로마이신 B로 처리된 것이다.

도 3c는 도 3a에서의 형질감염된 세포의 생존한 콜로니를 나타내는 막대 그래프이다.

도 3d는 도 3b의 pGT03-GFP 또는 pGT04/ID로 형질감염된 세포의 생존한 콜로니를 나타내는 막대 그래프이다.

도 4a는 세포 수에 대하여, pGT04/ID로 형질감염되고, 50 ㎍/ml, 400 ㎍/ml 또는 1000 ㎍/ml의 하이그로마이신 B로 처리된 DLD-1 세포의 녹색 형광 강도를 나 타내는 그래프이다.

도 4b는 도 4a의 세포의 EGFP 발현의 웨스턴-블롯팅 분석을 나타내는 사진이다. 형질전환되지 않은 DLD-1 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 단백질 로딩 수준의 조절은 세포 추출물로 이루어진 겔 중에서 항-액틴 모노클로날(monoclonal) 항체로 수행하였다(데이터는 제시하지 않음).

Claims

적어도 하나의 유전자;

핵 고정 요소; 및

서로 상보적인 두 개의 외측의 핵산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 역반복(IR) 요소를 포함하는 발현 벡터로서,

상기 발현 벡터는 포유류 세포를 형질감염시킬 수 있고; 상기 발현 벡터는 포유류 세포내의 에피좀 벡터인 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 시그널 펩티드, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 뉴로펩티드, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 항-혈관신생 인자, 전-혈관신생 인자, 수송 단백질, 수용체, 리간드, 조절 단백질, 구조 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 리보자임, 융합 단백질, 및 약물 내성 단백질로 구성되는 군 에서 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 발현 벡터.
제2항에 있어서, 상기 단백질은 천연 유래의 것이거나 인공적으로 변형된 것인 발현 벡터.
제3항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 녹색 형광 증강 단백질(EGFP)인 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 마이크로-RNA, 및 이중 가닥 RNA로 구성되는 군에서 선택되는 RNA로 전사되는 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간 세포인 것인 발현 벡터.
제6항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-결핍(MMR^-) 세포인 것인 발현 벡터.
제7항에 있어서, 상기 MMR^- 세포는 HCT116(hMLH1^-) 세포 또는 DLD-1(hMSH6^-) 세포인 것인 발현 벡터.
제6항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-풍부(MMR⁺) 세포인 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 핵 고정 요소는 EBV 핵 단백질 EBNA-1을 코딩하는 EBV(엡스타인-바 바이러스)(Epstein-Barr Virus) 유전자 및 EBV 리플리콘 oriP를 포함하는 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 IR 요소는 두 개의 외측 핵산 서열 사이에 삽입되어 있고 상기 두 개의 외측 핵산 서열 각각과는 상이한 중심 서열을 추가로 포함하는 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기의 적어도 하나의 IR 요소는 하나의 IR 요소를 함유하는 것인 발현 벡터.
제12항에 있어서, 상기 발현 벡터는 pGT02-GFP인 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 IR 요소는 두 개의 IR 요소를 함유하는 것이고, 상기의 두 개의 IR 요소는 서로 동일하거나 상이한 것인 발현 벡터.
제14항에 있어서, 상기의 발현 벡터는 pGT03-GFP 또는 pGT04-ID인 것인 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기의 발현 벡터는 포유류 세포내에서 유전자 발현을 증강 시킬 수 있는 것인 발현 벡터.
제1항에 따른 발현 벡터를 포함하는 인간 세포.
제17항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-결핍 세포(MMR^-세포)인 것인 인간 세포.
제17항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-풍부 세포(MMR⁺세포)인 것인 인간 세포.
두 개의 역반복(IR) 요소에 의해 구분되는 두 개의 긴 서열들을 갖는 환형 핵산 분자를 포함하는 역 이량체(ID)로서 구성된 발현 벡터로서;

상기 두 개의 긴 서열 각각은 서로에 대해 상보적이고, 각각은

적어도 하나의 유전자; 및

핵 고정 요소를 함유하는 것이며;

상기의 두 개의 IR 요소 각각은 두 개의 외측의 핵산 서열을 포함하고; 각각 은 서로 상보적이며; 상기 두 개의 IR 요소는 서로 동일하거나 상이하고;

상기 발현 벡터는 포유류 세포내의 에피좀 벡터인 것인 발현 벡터.
제20항에 있어서, 상기 유전자는 시그널 펩티드, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 뉴로펩티드, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 항-혈관신생 인자, 전-혈관신생 인자, 수송 단백질, 수용체, 리간드, 조절 단백질, 구조 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 리보자임, 융합 단백질, 및 약물 내성 단백질로 구성되는 군 에서 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 발현 벡터.
제20항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간 세포인 것인 발현 벡터.
제22항에 있어서, 상기 발현 벡터는 미스매치 복구-결핍 세포인 것인 발현 벡터.
제22항에 있어서, 상기 발현 벡터는 미스매치 복구-풍부 세포인 것인 발현 벡터.
제20항에 따른 발현 벡터를 포함하는 인간 세포.
제25항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-결핍 세포(MMR^- 세포)인 것인 인간 세포.
제25항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-풍부 세포(MMR⁺세포)인 것인 인간 세포.
제1항에 따른 발현 벡터를 포유류 세포에 형질감염시켜 형질감염된 세포를 생성하는 단계;

상기의 형질감염된 세포를 배양하여 상기의 형질감염된 세포가 상기의 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산하도록 하는 단계; 및

상기의 포유류 세포로부터 상기의 단백질을 수확하는 단계를 포함하는, 포유류 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 방법.
제28항에 있어서, 상기 유전자는 시그널 펩티드, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 뉴로펩티드, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 항-혈관신생 인자, 전 -혈관신생 인자, 수송 단백질, 수용체, 리간드, 조절 단백질, 구조 단백질, 리포터 단백질, 전사 인자, 리보자임, 융합 단백질, 및 약물 내성 단백질로 구성되는 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 방법.
제28항에 있어서, 상기 유전자는 tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 마이크로-RNA, 및 이중 가닥 RNA로 구성되는 군에서 선택되는 RNA로 전사되는 것인 방법.
제28항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간 세포인 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-결핍(MMR^-) 세포인 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 MMR^- 세포는 HCT116(hMLH1^-) 세포 또는 DLD-1 (hMSH6^-) 세포인 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 인간 세포는 미스매치 복구-풍부(MMR⁺) 세포인 것인 방법.
제20항에 따른 발현 벡터를 포유류 세포에 형질감염시켜 형질감염된 세포를 생성하는 단계;

상기의 형질감염된 세포를 배양하여 상기의 형질감염된 세포가 상기의 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산하도록 하는 단계; 및

상기의 포유류 세포로부터 상기의 단백질을 수확하는 단계를 포함하는, 포유류 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 방법.