CN101402970B - 基因扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种能在哺乳动物细胞中进行表达的表达载体，其包括有一欲表达的基因、一核锚定(nuclear anchoring)元件、及至少一反向重复(inverted repeat，IR)元件。本发明另关于一种藉由将前述表达载体转染(transfect)于诸如人类等哺乳类细胞以加强基因表达的方法。
Description
技术领域
本发明是关于一种能在哺乳动物细胞中进行表达的表达载体(expression vector)，其包括有一欲表达的基因、一核锚定(nuclear anchoring)元件、及至少一反向重复(inverted repeat，IR)元件。本发明另关于一种藉由将所述表达载体转染(transfect)于诸如人类等哺乳类细胞以加强基因表达的方法。
背景技术
即有基因表达方法是于原核表达系统中表达人类重组蛋白质。大多数的人类重组蛋白质需要进行转译后或转译时修饰作用(post-and/orperi-translational modifications)，诸如糖基化作用(glycosilation)、g-羧化作用(g-carboxylation)或g-羟化作用(g-hydroxylation)。因此，一个关于原核表达系统的已知问题是原核表达系统无法实行哺乳类表达系统所提供的转译后或转译时修饰作用。于是在原核表达系统中，将无法正常地表达需要进行转译后或转译时修饰作用才能发挥正常功能的蛋白质。
另一被广泛用以表达所述人类重组蛋白的既有方法是采用一哺乳类表达系统。哺乳类表达系统使用哺乳类细胞以利用其实行转译后或转译时修饰作用的能力。尤其是中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞已经常规化地被用以表达生物医药蛋白以供治疗与诊断。
于哺乳类细胞中加强基因表达的既有方法包括有一以提高选择剂(selection agent)浓度来进行逐步选择的步骤。这种于哺乳类细胞中加强基因表达的既有方法的一实施例是采用中国仓鼠卵巢细胞并以甲氨喋呤(methotrexate，MTX，或称“灭杀除癌锭”)逐步地选择二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)基因。可参阅Omasa，2002，J.Biosci.Bioeng.94：600-605。
然而，前述逐步选择的方式既繁琐又耗时。其过程需经数月才能达到让细胞内基因大量表达的目的，更何况在非人类的哺乳类细胞中的转译后修饰与人类细胞所实行的不尽相同。且这种具有基因扩增(gene amplification)的既有加强基因表达方法，并未被广泛地用于人类细胞中以生产生物医药蛋白以供治疗与诊断。一般而言，在人类细胞中产出的人类蛋白质应比以其它非人类系统所生的更具优势。
研究者已观察到一种错配修复(mismatch repair，MMR)系统，其于人类细胞中强效地压抑基因扩增。可参照Lin et al.，2001，Nucleic Acids Res 29，3304-3310；Chen et al.，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98，13802-13807。因此藉由基因扩增而加强的基因表达在错配修复系统正常(MMR-normal/MMR-proficient，或记为MMR+)细胞中亦受压抑。HCT116细胞是导因于hMLH1基因突变的错配修复系统缺陷(MMR-deficient，或记为MMR-)细胞。已知HCT116细胞能够藉由基因扩增加强基因表达。相对之下，HCT116+Ch3(藉由引入含有野生型hMLH1基因的第3对染色体于其中而具备正常错配修复系统)则压抑藉由基因扩增而加强的抗药基因表达。
发明内容
为克服前述在哺乳类细胞中(尤其是人类细胞中)既有基因表达方法与既有加强基因表达方法的缺点，本发明的目的在于提供一种能够去除或改善前述问题的方法。
为达到前述目的，本发明所采用的一种技术手段是提供一种表达载体(expression vector)，其包括有至少一基因、一核锚定(nuclear anchoring)元件以及至少一反向重复元件(inverted repeat，IR)，其中该反向重复元件具有二侧面核酸序列(lateral nucleic acid sequences)，各侧面核酸序列互补(complementary)于另一侧面核酸序列。又，所述表达载体是一位于所述哺乳类细胞内的游离型载体(episomal vector)且是得用以转染一哺乳类细胞的表达载体。
较佳的是，所述反向重复元件进一步包括有一中介序列(centralsequence)，其位于所述二侧面核酸序列之间，且相异于所述二侧面核酸序列之中的任一侧面核酸序列。
又，较佳的是，所述表达载体是如pGT02-GFP包括有一反向重复元件；更佳的是，所述表达载体是如pGT03-GFP或pGT04-ID包括有二反向重复元件。在所述包括有二反向重复元件的情况下，所述二反向重复元件可为彼此相同者或彼此相异。
所述表达载体的基因可为一编码一蛋白质的基因或一可被转录(transcribe)为一非编码RNA(non-coding RNA)的基因。由前述基因所编码的蛋白质可为但不限于信号肽(signal peptide)、生长因子(growth factor)、激素(hormone)、细胞介素(cytokine)、趋化因子(chemokine)、神经肽(neuropeptide)、抗原(antigen)、抗体(antibody)、酶(enzyme，酵素)、凝血因子(clotting factor)、抗血管生成因子(anti-angiogenic factor)、促血管生成因子(pro-angiogenic factor)、转运蛋白(transport protein)、受体(receptor)、配体(ligand)、调控蛋白(regulatory protein)、结构蛋白(structural protein)、报告蛋白(reporter protein)、转录因子(transcription factor)、核糖酶(ribozyme)、融合蛋白(fusion protein)或耐药蛋白(drug-resistance protein，抗药蛋白)。所述蛋白质可为天然蛋白质(protein of natural origin)或经人工修饰(artificiallymodified)的蛋白质，例如作为报告蛋白的增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent protein，EGFP)。
所述非编码RNA可为但不限于tRNA、rRNA、反义RNA(antisenseRNA)、微RNA(micro-RNA)或双链RNA(double stranded RNA)。
较佳的是，所述哺乳类细胞是一人类细胞，且可为一错配修复系统缺陷(mismatch repair-deficient，MMR-)细胞或一错配修复系统正常(mismatchrepair-proficient，MMR+)细胞。所述错配修复系统缺陷细胞可为但不限于一HCT116(hMLH1-)细胞或一DLD-1(hMSH6-)细胞。所述错配修复系统正常细胞可为但不限于一HCT116+ch3细胞或一HCT116+hMLH1细胞。
较佳的是，所述核锚定元件(nuclear-anchoring element)包括有一编码EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)核蛋白EBNA-1的EB病毒基因以及一EB病毒复制起点(origin of replication)oriP。
又，所述表达载体是得用以于哺乳类细胞中加强所述基因的表达的表达载体。
本发明所采用的另一技术手段是提供一种构成(organized as)反向二聚体(inverted dimer，ID)的表达载体，其包括有一具有二长序列(long sequence)的环形核酸分子(circular nucleic acid molecule)，所述二长序列是被二反向重复元件所分隔；
其中，所述二长序列彼此互补，且各长序列包括有至少一基因以及一核锚定元件；
又，所述各反向重复元件具有二侧面核酸序列，各侧面核酸序列互补于另一侧面核酸序列，所述二反向重复元件彼此相同或相异，而所述表达载体是得用以转染一哺乳类细胞的表达载体；且所述表达载体是一位于所述哺乳类细胞内的游离型载体。
此外本发明另采用的又一技术手段是提供一种于一哺乳类细胞中表达一基因的方法，该方法包括有：以本发明所述的表达载体转染所述哺乳类细胞以制成一转染细胞(transfected cell)；培养(culturing)所述转染细胞以令该转染细胞制造所述基因所编码的蛋白质；以及获取所述蛋白质等步骤。
所述表达载体可以采用电穿孔法(electroporation)送入所述哺孔类细胞。
本发明中，所述的哺乳类细胞、人类细胞不包含人类的生殖细胞、不包含人类受精卵、不包含人类胚胎也不包含人类胚胎干细胞。
为更进一步描述本发明的标的、改善及创新技术将配合附图详述于后。
附图说明
图1A是关于本发明的表达载体pGT01-GFP的图谱(map)。
图1B是关于本发明的表达载体pGT02-GFP的图谱。
图1C是关于本发明的表达载体pGT03-GFP的图谱。
图2是由图1C所示表达载体pGT03-GFP制作(generating)表达载体pGT04/ID的流程图。
图3A是以pGT03-GFP或pGT04/ID转染的DLD-1(hMSH6-)细胞，且该转染细胞是施以400μg/ml或1000μg/ml的潮霉素B(hygromycin B)处理。
图3B是以pGT02-GFP、pGT03-GFP或pGT04/ID转染的HCT116(hMLH1-)细胞或HCT116+hMLH1细胞，且该转染细胞是施以1000μg/ml的潮霉素B处理。
图3C是呈现图3A转染细胞存活群落(colony)数量的柱状图。
图3D是呈现图3B中pGT03-GFP或pGT04/ID转染细胞存活群落数量的柱状图。
图4A是细胞数对绿色荧光强度(intensity)的图表，其中所示的是以pGT04/ID转染并施以50μg/ml、400μg/ml或1000μg/ml潮霉素B处理的DLD-1(hMSH6-)细胞。
图4B是图4A所示细胞的免疫印迹法(Western-blotting，西方点墨法)分析图；其以未受转染的DLD-1细胞作为阴性对照组(negative control)。又，关于其于细胞萃取物的凝胶中施用抗肌动蛋白的单株抗体以作为蛋白质加载量(loading level)的对照组(control)则未示于本图。
具体实施方式
定义
用语「表达载体(expression vector)」于此定义为一载体，尤为一游离型载体(episomal vector)；其中所谓载体者，一般为一质粒(plasmid，质体)，其是用以被引入(introduce)一靶细胞(target cell，标的细胞)并于该靶细胞内表达一特定基因。所述表达载体可被用以制造大量的mRNA。当所述表达载体位于所述靶细胞内时，可藉由细胞的转录(transcription)及转译(translation)机制而制造一由所述特定基因所编码的蛋白质。所述质粒是具高效启动子(promoter)以制造大量的mRNA。一游离型载体则得被用以于其宿主细胞(host cell)中自主地(autonomously)自我复制(self-replicating)。
用语「基因(gene)」于此定义为一组核酸(nucleic acid)片段(segments)，其包括有为藉由转录过程(transcription process)调控并制造一功能性RNA产品所需的信息(information)。藉此，所述RNA即可被直接使用(例如：tRNA、rRNA、snRNAs及其它如SRP RNA等非编码RNA(non-coding RNA)、反义RNA(anti-sense RNA)或微RNA(micro-RNA))，抑或是用以引导(direct)蛋白质的合成。在「一基因编码一蛋白质」或「一蛋白质为一基因所编码」等语句中，其义为所述基因是被转录为一mRNA，而该mRNA进而被转译为一蛋白质，且可能进一步包括有哺乳类细胞的转译后及/或转译时修饰作用(post-and/or peri-translational modifications)。可通过所述表达载体所提供的一种加强复制系统(enhanced replication system)于哺乳类细胞中表达的蛋白质可为但不限于信号肽、生长因子、激素、细胞介素、趋化因子、神经肽、抗原、抗体、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、转运蛋白、受体、配体、调控蛋白、结构蛋白、报告蛋白、转录因子、核糖酶、融合蛋白或耐药蛋白。又所述蛋白质可为天然蛋白质或经人工修饰的蛋白质。
用语「报告基因(reporter gene)」于此定义为一基因，其结合于另一在细胞培养(cell culture)、动物或植物中欲使用的基因(another gene ofinterest)。某些基因之所以被选为报告基因是因其易于检测，或可用作选别标志(selectable marker)。报告基因主要被用以判断所述欲使用基因是否已进入细胞或是否已表达于细胞或有机体群落(organism population)中。常用的报告基因包括有但不限于编码水母绿色荧光蛋白(GFP)而能够使细胞在紫外光下发出荧光者、编码荧光素酶(luciferase)而能够催化荧光素(luciferin)发光者、编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)以让宿主细胞呈现蓝色的lacZ基因、以及可对于氯霉素产生抗性的氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)基因。为报告基因所编码的蛋白质被称为「报告蛋白」。
用语「反向重复(inverted repeat，IR)元件」于此定义为一核酸分子，其包括有二侧面核酸序列(lateral nucleic acid sequences)，且可进一步包括有一中介序列(central sequence)。各侧面核酸序列互补(complementary)于另一侧面核酸序列。所述二侧面核酸序列可形成为回文(palindrome)结构。所述中介序列是一异于所述二侧面核酸序列的短核酸序列，其插置于所述二侧面核酸序列之间，从而破坏所述二侧面核酸序列所形成的回文结构。例如：设一核酸具有「5′-taatccgga tt tccggatta-3′」的序列，其中相当于二侧面核酸序列的即分别为「5′-taatccgga-3′」与「5′-tccggatta-3′」，而相当于中介序列的则为「5′-tt-3′」。
为数众多的反向重复元件散见于人类基因体的不同部位。关于这些位于人类基因体的反向重复元件的信息是公众可得而知的。例如：波士顿大学(Boston University)维护一反向重复数据库(Inverted Repeats Database，IRDB)并对外公开，其不仅提供关于基因体DNA中反向重复元件的信息，更包括有多种分析用工具。可参照网站：「https://tandem.bu.edu/cgi-bin/irdb/irdb.exe」，现提供反向重复搜寻算法(Inverted Repeats Finder algorithm)、查询及筛选特定重复(repeat)元件的功能、基于序列相似度(similarity)的重复丛集运算法(repeat clustering algorithms)、PCR引物(PCR primer)选用功能、以及数种格式的数据下载功能。此外，前述反向重复数据库可作为一集中式的研究平台(centralized research workbench)，其提供了供储存分析结果的空间，且可在多数使用者之间共同分享数据与分析。又所述的反向重复元件可见于Lyu、Lin及Liu等人的著作(Lyu et al.，1999，J.Mol.Biol.，285：1485-1501)；且反向重复元件亦可人为设计。
用语「反向二聚体(inverted dimer，ID)」于此定义为一具有二长序列(longsequence)的环形核酸分子(circular nucleic acid molecule)，所述二长序列被二反向重复元件所分隔；其中，所述二长序列彼此互补，且各长序列包括有至少一基因以及一核锚定元件。所述反向二聚体可自一包括有二终端(terminal)反向重复元件的直链形DNA(linear DNA)底物(substrate)制成。理论上，所述具有二终端反向重复元件的直链形DNA底物是藉由细胞中的外切核酸酶(exonuclease)或螺旋酶/核酸酶(helicase/nuclease)的作用转变为一哑铃状的DNA中间产物(intermediate)。藉由螺旋酶/核酸酶的特异性可产出二种类的环状反向二聚体。就第一种类而言，一针对双链进行5′端至3′端(5′→3′)或3′端至5′端(3′→5′)的外切核酸酶可以所述二终端反向重复元件在相对链的DNA上外露为突出的单链DNA。在所述反向重复元件处所形成终端发夹圈将令所述DNA转变成一个具有终端圈(terminal loops)的哑铃状中间产物。后续的DNA复制过程则将所述哑铃状中间产物转变成环形反向二聚体。就第二种类而言，与所述相同或相异的外切核酸酶/螺旋酶可将所述直链形DNA底物转变为单链DNA。可采用单一外切核酸酶或螺施酶自一端进行处理。反向重复元件藉单链DNA黏合(annealing)将形成具有终端圈的哑铃状DNA。后续的DNA复制过程则将所述哑铃状DNA转变成环形反向二聚体。请参阅参考文献所载：Lin et al.，2001，Nucleic Acids Res.29：3529-3538。
用语「核锚定元件(nuclear anchoring element)」于此定义为一核酸分子的核酸序列，其被保持(retain)在一细胞的细胞核中，尤其是在一人类细胞的细胞核中。此核酸分子，作为一具有所述核锚定元件的载体，是锚定于核仁(nucleus)的细胞核基质(nuclear matrix)中。核锚定元件的例示包括有但不限于一编码EBV核蛋白的EBV基因(例如核抗原-1(nuclearantigen-1)[EBNA-1])及一EBV复制起点(例如EBV复制子(replicon)的oriP复制起点)、一乳多泡病毒(papovavirus)复制起点及一乳多泡病毒大T抗原(large T antigen)、或一多瘤病毒(polyomavirus，Py)的复制起点(PyOri)及大T(large T，LT)抗原的基因(PyLT)，请参阅Heffernan and Dennis，1991，NucleicAcids Res.19：85-92。
较受偏好的核锚定元件是前述EBV基因及EBV复制起点。所述EBV基因及EBV复制起点的锚定效果是导因于oriP序列的高亲和性(high-affinity)基质附着(matrix attachment)(Jankelevich et al.，1992，EMBO J.，11，1165-1176；Mattia et al.，1999，Virology 262，9-17)以及oriP与复制起点结合蛋白(origin binding protein)EBNA-1之间的交互作用(interaction)(Luptonand Levine，1985，Mol.Cell Biol.5，2533-2542；Polvino-Bodnar and Schaffer，1992，Virology 187，591-603；Yates et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，3806-3810)。
在本发明中，构建了包括有至少一反向重复元件或形成为反向二聚体的表达载体。这些载体可被选择以有效地提升基因表达。当用以表达一对抗选择剂的抗性基因(resistance gene)时，可以在单一步骤中采用高浓度的选择剂来选择细胞。即使在错配修复系统正常人类细胞之中，亦能够迅速而有效地获取由前述表达载体所表达的蛋白质。
本发明的方法是用以在细胞中生产至少一蛋白质并包括有下列步骤：
(a)准备一表达载体，其包括有至少一核锚定元件、至少一基因、以及至少一反向重复元件；
(b)转染所述表达载体于一哺乳类细胞以获取一转染细胞；
(c)培养所述转染细胞以让该转染细胞制造一为所述基因所编码的蛋白质；以及
(d)获取所述蛋白质。
所述用以表达所述表达载体的基因的哺乳类细胞较佳是但不限于：中国仓鼠卵巢细胞、人类胚胎肾脏细胞(HEK293)细胞、hMLH1-/-的人类大肠肿瘤(HCT116)细胞、引入第3对染色体的HCT116细胞(HCT116+ch3cell)、引入hMLH1基因的HCT116细胞(HCT116+hMLH1 cell)、人类结肠癌(DLD-1(hMSH6-))细胞。
以下的实验设计是用以描述本发明而非意图限定本发明的范围。对所属领域中具有通常知识的技术人员而言，可实行的合理变化调整将不逸脱本发明的范围。
实施例1
构建(Construction)并转染表达载体
如图1A所示，一商业上可购得的pEGFP-N1质粒(Clontech，CA)、一源于商业上可购得pDR2质粒(Clontech，CA)且基于EB病毒的p220.2质粒、以及一商业上可购得的pMAMneo质粒(Clontech，CA)是被用以构筑一pGT01-GFP质粒。
所述pEGFP-N1质粒具有多个克隆位点(cloning sites)，包括有一BglII、一BamHI、以及一XhoI限制酶切位点(restriction sites)。
所述pEGFP-N1质粒是先以BglII限制酶与BamHI限制酶处理，以自所述多个克隆位点之中排除所述XhoI限制酶切位点，并获取一直链形pEGFP-N1 DNA。在经过琼脂凝胶(agarose gel)纯化后，再让所述直链形pEGFP-N1 DNA进行自我连接(self-ligation)，且以EcoRI限制酶的截切(digest)确认XhoI限制酶切位点已遭排除，进而获取一无XhoI限制酶切位点的pEGFP-N1质粒。藉由以AflII与ApaLI限制酶截切所述无XhoI限制酶切位点的pEGFP-N1质粒，可获取一增强型绿色荧光基因(EGFP gene)以及一驱动(driving)所述增强型绿色荧光蛋白基因的巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子。其中，所述增强型绿色荧光基因具有一编码增强型绿色荧光蛋白的增强型绿色荧光蛋白编码序列(coding sequence)。
如图1A、图1B及图1C所示，一pGT01-GFP质粒具有一核锚定元件、一潮霉素B(hygromycin B)抗性基因、一安比西林(ampicillin，氨苄青霉素)抗性基因、一HindIII限制酶切位点、一AflII限制酶切位点、一PvuII限制酶切位点、一XhoI限制酶切位点、以及一BamHI限制酶切位点。所述增强型绿色荧光基因是作为一基因被插入在所述BamHI限制酶切位点。其核锚定元件包括有一编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及一EBV的oriP复制起点。
所述pEGFP-N1质粒是主要源自于所述p220.2质粒、以及所述pMAMneo质粒的BamHI-HindIII片段。
一HPH片段是一反向重复元作，且包括有位于二端的二H片段(segment)与位于中间之一P片段。所述HPH片段是取自一pHPH质粒。所述pHPH质粒是自pBR322质粒所制成(Bi and Liu，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，819-823)。所述HPH片段作为一HPH/tet片匣(cassette)存在于所述pHPH质粒上，其是一基因开关(genetic switch)，藉由所述P段落的指向(orientation)来调控具有功能的(functional)四环霉素(tetracycline)基因转录(transcription)。
削短的(shortened)所述HPH片段可藉由NruI限制酶截切而自一pHPH质粒(Lin et al.，1997，Nucleic Acids Res.25，3009-3016)取得。
一pGT02-GFP质粒是藉由克隆(cloning)所述HPH片段至平滑的(blunted)BamHI限制酶切位点作为第一反向重复元件，并藉由克隆一增强型绿色荧光基因至AflII限制酶切位点而制成。
一pGT03-GFP质粒是更进一步克隆所述HPH片段至所述pGT02-GFP质粒的PvuII限制酶切位点作为第二反向重复元件，且令所述第二反向重复元件的P片段与所述第一反向重复元件的P片段具有相反的指向。藉由限制酶截切的方式可以决定所述第一反向重复元件P片段与所述第二反向重复元件P片段间相对指向的关系。
请配合参照图2，所述pGT03-GFP质粒是以XhoI限制酶截切，并经过凝胶纯化(gel-purification)以获取一直链形pGT03-GFP DNA。
所述直链形pGT03-GFP DNA具有二端所述第一反向重复元件与所述第二反向重复元件是分别位于所述二端。
所述直链形pGT03-GFP DNA被变性(denatured)以获取一变性的(denatured)DNA溶液，溶液内含单链(single stranded)直链形pGT03-GFPDNA。可采用相当于所述DNA溶液容积(a volume)且最后浓度为0.1N氢氧化钠(NaOH)溶液对前述双链直链形pGT03-GFP DNA进行碱性变性。
等容积(an equal volume)的0.1N盐酸(HCl)溶液与十分之一容积的1M三羟甲基胺基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane，简称Tris)缓冲液(pH7.8)被加入前述DNA溶液进行中和并停止(quench)变性。被中和的DNA溶液暂时置于摄氏37度10分钟后再移至冰上，以让第一反向重复元件各H片段是相互黏合，并让第二反向重复元件各H片段亦相互黏合。
于所述单链直链形pGT03-GFP DNA二端形成类发夹结构(hairpin-likestructure)，以获取一自我黏合(self-annealing)的单链直链形pGT03-GFPDNA。如图2所示，在所述自我黏合的单链直链形pGT03-GFP DNA的二端之间形成一间隙(gap)。可采用DNA聚合酶(DNA polymerase)与连接酶(ligase)处理所述自我黏合的单链直链形pGT03-GFP DNA以封闭所述间隙并获取一哑铃形状的自我黏合的单链直链形pGT03-GFP DNA(Lin et al.，1997，Nucleic Acids Res.25，3009-3016；Lin et al.，2001，Nucleic Acids Res.29：3529-3538)。
所述哑铃形状的自我黏合的单链直链形pGT03-GFP DNA是被引入至一DH5α(RecA-)大肠杆菌(E.coli)之中，以进行DNA复制(DNA replication)并自所述哑铃形状的自我黏合的单链直链形pGT03-GFP DNA产生一双链DNA质粒(请参照图2)。所述双链DNA质粒是以HindIII限制酶与NotI限制酶截切并进行选择以获取一pGT04/ID反向二聚体。
被构建的pGT01-GFP质粒、pGT02-GFP质粒、pGT03-GFP质粒、以及pGT04/ID反向二聚体，是作为表达载体，藉由电穿孔(electroporation)以转染至细胞中。所述电穿孔可采用诸如商业上可得的Nuleofector system(Amaxa，Germany)，依据其制造者提供的指引实行。转染细胞(transfected cell)经24至48小时培养后加入50μg/ml的潮霉素B以选择稳定的克隆(clone，殖系)。
本发明的主要目的在于加强转染细胞的基因表达。为此，所述可在人类细胞中复制的表达载体被设计为包括有核锚定元件，以便渡过长时间的培养期间。在本实施例中，所述核锚定元件包括有编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP复制起点。一包括有编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP复制起点的载体，或一包括有编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP复制起点的表达载体皆可被称为EBV载体。一EBV载体藉由包括有oriP序列的高亲和性基质附着区域锚定于细胞核基质(Jankelevich et al.，1992，EMBO J.，11，1165-1176；Mattia etal.，1999，Virology，262，9-17)。
此外，oriP与复制起点结合蛋白EBNA-1之间的交互作用对于EBV载体在灵长类细胞中的复制、分离(segregation)、以及保留(retention)而言是必要的(Lupton and Levine，1985，Mol.Cell Biol.5，2533-2542；Polvino-Bodnarand Schaffer，1992，Virology 187，591-603；Yates et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，3806-3810)。请再参阅图1A、图1B及图1C，所述包括有EBV元件与至少一反向重复元件的表达载体的结构，是为了确认是否可以藉由至少一反向重复元件所调控(mediate)的DNA结构(DNA rearrangement)进而藉由被增加的药物选择与被增加的基因复本(copy)来加强基因表达。所述编码增强型绿色荧光蛋白且受巨细胞病毒启动子所驱动的增强型绿色荧光基因是作为基因被克隆进入所述各表达载体中。请配合参阅图2，所述pGT04/ID反向二聚体是藉由反向重复元件调控的方式自所述pGT03-GFP质粒制得。
实施例2
齐备细胞(准备细胞)
HCT116(hMLH1-/-之人类大肠肿瘤)细胞是来自Dr.C.R.Boland(UCSD，CA)(Koi et al.，1994，Cancer Res.54，4308-4312；ATCC#CCL-247)。
pC9MLHWT质粒包含有由巨细胞病毒启动子所控制野生型(wild-type)hMLH1互补DNA(complement DNA，cDNA)，其藉电穿孔转染HCT116细胞以回复错配修复功能。所述pC9MLHWT质粒是来自Dr.B.Vogelstein(Lin et al.，Nucleic Acids Res.29，3304-3310)。其表达hMLH1蛋白的G418抗性克隆(G418-resistant clone)被称为HCT116+hMLH1。HCT116+hMLH1细胞是于含有100μg/ml G418的环境下培养。
另一人类结肠癌细胞DLD-1(hMSH6-)(ATCC#CCL-221)是来自Dr.Thomas A.Kunkel(NIEHS，NC)。DLD-1细胞是于添加10％胎牛血清(fetalbovine serum)的完整RPMI培养基(complete RPMI medium)中培养。
实施例3
富集测定
在进行药物选择(drug selection)的24小时前，约1x104的未汇合细胞被殖于(seed)含有完整RPMI-1640培养基或添加10％胎牛血清(可自Gibco商业获得)DMEM培养基的100x20mm培养皿(culture dish)中。随着培养基营养消耗以及细胞废弃物(cell waste)的累积，经过一定的期间即以新鲜的培养基更新老化的(aged)培养基。在更新培养基后，在各盘(plate)中加入指定浓度的潮霉素B。所述培养皿是培养于摄氏37度并添加5％二氧化碳的培养器(incubator)中。随着潮霉素B所带来的细胞毒性，在处理2至4日后，重新补充新鲜的培养基予细胞。存活的群落(colony)在10至14日后观察其生长状态。将细胞殖于培养皿中的生长效率(plating efficiency)的测量方法是藉由将500细胞殖入100x20mm培养皿中，待其生长10日后再计算其群落数目。
实施例4
(1)测量绿色荧光蛋白生产量
以PBS清洗细胞、并进行胰蛋白酶处理使细胞悬浮于PBS。接着使用一荧光激发细胞分选器(FACS Vantage cell sorter)(Becton Dickinson，Mountain View，CA)以激发波长(excitation wavelength)480nm及放射波长(emission wavelength)525nm测定绿色荧光蛋白的绿色荧光。
(2)加强重组基因表达
作为人类结肠癌细胞的DLD-1细胞、HCT116细胞、以及HCT116+hMLH1细胞是转染所述各种表达载体并以50μg/ml潮霉素B选择稳定克隆。于各稳定克隆均培养了多个稳定克隆细胞。各种人类结肠癌细胞采1x104稳定克隆细胞殖于培养皿并于包括有400μg/ml或1000μg/ml潮霉素B的培养基中进行培养。
如图3A、图3B、图3C及图3D所示，在1000μg/ml潮霉素B的选择条件下，转染pGT04/ID反向二聚体的结肠癌细胞克隆DLD-1(MMR-)细胞与HCT116(MMR-)细胞比其它具有至少一反向重复元件的细胞具高于50倍的群落数目。请配合参阅图4A，在400μg/ml或1000μg/ml潮霉素B的选择条件下，以流动式细胞测量术(flow cytometry)测得增加的绿色荧光蛋白产出量(yield)。
实施例5
蛋白质印迹法
一蛋白酶抑制剂混合物(cocktail of protease inhibitors)对于诸如丝氨酸(serine)、半胱氨酸(cysteine)及天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases)与氨肽酶(aminopeptidases)等具有广泛的特异性(specificity)。一蛋白酶抑制剂混合物可包括有4-(2-氨乙基)氟化苯磺酰(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride，AEBSF)、胃蛋白酶抑制剂(pepstatinA)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(E-64)、氨肽酶抑制剂(bestatin)、亮抑酶肽(leupeptin)、以及抑胰肽酶(aprotinin)。一蛋白酶抑制剂混合物可不含金属螯合物(metal chelator)，亦得以自商业公司获得。
细胞萃取物(cell extracts)是在含有蛋白酶抑制剂混合物的溶解缓冲液(lysis buffer)(含50mM HEPES pH 7.6、0.5％SDS、1％脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)、以及5mM EDTA)(Sigma)中制备而成。部分蛋白质样本是于12％SDS-PAGE琼胶上分离，并以电转渍(electroblot)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)膜(Amersham)上。蛋白质印迹法是采用一GFP抗体(Chemicon International)及一肌动蛋白(actin)抗体(1-19；Santa CruzBiotechnology)进行。接合有辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的二次抗体(Secondary antibodies)(Sigma)与加强化学发光测定系统(enhancedchemiluminescence)(ECL；Amersham)则被用以进行侦测。
如图4B所示，在50μg/ml、400μg/ml或1000μg/ml潮霉素B的条件下培养的细胞以蛋白质印迹法观察到增加的绿色荧光蛋白产出量。
结果
上述实施例清楚地表示出具有核锚定元件与反向重复元件的表达载体，无论在错配修复系统缺陷与错配修复系统正常细胞中都加强了转染基因(transgene)的基因表达。
本发明所提及的实验是将具有核锚定元件、一或二个反向重复元件、二抗药基因(例如潮霉素B抗性基因与安比西林抗性基因)、以及一报告基因(例如增强型绿色荧光蛋白基因)的表达载体转染至人类细胞中。如图3A-D所示，由于更多克隆在1000μg潮霉素B存活，转染细胞表示出抗药性(drug-resistance)大幅地改善(例如对于潮霉素B抗性)。又如图4A-B所示，由提升的荧光强度(intensity of fluorescence)与SDS-polyacrylamide琼胶上较高的绿色荧光蛋白染色，可知在高浓度潮霉素B存活的克隆明显地比低浓度潮霉素B存活的对照组克隆(其未经表达载体转染)具有较高浓度的荧光蛋白。此结果确认了在转染细胞中基因扩增与基因表达均受到加强。最为明显的是这些改善非仅见于错配修复系统缺陷细胞(其无法压抑基因扩增与基因表达)中，在错配修复系统正常细胞(其通常具有压抑基因扩增与基因表达之效果)中亦有这些改善。
在本发明中构筑的各载体中，pGT04/ID反向双聚体作为表达载体是构成为环状反向二聚体(circular inverted dimer，circular ID)，其在宿主细胞(hostcell)中提供最高的抗药性效果与绿色荧光蛋白浓度。
所属技术领域的技术人员将可以理解所使用的所述抗药基因与绿色荧光基因可以采用编码其它蛋白质的基因代换，例如生长因子、激素、细胞介素、趋化因子、神经肽、抗原、抗体、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、转运蛋白、受体、配体、调控蛋白、结构蛋白、转录因子、核糖酶。
虽然本发明的许多特性与优点已如上记述，关于本发明详细的结构与性质，上述的揭露用意在于说明本发明。对于本发明的细部可进行修改，尤其是在本发明揭露的原则下，依照申请专利范围用语最广泛的解释对于形状、大小以及部件配置进行修改。
Claims (27)
1.一种表达载体，该表达载体是具有二长序列的环形双链核酸分子，所述二长序列被二反向重复元件所分隔，其中一个长序列的一端和另一个长序列的一端被其中一个反向重复元件所分隔，所述其中一个长序列的另一端和所述另一个长序列的另一端被另一个反向重复元件所分隔；
其中，所述二长序列彼此完全互补，且各长序列包括有；
至少一基因；以及
至少一核锚定元件；
并且，所述各反向重复元件，其具有二侧面核酸序列，各侧面核酸序列完全互补于另一侧面核酸序列；其中，所述反向重复元件进一步包括有一中介序列，其位于所述二侧面核酸序列之间，且相异于所述二侧面核酸序列之中的任一侧面核酸序列；
该表达载体是能够于哺乳类细胞中加强所述基因的表达的构成反向二聚体的表达载体；
其中，所述表达载体是能够转染一哺乳类细胞的表达载体；且
所述表达载体是一能够用于所述哺乳类细胞内的游离型载体。
2.如权利要求1所述的表达载体，其中，所述基因编码一蛋白质，该蛋白质选自由信号肽、生长因子、细胞介素、趋化因子、神经肽、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、转运蛋白、受体、配体、调控蛋白、结构蛋白、报告蛋白、转录因子、融合蛋白以及耐药蛋白所构成的群组。
3.如权利要求2所述的表达载体，其中，所述受体、配体是抗原、抗体。
4.如权利要求2所述的表达载体，其中，所述酶是核糖酶。
5.如权利要求2所述的表达载体，其中，所述调控蛋白是激素。
6.如权利要求2所述的表达载体，其中，所述蛋白质是天然蛋白质或经人工修饰的蛋白质。
7.如权利要求6所述的表达载体，其中，所述报告蛋白是增强型绿色荧光蛋白。
8.如权利要求1所述的表达载体，其中，所述基因是转录为一RNA，该RNA选自由tRNA、rRNA、反义RNA、微RNA以及双链RNA所构成的群组。
9.如权利要求1所述的表达载体，其中，所述哺乳类细胞是人类细胞。
10.如权利要求9所述的表达载体，其中，所述人类细胞是错配修复系统缺陷细胞。
11.如权利要求10所述的表达载体，其中，所述错配修复系统缺陷细胞是HCT116细胞或DLD-1细胞。
12.如权利要求9所述的表达载体，其中，所述人类细胞是错配修复系统正常细胞。
13.如权利要求1所述的表达载体，其中，所述核锚定元件包括有一编码EB病毒核蛋白EBNA-1的EB病毒基因以及一EB病毒复制子oriP。
14.如权利要求7所述的表达载体，其中，所述核锚定元件包括有一编码EB病毒核蛋白EBNA-1的EB病毒基因以及一EB病毒复制子oriP，而且所述表达载体具有潮霉素B抗性基因。
15.一种包括有如权利要求1所述表达载体的人类细胞，所述的人类细胞不包含人类的生殖细胞、不包含人类受精卵、不包含人类胚胎也不包含人类胚胎干细胞。
16.如权利要求15所述的人类细胞，该人类细胞是一错配修复系统缺陷细胞。
17.如权利要求15所述的人类细胞，该人类细胞是一错配修复系统正常细胞。
18.一种于一哺乳类细胞中表达一基因的方法，所述的哺乳类细胞不包含人类的生殖细胞、不包含人类受精卵、不包含人类胚胎也不包含人类胚胎干细胞，该方法包括有：
以权利要求1所述的表达载体转染所述哺乳类细胞以制成一转染细胞；
培养所述转染细胞以令该转染细胞制造所述基因所编码的蛋白质；以及
获取所述蛋白质。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述基因编码一蛋白质，该蛋白质选自由信号肽、生长因子、细胞介素、趋化因子、神经肽、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、转运蛋白、受体、配体、调控蛋白、结构蛋白、报导蛋白、转录因子、融合蛋白以及耐药蛋白所构成的群组。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述基因转录为一RNA，该RNA选自由tRNA、rRNA、反义RNA、微RNA以及双链RNA所构成的群组。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述哺乳类细胞是人类细胞，所述的人类细胞不包含人类的生殖细胞、不包含人类受精卵、不包含人类胚胎也不包含人类胚胎干细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述人类细胞是错配修复系统缺陷细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述错配修复系统缺陷细胞是HCT116细胞或DLD-1细胞。
24.如权利要求21所述的方法，其中，所述人类细胞是错配修复系统正常细胞。
25.如权利要求19所述的方法，其中，所述受体、配体是抗原、抗体。
26.如权利要求19所述的方法，其中，所述酶是核糖酶。
27.如权利要求19所述的方法，其中，所述调控蛋白是激素。
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