KR20160087903A

KR20160087903A - Cho 세포를 위한 합성 프로모터 및 전사 인자 결합 부위 모듈을 이용한 합성 프로모터의 제조 방법

Info

Publication number: KR20160087903A
Application number: KR1020167017364A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 캐머런 제임스; 애덤 존 브라운
Original assignee: 유씨비 바이오파마 에스피알엘
Priority date: 2013-11-29
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2016-07-22
Also published as: WO2015079053A2; CA2930344A1; RU2016125744A; WO2015079053A3; AU2014356396A1; US20170002378A1; MX2016006816A; EP3074516A2; JP2016537987A; CL2016001195A1; BR112016012177A2; IL245565A0; CN105793415A

Abstract

본 발명은 재조합 단백질을 발현하기 위한 CHO 세포 특이적 합성 프로모터 구성체, 그의 프로모터 구성체의 라이브러리, 및 그 프로모터 구성체의 제조 방법을 제공한다. CMV 프로모터의 전사 활성을 배가시킬 수 있는 최고 발현 프로모터를 가진 프로모터 구성체는 재조합 유전자 전사를 세 자릿수에 걸쳐 정확하게 조절할 수 있다.

Description

CHO 세포를 위한 합성 프로모터 및 전사 인자 결합 부위 모듈을 이용한 합성 프로모터의 제조 방법{SYNTHETIC PROMOTERS FOR CHO CELLS, METHODS OF PRODUCING SYNTHETIC PROMOTERS USING TRANSCRIPTION FACTOR BINDING SITE MODULES}

본 발명은 포유동물 세포, 특히 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포에 사용하기 위한 합성 프로모터 구성체 및 이를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 프로모터 구성체의 제조 방법, 상기 재조합 세포 및 이들 중 어느 하나의 용도, 예를 들어 재조합 단백질의 발현에서의 용도에 관한 것이다.

중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 중국 햄스터 난소로부터 유래하며 특히 재조합 단백질의 발현에 대한 유전적 연구, 독성 스크리닝 및 유전자 발현에 널리 사용된다. 이들은 1960대에 처음 도입되었으며, 현탁 배양물로 배양되며 배양 배지에 프롤린을 요구한다. CHO 세포는 재조합 단백질 치료제의 대량 생산을 위해 가장 보편적으로 사용되는 포유동물 숙주 세포주이다. 따라서, CHO 세포는 생물제약 산업에 중요한 도구가 된다.

재조합 단백질 제조에 CHO 세포를 이용할 때 직면하게 되는 한 가지 주요 난제는 재조합 단백질의 발현 수준을 정확하게 조절하는데 어려움이 있을 수 있다는 것이다. 현재 후보 생물 약제의 생물산업적 포트폴리오가 다양화되어 폴리펩티드 특이적 폴딩 및 조립 속도와 동역학적으로(kinetically) 조정되는 유전자 전사의 단백질 특이적 조절을 요구하는 수많은 "난발현(DTE: difficult to express)" 단백질을 포함하는 경우, 재조합 단백질의 발현 수준을 정확하게 조절하는 능력이 특히 중요하다. 예를 들어, 단클론 항체(mAb) 발현은 중쇄(HC)와 경쇄(LC) 유전자 발현 비율의 적정에 의해 실질적으로 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다(Ho et al. 2013).

또한, 최적화된 표현형(단백질 폴딩, 글리코실화, 아폽토시스 등)을 가진 새로운 세포 공장의 개발은 동의 유전자(multiple gene)의 전사 활성에 동시에 변화를 줄 수 있는 능력을 요구할 것이다(Datta et al. 2013, Lanza et al. 2012).

당시, CHO 세포에서 재조합 유전자 전사는 세포 스트레스 유도, 세포 주기 의존성, 및 후성적 침묵(silencing)과 관계되었지만 여전히 강한 바이러스 프로모터(예를 들어 인간 거대세포 바이러스 전초기 1(hCMV-IE1, 또는 CMV) 프로모터)로 통상적으로 조절된다(Dale 2006; Kim et al. 2011). CMV는 대부분의 생물제약 산물의 발현을 유도하는 데에 현재 사용되는 "골드 스탠다드" 프로모터이다. CMV는 많은 포유동물 숙주 세포를 감염시킬 수 있도록 바이러스에 의해 발전된 매우 복잡한 요소이다(Stinski and Isomura 2008). 그러나, 생물제약 생산을 이끌어 25년 이상 사용되어 왔는데도, 그들이 CHO 세포에서 기계론적으로 어떻게 기능을 하는지에 대해서 알려진 바가 없어서 그의 전사 활성을 정확하게 조절하고 향상시키는 방법은 일반적으로 이용 가능하지 않다.

그러므로 합성 프로모터는 발현 벡터 내에 기능적으로 불분명하고 제어 불가능한 유전 요소를, 숙주 세포 기능을 예상 가능하게 조작할 수 있는 정교한 맞춤형 제어기구로 대체할 수 있기 때문에 잠재적으로 매력적인 해결책을 제공해 준다.

합성 프로모터는 통상적으로 (i) 무작위 DNA 서열 또는 합성 올리고뉴클레오티드 반복서열 또는 (ii) 최소 코어 프로모터 모티프 양쪽 상류에 공지된 시스 조절 요소(예를 들어, 전사 인자 결합 부위, 또는 조절 요소, 또는 TFRE)의 집합체를 스크리닝함으로써 생성된다. 이러한 노력의 결과로 다양한 생물체, 대개는 미생물, 예를 들어 코리네박테리움(Corynebacterium )(Yim et al. 2013), 사카로마이세스(Saccharomyces)(Blazeck et al. 2012), 피키아(Pichia)(Stadlmayr et al. 2010) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces )(10), 게다가 포유동물 세포 (Ferreira et al. 2011; Schlabach et al. 2010)에서 기능을 하도록 설계된 합성 프로모터를 얻었다. 이러한 연구는 합성 프로모터에 의해 제공되는 정교한 유전자 발현이 매우 상황 의존적이며 각 숙주 세포 유형에 특이적으로 제작된 프로모터를 필요로 한다는 것을 증명하였다. 슐래바흐 연구자들(Schlabach et al.)은, 예를 들어, HeLa 세포에서 스크리닝된 포유동물 세포를 위한 합성 프로모터의 합성을 기재하고 있지만(CMV 활성의 207%), 다양한 포유동물 세포 유형에서 매우 가변적인 리포터 유전자 발현을 보고하고 있다(CMV의 21-113%)(Schlabach et al. 2010).

그러나 CHO 세포에서 합성 프로모터의 이용을 앞서 검토한 연구는 많지 않다. 토르뇌에 연구자들(Tornøe et al)은 키메라 프로모터 내에 TFRE 분리 서열을 무작위화하여 10배 범위의 활성을 가진 소량의 프로모터(< 20)를 생성하였다(Tornøe et al. 2002). 게다가, 그랩헤르 연구자들(Grabherr et al)은 높은 활성의 프로모터에서 발견된 조성을 모방하는 뉴클레오티드 조성의 인접한 서열을 제작함으로써 대략 등가의 활성을 갖는 5개의 합성 프로모터를 제작하였다(Grabherr et al. 2011). 그러나 상기 두 연구는 모두 포유동물 세포에서 광범위한 활성을 표적화하였으며(다수의 다양한 세포주에서 시험됨) 어느 연구도 CHO 세포 공장의 전사활성화 기구와 협력하여 기능을 하는 합성 프로모터를 특이적으로 설계하려고 시도하지는 않았다.

따라서, 상기 프로모터 구성체 중 어느 것도 CHO 유전자 발현을 광범위하고 역동 범위에 걸쳐 예측 가능하고, 정확하고, 강하게 제어할 수 없었으며, 보고된 합성 프로모터 활성은 CMV 활성보다 상당히 낮았다.

보다 최근에는, 레 연구자들(Le et al)은 트랜스크립톰 데이터를 이용하여 원하는 발현 동역학(dynamics)을 가진 CHO 내인성 프로모터를 확인하였다(Le et al. 2013). 이것은 별개의 발현 수준을 가진 프로모터를 확인하기 위한 유망한 방법이지만, 천연 활성에 제한된다. 게다가, 특정 유전자의 발현을 조절하는 게놈 조절 서열을 한정하는 것은 중요한 과제가 될 수 있다.

이런 이유로, 본 생물제약 생산 과제에 대해 다루기 쉬운 해결책을 제공할 수 있는 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 특이적 유전자 발현 조절 기술이 요구된다. 본 발명은 상기 과제를 다루고자 한다.

본 발명자들은 전사 인자 조절 요소와 연관된 모티프를 기능적으로 스크리닝하였으며 CHO 세포에서 활성을 갖는 요소를 최초로 확인하였다.

활성 요소를 이용하고 조합하여 재조합 숙주 세포, 특히 CHO 세포에 유용한 합성 프로모터를 제조하였다.

그 후 이들 CHO-활성 요소를 이용하여 1000배 걸쳐 발현을 나타내는 거대한 합성 프로모터 라이브러리를 제작하였다.

따라서, 본 발명자들은 기존의 CHO 세포 공장의 전사 활성화 기구를 특이적으로 활용하여 설계된 합성 프로모터의 최초 라이브러리를 제작하였다.

또한, 본 발명자들은 차세대 라이브러리가 특이적 발현 수준에 맞춰질 수 있다는 것을 보였으며, 예를 들어 일시적인 생산 과정에서, hCMV-IE1을 능가하는 활성을 가진 다중 프로모터를 제작하였다. 게다가, 광범위하고 역동 발현 범위에 걸친 프로모터 상대 활성은 다양한 CHO 세포 숙주와 장기간 일시적인 유가배양(fed-batch) 생산 모두에서 유지되었다.

본 합성 프로모터 기술에 의해 가능해진 강하고 정확한 유전자 발현 조절은 설계된 최적의 화학양론으로 작동하는 다중의 유전적 구성요소를 포함하는 맞춤형의 합성 포유동물 세포 공장의 생성을 용이하게 할 것이다. 게다가, 재조합 유전자 전사의 최적화된 단백질 특이적 조절이 난발현 단백질의 생산을 용이하게 하는데 이용될 수 있다. 또한, 일시적인 SEAP 유가배양 생산에서 CMV보다 더 높은 역가를 허용하는 본 발명의 프로모터를 이용하여 초기 단계 산물, 예를 들어 독성학 및 임상 실험 시험을 위한 개발 물질의 생산(예를 들어 일시적인 발현)을 최적화할 수 있다(Daramola et al. 2013).

첫째 측면에서, CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 유도하는 데에 적합한 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포로서, 상기 합성 프로모터가 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는 것인 CHO 세포를 제공한다.

또한, CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터로서, 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소들의 혼합, 특히 적어도 하나의 조절 인자의 2 이상의 카피를 포함하는 합성 프로모터를 제공한다.

주어진 포유동물 재조합 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 생성시키는 방법으로서,

A) 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포주에서 사용하는 데에 적합한 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계,

B) 단계 A)에서 선택된 요소들로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는 1 개 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계,

C) 단계 B)에서 제조된 합성 프로모터 구성체 또는 구성체들을, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서의 활성에 대해 시험하는 단계

를 포함하는 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 CHO 세포에서 유전자 발현을 음성적으로 조절할 수 있는 적어도 1 개의 전사 인자/전사 인자 조절 요소, 즉 YY1을 확인하였다. 따라서, 한 실시양태에서, 전사 인자 YY1의 활성이 녹다운되거나 또는 녹아웃된 CHO 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, YY1에 특이적인 블록 디코이(block decoy)의 용도를 제공한다.

본 발명은 다음 항과 같이 요약된다.

1. CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 유도하는 데에 적합한 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포로서, 상기 합성 프로모터가 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는 것인 CHO 세포.

2. 제1항에 있어서, 프로모터 코어가 CMV, SV40, UbC, EF1A, PGK 및 CAGG, 예를 들어 CMV 코어, 특히 hCMV-IE1로부터 선택되는 것인 CHO 세포.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 합성 프로모터가 2 내지 50 개의 전사 인자 조절 요소, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개, 예를 들어 5, 6, 7 또는 8 개의 상기 조절 요소를 포함하는 것인 CHO 세포.

4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소들은 서로 모두 동일한 것인 CHO 세포.

5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소들은 상이한 유형의 조합인 것인 CHO 세포.

6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소들은 서로 일렬로 있는 것인 CHO 세포.

7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 NFκB-RE, 예를 들어 그의 2 이상의 카피를 포함하는 것인 CHO 세포.

8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 E-박스, 예를 들어 그의 2 이상의 카피를 포함하는 것인 CHO 세포.

9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 CRE, 예를 들어 그의 2 이상의 카피를 포함하는 것인 CHO 세포.

10. 제5항에 있어서, 조합 내의 각 전사 인자 조절 요소가 NFκB-RE, E-박스, GC-박스, C/EBPα-RE, CRE 및 E4F1, 특히 NFĸB-RE, E-박스, GC-박스 및 C/EBPα-RE로부터, 구체적으로 NFκB-RE 및 E-박스, 특히 조합 내 적어도 하나의 조절 인자의 2 이상의 카피로부터 독립적으로 선택되는 것인 CHO 세포.

11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터 DNA 서열이 전장의 CMV 프로모터 서열 양의 0.9 이하, 예를 들어 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5 또는 그 미만인 CHO 세포.

12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 CMV 프로모터의 단위 DNA당 전사 활성보다 큰 합성 프로모터의 단위 DNA 서열당 전사 활성, 예를 들어 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4 또는 2.5 배 증가된 활성을 갖는 것인 CHO 세포.

13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포가 CHO-S, CHO-K1 및 CHO-DG44로부터 선택되는 것인 CHO 세포.

14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소 YY1의 활성은, 예를 들어 YY1에 특이적인 블록 디코이에 의해, 억제되는 것인 CHO 세포.

15. 제14항에 있어서, 세포는 변이되어 전사 인자 YY1을 결실시키고/시키거나 침묵(silent)시킴으로써 YY1의 활성을 억제하는 것인 CHO 세포.

16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 합성 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 CHO 세포.

17. 제16항에 있어서, 재조합 단백질이 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 CHO 세포.

18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 프로모터 코어 또는 야생형 프로모터에 비해 향상된 단백질 발현을 나타내는 것인 CHO 세포.

19. 제18항에 있어서, 향상된 단백질 발현이 더 높은 수준의 재조합 단백질 발현인 것인 CHO 세포.

20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 서열 번호 30 내지 169 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.

21. 제20항에 있어서, 합성 프로모터가 서열 번호 126 내지 169 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.

22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 CpG 아일랜드를 전혀 포함하지 않는 것인 CHO 세포.

23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개 이상의 프로모터, 예를 들어 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 정의된 2 개 이상의 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포.

24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 특정 세포에 적합한 특성을 갖는 것, 예를 들어 합성 프로모터 내 전사 인자 조절 요소가 세포에서 발견되는 전사 인자에 해당하는 것인 CHO 세포.

25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 그와 연관된 특정 재조합 단백질의 발현에 적합한 특성을 갖는 것인 CHO 세포.

26. CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터로서, 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소들의 혼합, 특히 조합 내 적어도 하나의 조절 인자의 2 이상의 카피를 포함하는 합성 프로모터.

27. CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터로서, 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE 및 CRE를 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소들의 혼합을 포함하는 합성 프로모터.

28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 합성 프로모터 DNA 서열이 전장의 CMV 프로모터 서열 양의 0.9 이하, 예를 들어 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5 또는 그 미만인 합성 프로모터 서열.

29. 제26항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터가 CMV 프로모터의 단위 DNA당 전사 활성보다 큰 합성 프로모터의 단위 DNA 서열당 전사 활성, 예를 들어 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4 또는 2.5 배 증가된 활성을 갖는 합성 프로모터 서열.

30. 주어진 포유동물 재조합 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 생성시키는 방법으로서,

a) 전사 인자 조절 요소의 모티프를 식별하는 단계,

b) 프로모터 코어와 조합된 단계 a)에서 식별된 각각의 전사 인자 조절 요소를, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포주에서의 활성에 대해 시험하는 단계,

c) 선택된 포유동물 숙주 세포주에서 프로모터 코어 단독보다 더 큰 활성을 갖는 단계 b)로부터의 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계,

d) 단계 c)에서 선택된 전사 인자 조절 요소들로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는 1 개 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계,

e) 단계 d)에서 제조된 합성 프로모터 구성체 또는 구성체들을, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서의 활성에 대해 시험하는 단계,

f) 야생형 프로모터와 비교하여 동일하거나 향상된 단백질 발현을 나타내는 합성 프로모터 구성체 또는 구성체들을 식별하는 단계

를 포함하는 생성 방법.

31. 제30항에 있어서, 하기 추가 단계들:

g) 단계 f)에서 식별된 구성체와 연관된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계, 및

h) 단계 g)에서 독립적으로 선택된 요소들을 포함하거나 이들로 이루어진 TFRE 구성체를 포함하는 1 개 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계를 포함하는 방법.

32. 제31항에 있어서, 단계 h)에서 제조된 TFRE 구성체가 전사 인자 조절 요소들을, 단계 f)에서 식별된 구성체에서의 그들의 상대 존재비를 반영하는 화학양론으로 포함하는 것인 방법.

33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계 f)는 야생형 프로모터와 비교하여 감소된 단백질 발현을 나타내는 프로모터 구성체와 가장 빈번하게 연관된 전사 인자 조절 요소 또는 요소들을 식별하여, 이들을 단계 g)에서 제외시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.

34. 주어진 포유동물 숙주 세포에서 원하는 수준으로 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 식별하는 방법으로서,

a) 제26항 내지 제28항에 정의된 2 개 이상의 합성 프로모터 구성체를 획득하는 단계,

b) 단계 a)에서 획득한 합성 프로모터 구성체를 시험하여, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서 각각의 구성체에 의해 유도된 재조합 단백질 발현 수준을 판정하는 단계,

c) 단계 b)에서 시험된 합성 프로모터 구성체가 원하는 수준으로 재조합 단백질 발현을 촉진하는 경우에 그 합성 프로모터 구성체를 선택하는 단계

를 포함하는 방법.

35. 제34항에 있어서, 단계 a)에서 획득한 2 개 이상의 합성 프로모터 각각이 서열 번호 30 내지 169 또는 서열 번호 126 내지 169 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 것인 방법.

36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 단백질 발현의 원하는 수준이 야생형 프로모터를 이용하여 달성된 것보다 더 높은 것인 방법.

37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 단백질 발현의 원하는 수준이 야생형 프로모터를 이용하여 달성된 것보다 더 낮은 것인 방법.

38. 전사 인자 조절 요소 구성체 라이브러리를 구성하는 방법으로서, 전사 인자 조절 요소 NFκB-RE와 E-박스를 5:3의 비율로 무작위 결찰(ligation)시키는 단계를 포함하는 방법.

39. 전사 인자 조절 요소 구성체 라이브러리를 구성하는 방법으로서, 전사 인자 조절 요소 NFκB-RE, E-박스, GC-박스 및 C/EBPα-RE를 5:3:1:1의 비율로 무작위 결찰시키 단계를 포함하는 방법.

40. 전사 인자 조절 요소 YY1 활성이 녹다운되거나 또는 녹아웃된 것인 CHO 세포.

41. 제40항에 있어서, YY1 활성이 YY1에 특이적인 블록 디코이에 의해 녹다운되거나 또는 녹아웃된 것인 CHO 세포.

42. 제40항에 있어서, 세포는 변이되어 전사 인자 YY1을 결실시키고/시키거나 침묵시킴으로써 YY1의 활성을 억제하는 것인 CHO 세포.

43. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 합성 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 CHO 세포.

44. 제43항에 있어서, 재조합 단백질이 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 CHO 세포.

45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유형이 CHO-S, CHO-K1 및 CHO-DG44로부터 선택되는 것인 CHO 세포.

유리하게는, 본 발명자들은 특정 전사 인자 조절 요소가 특히 CHO 세포에서 특별한 활성을 가진다는 것과 본 발명의 프로모터 구성체에 포함될 때 전사를 조절할 수 있다는 것, 예를 들어 코어 프로모터 단독으로 사용될 때와 비교하여 재조합 단백질의 발현 수준을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 이들 전사 인자 조절 요소의 조합을 포함하는 프로모터 구성체가 CHO 세포에서 광범위하고 역동 범위에 걸쳐(1000배 넘게) 재조합 유전자 전사를 정확하게 조절할 수 있다는 것을 발견하였다.

유리하게는, 합성 프로모터는 진화되기보다는 특이적으로 설계되었기 때문에, 프로모터는 중복 서열이 없으며, 따라서 단위 DNA 서열당 훨씬 더 효율적인 전사 효율을 갖는다. 예를 들어, 본원에서 기재된 합성 프로모터 2/01(서열 번호 126)은 CMV 프로모터에 비해 2.2배 증가된 활성을 보이지만 CMV의 절반 크기보다 작다.

그러나 다른 인자 예를 들어 재조합 시스템의 안정성, 적합한 폴딩을 위한 요건, 및 이중 특이적 항체와 같이 난발현 단백질을 발현하는 능력은 재조합 단백질의 최고 수준의 발현이 언제나 궁극적인 목표가 되는 것은 아니라는 것을 의미할 수 있기 때문에, 정확한 조절이 언제나 증가된 발현에 관한 것은 아니다. 실제로, 본 발명의 중요한 장점은 발현 수준이 합성 프로모터에 포함된 TFRE의 조합에 따라 요구되는 바대로 조정될 수 있도록 제공되는 유연성이다.

예를 들어, 전사 속도가 생산에 대해 높은 수준의 조절을 발휘하는 것으로 보이는 발현하기 쉬운 단백질의 경우(McLeod et al. 2011; O'Callaghan et al. 2010), 본 발명의 합성 프로모터는 재조합 유전자 전사 수준을 최대화하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 합성 프로모터 2/01을 이용하여).

이에 비해, 전사의 최대화가 유익할 것 같지 않은 난발현 단백질(예를 들어, 이중 특이적 항체, 융합 단백질)의 경우, 프로모터는 폴리펩티드 특이적 폴딩 및 조립 속도와 동역학적으로 조정되는 최적화된 단백질 특이적 전사 활성을 제공하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 가능한 용도는 단클론 항체(mAb) 발현이며, 여기서, 예를 들어, 서로 다른 활성의 2 개의 합성 프로모터를 이용하여 mAb 생산을 최적화하기 위한 mAb-특이적 경쇄:중쇄(LC:HC) 발현 비율을 달성할 수 있다(Ho et al. 2013; Pybus et al. 2013).

따라서, 한 실시양태에서, 합성 프로모터는 특정 재조합 단백질의 발현에 적합하도록 조정되거나 선택되는데, 즉, 프로모터의 특성은 특정 단백질의 적합한 발현에 맞춰진다.

본원에서 이용되는 특정 단백질의 적절한 발현은 프로모터가 공지된 CMV 프로모터로 얻어지는 결과와 비교할 때 바람직한 형태의 주어진 단백질의 발현을 최대화하고, 예를 들어 적합하게 폴딩된 단백질의 수율을 증가시키고/거나 그 양을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

한 실시양태에서, 본 발명의 합성 프로모터는 CpG 아일랜드를 포함하지 않는다. CMV 내 CpG 아일랜드는 기질 부착 부위의 기능성을 방해한다는 것이 밝혀졌다(Girod et al. 2005). CpG 아일랜드 내 시토신의 메틸화는 불안정하게 만든다고 알려져 있다. 이로 인해 본 발명의 프로모터는 CpG 아일랜드를 갖지 않기 때문에, 프로모터는 안정성이 상승되고, 결과적으로 재조합 단백질을 발현하는데 사용될 때 매우 재현성 있는 수준의 발현을 가져올 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 합성 프로모터는 기존의 전사 상승 기술, 예를 들어 편재적으로 작용하는 염색질 개구 요소, 세균 인공 염색체 및 부위 특이적 통합 시스템에 더 적합하다(Mader et al. 2012; Zhou et al. 2010).

게다가, 본 발명의 프로모터는 매우 정확한 조절을 필요로 하는 연구 용도에 다른 발현 조절 기술과 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 TFRE-특이적 디코이 기술(Brown et al. 2013), 또는 번역 개시 속도를 조절하는 최근 기재된 합성 요소(Ferreira et al. 2013)와 결합하여 이용될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 적어도 YY1에 특이적인 전사 인자 조절 요소를 포함하는 블록 디코이를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시의 합성 프로모터 내에 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 일렬로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 개시의 합성 프로모터 내에 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 모두 동일하다.

한 실시양태에서, 본 개시의 합성 프로모터 내에 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 상이한 유형의 조합이다.

한 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 1 개 이상의 동일한 TFRE의 다중 카피, 예를 들어, 1 개 이상의 동일한 TFRE의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피를 포함하는 상이한 유형의 조합이다. 한 실시예에서, 합성 프로모터는 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 NFκB-RE를 포함한다.

한 실시양태에서, 합성 프로모터는 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 E-박스를 포함한다.

한 실시양태에서, 합성 프로모터는 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 CRE를 포함한다.

한 실시양태에서, 합성 프로모터는 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 NFκB-RE 및 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 E-박스를 포함한다.

한 실시양태에서, 합성 프로모터는 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 NFκB-RE 및 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 CRE를 포함한다.

합성 프로모터가 2 개 이상, 예를 들어 두 가지 유형의 전사 인자 조절 요소 및 1 개 이상의 다중 카피를 포함할 때, 이들은 임의의 적합한 배열, 예를 들어 완전한 한 줄의 첫째 TFRE(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 NFκB-RE), 이어서 완전한 한 줄의 적어도 둘째 TFRE(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 E-박스)로서 제공될 수 있다. 별법으로, 첫째 및 둘째 TFRE 등은 무작위적으로 또는 첫째 TFRE의 1 개 카피(작은 줄)에 이어 둘째 TFRE의 1 개 카피(작은 줄), 이들은 차례로 첫째 TFRE의 1 개 카피(작은 줄) 등이 이어지는 형태로 혼합될 수 있다.

유리하게는, 본 발명자들은 상이한 유형의 전사 인자 조절 요소가 합성 프로모터 내에 결합될 때, 결과적으로 발현 수준을 상이한 수준으로 조절하고, 예를 들어 CMV 프로모터에 비해 발현 수준을 증가시키거나 감소시킨다는 것을 발견하였다. 별법으로 또는 추가적으로, 본원에서 제공되는 합성 프로모터는 단백질이 바람직한 형태, 예를 들어 적절하게 폴딩되도록 발현 안정성을 향상시키고 특이적인 단백질의 발현에 대해 최적화될 수 있다.

전사 인자 조절 요소의 조합을 포함하는 프로모터 구성체는 구성체가 단지 한 가지 유형의 전사 인자 조절 요소로만 이루지는 때와 비교하여 상이한 전사 활성을 가지며, 따라서 획득될 수 있는 가능한 전사 활성 범위가 크게 확장됨으로써 결과적으로 특정 재조합 단백질의 발현에 적합하게 맞추어질 수 있는 합성 프로모터로부터 광범위한 범위의 상이한 전사 활성을 가져온다. 따라서, 프로모터 구성체는 포유동물 세포, 특히 CHO 세포에서 단백질 발현을 정확히 조절하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 특정 TFRE 조합을 이용함으로써, 합성 프로모터는 생리학적 온도 이하의 온도에서(Al-Fageeh et al. 2006) 또는 정지기 세포 성장 과정에서(Prentice et al. 2007) 상승된 활성과 같은 바람직한 생물생산 기능성을 나타내도록 개량될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시의 합성 프로모터는 야생형 CMV 프로모터보다 더 작으며, 예를 들어 서열은 CMV 프로모터의 크기보다 약 0.9 이하, 예를 들어 CMV 프로모터 크기의 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5 또는 그 미만이다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 크기의 0.5는 CMV 프로모터의 절반 크기인 합성 프로모터를 언급하며, 이것은 즉 CMV 프로모터의 염기쌍의 약 1/2, 또는 CMV 프로모터 분자량의 절반을 포함한다.

유리하게는, CMV 프로모터보다 작은 합성 프로모터를 제조할 수 있다는 것은 기타 유전 물질을 코딩하는 발현 벡터 내에 더 많은 자리, 예를 들어 다유전자(multigene) 조작 벡터 내에 더 큰 재조합 유전자 또는 증가된 수의 기능성 유전자(예를 들어, 사페론, 산화환원 단백질, 폴딩되지 않은 단백질 반응 트랜스 작용 인자, 소포 수송 구성요소 등)를 허용한다. 또한, 합성 프로모터가 작을수록 CMV 프로모터에 상응하는 값보다 증가된 단위 DNA당 전사 활성을 갖는다.

한 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 활성화 단백질 1 조절 요소(AP1-RE), CC(A/T)₆GG 요소(CArG), CCAAT 치환 단백질 조절 요소(CDP-RE), CCAAT-인핸서 결합 단백질 α 조절 요소(C/EBPα-RE), 세포 골수아세포증 조절 요소(cMyb-RE), cAMP 조절 요소(CRE), 신장 인자 2 조절 요소(E2F-RE), E4F1 조절 요소(E4F1-RE), 조기 성장 반응 단백질 1 조절 요소(EGR1-RE), ERR-알파 조절 요소(ERRE), 인핸서 상자(E-박스), GATA-1 조절 요소(GATA-RE), GC-박스, 글루코코르티코이드 조절 요소(GRE), 성장인자 독립 1 조절 요소(Gfi1-RE), 헬리오스(Helios) 조절 요소(HRE), 간세포 핵인자 1 조절 요소(HNF-RE), 인슐린 프로모터 인자 1 조절 요소(IPF1-RE), 인터페론 자극 조절 요소(ISRE), 근세포 인핸서 인자 2 조절 요소(MEF2-RE), Msx 호메오박스 조절 요소(MSX-RE), 신경 성장 인자 유도 유전자 B 조절 요소(NBRE), 핵 인자 1 조절 요소(NF1-RE), 활성화 T 세포 조절 요소의 핵인자(NFAT-RE), 핵인자 카파 B 조절 요소(NFkB-RE), 옥타머 모티프(OCT), 레티노산 조절 요소(RARE) 및 인양(Ying Yang) 1 조절 요소(YY1-RE)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 상기 요소의 서열은 표 1, 서열 번호 1-28에 제공된다.

한 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

한 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE, E-박스, CRE, GC-박스, E4F1 및 C/EBPα-RE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

한 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE(서열 번호 25), E-박스(서열 번호 11), GC-박스(서열 번호 13) 및 C/EBPα-RE(서열 번호 4)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

유리하게는, 상기 4가지의 전사 인자 조절 요소는 고발현 프로모터 구성체와 상당히 연관된다. 이로 인해, 상기 특정 전사 인자 조절 요소를 포함하는 프로모터 구성체는 CMV 프로모터의 전사 활성을 배가시킬 수 있다.

한 실시예에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE, E-박스 및 GC-박스로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

한 실시예에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE, E-박스 및 C/EBPα-RE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE 및 E-박스로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE 및 CRE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

한 실시양태에서, 전사 인자 조절 요소는 YY1이 아니다.

유리하게는, 2 또는 3개의 전사 인자 조절 요소의 상기 조합은 본 발명의 고발현 프로모터 구성체에서 두드러지며, 따라서 발현 수준에 특히 강한 영향을 줄 것 같다.

따라서, 한 실시양태에서, 이용되는 합성 프로모터는 공지된 프로모터, 특히 야생형 CMV 프로모터에 비해 예를 들어 발현 수준에 있어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% 이상 증가된 발현 수준을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 예를 들어 라이브러리 또는 집합체에서 합성 프로모터를 이용하여 세 자릿수에 걸친 비활성을 제공한다. 이것은 특별한 목적, 예를 들어, 선별 마커 발현, 항체 중쇄:경쇄 비율 조절, 및 난발현 단백질을 위한 전사의 폴리펩티드 특이적인 조절을 위해 최적화된 전사 활성을 가능하게 한다.

따라서, 한 실시양태에서, 이용되는 합성 프로모터는 공지된 프로모터, 특히 야생형 CMV 프로모터에 비해 감소된 발현 수준을 제공한다. 그러나 이들 프로모터는 더 많은 단백질이 적절하게 폴딩되거나 유사하게 생산되도록 하는 것과 같은 공지된 프로모터보다 유익한 특성을 보이기 때문에, 이들 프로모터가 일반적으로 선택될 것이다.

한 실시양태에서, 전사 인자 조절 요소는 서열 번호 1 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는데, 예를 들어 전사 인자 조절 요소는 서열 번호 1, 4, 6, 8, 11, 13, 25, 26 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열 번호 4, 11, 13 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 특히 서열 번호 11 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

한 실시양태에서, 합성 프로모터는 2 내지 50 개의 전사 인자 조절 요소, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 전사 인자 조절 요소를 포함한다.

유리하게는, 2 개 이상의 재조합 유전자(예를 들어 중쇄 및 경쇄 유전자)의 발현을 조절하는 2 개 이상의 상이한 합성 프로모터의 사용은 유전자 카피 손실을 최소화하도록 도울 수 있다. 현재 표준 발현 시스템에서, 2 개의 동일한 CMV 프로모터를 사용하여 2 개의 유전자 모두의 발현을 조절하여, 상동 재조합에 의해 유전자 카피 손실을 일으킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 각 프로모터는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11 또는 12개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함한다.

본 개시의 합성 프로모터는 더 많은 유형의 전사 인자 조절 요소를 포함할 수 있으며, 이로써 획득될 수 있는 전사 활성 범위를 증가시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 코어 프로모터는 CMV, SV40, UbC, EF1A, PGK 및 CAGG, 예를 들어 CMV로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로부터 유래한다.

한 실시양태에서, 프로모터 또는 코어 프로모터는 EAAT2가 아니며, 특히 WO03/070965호에 개시된 서열 번호 1, 2 및/또는 3이 아니다. 한 실시양태에서, 프로모터 또는 코어 프로모터는 EAAT2로부터 유래하지 않는다.

한 실시양태에서, 프로모터 또는 프로모터 코어는 COX-2 유전자 프로모터가 아니다. 한 실시양태에서, 프로모터 또는 코어 프로모터는 COX-2 유전자 프로모터로부터 유래하지 않는다.

유리하게는, 본 발명자들은 CMV 코어 프로모터의 전사 활성이 CMV 코어 프로모터의 상류에 전사 인자 조절 요소의 블록을 포함시킴으로써 신뢰할 수 있게 변형될 수 있다는 것을 발견하였다. 이로 인해, CMV 코어 프로모터(서열 번호 170)은 본 발명의 합성 프로모터 구성체에 사용하기에 특히 적합하다.

또 다른 실시양태에서, 코어 프로모터는 유도성 프로모터, 예를 들어 TRE, PTRE3G 및 c-Fos로 이루어진 군으로부터 선택된 유도성 프로모터로부터 유래한다.

유리하게는, 코어 프로모터로서 유도성 프로모터의 사용은 재조합 단백질의 발현 시기의 조절을 가능하게 함으로써 본 발명의 프로모터 구성체의 전사 활성의 추가의 조절 단계를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 합성 프로모터는 서열 번호 30 내지 169로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

유리하게는, 이들 합성 프로모터는, 본 발명자들이 발견하였으며 CHO 세포에서 특히 활성을 가지는, NFκB-RE, E-박스, AP1-RE, CRE, GC-박스, E4F1-RE 및 C/EBPα-RE로부터 독립적으로 선택된 최대 7개의 전사 인자 조절 요소로 이루어진다. 본 발명의 합성 프로모터로 5'에서 3' 또는 3'에서 5'의 어느 방향으로든 포함되는 경우, 이들 TFRE는 결과적으로 광범위하게 상이한 전사 활성을 가져온다.

한 실시양태에서, 본 개시에 따른 합성 프로모터는 CMV의 근위 프로모터의 일부 또는 전부, 예를 들어 근위 프로모터의 10, 20, 30, 40, 50%를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 개시에 따른 합성 프로모터는 CMV의 원위 프로모터의 일부 또는 전부, 예를 들어 원위 프로모터의 10, 20, 30, 40, 50%를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 개시에 따른 합성 프로모터는 CMV의 근위 프로모터의 일부 또는 전부 및 원위 프로모터의 일부 또는 전부, 예를 들어 독립적으로 근위 프로모터 및 원위 프로모터의 10, 20, 30, 40, 50%를 포함한다.

한 실시예에서, 합성 프로모터는 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 NFκB-RE 및 2 개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피의 E-박스, 및 선택적으로 1 개 이상의 카피의 GC-박스 및/또는 C/EBPα-RE로 이루어진 TFRE 구성체를 포함한다.

한 실시예에서, 본 발명의 합성 프로모터는 서열 번호 126 내지 169로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 실시예에서, 본 발명의 합성 프로모터는 서열 번호 126 내지 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시예에서, 본 발명의 합성 프로모터는 서열 번호 30, 31, 32, 126, 128 및 144로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

유리하게는, 서열 번호 126 내지 169를 가진 전사 인자 조절 요소 구성체는 단지 4개의 전사 인자 조절 요소 NFκB-RE, E-박스, GC-박스 및 C/EBPα-RE만을 이용하여 제작되었다. 따라서, 상기 TFRE를 이용하여 얻은 발현 수준은 서열 번호 30 내지 125를 가진 구성체에 비해 상당히 높은 경향을 보인다.

또 다른 측면에서, 본원에서 정의된 다수의 합성 프로모터를 포함하는 포유동물 세포 특이적인 합성 프로모터 구성체의 라이브러리를 제공한다.

또 다른 측면에서, 예를 들어 서열 번호 30 내지 169, 예를 들어 126 내지 169를 가진 전사 인자 조절 요소 구성체의 라이브러리를 제공한다.

유리하게는, 본 발명의 전사 인자 조절 요소 구성체의 라이브러리 및 CHO 세포에서 재조합 단백질을 발현하기 위해 설계된 그들을 포함하는 합성 프로모터 구성체의 라이브러리는 서로 다른 범위의 발현 수준을 가진 이용 가능한 프로모터 구성체의 보관소를 제공한다. 라이브러리는 사용자가 원하는 발현 수준을 가진 프로모터 구성체를 용이하게 선택하거나 주어진 임의의 단백질의 원하는 발현 수준에 대해 시험할 수 있는 편리한 자원을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시에 따른 합성 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드 또는 벡터를 제공한다.

한 실시양태에서, 플라스미드 또는 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 재조합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 전사 가능한 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 후자는 RNAi, shRNA 및 기타 유용한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 플라스미드 또는 벡터는 예를 들어 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 전사 가능한 폴리뉴클레오티드를 사이에 끼우고 있는 한 쌍의 제한 부위를 포함할 수 있다. 제한 부위는 플라스미드 또는 벡터 내에 유전 물질의 교환을 가능하게 한다.

상기에서 논의한 바와 같이, 본 개시는 또한 본원에서 기재한 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포로 확장된다.

한 실시양태에서, 세포는 결합된 관심의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 유전자)의 합성 프로모터, 플라스미드 또는 벡터로 본 개시에 따라 일시적으로 형질감염된다.

한 실시양태에서, 세포는 본 개시에 따른 합성 프로모터로 안정적으로 형질감염되며, 예를 들어 상기 합성 프로모터는 관심의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 유전자)와 결합 된다.

또한, 본 개시에 따른 다양한 합성 프로모터로 안정적으로 형질감염된 세포, 예를 들어 CHO 세포의 라이브러리를 제공한다. 본원에서 이용되는 다양한 합성 프로모터는 일반적으로 각각의 세포가 그의 게놈으로 안정적으로 통합된 상이한 합성 프로모터 또는 상이한 조합의 합성 프로모터를 포함하는 것을 언급하고자 한다.

한 측면에서, 상기에 정의된 바와 같은 합성 프로모터 또는 발현 벡터를 포함하는 포유동물 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 골수종 세포 및 하이브리도마 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 세포 유형의 예는 림프구 세포주, 예를 들어, NS0 골수종 세포 및 SP2 세포 및 COS 세포를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 CHO 세포 유형은 CHO 및 CHO-K1 세포를 포함할 수 있으며, DHFR 선택표지와 함께 사용될 수 있는 dhfr- CHO 세포, 예를 들어 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포, 또는 글루타민 신테타제 선택표지와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포가 포함된다. 한 실시양태에서, CHO는 CHO-S, CHO-K1 및 CHO-DG44로부터 독립적으로 선택된다.

한 실시양태에서, CHO 세포와 같은 숙주 세포는 예를 들어 본원에 참고에 포함된 WO2010/092335호에 개시된 바와 같이 야생형 세포와 비교하여 Ero1 및/또는 XBP1의 발현 수준을 증가시켰다.

한 실시양태에서, CHO 세포와 같은 숙주 세포는 본원에 참고에 포함된 PCT/EP2013/070317호에 개시된 바와 같이 NHEJ 단백질(비상동성 말단 연결 단백질) 또는 그의 기능성 단편으로 형질감염된다.

한 실시예에서, CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 유발하는 데에 적합한 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포로서, 상기 합성 프로모터가 프로모터 코어 및 그의 상류에 적어도 1 개의 TFRE 구성체를 포함하며, 상기 각 TFRE 구성체가 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소로 이루어지는 것인 CHO 세포를 제공한다.

한 측면에서, 예를 들어 신규 키메라를 생성하도록 직접 결합된, 상기에 기재한 2 개 이상의 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포를 제공한다. 유리하게는, 이것은 추가의 프로모터를 세포에 형질감염될 발현 벡터에 삽입함으로써 존재하는 전사 인자 조절 요소의 조합을 변형시키는 용이한 방법을 제공한다.

한 측면에서, 상기에 기재된 바와 같이 2 개 이상의 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포로서, 각각이 상이한 재조합 단백질, 예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 항원 결합 단편의 합성을 지시하는데 이용되는 것인 CHO 세포를 제공한다. 이들이 벡터에 포함되는 경우, 이들 상이한 합성 프로모터는 동일하거나 상이한 벡터에 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

한 실시양태에서, 또한, 각각이 본 개시에 따른 합성 프로모터를 포함하는 플라스미드, 벡터 또는 세포의 라이브러리를 제공한다. 상기에 논의된 바와 같이 본 개시는 또한 본 개시의 상기 합성 프로모터(들) 또는 플라스미드/벡터를 포함하는 숙주 세포 라이브러리로 확장된다.

한 실시예에서, 본 발명은 주어진 포유동물 재조합 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 식별하는 방법으로서,

a) 프로모터 코어 및 그의 상류에 서열 번호 30 내지 169 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하거나 그로 이루어진 전사 인자 조절 요소를 각각 포함하는 2 개 이상의 합성 프로모터 라이브러리를 획득하는 단계,

b) a) 단계에서 획득한 합성 프로모터 구성체의 라이브러리를 시험하여, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서 각 구성체에 의해 유도된 재조합 단백질의 발현 수준을 판정하는 단계,

c) 단계 b)에서 시험된 합성 프로모터 구성체가 원하는 수준의 재조합 단백질 발현을 촉진하는 경우 그 합성 프로모터 구성체를 선택하는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 특정 단백질의 발현을 위해 프로모터와 세포 조합을 최적화하는 방법을 제공한다. 따라서, 비교 가능한 조건하에서 동일한 단백질에 대해 본 개시에 따른 합성 프로모터를 각각 포함하는 적어도 두 가지 숙주 세포(예를 들어 적어도 두 가지 CHO 세포)의 발현 수준과 같은 적어도 한 가지 변수를 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 방법은 주어진 단백질의 발현에 가장 적합한 세포 및 합성 프로모터 조합을 선택하는 단계를 더 포함한다.

본원에서 이용되는 "상이한"은 세포 내 요소의 조합이 비교되고 있는 세포와 같지 않다(동일하지 않다)는 것, 예를 들어 비교되는 세포의 게놈이 필수적으로 동일한 경우 세포 내 합성 프로모터가 상이할 것이라는(또는 세포 내 또 다른 존재가 상이할 것이라는) 것을 언급하고자 한다. 상기 적어도 두 가지 세포 내에서 합성 프로모터가 동일한 경우 세포 게놈 내의 일부 요소, 예를 들어 요소 또는 유전자는 상이할(동일하지 않을) 것이다.

따라서, 방법은 통상적으로, 분석이 유사한 조건하에서 실시될 때, 예를 들어 분석이 필수적으로 동시에 또는 동일한 실험으로 실시될 때, 적어도 두 가지 세포의 비교를 제공한다.

추가의 라이브러리가 본원의 상기에 기재된 TFRE 요소를 이용하여 제작되어 합성 프로모터 및 프로모터 라이브러리를 생성하는데 이용되고 본원에 기재되는 바와 같이 스크리닝될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 한 실시예에서, 본 발명은 TFRE 구성체 라이브러리를 구성하는 방법으로서, TFRE 요소 NFκB-RE, E-박스, GC-박스 및 C/EBPα-RE를 함께 무작위로 결찰시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 라이브러리는 예를 들어 상기 요소들을 5:3:1:1의 비율로 무작위로 결찰시켜 제작한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 TFRE 구성체 라이브러리를 구성하는 방법으로서, TFRE 요소 NFκB-RE 및 E-박스 및/또는 CRE를 함께 무작위로 결찰시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 라이브러리는 실시양태를 위해 상기 요소들을 5:3의 비율로 무작위로 결찰시켜 제작한다.

한 실시양태에서, 합성 프로모터의 라이브러리는 다양한 조합의 TFRE의 상이한 순열로, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같이, 특이적으로 설계(이론적 설계)된다.

상기에 논의된 바와 같이, 다양한 활성을 가진 프로모터는 본원의 개시 내용을 이용하여 제조될 수 있다. 세포 기능의 시스템 수준에서의 조절이 화학양론적으로 균형잡힌 여러 유전자의 구성적 발현을 요구할 수 있는 경우, 세 자릿수에 걸친 활성을 가진 별개의 프로모터를 제공함으로써 CHO 세포 공학자들이 적합한 세포 공장을 정확하게 조작하도록 해준다.

한 실시양태에서, 본 개시의 합성 프로모터, 이를 포함하는 플라스미드, 및 프로모터, 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 특히 CHO 세포는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 예를 들어 RNAi, shRNA 등의 전사를 유도하는데 적합하다.

한 측면에서, 주어진 포유동물 재조합 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 생성시키는 방법으로서,

a) 전사 인자 조절 요소의 모티프를 식별하는 단계,

c) 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포주에서 프로모터 코어 단독보다 더 큰 활성을 갖는 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계,

d) 단계 c)에서 선택된 전사 인자 조절 요소로부터 독립적으로 선택된 2 개 이상의 요소를 포함하는 1 개 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계,

e) 단계 d)에서 제조된 구성체 또는 구성체들을 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서의 활성에 대해 시험하는 단계, 및

f) 야생형 프로모터, 예를 들어 프로모터 코어가 유래한 야생형 프로모터와 비교하여 향상된 단백질 발현을 나타내는 합성 프로모터 구성체 또는 구성체들을 식별하는 단계

를 포함하는 생성 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 상기 방법은

g) 단계 f)에서 식별된 구성체와 결합된 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계, 및

h) 단계 g)에서 독립적으로 선택된 상기 요소들을 포함하거나 이들로 이루어진 TFRE 구성체를 포함하는 1 개 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계

를 더 포함한다.

유리하게는, 추가 단계는 상기 방법에 의해 제조된 합성 프로모터 구성체의추가적인 개선을 가능하게 함으로써, 결과적으로 상승된 발현, 예를 들어 상승된 발현 수준을 나타내는 표적 숙주 세포주를 위한 프로모터 구성체를 얻는다.

한 실시양태에서, 단계 h)에서 제조된 합성 프로모터 구성체는 단계 f)에서 식별된 구성체에서의 상대 존재비를 반영하는 화학양론의 전사 인자 조절 요소로 이루어진 TFRE 구성체를 포함한다.

유리하게는, 고발현 합성 프로모터에서 상대 존재비를 반영하는 화학량론으로 다양한 전사 인자 조절 요소를 포함시킴으로써, 코어 프로모터의 기본 전사 활성 수준을 상승시킬 가능성이 더 큰 전사 인자 조절 요소를 추가로 정제하고 단리하는 것을 돕는다.

한 실시양태에서, 방법은 야생형 프로모터와 비교하여 감소된 활성을 나타내는 프로모터 구성체와 가장 큰 빈도로 결합된 전사 인자 조절 요소 또는 요소들을 식별하는 단계 및 단계 (g)에서 이들을 선택하지 않는 단계를 더 포함한다.

상기에 기재된 방법에서, '활성'은, 통상적으로, 주어진 임의의 프로모터에 의해 유도된 단백질 발현 수준, 예를 들어 재조합 단백질 또는 리포터 유전자 발현 수준이다.

관련된 측면에서, 본 발명의 프로모터의 합성 방법으로서,

a) 포유동물 세포주에서 리포터 유전자 발현 수준을 분석하는 단계로서, 리포터 유전자 발현이 다수의 합성 프로모터에 의해 유도되며, 각 프로모터는 코어 프로모터 상류에 위치한 1 개 이상의 전사 인자 조절 요소 구성체를 포함하며, 각 TFRE 구성체가 단일형의 전사 인자 조절 요소로 이루어진 것인 단계,

b) 합성 프로모터에 의해 유도된 리포터 유전자 발현을 공지된 활성 수준을 갖는 대조 프로모터에 의해 유도된 리포터 유전자 발현 수준과 비교하는 단계,

c) 대조 프로모터 구성체의 발현 수준보다 높은 리포터 유전자 발현 수준을 보이는 합성 프로모터를 식별함으로써, 포유동물 세포주에서 활성을 갖는 전사 인자 조절 요소를 식별하는 단계, 및

d) c) 단계에서 식별된 전사 인자 조절 요소를 선택하고 2 개 이상의 상기 요소를 전사 인자 조절 요소 구성체에 포함시키고 상기 구성체를 합성 프로모터에 포함시키는 단계로서, 각 전사 인자 조절 구성체가 선택된 전사 인자 조절 요소만으로 이루어진 것인 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

유리하게는, 상기 방법은 특정 전사 인자 조절 요소가 표적 숙주 세포주에서 활성을 가져서 여기에 적합하다는 선험적 지식이 없는 경우 본 발명의 프로모터의 합성을 허용한다.

관련 실시양태에서, 상기 방법은

e) 포유동물 세포주에서 리포터 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계로서, 리포터 유전자 발현이 단계 d)의 다수의 합성 프로모터로부터 유도되는 것인 단계,

f) 최고 및 최저 수준의 발현을 보이는 프로모터를 식별하는 단계,

g) 단계 f)의 프로모터 구성체에 존재하는 각 전사 인자 조절 요소의 상대 존재비를 결정함으로써 더 높은 발현 수준과 연관된 전사 인자 조절 요소를 식별하는 단계, 및

h) 단계 g)에서 식별된 전사 인자 조절 요소를 선택하고 상기 요소를 1 개 이상의 전사 인자 조절 구성체를 포함하는 합성 프로모터에 포함시키는 단계로서, 각 구성체가 선택된 전사 인자 조절 요소만으로 이루어진 것인 단계

를 더 포함한다.

명백하게는, 상기 개시된 방법은 또 다른 바람직한 변수, 예를 들어 기능 분석 또는 단백질 폴딩의 적합도/수준으로 단백질 발현 수준을 대체하도록 변형될 수 있다.

본원에서 이용되는 다수의 합성 프로모터는 상이한 세포 집단의 발현 수준과 비교될 수 있도록 상이한 합성 프로모터 또는 상이한 합성 프로모터 조합을 각각 포함하는 유사한 세포 집단을 나타낸다.

한 실시양태에서, 재조합 단백질은 항체 또는 그의 결합 단편, 예를 들어 하기 상세 내용에서 논의되는 바와 같다.

유리하게는, 추가 단계는 상기 방법에 의해 제조된 합성 프로모터 구성체의 추가적인 개선을 가능하게 함으로써, 결과적으로 상승된 발현 수준을 나타내는 표적 숙주 세포주를 위한 프로모터 구성체를 얻는다.

한 실시양태에서, 전사 인자 조절 요소는 단계 d)로부터 합성 프로모터 구성체에서 상대적으로 나타낸 유도된 화학양론으로 단계 h)에서 프로모터 구성체로 포함된다.

유리하게는, 고발현 합성 프로모터에서 상대 존재비를 반영하는 화학량론으로 다양한 전사 인자 조절 요소를 포함시킴으로써, 코어 프로모터의 기본 전사 활성 수준을 상승시킬 가능성이 더 큰 전사 인자 조절 요소를 더 정제하고 단리하는 것을 돕는다.

[도 1]은 CHO 세포에서 활성을 갖는 전사 인자 조절 요소를 식별하기 위한 리포터 유전자 분석 결과를 도식하는 그래프를 나타낸다.
28개의 전사 인자 조절 요소(TFRE)(표 1 참조)는 포유동물 세포에서 활성을 갖는다고 알려진 보편적인 바이러스 프로모터 내에 전사 인자 결합 부위의 정보 분석으로 유도되었다.
28개의 TFRE를 SEAP/GFP 리포터 구성체를 이용하여 CHO-S에서 그들의 전사 활성을 평가하였다(표 2에 나타낸 서열 목록). 또한, 리포터 구성체의 일반적인 구조의 도식을 [도 1]에 나타낸다. 각 TFRE(표 1에 기재된 바)의 7개 카피를 GFP 또는 SEAP 리포터를 코딩하는 리포터 벡터 내에 최소 CMV 코어 프로모터의 상류에 연속적으로 클로닝하였다.
24웰 플레이트에 CHO-S 세포(2 x 10⁵)를 1 μg의 SEAP(검정 막대) 또는 GFP(백색 막대) TFRE 리포터 벡터로 형질감염시켰다. 세포 배양 상등액 내 SEAP 활성 및 세포 내 GFP를 형질감염 후 24시간에 측정하였다. 데이터를 최소 CMV 코어 프로모터(코어)만을 포함하는 벡터의 활성에 대해 변화 배수로 나타내었다. TFRE 서열에 공지된 상동성이 없는 무작위 8bp 서열(8mer)를 또한 음성 대조군으로 사용하였다. 막대는 각각의 TFRE 리포터 구성체의 세 개의 클론에서 유래된 플라스미드를 이용하여 각각 3회 중복 실시한 3회 독립적인 실험의 평균 +SD를 나타낸다.
[도 2]는 선택된 본 발명의 1세대 합성 프로모터(표 3에 나타낸 서열)의 발현 수준을 비교하는 리포터 유전자 분석 결과의 일부를 나타내는 그래프이다.
1세대 합성 프로모터는 NFκB, CRE, E-박스, GC-박스, E4F1 및 C/EBPα TFRE를 동일한 비율로 무작위 결찰시켜 제작하였다. 합성 프로모터를 SEAP 리포터 플라스미드 내 최소 CMV 코어 프로모터의 상류에 삽입하고 CHO-S 세포에 형질감염시켰다. [도 2]는 1세대 합성 프로모터의 일반적인 구조의 개략도를 포함한다.
SEAP 발현을 형질감염 후 24시간에 정량하였다. 데이터를 프로모터 1/01에 나타낸 생산량의 백분율로서 나타내었다(표 3의 서열 참조). 대조 CMV-SEAP 리포터의 SEAP 생산량은 검정 막대로 나타낸다. 각 막대는 각 프로모터에 대해 2회의 형질감염의 평균을 나타내며, SEAP 생산량에서 10% 미만의 차이가 관찰되었다.
[도 3a/b]는 각각의 그래프가 TFRE가 존재하는 1세대 프로모터 구성체의 발현 수준에 대한 TFRE의 존재비의 분석 결과를 나타내는 일련의 그래프를 나타낸다.
각 합성 프로모터의 각 TFRE의 개수를 그 프로모터 (A-F)의 상대 활성에 대해 플로팅한다. 각각의 경우, 선형 회귀 직선을 나타내며, 여기서 직선의 기울기는 각 TFRE가 서로 다른 활성의 프로모터에서 존재하는 정도를 나타낸다.
평균 초과: 평균 발현 수준보다 높다(즉, 고발현 구성체).
평균 미만: 평균 발현 수준보다 낮다(즉, 저발현 구성체).
[도 4]는 선택된 본 발명의 리포터 2세대 합성 프로모터 구성체의 발현 수준을 비교하는 리포터 유전자 분석 결과의 일부를 도식하는 그래프를 나타낸다(표 4에 나타낸 서열).
2세대 합성 프로모터를 NFκB, E-박스, GC-박스, C/EBPα TFRE를 5:3:1:1 비율로 무작위 결찰시켜 제작하였다. 합성 프로모터를 SEAP 리포터 플라스미드 내 최소 CMV 코어 프로모터의 상류에 삽입하고 CHO-S 세포로 형질감염시켰다. SEAP 발현을 형질감염 24시간 후에 정량하였다. 데이터를 CMV 대조 프로모터(검정 막대)에 의해 나타난 생산량의 백분율로서 나타낸다. 1세대 라이브러리(1/01; 도 2) 리포터에서 최대 활성의 프로모터로부터 SEAP 생산량을 체크무늬 막대로 나타낸다. 그외에, 각 프로모터에 대해 2회의 형질감염의 평균을 나타내며, 각 막대에 대해 SEAP 생산량에서 10% 미만의 차이가 관찰되었다.
프로모터 구성체 1/01(빗금 막대): 최고 발현 수준을 생산한 최고 1세대 프로모터.
[도 5]는 각각의 그래프가 TFRE가 존재하는 2세대 프로모터 구성체의 발현 수준에 대한 TFRE의 존재비의 분석 결과를 나타내는 일련의 그래프를 나타낸다.
각 합성 프로모터의 각각의 TFRE의 개수를 그 프로모터(A-D)의 상대 활성에 대해 플로팅한다. 각각의 경우에, 선형 회귀 직선을 나타내며, 여기서 직선의 기울기는 각 TFRE가 서로 다른 활성의 프로모터에서 존재하는 정도를 나타낸다.
평균 초과: 평균 발현 수준보다 높다(즉, 고발현 구성체).
평균 미만: 평균 발현 수준보다 낮다(즉, 저발현 구성체).
[도 6]은 상이한 상대 활성을 갖는 7개의 합성 프로모터의 상대 활성을 CHO-S 세포, CHO-K1 세포 및 CHO-DG44 세포에서 결정하였다는 것을 나타내는 리포터 유전자 분석의 결과를 나타낸다. 세포(2 x 10⁵)를 250 ng의 SEAP-리포터 벡터로 형질감염시키고, SEAP 생산량을 감염 후 24시간에 정량하였다. 데이터를 각 세포주에서 CMV 프로모터 활성의 백분율로 나타낸다. 값은 3회 중복 실시한 3회의 독립적인 실험의 평균 + S.D를 나타낸다.
흥미롭게도, 각 프로모터의 상대적인 성능은 시험된 모든 세포에서 동일하지 않았다.
[도 7]은 [도 6]에 도식한 동일한 합성 프로모터 구성체를 이용하여 CHO-S 세포의 유가배양에서 더 긴 기간의 일시적인 발현(즉, 7일 초과 실시)를 수반하는 리포터 유전자 분석의 결과를 나타낸다.
CHO-S 세포(6 x 10⁶)를 7.5 μg의 SEAP 리포터-벡터로 형질감염시켰으며, 여기서 SEAP 발현은 서로 다른 활성을 가진 합성 프로모터 또는 대조 CMV 프로모터의 조절하에 있었다. SEAP 생산량 및 생존 세포 농도는 튜브-스핀 생물반응기에서 7일간 유가배양 공정 과정에 걸쳐 측정하였다. 7일에 평균 IVCD(생존 세포 밀도의 적분)(백색 막대) 및 SEAP 역가(검정 막대)로 나타낸다. SEAP 데이터는 대조 CMV 프로모터 활성의 백분율로 나타낸다. 2회의 독립적인 형질감염을 중복하여 실시하였다.
[도 8]은 본 개시에 따른 합성 프로모터의 다양한 서열을 나타낸다.

본원에서 사용되는 "일렬로"는 한 서열 뒤에 다른 서열이 "일직선"으로 있는 서열을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "전사 인자"는 시스 작용 영역에 결합하고 유전자의 발현을 양성적 또는 음성적으로 조절하는 단백질을 포함한 임의의 세포 인자를 나타내며, 예를 들어 전사 인자는 RNA 폴리머라제 결합을 돕거나 차단함으로써 유전자의 전사를 상승시키거나 억제하는 유전자의 코딩서열 상류에 결합할 수 있다. 전사 인자 또는 억제인자 또는 공-활성화 인자 또는 공-억제인자 등은 본 정의 내에 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "전사 인자 조절 요소", 또는 "TFRE", 또는 "조절 요소"는 전사 인자에 의해 인식되고 결합되는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

TFRE는 핵산 서열, 적절하게는, 이중 가닥 DNA 서열을 포함한다. TFRE는 시스 작용 영역을 포함할 수 있고 또한 추가의 핵산을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서 요소의 코어의 6 내지 8개의 뉴클레오티드는 그들의 상응하는 전사 인자가 결합하는데 충분할 수 있다.

따라서, TFRE는 6 내지 8개의 핵산 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명의 TFRE는 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 또는 30개 이상의 염기 길이일 수 있다. 본 발명의 TFRE는 100개 이하, 75개 이하, 50개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하 또는 15개 이하의 염기 길이일 수 있다.

그러나 당업자는 기타 전사 인자, 예를 들어 일반적인 전사 인자 또는 폴리뉴클레오티드에 불규칙하게 결합하는 전사 인자의 영향이 항상 배제되는 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 전사 인자 조절 요소가 합성 프로모터에 포함되어 있는 그 전사 인자에 의해 전사 활성 또는 억제 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%가 매개되는 상기 프로모터 구성체를 전사 인자에 의해 특이적으로 조절되는 것으로 간주해야 한다.

특히 적합한 TFRE는 관심의 세포 또는 조직 내에서 활성을 갖는 것이다. 이러한 TFRE는 관심의 세포 또는 조직에서 발현되는 유전자와 연관된 것으로 확인될 수 있으며, 예를 들어 TFRE는 또 다른 세포 또는 조직과 비교될 때 그 세포 또는 조직에서 차등적으로 발현되는 유전자와 연관될 수 있다. 유전자의 차등적인 발현은 2 개의 상이한 세포 또는 조직에서, 또는 동일한 세포 또는 조직에서 상이한 조건하에서 비교함으로써 알 수 있다.

한 세포 또는 조직 유형에서 발현은 상이하지만 관련된 조직 유형에서의 발현과 비교될 수 있으며, 예를 들어 관심의 세포 또는 조직이 질환 세포 또는 조직이거나 본원에서 기재된 바와 같이 인위적으로 조작되는 경우, 그 세포 또는 조직의 유전자의 발현은 등가의 정상 또는 치료받지 않은 세포 또는 조직에서 동일한 유전자의 발현과 비교될 수 있다. 이것은 두 가지 세포 또는 조직 유형 사이에 차등적으로 조절되는 유전자의 확인을 가능하게 할 수 있다.

이같은 유전자와 연관된 TFRE는 대개 세포의 게놈 내의 유전자의 코딩 서열과 근접하게 위치하는데, 예를 들어 이러한 TFRE는 그 코딩 서열의 바로 상류 또는 하류 영역에 위치할 수 있다. 이러한 TFRE는 유전자 발현을 조절하는 프로모터 또는 기타 조절 서열과 근접하게 위치할 수 있다. TFRE의 위치는 다양하게 공지된 방법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 전사 인자 조절 요소의 일부 적합한 예는 하기 표 1에 나타낸다.

<표 1> 전사 인자 조절 요소: CHO 세포에서 활성을 보이는 것으로 생각되는 10개의 바이러스 프로모터를 위양성(false positive)을 최소화하는 엄격한 검색 변수를 이용한 전사 요소 검색 시스템(TESS: Transcription Element Search System) 및 전사 친화도 예측(TRAP: Transcription Affinity Prediction) 알고리즘을 이용하여 별개의 전사 인자 조절 요소(전사 인자 결합 부위)의 존재를 조사하였다. 많은 바이러스 프로모터에 존재하는 단일 TFRE 서열을 열거한다. CHO-S 세포에서 재조합 리포터 유전자의 전사를 활성화시키는 상대적 능력 측정값은 [도 1]에 나타낸다.

본 발명의 전사 조절 요소는 명세서에 언급된 특정 서열에 제한되는 것이 아니라 그들의 구조적 기능적 유사체/상동체도 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. 이러한 유사체는 위치지정 또는 무작위 돌연변이 유발법에 의해 도입된 1 개 이상의 뉴클레오티드의 절단, 결실, 삽입, 및 치환을 포함할 수 있다. 절단은 공지된 전사 억제제에 대한 1 개 이상의 결합 부위를 결실시키도록 도입될 수 있다.

추가적으로, 이 같은 서열은 본 발명의 서열과 고도의 동일성을 나타내는 자연에서 천연적으로 발견되는 서열로부터 유래할 수 있다. 약 20개 뉴클레오티트 이상의 핵산은 엄격 조건하에서 관련된 전사 인자에 혼성화하는 경우 본 발명의 전사 인자 조절 요소와 고도의 동일성을 갖는다고 간주될 것이다. 별법으로, 핵산은 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, 문헌(Altshul et al., J. Mol . Biol . 1990, 215: 403-410) 기재된 BLAST(Basic Local Alignment Tool), 문헌(Needleman et al., J. Mol . Biol . 1970, 48: 444-453)의 알고리즘, 또는 문헌(Meyers et al., Comput. Appl . Biosci . 1988, 4: 11-17)의 알고리즘에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 퍼센트 동일성을 갖는 약 20개 뉴클레오티드 이상의 인접 서열을 포함하는 경우 본 발명의 전사 인자 조절 요소와 고도의 동일성을 갖는 것으로 간주될 것이다.

본 발명의 전사 인자 조절 요소는 표적 숙주 세포에서 활성을 갖는 것으로 이미 공지된 전사 인자 조절 요소로부터 선택될 수 있거나 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 코어 프로모터의 상류 서열의 인 실리코(in silico ) 분석에 의해 결정된 추정되는 조절 요소가 될 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에서 기재된 군으로부터 선택된 전사 인자 조절 요소의 조합의 용도, 예를 들어 숙주 세포에서, 특히 합성 프로모터로 포함되어 전사, 번역 또는 발현을 향상시키기 위한 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 발현을 유도하기 위한, 예를 들어 본원에서 기재된 바와 같은, 합성 프로모터의 용도를 제공한다.

이러한 인 실리코 분석은 통상적으로 다양한 생물체의 게놈 사이의 비코딩 조절 서열을 비교함으로써 작동되어 후보 유전자의 또는 미세배열 분석에 의해 확인된 클러스터로부터 유래한 프로모터에 상당히 풍부하거나 전사 인자 조절 요소로서 잠재적으로 기능을 할 수 있는 보존 영역의 확인을 가능하게 한다. 이러한 소프트웨어 제품군의 예는 TRAFAC, CORG, CONSITE, CONFAC, VAMP 및 CisMoIs 분석기를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "프로모터 " 또는 "프로모터 구성체"은 유전자의 효율적인 전사를 위한 구성요소를 포함하고 한 가지 이상의 전사 인자 조절 요소, 코어 프로모터 영역, 및 선택적으로 5'-비번역 영역 또는 인트론을 포함하는 DNA 분절을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "합성 프로모터 구성체" 또는 "합성 프로모터"는 예를 들어 2 개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는, 예를 들어 1 개 이상의 전사 인자 조절 요소 구성체를 포함하는, 인공의 또는 조작되거나 조립된 프로모터 서열을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "전사 인자 조절 요소 구성체" 또는 "TFRE 구성체"은 1 개 초과의 전사 조절 요소 서열을 포함하는 조립된 이중 가닥 DNA 분자를 나타낸다. 구성체는 다양한 이중 가닥 전사 조절 요소를 함께 나란히 또는 지정된 형태로 결찰시키는 것을 포함하여 당업자에게 공지된 많은 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 구성체는 기타 핵산 서열, 예를 들어 전사 인자의 결합을 매개하지 않지만 결합 부위의 정확한 공간 배열을 가능하게 하는 스페이서를 또한 포함할 수 있다. 스페이서 영역은 예를 들어 상이한 TFRE가 서로 쉽게 결찰되도록 하는 통상의 오버행일 수 있다.

TFRE는 대개 서로 나란히 존재하지만 오버행 서열에 의해 분리될 수 있다.

구성체는 적어도 2 개의 동일한 전사 인자 조절 요소를 포함할 수 있다.

구성체는 적어도 2 개의 상이한 전사 인자에 대한 적어도 2 개의 상이한 전사 인자 조절 요소를 포함할 수 있다.

구성체는 또한 다수, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함할 수 있다. 이들의 개수는 동일할 수 있거나 모두 상이할 수 있다.

구성체 내에 조립될 때, 전사 인자 조절 요소는 표적 숙주 세포 내에서 발현되는 다수의 전사 인자에 결합하고 재조합 단백질 또는 리포터 단백질의 발현을 효율적으로 유도한다. 그러나 조합된 동일한 전사 인자 조절 요소는 서열 요소에 결합하는데 필요한 특정 전사 인자의 결여로 인해 비표적 숙주 세포에서 활성을 갖지 않을 수 있다. 따라서, 유전자 전사의 조합 특성은 표적 숙주 세포에서 활성을 갖는 전사 인자 및 공동 조절 인자의 정확한 프로파일을 이해함으로써 가장 효율적으로 이용된다.

본원에서 사용되는 "코어 프로모터" 또는 "프로모터 코어"는 전사를 개시하는데 필요한 프로모터의 최소 부분이 되는 짧은 DNA 분절을 나타낸다. 코어 프로모터 서열은 원핵 및 진핵 유전자를 포함한 여러 가지 다양한 기원으로부터 유래할 수 있다. 이러한 예는 도파민 베타-히드록실라제 유전자 최소 프로모터 및 거대세포 바이러스(CMV) 전초기 유전자 프로모터이다. 한 실시예에서, 코어 프로모터는 CMV, SV40, UbC, EF1A, PGK 및 CAGG로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터, 예를 들어 CMV로부터 유래한다.

코어 프로모터는 "유도성"일 수 있는데, 여기서 유도제가 존재한다면, 유도제가 없을 때의 전사 수준과 비교하여 유도제 또는 증가된 수준의 작동 가능하게 연결된 발현가능 폴리뉴클레오티드에 반응하여 전사가 개시되는 것이다.

별법으로, 프로모터는 "구성적"일 수 있는데, 여기서 전사 활성은 유도제의 존재에 의해 영향받지 않는다.

용어 "유도제"는 유도성 프로모터부터 전사를 일으키는 화학적, 생물학적 또는 물리학적 제제를 나타내는데 사용된다. 유도제는 예를 들어 세포가 노출되는 스트레스 조건, 예를 들어 열 또는 저온 쇼크, 독성제, 예를 들어 중금속 이온, 또는 영양분의 결핍, 호르몬, 성장 인자 등일 수 있거나, 호르몬 또는 성장 인자와 같은 세포의 성장 또는 분화 상태에 영향을 주는 물질에 대한 노출일 수 있다.

코어 프로모터는 또한 특정 조직 유형에서 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 전사하는데에만 활성을 갖도록 하는 "조직 특이적" 또는 "조직 우선적" 방식으로 조절될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "야생형 프로모터"는 자연에 존재하는 프로모터 서열을 나타낸다.

달리 명시되지 않는다면, 용어 "CMV 프로모터"는 보편적으로 인정받는 전장의 hCMV-IE1 프로모터(즉, 코어 및 근위 요소)(진뱅크(GenBank) 승인번호 M60321.1, 염기 595 - 1193)를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "CMV 코어" 또는 "hCMV-IE1 코어"는 본원에서 서열 번호 170으로 제공되는 최소 hCMV-IE1 코어 프로모터를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 물리적 위치가 아닌 작용하는 기능(즉 기능에 영향을 주거나 기타 요소의 기능에 반응할 수 있는)에 의해 연결된 핵산 서열 내 요소 또는 구조를 나타낸다. 이로 인해, 핵산 서열 내의 요소 또는 구조는 작동 가능하게 연결되도록 나란하거나 인접한 순서로 존재하는 것이 반드시 필수적인 것은 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 세포 또는 생물체 내로 핵산을 운반하는 임의의 비히클을 나타낸다. 벡터의 예는 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있고 크로모좀 DNA와 별도로 복제할 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"이다. 플라스미드는 주로 세균 및 때때로 다른 미생물에 존재하거나 그들로부터 유래한다. 그러나 미토콘드리아 및 엽록체 DNA, 효모 킬러 및 기타 경우는 보편적으로 제외된다.

또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 분절이 바이러스 서열로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 어떤 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어 세균 복제 기원을 가진 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 기타 벡터(예를 들어 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있으며, 그들은 그 후에 숙주 게놈과 함께 복제된다. 본 명세서에서, 플라스미드는 가장 보편적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 호환적으로 사용될 수 있다.

벡터가 제작될 수 있는 일반적인 방법인 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing)을 참조한다.

본 발명의 벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 그의 발현으로 마커 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 확인하도록 해주는 단백질이다.

다양한 선택 마커가 당 업계에 공지되어 있는데, 예를 들어 선택 마커는 항생제 카나마이신에 내성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt II)에 대한 유전자, 및 관련 항생제 네오마이신, 파로마이신, 젠타마이신 및 G4148에 대한 유전자, 또는 히그로마이신에 내성을 부여하는 효소를 발현하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt)에 대한 유전자일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 표적 숙주 세포에서 발현되는 재조합 단백질을 코딩하는 벡터를 나타낸다. 본원에서 기재된 바와 같이 다수의 다양한 발현 벡터가 제공될 수 있다. 이들은 라이브러리를 형성할 수 있다.

본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 본 발명의 1 개 이상의 합성 프로모터, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 세포이다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 체내 세포 일 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.

본 발명의 표적 숙주 세포로 벡터의 형질감염은 임의의 적합한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 다양한 형질감염 방법은 당 업계에 공지되어 있으며 당업자는 벡터 유형 및 원하는 숙주 세포 유형에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "일시적인 발현"은 재조합 유전 서열의 전사 및 번역을 지시하는 숙주 세포의 능력을 나타낸다. 이러한 전사 및 번역은 유전 서열이 숙주 세포에 도입된 후 곧 일어난다. 이러한 발현은 심지어 기능성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자 서열을 운반하는 플라스미드가 플라스미드를 복제하거나 증식할 수 없는 숙주 세포에 도입되는 때에도 일어날 수 있다.

본원에서 사용되는 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작되거나 생산되는 단백질을 나타낸다. 관심의 단백질은 외인성 벡터로부터 발현되는 내인성 단백질과 동일한 외인성 서열, 또는, 예를 들어 약화된 생물활성을 가진 그의 변이된 형태, 또는 그의 단편일 수 있다. 별법으로, 관심의 단백질은 숙주 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 이종 단백질일 수 있다.

재조합 단백질은 치료, 예방 또는 진단 단백질을 포함하는 임의의 적합한 단백질일 수 있다.

본 발명에 따른 합성 프로모터의 조절하에 발현되는 재조합 단백질은 예를 들어 면역원성 단백질, 2 개의 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질, 또는 항체일 수 있다. 재조합 단백질로서 사용하기 위한 항체는 단클론, 다가, 다중 특이적, 인간화, 완전 인간 또는 키메라 항체를 포함한다. 항체는 전장의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 완전 항체 또는 그의 단편, 예를 들어, VH, VL, VHH, Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 scFv 단편일 수 있다.

발현 후에, 항체 단편은 예를 들어 또 다른 독립체에 접합에 의해 추가로 처리되거나, 예를 들어 항체 단편은 페길화되어, 예를 들어 원하는 경우 전체 항체와 유사한, 원하는 특성을 갖는 산물을 생성할 수 있다.

항체 또는 그의 단편에 의해 결합된 관심의 항원의 예는 질환 또는 감염 시 상승조절되는 단백질과 같은 임의의 의학적으로 적절한 단백질, 예를 들어 수용체 및/또는 그의 상응하는 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 세포 표면 단백질의 구체적인 예는 부착 분자, 예를 들어 β1 인테그린과 같은 인테그린 예를 들어 VLA-4, E-셀렉틴, P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134(OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, 두둘린2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, 넥틴 유사2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 발암 배아성 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), 인간 유지방 글로불린(HMFG1 및 2), MHC I형 및 MHC II형 항원, 및 VEGF, 및 적합한 경우, 그들의 수용체를 포함한다.

가용성 항원은 인터류킨 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16, IL-23, 바이러스 항원 예를 들어 호흡기 세포 융합 바이러스 또는 거대세포 바이러스 항원, 면역글로불린, 예를 들어, IgE, 인터페론, 예를 들어 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ, 종양 괴사 인자-β, 콜로니 자극 인자 예를 들어 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유래 성장 인자 예를 들어 PDGF-α, 및 PDGF-β 및 적합한 경우 그들의 수용체를 포함한다. 기타 항원은 세균 세포 표면 항원, 세균 독소, 바이러스 예를 들어 인플루엔자, EBV, HepA, B 및 C, 생물 테러 제제, 방사성 핵종 및 중금속, 및 뱀 및 거미 독 및 독소를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "리포터 유전자"는 분석이 용이한 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 보다 보편적으로 사용되는 리포터 유전자 중에는 "리포터 단백질"-클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 분비 알칼리 포스파타제(SEAP), β-갈락토시다제(GAL), β-글루쿠로니다제(GUS), 루시퍼라제(LUC), 및 녹색 형광 단백질(GFP)-에 대한 유전자들이 있다. 당업자는 기타 이용 가능한 리포터 유전자를 알 것이다.

또한, 본 발명은 세포 내에서 특정 합성 프로모터 구성체의 전사 활성이 분석될 수 있는 방법으로서 "리포터 유전자 분석법"을 제공한다. 이러한 분석법은 프로모터 활성을 가시화하기 위한 리포터 유전자를 관심 프로모터 하류에 연결하여 리포터 구성체를 얻는 단계, 시험 세포 내에 리포터 구성체를 도입하는 단계 및 측정된 발현 리포터 단백질의 수준을 기초로 하여 프로모터 활성화 조건을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

리포터 유전자는 분비 가능한 리포터 단백질을 코딩할 수 있는데, 이것은 전사되고 번역될 때 결과적으로 합성되어 외부 배양 배지로 분비되는 분비 가능한 리포터 단백질을 가져올 것이다. 리포터 분자의 존재는 미생물 숙주 세포의 파괴 또는 파열을 요구하지 않으면서 배지를 분석함으로써 모니터 된다. 배양 배지의 부분 표본은 리포터 분자를 검출할 수 있는 임의의 방법에 의해 평가된다. 이러한 방법은 예를 들어 면역분석법 또는 당 업계에 공지된 다른 방법일 수 있다. 따라서, 외부 배양 배지 내에 리포터 분자의 축적 속도는 플라스미드/발현 벡터 상에서 리포터 유전자 서열과 인접하게 클로닝되어 그에 선행하는 단편에 존재하는 임의의 프로모터 구성체의 전사 활성을 나타낸다.

별법으로, 루시퍼라제와 같이 가시적으로 식별가능한 리포터 유전자가 사용되는 경우(결과적으로 기질인 루시페린과 ATP가 존재하는 경우 광자를 방출), 리포터 단백질의 발현 수준은 광도계를 이용하여 쉽게 모니터될 수 있다.

한 실시양태에서, 재조합 단백질은 리포터 단백질이 아니며, 즉 본 개시의 구성체는 리포터 유전자를 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 재조합 단백질은 루시퍼라제가 아니며, 즉 본 개시의 구성체는 루시퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "전사 활성"은 DNA에 코딩된 정보의 RNA 분자로 전사, 또는 RNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 코딩된 정보의 단백질 내 정의된 서열의 아미노산으로 번역을 나타낸다.

"높은" 전사 활성을 가진 프로모터 구성체는 재조합 단백질 또는 리포터 단백질을 다양한 프로모터 구성체로 얻어지는 평균 발현 수준에 비해 더 높은 발현 수준으로 정의된 "높은" 수준으로 발현할 수 있는 구성체를 나타낸다. 판단 기준으로서, 최고 수준의 활성을 가진 합성 프로모터는 CHO 세포 내에서 가장 강한 프로모터 중 하나로서 널리 인식되는 hCMV-IE1의 활성을 능가한다.

반대로, "낮은" 전사 활성을 가진 프로모터 구성체는 재조합 단백질 또는 리포터 단백질을 다양한 프로모터 구성체로 얻어지는 평균 발현 수준에 비해 더 낮은 발현 수준으로 정의된 "낮은" 수준으로 발현하는 구성체를 나타낸다.

따라서, 용어 "전사 활성" 및 "발현 수준"은 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.

용어 "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 2 개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 서열을 의미하는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 이와 같이, 용어는 유전자 또는 그의 일부분, cDNA, 합성 폴리데옥시리보 핵산 서열 또는 폴리리보 핵산 서열 등일 수 있는 RNA 및 DNA를 포함하며 단일 가닥 또는 이중 가닥, 및 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 게다가, 용어 "올리고뉴클레오티드". "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 세포로부터 단리될 수 있는 천연 핵산 분자뿐만 아니라 화학 합성 방법에 의해 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 효소 방법에 의해 제조될 수 있는 합성 분자를 포함한다.

뉴클레오티드 서열을 제조하기 위한 합성 방법은 예를 들어 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법(각각이 본원에서 참고에 포함되는 문헌(Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, (1979); 미국 특허 제4,356,270호, 미국 특허 제458,066호, 미국 특허 제4,416,988호, 미국 특허 제4,293,652호; 및 Brown et al, Meth. Enzymol. 68:109, (1979))을 참조)을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 방법에 유용한 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 골격 결합을 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오티드(폴리뉴클레오티드)를 포함하는 뉴클레오티드는 일반적으로 천연 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 2'-데옥시리보스에 결합된 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민, 또는 리보뉴클레오티드 예를 들어 리보스에 결합된 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실이다. 그러나 폴리뉴클레오티드는 또한 비천연 합성 뉴클레오티드 또는 변형된 천연 뉴클레오티드를 포함한 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 당 업계에 잘 알려져 있으며 시판되고 있으며, 이러한 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드도 마찬가지이다(각각이 본원에서 참고에 포함되는 문헌(Lin et al., Nucl. Acids Res. 22:5220-5234 (1994); Jellinek et al, Biochemistry 34:11363-11372 (1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73 (1997))

올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 연결하는 공유 결합은 대개 포스포디에스테르 결합이다. 그러나 공유 결합은 또한 티오디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 펩티드 유사 결합 또는 뉴클레오티드를 연결하여 합성 폴리뉴클레오티드를 생성하는데 유용한 것으로 당 업자에게 공지된 기타 임의의 결합을 포함한 기타 많은 결합 중 임의의 결합일 수 있다(예를 들어, 각각이 본원에서 참고에 포함된 문헌(Tarn et al., Nucl. Acids Res. 22:977-986 (1994); Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351360 (1995)) 참조). 변형된 뉴클레오티드 서열이 분해에 덜 민감할 수 있기 때문에, 비천연 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 또는 유사체를 연결하는 결합의 포함은 뉴클레오티드 서열이 예를 들어 조직 배양 배지 또는 살아있는 피험체에 투여될 때를 포함하여 핵산 분해 활성을 포함할 수 있는 환경에 노출되는 경우 특히 유용할 수 있다.

천연 뉴클레오티드와 포스포디에스테르 결합을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성되거나 적합한 폴리뉴클레오티드를 주형으로 이용하는 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 반면, T7 폴리머라제와 같은 효소가 특정 유형의 뉴클레오티드 유사체를 폴리뉴클레오티드에 포함시킬 수 있어서 이러한 폴리뉴클레오티드를 적합한 주형으로부터 재조합적으로 생산하는데 이용될 수 있긴 하지만, 뉴클레오티드 유사체 또는 포스포디에스테르는 이외의 공유 결합을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 대개 화학적으로 합성된다(Jellinek et al., 상기 문헌, 1995).

본원에서 사용되는 용어 "라이브러리"는 본문에서 언급되는 경우 본 개시의 2 개 이상의 TFRE 구성체, 2 개 이상의 합성 프로모터 또는 2 개 이상의 발현 벡터를 나타낸다. 명세서에서 걸쳐 기재된 바와 같이, 용어 "라이브러리"는 가장 광범위한 의미로 사용되며 본 개시의 라이브러리를 생성하는데 결합될 수 있거나 결합되지 않을 수 있는 부분 라이브러리를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 서 관심의 세포 또는 조직 유형에서 활성을 갖는 것으로 확인된 TFRE는 그 세포 또는 조직 유형에 대한 유전자를 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 TFRE가 특정 세포유형에서 특이적으로 활성을 갖지만 대조 세포 유형에서 활성을 갖지 않는다는 것을 나타내는 경우, TFRE가 관심의 세포 유형에서 특이적으로 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 TFRE는 특정 세포 유형에서 발현되기를 바라는 유전자와 결합될 수 있다.

본 명세서의 본문에서 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"의 의미를 의도한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.

기술적으로 적합한 경우, 본 발명의 실시양태는 조합될 수 있다.

실시양태는 확실한 특성/요소를 포함하는 것으로 본원에서 기재된다. 또한, 본 개시는 상기 특성/요소로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 분리된 실시양태에 확장된다.

특허 및 출원과 같은 기술적 참고 문헌은 본원에서 참고에 포함된다.

본원에서 구체적으로 명백하게 인용된 어떤 실시양태이든 단독으로 또는 한 가지 이상의 추가의 실시양태와 결합하여 면책의 근거를 형성할 수 있다.

본 발명은 이제 하기 실시예와 관련하여 기재될 것이며, 이들은 단지 예시일 뿐이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

참고 문헌

실시예 1 CHO -S 세포에서 활성을 갖는 전사 인자 조절 요소의 실별

전사 인자 조절 요소의 인 실리코 분석

CHO-S 세포에서 재조합 유전자 전사활성화가 가능한 별개의 TFRE(전사 인자 결합 부위)를 확인하기 위하여, 발명자들은 일반적으로 CHO 세포에서 활성을 갖는 것으로 공지된 10개의 바이러스 프로모터에 대해 추정되는 TFRE를 조사하였다.

하기 프로모터 서열을 진뱅크로부터 검색하였다: hCMV-IE1(승인번호 M60321.1), 마우스 CMV-IE1(M11788), 랫트 CMV-IE1(U62396), 기니아 피크 CMV-IE1(CS419275), 마우스 CMV-IE2(L06816.1), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터 및 인핸서(NC_001669.1), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(KF268310), 골수 증식성 육종 바이러스 긴 말단 반복(LTR)(K01683.1), 라우스 육종 바이러스 LTR(J02025.1), 및 인간 면역결핍 바이러스 LTR(K03455.1).

문헌(Schug(Schug 2008) 및 Manke et al(Manke et al. 2008))에 의해 종래에 기재된 방법에 따라 전사 요소 검색 시스템(TESS: http://www.cbil. upenn.edu/cgi-bin/tess/tess) 및 전사 친화도 예측 도구(TRAP: http://trap.molgen.mpg.de/cgi-bin/trap_form.cgi)를 이용하여 프로모터를 분석하였다. 엄격한 검색 변수를 이용하여 위양성을 최소화하였다.

전사 인자(TF) 결합 부위에 대해 DNA 서열을 스캐닝하는 온라인 검색 도구, 구체적으로 전사 요소 검색 시스템(TESS) 및 전사 친화도 예측 도구(TRAP)를 이용하면서, 엄격한 검색 변수(Manke et al. 2008; Schug 2008)를 이용하여 위양성을 최소화하였다. 모든 바이러스 프로모터 서열에서, 67개의 별개의 TFRE가 1 개 이상의 프로모터 내에 존재한다는 것을 확인하였다. 상기 집단(설계 공간)을 더 최소화하기 위하여, 적어도 2 개의 프로모터에서 존재하지 않는 TFRE를 걸러냈다.

상기 인 실리코 분석을 기초로 하여, 28개의 전사 인자 조절 요소(TFRE)(하기 표 2 참조)를 식별하였다.

<표 2> 바이러스 프로모터의 생물정보 검색에 의해 확인된 전사 인자 조절 요소: CHO 세포에서 활성을 나타내는 것으로 알려진 10개의 바이러스 프로모터를 위양성을 최소화하기 위해 엄격한 검색 변수를 이용한 전사 요소 검색 시스템(TESS) 및 전사 친화도 예측(TRAP) 알고리즘을 이용하여 별개의 전사 인자 조절 요소(전사 인자 결합 부위)의 존재에 대해 조사하였다. 많은 바이러스 프로모터에서 발현되는 28개의 단일 TFRE를 열거한다.

TFRE -리포터 벡터 제작

종래에 기재된(Brown et al. 2013) 프로모터 없는 리포터 벡터(pSEAP2control(Clontech, Oxford, UK))로부터 서브클로닝됨)를 본 연구에 이용하였다. 이들 플라스미드는 분비 알칼리 포스파타제(SEAP) 또는 터보 녹색 형광 단백질(GFP) 오픈 리딩 프레임(ORF)의 상류에 최소 hCMV-IE1 코어 프로모터(5'-AGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGAC-3') (서열 번호 170)를 포함한다.

RE 리포터 플라스미드를 생성하기 위하여, 표 1에서 각각의 TFRE 공통 서열의 7x 반복 카피를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 합성하고(Sigma), PCR 증폭하고, CMV 코어 프로모터의 상류에 KpnI과 XhoI 부위에 삽입하였다. 각 TFRE 리포터에 대해 3개의 클론으로부터 유래한 플라스미드를 키아젠 플라스미드 미니 키트(Qiagen plasmid mini kit)(Qiagen, Crawley, UK)를 이용하여 정제하였다. 모든 플라스미드 구성체의 서열을 DAN 서열분석에 의해 확인하였다.

세포 배양 및 형질감염

CHO-S 및 CHO-K1 세포를 8 mM 및 6mM L-글루타민(Sigma)이 각각 보충된 CD-CHO 배지(Life Technologies)에서 배양하였다. CHO-DG44 세포를 8 mM L-글루타민 및 18 mL/L 플루로닉 F68(Life Technologies)이 보충된 CD-DG44 배지(Life Technologies)에서 배양하였다. 모든 세포를 통상적으로 통기 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크(Corning, UK) 내에 37℃, 5%(v/v) CO₂, 140 rpm에서 진탕 배양하고 3-4주 마다 2 x 10⁵ 세포/ml의 접종 밀도로 계대 배양하였다. 세포 농도 및 생존도를 바이셀(Vi-Cell) 세포 생존도 분석기(Beckman-Coulter, High Wycombe, UK)를 이용하여 자동화 트립판 블루(Trypan Blue) 제거 분석에 의해 결정하였다. 형질감염 2시간 전에, 중간 지수기 배양으로부터 2 x 10⁵ 세포를 24웰 플레이트(Nunc, UK)의 각 웰에 접종하였다. 세포를 DNA와 리포펙타민(Lipofectamine)(Life Technologies)을 포함하는 DNA-지질 복합체로 형질감염시켜 제조사의 지시에 따라 제조하였다. 형질감염된 세포를 단백질 발현 분석 전 24시간 동안 인큐베이션하였다.

리포터 발현의 정량

SEAP 단백질 발현을 센소라이트(Sensolyte) pNPP SEAP 비색 리포터 유전자 분석 키트(Cambridge Biosciences, Cambridge, UK)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 정량하였다. GFP 단백질 발현을 플로아로스캔 어센트(Flouroskan Ascent) FL 형광분석기(여기 필터: 485 nm, 방출 필터: 520 nm)를 이용하여 정량하였다. 배경 형광도/흡광도를 프로모터 없는 벡터로 형질감염된 세포에서 측정하였다.

리포터 분석 결과는 [도 1]에 나타낸다. 무시해도 좋은 기본 활성은 CMV 코어 프로모터(TSS와 관련하여 -34 내지 +48은 TATA 박스 및 개시 요소를 포함)로 확인하였다.

나타낸 바와 같이, 대부분의 TFRE는 결과적으로 코어 프로모터를 단독으로 사용할 때에 비해 SEAP/GFP의 발현 수준을 증가시키지 못하였다. 그러나 7개의 TFRE, 즉 NFκB-RE, E-박스, AP1-RE, CRE, GC-박스, E4F1-RE 및 C/EBPα-RE는 코어 프로모터 CMV 단독에 비해 더 높은 발현 수준의 SEAP/GFP를 보였다.

이들 7개의 TFRE를 1세대 합성 프로모터에 포함 시키기 위해 선택하였다.

실시예 2 - 1세대 프로모터의 제작 및 분석

합성 프로모터 라이브러리 제작

합성 프로모터 TFRE를 상보성 단일 가닥 5' 인산화 올리고뉴클레오티드(Sigma, Poole, UK)로부터 제작하고, STE 완충액(100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.8, Sigma) 중에서 95℃에서 5분간 가열하여 어닐링하고 2시간 넘게 25℃로 서서히 냉각하였다. 생성된 이중 가닥 블록이 특정 TFRE(표 1) 및 각 5' 말단에 4 bp TCGA 단일 가닥 오버행을 포함하도록 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 예를 들어 NFkB-RE 블록에 사용된 서열은 다음과 같았다(밑줄은 RE 부위).

5'-TCGATGGGACTTTCCA-3' (서열 번호 171) 및 5'-TCGATGGAAAGTCCCA-3' (서열 번호 172).

제1세대 합성 프로모터 라이브러리를 제작하기 위하여, CHO-S 세포에서 전사 활성을 갖는 것으로 확인된 7개의 TFRE 모두를 사용하였다. 각 TFRE 서열의 단일 카피를 포함하는 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록을 화학 합성하였다. NFκB, CRE, E-박스, GC-박스, E4F1, 및 C/EBPα; AP1은 앞서 CRE와 AP1 부위 사이에 기능적 중복이 확인되었기 때문에(Hai and Curran 1991) 라이브러리로부터 제외시켰다.

전사 인자 조절 요소 블록을 고농도의 T4 DNA 리가아제(Life Technologies, Paisley, UK)와 적당한 화학양론적 몰 비율로 TFRE를 결찰시켜 합성하였다. KpnI 및 XhoI 부위를 포함하는 '클로닝 블록'을 1:20 몰비율의 TFRE로 결찰 혼합물에 포함시켰다. 결찰된 분자를 KpnI 및 XhoI(Promega, Southampton, UK)로 절단하고, 겔 추출(Qiaquick gel extraction kit, Qiagen)하고, 프로모터 없는 SEAP 리포터 벡터 내 최소 CMV 코어 프로모터의 상류에 삽입하였다. 클론 유래된 플라스미드를 정제하여 서열분석하였다. 대조 CMV 프로모터 리포터 플라스미드를 SEAP ORF의 상류에 hCMV-IE1 프로모터(이후로 CMV로 언급)를 이용하여 제작하였다.

SEAP의 일시적인 생산량은 처리량을 최대화하면서 통합 특이적 효과 또는 침묵으로부터 잠재적인 간섭없이 합성 프로모터 전사활성의 직접적인 판독 값을 제공하기 때문에, 이를 이용하여 합성 프로모터의 상대 활성을 결정하였다. SEAP 생산량은 전사 활성의 직접적인 측정법은 아니지만, 본 실험실의 앞선 실험은 세포 배양 상등액 내 SEAP 활성이 형질감염 후 SEAP mRNA 수준과 선형으로 연관된다는 것을 확인하였다. 게다가, 분석 조건은 대조 CMV-SEAP 리포터 활성이 플라스미드 카피 수(DNA 로드) 및 측정된 SEAP 생산량과 관련하여 선형 분석 범위의 중앙에 있도록 최적화하였다(데이터 미제시).

무작위로 선택된 110개의 형질전환된 이. 콜라이(E. coli) 콜로니로부터 정제된 플라스미드 DNA를 이용하여 SEAP 리포터 생산량을 측정하였다. 형질감염 후 24시간에 SEAP 생산량을 각 합성 프로모터에 대해 측정하였고, 각 프로모터를 서열분석하여 그의 TFRE-블록 조성을 밝혔다. 적은 비율(14)의 리포터 플라스미드는 프로모터 삽입체가 결여된 것으로 확인되었으며 이것은 추가 분석에서 제외시켰다.

잔여 96개 프로모터의 상대적인 전사 활성은 [도 2]에 나타내며, 그들의 TFRE 블록 조성은 하기 표 3에 열거한다. 이들 데이터는 1세대 합성 프로모터 활성이 100배에 걸쳐 있으며, 가장 큰 활성의 합성 프로모터는 CMV 대조 벡터로부터 유래한 것에 비해 1.2 배 증가를 나타내었다.

<표 3> 1세대 프로모터: N = NFκB-RE, E = E-박스, G = GC-박스, B = C/EBPα-RE, C = CRE, F = E4F1-RE. 역방향(SEAP 리포터에 대해 3'에서 5') TFRE는 아포스트로피로 나타내었다. 기타 모든 TFRE는 5'에서 3' 방향에 있다.

합성 프로모터 조성 분석은 (i) 전사의 상대 활성이 프로모터 길이와 관련이 없었지만, 합성 프로모터 길이는 7과 31개의 TFRE 사이로 달랐으며(평균 = 11.9 ± 4.2 블록; 189 ± 66 bp), (ii) 1세대 라이브러리에서 6개의 TFRE의 상대 존재비는 대략 등가였으며, (iii) 개별 TFRE는 정방향 또는 역방향으로 일어날 수 있지만[즉, 공통 TF 인식 서열은 양쪽 DNA 가닥에 존재할 수 있음] 이것은 전반적인 발생 빈도와 관련되거나 특정 TFRE 블록의 상대 방향과 관련하여 합성 프로모터 활성과 명백하게 연관되지는 않았다는 것을 밝혔다.

따라서, 발명자들은 합성 프로모터 활성에 있어 차이는 프로모터 내 특정 TFRE의 상이한 상대 존재비 및/또는 위치 효과의 결과였다(즉, TFRE의 인접 또는 원위 조합이 프로모터 세기에 영향을 줄 것이다)고 추론하였다. 후자는 라이브러리 크기로 주어지는 경우 컴퓨터로 다루기 아주 힘든 반면, 발명자들은 개별 TFRE가 서로 다른 활성의 합성 프로모터 내에 존재하는 상대적인 빈도를 결정함으로써 전자를 다루었다. 이들 데이터는 [도 3]에 나타낸다.

단일 TFRE는 합성 프로모터 세기에 대해 명백하게 우세한 영향을 나타내지 않았지만, 개별 TFRE는 높은 전사 활성 프로모터에서 상대적으로 많았거나(NFκB, E-박스), 프로모터에 걸쳐 동등하게 분포되었거나(C/EBPα, GC-박스) 낮은 활성 프로모터에서 상대적으로 많았다(E4F1, CRE). 이러한 편향은 다중 선형 회귀 분석에 의해 확인되었으며, 모든 인자 모델(6개 TFRE 모두 포함, r² = 0.57, p = 1.7 x 10^-14) 또는 C/EBPα 및 GC-박스 TFRE를 제외한 간명 모델(이들은 모델 적합성을 향상시키지 못하기 때문에; r² = 0.56, p = 8.84 x 10^- ¹⁶)은 최적 화학양론의 TFRE 블록이 NFκB 1.58: E-박스 1 임을 예측하였다.

기타 TFRE는 중성(C/EBPα, GC-박스) 또는 음성 이펙터(E4F1, CRE)였다. 라이브러리 전반에 걸쳐 특이적 프로모터 서열 분석은 양성, 중성 또는 음성으로 부위 지정을 확인하였다. 예를 들어, 가장 강한 프로모터(1/01)는 라이브러리 내에 최고 비율의 양성(NFκB, E-박스):음성(E4F1, CRE) 부위(9:1)를 포함한다. 게다가, 3개의 최대 활성의 프로모터(1/01 - 1/03)는 라이브러에서 7개 초과의 양성 부위 및 3개 미만의 음성 부위를 포함하는 유일한 프로모터이다. 또한, 많은 개수의 양성 부위는 많은 개수의 음성 부위에 의해 명백하게 반작용으로 중화되어 상대적으로 약한 프로모터를 생성하는 여러 예, 예를 들어 양성:음성 비율을 각각 8:8, 8:8 및 9:11을 갖는 프로모터 1/37, 1/52 및 1/68이 존재한다.

따라서, 본 실시예는 본 발명의 합성 프로모터가 선택된 프로모터 구성체에 따라 특이적으로 발현하도록 재조합 단백질의 발현을 조절할 가능성을 갖는다는 것을 증명한다.

실시예 3 - 2세대 합성 프로모터의 제작 및 분석

상기 1세대 합성 프로모터의 분석을 기초로 하여, 본 발명자들은 1세대 프로모터의 조성 분석으로부터 유도된 최적의 비율로 TFRE 혼합물의 무작위 결찰을 이용하여 2세대 합성 프로모터를 생성함으로써 합성 프로모터 활성을 더 향상시키고자 하였다.

확인된 초기 7개의 TFRE 중 4개([도 1] 참조)를 이용하여 1세대 합성 프로모터 구성체에서 활성인 합성 프로모터에서 상대적으로 나타낸 정량적으로 유도된 화학양론으로 프로모터 구성체의 2세대 라이브러리를 제작하였다. 사용된 화학량론적 비율은 5:3:1:1(NFkB-RE: E-박스: C/EBPa-RE: GC 박스)였다.

구체적으로, 초기 7개의 TFRE 중에 음성 TFRE인 E4F1 및 CRE([도 3] 참조)를 제외시키는 한편(즉, 다수의 상기 TFRE를 포함한 프로모터는 더 낮은 리포터 유전자 발현 수준과 연관됨), 중성 TFRE인 C/EBPα 및 GC-박스는 복합성의 증가가 유리할 수 있다는 이론을 근거로 하여 포함 시켰다. 예를 들어, 1세대 라이브러리에서 가장 큰 활성의 3개의 합성 프로모터는 모두 적어도 2개 카피의 중성의 TFRE 2 개 모두를 포함하였고(표 3 참조) 따라서 미지의 위치 효과에 기여할 수 있었다. 본 발명자들은 2세대 프로모터가 1세대 프로모터와 동일한 평균 개수의 TFRE(12)를 포함할 것이라고 예상하였다.

2세대 프로모터 구성체(서열에 대해 하기 표 4를 참조)을 상기 실시예 2에 기재한 동일한 구성 방법을 이용하여 생성하였다.

<표 4> - 2세대 프로모터 : N = NFκB-RE, E = E-박스, G = GC-박스, B = C/EBPα-RE.

반대 방향(즉, SEAP 리포터에 대해 3'에서 5')의 TFRE는 아포스트로피로 나타낸다. 기타 모든 TFRE는 5'에서 3' 방향에 있다.

50개의 형질전환된 이. 콜라이 콜로니를 무작위로 선택하여, 정제된 플라스미드 DNA 내 합성 프로모터를 서열분석하여 프로모터 서열을 포함하는 44개의 리포터 플라스미드를 SEAP 생산량을 측정하는데 이용하였다. 2세대 프로모터의 전사 상대 활성은 [도 4]에 나타낸다.

2세대 합성 프로모터는 1세대 프로모터에 비해 상당히 증가된 활성을 나타내었다. 특히, 평균 발현 수준(CMV에 비해)이 1세대 프로모터의 21.2%에서 2세대 프로모터의 116%로 이동하였다. 실제로, 결과는 다수의 2세대 프로모터가 최고의 1세대 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 25개의 2세대 합성 프로모터(라이브러리의 57%)는 2.2배 증가를 나타내는 가장 강한 프로모터(2/01)와 함께 CMV 대조군보다 더 높은 SEAP 생산량을 달성하였다.

[도 5]는 TFRE가 존재하는 2세대 합성 프로모터 구성체의 발현 수준에 대한 각 TFRE의 상대 존재비 분석 결과를 보여준다.

2세대 프로모터의 TFRE 블록 조성의 분석은 라이브러리에서 TFRE의 상대적인 화학양론이 대략 설계된 바(NFB 5:E-박스 2.81:GC-박스 1.32:C/EBPα 1.15)와 같다는 것을 밝혔다. [도 5]에 나타낸 바와 같이, 2세대 프로모터의 경우 GC-박스 및 C/EBPα의 영향은 대개 음성이지만, NFκB 및 E-박스는 여전히 양성 이펙터이다.

그러나 2세대 프로모터의 조성(표 4의 서열 참조)을 고려하면, 결과는 NFκB 또는 E-박스 TFRE 블록도 높은 전사 활성을 단독으로 지원할 수 없으며 둘 다의 조합이 필수적이라는 것을 시사한다.

가장 강력한 프로모터(2/01- 2/03)는 상대적으로 적은 수의 음성 GC-박스 및 C/EBPα 블록과 함께 대략 동일한 비율로 상대적으로 많은 수의 TFRE 모두를 포함한다. 일부 더 낮은 활성의 프로모터는 상대적으로 많은 수의 NFκB 또는 E-박스 블록을 포함하지만(예를 들어, 2/11, 2/13, 2/17), (i) 차선의 비율의 NFκB:E-박스을 포함하거나(2/11, 2/17), (ii) 상대적으로 많은 수의 GC-박스 및 C/EBPα 블록도 포함한다(2/13).

그러므로 본 실시예는 2세대 프로모터가 1세대 프로모터를 이용하여 CHO 세포 내에서 달성될 수 있는 가능한 전사 활성 범위를 성공적으로 확장할 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 4 - 상이한 CHO 숙주 세포 유형에서 1세대 및 2세대 프로모터 구성체의 분석

본 발명의 합성 프로모터가 강력하고 예측 가능하게 작동하는 지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 상이한 CHO 숙주 세포주에서 상대적인 기능성을 평가하였다.

1세대 및 2세대 라이브러리 모두로부터 광범위한 프로모터 활성(즉, 1/51 < 1/17 < 1/04 < 1/02 < 2/19 < 2/03 < 2/01)을 포함하는 7개의 프로모터를 선택하였다. 이들을 CMV 활성과 비교하였다.

[도 6]은 통상적으로 이용되는 3개의 숙주 세포주 CHO-S, CHO-DG44 및 CHO-K1에서 모든 프로모터로부터 일시적인 SEAP 생산량을 나타낸다. 프로모터 활성의 상대적인 순위는 초기 스크리닝(실시예 3 참조)에 비해 2/03이 CHO-K1에서 2/01을 능가하고 프로모터 2/03 및 2/01는 CHO-DG44와 CHO-S에서 대략 등가의 발현을 보인다는 것을 제외하고 세 개의 세포주 모두에서 유지된다.

각 세포주에서, 최고 성능의 합성 프로모터는 CMV에 비해 CHO-DG44, CHO-S, 및 CHO-K1 세포에서 각각 3.1배, 1.9배, 및 1.7배로 상당히 더 높은 SEAP 생산량을 유도한다. 일반적으로, CHO-DG44 세포는 CHO-S 또는 CHO-K1 세포보다 상당히 더 적은 리포터 생산량을 보였는데, 아마도 그들의 리포펙틴에 의한 "형질감염성"의 감소때문이다.

그렇지만, 본 실시예는 프로모터 구성체의 순위가 상이한 CHO 세포에서 대개는 유지된다는 것을 나타내며, 프로모터 구성체가 또한 시험된 3가지 유형 이외의 다른 CHO 세포에서도 효과적일 것이라는 것을 시사하며, 또한 합성 프로모터가 다양한 형질전환된 포유동물 세포 유형에서 기능을 할 것이고 암 표적화 유전자 치료 적용에 있어 용도를 가질 것을 시사한다.

실시예 5 더 긴 기간의 일시적인 형질감염에서 1세대 및 2세대 프로모터 구성체의 분석

다음, 산업적으로 적절한 생산 공정에서 합성 프로모터의 기능성을 결정하기 위하여, 동일한 패널의 프로모터를 CHO-S 숙주 세포를 이용하여 유가배양 SEAP 생산 공정에서 더 긴 기간의 일시적인 형질감염(7일)에 대해 평가하였다.

일시적인 시스템을 이용하여(오히려 안정한) 생산 가변성이 세포주 특이적이고 부위 특이적인 통합 또는 프로모터 침묵(예를 들어 메틸화, 결실) 인공물보다는 프로모터 활성에 있어 차이와 직접적으로 연관된다는 것을 확실하게 하였다.

형질감염 2시간 전에 중간 지수기 CHO-S 배양으로부터 6 x 10⁶ 세포를 50 mL 컬티 플라스크(CultiFlask) 생물반응기(Sartorius, Surrey, UK)에 작업부피 6 mL로 접종하였다. 세포를 제조사의 지시에 따라 제조된 DNA:리포펙타민 복합체로 형질감염시켰다. 유가배양을 10% v/v CHO CD 에피이션트 피드(Effiicient Feed) A(Life Technologies)로 2, 4 및 6일에 영양 보충하여 7일 동안 유지시켰다. SEAP 발현 및 세포 성장을 24시간 간격으로 측정하였다.

SEAP 발현 분석 결과는 [도 7]에 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 활성의 상대적인 순서는 단기간 일시적인 발현 결과와 비교하여 대부분 유지되며(즉, 실시예 4에서 고정된 마이크로플레이트 실험, [도 6] 참조), 이것은 강력하고 재현 가능한 발현 수준이 본 발명의 합성 프로모터 구성체를 이용하여 장기간 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.

게다가, 프로모터 2/03에 의해 유도된 SEAP의 최고 역가는 CMV 매개된 발현에 의해 얻어진 것보다 1.65배가 넘었다.

IVCD 결과는 또한 CHO 세포가 본 발명의 프로모터 구성체로 형질감염될 때 세포 생존도가 크게 영향받지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 프로모터 구성체가 정상 세포 기능에 불리하게 영향을 주지 않으면서 숙주 세포에서 사용될 가능성을 가진다는 것을 보여주기 때문에 중요하다.

SEQUENCE LISTING <110> UCB BioPharma SPRL <120> Synthetic Promoters <130> G190_WO <150> GB1321109.9 <151> 2013-11-29 <150> GB1411717.0 <151> 2014-07-01 <160> 172 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC(A/T)6GG element (CArG) <400> 2 ccaaatttgg 10 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4F1 <400> 8 gtgacgtaac 10 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Estrogen-related receptor alpha RE (ERRE) <400> 10 aggtcatttt gacct 15 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucocorticoid RE (GRE) <400> 14 agaacatttt gttct 15 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helios RE (HRE) <400> 16 aatagggact t 11 <210> 17 <211> 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aattgcgcaa aatcgaaaca cgtgaatcga aattgcgcaa aatcgatccc cgccccatcg 60 atgggacttt ccatcgattt tgcgcaattt cgattttgcg caatttcgaa acacgtgaat 120 cgaaatgacg tcaaatcgat gggactttcc atcgatggga ctttcca 167 <210> 37 <211> 161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1/08 <400> 37 aacacgtgaa tcgattcacg tgtttcgatg gaaagtccca tcgatttgac gtcatttcga 60 aattgcgcaa aatcgattca cgtgtttcga aacacgtgaa tcgatggggc ggggatcgat 120 tttgcgcaat ttcgaaacac gtgaatcgat gggactttcc a 161 <210> 38 <211> 164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1/09 <400> 38 ttttgcgcaa tttcgatccc cgccccatcg atgggacttt ccatcgaaat tgcgcaaaat 60 cgaaatgacg tcaaatcgat ggaaagtccc atcgaaacac gtgaatcgat tcacgtgttt 120 cgaaatgacg tcaaatcgat ggggcgggga tcgattcacg tgtt 164 <210> 39 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1/10 <400> 39 aattgcgcaa aatcgaaaca cgtgaatcga tggaaagtcc catcgaaaca cgtgaatcga 60 ttcacgtgtt tcgattttgc gcaatttcga aatgacgtca aatcgatggg gcggggatcg 120 atggggcggg gatcgatggg actttcca 148 <210> 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127 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/02 <400> 127 aacacgtgaa tcgatggaaa gtcccatcga tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc 60 gaaacacgtg aatcgaaaca cgtgaatcga ttcacgtgtt tcgatggaaa gtcccatcga 120 ttcacgtgtt tcgaaattgc gcaaaatcga tggaaagtcc catcgattca cgtgtttcga 180 tgggactttc catcgatggg actttccatc gattcacgtg tttcga 226 <210> 128 <211> 209 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/03 <400> 128 aacacgtgaa tcgaaacacg tgaatcgatg gaaagtccca tcgatccccg ccccatcgaa 60 acacgtgaat cgatggaaag tcccatcgat tcacgtgttt cgatggaaag tcccatcgat 120 ggaaagtccc atcgattcac gtgtttcgat ggaaagtccc atcgatggaa agtcccatcg 180 atgggacttt ccatcgattt tgcgcaatt 209 <210> 129 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/04 <400> 129 tgggactttc catcgaaaca cgtgaatcga tgggactttc catcgaaaca cgtgaatcga 60 tgggactttc catcgatgga aagtcccatc gatggaaagt cccatcgaaa cacgtgaatc 120 gatgggactt tcca 134 <210> 130 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/05 <400> 130 tggaaagtcc catcgatggg actttccatc gatggggcgg ggatcgatgg gactttccat 60 cgaaattgcg caaaatcgat tcacgtgttt cgattcacgt gtttcgatgg gactttccat 120 cgattttgcg caatttcgat gggactttcc atcgattcac gtgtttcgat gggactttcc 180 atcgatggaa agtccca 197 <210> 131 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/06 <400> 131 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gatgggactt tccatcgatg ggactttcca 60 tcgattcacg tgtttcgatg ggactttcca tcgatccccg ccccatcgat tcacgtgttt 120 cgatggaaag tcccatcgaa acacgtgaat cgaaattgcg caaaa 165 <210> 132 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/07 <400> 132 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gattcacgtg tttcgatggg actttccatc 60 gatccccgcc ccatcgatgg aaagtcccat cgatggaaag tcccatcgat ggaaagtccc 120 atcgattttg cgcaatttcg atgggacttt cca 153 <210> 133 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/08 <400> 133 ttcacgtgtt tcgattcacg tgtttcgatg gaaagtccca tcgaaattgc gcaaaatcga 60 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gatccccgcc ccatcgatgg gactttccat 120 cgatgggact ttccatcgat ggaaagtccc atcgaaacac gtgaa 165 <210> 134 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/09 <400> 134 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gaaacacgtg aatcgatggg actttccatc 60 gattttgcgc aatttcgatg ggactttcca tcgatggaaa gtcccatcga ttcacgtgtt 120 tcgatgggac tttccatcga tggggcgggg atcgattcac gtgtttcgaa acacgtgaa 179 <210> 135 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/10 <400> 135 ttcacgtgtt tcgatgggac tttccatcga aattgcgcaa aatcgatgga aagtcccatc 60 gatgggactt tccatcgatt cacgtgtttc gatgggactt tccatcgatt ttgcgcaatt 120 tcgatgggac tttccatcga tgggactttc catcgatgga aagtcccatc gatccccgcc 180 ccatcgatgg gactttccat cgatgggact ttccatcgat ggaaagtccc a 231 <210> 136 <211> 304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/11 <400> 136 aacacgtgaa tcgatggaaa gtcccatcga aacacgtgaa tcgatgggac tttccatcga 60 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gatggaaagt cccatcgatg ggactttcca 120 tcgattcacg tgtttcgatg gaaagtccca tcgatggaaa gtcccatcga tggaaagtcc 180 catcgatgga aagtcccatc gattttgcgc aatttcgatg gaaagtccca tcgattcacg 240 tgtttcgatg ggactttcca tcgattcacg tgtttcgatg ggactttcca tcgattcacg 300 tgtt 304 <210> 137 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/12 <400> 137 tggaaagtcc catcgattca cgtgtttcga tgggactttc catcgatggg actttccatc 60 gaaattgcgc aaaatcgatg gaaagtccca tcgatgggac tttccatcga tgggactttc 120 catcgattca cgtgtttcga ttttgcgcaa tttcgaaaca cgtgaa 166 <210> 138 <211> 286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/13 <400> 138 aacacgtgaa tcgattttgc gcaatttcga aattgcgcaa aatcgaaaca cgtgaatcga 60 aattgcgcaa aatcgatggg actttccatc gatgggactt tccatcgatt cacgtgtttc 120 gatgggactt tccatcgatg gaaagtccca tcgaaacacg tgaatcgaaa cacgtgaatc 180 gatccccgcc ccatcgatgg gactttccat cgatggggcg gggatcgatg ggactttcca 240 tcgaaacacg tgaatcgatt ttgcgcaatt tcgatgggac tttcca 286 <210> 139 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/14 <400> 139 aacacgtgaa tcgatggaaa gtcccatcga tggaaagtcc catcgatggg actttccatc 60 gatggggcgg ggatcgatgg gactttccat cgatggaaag tcccatcgat ccccgcccca 120 tcgattttgc gcaatttcga tggaaagtcc catcgatggg gcggggatcg atgggacttt 180 cca 183 <210> 140 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/15 <400> 140 tgggactttc catcgatccc cgccccatcg attcacgtgt ttcgatggaa agtcccatcg 60 atggaaagtc ccatcgatgg gactttccat cgatggaaag tcccatcgat tcacgtgttt 120 cgatgggact ttcca 135 <210> 141 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/16 <400> 141 tgggactttc catcgatccc cgccccatcg aaacacgtga atcgatggga ctttccatcg 60 atggaaagtc ccatcgaaat tgcgcaaaat cgatgggact ttccatcgat gggactttcc 120 atcgatcccc gccccatcga tggggcgggg a 151 <210> 142 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/17 <400> 142 ttcacgtgtt tcgatgggac tttccatcga tccccgcccc atcgatcccc gccccatcga 60 ttcacgtgtt tcgaaacacg tgaatcgatg ggactttcca tcgatgggac tttccatcga 120 tgggactttc catcgattca cgtgtttcga tgggactttc catcgatgga aagtcccatc 180 gatccccgcc ccatcgatgg aaagtcccat cgaaattgcg caaaatcgat gggactttcc 240 atcgaaacac gtgaatcgat tcacgtgttt cgatgggact ttccatcgat gggactttcc 300 atcgatggga ctttcca 317 <210> 143 <211> 182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/18 <400> 143 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gatgggactt tccatcgatg gaaagtccca 60 tcgatccccg ccccatcgat ggaaagtccc atcgatggga ctttccatcg atccccgccc 120 catcgattca cgtgtttcga tgggactttc catcgatttt gcgcaatttc gaaacacgtg 180 aa 182 <210> 144 <211> 211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/19 <400> 144 ttcacgtgtt tcgatggaaa gtcccatcga tgggactttc catcgaaatt gcgcaaaatc 60 gatgggactt tccatcgatg ggactttcca tcgattcacg tgtttcgatg gggcggggat 120 cgatgggact ttccatcgat gggactttcc atcgaaacac gtgaatcgaa attgcgcaaa 180 atcgatggga ctttccatcg aaacacgtga a 211 <210> 145 <211> 188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/20 <400> 145 aacacgtgaa tcgaaacacg tgaatcgatg gaaagtccca tcgattcacg tgtttcgatt 60 cacgtgtttc gaaacacgtg aatcgatgga aagtcccatc gatccccgcc ccatcgattc 120 acgtgtttcg atgggacttt ccatcgattc acgtgtttcg atgggacttt ccatcgatcc 180 ccgcccca 188 <210> 146 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/21 <400> 146 tgggactttc catcgatggg actttccatc gattcacgtg tttcgaaaca cgtgaatcga 60 tggaaagtcc catcgatggg actttccatc gatggggcgg ggatcgattc acgtgtttcg 120 atggaaagtc ccatcgattc acgtgtttcg a 151 <210> 147 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/22 <400> 147 tgggactttc catcgattca cgtgtttcga tccccgcccc atcgaaacac gtgaatcgat 60 ggaaagtccc atcgattttg cgcaatttcg attcacgtgt ttcgatggaa agtcccatcg 120 aaacacgtga atcgatggga ctttcca 147 <210> 148 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/23 <400> 148 tggaaagtcc catcgattca cgtgtttcga tggaaagtcc catcgatggg actttccatc 60 gatggggcgg ggatcgatgg aaagtcccat cgatgggact ttccatcgat gggactttcc 120 atcgatgggg cggggatcga ttcacgtgtt 150 <210> 149 <211> 196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/24 <400> 149 aattgcgcaa aatcgaaaca cgtgaatcga tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc 60 gaaacacgtg aatcgatgga aagtcccatc gatccccgcc ccatcgatgg gactttccat 120 cgattcacgt gtttcgatgg ggcggggatc gatgggactt tccatcgaaa ttgcgcaaaa 180 tcgatgggac tttcca 196 <210> 150 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/25 <400> 150 tgggactttc catcgatccc cgccccatcg atgggacttt ccatcgatgg gactttccat 60 cgatgggact ttccatcgat ggaaagtccc atcgatggaa agtcccatcg attttgcgca 120 atttcgatgg aaagtcccat cgatgggact ttcca 155 <210> 151 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/26 <400> 151 ttttgcgcaa tttcgattca cgtgtttcga tccccgcccc atcgatggga ctttccatcg 60 atccccgccc catcgatgga aagtcccatc gaaacacgtg aatcgatggg gcggggatcg 120 attcacgtgt ttcgatggaa agtcccatcg atccccgccc ca 162 <210> 152 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/27 <400> 152 tggaaagtcc catcgatggg actttccatc gattcacgtg tttcgatgga aagtcccatc 60 gatggaaagt cccatcgaaa cacgtgaatc gaaacacgtg aatcgaaatt gcgcaaaatc 120 gaaacacgtg aatcgatccc cgccccatcg attcacgtgt ttcga 165 <210> 153 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/28 <400> 153 aacacgtgaa tcgatggaaa gtcccatcga tggaaagtcc catcgatggg actttccatc 60 gatggaaagt cccatcgatg ggactttcca tcgatggaaa gtcccatcga ttttgcgcaa 120 tt 122 <210> 154 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/29 <400> 154 aattgcgcaa aatcgatgga aagtcccatc gatccccgcc ccatcgatcc ccgccccatc 60 gattcacgtg tttcgatgga aagtcccatc gattcacgtg tttcgatggg actttccatc 120 gaaacacgtg aatcgatgga aagtcccatc gattttgcgc aatttcgatg ggactttcca 180 tcga 184 <210> 155 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/30 <400> 155 aacacgtgaa tcgatgggac tttccatcga tggaaagtcc catcgatggg actttccatc 60 gaaacacgtg aatcgatggg actttccatc gattttgcgc aatttcgatg gaaagtccca 120 tcgatggaaa gtccca 136 <210> 156 <211> 163 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/31 <400> 156 ttcacgtgtt tcgatccccg ccccatcgat ccccgcccca tcgatggaaa gtcccatcga 60 tccccgcccc atcgaaacac gtgaatcgat tttgcgcaat ttcgatggaa agtcccatcg 120 aaacacgtga atcgatggaa agtcccatcg atgggacttt cca 163 <210> 157 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/32 <400> 157 tgggactttc catcgatggg actttccatc gatccccgcc ccatcgaaac acgtgaatcg 60 attcacgtgt ttcgatggga ctttccatcg atggaaagtc ccatcgatcc ccgccccatc 120 gaaacacgtg aatcgaaaca cgtgaa 146 <210> 158 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/33 <400> 158 tggaaagtcc catcgaaaca cgtgaatcga tggggcgggg atcgatggga ctttccatcg 60 atggaaagtc ccatcgaaac acgtgaatcg attcacgtgt ttcgaaattg cgcaaaatcg 120 atggaaagtc ccatcga 137 <210> 159 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/34 <400> 159 ttttgcgcaa tttcgaaaca cgtgaatcga tccccgcccc atcgatggaa agtcccatcg 60 atgggacttt ccatcgatgg gactttccat cgatggggcg gggatcgaaa cacgtgaa 118 <210> 160 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/35 <400> 160 tggaaagtcc catcgatgga aagtcccatc gatggggcgg ggatcgattt tgcgcaattt 60 cgatccccgc cccatcgaaa ttgcgcaaaa tcgatgggac tttccatcga tggaaagtcc 120 catcgatggg actttccatc gatggaaagt cccatcgaaa ttgcgcaaaa 170 <210> 161 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/36 <400> 161 tggaaagtcc catcgaaaca cgtgaatcga tggaaagtcc catcgatggg gcggggatcg 60 atgggacttt ccatcgatgg gactttccat cgaaattgcg caaaatcgaa acacgtgaat 120 cgatggggcg ggga 134 <210> 162 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/37 <400> 162 tccccgcccc atcgatggga ctttccatcg atgggacttt ccatcgatgg aaagtcccat 60 cgatgggact ttccatcgaa acacgtgaat cgaaacacgt gaatcgatcc ccgccccatc 120 gatccccgcc cca 133 <210> 163 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/38 <400> 163 tggggcgggg atcgaaacac gtgaatcgat tttgcgcaat ttcgatggga ctttccatcg 60 atgggacttt ccatcgattc acgtgtttcg attcacgtgt ttcgatggaa agtccca 117 <210> 164 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/39 <400> 164 tgggactttc catcgatggg actttccatc gatggggcgg ggatcgattc acgtgtttcg 60 attttgcgca atttcgattc acgtgtttcg atgggacttt cca 103 <210> 165 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/40 <400> 165 tccccgcccc atcgatggaa agtcccatcg atgggacttt ccatcgattc acgtgtttcg 60 atggggcggg gatcgatgga aagtcccatc gatggaaagt cccatcgatt ttgcgcaatt 120 tcgatggggc gggga 135 <210> 166 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/41 <400> 166 aacacgtgaa tcgaaattgc gcaaaatcga ttcacgtgtt tcgaaacacg tgaatcgaaa 60 ttgcgcaaaa tcgatggaaa gtcccatcga tggaaagtcc catcgattca cgtgtttcga 120 aattgcgcaa aa 132 <210> 167 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/42 <400> 167 tggaaagtcc catcgatggg gcggggatcg atggaaagtc ccatcgatgg gactttccat 60 cgaaacacgt gaatcgatgg ggcggggatc gaaattgcgc aaaatcgaaa ttgcgcaaaa 120 <210> 168 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/43 <400> 168 tggggcgggg atcgattcac gtgtttcgaa attgcgcaaa atcgatggga ctttccatcg 60 atccccgccc catcgatggg actttccatc gatggggcgg ggatcgaaat tgcgcaaaat 120 cgatgggact ttcca 135 <210> 169 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2/44 <400> 169 ttttgcgcaa tttcgaaaca cgtgaatcga ttcacgtgtt tcgaaacacg tgaatcgatt 60 ttgcgcaatt tcgattcacg tgtttcgaaa ttgcgcaaaa tcgattttgc gcaatttcga 120 ttcacgtgtt tcgatgggac tttcca 146 <210> 170 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CMV core promoter <400> 170 aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctagata cgccatccac 60 gctgttttga cctccataga agac 84 <210> 171 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NFkB-RE <400> 171 tcgatgggac tttcca 16 <210> 172 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NFkB-RE <400> 172 tcgatggaaa gtccca 16

Claims

CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 유도하는 데에 적합한 합성 프로모터를 포함하는 CHO 세포로서, 상기 합성 프로모터는 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는 것인 CHO 세포.
제1항에 있어서, 프로모터 코어는 CMV, SV40, UbC, EF1A, PGK 및 CAGG, 예컨대 CMV 코어, 특히 hCMV-IE1 코어(서열 번호 170)로부터 선택되는 것인 CHO 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 합성 프로모터는 2 내지 50의 전사 인자 조절 요소, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 예를 들어 5, 6, 7 또는 8의 상기 조절 요소를 포함하는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소들은 모두 동일한 유형인 CHO 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소들은 상이한 유형들의 조합인 CHO 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소들은 일렬로 배열된 것인 CHO 세포.
제5항에 있어서, 조합 내의 각 전사 인자 조절 요소는 NFκB-RE, E-박스, GC-박스, C/EBPα-RE, CRE 및 E4F1, 특히 NFĸB-RE, E-박스, GC-박스 및 C/EBPα-RE로부터, 구체적으로 NFκB-RE 및 E-박스, 특히 조합 내 적어도 하나의 조절 인자의 2 이상의 카피로부터 독립적으로 선택되는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터 DNA 서열이 전장의 CMV 프로모터 서열 크기의 0.9 이하, 예를 들어 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5 또는 그 미만인 CHO 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터는 CMV 프로모터의 단위 DNA당 전사 활성보다 큰 합성 프로모터의 단위 DNA 서열당 전사 활성, 예를 들어 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4 또는 2.5 배 증가된 활성을 갖는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포는 CHO-S, CHO-K1 및 CHO-DG44로부터 선택되는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 조절 요소 YY1의 활성은, 예를 들어 YY1에 특이적인 블록 디코이(block decoy)에 의해, 억제되거나, 또는 세포는 변이되어 전사 인자 YY1을 결실시키고/시키거나 침묵(silent)시킴으로써 YY1의 활성을 억제하는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 합성 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 CHO 세포.
제12항에 있어서, 재조합 단백질은 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 CHO 세포.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 프로모터 코어 또는 야생형 프로모터에 비해 향상된 단백질 발현을 나타내는 것인 CHO 세포.
제14항에 있어서, 향상된 단백질 발현은 더 높은 수준의 재조합 단백질 발현인 CHO 세포.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터는 서열 번호 30 내지 169 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.
제16항에 있어서, 합성 프로모터는 서열 번호 126 내지 169 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.
제16항에 있어서, 합성 프로모터는 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 126, 서열 번호 128 또는 서열 번호 144에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터는 CpG 아일랜드를 전혀 포함하지 않는 것인 CHO 세포.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 프로모터는 그와 연관된 특정 재조합 단백질의 발현에 적합한 특성을 갖는 것인 CHO 세포.
CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터로서, 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE, E-박스, AP1, CRE, GC-박스, E4F1, C/EBPα-RE, OCT 및 RARE로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 이상의 전사 인자 조절 요소들의 혼합, 특히 조합 내 적어도 하나의 조절 인자의 2 이상의 카피를 포함하는 합성 프로모터.
CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터로서, 프로모터 코어 및 그의 상류에 NFκB-RE 및 CRE를 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2 이상의 전사 인자 조절 요소들의 혼합을 포함하는 합성 프로모터.
주어진 포유동물 재조합 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 생성시키는 방법으로서,
a) 전사 인자 조절 요소의 모티프를 식별하는 단계,
b) 프로모터 코어와 조합된 단계 a)에서 식별된 각각의 전사 인자 조절 요소를, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포주에서의 활성에 대해 시험하는 단계,
c) 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포주에서 프로모터 코어 단독보다 큰 활성을 갖는 단계 b)로부터의 2 이상의 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계,
d) 단계 c)에서 선택된 전사 인자 조절 요소들로부터 독립적으로 선택된 2 이상의 전사 인자 조절 요소를 포함하는 1 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계,
e) 단계 d)에서 제조된 합성 프로모터 구성체 또는 구성체들을, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서의 활성에 대해 시험하는 단계, 및
f) 야생형 프로모터와 비교하여 동일하거나 향상된 단백질 발현을 나타내는 합성 프로모터 구성체 또는 구성체들을 식별하는 단계
를 포함하는 생성 방법.
제23항에 있어서, 하기 추가 단계들:
g) 단계 f)에서 식별된 구성체와 연관된 2 이상의 상기 전사 인자 조절 요소를 선택하는 단계, 및
h) 단계 g)에서 독립적으로 선택된 요소들을 포함하거나 이들로 이루어진 TFRE 구성체를 포함하는 1 이상의 합성 프로모터 구성체를 제조하는 단계
를 포함하는 생성 방법.
제24항에 있어서, 단계 h)에서 제조된 TFRE 구성체는 전사 인자 조절 요소들을, 단계 f)에서 식별된 구성체에서의 그들의 상대 존재비를 반영하는 화학양론으로 포함하는 것인 생성 방법.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 생성 방법의 단계 f)는 야생형 프로모터와 비교하여 감소된 단백질 발현을 나타내는 프로모터 구성체와 가장 빈번하게 연관되는 전사 인자 조절 요소 또는 요소들을 식별하여, 이들을 단계 g)에서 제외시키는 단계를 더 포함하는 것인 생성 방법.
주어진 포유동물 숙주 세포에서 원하는 수준으로 재조합 단백질 발현을 촉진하는 데에 적합한 합성 프로모터를 식별하는 방법으로서,
a) 제21항 또는 제22항에 정의된 2 이상의 합성 프로모터 구성체를 획득하는 단계,
b) 단계 a)에서 획득한 합성 프로모터 구성체를 시험하여, 선택된 포유동물 재조합 숙주 세포에서 각각의 구성체에 의해 유도된 재조합 단백질 발현 수준을 판정하는 단계,
c) 단계 b)에서 시험된 합성 프로모터 구성체가 원하는 수준으로 재조합 단백질 발현을 촉진하는 경우에 그 합성 프로모터 구성체를 선택하는 단계
를 포함하는 식별 방법.
제27항에 있어서, 단계 a)에서 획득한 2 이상의 합성 프로모터 각각은 서열 번호 30 내지 169, 또는 서열 번호 126 내지 169 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 것인 식별 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 단백질 발현의 원하는 수준은 야생형 프로모터를 이용하여 달성된 것보다 높은 것인 식별 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 단백질 발현의 원하는 수준은 야생형 프로모터를 이용하여 달성된 것보다 낮은 것인 식별 방법.
전사 인자 조절 요소 구성체 라이브러리를 구성하는 방법으로서, 전사 인자 조절 요소 NFκB-RE와 E-박스를 5:3의 비율로 무작위 결찰(ligation)시키는 단계를 포함하는 구성 방법.
전사 인자 조절 요소 구성체 라이브러리를 구성하는 방법으로서, 전사 인자 조절 요소 NFκB-RE, E-박스, GC-박스 및 C/EBPα-RE를 5:3:1:1의 비율로 무작위 결찰시키는 단계를 포함하는 구성 방법.
전사 인자 조절 요소 YY1 활성이 녹다운되거나 또는 녹아웃된 CHO 세포.
제33항에 있어서, YY1 활성은 YY1에 특이적인 블록 디코이에 의해 녹다운되거나 또는 녹아웃되는 것인 CHO 세포.
제33항 또는 제34항에 있어서, 세포는 합성 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 CHO 세포.