CN110343699A - 用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列、表达载体、表达系统及其应用 - Google Patents

用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列、表达载体、表达系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列、表达载体、表达系统及其应用，属于基因工程技术领域。本发明根据CMV启动子、增强子的序列特征，结合生物学信息及实验，发明了3种用于组合启动子的调控序列，分别为人CMV启动子核心序列(hCPE)、合成的调控元件(SEE)、人巨细胞病毒即早期增强子(hCMVE)，将这三种调控序列插入表达载体的启动子上游，可以驱动外源基因高效、持续、稳定表达。同等条件下，与不含上述调控序列的表达载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。

Description

用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列、表达载体、表 达系统及其应用
技术领域
本发明涉及用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列、表达载体、表达系统及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
基因工程是以分子遗传学为理论基础，将重组表达载体导入到受体细胞中，进行复制、转录和翻译表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。由于哺乳动物细胞表达系统由于能够进行重组蛋白正确的折叠和翻译后修饰，对于复杂的重组蛋白，尤其是结构复杂或糖基化的蛋白质，哺乳动物细胞表达系统是其蛋白表达的优选系统。但哺乳动物表达系统普遍存在表达水平较低，转基因沉默(Transgene silencing)和转基因表达水平低下已成为基因工程产业亟待解决的关键问题。研究证实转基因虽能够整合到宿主的基因组中，且保留完整的拷贝，但是转基因却不能稳定表达或表达水平低下，有时甚至完全被抑制。为提高转基因表达水平和稳定性，研究人员在克服转基因沉默等方面进行了许多有益的尝试，比如在构建表达载体时选用强启动子、使用增强子，或在转基因操作时进行去甲基化处理等。
其中利用组合启动子(Synthetic promoter)提高转基因表达是近年来发展起来的克服转基因沉默、提高转基因表达的一种有效方法。组合启动子是调控元件和启动子的结合序列。将组合启动子整合到表达载体中能够发挥表观调控因子作用，并降低转基因沉默。目前虽然有组合启动子的报道(Brown,A.J.,Sweeney,B.,Mainwaring,D.O.&James,D.C.Synthetic promoters for CHO cell engineering.Biotechnol.Bioeng.2014,111(8):1638–1647.Sladitschek,H.L.Neveu,P.A.Bidirectional Promoter Engineeringfor Single Cell MicroRNA Sensors in Embryonic Stem Cells.PLoS One.11,2016,e0155177)。但是这些组合启动子在提高转基因表达水平方面仍不尽理想，一是组合启动子序列较长，二是转基因表达水平还有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列，该序列可有效提高重组CHO细胞转基因表达水平。
本发明还提供了包含上述调控序列的表达载体及其制备方法。
本发明还提供了包含上述表达载体的表达系统及其制备方法。
本发明还提供了上述调控序列、表达载体、表达系统的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:3所示。
本发明中的调控序列分别为人CMV启动子核心序列(hCPE)、合成的调控元件(SEE)、人巨细胞病毒即早期增强子(hCMVE)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明中的hCPE为CMV启动子的-34到+48位置为其核心序列，包括TATA元件及其起始元件(initiator element)，其序列如SEQ ID NO.1所示。目前，用于重组蛋白表达的哺乳动物宿主细胞主要是CHO细胞，而CMV启动子是CHO细胞中常用的启动子，因此本发明选择CMV启动子的-34到+48之间的核心序列作为调控序列。启动子作用的机制尚不清楚，生物信息学分析启动子包括转录调控序列(transcription factor regulatory elements,TFREs)，可能与其功能相关。
本发明利用网站：http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess、http://trap.molgen.mpg.de/cgi-bin/trap_form.cgi分析启动子CMV的TFREs序列，并设计如SEQID NO.2所示的序列，包括NGEE’NE’E’NNNE’ENE’序列(N＝NFκB(GGGACTTTCC)，E＝E-box(CACGTG)，G＝GC-box(GGGGCGGGG)，“’”代表对应的反向序列)。
本发明中的第三个序列hCMV-IE enhancer如SEQ ID NO.3所示。本发明中所选择的hCMVE为人巨细胞病毒即早期增强子，增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列，增强子是通过启动子来增加转录的，有效的增强子可以位于基因的5′端，也可位于基因的3′端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，增强子的作用没有“位置效应”和方向性。
本发明根据CMV启动子、增强子的序列特征，结合生物学信息及实验，发明了3种用于组合启动子的调控序列，可有效提高重组CHO细胞转基因表达水平。
表达载体，包含上述调控序列，所述调控序列位于表达载体的启动子下游和/或启动子上游。
所述启动子为CMV、SV40或人源EF1-α启动子。
上述表达载体可采用常规方法构建。也可以由如下方法构建得到：人工合成所述调控序列，将调控序列插入出发载体的启动子下游和/或启动子上游，即得。该处的启动子为出发载体的表达区域启动子。
所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1、pCHO1.0载体中的任意一种。优选的，所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3。
表达系统，包含上述表达载体。该表达系统可采用常规方法构建。也可以由如下方法构建得到：将所述表达载体转入宿主细胞中，筛选阳性细胞即得。
所述宿主细胞为CHO、HEK293、BHK21或COS-7。
上述的调控序列、表达载体或者表达系统在制备目的蛋白或者包含目的蛋白的制剂中的应用。
所述目的蛋白为EPO蛋白。
本发明的有益效果：
本发明中的调控序列hCPE、SEE、hCMVE能够提高哺乳动物细中外源基因的表达水水平，用其构建得到的哺乳动物细胞表达载体中包含hCPE、SEE和/或hCMVE序列，通过将外源目的基因插入载体的多克隆位点，构建的表达载体能够克服转基因沉默，介导外源基因在宿主细胞中稳定、高效、持久表达。同等条件下，与不含上述调控序列的表达载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。
附图说明
图1为pIRES-Neo2质粒图谱；
图2为对比例1中表达载体pIRES-EGFP的质粒图谱；
图3为对比例1中表达载体pIRES-HEF1-α-EGFP的质粒图谱；
图4为实施例2表达载体pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP的质粒图谱；
图5为对比例2中表达载体pIRES-HEF1-α-EPO的质粒图谱；
图6为实施例3中表达载体pIRES-hCPE-HEF1-α-EPO的质粒图谱；
图7为流式细胞术检测不同表达载体中EGFP的瞬时表达量对比图；
图8为流式细胞术检测不同表达载体中EGFP的稳定长期表达量对比图；
图9为ELISA检测EPO的表达水平对比图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。未特别指明的，实施例、对比例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:alaboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。
实施例及试验例中所用细胞系、质粒载体、试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-neo2质粒购自美国Clontech公司，中国仓鼠卵巢细胞购自中国科学院上海细胞库。
实施例1调控元件的设计
CMV启动子的-34到+48位置为其核心序列，包括TATA元件及其起始元件(initiator element)，其序列如SEQ ID NO.1所示。
利用网站：http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess、http://trap.molgen.mpg.de/cgi–bin/trap_form.cgi分析启动子CMV的TFREs序列，设计序列如SEQ ID NO.2所示，包括NGEE’NE’E’NNNE’ENE’序列(N＝NFκB(GGGACTTTCC)，E＝E-box(CACGTG)，G＝GC-box(GGGGCGGGG)，“’”代表对应的反向序列)。
hCMV-IE enhancer如SEQ ID NO.3所示。
对比例1pIRES-HEF1-α-EGFP的构建
1、扩增EGFP基因片段
参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：
P1：5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；
P2：5′-CTAGGATCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。
以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P1、P2扩增EGFP基因。
表1 PCR扩增体系
反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度2个循环(分别为56、57、58、59、60℃五个温度)，最后55℃30s，30个循环，72℃3min。
琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。
2、构建含EGFP序列的表达载体pIRES-EGFP
1)用EcoRI、BamHI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-Neo2质粒DNA(质粒图谱见图1)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES-Neo2线性质粒DNA。
2)EGFP序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。
pIRES-Neo2质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-Neo2 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。
3)取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-Neo2线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-Neo2线性质粒DNA10ng，酶切后的EGFP序列片段30ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli DH5α感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LA固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EGFP(质粒图谱见图2)。
3、表达载体pIRES-HEF1-α-EGFP的构建，步骤如下：
1)出发载体为pIRES-EGFP，用MluI和EcoRI双酶切CMV启动子，回收载体片段。
2)根据报道的HEF1-α(KY447299.1position 12-1346)序列，人工合成HEF1-α。为方便克隆，合成序列5′及3′分别加上MluI和EcoRI酶切位点。
3)合成的HEF1-α序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL MluI、EcoRI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。
pIRES-EGFP质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL MluI、EcoRI酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-EGFP 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。
取酶切后的pIRES-EGFP母载体片段和HEF1-α片段，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-EGFP载体线性质粒DNA10ng，酶切后的HEF1-α序列片段30ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-HEF1-α-EGFP(质粒图谱见图3)。
实施例2pIRES-调控序列-HEF1-α-EGFP的构建
表达载体pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP、pIRES-SEE-HEF1-α-EGFP、pIRES-hCMVE-HEF1-α-EGFP的构建，以pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP为例，步骤如下：
1)人工合成hCPE-HEF1-α片段，为方便克隆，合成序列5′及3′分别加上MluI和EcoRI酶切位点。
2)hCPE-HEF1-α序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL MluI、EcoRI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。
pIRES-HEF1-α-EGFP质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL MluI、EcoRI酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-HEF1-α-EGFP 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。
取酶切后的pIRES-HEF1-α-EGFP母载体片段和hCPE-HEF1-α片段，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-EGFP母载体线性质粒DNA10ng，酶切后的HEF1-α序列片段30ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli DH5α感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP(质粒图谱见图4)。
pIRES-SEE-HEF1-α-EGFP、pIRES-hCMVE-HEF1-α-EGFP的构建方法同pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP，仅在于人工合成的片段不一样。
对比例2pIRES-HEF1-α-EPO载体的构建
含EPO表达载体的构建
1)PCR扩增人EPO基因
根据人EPO序列(GenBank：KF178447.1，第10～591位碱基)设计引物P3和P4(用于扩增582bp的人EPO基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)：
P3：5′-CCG GAATTCATGGGGGTGCACGAA-3′；
P4：5′-CTA GGATCCAACTCTGTCCCCTGTCCTG-3′。
提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P3、P4扩增人EPO基因，反应体系和反应条件基本同实施例1，表1中P1、P2替换为P3、P4即可。
琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的人EPO序列完全一致。
2)构建不含hCPE的EPO对照表达载体pIRES-HEF1-α-EPO
用EcoRI、BamHI酶切人EPO序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-HEF1-α-EGFP质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的人EPO序列片段和pIRES-HEF1-α-EGFP母载体片段。
人EPO序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.78μg/μL EPO扩增产物1.39μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。
pIRES-HEF1-α-EGFP质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoR I、BamHI酶各0.5μL，0.854μg/μL质粒pIRES-HEF1-α-EGFP 1.17μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。
取酶切后的人EPO序列片段和pIRES-HEF1-α-EGFP母载体片段，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-HEF1-α线性质粒DNA10ng，酶切后的EPO序列片段30ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coliDH5α感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LA固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-HEF1-α-EPO(质粒图谱见图5)。
实施例3构建含调控序列和EPO序列的表达载体pIRES-调控序列-HEF1-α-EPO
1、用EcoRI、BamHI双酶切人EPO序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的人EPO序列片段和pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP线性质粒DNA。
人EPO序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRⅠ、BamHⅠ酶各0.5μL，0.78μg/μL EPO扩增产物1.39μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。
pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRⅠ、BamHⅠ酶各0.5μL，0.854μg/μL质粒pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP 1.17μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。
取酶切后的人EPO序列片段和pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-HEF1-α-hCPE线性质粒DNA 200ng，酶切后的EPO序列片段70.5ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli DH5α感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LA固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-hCPE-HEF1-α-EPO(质粒图谱见图6)。
2、pIRES-SEE-HEF1-α-EPO、pIRES-hCMVE-HEF1-α-EPO的构建方法同pIRES-hCPE-HEF1-α-EPO，仅在于是以pIRES-SEE-HEF1-α-EGFP、pIRES-hCMVE-HEF1-α-EGFP为出发载体构建的。
试验例1调控元件对外源EGFP基因稳定表达的影响
1、将对比例1合成的pIRES-HEF1-α-EGFP和实施例2中的pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP、pIRES-SEE-HEF1-α-EGFP、pIRES-hCMVE-HEF1-α-EGFP载体转染CHO细胞表达系统。
CHO细胞于37℃、5％CO2条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×106/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为4个试验组：1)对照组-转染不含hCPE的对照载体pIRES-HEF1-α-EGFP，2)hCPE组-转染含hCPE和EGFP序列的质粒pIRES-hCPE-HEF1-α-EGFP，3)SEE组-转染含SEE和EGFP序列的质粒pIRES-SEE-HEF1-α-EGFP，4)hCMVE组-转染含hCMVE和EGFP序列的质粒pIRES-hCMVE-HEF1-α-EGFP。
2、hCPE(SEE、hCMVE)序列对EGFP基因瞬时表达的影响
细胞转染48小时后，收集细胞进行流式细胞检测，分析hCPE(SEE,hCMVE)对重组基因瞬时表达的影响，试验结果见图7。
由图7可知，与不含hCPE(SEE、hCMVE)的对照载体pIRES-HEF1-α-EGFP相比，含hCPE(SEE、hCMVE)序列的表达载体均能显著提高EGFP基因的瞬时表达水平。SEE对提高转基因表达的影响更显著，增加倍数达1.75倍。hCMVE提高1.75倍，hCPE提高1.60倍。所有数据均为三次重复试验统计数据。
3、hCPE(SEE、hCMVE)对EGFP长期表达的影响
用含浓度为500μg/mL G418的培养基传代培养筛选获得的多克隆CHO细胞30天后，收集各试验组细胞进行流式细胞检测，分析hCPE(SEE、hCMVE)序列对重组目的基因长期表达的影响，试验结果见图8。
由图8可知，与不含对照载体pIRES-HEF1-α-EGFP相比，含hCPE、SEE、hCMVE的表达载体均能稳定提高EGFP基因的稳定表达水平。hCPE提高转基因表达的影响最显著，增加倍数达2.45倍，hCMVE提高1.97倍。所有数据均为三次重复试验统计数据。
试验例2调控元件对外源EPO基因表达的影响
1、不同表达载体转染CHO细胞
CHO细胞于37℃、5％CO2条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×106/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为4个实验组：1)对照组-转染不含hCPE的对照载体pIRES-HEF1-α-EPO，2)hCPE组-转染含hCPE和EPO序列的质粒pIRES-hCPE-HEF1-α-EPO，3)SEE组-转染含SEE和EPO序列的质粒pIRES-SEE-HEF1-α-EPO，4)hCMVE组-转染含hCMVE和EPO序列的质粒pIRES-hCMVE-HEF1-α-EPO。
2、hCPE、SEE、hCMVE序列对人EPO基因稳定表达的影响
用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时降低G418浓度，换用含500μg/mL G418的培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。将稳定转染EPO的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，初始细胞量为5～6×106个/mL，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组目的蛋白EPO的表达量，试验结果见图9。
由图9可知，转染pIRES-hCPE-HEF1-α-EPO的CHO细胞分泌的EPO是转染pIRES-HEF1-α-EPO的CHO细胞分泌量的1.67倍。说明hCPE可显著提高提高EPO基因的表达。
<110> 新乡医学院
<120> 用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列、表达载体、表达系统及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> hCPE
<400> 1
aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctagata cgccatccac 60
gctgttttga cctccataga agac 84
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SEE
<400> 2
gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60
tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca c 111
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> hCMVE
<400> 3
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattac 376
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物P1
<400> 4
ccggaattca tggtgagcaa gggcgaggag 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物P2
<400> 5
ctaggatccg gacttgtaca gctcgtccat gc 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物P3
<400> 6
ccggaattca tgggggtgca cgaa 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物P4
<400> 7
ctaggatcca actctgtccc ctgtcctg 28

Claims (8)

1.用于提高哺乳动物细胞转基因表达的调控序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，或者如SEQ ID NO.2所示，或者如SEQ ID NO.3所示。
2.包含如权利要求1所述调控序列的表达载体，其特征在于：所述调控序列位于表达载体的启动子下游和/或启动子上游。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述启动子为CMV、SV40或人源EF1-α启动子。
4.如权利要求2所述表达载体的制备方法，其特征在于：人工合成所述调控序列，将调控序列插入出发载体的启动子下游和/或启动子上游，即得。
5.包含如权利要求2所述表达载体的表达系统。
6.如权利要求5所述表达系统的制备方法，其特征在于：将所述表达载体转入宿主细胞中，筛选即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为CHO、HEK293、BHK21或COS-7。
8.如权利要求1所述的调控序列、权利要求2-3任一项所述的表达载体或者权利要求5所述的表达系统在制备目的蛋白或者包含目的蛋白的制剂中的应用。
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