JP5554907B2 - 促進された遺伝子発現能力を伴う新規発現ベクターおよびそれを使用するための方法 - Google Patents
促進された遺伝子発現能力を伴う新規発現ベクターおよびそれを使用するための方法 Download PDFInfo
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Description
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、ベクター、とりわけエピソームベクターを意味する。一般的に、ベクターは、標的細胞内に特定の遺伝子を導入して発現させるために用いられるプラスミドである。発現ベクターによって、安定したmRNAの大量生産が可能になる。一旦発現ベクターが細胞内に入ると、細胞性転写および翻訳機構によって、その遺伝子がコードするタンパク質が生産される。プラスミドは、mRNAの大量生産を誘導する非常に活性の強いプロモーターが含まれるように改変される。エピソームベクターは、宿主細胞内で自発的に自己複製する能力を有する。
図1Aに関連して、市販のpEGFP−N1プラスミド(Clontech,CA)、市販のpDR2プラスミド(Clontech,CA)に由来するEBVベースのp220.2プラスミド、および市販のpMAMneoプラスミド(Clontech,CA)を用いて、pGT01−GFPプラスミドを構築した。
HCT116(hMLH1-/-を伴うヒトの結腸ガン)細胞を、Dr.C.R.Boland(UCSD,CA)(Koi et al.,1994,Cancer Res.54,4308−4312、ATCC#CCL−247)から入手した。
薬剤による選択の24時間前に、約1×104のサブコンフルエントな細胞を、10%の市販のウシ胎仔血清(Gibco)を添加した完全RPMI−1640培地またはDMEM培地を満たした100×20mmの培養皿に播種した。培地の栄養が消費され、細胞の老廃物が蓄積したので、古くなった培地を期間内に新鮮な培地で新しいものにした。培地を新しいものにした後、支持された濃度でハイグロマイシンBをそれぞれのプレートに添加した。5%のCO2を供給したインキュベーター内で、培養皿を37℃でインキュベートした。処理から2〜4日後に、ハイグロマイシンBによって誘導される細胞毒性によって、新鮮な培地と一緒に細胞を再補充した。生き残ったコロニーの生育を10〜14日後に観察した。500細胞を100×20mmの培養皿に播種し、生育から10日後のコロニー数を数えることによって、セルラインの平板効率を測定した。
細胞をPBSで一回洗浄し、トリプシン処理を行って、PBSに再懸濁させた。FACS・Vantageセルソーター(Becton Dickinson,Mountain View,CA)を用いて、480nmの励起波長および525nmの蛍光波長で、EGFPの緑色蛍光を測定した。
ヒトの結腸ガン細胞であるDLD−1、HCT116、およびHCT116+hMLH1を、それぞれの発現ベクターでトランスフェクトし、50μg/mlのハイグロマイシンBを用いて、安定したクローンについて選択した。それぞれの安定したクローンの複数の安定したクローン細胞を培養した。それぞれのヒトの結腸ガン細胞の1×104の安定したクローン細胞を播種し、400μg/mlまたは1000μg/mlのハイグロマイシンBのいずれかを含む培地でさらに培養した。
プロテアーゼインヒビターのカクテルは、セリン、システイン、アスパラギン酸のプロテアーゼおよびアミノペプチダーゼなどのプロテアーゼの阻害について幅広い特異性を伴ったプロテアーゼインヒビターの混合物である。プロテアーゼインヒビターのカクテルは、4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)、ペプスタチンA、E−64、ベスタチン、ロイペプチンおよびアプロチニンを含んでもよい。プロテアーゼインヒビターのカクテルは、金属キレート剤を含んでいなくてもよい。プロテアーゼインヒビターのカクテルは市販品でもよい。
上記で示される実施例から、核のアンカーリングエレメントおよび(単数または複数の)IRエレメントの両者を含む発現ベクターが、MMR-細胞およびMMR+細胞の両者において、遺伝子のトランス遺伝子発現を促進することが明確に実証された。
Claims (21)
- 哺乳動物細胞における遺伝子発現を促進するための発現ベクターであって、
二つの逆位反復(IR)エレメントで分離された二本の長い配列を有する環状の核酸分子を含み、
前記二本の長い配列のそれぞれが互いに対して相補的であって、それぞれが、
少なくとも一つの遺伝子、および
核のアンカーリングエレメントを含み、
前記二つのIRエレメントのいずれも、互いに対して相補的な二本の外側核酸配列と、前記二本の外側核酸配列の間に挿入され、かつ前記二本の外側核酸配列のそれぞれとは異なる中央部配列と、を含み、
前記発現ベクターが哺乳動物細胞における前記遺伝子発現を促進するためにインバーテッドダイマー(ID)として組織され、
前記発現ベクターが哺乳動物細胞をトランスフェクトする能力を有し、かつ
前記発現ベクターが前記哺乳動物細胞内のエピソームベクターである、発現ベクター。 - 前記遺伝子が、シグナルペプチド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、レポータータンパク質、転写調節因子、リボザイム、融合タンパク質および薬物抵抗性タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記タンパク質が天然由来のものか、または人為的に修飾されたものである、請求項2に記載の発現ベクター。
- 前記レポータータンパク質が緑色蛍光タンパク質(EGFP)である、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記遺伝子が、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNAおよび二本鎖RNAからなる群より選択される一つのRNA内に転写される、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記ヒト細胞がミスマッチ修復欠損(MMR-)細胞である、請求項6に記載の発現ベクター。
- 前記MMR-細胞がHCT116(hMLH1-)細胞かまたはDLD−1(hMSH6-)細胞である、請求項7に記載の発現ベクター。
- 前記ヒト細胞がミスマッチ修復熟練(MMR+)細胞である、請求項6に記載の発現ベクター。
- 核のアンカーリングエレメントが、EBV核タンパク質EBNA−1およびEBVレプリコンoriPをコードするEBV(エプスタイン・バー・ウイルス)遺伝子を含む、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、前記哺乳動物細胞における前記遺伝子の発現を促進することができる、請求項1に記載の発現ベクター。
- 請求項1に記載の発現ベクターを含むヒト細胞。
- 前記ヒト細胞がミスマッチ修復欠損(MMR-細胞)である、請求項12に記載のヒト細胞。
- 前記ヒト細胞がミスマッチ修復熟練(MMR+細胞)である、請求項12に記載のヒト細胞。
- 哺乳動物細胞における遺伝子を発現させるための方法であって、
請求項1に記載の発現ベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクトしてトランスフェクト細胞を生産する工程、
前記トランスフェクト細胞を培養して、前記遺伝子がコードするタンパク質を前記トランスフェクト細胞に生産させる工程、および
前記哺乳動物細胞から前記タンパク質を回収する工程、を含む方法。 - 前記遺伝子が、シグナルペプチド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、レポータータンパク質、転写調節因子、リボザイム、融合タンパク質および薬物抵抗性タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項15に記載の方法。
- 前記遺伝子が、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNAおよび二本鎖RNAからなる群より選択される一つのRNA内に転写される、請求項15に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記ヒト細胞がミスマッチ修復欠損(MMR-)細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記MMR-細胞がHCT116(hMLH1-)細胞またはDLD−1(hMSH6-)細胞である、請求項19に記載の方法。
- 前記ヒト細胞がミスマッチ修復熟練(MMR+)細胞である、請求項18に記載の方法。
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