JPH029368A - 発現ベクター - Google Patents

発現ベクター

Info

Publication number
JPH029368A
JPH029368A JP62306017A JP30601787A JPH029368A JP H029368 A JPH029368 A JP H029368A JP 62306017 A JP62306017 A JP 62306017A JP 30601787 A JP30601787 A JP 30601787A JP H029368 A JPH029368 A JP H029368A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
gene
enhancer
promoter
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP62306017A
Other languages
English (en)
Inventor
Fredericus A M Asselbergs
フレデリックス　アー．エム．アセルベルグス
Danielle Alaimo
ダニエル　アレモ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy AG filed Critical Ciba Geigy AG
Publication of JPH029368A publication Critical patent/JPH029368A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は非常に確実性の高い発現ヘクターに関するも
のであり、この発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入
された後に、マーカーを発現する子孫細胞の大部分が目
的の遺伝子産物をも発現することを保証するために、エ
ンハンサ−を有しないマーカー遺伝子モジュールに連結
されたエンハンサ−含有遺伝子発現モジュールを用いる
。
Ｃ従来の技術〕 形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、新たな
遺伝子材料を原核細胞又は真核細胞に移行せしめるため
に一般に用いられる遺伝予湿作法である。一般に、形質
転換を受けそして外来ＤＮＡを安定的に取り込む集団中
の細胞数は非常に少い。外来ＤＮＡによるこの低い形質
転換頻変の問題には、宿主細胞を生産遺伝子（すなわち
、目的の生成物、例えば有用な酵素、ホルモン又はリン
ホカインをコードしており、実験の真の目的がその発現
であるような遺伝子）と共に選択マーカー（すなわち、
容易に同定することができる性質、例えば抗生物質に対
する耐性を発現するＤＮＡ）により宿主を形質転換する
ことにより対処することができる。劣性（ｒｅｃｅｓｓ
ｉνｅ）と称される幾つかのマーカー遺伝子のみが変異
体宿主細胞タイプにおいて使用され得る。形質転換の後
、細胞集団がマーカーの存在について試験される。これ
は、選択マーカーが生産遺伝子にリンクしているか否か
及びいかにリンクしているか、並びにマーカーを発現す
る細胞の内どれだけが生産遺伝子をも含存しそしてそれ
を発現するかに依存している。マーカー遺伝子が好結果
に導入された細胞はマーカー特性を発現する（例えば、
抗生物質の存在下で生存する）であろうし、マーカー遺
伝子の取り込みに失敗した細胞はマーカー特性を発現し
ない（例えば、それらは抗生物質を含有する培地中で死
滅する）であろう。
一般に、マーカー特性を発現する細胞集団の一部分のみ
が機能的な形態での生産遺伝子を含有するであろう。マ
ーカー特性を有する細胞が生産遺伝子をも発現する確率
を最大にするベクター造成物は当業界における改良を構
成する。
典型的な真核生物遺伝子は３つの領域、すなわち、蛋白
質コード部分自体、ｔｓＲＮＡプロセシングシグナルを
含有する領域、及び転写制御シグナルを含有する領域か
ら成る。これらの領域はある程度オーバーラツプしてい
てもよい。遺伝子発現のレベルは主として転写のレベル
により制御される。
転写制御シグナルは２つのカテゴリー、すなわち（１）
転写開始点に又はそれかられずかに上流に位置する上’
ｆｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列、及び（２）エンハンサ−に含ま
れる。多くの遺伝子において見出される典型的な上流要
素は、転写開始部位からそれぞれ３０ヌクレオチド及び
８０ヌクレオチド上流に位置する“ＴＡＴＡ”ボックス
及び“ＣＡＡＴ”ボックスである（Ｊ、Ｃｏｒｄｅｎ等
、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　、１４０６−４１４（１９
８０）　；　Ｒ，Ｂｒｅａｔｎａｃｈ及びＰ、Ｃｈａｍ
ｂｏｎ、　ＡｎｍｕａｌＲｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ　５０．３４９　３８３（１９８１
）　）。
上流配列の特徴的性質は、それらが機能的であるために
は転写開始部位から所定の距離に、所定の方向で存在し
なければならないことである。上流要素は一緒にしてし
ばしば、エンハンサ−要素に対してプロモーターと称さ
れる。これらのエンハンサ−はより長い可変的距離にわ
たって、いずれの方向においても機能することができる
。エンハンサ−はしばしば転写開始部位から上流に位置
するが、しかしまた下流に位置する場合でも機能するこ
とができ、そして多数の遺伝子を活性化することさえで
きる（Ｆ、Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ。
１８９．４０１−４１１（１９８６）　）。エンハンサ
−の使用機構は完全には理解されていない。エンハンサ
−機能に関する重要な現象は、しばしば原核生物に由来
するある種のＤＮＡ配列がエンハンサ−と上流ＤＮＡ配
列との間に挿入された場合増強（ｅｎｈａｎｃｅａ＋ｅ
ｎ　ｔ）をブロックすることである０例えば、プラスミ
ドｐＢＲ３２２のＤＮＡは複数のエンハンサ−終止配列
を含有する（Ｊ、ＤｅＶｉｌｌｉｅｒｓ及びＷ、５ｃｈ
ａｆｆｎｅｒ（１９８３）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎａｌ　ｅｎｈａｎｃｅｒｓ　ｆｒｏｒｓ　ｐａｐｏ−
ｖａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏ
ｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｖｅｃｔｏｒｓ。
Ｔｅｃｈｎｆｑｕｅｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　
５ｃｉｅｎｃｅｓ、　　Ｖｏ１５．　　Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｃｌ　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ、　（Ｒ，
Ａ、Ｆｌａｖｅｌ　ｌ１ｇ）　　、Ｅｌｓｅｒｖｉｅｒ
ｓＳｃｉ、Ｐｕｂｌ、Ｌｔｄ、　＋アイルランド、１−
２０頁；Ｅ、５ｃｈｒｅｉｂｅｒ等、Ｅｘｐｅｒｉｅｎ
ｔｉａ　４２，６５２−３（１９８６）　）。
〔発明の目的〕
この発明は哺乳動物細胞中で使用するための新規なバイ
ブリドベクターを提供することを目的としており、この
ベクターは異種蛋白質をコードするＤＮＡ及び選択遺伝
子の両者の発現を制御する転写シグナルの特定の配置を
含んで成り、このＤＮＡが環状ＤＮＡとして真核生物細
胞に適用された場合でさえ、トランスフェクトされた真
植生物細胞の多くが異種遺伝子を安定に発現することを
保証する。この発明の他の目的は、前記バイブリドベク
ターにより形質転換された真核性宿主細胞、及びこの形
質転換された真核性宿主細胞を用いて異種蛋白質を製造
する方法に関する。
以下余白 〔具体的な記載〕 真核細胞のために使用されるＤＮＡ発現ベクターは一般
に、既存のＤＮＡ又は合成ＤＮＡからインビトロで組み
立てられ、そして細菌中で、通常は宿主としてＥ、コリ
を用いてプラスミドとして増幅される。この段階で、制
限酵素消化及び／又はＤＮＡ配列決定によりＤＮＡが意
図された構造を有するか否から確認される０次に、この
ＤＮＡはその最終宿主細胞に導入され、この細胞の中で
ベクターが遺伝子造成物を発現せしめ、次に宿主細胞が
目的の蛋白質を生産する。
１、主里二久り二 この発明は組換ＤＮＡ分子、例えば環状バイブリドベク
ターのごときバイブリドベクターに関し、このＤＮＡ分
子は、一連の機能的要素：（ａ）エンハンサ−／プロモ
ーターユニット；（ｂ）前記ユニットが作用可能に連結
されているＤＮＡセグメントであって、所望の蛋白質生
成物のためのコード能力を有しそしてポリアゾニレ−シ
ランのため及び細胞質への効率的な輸送のためのシグナ
ルを含んで成るｍＲＮＡに転換され得るＤＮＡセグメン
ト；及び （ｃ）前記ＤＮＡセグメントにＭ＜　ＤＮＡセグメント
であって、プロモーターユニット（ｃＩ）、及び該プロ
モーターユニット（ｃ１）が作用可能に連結されている
ＤＮＡサブセグメント（ｃ２）であって選択マーカー遺
伝子のｍＲＮＡに転写され得るもの、から成るＤＮＡセ
グメント； をこの順序で含んで成り、前記プロモーターユニット（
ｃ１）は機能的エンハンサ−を欠いているが、しかし（
ａ）と（ｃ１）との間にエンハンサ−終止ＤＮＡ配列が
存在しないために（ａ）中に位置する前記エンハンサ−
により刺激されることができることをコードする、。
この発明は、転写エンハンサ−がその応答する上流要素
に物理的にリンクされた場合、転写エンハンサ−は１個
より多くのセットの上流要素を活性化することができる
という知見を利用する。遺伝的に言えば、増強（エンハ
ンシング；　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）は“ｃｉｓ”効果で
ある。典型的には、発現ベクターにおいて、強力なエン
ハンサ−／プロモーターの徂合せが生産遺伝子のコード
部分から上流に置かれ、これは転写物がｍＲＮＡプロセ
シング（例えばスプライシング）及びポリアデニレーシ
ョンのためのシグナルを備えるように構成される。
この発明のベクターにおいて蛋白質コード領域（′生産
遺伝子”）の転写を指令することができるエンハンサ−
／プロモーターユニットには、特に、アクチン遺伝子、
ネズミもしくはヒトのメタロチオネイン１及び■遺伝子
、他の細胞性遺伝子のプロモーター−エンハンサ−；マ
ウスもしくはヒトのサイトメガロウィルス主要即時−初
期（ｒａａｊｏｒ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）
遺伝子のエンハンサーープロモーター領域；バボバウイ
ルス、例えばシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）、ポ
リオーマウィルスもしくは種々のパピローマウィルスの
初′Ｍ（ｅａｒｌｙ）エンハンサーープロモーター；又
はヘルペスウィルスのエンハンサ−が含まれる。エンハ
ンサ−／プロモーターユニットはまた、１個より多くの
天然遺伝子に由来する複数の要素から造成することもで
きる。この発明のベクターのための適当な組合わせには
、特に、ヒトα−グロビン遺伝子からのプロモーター領
域とＳＶ４０エンハンサ−との組合せ、及びＳＶ４０か
らのプロモーター領域とメタロチオネイン又はサイトメ
ガロウィルス主要即時〜初期エンハンサ−との組合わせ
が含まれる。
目的の（外来又は異種）蛋白質をコードするＤＮＡセグ
メントは特に、広範囲の種類の蛋白質、例えば、グリコ
ジル化蛋白質、特に高等真核生物、特に哺乳動物、例え
ばヒト以外の動物、又は詩にヒト由来のグリコジル化蛋
白質、例えば、栄養の製造のため及び化学において酵素
反応を行うために使用することができる醇素頚あるいは
ヒト及び動物の疾患を治療するため、又はその診断又は
予防のために有用な、そして価値あるポリペプチド、例
えば血清蛋白質、ポリペプチドホルモン、ホルモン受容
体、リンホカイン、インターフェロン、酵素、酵素阻害
剤、鎮痛性ポリペプチド、糖蛋白質、免疫グロブリン、
免疫グロブリン−結合性蛋白質、抗原蛋白質、ワクチン
蛋白質、プラスミノーゲン活性化因子、あるいはこれら
の前駆体、例えば対応するブロー蛋白質及びプレープロ
ー蛋白質、のいずれかをコードするＤＮＡ　（遺伝子）
である。
この様な蛋白質の例として、インシュリン、成長因子、
例えば上皮成長因子、インシュリン様成長因子、コスト
細胞成長因子、神経成長因子又は形質転換成長因子、成
長ホルモン、ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモン、
インターロイキン、例えばインターフェロン−１又は−
２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）又はＭ
ＩＦ関連ポリペプチド、インターフェロン、例えばヒト
インターフェロン−α、例えばインターフェロン・−α
Ａ、−αＢ１−αＤ又はαＦ１β−インターフェロン、
γ−インターフェロン又はバイブリドインターフェロン
、例えばαＡ−αＤ−又はαＢ−αＤ−インターフェロ
ン、肝炎ウィルス抗原、例えば肝炎Ｂウィルス表面もし
くはコアー抗原又は肝炎Ａウィルス抗原、プラスミノー
ゲン活性化因子２、例えば組織プラスミノーゲン活性化
因子又はウロキナーゼ、バイブリドプラスミノーゲン活
性化因子、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β
−エンドルフィン、免疫グロブリン、例えば、免疫グロ
ブリンＤ、Ｅ又はＧの軽鎖及び／又は重鎖、免疫グロブ
リン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）結合
因子、受容体、例えば、ウィルス、成長因子、リンホカ
イン、インターフェロン、ホルモン又は免疫グロブリン
のための受容体、特に免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）受容
体、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペプチド、血
液凝固因子、例えばファクター■又は■Ｃ、ニグリン、
例えばニグリンＣ、ヒルジン、デスルファトヒルジン、
又はヒトスーパーオキシドジスムターゼ、等が挙げられ
る。
好ましくは、この発明のバイブリドベクターは、適切な
転写停止及びポリアデニレーションのためのシグナルを
含んで成る真核性遺伝子の３′−避翻訳領域、例えばラ
ビットβ−グロビン遺伝子、ヒトβ−アクチン遺伝子又
はＳν４０初期遺伝子の３′部分を含有する。目的の蛋
白質のためのコード配列が真核生物のゲノムＤＮＡに由
来する場合、それは通常コード配列中に埋め込まれたス
プライシングを可能にするシグナルを含有する。例えば
選択マーカーの多くがそうであるように選択されたコー
ド配列がｃＤＮＡ又は原核生物に由来するために、スプ
ライシングのためのシグナルがコード配列中に存在しな
い場合、そのようなＲＮＡプロセシングシグナルをベク
ターの５′又は３′の翻訳されない、転写される領域に
設けるのが好ましい。
この発明のベクターのための適当なスプライシングシグ
ナルは合成ＤＮＡにより与えられ〔例えば、Ｇ、Ｒａｕ
ｔｍａｎｎ等、ＥＦＩＢＯ−Ｊ、　３　、２０２１−２
０２８（１９８４）を参照のこと〕、あるいは天然遺伝
子に由来し、例えばヒトβ−７クチン遺伝子の５′イン
トロン、β−グロビンの３′イントロンもしくは５ｖ４
０初期遺伝子からのスプライシングシグナル、又は異る
遺伝子からのシグナルの組合せ、例えばアデノウィルス
主要後期転写物の第一ドナ一部位と免疫グロブリン遺伝
子のアクセプタ一部位との組合せ（Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍ
ａｎ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１５９．６０１−６
２１（１９８２）　）である。
機能的要素（ｂ）中に含まれるポリアデニレーションシ
グナルから下流に、選択遺伝子の転写が生産遺伝子のそ
れと同じ方向になるようにマーカー遺伝子のプロモータ
ー（ｃ１）が置かれる。要素（ｂ）の蛋白質コード領域
の３′末端とマーカー遺伝子のプロモーターとの間の距
離は臨界的ではない０機能的要素（ａ）のエンハンサ−
とマーカー遺伝子のプロモーターとの間にあるＤＮＡ配
列がマーカー遺伝子のプロモーターに対する所望の刺激
効果妨害しないように注意が払われれば、前記の距離は
数ヌクレオチド−数千ヌクレオチドであることができる
。このようなエンハンサ−終止配列はしばしば原核性Ｄ
ＮＡ、例えばρＢＲ３２２、Ｍ１３、ファージλまたは
Ｔ、、５ＤＮＡ中に存在し、従ってこれらはこの位置中
には回避されるべきであるが、しかし真核性ＤＮＡ中で
はまれであり、従ってこれが好ましい。選択マーカー遺
伝子のためのプロモーターとして、好ましい宿主細胞中
の非相応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ）プロモーター、例
えば、多くのセルライン中のアデノウィルス主要後期プ
ロモーターに依存するとして示され得る適当な天然プロ
モーター（Ｊ、ＲｏＫａｕｆｓａｎ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｏｉｌ、　。
１５９．６０１−６２Ｎ１９８２）　　；Ｆ、Ａｓｓｅ
ｌｂｅｒｇｓ等、Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　１８９．４０１（１９８６））　、あるい
は機能的プロモーターであって該プロモーターと天然に
関連しているエンハンサ−ＤＮＡの意図的な除去により
エンハンサ−を伴わないようにされたプロモーターを選
択することができる。後者の好ましい例は、ヘルペスウ
ィルス−チミジンキナーゼプロモータ（ＥｃｏＲＩ　−
Ｂｇｌ　Ｉ　、ヌクレオチド１２１−２５２、Ｓ、Ｍｃ
Ｋｎｉｇｈｔ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃａｄｓ　Ｒｅｓ、　　
８＋５９４９（１９８０）　）及ヒ５ｖ４０初朋エンハ
ンサー／プロモーターマイナスいわゆる７２ｂｐレピー
ト（Ｌ、Ａ、Ｌａ１ｍ１ｎｓ等、Ｐｒｏｃ。
ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　７９．６４５
３＜１９８２）：Ｆ、Ｗｅｂｅｒ等、Ｃｅ１ｌ　３６，
９８３（１９８４））である。生産遺伝のために適当で
あると考えられるのと同じ群（前記参照のこと）から選
択されるプロモーターのエンハンサ−欠失誘導体も好ま
しいが、しかしながらこの場合には、相同性遺伝子組換
を回避するように、生産遺伝子及び選択マーカー遺伝子
の両者での同じＤＮＡ配列の使用を最小にするように又
は全く回避するように注意が払われなければならない、
この考慮はまた、生産遺伝子プロセシングシグナルのた
めに示されたのと同じ遺伝子群から選択され得る、ＲＮ
Ａプロセシングシグナルを有する選択遺伝子を得るよう
にＤＮＡ配列が選択される場合にも、なされなければな
らない。例えば、スプライシング及びホリアデニレーシ
ジンのためのシグナルとして、“生産物”コード配列か
ら下流にラビットβ−グロビン遺伝子の３′部分を置く
ことができ、これに対して選択遺伝子のためのスプライ
シングシグナルをマウスＤＨＰＲをコードすることがで
きるコード配列の上流に置かれたアデノウィルス／免疫
クロプリン−バイブリドイントロンにより提供し、そし
て選択遺伝子の３′ポリアデニレーションシグナルを下
流に置かれたＳＶ４０からの初期ポリアデニレーション
シグナルにより提供することができる（Ｋａｕｆｍａｎ
等、前掲）。
典型的には“上流要素”のみから成るこのようなプロモ
ーターの後に、使用される宿主細胞のタイプに適した選
択マーカー遺伝子のためのコード配列（ｃ２）が置かれ
る。このマーカー遺伝子は真核生物由来のものでも原核
生物由来のものでもよい。抗生物質耐性遺伝子、例えば
プレオマイシン（Ｐ、　Ｍａｏｄ　ｉｏｒ等、Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、ｕ、１９５　２０５（１９
８５）　；　Ｄ、Ｓｅｍｏｎ等、Ｐｌａｓｍｉｄ　１７
．４６−５３（１９８７））ハイグロマイシン−Ｂ及び
ネオマイシン−型抗生物Ｗ　（Ｂｒｅｎｎｅｒ、　Ｎａ
ｆｕｒｅ　３２９．２Ｈ１９８７）に列挙されている〕
に対する耐性を付与する各遺伝子が好ましい。従来Ｇ４
１８として知られるゼネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）
は真核細胞の選択のために最もしばしば用いられるネオ
マンシン−型抗生物質である。
細胞に新たな生合成経路を提供しそれによって細胞性栄
養要求性を抑制する遺伝子も好ましい。チミジンキナー
ゼ（ｔ　ｋ）遺伝子（ｔｋ−細胞のため）、ジヒドロフ
オレート・レダクター−１！”　（ＤＨＰＲ）遺伝子（
ｄｈｆｒ−細胞のため）及びキサンチン−グラニシン−
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝
子（キサンチン、アミノプテリン及びミコフェノール酸
の存在下で培養された哺乳動物細胞のため）が適切な例
である。他のマーカー蛋白質には、着色物質を無色の基
質から又は異る色を有する基質から生産する酵素が含ま
れる。好ましい選択遺伝子の内、遺伝子の増幅を誘導す
るために使用され得るもの、例えばジヒドロフォレート
・レダクターゼ（ＤＨＰＲ）遺伝子、特にその阻害剤で
あるメトトレキセートに対する親和性が低下しり変形体
、ヘルペスシンプレックスウィルスのチミジンキナーゼ
遺伝子、及びＧ、Ｒ，５ｔａｒｋ等″Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　’　、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、５３゜４４７−４９１　（１９８４）中に
挙げられているものが特に特徴的である。
好ましくは、この発明のベクターはＥ、コリ中での増加
のための複製開始点及び抗生物質耐性遺伝子、例えばａ
ｍｐ又はｔｅｔを含有する。哺乳類復製開始点は、ベク
ターの造成中に真冬性複製開始点、例えばＳＶ４０又は
他のウィルス源由来のものを含有せしめることにより与
えることができ、あるいはベクターの宿主細胞染色体へ
の組込みの後に宿主細胞の染色体により与えられる。Ｓ
Ｖ４０の復製開始点は、例えば、ウィルスＤＮＡの旧ｎ
ｄＩ［［−３ｐＨＩ断片〔ヌクレオチド５１７１−１２
８　、開始点＝１位：Ｊ、Ｔｏｏｚｅ（ｍ）　、、　Ｄ
ＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ。
Ｐａｒｔ２、？２版、コールドスプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−ニュー
ヨーク、１９８２）中に含まれる。
宿主の染色体上に存在するような余分のエンハンサ−の
影響から上記の二元遺伝子造成物を遮蔽するため、生産
遺伝子のプロモーター／エンハンサ−から上流及び選択
遺伝子のプロモーターの下流にエンハンサ−終止ＤＮＡ
を有することが好ましい。選択遺伝子のコードＤＮＡ配
列がすでにエンハンサ−終止活性を有しない場合には、
遺伝遺伝子の後にそのようなＤＮＡを備えるのが好まし
い。好ましいエンハンサ−終止ＤＮＡ［は原核性ＤＮＡ
である。ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子の
ような真核遺伝子が使用される場合にしばしばそうであ
るように、選択遺伝子のコード配列中にも、５′及び３
′非翻訳領域にもエンハンサ−終止ＤＮＡ配列が存在し
ない場合、全体遺伝子を逆にして転写が生産遺伝子と逆
の方向になるようにすることもできる。
上記の二元遺伝子造成物は好ましくはプラスミド又はバ
クテリオファージとして中間宿主、通常は細菌、例えば
Ｅ、コリ中で増幅される。プラスミド型レプリコンが好
ましい場合、上記の二元遺伝子造成物は、細菌宿主中で
活性な選択遺伝子及び複製シグナルを含有する細菌プラ
スミドの断片と組合わされる。好ましくは、ベクターの
ＳＶ４０　Ｔ抗原により誘導される複製を阻害するいわ
ゆる毒性（ｐｏｉｓｏｎ）配列が除去されているｐＢＲ
３２２ｉｆｉ１体、例えばｐｓＶＯｄ　　（Ｐ、Ｍｅｌ
ｌｏｎ等、Ｃｅ１ｌ　　２７．２７９　２８８（１９８
１））から得られる。
細菌由来の複製開始点及び選択マーカーの通常両者を含
有するこの発明の組換ＤＮＡ分子の部分を“ベクターＤ
ＮＡ”と称する。
この発明の組換ＤＮＡ分子は、前記の機能的要素＜ａ）
〜（ｄ）をベクターＤＮＡに、これらが所定の順序で配
置されるように、連結することにより製造される。
ＤＮＡセグメントをインビトロで連結するために種々の
技法を用いることができる。ある種の制限エンドヌクレ
アーゼによって生成される平滑末端（完全に塩基対合し
たＤＮＡデエプレンクス）はＴａ　ＤＮＡリガーゼによ
り直接連結することができる。さらに−船釣には、ＤＮ
Ａセグメントはそれらの単鎖接着末端を介して連結され
、そしてＤＮＡリガーゼ、例えばＴ、　ＤＮＡリガーゼ
により共有結合的に閉じられる。このような単鎖“接着
末端”は不ぞろい末端（ＤＮＡデュプレフクスの２本の
鎖が数ヌクレオチド離れた異る点で開裂される）を生成
する他のクラスのエンドヌクレアーゼによりＤＮＡを開
裂せしめることにより形成される。
単鎖はまた、ターミナルトランスフェラーゼを用いて平
滑末端又は接着末端にヌクレオチドを付加することによ
り（“ホモポリマー・ティリング′）、又は平滑末端Ｄ
ＮＡセグメントの１つの鎖を適当なエキソヌクレアーゼ
、例えばλエキソヌクレアーゼにより単にチューバック
（ｃｈｅｗ　ｂａｃｋ）することによっても形成するこ
とができる。接着末端を形成するための他の方法は、平
滑末端ＤＮＡセグメントに接着末端形成性エンドヌクレ
アーゼの認識部位を含有する化学合成リンカ−ＤＮＡを
連結し、そして生ずるＤＮＡを対応するエンドヌクレア
ーゼにより消化することから成る。この発明のバイブリ
ドベクター成分は適切な機能を保証するようにあらかじ
め定められた順序に一緒に連結される。ベクターの造成
に使用される一般的技法はＴｌＭａｎｉａｔｉｓ等によ
る’　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ａ＋ａｎｕａｌ’　（コールド°スプ
リングハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング
・ハーバ−、ニューヨーク、１９８２）に記載されてい
る。
この発明の他の観点は、この発明の組換ＤＮＡ分子、特
にバイブリドベクターにより形質転換された真核宿主細
胞、及びその製造方法に関する。
この発明の発現ベクターのための適当な最終宿主は、エ
ンハンサ−により制御される遺伝子発現がその中で機能
する宿主である。これには高等真核生物、例えば真菌、
植物及び動物の細胞が含まれる。
適当な真核宿主の例には、緑色植物、真菌、樹立された
哺乳類セルライン、例えばヒト又は動物のセルライン、
例えば骨髄腫細胞、ヒト胎児肺繊維芽細胞Ｌ−１３２、
Ｌ　Ｔ　Ｋ−細胞、ヒトＢｏＨｅｓ黒色腫細胞、ＨｅＬ
ａ細胞、ＳＶ　−４０ウイルスにより形質転換されたア
フリカミドリザルの腎細胞、例えばＣＯ８細胞、又はチ
ャイニーズハムスター卵巣（ｃＨＯ）細胞、及びこれら
の誘導体がある。形質転換される宿主生物の変異体には
特に、蛋白質分解プロテアーゼが少なく、異種蛋白質の
高収量をもたらし、蛋白質の少い培地中で増殖し、又は
ベクターの選択遺伝子の発現に欠ける変異体が含まれる
。
形質転換された宿主の製造方法はこの発明の組換ＤＮＡ
分子により宿主を形質転換することを含む。
真核宿主細胞、例えば哺乳動物細胞の形質転換は当業界
において知られている方法により達成される。哺乳動物
細胞へのバイブリドベクターの導入は、ＤＮＡの取り込
みを促進するためのヘルパー化合物、例えばジエチルア
ミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリ
セリン、ポリエチレングリコール、ＤＥＡＥ−ギキスト
ラン、ポリオルニチン、クロロキン、又は酪酸ナトリウ
ム等の存在下での、あるいはベクターＤＮＡとリン酸カ
ルシウムとの同時沈澱物としての、トランスフェクショ
ンにより行われる。他の適当な方法には、細胞核へのベ
クターＤＮＡの直接マイクロインジェクション及びエレ
クトロポレーション、すなわち細胞膜の透過性を増加せ
しめるための短い電気パルスによるＤＮＡの導入が含ま
れる。形質転換の間、細胞は一般に非−選択的条件下で
培養される。これに続（形質転換された細胞の選択は、
発現ベクターに共有結合的に組み込まれた選択マーカー
又は形質転換中に別途添加された選択マーカーを用いて
行うことができる。選択マーカーは抗生物質に対する耐
性を付与する遺伝子又は宿主細胞の遺伝的傷害を補完す
る遺伝子を包含する（前掲）。
１つの好ましい選択系は、外来ＤＩＩＰＲ遺伝子が供給
されない限り増殖のためにチミジン、グリシン及びプリ
ンが絶対的に必要とするジヒドロフォレート・レダクタ
ーゼ欠損細胞（ＤＨＰＲ−）　、例えばＣＨＯ細胞を用
いる。適当なりＨＦＲ−細胞、例えばＣＨＯ細胞へのＤ
ＩＩＦＲ遺伝子を含有するバイブリドベクターへの導入
の後、培地中の抗−フオレート剤メトトレキセートの濃
度を増加せしめることにより、形質転換された細胞を選
択する。
他の好ましい選択法は、抗生物質耐性例えばＧ−４１８
に対する耐性をコードする遺伝子を含有するベクターＤ
ＮＡとリン酸カルシウムとの同時沈澱物により適当な哺
乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞を処理する方法である。対
応する抗生？ｌ譬、例えばＧ−４１８の存在下で培養す
ることにより、そして／又は目的の蛋白質の発現につい
てスクリーニングすることにより、形質転換された細胞
を選択する。
３、　　Ｃ（Ｄ　　Ｂ　（７）、　　１７目Ｗム一般に
、一部の細胞のみがＤＮＡを取り込み、そしてわずかな
比率の形質転換された細胞においてのみＤＮＡが宿主細
胞の染色体に組み込まれる。
従って、トランスフェクションの後短時間で、新たな培
養条件がマーカー遺伝子を発現する細胞のみの増殖を許
容するように細胞の培養条件を変える。適当な増力期間
、はとんどのＭｉ織培養セルラインについては典型的に
は２〜４遇間の後、形質転換された細胞のコロニーが出
現する。次々、多数のこのようなコロニーからの細胞を
別々の培養容器中でさらに培養し、そして生産遺伝子の
発現について試験しなければならない、一般に、コロニ
ーの内わずかなもののみが生産遺伝子を発現するからで
ある。これに対して、この発明のバイブリドベクターを
使用すれば、予想に反して、この段階で実質的にすべて
のコロニーが生産遺伝子を発現することが観察される。
実際に、はとんどの目的のために、個々のコロニーを選
択しそして試験することはもはや必要でない。混合形質
転換体の培養物は典型的な形質転換コロニー由来の細胞
と同様に良好に生産するからである。一連の入念な試験
が排除されるのとは別に、この方法は一層早く生産期を
達成する。
４、　　　の　　　　　の−　の この発明の形質転換された宿主生物は、当業界において
知られている方法を適用して変異及び選択を行うことに
より異種蛋白質の生産について改良することができる。
変異は例えばＵ、Ｖ照射又は適当な化学薬剤により行う
ことができる０例えば、増幅可能な遺伝子、例えば５ｔ
ａｒｋ等〔“Ｇｅｎｅ、′１ｍｐ１１ｆｉｃａｔｉｏｎ
’、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５３．４４７　
４９１（１１３８４）　ｉにより列挙された遺伝子を選
択遺伝子として使用する場合に起こるように、ベクター
ＤＮＡのコピー数の増加に基いてマーカー遺伝子の増加
した発現を示す細胞を選択する方法が特に好ましい。例
えば、選択遺伝子が細胞成分の合成を制限する酵素の遺
伝子であれば、競争阻害剤（ＤＨＦＲの場合には基質類
似体メトトレキセート）の；゛店度を徐々に上昇せしめ
ることにより選択を達成することができる。別の方法と
して、選択遺伝子が抗生物質を修飾する酵素をコードす
る場合、遺伝子の増幅のために必要な上昇した選択圧は
抗生物質濃度を上昇せしめることにより達成することが
できる。さらに、生産された蛋白質の蛋白質分解的破壊
を回避するためにはプロテアーゼ欠損変異様が好ましい
。
５、　　　　　された　４　　の この発明はさらに、目的の蛋白質の製造方法に関し、こ
の方法はこの発明のｌ［ＤＮＡ分子を含有する形質転換
された真核宿主を適切な栄養条件下で培養し２、そして
該蛋白質を単一することを含んで成る。
形質転換された宿主雨胞は、資化性の炭素源、窒素源及
び無機塩を含有する液体培地中で当業界において既知の
方法により培養される。培養条件例えば温度、培地のｐ
Ｈ値、及び発酵時間は、異種蛋白質の最大力価が得られ
るように選択する。
哺乳類細胞は、場合によっては増殖促進物質及び／又は
補￥Ｌ類血清が補充された市販の培地を用いて組織培養
条件下で増殖する。細胞は固体支持体、例えばマイクロ
キャリヤー又は多孔質ガラス繊維に付着した状態で、あ
るいは適当な培養容器中で自由浮遊した状態で増殖する
。培地は好ましくは、選択圧が発揮され、そして遺伝マ
ーカーを含有するバイブリドベクターＤＮＡをなお含有
している細胞のみが生存するように選択される。すなわ
ち、例えば、バイブリドベクターが抗生物質耐性遺伝子
を含有する場合、対応する抗生物質が培地に添加される
。
細胞濃度が十分な値に達した時培養を停止し、そして蛋
白質を単離する。あるいは、蛋白質は通常は培地に分泌
されるので、生成物を含有する培地を細胞から分離し、
この細胞に新鮮な培地を与えて連続生産のために使用す
ることができる。生じた混合物を、常用の手段により、
例えばポリエチレンイミンを用いる処理によるほとんど
の非−蛋白質物質の除去、硫酸アンモニウムを用いる蛋
白質の沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー
、例えばイオン交換クロマトグラフィーサイズ排除クロ
マトグラフィー、ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣ，適当なセ
ファデフラム上ラム上での分子サイズ分は等により、目
的の蛋白質について濃縮する。前精製された生成物の最
終精製は、例えばアフィニティークロマトグラフィー、
例えば抗体アフィニティクロマトグラフィー、特に当業
界において既知の方法により不溶性マトリクスに固定さ
れたモノクローナル抗体を用いるモノクローナル抗体ア
フィニティークロマトグラフィーにより達成される。
この発明は特に、下記の例に記載するような、組換ＤＮ
Ａ分子、形質転換された宿主及びその製造方法、並びに
前記形質転換された宿主による目的蛋白質の製造方法に
関する。
次の実験の部において、この発明の種々の態様を図面に
言及しながら説明する。
以下余白 直１し１皿 これは５つの段階において達成される（第１図）、プラ
スミドｐＷ３４９Ｆ　（７，Ｏｋｂ　：ヨーロッパ特許
出願−１４３，０８１）を制限酵素Ｈｇ１ＡＩを用いて
、プラスミドの二次切断を抑制するためｌＯμｇ／＋ｄ
の臭化エチジウムを補充したほか製造者（ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ）により推奨される緩衝液中で
１２０／ｄの前記酵素と共に２０μｇ／＋ｄのＤＮＡを
３７℃にて１時間インキュベートすることにより、部分
的に開裂せしめた。次に、線状化されたプラスミドＤＮ
ＡをＴＢＥ＄１街液（ＴＢＥ：１ｍＭＨＤＴＡを含有す
る８ｈＭ　Ｔｒｉｓ−硼酸緩衝液、ｐＨ８，９）中０，
８％アガロースゲルに適用し、同じ緩衝液中に電気泳動
的に溶出し、フェノールで２回抽出し、クロロホルムで
２回抽出し、そして最後に０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ρｌ（５，２）を添加した後に一２０℃にてアル
コールで沈澱せしめた。ペレット化されたＤＮＡを０．
２ｇ／ＩＲ１で、ＴＥ（ＴＥ：１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ　、　ｐＨ１，２、０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に溶
解した。
次に６３Ｉｌｌの線状化ＤＮＡを３７℃にて３０分間、
１５０の７４　ＤＮＡポリメラーゼと共に、リガーゼ緩
衝液（３３ｌｉＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，９）　、
６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０
．５　ａ＋Ｍジチオスレイトール及び０．１■／ｉウシ
血清アルブミン〕中でインキエベートし、次に６０℃に
て１０分間加熱して酵素を不活性化する。このインキュ
ベーションの目的は、Ｔ４ポリメラーゼのエキソヌクレ
オチド分解活性を利用してＨｇ１Ａ　Ｉによる消化の後
に残存する突出した４個のヌクレオチドを除去すること
により平滑未満ＤＮＡ分子を得ることである。
ＨｉｎｄＩ［［リンカ−（ｃＡＡＧＣＴＴＧ）を平滑末
端ＤＮＡに連結するため、６　ｄ　（３００■）のキナ
ーゼ処理されたリンカ−を前記の溶液に４Ｉ１１の１０
１＋１Ｍ　ＡＴＰ及び３ＩＩｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ
（二ニー・イングランド・バイオラプス、４００μ／！
１１）と共に添加し、そして１６℃にて１６時間インキ
ュベートする。混合物を６８℃にて１０分間加熱するこ
とにより連結を停止し、次にＤＮＡをｔｌｉｎｄｌ］Ｊ
及び８ｇ／ＩＩにより消化する。すなわち１５　ｕｌ（
１３５Ｖ）の旧ｎｄｎＩを１、５１Ｊｌの４１８ａｃｌ
Ｏ，２ｐｌのＩＭＭｇＣｌ、及びＩｌｍの１ｍｇ／−ウ
シ血清アルブミンと共に添加し、３７℃にて１時間イン
キュベートし、次に４００のＢｇｌＩＩを添加した後３
７℃にて１時間さらにインキュベートする。得られる１
７７塩基対断片をＴＢＥ中６％ポリアクリルアミドゲル
上で精製し、Ｔ　ＨＥ（ＴＮＥ　：　１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ＣＩ！、　ｐＨ８，８、１００ａ＋ＭＮａＣ１
及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有）中に溶出し、ＤＥＡＥセ
ルロース（ワットマンＤＥ５２）に吸着せしめ、１ＭＮ
ａＣ１／ＴＮＥにより溶出し、４容量の水で稀釈し、２
．５容量のエタノールを添加した後−２０℃で沈澱せし
め、そして最後に１７ｍのＴ　Ｅ　（ＴＥ　：　１０ｍ
ＦＩＴｒｉｓ−ＨＣ４、ｐＨ８，０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
を含を）中に溶解する。
プラスミドｐＲ５Ｖｎｅｏ（５，７ｋｂ　；　ＡＴＣＣ
３７１９８）はプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　　（Ｐ、Ｊ
、５ｏｕｔｈｅｒｎ及びＰ、Ｂｅｒｇ、Ｊ。
Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　１．３２７−３４１
　（１９８２）　）の誘導体であって、ＳＶ４０由来の
Ｐνｏｉｌ−旧ｎｄｎＩ断片がラウス肉腫ウィルスから
のＬＴＲプロモーターを含有するＰｗ　ＩＩ　−Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ断片により置き換えられており、これはｐＲ
５ＶｃａｔがｐｓＶ２ｃａｔ　　（ｃ，Ｍ、Ｃｏｒ＋ｗ
ａｎ等、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　、ｌｉ、６７
７７−６７８１　（１９８２）　）から造成されたのと
同じ態様である。５４のこのプラスミドを５０ｄの容量
中で２４０のＢｇｌｌｌにより製造者の指示に従って切
断する。３７℃にて１時間のインキュベーションの後、
４０Ｕの旧ｎｄｌ［Ｉを添加し、そしてインキュベーシ
ョンを１．５時間続け、この後火５．４ｋｂ断片を前記
のようにして精製する。
１７ｍの精製された１１７６ｐ断片を１６℃にて１８時
間、２ＩＪ１（２０ｍｇ）のｐＲ５Ｖｎｅｏ断片に、０
．２５ｍ　（１００Ｖ）　（７）Ｔ　４１，１ガーゼを
用イテ全容量２２ｄのリガーゼ緩衝液中で連結し、次に
プラスミドＤＮＡを用いてり、Ｈａｎａｈａｔｍ　　Ｃ
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。
皿、５５７−５８０　（１９８３）　）に従ってＥ、コ
リーを形質転換する。住するアンピシリン耐性株から、
制限酵素分析により証明されるように１７７ｂｐＨｉｎ
ｄ　ｍＢｇｌＩｒ断片ををするｐｔｐａｔ、と称される
プラスミド（５，６ｋｂ）を含有する１株を選択する。
０．１ｇのこのプラスミドを６０ｍ中で１６ＶのＢａ１
ｌＩを用いて′Ｍ造者の推奨に従って、３７℃にて１．
５時間切断する０次に、この溶液に２０Ｖのウシ小腸ア
ルカリ性ホスファターゼベーリンガーマイハイム）を加
え、そしてインキュベーションを３０分間続け、次にＤ
ＮＡをフェノールで２回抽出し、クロロホルムで２回抽
出し、次に０．１容量の３．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｌ
４５．２　）及び０．６容量のインプロパツールを添加
した後沈澱せしめ、ＴＥ中に溶解し、前記のようにして
アガロースゲル電気泳動によりさらに精製し、フェノー
ルで２回抽出し、クロロホルムで２回抽出し、２，５容
量のエタノール及び０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ５，２）を添加した後−２０℃にて沈澱せしめ、そ
して最後に３０ｍＴＥ中に溶解する０次に、２．１ｋｂ
のｔ−ｐ＾Ｂ、ｌＩｌ断片を５ＪｌｇのｐＷ３４９Ｆか
ら２０！Ｊｌの反応容量中で２０ＶのＢｇｌＩＩを用い
て３７℃にて２時間切り出し、０．８％アガロースゲル
上で精製し、前記のようにして電気泳動的に溶出し、フ
ェノールで２回抽出し、クロロホルムで２回抽出し、２
．５容量のエタノール及び０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，２）の添加の後−２０℃にて沈澱せしめ
、そしてＴＥ中に８ｍｇ／ｍの濃度で溶解する０次に、
ｌｄのｔ−ＰＡ断片をＩＯＪの反応容量中で７．５ｍｇ
のＢｇｌＩｌ切断ベクターＤＮＡに、１００　ＶのＴ４
リガーゼ（バイオラプス）を用いて１６℃にて１７時間
連続し、そして次にＥ、コリに形質転換する。
得られるクローンの１つｐＤＯ２（７，６ｋｂ）は、こ
のプラスミドがヒトｔ−ＰＡの連続オーブンリーディン
グフレームを含有するようにｔ−ＰＡ　Ｂｇｌ　ｎ断片
を含有する。
Ｂ）　ｔ−ＰＡ　ｃＤＮ＾とβ−グロビン　　との　Ａ
せプラスミドｐＤＯ１０（６，５ｋｂ　；第２図）を次
の３つのＤＮＡ断片を連結することにより造成する。
（ｉ）Ｂａ１ｍで部分切断されそしてＨｉｎｇ（［［で
完全切断された１０ｎのｐＤＯ２ＤＮＡが負荷されたア
ガロースゲルから、）Ｉｉｎｄｌ１１部位から始まりそ
してＢａｌ■部位で終り、全ｔ−ＰＡコード配列を含有
する２、１ｋｂ断片を単離する。（ｉｉ）　ｐｌＪＢ　
　（４，８ｋｂ；Ｐ、Ｗｅｂｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　　
３１５．７５−７７　（１９８５）　）は、プラスミド
ｐｌＪｃ９　（Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ及びＪ、Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ、Ｇｅｎｅ　　１９＋　２５９−２６８　（１９７９
））　　ｉ同、■、２６９−２７６（１９８２））中に
Ｂｇｌ■部分消化物としてサブクローニングされたラビ
ットβ−グロビン遺伝子（Ａ、Ｖａｎ　０ｏｙｅｎ等、
５ｃｉｅｎｃｅ　２０６．３３７（１９７９））を含有
するプラスミドである。このプラスミドから、第二イン
トロン及びポリアデニレーション部位を含有する１、２
ｋｂＢａｇ　Ｈｌ−旧ｎｄｎＩ断片を切り出し、そして
アガロースゲル電気泳動により精製する。（ｉｉｉ　）
ベクターｐｏｏｔ　（３，２ｋｂ）は、複製開始点を含
むｐＢＩ？３２２のＨｉｎｄＴｆｉ−Ａｃｃ　Ｉ断片の
Ｈｊｎｄｌｌｒ部位（第２図）から反時計方向に、合成
Ｘｂａ１部位で終るヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭ
Ｖ）のエンハンサ−を含有する０、３ｋｂ断片、これに
続く、合成旧ｎｄＩＩＩ部位において終る相同性プロモ
ーターに付加された前記エンハンサ−の第二コピーから
構成されている。このベクターＤＮＡをＨｊｎｄＩ［［
で切断し、そして６．３ｋｂ線状プラスミドをアガロー
スケル電気泳動により精製する。
ｐｓＰ６２Ｐｓｔ３３　（６，２ｋｂ　；第３図）は、
図に示すように、プラスミドｐＳＰ６２　（ベーリンガ
ーマンハイム）のＰｓｔ１部位に挿入された、ウィルス
直接初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　；　ＩＥ
）プロモーターを含有するマウスサイトメガロウィルス
（ＭＣＭＶ）　ＤＮＡの２．１　ｋｂＰｓｔＩ断片を含
有するプラスミドである。
ｐＳＰ６２Ｐｓ　ｔ３３の旧ｎｄＩ１１部位にｐＤＯｌ
ｏからの旧ｎｄＩＩ［断片を挿入する。ＭＣＭＶ　ＩＥ
プロモーターから“センス（ｓｅｎｓｅ）”方向に転写
され得るようにｔ−ＰＡコード配列が挿入されているプ
ラスミドｐＣＧＡ２６　（９，６ｋｂ）を選択する。
プラスミドｐｓＶ２９１１ｎｅｏ　（５，７ｋｂ　；　
Ｆ、Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
　１８９．４０１−４１１　（１９８６）　）は、ＳＶ
４０発現カセット中にトランスボゾンＴＮ５からのネオ
マイシン（ｎｅｏ）ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を
含有する（第４図）。従って、これは細菌においてネオ
マイシン及びカナマイシンに対する耐性を与え、そして
哺乳類織組培養細胞に導入された場合にジエンチシン（
Ｇ４１Ｂ）に対する耐性を付与する＊　ｐｓＶ２９１１
ｎｅｏ　ＤＡＮは、Ｂａｎ＋ＨＩで切断し、ウシ腸アル
カリ性ホスファターゼで処理し、フェノールで２回抽出
し、クロロホルムで２回抽出し、アルコールで沈澱せし
め、そして最後にＴＥに溶解することにより、クローニ
ングのために調整される。プラスミドｐＣＧＡ２６を制
限酵素Ａｃｃｌで切断する。この制限酵素は）ＩＣＭＶ
エンハンサ−／プロモーター領域（Ｋ、Ｐｏｅｒｓｃｈ
−Ｈａｅｓｓｌｅｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．８３２５−８３２９
　（１９８５）中の３４５位のＧＴ／ＡＣＡＣ、及びグ
ロビン部分の後の配列ＧＴ／ＣＧＡＣ（Ｓａｔ　Ｉによ
っても切断され得る）を切断する。切断後に生ずる２塩
基の突出部をＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ夏　（大断片
）によりフィルインし、得られた平滑末端をＢａｎ＋Ｈ
Ｉリンカ−（ｃＧＧＡ　ＴＣＣＧ）に連結し、そしてこ
れをＢａｍＨＩ酵素で切断する。
今やＢａｔａＨＩ末端を有するＭＣＭＶ／ｌＰＡ／グロ
ビンユニットを担持する３、８ｋｂ断片をアガロースゲ
ルにより精製し、そして次に上記のようにして調製した
ｐｓＶ２９１１ｎｅｏ　ＤＮＡに連続して発現プラスミ
ドｐＣＧＡ２８を得る。
一船釣ｃＤＮへ−発現ベクターｐＣＧＡ４４　（第４図
）は、ｐＣＧＡ２８を５ａｃｌで切断し、次に生じた大
ＤＮＡ断片を再環することにより調製される。従って、
を−ＰＡコード配列のほとんどが除去されており、そし
てｐＣＧＡ４４のユニーク５ａｃ１部位に他のコード配
列を便利に挿入することができる。
Ｅ）Ｊ　　　云　　の　　　゛　　（５′プラスミドｐ
ＤＩＩＦＲ２９１１（５，３ｋｂ　；　Ｆ、Ａｓｓｅｌ
ｂｅｒｇｓ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、月３９．４０１
−４１１　（１９８６）　）は１モジユールのジヒドロ
フォレート・レダクターゼ（ＤＨＰＲ）遺伝子を含有す
る。この遺伝子は、ＤＩＩＰＲ−細胞における有用な選
択遺伝子であり、さらに形質転換されたＭｉ織培養細胞
が徐々に上昇する濃度の薬剤メトトレキセートに暴露さ
れた場合にＤＨＦＲ遺伝子と共にＤ　Ｎ　Ａ配列を同時
増幅するために使用することもできる。制限酵素Ｘｈｏ
ｌ及び５ａｉｌを用いてｐＤＨＦＲ２９１１から２．２
　ｋｂ　ＤＨＦＲ遺伝子を切り出し、アガロースゲルに
より精製し、そして５ａｉｌで切断されたｐＣＧＡ２８
に連結する　（第５図）。
挿入部がｐＣＧＡ２８中の切り縮められたテトラサイク
リン耐性遺伝子を完成する場、ｐＣＧ４４８　（１１，
９ｋｂ）と称する新たなプラスミドはＥ、コリを３種類
の抗生物質すなわちアンピシリン、テトラサイクリン及
びカナマイシンに対して耐性にするので、容易に固定す
ることができる。プラスミドｐＣＧ６４８により、選択
マーカーとしてＤＨＰＲ遺伝子を用いてＤＨＦＲ−細胞
を形質転換し、そしてｎｅｏ選択マーカーを用いてＤＨ
ＰＲ”細胞を形質転換することができる。このようなｐ
ＣＧＡ４８により形質転換された細胞を徐々に上昇する
濃度のメトトレキセートに暴露することにより、最初に
形質転換されたセルラインが機能的Ｄ）ＩＦＲ遺伝子を
含有していた否かにかかわらず、染色体に組み込まれた
ｐＣＧＡ４８　ＯＮＡの増幅が導かれる。プラスミドＤ
ＮＡの増加したコピー数はしばしば上昇した蛋白質生産
レベルをもたらす。
Ｆ）ブースミドＣＧＡ３１の゛”　　（６）プラスミド
ｐｃＧＡ３１　（６，７ｋｂ）は、ｌＯｔｒｇのｐＣＧ
Ａ２８（１，Ｄを参照のこと）を旧ｎｄｎｌで完全消化
し、大（６，７ｋｂ）断片を精製し、そしてこのＤＮＡ
をＴ４リガーゼにより再環化することにより造成される
。形質転換の後、ＳＶ４０初期エンハンサ−／プロモー
ターの転写制御のちとにｔＰＡ−β−グロビンを含をす
るｐｃＧＡ３１が得られる（第６図）。
Ｇ）ブースミドＣＧへ３ｌ−ＤＨＰＲのこのプラスミド
の造成においては１０鱈のｐＣＧＡ３１を５ａｌｌによ
り完全消化し、次にフェノール及びクロロホルムで抽出
し、この後ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、５０ｕｌ
のＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＲ、ｐＨ８，０、
１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する）中に溶解する。１０ｎｇ
のこのＤＮＡをｐＤＨＦＲ２９１１のＤＨＦＩ？−含有
Ｘｈｏ　Ｉ　−５ａｌ　Ｉ断片（１，Ｅを参照のこと）
ｌＯｎｇに連結し、Ｅ、コリＨＢＩＯＩに形質転換し、
そしてテトラサイクリン耐性コロニーを選択する。１個
のクローンが選択され、そしてその制限酵素消化パター
ンはｐＣＧ八３へ−ＤＨＦＲ（９ｋｂ）から予想される
それと一致する。ｐｃＧＡ３１−ＤＨＦＩ？は、ｔ−Ｐ
Ａ遺伝子がＳＶ４０初期プロモーターにより駆動されそ
して全体ｎｅｏユニットが欠けている点を除き、ｐＣＧ
Ａ４Ｂと同じ遺伝子配置を含有する。
Ｈ）ブースミドＣＧＡ４６の６ノ この項は、マウスメタロチオネインＩ遺伝子からのエン
ハンサ−ＤＮＡを含有しＳＶ４０初期プロモーターから
成るバイブリドエンハンサ−／プロモーターの制御のも
とでｔ−ＰＡを生産することができるプラスミドの造成
を記載する。　ｐｓＶＭＴ１７はＥ。
Ｓｃｒｆｌｉｎｇ等（ＥＭＢＯ，Ｊ、　４．３８５１−
３８５９　（１９８５）　）により記載されたプラスミ
ドであり、ｐＢｌ？３２２のＢ　ａｍＨＩ↓こ部位にク
ローン化された、単一のＢａｒａＨ１部位で切断された
完全ｍ換ＳＶ４０ウィルスＳＶＭＴ−Ｉ　−１７を含有
する。いわゆる毒性配列（ｐｏｉｓｏｎ５６ｑｕｅｎｃ
ｅ）を欠（ｐＢＲ３２２の誘導体であるｐＢＲｄ　［Ｆ
。
Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１
８９．４０１−４１Ｈ１９８６））ＩＯ！ＪｇをＣｌａ
ｌ部位及びＢａｌ１）ｌ　　１部位で切断し、そして大
断片をゲル電気泳動により精製した。同様にして、ｐｓ
ＶＭＴ１７をＨ１）ｚｎ及びＢａ＋ａｌ（Ｉで切断し、
そして初期遺伝子を含有する３ｋｂ断片を精製した。Ｈ
ｐａＩＩ制限酵素はＣ１ａＩ酵素と同様に２塩基突出部
を残す。そこで、１０ｎｇのＨｐａ　Ｉｆ　−Ｂａｗｌ
　　ＩｐｓＶＭＴ１７断片をｌＯｎｇのＣｌａ　Ｉ　−
Ｂａｍ＋）Ｉ　　Ｉ　　ｐＢＲｄ断片に連結し、次にＥ
、コリに形質転換することによりプラスミドｐＣＧＡ３
９　（５，９ｋｂ　；第７図）を得る。
１０河のことプラスミドをＨｉｎｄｎ［及び５ａ１１の
両者によって完全消化し、そして大３．４ｋｂ断片を精
製した。同様にして、プラスミドｐＤＯ１０（１，０゜
を参照のこと）を旧ｎｄＩＩ［、Ｐｖｏｌ及び５ａｌｌ
により完全消化し、そして３．４ｋｂ　ｔｌｉｎｄ　ｌ
ｌ−５ａｌ　！断片を精製する。Ｓａｌ　Ｉ　＋Ｈｉｎ
ｄｌｌ［はこのプラスミドを同じ長さの複数の断片に切
断するので、該プラスミドをＰｖｏｌのごとき第３の酵
素により切断する必要がある。１０ｎｇずつのこれら２
つの断片の連結及びこれにＶｔ　＜　Ｅ　、コリＩＩＢ
ＩＯＩへのトランスフェクションによりプラスミドｐＣ
ＧＡ４６が得られ、このプラスミドはｔ−ＰＡコード配
列を上流のメタロチオネイン−３ν４０バイブリドプロ
モーター、並びに転写物め適切なスプライシング及びポ
リアデニレーションのために必要な下流のラビットβ−
グロビン断片と共に含有する（第８図）。
■）ブースミ　ＣＧＡ　６−ＤＨＰＲのこのプラスミド
の造成（第８図）においては、１０ｇのｐＣＧＡ４６を
５ａｌＩにより完全消化し、次にフェノール及びクロロ
ホルムで抽出し、この後ＤＮＡをアルコールで沈澱せし
め、そして５０ＩのＴ　Ｅ　（１ｈＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ
／！　、　ｐＨ８，０、１ａ＋Ｍ　ＥＤＴ＾を含有する
）中に再溶解する。１０ｎｇのこのＤＮＡをｐＤＨＦＲ
２９１１（１，Ｅ、を参照のこと）のＤＨＩ’Ｒ含有Ｘ
ｈｏＩ−３ａｌＩ断片１０ｎｇに連結し、Ｅ、コリＨＢ
ＩＯＩにトランスフェクトし、そしてテトラサイクリン
耐性コロニーを選択する。１つのコロニーが選択され、
そしてその制限酵素消化パターンはｐＣＧＡ４６−ＤＨ
ＰＲについて予想されるそれと一致する。
ｐＣＧＡ４６−ＤＨＰＲ（８，６ｋｂ）は、標準的ＳＶ
４０初期ブＣＩモーターの代りにメタロチオネイン−５
Ｖ４０バイブリドプロモーターを含有する点を除き、ｐ
ｃＧＡ３１−ＤＨＰＲと基本的に同じ遺伝子配置を含有
する。
肛ＩＥ　　　び゛　るＩＥ人 この項は、Ｌｕｅｄｉｎ等（ＥＭＢＯＪ、　６．１０９
−１１４（１９８７）　）により記載された免疫グロブ
リンタイプＥ（ＩｇＥ）受容体を発現することができる
プラスミドの造成を記載する。俳号−ＥＲを有するプラ
スミドはＩｇＥ受容体の生産を意味し、他方符号−ＢＦ
を有するプラスミドははＩｇＥ結合因子の生産を意味す
る。−ＤＨＰＲと称されるプラスミドはさらに選択マー
カーとしてジヒドロフォレート・レダクターゼ遺伝子を
含有する。いずれもＳＶ４０初期エンハンサ−／プロモ
ーターを用いるｐＳＶＧ−ＥＲ。
ｐｓＶＧ−ＥＲ−ＤＨＰＲ，ｐｓＶＧ−ＢＰ及びｐＳＶ
Ｇ−ＢＰ−Ｄ）ＩＦＲ；　イずれもマウスサイトメガロ
ウィルス主要即時−初期プロモーターを用いるｐＭＧ−
ＥＲ，ｐＭＧ−ＥＲ−ＤＨＰＲ。
ｐＭＧ−ＢＰ及びｐＭＧ−ａｌｌ−ＤＨＰＲ？並びにエ
ンハンサ−の主要部分であるいわゆる７２ｂｐレピート
がマウスメタロチオネイン遺伝子からエンハンサ−ＤＮ
Ａにより置き換えられているＳＶ４０エンハンサ−／プ
ロモーターの誘導体をいずれもが用いるｐＳＶＭＴ−［
！Ｒ５ｐＳＶＭＴ−ＥＲ−ＤＨＦＲＳｐｓＶＭＴ−ＢＦ
及びｐｓＶ？ｆＴ−ＢＰ−ＤＨＰＲが記載される。
ａ）匹ん１」（社）Ｌ級 ｐＣＡＬ３　　（４，１ｋｂ）は、ＩｇＥ−受容体−ｃ
ＤＮＡ（Ｌｕｅｄｉｎ等、前掲）の旧ｎｃ　Ｕ　／Ｒｓ
ａ　Ｉ断片（ｐＣＬ２（４，５ｋｂ）から得られる〕が
ｐＧＥ？Ｉ”−１（プロメガ・バイオチック、マジソン
、ライスコンシン、米国〕中に次の様にしてクローン化
されているプラスミドである。
１０ｎのｐＣＬ−２（１９Ｂ６年７月３０日にＤＳＭに
隘ΩＳ１１３８０７として寄託されたＥ、コリ）ＩＢＩ
ＯＩ／ＰＣＬ−２から単離される）プラスミドＤＮＡを
制限酵素）１ｉｎｃＩｒ及びＲｓａＩにより消化する。
１．６　、１．２５　。
０．７２　、０．４６及び０．２３ｋｂの断片を得、そ
してＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲルによる電気泳動
により分離する。１．２５ｋｂのＤＮＡ断片を例１に記
載したようにして回収する。平行して、■ｏｎのプラス
ミドｐＧＥＭ”−１（２，９ｋｂ）を、５０Ｉｌｌの１
０ｏ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，６）　、５０ｎ＋
Ｍ　ＮａＣ１，１０ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１。
及び５ｍＭ　ＤＴＴ中で２０ユニツトの旧ｎｃＩ［（ベ
ーリンガー）により線状化する。３７℃にて２時間の後
、反応混合物に５０Ｊ１１のＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！
　　（ｐＨ８，５）、１０ＩＩＩの水、及び２０ユニツ
トのウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー）
を補充し、そして３７℃にて３０分間インキュベーショ
ンを続ける。この混合物をフェノール−クロロホルムに
より３回抽出し、そして次にＴＢＥ緩衝液中１％アガロ
ースゲルを通して電気泳動する。プラスミドＤＮＡを例
１に記載したようにして電気溶出によりゲルから回収す
る。１０ｎｇの１．２５ｋｂｃＤＮＡ断片及び１０ｎｇ
のＨｋｎｃｒｌ開裂ｐＧ！！ＭＴ″−１を１０１１１の
容量中で１５°Ｃにて１０時間連結する。この反応混合
物はさらに１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
　、Ｉ　ＬａＭＦＩｇＣｌｔ　、２ａ＋Ｍ　ＤＴＴ、　
０．５ｍＭ　ＡＴＰ及び１００ユニツトのＴ４−リガー
ゼ（ベーリンガーマンハイム）を含有する。Ｔ、　Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉＢ。
Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、コールドスプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリン
グ・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）、　２５０頁
に記載されている様にして、５Ｊ１１の混合物を用いて
コンビテントＥ、コリＩＩＢＩＯＩ細胞を形質転換する
。この細菌を、１１００Ｊ１／ｍｊのアンピシリンが補
充された寒天プレート上にプレートする。約５０個のア
ンピシリン耐性コロニーが得られる。２４個のコロニー
を増殖せしめ、そしてプラスミドＤＮＡを各培養物から
単離する。各培養物からの約ＩＩ！ｇのプラスミドＤＮ
Ａを旧ｎｄＤＩで消化し、そして消化されたＤＮＡ断片
の長さを、サイズマーカーとして旧ｎｄｍで消化された
λＤＮＡ　（ファルマシア、スエーデン）を用いて１％
アガロースゲル上で分析する。幾つかはコロニーの消化
されたプラスミドＤＮＡは０．５ｋｂ及び３．６ｋｂの
ＤＮＡ断片を与え、他の幾つかの０．７ｋｂ及び３．４
ｋｂの長さのＤＮＡ断片を与え、これらは断片挿入の可
能性ある２つの方向付けに対応する。これらのプラスミ
ドをそれぞれｐＣＡＬ−３及びｐＣＡＬ−４と命名する
　（第９図）。
ｂ、ブースミ′５ｖＧ−εＲの″ プラスミドｐｓＶ２９１１ｎａｏ　（Ｆ、Ａｓｓｅｌｂ
ｅｒｇｓ等、Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏ＋、　１８９．４０１−４１１　（１９
８６）　）を用いてベクターＤＮＡを調製する。これを
制限酵素Ｈｉｎｄｎｌ及び５ａｌＩにより消化する。３
．９及び１．８　ｋｂの断片を得る。混合物をアルカリ
性ホスファターゼで処理し、そして１％アガロースゲル
での電気泳動の後１９ｋｂ断片を単離する。平行して、
それぞれＩｇＥ受容体及びラビットβ−グロビン遺伝子
の３′側半分をコードする２つのＤＮＡ挿入部を調製す
る。一方では、１０ＪｒｇのプラスミドｐＣＡＬ　３を
ＨｉｎｄｎＩにより部分消化し、そしてＢａｗｌ（Ｉを
完全消化する。１．２６ｋｂのｃＤＮＡ挿入部を、アガ
ロースゲル電気泳動及びゲル溶出により単離する。他方
、１０ｇのプラスミドｐＶＢ　　（例１．Ｂ、第２図を
参照のこと）をＢａｍＨＩ及び５ａｉｌにより完全消化
する。１．２　ｋｂ　ＤＮＡ断片を単離する。これは、
ラビットβ−グロビン遺伝子の大イントロン及びポリ（
Ａ）シグナルを含有する。上記からの１０ｎＨのベクタ
ーＤＮＡ及びｌｏｎｇの各挿入部ＤＮＡを連結する。得
られるＤＮＡを用いてコンピテントＥ、コリ）ＩＢＩＯ
Ｉをトランスフェクトする。ベクターＤＮＡに両ＤＮＡ
挿入部が取り込まれた後に予想されるような、予想通り
の制限パターンを示す組換プラスミド（９ＳＶＧ−ＥＲ
；　５．６　ｋｂ　；第１０図）を選択する。
Ｃ，ブースミ゛Ｓｔ／Ｇ−ＥＲ−ＤＨＰＲの１０鱈ｇの
ｐＳＶＧ−ＥｌｌプラスミドＤＮＡを５ａｌｌにより部
分消化する。１回のみ切断され、そしてそれ故に完全な
長さの線状を示すＤＮＡ分子をアガロース電気泳動によ
り精製する。平行して、１０鱈のｐＤＨＦＲ２９１１プ
ラスミドＤＮＡ　（例１．Ｅ；第５図を参照のこと）を
Ｘｈｏｌ及び５ａｌＩにより完全消化し、２．２ｋｂの
ＤＨＰＲ含有断片を例ＩＥに記載したようにして精製す
る。次に、１０鱈ｇの５ａｌｌ−開裂ｐＳＶＧ−ＥＲ及
びｐＤＨＦＲ２９１１の２．２　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　／
Ｘｈ。
Ｉ断片Ｌｏｎｇを混合し、そして連結する。生ずるＤＮ
Ａを用いてコンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞を形質
転換する。形質転換された細胞を、ＬＢ−培地及び１０
ｎ／ｄのテトラサイクリンを含有する寒天プレートに拡
げる。予想通りのＤＮＡ制限パターンを示す組換プラス
ミド（ｐＳ￥Ｇ−ＥＲ−ＤＨＰＲ１７、８ｋｂ　；第１
０図）を、哺乳類宿主でのＩｇＥ受容体の発現について
選択する。このものは、ＥｇＥ受容体ｃＤＮＡの下流に
ｄｈｆｒ−選択マーカーを含有する。
転写の方法は両遺伝子について同じである。
ｄ、ブー７！、　ミ”　５ＶＧ−ＢＦ　（７）”’プラ
スミドｐＳシＧ−ＢＦ（５ｋｂ）は前記プラスミドｐＳ
ＶＧ−ＥＲの誘導体であって、式（１）のポリペプチド
のアミノ酸１〜１４７をコードするＤＮＡ配列が鳥類イ
ンフルエンザのへマグルチニンのシグナル配列をコード
する新たなＤＮＡ配列により置き換えられている。この
変化は式（１個ずつの文字はコードされたし一アミノ酸
の一般的略号を意味する）のポリペプチドのアミノｉ＄
ｆ１４８−３２１を含んで成るＩｇＥ−結合因子の分泌
を可能にする。
ＱＫＳＱＳＴＱＩＳＱＥＬＥＥＬＲＡＥＱ（，１ＲＬＫ
ＳＱＤＬＥＬＳＷＮＬＮＧＬＱＡＤＬＳｏｃ、９８．３
６５５　（１９７６）　；Ｋｏｒａｎａ等、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、ＣｈｅＩｌｌ。
２５１　＋５６５　（１９７６）　　；Ｓ、Ａ、Ｎａｒ
ａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　３９゜３　（１９
８３）を参照のこと〕に記載されている標準的方法に従
って、次の式： ％式％ の目的のため、文献（Ｓ、八、　Ｎａｒａｎｙ等、Ａｎ
ａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、■Ｌ、３６５（２９８２）　；　Ｋ
、Ｌ、Ａｇａｗａｌ等、Ｑｎｇｅｗ。
ＣｈｅＩｌ、　８４．４８９　（１９７２）　；　Ｃ，
Ｂ、Ｒｅｅｓｅ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３４．３１４
３　（１９７２）　；　Ｒルルｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ
、Ａ＊、Ｃｈｅｍ。
で示されるｄｓ　ＤＮＡ断片を化学的に合成する。
０．２ｎｇのこのＤＮＡを１０ｎＨのベクターＤＮＡ及
び２ｎｇの０．７　ｋｂ　Ｄｄｅ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ　
ｃＤＮＡ挿入部と連結する。ベクター断片はｐＳＶＧ−
ＥＲ（第１０図）プラスミドＤＮＡから次のようにして
得る。該プラスミドＤＮＡをＸｈａｌ及び旧ｎｄｌ［［
により完全消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱リン
酸化し、そしてベクターＤＮＡをアガロースゲルにより
精製する。前記０．７　ｋｂ　ｃＤＮＡ挿入断片はｐＣ
ＡＬ３　　（第９図）から誘導する。３０ｎのｐＣＡＬ
　３プラスミドＤＮＡを旧ｎｄＩ［Ｉ及びＸｂａｌによ
り消化し、そして０．８　ｋｂｃＤＮＡ挿入部をアガロ
ースゲル精製により単離する。
３ｎのこの０．８　ｋｂ断片をＤｄｅｌにより消化し、
これにより０．１及び０．７ｋｂのＤＮＡ断片を生じさ
せる。最後に、０．７　ｋｂ　ＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動及び精製により単離する。連結されたＤＮ
Ａを用いてコンピテントＥ、コリ１１８１０１細胞を形
質転換する。ベクターＤＮＡへのＤＮＡ挿入部の一体化
の後に予想されるような、予想通りの制限断片を示す組
換プラスミド（ｐｓｖｃ　−ＢＦ　；第１１図）を選択
する。
ｅ、　　５ＶＧ−ＢＦ−ＤＦＩＦＲの１１ＯｎのｐＳＶ
Ｇ−ＢＦプラスミドＤＮＡを５ａｉｌにより完全消化す
る。線状ＤＮＡ分子をアガロースゲル電子泳動により精
製する。５ａｉｌで開裂された１０ｎｇのｐＳＶＧ−Ｂ
ＦをプラスミドｐＤＨＦＲ２９１１の２、２ｋｂ　Ｓａ
ｌ　Ｉ／χｈｏＩ断片１０ｎｇと連結する。連結された
ＤＮＡを用いてコンピテントＥ、コリＨＢ１０１を形質
転換し、これを５０ｔｎｒ／ｄのテトラサイクリンが補
充されたＬＢ培地を含有する寒天プレートにプレートす
る。形質転換された哺乳類宿主でのＩｇＥ−ＢＰの発現
及び生産のために組換プラスミ）’　（ｐＳＶＧ−ＢＰ
−ｂＨＦＲ；　７．３　ｋｂ　；第１１図）を選択する
。
ｆ、ブースミドＭＧ−ＥＲの１ プラスミドρ５Ｐ６２（ベーリンガーマンハイム）のＰ
ｓｔ１部位に挿入された、ウィルス主要中間−初期（Ｉ
Ｅ）プロモーターを含有する、マウスサイトメガロウィ
ルス（ＭＣＭＶ）　ＤＮＡの２．１　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ
断片を含有するプラスミドρ５Ｐ６２Ｐｓｔ３３　（第
１２図）１０ｎをＡｃｃｌにより切断する。この制限酵
素による切断の後に生ずる塩基突出をＥ、コリＤＮＡポ
リメラーゼ（大断片）によりフィルインし、フェノール
及びクロロホルムでＤＮＡを抽出することによりＤＮＡ
ポリメラーゼを除去し、次にＤＮＡをアルコールで沈澱
せしめる。次に、ＤＮＡを再溶解し、旧ｎｄｌ［［制限
酵素により完全消化し、次にＭＣＭＶ　ＩＥエンハンサ
−／プロモーターを含有する０、５ｋｂ断片をゲル電気
泳動により精製する。同様に、１０μｇのプラスミドｐ
ＳＶＧ−ＥＲ（第１０図）をＥｃｏＲＩで切断し、塩基
突出をＤＮＡポリメラーゼによりフィルインし、次にＤ
ＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、アルコー
ルで沈澱甘しめ、この後ＤＮＡを５ａｌｌで消化し、そ
してβ−グロビン−スプライス／ポリアデニレーション
ユニット、細菌複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子
を含有する最大の断片を単離する。次に連結反応を行い
、この場合１０ｎｇのこの平滑（ｅｘ−ＥｃｏＲ１）−
ＢａｍＨＩ断片を１０イｇの平滑（ｅｘ−Ａｃｃ　Ｉ　
）ｆ（ｉｎｄ！１１　ＭＣＭＶ　ｘンハ７す／７’０モ
ータ＠片及びｐＣＡＬ３　　（例２．　ｈを参照のこと
）からのｌｏｎｇのｆｌｉｎｇＤＩ　（部分消化）　−
Ｂａａ　ｌ（Ｉ断片と連結する。連結されたＤＮＡ断片
をＥ、コリＨＢＩＯＩにトランスフェクトレ、そしてコ
ロニーを単離する。制限酵、素分析により、満たされた
Ａｃｃｌ及びＥｃｏＲ１部位の平滑末端が相互に連結さ
れておりそして２つの親プラスミドの旧ｎｄｌ［［部位
が連結されているコロニーを同定する。従って、得られ
たプラスミドｐＭＧ−ＥＲ（５，７ｋｂ　ｉ第１２図）
におイテは、ｐＳＶＧ−ＥＲ中の比較的弱いＳν４０初
期エンハンサ−／プロモーターが今や、多（の細胞にお
いて高レベルの転写物を誘導するＭＣＭＶエンハンサ−
／プロモーターで置き換えられている。
ｇ６プースミドＭＧ−ＥＲ−ＤＨＰＲの１０パのプラス
ミドｐＭＧ−ＥＲを５ａｌＩにより部分消化し、そして
線状ＤＮＡをゲル電気泳動により精製する。１０イｇの
このＤＮＡに、ＤＨＰＲ選択マーカーを含有するｐＤ）
ＩＦＲ２９１１の２．２ｋｂのＸｈｏ　　ｌ−５ａｌＩ
断片１０ｎｇを連結する。この連結されたＤＮＡをＥ、
コリ）ＩＢＩＯＩに形質転換し、そしてテトラサイクリ
ン耐性コロニーを例２ｅにおけるようにして得る。生ず
るプラスミドｐＭＧ−ＥＲ−ＤＨＦＲ（７，９ｋｂ　；
第１２図）を哺乳類組織培養細胞にトランスフェクトし
て、ＩｇＥ結合因子を分泌するセルラインを得ることが
できる。組織培養細胞中のプラスミドのコピー数をもと
の形質転換体のコピー数から、増加する濃度のアンチフ
ォルメート例えばメトトレキセートに対する耐性につい
て選択することにより増加せしめることができ、このコ
ピー数の増加にはしばしばＩｇＥ−ＢＰの生産レベルの
比例的上昇が伴う。
ｈ、　　−スミ　′ＭＧ−ＢＦの゛告 １０ｔｔｔのｐＭＧ−Ｅｅｌを旧ｎｄＩｎ及びＸｂａｌ
で完全消化し、そしてＭｌ’ＭＶエンハンサ−／プロモ
ーター、β−グロビン−スプライシング／ポリアデニレ
ーション断片、アンピシリン遺伝子生細菌複製開始点を
含んで成る大断片（４，３ｋｂ）をゲル電気泳動により
精製する。１０ｎＨのこのＤＮＡに、分泌性ＩｇＥ−結
合因子のためのコードＤＮＡ　（例２．ｄ、を参照のこ
と）を含有するｐＳＶＧ−ＢＦの小１１ｉｎｄ　ｌｌ１
Ｆ　−Ｘｂａ　Ｉ断片１０ｎ８に連結する。Ｅ、コリＨ
ＢＩＯＩへのトランスフェクションの後、アンピシリン
耐性コロニーを単離する。これからのＤ　Ｎ　Ａは予想
される制匝酵素パターンを有し、そしてｐｌＩＧ−ＢＰ
と命名される（５．２ｋｂ；第１３図）。
ｉ、ブースミドＭＧ−ＢＰ−ＤＨＰＲの１１０ｇのプラ
スミドｐＭＧ−ＢＦを５ａｌＪで消化し、そして線状Ｄ
ＮＡをゲル電気泳動により精製する。
１０イｇのこのＤ　Ｎ　Ａに、ＤＨＰＲ選択マーカーを
含有する２、　２　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｔ　−５ａｔ　Ｉ断
片１０ｎｇを連結する。
この連結されたＤＮＡをＥ、コリＨＢ　１０１にトラン
スフェクトし、そして例２．ｅ、におけるのと同様にし
てテトラサイクリン耐性コロニーを得る。生ずるプラス
ミドｐＭＧ−ＢＰ−ＤＨＦＲ（７，４ｋｂ　ｉ第１３図
）を哺乳類組織培養細胞にトランスフェクトして、Ｉｇ
Ｅ結合因子を分泌するセルラインを得ることができる。
この組織培養細胞中のプラスミドのコピー数を、もとの
形質転換体におけるそれから、増加する４度のアンチフ
ォルメート、例えばメトトレキセートに対する耐性につ
いて選択することにより増加させることができ、この増
加に伴ってしばしばＩｇＥ−ＢＦの生産レベルが上昇す
る。
ｊ、ブースミ）’　ＳＶＭＴＧ−ＥＲびＳＶＭＴＧ−Ｅ
Ｒ−Ｄ）ＩＦＲの遺戊 ｐｃＧＡ３９はＳＶ４０初朋遺初子遺伝子するプラスミ
ドであり、この遺伝子中では７２ｂｐレビートがマウス
メタロチオネインＩ遺伝子（例１．Ｈ１を参照のこと）
からのエンハンサ−ＤＮＡにより凄き換えられている。
これは、組換ＳＶ４０ウイ／ｌ、　スＳＶ？ＩＴ−１１
−１７（Ｓｅｒｆｌｉｎ等、前掲）からの初期遺伝子ユ
ニットを含有するＨρａｌＴ−Ｂａｍｆｌｌ断片をクロ
ーン化することにより造成される。１０イのＪ）ＣＧＡ
３９をＰｖｕｌ及び旧ｎｄＩＶで完全消化し、そしてハ
イブリドエンハンサー／プロモーターを含有する０、９
５ｋｂ断片を精製する。さらに、旧ｎｄＩＩＩにより部
分切断された１　０　ｇノｐｓＶＧ−ＥＲ（第１Ｏ図）
から、線状プラスミドを精製し、次にこれをＰｖｕＩに
より完全切断する。従って、エンハンサ−／プロモータ
ー以外のｐＳＶＧ−ＢＲのすべてを含有する５ｋｂのＰ
ＶＬＩＩＨｉｎｄｌ［Ｉ断片が得られる。Ｌｏｎｇのこ
の断片を１０■ｇのｐＣＧＡ３９　（第７図）の０．９
５ｋｂ断片に連結し、これをＥ、コリＨＢＩＯＩにトラ
ンスフェクションした後プラスミドｐＳＶＭＴＧ−ＥＲ
（５，５ｋｂ　、第１４図）が得られる。ｐｓＶＧ−Ｅ
Ｉ？−ＤＨＰＲの造成について前記したのと同様の方法
で、ｐＤＨＰＲ２９１１からのＸｈｏ　Ｉ　−５ａｔＩ
　ＤＨＰＲ断片を５ａｌＩによる部分切断により線状化
したｐｓＶ？１ＴＧ−ＥＲに挿入することによりテトラ
サイクリン耐性プラスミドｐＳＶＭＴＧ−ＢＲ−ＤＨＰ
Ｒ（７，７ｋｂ）を造成する（第１４図）。
ｋ、ブースミ）’　ＳＶＭＴＧ−ＢＦ　　びＳＶＭＴＧ
−ＢＰ−ＤＨＰＲの１双 上記の様にして、Ｐｖｕｌ及び旧ｎｄＩ［Ｉにより完全
切断された１０■のｐＣＧＡ３９　（第７図）から、バ
イブリドエンハンサ−／プロモーターを含有する０、９
５ｋｂ断片を精製する。さらに、１０ｊ！ｇのｐＳＶＧ
　−ＢＦを旧ｎｄＩ［［及びＰｖｕｌで完全消化し、そ
してエンハンサ−／プロモーター以外のｐＳＶＧ−Ｅｌ
？のすべてを含有する大断片を精製する（第１１図）。
１０■ｇのこの断片をｐＣＧＡ３９の０．９５ｋｂ断片
１０ｎｇに連結し、これをＥ、コリＨＢＩＯＩにトラン
スフェクトした後プラスミドｐＳＶＭＴＧ−ＢＦ（５ｋ
ｂ　ｉ第１４図）を得る。ｐＳＶＭＴＧ−ＥＲ−ＤＨＰ
Ｒの造成について前記したのと同様にして、ｐＤＨＦＲ
２９１１からのＸｈｏ　１−５ａ１１　ＤＨＰＲ断片を
、５ａｌＩによる完全切断により線状化されたｐＳＶＭ
ＴＧ−ＢＰに挿入することにより、テトラサイクリン耐
性プラスミドｐＳＶＭＴＧ−ＢＰ−ＤＨＰＲ（７，２ｋ
ｂ）を造成する（第１４図）。
五１　　　　　　れた　　　　　に　　ｔ−ＰＡの哺乳
類細胞へのＤＮＡのトランスフェクションのために使用
される方法、並びに形質転換された細胞の選択及び遺伝
子増幅のための選択の方法は詳細に記載されており〔米
国特許Ｎ１４，３９９．２１６　　；Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆ
ｍａｎ及びＰ、Ａ、５ｈａｒｐ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、　１５ＩＬ。
６０１−６２１　（１９８２））　、そして当業者によ
く知られている。
ＤＮＡ造成物は、酵素ジヒドロフォレート・レダクター
ゼを欠く変異株であるチャイニーズハムスター卵巣細胞
のＤＵＫＸＢＩ系において発現される（Ｇ、　Ｖｒｌａ
ｕｂ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＬＩＳ
Ａ　７’Ｌ　４２１６−４２２０　（１９８０））　、
細胞を、５％ウシ胎児血清が補充された、ヌクレオシド
（ギブコ）を含有するα４１２Ｍ培地中で培養する。
細胞を６−ウェルのマルチプレート（直径３．４ｃｍ）
に１０，０００／−の密度でプレートし、そして４遁の
ＤＮＡにより形質転換する。ＤＮＡは、０．１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡを含有する１　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４（ｐＨ
７，０）中に５０躍／−となるように溶解し、氷上で５
分間冷却し、０．２５容量のＩＭＣａ（Ｊ、を加え、そ
して氷上で１０分間インキュベートする。次に、この混
合物を同容量の２ＸＨＢＳ（５抛Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、２８
０ＩＩＩＭＮａＣｊ！　、、　　０．７５ｍＭ　Ｎａｔ
ＨＰＯｎ、０．７５ｍＭ　ＮａＨｚＰＯｎ、ｐＨ７，１
２）と混合し、次に氷上でさらに１０分間インキュベー
トする。最後に、このＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈澱
物を培地に加え、そして細胞をこのＤＮＡと共に１６〜
１８時間インキュベートし、次にグリセリンショックを
与える。すなわち、細胞をＴＢ　Ｓ　（８０ｇ＃！　　
Ｍａｃｌ、　３．８ｇ１ｌ　ＫＣｌ、　Ｉｇ＃ＩＮａｚ
ＨＰＯａ　　・２ＨｚＯ１Ｏ，１１４ｇ／ｌ　　ＣａＣ
ｌ２　ｚ　　’　２１ｈ０゜０．１１ｇ／ｊ！　　Ｍｇ
Ｃ１ｔ　　・６ＨｚＯ２２５１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！
　％　Ｉ）Ｈ７，５）ですすぎ、７８３９２０％（ｖ　
／　ｖ　）グリセリンと共に１分間インキュベートし、
再びＴＢＳですすぎ、そして組織培養培地中で２４時間
培養する０次に細胞をトリプシン処理し、そして細胞を
直径８Ｃ＠のベトリ皿３枚に移す。次の日、最初の非−
選択的培地を、ヌクレオシドを含有せずそして正常Ｆｅ
Ｓ２代りに５％の透析されたＦｅ２を含有する培地で置
き換える。３〜４日毎に培地を置換する。およそ１４日
目にコロニーを見ることができる。ピペットのチップに
より細胞をかき落とし、同時にそれらをトリプシン溶液
を満たしたチップに吸い取り、そして選択培地が補充さ
れた２４−ウェルのマルチプレートのウェルに移すこと
により、個々のコロニーから細胞を単離する。これらが
コンフルエントになったとき、培地を無血清培地で置換
し、そして条件化培地の２４時間アリコートを採取して
ヒトｔＰＡの含量を試薬する。
プラスミノーゲン活性化因子の鋭敏な測定法においては
、プラスミノーゲン（プラスミノーゲン・シグマＡ−６
８７７を５０℃Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ｐＨ８，０
）に溶解し、そして１００容量のこの緩衝液に対して２
回透析することにより調製されるストック溶液〕及びカ
ゼイン（無脂乳として添加される）又はフィブリン（フ
ィブリノーゲン十トロンビンとして添加される）が添加
されたアガロースゲルが使用される。プラスミノーゲン
活性化因子を含有するサンプル、例えば前記の条件化培
地０．０２５−を、厚さ４寵のアガロース層に作られた
直径５酊の孔に通用し、そして次に３７℃にてインキュ
ベートする。次に、プラスミノーゲン活性化因子がサン
プルのウェルから急速に拡散し、ゲル中のプラスミノー
ゲンをプラスミンに変え、今度はこのプラスミンがカゼ
イン又はフィブリンを消化してサンプルウェル周辺の不
透明なゲル中にクリアーハローを形成する。このハロー
の半径（最も便利には、サンプルウェルの縁から測定さ
れる）が活性化されたプラスミノーゲンの量を示す。こ
のアッセイは、添加されたプラスミノーゲン活性化因子
に対して直線的な応答を示さない、少量のプラスミノー
ゲンの活性化因子アッセイのため、インキュベージシン
を数日間に延長することができる。カゼインアッセイの
方法及び換算がＪ、Ｔａｎｇ等（Ａｎｎ、Ｎ。
Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　４３４．５３６−５４０（１
９８４）　）に記載されているが、２％（Ｗ／Ｖ）カー
ネーション無脂粉ミルクの代りに１２．５％（Ｖ／Ｖ）
殺菌（ＵＨＴ）無脂ミルク（ミグロス社、スイス）が使
用される。
基質としてフィブリン（Ａ、Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐ
ｅｒｎｏ及びＥ、Ｒｅ１ｃｈ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１
４８．２２３２３４（１９７８）　）を使用する場合に
は、０．２　ｇのアガロースを１５−の０、９％ＮａＣ
１に溶解し、そして４℃に冷却する。
この時点で８０ｇのウシフィブリノーゲン（シグマ、Ｆ
−８６３０）を含有する０、９％ＮａＣ１５ａ（，０，
１−のプラスミノーゲン溶液（前記）及び０．１−の１
００■／ａｆＮａＮｚを４２℃にて加える。最後に、０
．２−のウシトロンビン（シグマ、Ｔ−６６３４，０，
９％ＮａＣ１中に１６．６ＮＩＮユニツトで溶解したも
の）を添加し、そしてこの混合物を迅速にベトリ皿（直
径８Ｃ１１＞に注ぎ、そして室温にて１時間放冷する。
得られるゲルは約４關の厚さを有し、そしてカゼイン含
をゲルと同様に４℃にて数日間貯蔵することができ、又
は前記と同様にしてすぐ使用することができる。
Ｃ）ＰＡゝ　の゛ 既知数のセルからの条件化培地をＡ）において記載した
ようにして単離する。次に、Ｍ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ等
の方法に従ってアミド化活性を測定する（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ５Ａ７５，７５０−７
５３（１９７８）　）　、蛍光基質としてＮ−ＣＢＺ−
グリシル−グリシル−し−アルギニン−７−アミノ−４
−メチル−クマリン（バケム、デュベンドルフ、スイス
）を使用し、そして標準として７−アミノ−４−メチル
−クマリン（シグマ）を使用する。
Ｄ）　ｔ−ＰＡ　　　へのノ　−　のｔ・例３．Ａ）に
記載した方法に従って、プレート当り５０個以上のＤＨ
ＰＲ”コロニーを得る。よく先達したコロニーをランダ
ムに選択し、そして２４−ウェルミクロタイター培養プ
レート（ＮＩＩＮＣ）中で増幅する。コンフルエンシー
状態において、標準培地を無血清培地（ヌクレオシドを
含有しないα−ＭＥＭ　、ビブ１）で置換し、そして２
４時間後に条件化培地を収得し、そしてそのｔ−ＰＡ含
量について試験する。こうして試験された４８コロニー
のすべてが１８時間のインキュベージタンの後にカゼイ
ンプレート上で４寵以上のハローを形成した。
このような状況上で、形質転換されていないＣＨＯＤＩ
ＩＫＸＢＩ細胞、又はプラスミノーゲン活性化因子をコ
ードしないプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（Ｋａｕｆ
ｍａｎ及び５ｈａｒｐ　、前掲）により形質転換された
対照細胞からの条件化培地ではハローが観察されない。
従って、ｐＣＧＡ４８により形質転換されたＩＩＨＦＲ
”　ＣＨＯ細胞の９５％より多くがヒトｔ−ＰＡをも生
産すると結論される。この結果は、一般にわずか４〜６
時間を要するフィブリンアガロースプレート上で確認さ
れる。これらのプレート上では長いインキュベーション
（１８時間）の後、ＣＨＯ細胞により生産された微量の
ハムスターｔ−ＰＡの存在により１ｆ１未満の小ハロー
が観察される。ヒトｔ−ＰＡＯ量がハムスターｔ−ＰＡ
の生産をはるかに超えることはまた、条件化培地を蛍光
測定により試験した場合にも証明される。観察される平
均生産量は、４５，０ＯＯＦυ／■蛋白質（ＦＵ：蛍光
測定ユニット）の比活性を有するＢｏｗｅｓ黒色腫細胞
から単離された実験室標準ｔ−ｐ＾に比べて２２±１０
ｐｇ／細胞／２４時間である。
さらに、例３．Ｃ）に記載したこの試験において、ｐＣ
ＧＡ４８で形質転換されたＤＨＰＲ”　ＣＨＯ細胞から
の条件化培地は、対照ＣＨＯ細胞のそれに比べて１０倍
以上高いスコアーを示す、６週間継代培養された後、す
なわち５０細胞世代の後、ＤＨＦＲ″ＣＨＯ細胞はなお
し）　ｔ−ＰＡを生産し、ｔ−ｐ＾生産が宿主染色体へ
の安定な組込みに基くことが示される。
Ｅ）　ｔ−ＰＡ　　　の　　　れる　　の＝上記の例に
おいて、ｐＣＧＡ４８　ＤＮ＾は環状プラスミドＤＮＡ
として適用される。宿主染色体へのプラスミドの組込み
の細胞内過程の部分として、プラスミドが線状に転換さ
れる。これはＤＮＡ中のランダムな部位において起こる
と考えられるので、線状化の結果として遺伝子のＤＮＡ
配列が中断される機会は遺伝子のサイズの一次関数であ
る。
ＤＨＦＲ“コロニーの選択の場合、２ｋｂＤ）ＩＦＲ遺
伝子の外側の線状化のみが機能的子孫を生成する。
ＤＨＰＲ遺伝子の外側のｐＣＧＡ４８の９．６　ｋｂ　
ＤＮＡを１００％と考えれば、３．９　ｋｂ　ｔ−ＰＡ
ユニット、２．８　ｋｂ　ｎｅ。
ユニット及び２．９　ｋｂのｐＢＲ３２２由来ＤＮＡは
それぞれ４１％、２９％及び３０％を構成する。従って
、ＤＨＰＲ遺伝子の外側でのわずか５９％の線状化事象
がｎｅｏユニット中又はｐＢＲ３２２由来ＤＮＡ中で起
こりｔ−ＰＡ生産性子孫を導き、他方４１％においてお
そら（ｔ−ＰＡ遺伝子が破壊されると予想される。従っ
て、選択された４８コロニーの内１０個より多くがｔ−
ＰＡを生産しないことが予想されよう。
Ｆ）ｔ−ＰＡ　　　の　　　　　に　　い　　　の例３
．Ｄ）に示すように、予想される４１％の非−ｔ−ＰＡ
生産性コロニーは実際には観察されない、なお、仮定的
な線状化事象の結果として、ｔ−ＰＡ遺伝子のＭＣＭＶ
エンハンサ−／プロモーターユニット中に存在スるエン
ハンサ−と、やはりＭＣ１ＩＶエンハンサ−による刺激
に依存するアデノウィルスプロモーターとの間の空間的
連結が破壊される。従って、この様な線状化事象は原則
としてさらに非−生存ＤＩＩＦＩ？−形質転換体を生成
する。すなわち、ｐＣＧＡ４Ｂ中の遺伝子要素の特定の
空間的配置に基き、このプラスミドは形質転換後、その
すべてではないにしても多くがｔ−ＰＡを生産するＣＨ
Ｏ細胞の集団をもたらす。
Ｇ　）　　ＣＧＡ３１−　ＤＨＰＲによるＣＨＯのＤ）
ＩＦＲ−ＣＨＯ細胞のトランスフェクション例３．Ａ）
に記載したようにして行う。ｐＣＧＡ４８の場合よりわ
ずかに少ないコロニーが得られる。４８個のコロニーを
選択して例３．Ｂ）及び３．０）に記載したようにして
ｔ−ＰＡ生産を評価する。ｔ−ＰＡの生産が４７個のコ
ロニーにおいて観察される。平均生産量は１５±３ｐｇ
／細胞／２４時間であり、ｐＣＧＡ４８の場合よりわず
かに少い。
Ｈ）　　ＣＧＡ４６−ロＨＦＲによるＣＨＯの例３．Ａ
）に記載した標準的条件下でのｐＣＧ４６−ＤＨＰＲの
トランスフェクションはコロニーをほとんど又は全くも
たらさない。なぜなら、メタロチオネインエンハンサ−
の適切な刺激なくして、ＤＩ（ＰＲユニットは、選択条
件下で細胞の生存を許容するために十分に活性だからで
ある。従って、選択条件をわずかに変更して５　Ｘ　Ｌ
Ｏ−’Ｍ　ＺｎＳＯ４及び５×１０−７Ｍ　ＣｄＳＯ４
を加える　（本発明の条件下で最適）。
Ｚｎ５Ｏ，が省略されれば、おそらくメタロチオネイン
の不十分な生産のため細胞はＣｄ５０．により殺される
。多すぎるＣｄＳＯ４が添加された場合、細胞はやはす
死ぬ。クローニングのための毒性濃度及び最適濃度は具
体的な培地条件によって異り、そしてまた使用される血
清のバッチにも依存する。２Ｘｌ０−７Ｍより高濃度の
ＣｄＳＯ４は通常使用すべきでない。少なくとも５０ク
ローン／パブラスミドＤＮＡが得られる。拾い上げられ
た４８コロニの内、９５％以上が最適量の金属塩の存在
下でｔＰＡを発現する。クローンの２５％より多くにお
いて、ｔ　−１）Ａ及びＤ　１１　Ｆ　Ｒの合成が金属
依存的に調節される。Ｃｄ５０ａ’／＠度を低くする場
合金属依存性細胞によるｔ−ＰＡの合成が減少し、そし
てＤ　ＩＩ　Ｐ　Ｒ発現についてｉＡ択する培地におい
て細胞の増殖が遅くなる。
逆；こ、ｐｃＧＡ３１−　ＤＩＩＰＲで形質転換された
セルラインの構成的生産レベルと同じレベル又はそれよ
り高いレベルに達する高いＣｄＳＯ４レベルｉ度におい
て、ｔ−ＰＡ合成の速度は上昇する。金属により刺激さ
れたｔ−ＰＡ合成はＣｄ５０ａの非存在下よりも少なく
とも５倍高い、徐々に上昇する濃度のメトトレキセート
での選択によりプラスミドコピー数が増加する場合、ｔ
−ＰＡ及びＤＩＩＦＲの制御された合成が維持される。
有利なことには、増幅過程における後期により低いＣｄ
ＳＯ４濃度においてやはり選択圧を維持するために少な
いメトトレキセートが必要である。従って、低いＣｄＳ
Ｏ４レベルに基＜低いｔ−ＰＡ生産レしルにおいて一層
の増幅を行うことにより、細胞の実際の増殖を阻害する
であろう量のｔ−ＰＡをＣｄ５０ｎにより刺激された場
合に生産することができるセルラインを得ることができ
る。
皿 チャイニーズハムスター卵巣セルラインのジヒドロフォ
レート・レダクターゼ陰性菌（ｄｈｆｒ−）を宿主とし
て使用する（セルラインＤＵＫＸＢＩ　；　Ｌ、Ａ。
Ｃｈａｓｉｎ及びＧ、Ｕｒｌａｕｂ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７゜４２１６−４２
２０　（１９８０）　）。細胞を、５％ＦＣ３及び０．
１■／−シエンタマイシン（ギブコ）が補充された？Ｉ
ＥＭ−α培地（ギブコ、パイスレー、スコツトランド）
中に維持する。サブコンフルエント状態（７）ＣＨＯ細
胞ニ４　ｎ　（７）ｐＳＶＧ−ＢＦ−ＤＨＰＲ又はｐ）
’ＩＧ−ＢＦ−ＤＨＦＲプラスミドＤＮＡを、例３．Ａ
）に記載のリン酸カルシウム同時沈澱法を用いてトラン
スフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、５％
の透析されたＦｅ２及びジエンタマイシンが補充された
、ヌクレオシドを含まないα−ＨＥＭ培地中で増殖せし
める。
２回間後、Ｄ）ＩＦＲ＋のシングルコロニーが出現する
。４８個のコロニーを別々に２４−ウェルミクロタイタ
ープレート（ヌンク）のウェルに移し、そして上記の選
択培地中でコンフルエンシーに増殖せしめる。次に、培
地のアリコートを取り出し、そして後で記載するＲＩＡ
を用いてＩｇＥ結合因子の存在について試験する。３回
の別々の形質転換実験において、各回において９５％よ
り多くのコロニーが陽性であり、そしてｄ当り１〜Ｌｏ
ｎｇより多くの組換ポリペプチドを生産する。プラスミ
ドｐＭＧ−ＢＰ−Ｄ）ＩＦＲは、　１００コロニー／ｎ
ＤＮＡをもたらすｐＳＶＧ−ＢＰ−ＤＨＦＲに比べて実
質的に多くのコロニーをもたらす。ｐＳＶＧ−ＢＰ−Ｄ
ＩＩＰＲ−形質転換体は一層に、ｐＳＶＧ−ＢＦ−ＤＩ
ＩＰＲにより形質転換された細胞よりも３倍より多くの
ＩｇＥ−ＢＦを生産する（１〜３ｎｇ／ｍ／）、最良の
生産株であるセルラインＣＨＯ−ＢＦを多量に増殖せし
める。５０−の選択培地を含む組織培養フラスコ　（フ
ァルコン、１７５ｃｓ１）に約３×１０ｂ個の細胞を接
種する。細胞層がコンフルエンシーに達した時、培地を
除去し、そして１％ＦＳＣ＆び０．１■／ａ／ジエンタ
マイシンが補充された５０−のα−ＨＥＭ培地と換える
。１週間に２回、数週間にわたり培地を集める。これを
５０００　ｇにて１０分間遠心し、そして−２０℃で貯
蔵する。最後に、ＩｇＥ拮合話合活性する組換ポリペプ
チドを一緒にした上清からアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製する。
サンプルをＩｇＥ−ＢＦについて、次の様にして測定す
る。ＰＶＣミクロタイタープレートのウェルをＭａｂ−
１７６（ＥＰ２０５４０５　；　　ＰＢＳ中５　ｐｇ／
　ｍｌ　；　　１１００ｐ／ウエル）により一夜、温室
中で室温にてコートする。
プレートをＰＢＳにより２回洗浄した後、非特異的結合
部位を０．２％ゼラチンを含有するＰＢＳによりブロッ
クする（１５０ＪＪｌ／ウェル；３７℃、１時間）、プ
レートをＰＢＳで再び洗浄する。クロマトグラフィー実
験からの両分をＰＢＳ中に１＝５０で稀釈し、ウェルに
加え（１００ｊ１１／ウエル）、そして温室中室温にて
一夜インキユベートする。
プレートをＰＢＳにより４回洗浄する。結合したＩｇＥ
−ＢＰを検出するため、ビオチンを共有結合により結合
させたＭａｂ−１３５Ｃ例１９、ＥＰ２０５４０５）　
（０，２％ゼラチンを含有するＰＢＳ中０．５　ｎ／ｌ
ｄ　；　　１００ｔＩ！／ウエル）を添加し、そして温
室中３７℃にて４時間インキュベートする。ＰＢＳで洗
浄（４回）した後、０．２％ゼラチンを含有するＰＢＳ
中アビジンとアルカリ性ホスファターゼとの接合体（シ
グマ、カント！’＆ｉ　Ａ　２５２７．０．５　ｎ／　
ａｔ）１００ｐｌと共に３７℃にて２時間インキュベー
トする。ＰＢＳによりさらに洗浄した後、基質緩衝液（
８００−の水中１１００ｒｘ　ＮｇＣｌ　ｚ　”　６Ｈ
ｔＯ１２００ｗＮａＮ、、９７−ジニタノールアミン、
３７％ＭＣＩにてｐＨを９．８に調整）中１■／１ｄｐ
−ニトロフェルルホスフェート２ナトリウムによりプレ
ートを発色せしめる。３７℃にて２０〜４０分間の後黄
色となる反応が最適である。
次に、ウェル当り５０μｌのＩ　Ｍ　Ｎａ０ｔｌにより
反応を停止せしめる。モデル２５５０εＩＡリーダー（
ビオ−ラド）を用いて４０５龍にて光学濃度を決定する
。
ＩｇＥ−ＢＦの精製はＲＰＭ１８８６６細胞上清からの
ＩｇＥ−ＢＰのために開発された方法（ＥＰ２０５４０
５）に本質的に従う。
ＣＨＯ−ＢＦ細胞からの１（ｌの培養上清を、Ｍａｂ−
４５−アフィゲル（ＥＰ２０５４０５の例１０）の２０
Ｉｎ７カラムを通して１２０＠１／時の流速で濾過する
。ゲルをＰＢＳで洗浄する。流通液の蛋白質含量をユビ
コード分光光度計を用いて２８０龍ｍでのオンライン吸
光によりモニターして、未結合蛋白質の完全な除去を保
証する。カラムを５０−の０４１Ｍグリシン−ＨＣｊ２
（ｐＨ２，６）により溶出する。同量のＩ　Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ２（ｐＨ８，０）及び０．５％トウィーン２
０を含むチューブに百分を集める。ｒｇＥ−ＢＦ含有画
分をプールし、そして１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７，４）に対して透析する。
例４．０）の精製されたＩｇＥ−ＢＰを５ｙｎＣｈｒｏ
ｐａｋ　ＡＸ３００陰イオン交換カラム（シンクロバン
ク社、リンデン、ＩＮ）に負荷する。カラムを１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）で洗浄し、そして１
ａＺ／分の流速にて１００分間にθ〜Ｉ　Ｍ　ＮａＣｊ
！のグラジェントにより蛋白質を溶出する。溶出を２５
４龍ｍでのＵＶ吸収についてモニターする。画分を１％
オクチルピラノグルコシド（シグマ）中に集め、そして
例４゜Ｂ）に記載したようにしてＩｇＥ−ＢＰについて
アッセイした。
例４．Ｄ）の５０−のＩｇＥ−ＢＦを０．５１のＰＢＳ
に対して、及び０．１％オクチルピラノグルコシドを含
有するＰ　Ｂ　Ｓ　Ｏ，５１に対して２回透析する。凍
結乾燥の後、ＩｇＥ−ＢＰを１．！Ｍｌの水に溶解し、
そして０．１％オクチルピラノグルコースを含有するＰ
　Ｂ　Ｓ　Ｏ，５Ａに対して２回透析する。０．１％Ｔ
ＦＡ（ビエルス）及び５％アセトニトリル（メルク）中
５ｙｎＣｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−４（ジンクロム社）カラ
ム上で逆相クロマトグラフィーを行う。０．５ｍ／／分
の流速度にて３０分間にわたり０．１％ＴＦＡ中５〜６
０％アセトニトリルのグラジェントを適用することによ
りＩｇＥ−ＢＦの溶出を得る。　　２５４龍ｍでのＵＶ
吸収について溶出をモニターする。ｌｄの画分を０．０
５％ＳＤＳ中に集め、そして例Ａ）に記載したようにし
てＩｇＥ−ＢＦについて測定する。ＩｇＥ−ＢＰの純度
を５Ｏ５−ＰＡＧＥ及びこれに続く銀染色（ＥＰ２０５
４０５、例２０）によりコントロールする。
同様にしてｐＭＧ−ＥＲ−［ｌＨＦｌ１及びｐｓＶＧ−
ＥＲ−ＤＨＦＲをＤＦＩＦＩＩ−ＣＨＯ細胞にトランス
フェクトする。なお、ＩｇＥ受容体の生産の頻度は２つ
の方法で測定することができる。第一に、後で記載する
ＲＩＡアッセイを用いて、ＩｇＥ受容体の蛋白質分解的
開裂により生成するＩｇＥ−ＢＦの条件化培地中での存
在を測定することができる。別の方法として、ＩｇＥが
コートされたウシ赤血球を用いてＩｇＥ受容体止産性Ｃ
ＨＯ細胞の周囲にロゼツトを形成せしめることができる
（Ｌｕｅｄｉｎ等、前掲）。両者の測定により、９５％
より多くのＤＨＦＲ″ＣＨＯクローンがＩｇＥ受容体を
生産する。これらのクローンにより生産されるＩｇＥ−
ＢＦのレベルは上記のプラスミドによるのよりも非常に
低く、一般に０．１〜３ｎｇ／−である。
Ｆ）　　　−ブースミドによるトランスフェクション プラスミドｐＳＶＭＴＧ−ＥＲ−ＤＨＰＲ及びｐＳＶＭ
ＴＧ−ＢＰ−ＤＩＩＦＲによるトランスフェクションを
例４．Ａ）と同様にして行うが、しかし選択培地に５　
Ｘ　ＩＯ−’Ｍ　ＺｎＳＯ４及び５　Ｘ　１０−７Ｍ　
Ｃｄ５０ａを添加する。Ｃｄ５０．を使用しなければほ
とんど、又は全くコロニーが得られない。最適量のＣｄ
ＳＯ４を使用する場合、トランスフェクトされた１■の
ＤＮＡ当り少なくとも５０個のコロニーが得られる。９
５％以上のコロニがそれぞれＩｇＥ受容体又はｒｇＥ結
合因子を発現する。Ｃｄ５０．の存在下での生産は一般
に、野性型５Ｖ４０エンハンサ−・プロモーターを有す
る対応するプラスミドにより形質転換された細胞による
のと同等であるか又はそれより良好である。これらのコ
ロニーの少なくとも２５％において、ＩｇＥ受容体又は
ＩｇＥ結合因子の合成は、例３．Ｈ）でｔ−ＰＡ−コー
ドプラスミドについて記載したのと同様にＣｄ５０．濃
度を変えることにより制御され得る。
貫ｌ　　の　　′　　　　１　　るブースミ′これらの
プラスミドの基礎はエンハンサ−ＤＮＡ（ｐＮＥ）を含
まないＳＶ４０初期遺伝子を含有する造成物である（ｐ
ＮＥ）。次に、いかにしてＴ−抗原コード配列をネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ（ｐＮＥ−ｎｅｏ）　
、キサンチン−グラニシン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）　（ｐＮＥ−ｇｐｔ）及びチミ
ジンキサーゼ（ｐＮＥ−ｔｋ）により置換され得るが、
並びにいかにしてこれらの選択遺伝子をｔ−ＰＡ生産遺
伝子と組合わせることができるかについて記載する。
以下余白 Ａ）ブースミ＝ＮＥ　　ＮＥ−ｎｅｏ　　ＮＥ−ｔ　　
びエンハンサ−を含まないＳＶ４０初期遺伝子を次の様
にしてクローン化する。１０躍のＳＶ４０ウィルスＤＮ
Ａを５ｐｈｌを用いて切断し、生ずる接着ＤＮＡ断片を
８１ヌクレアーゼにより平滑化し、この２１　Ｄ　Ｎ　
Ａ　ラフエノール及びクロロホルムによる逐次的抽出、
並びにエタノール沈澱により精製する。
ホスホリル化されたＣ１ａニリンカー　（ｃＡＴＣＧＡ
ＴＧ　ｉニューイングランド・ビオラプス社）をＤＮＡ
に連結し、次にこれをＣ１ａｌ及びＲａｍ）ｌ　Ｉによ
り切断する。生ずる断片の内、最大のものをゲル電気法
′ｊＪＪにより精製し、そしてｐＢＲｄ　（例１．Ｈ）
、第７図）の同様にして精製した大Ｃｌａ　ｒ　−Ｂａ
ｉｌ　Ｔ断片に連ｉ吉してフ゛ラスミドｐＮＥ（５，８
ｋｂ　；エンハンサ−なし、第１５図）を形成せしめる
。このプラスミドを選択遺伝子の挿入のために用意する
ため、このプラスミドの１０Ｉ！ｇのＤＮＡを旧ｎｄｌ
ｌｌ及びＢａｍＨＩにより完全切断し、そしてエンハン
サー不含プロモーター及びｐＢ［！３２２由来配列を含
有する大断片を精製する。同様に、ｐＳＶ２ｎｅｏ　（
５，７ｋｂ　；　ＡＴＣＣ３７／４９　；Ｐ、Ｊ、５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ及びＰ、Ｂｅｒｇ、Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ
、Ｇｅｎｅｔ、工。
３２７−３４Ｈ１９８２）　）をＨｉｎｄｌｌ［及びＢ
ａｗ＋）Ｉ　Ｅで完全消化し、そしてＴ、、５プロモー
ター、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼコード
配列及びＳＶ４０を一抗原遺伝子由来のスプライシング
／ポリアデニレーションユニットを順次含有する２ｋｂ
断片を精製する。これらの断片１０ｎｇずつを連結して
、Ｅ、コリに形質転換した後ｐＮＥ−ｎｅｏ（５，５ｋ
ｂ）を得る。ｐＮＥ−ｇｐｔ（５，Ｏｋｂ）は同様にし
て造成されるが、但しｐＳＶ２ｇｐｔ　（５，２ｋｂ　
；　ＡＴＣＣ３７／４５；Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ及
びＰ、Ｂｅｒｇ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１．４
４９−４５９（１９８１）　）の小１１ｉｎｄ　ＩＩＩ
　−ＢａｍＨＴ断片をｐＮＥ　）ｌｉｎｄｌ［［−Ｒａ
ｍ）Ｉ　Ｉ断片に連結する。ｐＮＥ−ｈｐｈ（６，３ｋ
ｂ）を形成するため、まずｐＮＥ−ｎｅｏをＳｍａＩ及
び旧ｎｄｌ［［で切断し、そして大きい方のＤＮＡ断片
を精製する。平行して、１１ｉｎｄ　ｍ　　Ｓ　ｍａ　
Ｉ断片をｐＫｃ２１４　（１，６，６ｋｂ　；第１５図
；Ｒ，Ｐ、５ａｎｔｅｒｒｅ等、Ｇｅｎｅ　３］、１４
７　１５６　（１９８４））から調製し、そして上に調
製したｐＮＥ−ｎｅｏ口ＮＡに連結する。生ずるプラス
ミドｐＮＥ−ｈｐｈを第１６図に示す。
Ｂ）′　゛　　　と　　　　　の　ムわせ１０Ｉ！ｇの
プラスミドｐｃＧＡ３１又はｐＨＧ−ＢＰを５ａｌｌで
完全切断し、切断されたＤＮＡをウシ腸アルカリ性ホス
ファターゼにより脱リン酸化し、そして線状ＤＮＡをア
ガロースゲル電気泳動により精製する。これを５ａｌｌ
ベクターＤＮＡと称する。平行して、選択遺伝子を含有
する５ａｌＩ末端断片を次のようにして調製する。ｐＮ
Ｅ−ｎｅｏ　　、ｐＮＥ−ｇｐｔ及びｐＮＥ−ｈｐｈか
らＥｃｏＲＩによる切断により（２個のＥｃｏＲＴ部位
を含有するｐＮＥ−ｈｐｈについては、部分切断された
ＤＮＡを調製する）、Ｌｏｇの線状ＤＮＡを調製する０
次に、突出ＥｃｏＲＩ末端を、Ｅ、コリＤＮＡポリメラ
ーゼＩ入断片を用いてフィルインすることにより平滑末
端に転換する。
ｐＲＢ１０３　（７，８ｋｂ　；　Ｌ、Ｐｏ５ｔ等、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７、４２０１−４２０５（１９８０
））は、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＴ部位にクローン化さ
れたＨ５Ｖ−１（Ｆ）ＢａｍＨＩ　−Ｑ断片の形でＨ３
Ｖチミジンキナーゼ（ｔｋ）を含有し、ｔｋ遺伝子の転
写の方向がｐＢＲ３２２Ｔｅｔ遺伝子のそれと同じにな
っている（第１６図）、適当な２．５ｋｂチミジンキナ
一ゼ断片を前記プラスミドから、ＩＥｃｏＲＩによる切
断及び５ａｉｌリンカ−の付加の後に調製する。こうし
て形成された平滑末端に５ａｌＩリンカ−（ＧＧＴＣＧ
ＡＣＣ）を連結し、次にフェノール及びクロロホルムに
より逐次ＤＮＡを抽出し、そしてエタノールで沈澱せし
め、５ａｉｌで完全切断した。こうして、各選択遺伝子
を含有するｐＮＥｎｅｏ　　、ｐＮＥ−ｇｐＬ及びｐＲ
Ｂ１０３　（不所望のＤＮＡ断片から適切に分離できる
ようにＥｃｏＲＩによっても切断する）の３ｋｂ、３ｋ
ｂ、９ｋｂ及び２．５ｋｂの５ａｉｌ断片を得、ゲル電
気泳動によりさらに精製し、脱リン酸化された５ａｉ１
ベクターＤＮＡに連結した。
これはＥ、コリへのトランスフェクションの後、アンピ
シリン耐性クローンを生じさせ、これらをそれぞれｐＳ
ＶＧ−ｔＰＡ−ｎｅｏ　（９，６ｋｂ）　、ｐＳＶＧ−
ｔＰＡ−ｇｐｔ（９，２ｋｂ）　、ｐＳＶＧ−ｔＰＡ−
ｈｐｈ　（１０ｋｂ）及びｐＳＶＧｔＰＡ−ｔｋ（９，
２ｋｂ　；第１７図）、並びにｐＭＧ−ＢＦ−ｎｅ。
（８，０ｋｂ）　、ｐＭＧ−ＢＰ−ｇｐｔ　（７，６ｋ
ｂ）　、ｐＭＧ−ＢＰ−ｈｐｈ（７，６ｋｂ）及びｐＭ
ｃ−ＢＰ−ｔｋ（７，６ｋｂ）と称する（第１８図）。
ｐＮＥ−ｈｐｈからのハイガロマイシン−β耐性遺伝子
をわずかに異る方法により調製する。まずｐＮＥｈｐｈ
をＥｃｏＲＥによる部分消化によって線状化する。
フェノール及びクロロホルムによる逐次抽出並びにそれ
に続くアルコール沈澱によりＥｃｏＲＩを不活性化した
後、ＤＮＡをＢａａ＋ＨＩにより完全消化し、ＤＮＡ接
着末端をＥ、Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素）により平滑化し、ホスホリル化されたＸｈｏ
ｌリンカ−（ｃＣＴＣＧＡＧＧ）をこのＤＮＡに連結し
、これを次にｘｈｏｒｆｔ＋Ｊ１！］ｆ［素で切断し、
次にハイガロマイシン−β耐性遺伝子を含有する２ｋｂ
断片をゲル電気泳動により精製する。接着Ｘｈｏｌ末端
は５ａｌｌ末端に適合性であり、そしてｐＮＥ−ｎｅｏ
及びｐＮＥ−ｇ１）ｔについて上記したようにしてＤＮ
Ａを発現ベクターに連結してそれぞれｐｓｖｃ−ｔＰＡ
−ｈｐｈ及びｐＭＧ−ＢＰ−ｈｐｈ（７，６ｋｂ　；第
１８図）を得る。
Ｃ）　　５ＶＧ−ｔＰＡ−ｎｅｏ　　び５ＶＧ−ｔＰＡ
−ｈ　ｈの例３．　Ａ　）に概略記載したトランスフェ
クション方法を次の変更を加えて使用する。ＤＵＫＸＢ
Ｉ細胞を増殖せしめるためにα−ＭＥＭ＋ヌクレオシド
を非透析培地と共に使用し、そして形質転換体を選択す
るため１＊／ｍｌジェンチシン（ギプコ、ｐＳＶＧ−ｔ
ＰＡ−ｎｅｏ及びｐＭＧ−ＢＰ−ｎｅｏのため）又は０
．２　ｔａ；ｒ／　ｒｔｌハイグＯ’？イシンーβ（カ
ルビオチム、ｐＳＶＧ−ｔＰＡ−ｈｐｈ及びｐＭＧ−Ｂ
Ｐ−ｈｐｈのため）を用いる。分析したコロら−の内９
５％以上が、ｐｃＧＡ３１−ｄｈｆｒで形質転換された
ＣＨＯ細胞（例３．Ｇ）を参照のこと）により生産され
るのと同等のレベルでｔ−ＰＡを発現する。
Ｄ　）　　５ＶＧ−ｔＰＡ−ｔのトーンスフェクション
チミジンキナーゼーマイナスＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌｌ、３）をアメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ションから得、これを宿主として使用する。
例３．Ａ）に記載された方法に次の変更を加えてトラン
スフェクションを行う。細胞を、１０％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭ中で増殖せしめる。増殖培地にヒボキサン
チン（１５ｇ／ｍ１）、キサンチン（２５０μｇ／＠１
）及びマイコフェノール酸（カルビオケム、２ｎ／ｍ１
）を添加することによりＧＰＴ　”細胞を選択する。別
の方法として、ヒポキサンチン（１５μｇ／ｍ）、キサ
ンチン（２５０μｇ／−）及びミコフェノール酸（カル
ヒ：オチム、２μｇ／−）を含有するＭＥトα培地中で
ＧＰＴ’　Ｃ）１０−に夏（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）細
胞を選択する。フィブリンプレードア７セイ（例３．Ｂ
）により測定した場合、分析したコロニーの内９５％以
上がヒｌ−ｔ−ＰＡを発現する。
Ｅ　）　　ＭＧ−ｔＰＡ−ｔｋのトーンスフェクション
チミジンキナーゼーマイナスＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌｌ、３）をアメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ションから得、宿主として使用する。細胞を、１０％ウ
シ胎児血清を含有するＤＭＥＩ’ｌ中で増殖せしめる。
ＴＫ”細胞をＨＡＴ培地Ｃヒボキサンチン（１０−’Ｍ
）　、アミノプテリン（１０−’Ｍ）及びチミジン（４
Ｘ１０−’Ｍ）を含有するＤＭＥＭ）中で選択する。フ
ィブリンプレートアッセイにより測定する場合、分析し
たコロニーの内９５％以上がヒトｔ−ＰＡを発現する。
Ｆ）　ｌ　Ｅ−ＢＦ　　　ブースミ′の　−ンスフェク
ション トランスフェクション方法は対応するｔ−ＰＡ発現プラ
スミドのそれと同様であり、具体的にはｐＭＧ８Ｆ−ｎ
ｅｏはｐＳＶＧ−ｔＰＡ−ｎｅｏと同様であり、ｐＦＩ
Ｇ−ＢＰ−ｈｐｈはｐＳＶＧ−ｔＰＡ−ｈｐｈと同様で
あり、ｐＭＧ−ＢＦ−ｇｐｔはｐｓνＧ−ｔｐΔ−ｇｐ
ｔと同様であり、そしてｐＭＧ−ＢＦ−ｔｋ　Ｌｌ、！
、ｐｓシＧ−ｔＰＡ−ｔｋと同様である。各トランスフ
ェクションから４８コロニーを拾い上げ、２４−ウェル
ミクロタイタープレート中で増幅し、そしてコンフルエ
ンシーにおいて、例４．Ｂ）に記載したようにしてＩｇ
Ｅ−ＢＰの生産について試験する。４つの異るトランス
フェクション実験において、すべての培養物の９５％以
上が５ｎｇ／−以上のＩｇＥ−ＢＦを生産し、異る宿主
細胞タイプにおいて異る選択マーカーを用いるこのヘク
ター系が機能することが示される。
これらのプラスミドのだめの基礎は、ｐＵＮ１２１（８
，Ｎｉ１ｓｓｏｎ等、ＮｕｃＪ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
旦、　８０１９−８０３０（１９８３）　）中にクロー
ン化されたヒトウロキナーゼｃＤＮＡをコードするｃＤ
ＮＡ　（Ｄ　Ｎ　Ａ配列、Ｗ、Ｅ、Ｈｏｌｍｅｓ等、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３．９２３９２９（１９８
５）　）を含有する造成物であるｐｃＵＫ１７９（６，
３ｋｂ　；第１９図）である、　ｐｃＵＫ１７６を５ａ
ｉｌ及びＡｈａｎＩで消化し、１）　Ｎ　Ａの生ずる平
滑末端に、ホスホリル化されたＳ、ｉｃＴリンカ−を連
結し、過剰のリンカ−を５ａｃｌ制限酵素で切断するこ
とにより除去し、そしてｕ−ＰＡコード配列を含有する
２、２５ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて精
製する。１０ｕｇのｐＣＧＡ４４のＤＮＡ　（例１．Ｄ
）；第４図）を５ａｃＩにより完全切断し、線状ＤＮＡ
をゲル電気泳動により精製し、次にフェノール及びクロ
ロホルムにより抽出する。最後に、ＤＮＡをエタノール
で沈澱せしめ、ＴＥ中に再溶解し、そしてｌＯｎｇのＤ
　Ｎ　Ａを上記のｕ−ＰＴ　ＤＮＡ１１片３０ｎｇに連
結する。Ｅ、コリの形質転換の後、プラスミドｐ８１？
３ａ（１０，５ｋｂ　；第１９図）を得る。
ｐＢＲ３ａのｄｈｆｒ−発現誘導体を次の（袈にして造
成する。ｌＯｎのｐＢＲ３ａ　ＤＮＡを５ａｌＩにより
完全切断し、線状ＤＮＡを精製し、そのｌＯｎｇをｐＤ
ＨＦＲ２９１１のｄｈｆｒ−含有ＸｈｏＩ　　５ａｉｌ
断片ｌｏｎｇに連結し、次にＥ、コリに形質転換してテ
トラサ１′クリン耐性プラスミドｐＢＲ３ａ−ｄｈｆｒ
　（１２，７ｋｂ）を得る。
ｄｈｆ＋”　Ｃ）１０細胞を形質転換するため、例３６
Ａ）に記載した方法を次の変更を加えて使用する。選択
培地（透析された血清、及び場合によっては１■／ｍ／
シエンチシジン、ギブコを含み、ヌクレオシドを含まな
いＭＥＦＩ−α）を使用する。カゼイン及びフィブリン
プレートアッセイ　（例３．Ｂ）を参照のこと）により
測定した場合、分析したｄｈｆｒ”コロニーの内９５％
以上がヒトｕ−ＰＡを発現する。３ｄのラビット抗−ウ
ロキナーゼ抗体（七ロノのウロキナーゼに対して生成し
たもの）はハローの形成を阻害するが、抗−ｔ−ＰＡ血
清及び対照ラビット血清はそうでないことにより、生成
物のウロキナーゼとしての同定が確認される。蛍光法（
例３、Ｃ）を参照のこと）により測定した場合、プラス
ミノーゲン活性化因子活性は、未形質転換ＤＵＫＸＢＩ
細胞又はプラスミノーゲン活性化因子をコードしないプ
ラスミドにより形質転換された細胞の場合に比べて１０
倍以上高い。
以下仝白 鐵滋Ｊ１γ葭匝 下記の微生物が１９８７年１０月２３日に、Ｄｅｕ　ｔ
ｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）　、Ｇｒｉｓｅｂａ−ｃｈｓ
ｔｒａｓｓｅ　８＋Ｄ−３０００Ｇｏｅｔｉｎｇｅｎ（
ＦＲＧ）に寄託された。
微生物 受託番号 Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｈ８１０１／ｐｓＶ２９１１ｎｅｏ　
　　　　ＤＳＭ　４２９２Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｔｌＢ１０
１／ｐＤＨＦＲ２９１１ＤＳＭ　４２９３Ｅ、ｃｏｌｉ
　ＨＢＩＯＩ／ｐＣＧＡ２６　　　　　　　　ＤＳＭ　
４２９６Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／ｐｃＵＫ１７６　
　　　　　　ＤＳＭ　４２９０
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＤ０２の造成を模式的に示す。 第２図は、β−グロビン断片と組み合わされたｔ−ＰＡ
　ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＤＯ１０の造成を模
式的に示す。 以下余白 第３図は、ＭＣＭＶ　ＩＥプロモーターの制御のもとに
あるｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ及びβ−グロビン断片を含有す
るプラスミドｐＣＧＡ２６の造成を模式的に示す。 第４図は、ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＣＧＡ２８及びユ
ニバーサル発現プラスミドｐＣＧＡ４４　（両者ともネ
オマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドである）の
造成を模式的に示す。 第５図は、ネオマイシン耐性遺伝子及びＤＨＰＲ遺伝子
を含有するｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＣＧＡ４８の造成
を模式的に示す。 第６図は、ＳＶ４０初期プロモーターのもとにヒトｔ−
ＰＡを発現することができるプラスミドｐｃＧＡ３１、
及びさらにマウスＤＨＰＲを発現する誘導体ｐＣＧＡ３
１−ｄｈｆｒの造成を模式的に示す。 第７図は、マウス−メタロチオネイン−エンハンサ−を
伴うＳＶ４０初期プロモーターの制御のもとにＳＶ４０
の腫瘍抗原を発現することができるプラスミドｐＣＧＡ
３９の造成を模的的に示す。 第８図は、マウス−メタロチオネイン−エンハンサ−を
伴うＳＶ４０初期プロモーターの制限のもとにヒトｔ−
ＰＡを発現することができるプラスミドｐＣＧＡ４６、
及びさらにマウスＤＨＰＲを発現する誘導体ｐＣＧＡ４
６−ｄｈｆｒの造成を模式的に示す。 第９図は、ヒトＩｇＥ　ｃＤＮＡプラスミドの構造、及
びプラスミドｐＣＡＬ３の造成を模式的に示す。 第１０図は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御のもとに
ヒトＩｇＥ受容体を発現することができるプラスミドｐ
ｓＶＧ−ＥＲ、及びさらにマウスＤＩＩＦＲを発現する
誘導体ｐＳＶＧ−ＥＲ−ｄｈｆｒの造成を模式的に示す
。 第１１図は、ＳＶ４０初期プロモーターのもとにヒト１
ｇＥ結合因子を発現することができるプラスミドｐＳＶ
Ｇ−ＢＦ　、及びさらにマウスＤＨＰＲを発現する誘導
体ρ５ＶＧ−ＢＰ−ｄｈｆｒの造成を模式的に示す。 第１２図は、ＭＣＭＶ主要即時−初期プロモーターの制
御のもとにヒ）ＩｇＢ受容体を発現することができるプ
ラスミドｐＭＧ−ＥＲ１及びさらにマウスＤＨＦＲを発
現する誘導体ｐＭＧ−ＥＲ−ｄｈｆｒの造成を模式第１
３図は、？ＩＭＴＶ主要即時−初期プロモーターのもと
でヒトＩｇＥ結合因子を発現することができるプラスミ
ドｐＭＧ−ＢＦ、及びさらにマウス口ＨＦＲを発現する
誘導体ｐＭＧ−ＢＦ−ｄｈｆｒの造成を模式的に示す。 第１４図は、マウス−メタロチオネイン−エンハンサ−
を伴うＳＶ４０初期プロモーターの制御のもとにそれぞ
れヒ）ＩｇＥ受容体及びＩｇＥ結合因子を発現すること
ができるプラスミドｐＳＶＭＴＧ−ＥＲ及びｐＳＶＭＴ
Ｇ−ＢＰ　、並びにさらにマウスＤＨＰＲを発現するこ
れらの誘導体ｐＳＶＭＴＧ−ＥＲ−ｄｈｆｒ及びｐＳＶ
ＭＴＧ−ＢＰ−ｄｈｆｒの造成を模式的に示す。 第１５図は、エンハンサ−活性を欠＜　ＳＶ４０初期プ
ロモーターを含有する発現ベクターであるプラスミドｐ
ＮＥ　、並びに選択遺伝子のコード配列の供与体プラス
ミドであるｐＳＶ２ｎｅｏ　、　ｐｓＶ２ｇｐｔ及びｐ
Ｋｃ２１４の構造を模式的に示す。 第１６図は、エンハンサ−活性を伴わない選択遺伝子を
便利に切り出すことができるプラスミドｐＮＥ−ｎｅｏ
　　、　ｐＮＥ−ｇｐｔ　　、　ｐＮＥ−ｈｐｈ及びｐ
ＭＫの構造を模式的に示す。 以下余白 第１７図は、異る選択遺伝子を含有するｔ−ＰＡ発現プ
ラスミドであるｐＳνＱ−ｔＰＡ−ｎｅｏ　、　ｐＳＶ
Ｇ−ｔＰＡ−ｇｐｔ。 ｐＳＶＧ−ｔＰＡ−ｈｐｈ及びｐＳＶＧ−ｔＰＡ−ｔｋ
　（７）構造を模式的に示す。 第１８図は、異る選択遺伝子を有用するＩｇＥ結合因子
発現プラスミドｐＭＧ−ＢＰ−ｎｅｏ　、　ｐＭＧ−Ｂ
Ｐ−ｇ１）ｔ。 ｐＦＩｃ−Ｂｐ−ｈｐｈ及びｐＭＧ−ＢＰ−Ｌｋの構造
を模式的に示す。 第１９図は、ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性
化囚子（ｕ−ＰＡ）を発現することができるｎｅｏ”プ
ラスミドｐ８Ｒ３ａ　、及びさらにマウスＤＨＦＩ？を
発現する誘導体ｐＢＲ３ａ−ｄｈｆｒの造成を模式的に
示す。 図中の記号は次の意味を有する。 ＡＭＰ、Ａｍｐ”　　　　アンピシリン耐性遺伝子（β
ラクタマーゼ） ＴＥＴ、Ｔｅｔ”　　　　テトラサイタリン耐性遺伝子
スフェラーセ ＢＲｏｒｉ ＳＶ４０ｅｎｈ、５Ｖ４０Ｅ ＡＰ ＰＬＤ ＰＬＡ ＡＰ ＩＰ プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点 ７２ｐｂエンハンサ−１ＳＶ４０初朋プロモーターの部
分 真核性ｍＲＮＡの５　’　ｍ７Ｇｐ 部位 ｃａｐ　’の スプライスドナ一部位、インド ロンの５′末端 スプライスアクセプク一部位、 イントロンの３′末端 細菌アルカリ性ホスファターゼ ウシ腸ホスファターゼ （Ｂａｇ）ＩＩ／Ｂｇｌ　Ｉ［） ｚ＜ｙ Ｇ／Ｃ−ｔａ　ｉ　１ Ｂａｓ＋ＨＩ及びＢｇ１１１部位からの５ａｕ３ａｙか
ら時計方向に位置する制限 酵素部位Ｘ プロモーター Ｇ及びＣ残基のホモポリマー

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、組換ＤＮＡ分子であって、一連の機能的要素： （ａ）エンハンサー／プロモーターユニット； （ｂ）前記ユニットが作用可能に連結されているＤＮＡ
    セグメントであって、所望の蛋白質生成物のためのコー
    ド能力を有しそしてポリアデニレーションのため及び細
    胞質への効率的な輸送のためのシグナルを含んで成るｍ
    ＲＮＡに転換され得るＤＮＡセグメント；及び （ｃ）前記ＤＮＡセグメントに続くＤＮＡセグメントで
    あって、プロモーターユニット（ｃ１）、及び該プロモ
    ーターユニット（ｃ１）が作用可能に連結されているＤ
    ＮＡサブセグメント（ｃ２）であって選択マーカー遺伝
    子のｍＲＮＡに転写され得るもの、から成るＤＮＡセグ
    メント； をこの順序で含んで成り、前記プロモーターユニット（
    ｃ１）は機能的エンハンサーを欠いているが、しかし（
    ａ）と（ｃ１）との間にエンハンサー終止ＤＮＡ配列が
    存在しないために（ａ）中に位置する前記エンハンサー
    により刺激されることができることを特徴とする、前記
    組換ＤＮＡ分子。 ２、前記ユニット（ｃ２）が、抗生物質耐性蛋白質、細
    胞性栄養要求性を抑制する酵素、又は着色物質を無色の
    基質からもしくは異る色を有する基質から生産すること
    ができる酵素、の群から採用される容易に同定され得る
    マーカー蛋白質をコードしている、特許請求の範囲第１
    項に記載のＤＮＡ分子。 ３、前記ＤＮＡサブセグメント（ｃ２）が原核生物由来
    のものである、特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分
    子。 ４、前記ＤＮＡサブセグメント（ｃ２）が真核生物由来
    のものである、特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分
    子。 ５、前記プロモーター／エンハンサー要素（ａ）に先行
    してエンハンサー終止配列が存在している、特許請求の
    範囲第３項に記載のＤＮＡ分子。 ６、前記エンハンサー終止配列が原核生物由来のＤＮＡ
    から成る、特許請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ分子。 ７、前記プロモーター／エンハンサー要素（ａ）に先行
    してエンハンサー終止ＤＮＡ配列が存在し、そしてＤＮ
    Ａセグメント（ｃ）に続いてエンハンサー終止ＤＮＡ配
    列が存在する、特許請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ分
    子。 ８、前記複数のエンハンサー終止配列が原核生物由来の
    ＤＮＡから成る、特許請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ
    分子。 ９、前記マーカー遺伝子（ｃ２）が酵素ジヒドロフォレ
    ート・レダクターゼをコードしている、特許請求の範囲
    第１項に記載のＤＮＡ分子。 １０、前記ユニット（ｂ）のＤＮＡ配列が、血清蛋白質
    、ポリペプチドホルモン、ホルモン受容体、リンホカイ
    ン、インターフェロン、酵素、酵素阻害剤、鎮痛性ポリ
    ペプチド、糖蛋白質、免疫グロブリン、免疫グロブリン
    −結合性蛋白質、抗原性蛋白質、ワクチン蛋白質、プラ
    スミノーゲン活性化因子、又は前記所望の蛋白質への前
    駆体から成る群から選択された所望の蛋白質をコードす
    る、特許請求の範囲第１項に記載の組換ＤＮＡ分子。 １１、前記プロモーター／エンハンサー（ａ）が、アク
    チン遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、他の細胞性遺伝
    子、ＳＶ４０初期遺伝子、ヘルペスウィルス遺伝子、ヒ
    トサイトメガロウイルス主要即時初期遺伝子、マウスサ
    イトメガロウイルス主要即時初期遺伝子、及び他のウィ
    ルス遺伝子から成る群から選択された遺伝子からのプロ
    モーター及びエンハンサーを含んで成る、特許請求の範
    囲第１項に記載の組換ＤＮＡ分子。 １２、前記プロモーター（ｃ１）が、ＳＶ４０初期遺伝
    子、主要後期アデノウィルス遺伝子、ヘルペスチミジン
    キナーゼ遺伝子、ヒトサイトメガロウイルス主要即時−
    初期遺伝子、マウスサイトメガロウイルス主要即時初期
    遺伝子、細胞性遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子から
    成る群から選択された遺伝子からのフロモーターである
    か又はプロモーター断片を含んで成る、特許請求の範囲
    第１項に記載の組成ＤＮＡ分子。 １３、組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主であっ
    て、該組換ＤＮＡ分子が、一連の機能的要素： （ａ）エンハンサー／プロモーターユニット； （ｂ）前記ユニットが作用可能に連結されているＤＮＡ
    セグメントであって、所望の蛋白質生成物のためのコー
    ド能力を有しそしてポリアデニレーションのため及び細
    胞質への効率的な輸送のためのシグナルを含んで成るｍ
    ＲＮＡに転換され得るＤＮＡセグメント；及び （ｃ）前記ＤＮＡセグメントに続くＤＮＡセグメントで
    あって、プロモーターユニット（ｃ１）、及び該フロモ
    ーターユニット（ｃ１）が作用可能に連結されているＤ
    ＮＡサブセグメント（ｃ２）であって選択マーカー遺伝
    子のｍＲＮＡに転写され得るもの、から成るＤＮＡセグ
    メント； をこの順序で含んで成り、前記プロモーターユニット（
    ｃ１）は機能的エンハンサーを欠いているが、しかし（
    ａ）と（ｃ１）との間にエンハンサー終止ＤＮＡ配列が
    存在しないために（ａ）中に位置する前記エンハンサー
    により刺激されることができることを特徴とする、前記
    形質転換された宿主。 １４、前記宿主が、Ｅ．コリ（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）、他
    の細菌、酵母、糸状菌、緑色植物及び動物細胞から成る
    群から選択されたものである、特許請求の範囲第１３項
    に記載の宿主。 １５、前記宿主がチャイニーズハムスター卵巣セルライ
    ンである、特許請求の範囲第１３項に記載の宿主。 １６、前記宿主が酵素ジヒドロフォレート・レダクター
    ゼを欠いている、特許請求の範囲第１３項に記載の宿主
    。 １７、所望の蛋白質を製造する方法であって、一連の機
    能的要素； （ａ）エンハンサー／プロモーターユニット； （ｂ）前記ユニットが作用可能に連結されているＤＮＡ
    セグメントであって、所望の蛋白質生成物のためのコー
    ド能力を有しそしてポリアデニレーションのため及び細
    胞質への効率的な輸送のためのシグナルを含んで成るｍ
    ＲＮＡに転換され得るＤＮＡセグメント：及び （ｃ）前記ＤＮＡセグメントに続くＤＮＡセグメントで
    あって、プロモーターユニット（ｃ１）、及び該プロモ
    ーターユニット（ｃ１）が作用可能に連結されているＤ
    ＮＡサブセグメント（ｃ２）であって選択マーカー遺伝
    子のｍＲＮＡに転写され得るもの、から成るＤＮＡセグ
    メント； をこの順序で含んで成り、前記プロモーターユニット（
    ｃ１）は機能的エンハンサーを欠いているが、しかし（
    ａ）と（ｃ１）との間にエンハンサー終止ＤＮＡ配列が
    存在しないために（ａ）中に位置する前記エンハンサー
    により刺激されることができることを特徴とする、前記
    組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培養し、そ
    して該蛋白質を単離することを特徴とする方法。 １８、形質転換された宿主細胞の混合クローンを培養す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の方
    法。
JP62306017A 1986-12-05 1987-12-04 発現ベクター Pending JPH029368A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB868629153A GB8629153D0 (en) 1986-12-05 1986-12-05 Hybrid proteins
GB8629153 1986-12-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH029368A true JPH029368A (ja) 1990-01-12

Family

ID=10608539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62306017A Pending JPH029368A (ja) 1986-12-05 1987-12-04 発現ベクター

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0271003A3 (ja)
JP (1) JPH029368A (ja)
KR (1) KR880007731A (ja)
CA (1) CA1310601C (ja)
DK (1) DK638087A (ja)
GB (2) GB8629153D0 (ja)
IE (1) IE873300L (ja)
PT (1) PT86275B (ja)
ZA (2) ZA879121B (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05503015A (ja) * 1990-02-28 1993-05-27 シェリング・コーポレーション 哺乳類発現ベクター
JP2009079716A (ja) * 2007-09-26 2009-04-16 Jatco Ltd 自動変速機の変速制御装置
US9604349B2 (en) 2008-01-17 2017-03-28 Wagic, Inc. Universal ratcheting tool
US9676083B2 (en) 2009-10-05 2017-06-13 Wagic, Inc. Dual purpose flip-out and T handle
US9701005B2 (en) 2008-01-17 2017-07-11 Wagic, Inc. Biaxial foldout tool with multiple tools on a side and a rotational stop

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5204255A (en) * 1986-01-31 1993-04-20 Sagami Chemical Research Center Hybrid tissue plasminogen activator/urokinase polypeptides
AU692152B2 (en) * 1993-03-17 1998-06-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
WO1994024296A2 (en) * 1993-04-19 1994-10-27 University Of Saskatchewan Recombinant bovine herpesvirus type 1 vaccines

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3688418T2 (de) * 1985-02-13 1993-08-26 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
AU582288B2 (en) * 1986-03-07 1989-03-16 Damon Biotech Inc. Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05503015A (ja) * 1990-02-28 1993-05-27 シェリング・コーポレーション 哺乳類発現ベクター
JP2009079716A (ja) * 2007-09-26 2009-04-16 Jatco Ltd 自動変速機の変速制御装置
US9604349B2 (en) 2008-01-17 2017-03-28 Wagic, Inc. Universal ratcheting tool
US9701005B2 (en) 2008-01-17 2017-07-11 Wagic, Inc. Biaxial foldout tool with multiple tools on a side and a rotational stop
US9676083B2 (en) 2009-10-05 2017-06-13 Wagic, Inc. Dual purpose flip-out and T handle
US10343273B2 (en) 2009-10-05 2019-07-09 Wagic, Inc. Dual purpose flip-out and T handle

Also Published As

Publication number Publication date
EP0271003A2 (en) 1988-06-15
GB8701160D0 (en) 1987-02-25
DK638087D0 (da) 1987-12-04
CA1310601C (en) 1992-11-24
GB8629153D0 (en) 1987-01-14
ZA879121B (en) 1988-06-06
PT86275A (en) 1988-01-01
IE873300L (en) 1988-06-05
ZA879118B (en) 1988-06-06
EP0271003A3 (en) 1989-10-11
KR880007731A (ko) 1988-08-29
PT86275B (pt) 1990-11-07
DK638087A (da) 1988-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5122458A (en) Use of a bgh gdna polyadenylation signal in expression of non-bgh polypeptides in higher eukaryotic cells
EP0117058B1 (en) Methods for producing mature protein in vertebrate host cells
US4663281A (en) Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells
US4727028A (en) Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US5024939A (en) Transient expression system for producing recombinant protein
US5464758A (en) Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US7001733B1 (en) Methods and compositions for screening for modulations of IgE synthesis, secretion and switch rearrangement
EP0068740B1 (en) Recombinant dna cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
EP0260148A2 (en) Improved recombinant expression method, vector and transformed cells
CA2071543C (en) Recombinant dna method and vectors for use therein
JPH0866190A (ja) 哺乳動物の誘導性プロモーターカスケード系
EP0118393A2 (en) Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products
US4965196A (en) Polycistronic expression vector construction
JP2641875B2 (ja) ハイブリッドタンパク質
JPH08308576A (ja) ターゲット遺伝子を捕捉するための新規ベクター及びその使用
JPH029368A (ja) 発現ベクター
JPH05503015A (ja) 哺乳類発現ベクター
JP2574142B2 (ja) 組換えリシン毒素フラグメント
US7566685B2 (en) Methods and compositions for screening using diphtheria toxin constructs
IE920576A1 (en) Improved yeast vectors
US20030232414A1 (en) Hybrid vector having a cytomegalovirus enhancer and myeloproliferative sarcoma virus promoter
US5747308A (en) Recombinant DNA method
EP0266057A2 (en) Plasmid containing an eucaryotic secretory signal sequence and process for secreting encoded proteins
US5554510A (en) Regulation of gene expression
US5646010A (en) Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products