JP2693361B2 - 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 - Google Patents
組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法Info
- Publication number
- JP2693361B2 JP2693361B2 JP5256173A JP25617393A JP2693361B2 JP 2693361 B2 JP2693361 B2 JP 2693361B2 JP 5256173 A JP5256173 A JP 5256173A JP 25617393 A JP25617393 A JP 25617393A JP 2693361 B2 JP2693361 B2 JP 2693361B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- dna
- cells
- fragment
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は真核細胞による興味ある
蛋白質の産生に関する。特に、蛋白質および選択しうる
マーカーをコードする遺伝子で形質転換された真核細胞
培養物から分泌された商業的に有用な蛋白質を高収量で
得ることに関し、より詳細には蛋白質の発現を高める補
助ＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ＤＮＡ）と関連させて
蛋白質をコードする遺伝子を含有する形質転換用ベクタ
ーに関する。 【０００２】 【従来の技術】次の定義は本発明の理解を容易にするた
めに提供される。当技術分野で流通している意味から少
しはずれた程度にまで下記の定義は及ぶべきである。増
幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は細胞がそれらの染
色体ＤＮＡ内で遺伝子複製を生ずる過程を意味する。同
時形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は細
胞にとって異質の１つ以上の外来性遺伝子（そのうちの
１つは選択しうる表現型を細胞に付与する）で細胞を形
質転換する過程を意味する。下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａ
ｍ）はヌクレオチド配列の３′末端の方へ行く方向を意
味する。促進因子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は遺伝子の本
性、遺伝子に対するそのヌクレオチド配列の位置または
その配列の方向性とは無関係に遺伝子の転写を増強する
ことができるヌクレオチド配列のことである。遺伝子は
目的の成熟蛋白質をコードするデオキシリボヌクレオチ
ド配列である。本明細書においては、遺伝子はＲＮＡ転
写開始信号、ポリアデニレーション付加部位、プロモー
ターまたは促進因子のような翻訳されない側面領域（ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含まないだろう。 【０００３】選択遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｇｅｎ
ｅ）は検出できる蛋白質として遺伝子を発現する細胞に
表現型を付与する遺伝子のことである。選択因子（ｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）は選択遺伝子の発現を検
出可能にする条件または物質である。表現型（ｐｈｅｎ
ｏｔｙｐｅ）は細胞の遺伝子型により発現した細胞の観
察しうる諸性質を意味する。生産物遺伝子（ｐｒｏｄｕ
ｃｔ ｇｅｎｅ）は診断上または治療上有用であるよう
な望ましい特性を有する蛋白質産物をコードする遺伝子
のことである。遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）は表現型
として観察されるその発現に対立するものとして細胞内
に包含される遺伝情報を意味する。結合（ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ）は２つのＤＮＡ鎖の５′末端と３′末端との間に
ホスホジエステル結合を形成する過程を意味する。これ
はＴ４ＤＮＡリガーゼによる平滑末端の結合を含むいく
つかのよく知られた酵素的操作により達成される。 【０００４】方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）はＤＮ
Ａ配列におけるヌクレオチドの順序を意味する。ＤＮＡ
配列の反対の方向性は、他の配列に関してその配列の
５′−３′順序が、その配列が得られたＤＮＡの基準的
に比較した場合反対になっているものである。この種の
基準点にはＤＮＡ源における他の特定のＤＮＡ配列の転
写方向またはその配列を含む複製可能なベクターの複製
開始点が含まれる。転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ）はＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を意味する。形質
転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は細胞が外来性
ＤＮＡを取り込むことにより細胞の遺伝子型を変化させ
ることを意味する。形質転換は一時的であるかまたは安
定であって、いくつかの場合には細胞の表現型の変化に
より検出できる形質転換された細胞は形質転換体と呼ば
れる。前形質転換細胞は母細胞と称される。 【０００５】翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）はメッセ
ンジャーＲＮＡからのポリぺプチドの合成を意味する。
真核細胞へのＤＮＡの導入は一般によく知られた方法で
あり、各種の標準方法により達成することができる。こ
れらにはプロトプラスト融合、ＤＮＡの微小注射、染色
体トランスフェクション、溶菌および非溶菌ウイルスベ
クター〔例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの“Ｎａｔｕｒ
ｅ”（ロンドン）２７７：１０８〜１１４（１９７
９）〕、細胞−細胞融合〔Ｆｏｕｒｎｉｅｒらの“Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．”７４：３１９〜３
２３（１９７７）〕、脂質構造（米国特許第４３９４４
４８号）およびＤＮＡ沈殿物の細胞エンドサイトーシス
〔Ｂａｃｈｅｔｔｉらの“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．”７４：１５９０〜１５９４（１９７
７）〕の使用が含まれる。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】細胞は一時的にＤＮＡ
を取り込むことができるか、またはそのＤＮＡは取り込
まれて諸条件に応じて安定な細胞系列を産生することが
できる。安定な細胞系列を得るための１つの方法は、目
的の蛋白質遺伝子を含むＤＮＡとともに選択遺伝子を挿
入し、そしてその細胞系列を選択圧力下に保持すること
である。いずれにしても、形質転換された細胞からの蛋
白質の発現を高める方法を見つけることが望ましい。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は真核細胞内での
異種蛋白質の発現を高める手段を提供する。本発明によ
れば、真核細胞内で異種蛋白質の発現を高める方法は、
真核細胞内に異種の非ウイルス性蛋白質をコードするＤ
ＮＡおよび補助ＤＮＡを導入し、そしてその細胞を培養
して前記蛋白質を発現させることから成っている。本発
明はまた異種の非ウイルス性蛋白質を発現させるべく真
核細胞内で使用するための補助ＤＮＡを含む形質転換用
ベクターを提供することである。好適な実施態様におい
ては、増幅しうる選択可能な表現型を発現する遺伝子が
真核細胞内に導入されて、目的の異種蛋白質をコードす
る導入ＤＮＡおよび補助ＤＮＡの増幅が促進される。 【０００８】本発明によれば、補助ＤＮＡおよび目的の
蛋白質をコードするＤＮＡ（すなわち生産物遺伝子）が
真核細胞内に導入される。補助ＤＮＡは意図する蛋白質
の発現を高める。例えば、補助ＤＮＡは転写または翻訳
の効率を増加させるか、または目的の蛋白質の発現を高
めるための他の作用をもつことができる。本発明によれ
ば、補助ＤＮＡは形質転換用ベクター系の一部分であ
る。それは目的の異種蛋白質をコードするＤＮＡの導入
前に、導入と同時に、あるいは導入後に細胞内に導入さ
れる。補助ＤＮＡは形質転換された細胞系列により合成
される生産物の安定性を改善し、その細胞系列内に導入
された外来性遺伝子の増幅を高め、また転写もしくは翻
訳の効率を増すＤＮＡである。補助ＤＮＡは母細胞によ
り認識される諸機能を含む。こうして、補助ＤＮＡは形
質転換において以前に用いられた単なるキャリヤーＤＮ
Ａまたは崇高ＤＮＡ以上のものである。 【０００９】補助ＤＮＡの１つの部類は翻訳活性化因子
をコードするＤＮＡからなる。翻訳活性化遺伝子は蛋白
質、または翻訳の効率を高めるように生産物のためのメ
ッセンジャーＲＮＡと相互に作用する短い非翻訳ＲＮＡ
産物を生ずる。１つの例はウイルスに関係のある（Ｖ
Ａ）ＲＮＡをコードするアデノウイルスＤＮＡである
〔Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａらの“Ｃｅｌｌ”３１：５４
３〜５５１（１９８１）〕。このＤＮＡは小型の非翻訳
ＲＮＡの２つの物質（ＶＡ１およびＶＡ２）を生産す
る。ＶＡ ＤＮＡのＲＮＡ産物は目下のところ不確かな
方法でアデノウイルスの主後期プロモーター（ｍａｊｏ
ｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の３部分リーダー配
列と関係して、そのリーダー配列を含むｍＲＮＡからの
翻訳を高めると考えられる。ＶＡ ＲＮＡはまた他の初
期アデノウイルスｍＲＮＡの翻訳可能性を高める〔Ｓｖ
ｅｎｓｓｏｎおよびＡｋｕｓｊａｒｕの“ＭｏＩ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏ．”４：７３６〜７４２（１９８４）〕。
ＶＡ１またはＶＡ２ ＤＮＡはよく知られている。それ
は、そのプロモーターとともに、連鎖ベクター内に（好
ましくは生産物遺伝子のプロモーターから上流またはポ
リアデニレーション部位から下流に）直接結合される
か、あるいは生産物遺伝子または選択遺伝子へ結合され
ないままでトランスフェクトされてもよい。ＶＡ ＲＮ
Ａにより高められた翻訳は、後期アデノウイルスｍＲＮ
Ａの３部分リーダー構造がそのｍＲＮＡに存在する場
合、最も劇的である。 【００１０】補助ＤＮＡのもう１つの部類は母細胞から
の真核細胞ゲノム性ＤＮＡを含む。このＤＮＡは複製開
始点またはＤＮＡの安定性を促進する配列を含むと考え
られるが、この種のＤＮＡの有益な作用をうながすその
メカニズムは知られていない。このＤＮＡは細胞系列の
ゲノム性ＤＮＡをランダムに切断するかまたはエンドヌ
クレアーゼで消化することにより得ることができる。ゲ
ノム性補助ＤＮＡは大きさが約５０〜５０００塩基対の
断片からなるべきである。これらの断片はその後形質転
換用ベクターのプロモーターから上流（好ましくはいず
れの促進因子からも上流）またはポリアデニレーション
部位から下流の利用しうる制限部位で結合させる。こう
してこれらのベクターは形質転換に適するものとなり、
この後形質転換体は１つまたはそれ以上の望ましい特性
（例えば、形質転換体の段階的培養後の生産物合成の安
定性および／または生産物の高収量）について選別され
る。 【００１１】形質転換体からの生産物の収量は、トラン
ス−作働性転写活性化因子と名づけた１部類の補助ＤＮ
Ａで細胞を形質転換することにより改善できる。この種
のＤＮＡは転写を刺激する蛋白質または蛋白質誘導体を
コードする。転写活性化因子の１つの部類はそれらが無
限の連続した子孫形成を可能にするので不滅性遺伝子と
称され、この種の遺伝子を含む細胞は所定の数の分裂も
死滅しない。これらの活性化因子は転写速度を増すため
に生産物遺伝子と同じＤＮＡ鎖内に結合される必要はな
く、この点においてこれらは促進因子と異なる〔Ｉｍｐ
ｅｒｉａｌｅらの“Ｃｅｌｌ”３５：１２７〜１３６
（１９８３）、Ｇｒｅｅｎらの“Ｃｅｌｌ”３５：１３
７〜１４８（１９８３）〕。本発明で用いる数種のトラ
ンス−作働性転写活性化因子はそれら自体既知であって
クローン化されている。最も広く研究された例にはヒト
Ｃ−ｍｙｃ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、ポリオーマ大型Ｔ抗
原およびアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子が含まれる。 【００１２】使用することができる生産物遺伝子は本質
的に無限である。蛋白質をコードする遺伝子、または酵
素転化のような蛋白質に基づいた反応により作ることが
できる物質をコードする遺伝子が適当である。毒素を合
成するかまたは宿主蛋白質を加水分解することによって
宿主細胞に悪影響を与える蛋白質（例えば原核細胞また
は下等な真核細胞源からのいくつかの酵素）をコードす
る遺伝子は、例えば抗毒素を培地に加えるかまたは最適
と思われるより低い発現レベルを選択するなどの制限を
加えて使用することができる。活性を示す蛋白質または
酵素の遺伝子は、哺乳動物または脊推動物などの高等動
物の細胞内に見出される。大抵の治療用蛋白質をコード
する興味ある遺伝子はこの部類に属するだろう。生産物
遺伝子の例は、血液凝固性または線維素溶解性蛋白質
（例えば抗血友病性因子、組織プラスミノゲン活性化因
子、ウロキナーゼおよび凝血因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、
ＸまたはＸＩＩＩ）、血液蛋白質（例えばフイブロネク
チンまたはアルブミン）、プロテアーゼ阻害因子（例え
ば抗トロンビンＩＩＩ、アルファー１−抗トリプシンお
よび２マクログロブリン）、ホルモンまたは調節蛋白質
（例えばエリスロポエチンおよび他のＴ−細胞活性物質
などのリンフォカイン、成長ホルモンおよび血小板誘導
成長因子）、腫瘍遺伝子産物、細胞表面抗原、免疫蛋白
質（例えばＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）および補体、
ならびに他の商業上興味ある蛋白質をコードする遺伝子
である。 【００１３】形質転換用ベクター 本発明による形質転換に用いるベクターは一般に補助Ｄ
ＮＡと生産物遺伝子とを含むだろう。さらに、形質転換
用ベクターには通常促進因子、プロモーター、イントロ
ン、ポリアデニレーション部位および以下で述べる３′
非コード領域などの他の要素が存在するだろう。選択遺
伝子を用いる場合、それはベクター内の生産物遺伝子へ
結合されるか、またはその生産物遺伝子を含むベクター
と同時形質転換される別のベクター内に存在することが
できる。選択遺伝子は３つのカテゴリー：検出可能に増
幅される選択遺伝子、優性の選択遺伝子、および検出可
能に増幅される優性選択遺伝子に区分される。 【００１４】検出可能に増幅される選択遺伝子は、宿主
細胞を選択因子へさらすことにより増幅を検出し得るも
のである。検出可能に増幅される非優性遺伝子は一般に
遺伝子型として選択遺伝子を欠く母細胞系列を必要とす
る。例としてはアスパラギンシンセターゼ；アスパラギ
ン酸トランスカルバミラーゼ〔Ｋｅｍｐらの“Ｃｅｌ
ｌ”９：５４１（１９７６）〕；アデニル酸デアミナー
ゼ〔ＤｅＢａｔｉｓｓｅらの“Ｍｏｌ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．”２（１１）：１３４６〜１３５３（１
９８２）〕；アデノシンデアミナーゼ〔Ｙｅｕｎｇらの
Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５８：１５１８５（１９８３）〕；マウ
スジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびマウス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）（欠損プロモーターをもつ）
をコードする遺伝子類が含まれる。優性の選択遺伝子は
母細胞の遺伝子型にかかわらず形質転換体において発現
されるものである。大抵の優性選択遺伝子は検出可能に
増幅されない。というのはその表現型が選択因子を処理
するのに非常に効果的であるので、その遺伝子を増幅し
た細胞系列と増幅しなかった細胞系列とに識別するのが
困難であるからである。この型の優性選択遺伝子の例は
キサンチン−グアニン ホスホリボキシルトランスフェ
ラーゼ〔Ｍｕｌｌｉｇａｎらの“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．”７８（４）：２０７２〜２０７６
（１９８１）〕およびアミノグリコシド３′−ホスホト
ランスフェラーゼ〔Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら
の“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”１５０：１〜１４（１９
８１）〕などの原核動物の酵素をコードする遺伝子類で
ある。 【００１５】いくつかの優性選択遺伝子はまた検出可能
に増幅される。適当な例にはＨａｂｅｒらの“Ｓｏｍａ
ｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ”４：４９９〜５０８
（１９８２）に記載された突然変異ＤＨＦＲ遺伝子、Ｈ
ＬＡ抗原のような細胞表面マーカー、および当技術分野
で知られた蛍光原または色素原基質から蛍光産物または
着色産物を生ずる酵素（例えば特異なエステラーゼ類）
をコードする遺伝子が含まれる。本発明においては検出
可能に増幅される優性の選択遺伝子を使用するのが好ま
しい。いくつかの場合の優性選択遺伝子は、その遺伝子
内での適当な突然変異によって、検出可能に増幅される
遺伝子に転化できると理解すべきである。 【００１６】選択因子は選択遺伝子の不存在下で細胞増
殖を抑制するものであるのが好ましい。こうして、選択
遺伝子（および恐らくは生産物遺伝子）を欠くか、また
はその選択遺伝子をもはや発現しない長期培養の復帰突
然変異細胞はその集団を増殖し過ぎることがないだろ
う。しかしながら、治療目的のための蛋白質産物の商業
的生産においては、細胞毒素の使用を避けてその産物の
精製工程を簡単にすることが望ましいだろう。それ故、
望ましい選択遺伝子は、形質転換体が選択遺伝子を欠く
場合に用いることのできない増殖にとって不可欠な栄養
素を形質転換体に使用させ得るものであるだろう。１つ
の例としては先に述べたＴＫ遺伝子がある。 【００１７】選択遺伝子はまた生産物遺伝子であり得る
ことに留意すべきである。例えば、治療剤または診断剤
として使用するための選択遺伝子の生産物を収穫するこ
とが望まれる。生産物遺伝子は、もし形質転換体の環境
が変更されてその生産物が形質転換体にいくつかの選択
利益を付与することができるならば、選択遺伝子として
機能することができるようになるだろう。例えば、生産
物遺伝子は細胞培地中の他の方法では使用できない不可
欠な基質に作用してその不可欠な基質（例えば必須栄養
素）を放出させる酵素を産生することができる。ここで
用いる選択遺伝子および生産物遺伝子はそれらの野性型
の翻訳されない側面配列の全てまたは一部分を同伴して
もよいが、通常この種の配列は以下で述べるように同伴
されないだろう。連鎖ベクターの場合に、生産物収量の
特に有益な結果は選択遺伝子の翻訳領域から上流でかつ
この領域に接近して生産物遺伝子を位置させることによ
り得られる。このことは一般に野性型生産物遺伝子から
下流に見出される３′非翻訳領域および野性型選択遺伝
子から上流に見出される５′非翻訳領域の全部でないと
しても大部分が適当な制限エンドヌクレアーゼによって
切断されるか、あるいは本明細書の他の処で示すＭ１３
でのオリゴヌクレオチドプライミングを経る欠失によっ
て切断されることを意味している。その結果、両方の遺
伝子は生産物遺伝子と選択遺伝子との間にプロモーター
が挿入されることなく直接結合される。 【００１８】ここで用いる遺伝子は一般に成熟生産物の
構造、安定性および／または分泌にとって望ましいプレ
プロ−ポリぺプチド（例えば分泌リーダー）をコードす
る野性型翻訳配列を含むだろう。しかしながら、野性型
の翻訳リーダー配列が形質転換体内で適切に作用しない
場合には、この種のプレプロ配列はベクターへの組み込
みおよびその後の宿主細胞の同時形質転換以前に欠失さ
れるか、またはベクター内で適切に作用する他のプレプ
ロ配列によって置換されてもよい。一般に、ベクターま
たはベクター内に含まれる遺伝子がイントロンで中断さ
れることは、ベクターからのメッセンジャーＲＮＡ転写
物が形質転換体によって適切に切り出されて成熟蛋白質
および目的のリーダー配列へ翻訳されるメッセンジャー
ＲＮＡを生ずる限り、重要なことでない。これは他の高
等真核細胞によりプロセシングされるはずの所定の高等
真核細胞の遺伝子に見出されるイントロンの場合である
だろう。ここで用いる大部分の遺伝子はｃＤＮＡ逆転写
物であるのでイントロンは全く存在せず、まちがった転
写後切り出し（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）の可能性は相当減少するだろ
う。 【００１９】連鎖ベクターの場合、選択遺伝子および生
産物遺伝子のためのコード鎖は生産物遺伝子の停止コド
ンを選択遺伝子の開始コドンへ直接結合することによっ
て接合されるのが好ましい。これとは別に、これらの両
遺伝子はグアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）およ
びシトシンデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）に富むオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド橋を介して結合される。こ
の橋はＲＮＡヘアピンループの形成可能性を減ずるため
に、終止コドンおよび開示コドン、ならびにパリンドロ
ーム構造（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｅ）を含まない方がよ
い。“生産物遺伝子”および“選択遺伝子”という用語
は、ただ１個の各遺伝子または単一の各遺伝子コピーの
みがベクター内で使用されるということを意味するもの
ではない。第一に、所定の選択表現型は１つ以上の別個
の蛋白質の合成を必要とするかも知れない。この場合、
例えば各蛋白質の選択遺伝子は生産物遺伝子または他の
どの選択遺伝子にも共有結合で結合されないベクター内
に存在するだろう。また各選択遺伝子は先に述べたごと
くまたは米国特許第４３９９２１６号に記載されるごと
く生産物遺伝子へ結合されるだろう。各選択遺伝子が他
のとの選択遺伝子とも無関係に同じ選択因子のための選
択表現型を与える場合、１個以上の選択遺伝子を使用す
ることは好ましくないだろう。 【００２０】別個の生産物遺伝子を複数含む１つまたは
それ以上のベクターを用いて形質転換するのが望ましい
かも知れない。互いに有益な作用をもつ蛋白質をコード
する別個の生産物遺伝子は特に興味をもたれる。例え
ば、他の蛋白質産物を安定化する蛋白質、または生物学
的に活性な作用をもつ多重蛋白質系の一部をなす蛋白質
を同時発現させることができる。さらに、選択遺伝子お
よび生産物遺伝子のいずれか一方または両方は１つまた
はそれ以上のベクター内で反復されてもよく、すなわち
多重の、一般にはタンデム（直列）のコピーで存在し得
る。このような場合に、反復された遺伝子は各々ただ１
個の遺伝子コピーのみを含むベクター内に存在するＲＮ
Ａプロセシングおよび転写制御配列の全てを含むのが有
利である。 【００２１】ベクターはまた促進因子を含むことができ
る。促進因子はプロモーターと機能的に異なるが、プロ
モーターと協力して作働すると思われる。細胞レベルで
のそれらの機能は十分理解されていないが、それらの特
異な性質は位置や方向性に関係なく転写を活性化させま
た増強させるその能力にある。プロモーターは遺伝子の
上流に存在する必要があり、一方促進因子はプロモータ
ーから上流すなわち５′方向に、イントロンとして遺伝
子内に、または遺伝子とポリアデニレーション部位との
間の遺伝子から下流すなわちポリアデニレーション部位
から３′方向に存在していてもよい。逆転プロモーター
は機能的でないが、逆転促進因子は機能的である。促進
因子はシス−作働性である、すなわちそれらが同一ＤＮ
Ａ分子に存在する時のみプロモーターに効果を及ぼす。
促進因子の一般的概論についてはＫｈｏｕｒｙらの“Ｃ
ｅｌｌ”３３：３１３〜３１４（１９８３）を参照され
たい。 【００２２】好適な促進因子はシミアンウイルス４０、
ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、レトロウイ
ルスまたはアデノウイルスのような動物ウイルスから得
られる。理想的には、促進因子は宿主細胞が許容するウ
イルス、すなわち通常宿主型の細胞に感染するウイルス
からのものである方がよい。ウイルス性促進因子は公然
と入手できるウイルス類から簡単に得ることができる。
例えば、ラウス肉腫ウイルスやシミアンウイルス４０の
ような数種のウイルスの促進因子領域はよく知られてい
る。Ｌｕｃｉｅｗらの“Ｃｅｌｌ”３３：７０５〜７１
６（１９８３）を参照されたい。問題のウイルスの公表
された制限地図に基づいてこれらの領域を切り取り、必
要に応じてそれらの部位を修飾して生産物遺伝子または
選択遺伝子のベクター内にその促進因子をつなぎ合わせ
ることは慣用的な化学手段であるだろう。例えば、Ｋａ
ｕｆｍａｎらのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２ １３
０４〜１３１９頁（１９８２）を参照されたい。別の方
法として、促進因子は配列データから合成することがで
きる。ウイルス性促進因子の大きさ（一般に約１５０塩
基対以下）は十分に小さいので、これは実際に達成でき
るだろう。 【００２３】促進因子はタンデム型（自然界に見出せる
ＳＶ４０ウイルス性促進因子を用いる場合）で、または
先に論じた部位でベクター全体にわたり分離してベクタ
ー内に反復させることができる。好ましくは、促進因子
は野性型源においてその影響下にある遺伝子に関してそ
れがもっていた方向性と同じ方向性を生産物遺伝子およ
び／または選択遺伝子に関してもつ。促進因子はベクタ
ー内に存在する全てのプロモーターから上流に位置する
のが好適である。複数の異なる促進因子を用いてもよ
く、また促進因子は形質転換の際に役に立つために生産
物遺伝子または選択遺伝子へ結合される必要はない。非
連鎖ベクター系において、促進因子は生産物遺伝子を含
むベクターに存在することが好ましい。これは生産物遺
伝子および選択遺伝子が同時形質転換体内で物理的に結
合される可能性を増すだろう。この型においては所定量
の形質転換ＤＮＡに対して約１〜１００倍以上の形質転
換体を、選択遺伝子の転写に用いられるプロモーターに
応じて、得ることができる。 【００２４】促進因子はその野性型環境に見出せる側面
配列（例えばウイルスの複製開始点、ＴＡＴＡボックス
のような関係のあるプロモーター成分、キャップ部位ま
たは転写プライマー配列）のどれも含む必要はない。し
かし、これらの配列の欠失を可能にする制限酵素部位が
存在しない時にはこれらの配列の全てまたは一部分を組
み入れる方が都合がよい。また、促進因子とその促進因
子の野性型制御下にあるプロモーターとの両方を含むＤ
ＮＡ断片を使用することはさらに都合がよいだろう。 【００２５】促進因子および促進因子−プロモーター領
域はウイルスよりもむしろ真核細胞から選択することが
できる。これらは源細胞内で大きな構成量の蛋白質を産
生する遺伝子と関連した促進因子であるのが好ましい。
それらは野性型環境において通常制御される遺伝子以外
の遺伝子から高収量の生産物を同様に産生することを見
出された。形質転換しようとする宿主細胞は好適には促
進因子が得られた細胞と同じ体細胞系列また生殖細胞系
列である。例えば、Ｊｋ−Ｃｋイントロン内の免疫グロ
ブリン遺伝子を活性化または促進する領域（免疫グロブ
リン促進因子）は生産物遺伝子の上流または下流に導入
され、そしてこの構成物は骨髄腫細胞系列内へ選択遺伝
子とともに導入される。この促進因子についての詳細は
Ｇｉｌｌｉｅｓらの“Ｃｅｌｌ”３３：７１７〜７２８
（１９８３）を参照されたい。免疫グロブリン促進因子
は蛋白質産物を産生させるための骨髄腫細胞内に挿入さ
れる予定のベクターにおいて用いられるのが有利であ
る。 【００２６】生産物遺伝子および選択遺伝子は共にプロ
モーターの転写制御下におかれるようにプロモーターへ
結合されるだろう（ただし先に述べた連鎖ベクターの場
合を除く）。プロモーターは問題の遺伝子のための野性
型プロモーターであってもよく、また遺伝子は他の真核
細胞系列または原核生物ウイルスからの形質転換細胞系
列内で他の遺伝子からのプロモーターへ結合されてもよ
い。明らかに、そのプロモーターは形質転換細胞内のプ
ロモーターとの偶発的組み換えなしに形質転換しようと
する宿主によって認識されるべきであるが、その他の場
合はプロモーターの選択は限定的であると考えない。特
に望ましいプロモーターは５′非翻訳リーダーへ結合さ
れて、外来性の因子または条件〔例えば補助遺伝子産物
（転写物およびポリぺプチド）、重金属イオン、熱によ
る衝撃またはウイルス感染〕により転写的にまたは翻訳
的に活性化される。生産物遺伝子発現にとって好適なプ
ロモーターは３部分リーダーをもつアデノウイルスの主
後期プロモーターである。 【００２７】ベクター系は、促進因子と無関係のプロモ
ーター（例えばマウスアルファーグロビンのためのプロ
モーター）が選択される場合に、促進因子を含む必要は
ない。しかし、この種の促進因子−非依存性の強力プロ
モーターよりもむしろ促進因子と促進因子−依存性の強
力プロモーター（例えばアデのウイルス主後期プロモー
ター）とを含むベクターが使用される。強力プロモータ
ーは制御された条件下でＳＶ４０の初期プロモーターと
同じかまたはそれより多い転写物をもたらすものであ
る。ベクター内に存在する方がよい他の要素はポリアデ
ニレーション部位である。これは遺伝子の翻訳領域から
下流に位置するＤＮＡ配列であって、その遺伝子にアデ
ニンリボヌクレオチドが付加してメッセンジャーＲＮＡ
の３′末端にポリアデニレートの尾を形成する。ポリア
デニレーションは細胞の分解、メッセンジャーＲＮＡの
レベルおよび蛋白質産物のレベルを低下させる現象に対
してメッセンジャーＲＮＡを安定化させるのに重要であ
る。 【００２８】真核細胞のポリアデニレーション部位はよ
く知られている。コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）
配列が真核細胞遺伝子の間に存在する：ヘキサヌクレオ
チドの５′−ＡＡＵＡＡＡ−３′はポリアデニレーショ
ンが出発するＲＮＡの１つの点から１１−３０ヌクレオ
チドのところに見出される。ポリアデニレーション部位
を含むＤＮＡ配列は発表された報告書に従ってウイルス
から得ることができる。ポリアデニレーション配列の例
はマウスベーターグロビン、シミアンウイルス４０の後
期または初期領域遺伝子などから得られる。ウイルスの
ポリアデニレーション部位の方が好ましい。これらの配
列は知られているので、インビトロで合成して慣用方法
でベクターへ結合させることができる。ポリアデニレー
ション領域は連鎖または非連鎖ベクター内で生産物遺伝
子から下流に位置するべきである。非連鎖ベクターにお
いてはそれは場合により選択遺伝子から下流に結合され
る。ポリアデニレーション部位を翻訳停止コドンから分
離する配列は好ましくは促進されない真核細胞遺伝子の
ような非翻訳ＤＮＡ領域である。オリゴヌクレオチドは
停止コドンからポリアデニレーション部位まで相当な距
離（約１０００塩基以下）を延びるのが好ましい。この
３′非翻訳ヌクレオチド配列は一般に生産物の収量を増
加させる。ベクターはコンセンサス配列から約３０塩基
対下流から終るが、野性型環境内でポリアデニレーショ
ン部位から下流に見出せる３′配列を保持することが有
利である。これらの配列は一般にポリアデニレーション
部位から下流へ約２００〜６００塩基対延びる。 【００２９】ベクターの非翻訳、転写部分にイントロン
が存在すると生産物の収量が増加するのがわかった。こ
の種のイントロンは宿主細胞または遺伝子源以外の他の
源から得てもよい。例えば、アデノウイルス主後期転写
物の非翻訳領域内にこの転写物のノーマルイントロンの
一部分の代わりに挿入された免疫グロブリン遺伝子から
の３′スプライス部位は、生産物の収量増加をもたらす
ことができる。転写活性化因子、翻訳活性化因子、およ
び強力プロモーターまたはプロモーターと促進因子との
組合せによってトランスフェクトされた細胞は最も高め
られた生産物合成を提供する。カスケード作用はこの転
写および翻訳活性化因子−形質転換細胞から生ずるだろ
う。 【００３０】ベクターは好適にスーパーコイル状の二本
鎖環状構造物であるだろう。これはベクターが標準原核
生物クローニング法（この方法によってベクターは作ら
れる）から得られる形体である。しかし、ベクターは線
状化されていてもよく、すなわちゲノム性補助ＤＮＡへ
の結合のような他の工程に付随して、ある１つの点で共
有結合的に切断されていてもよい。次の表は適当な形質
転換用ベクター系の代表的な例である。 【００３１】 【表１】表 １ 【表２】 【００３２】ＥＰ＝真核宿主細胞によって認識される非
ウィルスプロモーター ＶＰ＝真核宿主細胞によって認識されるウィルスプロモ
ーター ＴＴＡ＝トランス−作働性転写活性化因子 Ｅｎ＝促進因子 ＴＬＡ＝翻訳活性化因子 ｐ（Ａ）＝ポリアデニレーション部位 Ｐｄ＝生産物遺伝子 Ｓ＝選択遺伝子 Ｂ＝オリゴヌクレオチド橋 −＝ホスホジエステル結合 ；＝非結合ベクター成分を表わす ＧＦ＝真核細胞ゲノム性断片 Ｉ＝外来性イントロン Ｒ＝複製成分（合成ベクターからのプラスミドまたはバ
クテリオファージ残部） 【外１】 【００３３】ベクター合成 生産物遺伝子と選択遺伝子との間に短いオリゴヌクレオ
チド配列をもつか、あるいはこれらの間にオリゴヌクレ
オチド配列をもたない連鎖ベクターは、数種の方法で作
ることができる。生産物遺伝子の翻訳停止コドンに隣接
して、あるいはそこから下流の一番近いところに制限部
位が存在しない場合、生産物遺伝子は野生型翻訳停止コ
ドンの上流の制限部位で切断され、その後そのコドンは
合成結合剤を用いて選択遺伝子断片へ結合される。この
ようなベクターの別の作成方法は、架橋ヌクレオチドプ
ローブを使用して生産物遺伝子と選択遺伝子との間にあ
る望ましくない配列を欠失させることである。もう１つ
の方法として、蛋白質産物のカルボキシ末端アミノ酸が
生物学的活性に必要なものでない場合、合成終止コドン
が便利な３′末端へ結合されるだろう。ここで遺伝子断
片を使用することは、自然界に見出せるものと出来るだ
け同一の蛋白質産物を合成することが望まれるので、好
適な実施態様とは言えない。 【００３４】野生型環境内で選択遺伝子の側面にある
５′非翻訳領域は、生産物遺伝子について先に述べた方
法と同じ方法で除去することができ、これは実施例４に
示すごとく生産物遺伝子からの欠失と同時に行われる。
しかしながら、選択遺伝子またはその誘導体によって発
現される蛋白質は野生型と同一である必要はなく、例え
ば増殖制限基質に対してより活性であるかまたは野生型
蛋白質より毒素に対してより抵抗性であってよい。連鎖
ベクターにおいて、選択遺伝子は生産物遺伝子のプロモ
ーターの制御下にあるのが好ましい。これは、生産物遺
伝子を欠く細胞が形質転換体との組み換え現象がない場
合に選択因子から生きのびることはできないので、細胞
の遺伝子型および蛋白質産物の発現を安定化するのに役
立つだろう。非連鎖ベクターの場合に反対のことが見出
されたが、ここでも同じプロモーターを選択遺伝子およ
び生産物遺伝子の両方に使用することができる。 【００３５】この他に、ここに示すベクターは当技術分
野において習熟した者によく知られた技術を用いて合成
することができる。生産物遺伝子、選択遺伝子、促進因
子、プロモーター、および補助ＤＮＡ（例えばトランス
−作働性転写活性化因子、翻訳活性化因子および類似の
もの）などのベクター成分は天然源から得ることがで
き、また先に述べたように合成することもできる。基本
的には、ベクター成分が大量に入手できるＤＮＡ中に見
出される場合（例えばウィルス機能のような成分）、ま
たそれらが合成可能である場合（例えばポリアデニレー
ション部位）、大量のベクターは生物源を培養し、その
ＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで消化し、そのＤＮ
Ａ断片を分離し、興味ある要素を含むＤＮＡを同定し、
そしてそのＤＮＡを当技術分野でよく知られた方法を用
いて回収することにより得ることができる。一般に、形
質転換用ベクターは少量作られ、その後原核生物のプラ
スミドまたはファージのような自律的に複製する合成ベ
クターへ結合される。ｐＢＲ３２２プラスミドは多くの
場合に使用できる。Ｋａｕｆｍａｎらの上記文献（１９
８２）を参照されたい。大きな形質転換用ベクターはコ
スミド（ｃｏｓｍｉｄ；ファージＤＮＡがファージカプ
シド内に封入されているが、受容宿主へトランスフェク
トされた場合プラスミドとして複製するベクター）のよ
うな収容能力の高い合成ベクターを必要とするかも知れ
ない。 【００３６】合成ベクターは慣用方法で、例えば受容原
核生物のトランスフェクション、高いコピー数への合成
ベクターの複製、細胞溶解による合成ベクターの回収、
および当技術分野でよく知られた方法による細胞破片か
らの合成ベクターの分離によって、形質転換用ベクター
をクローン化するのに用いられる。得られた合成ベクタ
ーは真核細胞内へ直接トランスフェクトされるか、ある
いは形質転換用ベクターが適当なエンドヌクレアーゼ消
化、分子量による分離および形質転換用ベクターの回収
により合成ベクターから単離される。形質転換用ベクタ
ーの単離は、合成ベクターの残部が真核細胞遺伝子の増
幅、転写または翻訳に悪影響を及ぼさない限り、必要な
い。例えば、ここで用いる好適な合成ベクターはプラス
ミドｐＳＲ３２２の突然変異体であり、これはプラスミ
ドｐＳＲ３２２中の真核細胞にとって有害な配列が欠失
されたものである。ＬｕｓｋｙらのＮａｔｕｒｅ ２９
３：７９〜８１（１９８１）を参照されたい。この突然
変異体の使用は形質転換前にプラスミドの残部を欠失さ
せる必要性を取り除いた。 【００３７】形質転換 形質転換しようとする細胞は酵母のプロトプラストを含
むどの真核細胞であってもよいが、好適には真菌細胞以
外の細胞である。原始的移植物（幹細胞のような比較的
未分化な細胞を含む）、および不滅性のかつ／または形
質転換された細胞系列が適している。細胞はその選択遺
伝子が、使用された時、優性に作用する限りその選択遺
伝子を遺伝子型として失う必要がない。ある実施態様に
おいては、形質転換された安定な細胞系列を必要としな
い。このような場合に、適当な形質転換用ベクターは哺
乳動物細胞内へのＤＮＡの一時的導入に頼ることができ
る〔Ｐ．Ｍｅｌｌｏｎ，Ｖ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｙ．Ｇｌｕ
ｚｍａｎ，Ｔ．ＭａｎｉａｔｉｓのＣｅｌｌ ２７：２
７９〜２８８（１９８１）〕。目的の形質転換体を単離
するために、その集団の全細胞が目的の蛋白質産物を発
現する外来性遺伝子を安定に含むことは要求されない。
数日間にわたって目的の生産物を発現するような細胞の
サブ集団へ外来性遺伝子を一時的に導入することが可能
である。本発明によるＤＮＡのトランスフェクションお
よび発現系によって選択しうるマーカーは形質転換用ベ
クター内に必要とされないので、外来性遺伝子は１〜２
週間にわたる細胞増殖の際に失われる。しかし、適当な
哺乳動物細胞のトランスフェクションの２〜３日後に、
目的の生産物が合成されたことが見出されそして検出さ
れる。 【００３８】こうして、哺乳動物蛋白質の遺伝子をクロ
ーン化するための宿主−ベクター系は、複製開始点−欠
損ＳＶ４０ＤＮＡ分子で形質転換されたＣＶ−１サル細
胞系列の開発に基づいている〔Ｙ．ＧｌｕｚｍａｎのＣ
ｅｌｌ ２３：１７５〜１８２（１９８１）〕。ＳＶ４
０はサルの細胞内で細胞溶解的に複製する小型のＤＮＡ
腫瘍ウィルスである。ＤＮＡの複製がない場合に、ＳＶ
４０はサルの細胞を形質転換するだろう。欠損ＳＶ４０
ＤＮＡを含む形質転換されたサルＣＶ−１細胞（ＣＯＳ
と称する）はＳＶ４０ゲノムの完全なコピーを含まない
が、高レベルで大型Ｔ抗原を産生しかつＳＶ４０ＤＮＡ
の複製を許容する。それらはまた初期領域の欠失をもつ
ＳＶ４０とＳＶ４０の複製開始点を含む細菌プラスミド
との複製を効率よく支持する〔Ｒ．Ｍ．Ｍｙｅｒｓおよ
びＲ．ＴｊｉａｎのＰＮＡＳ７７：６４９１〜６４９５
（１９８０）〕。それ故、この系は外来性ＤＮＡから発
現される蛋白質とｍＲＮＡのレベルを増加させるため
に、ＳＶ４０仲介ＤＮＡの複製を経てトランスフェクト
された外来性ＤＮＡ（蛋白質遺伝子および補助ＤＮＡ）
を増幅させる手段を提供する。他の実施態様では、細胞
は安定な不滅化した哺乳動物細胞系列である。染色体Ｄ
ＮＡ内に選択遺伝子を安定して組み込むことが知られて
いる細胞系列が好適であり、例えばチャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列である。この他にヒーラ
（Ｈｅｌａ）細胞、ＣＯＳサル細胞、メラノーマ細胞系
列〔例えばバウエス（Ｂｏｗｅｓ）細胞系列〕、マウス
Ｌ細胞、マウス線維芽細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞お
よび類似の細胞が有用である。 【００３９】非連鎖ＤＮＡでの形質転換は段階的にまた
は同時に行われる。細胞によるＤＮＡの取り込みを促進
させる方法が知られている。細胞核内へのベクターの微
小注射は最高の形質転換効率を生ずるが、燐酸カルシウ
ム沈降物の形のＤＮＡを母細胞にさらすことは一般にも
っと都合がよいだろう。生産物を発現する形質転換体の
頻度は、選択遺伝子に対してモル過剰の生産物遺伝子
（約１０：１またはそれ以上）を用いて形質転換するこ
とによりさらに高められる。 【００４０】選択形質転換体はその後それらの染色体内
の生産物遺伝子の結合または生産物それ自体の発現につ
いてスクリーニングされる。前者はサザン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）ブロット分析を用いて達成され、後者は標準的
な免疫検定法または酵素検定法によって達成される。ひ
とたび形質転換体が識別されると、一定量または増加量
の選択遺伝子の存在下にサブクローニングすることによ
り生産物遺伝子の発現をさらに増幅する工程が行われ
る。一般に、これは形質転換体の細胞集団を取り出し、
そして（ａ）その細胞集団の他の細胞に比較した場合に
より優れた方法で生産物を発現する１つまたはそれ以上
の細胞をその集団から選択し；（ｂ）選択した１つまた
はそれ以上の細胞を、表現型発現における変化によって
選択するように設定した条件下で次の細胞集団へと培養
し；そして（ｃ）工程（ｂ）からの集団の他の細胞に比
較した場合により優れた方法で生産物を発現する１つま
たはそれ以上の細胞をその集団からさらに選択する；こ
とを伴う。工程（ｂ）は工程（ａ）からのクローンを多
数用いることにより有利に実施される。この方法は１９
８３年１２月１７日付の係属中の米国特許出願第５６５
６２７号（参照によりここに引用される）に詳しく記載
されている。次の実施例は本発明をさらに例示するため
に提供されるものであり、特許請求の範囲を限定するも
のではない。実施例において用いられる温度は℃であ
る。 【００４１】 【実施例】実施例１ 細胞培養 ＳＶ４０形質転換ＣＯＳサル細胞（クローンＭ６）は
Ｍ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐ．Ｇｅｎｅｔ．２，１４７−９ページ（１９
８３））により提供を受けた。アデノウィルス２はＰ．
Ｓｈａｒｐより提供を受けた。アデノウィルス感染は３
７℃で９０分間２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌを吸収させる事に
より実施した。洗浄後、細胞を３７℃で１８時間インキ
ュベートした。この時間に著しい細胞症効果が観察され
た。 【００４２】ＤＮＡトランスフェクションはＳｏｍｐａ
ｙｒａｃおよびＤａｎｎａによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，７５７５−８ページ（１９
８１）に記載されている方法にクロロキン処理（Ｌｕｔ
ｈｍａｎおよびＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ，１１，１２９５−１３０８ページ（１９８
３））を加えて実施した。細胞を無血清培地で洗浄し、
ｐＨ７．３の０．１Ｍトリスに加えたＤＥＡＥデキスト
ラン（ＮＷ５０００．０００Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２５
０ｍｇ／ｍｌ）および２μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ
を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地中で１
２時間３７度でインキュベートする。インキュベーショ
ン後、細胞を無血清培地で洗浄し、血清含有培地中０．
１ｍＭクロロキンで３７度にて２時間処理する。細胞は
続いて培地に播種し、指定された時間インキュベートす
る。 【００４３】プラスミド構成 アデノウィルス特異的相互作用因子がアデノウィルスＭ
ＬＰに影響しているかを分析するため、一連のＤＨＦＲ
ｃＤＮＡ遺伝子を構成してあり、それらは図１（ａ）−
１（ｅ）に示してある。ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）は
第１のリーダーおよびアデノウィルス後期ｍＲＮＡから
の５′スプライス部位を含むアデノウィルスＭＬＰの制
御下にあるマウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含有している。こ
の５′スプライス部位はマウスイムノグロブリン遺伝子
（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，２，１３０４−１９ページ（１９８
２））から導入される３′スプライス部位と適切にスプ
ライスされる。ＳＶ４０初期ポリアデニル化信号はＤＨ
ＦＲコード領域の３′末端に存在する。ｃＤＮＡ遺伝子
は哺乳類細胞の複製に有害な配列（Ｌｕｓｋｙら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）；２９３，７９−８１ページ
（１９８１））を欠き、ＳＶ４０由来または複製物（Ｍ
ｅｌｌｏｎら）を含むｐＢＲ３２２誘導体（ｐＳＶＯ
ｄ）中にクローンする。プラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａ（３）（図１（ａ））およびｐＣＶＳＶＬ（図１
（ｂ））はすでに記載されている（Ｋａｕｆｍａｎおよ
びＳｈａｒｐ，上記文献）。ｐＣＶＳＶＬ２はＸｈｏｌ
リンカーの添加およびアデノウィルスＭＬＰ上流のＸｈ
ｏｌ部位（１５．８３ｍ．ｕ．）への挿入により導入さ
れた重複したＳＶ４０ＡｖａＩＩＤフラグメントを含む
点を除いてｐＣＶＳＶＬと同一である。ＳＶ４０後期プ
ロモーターがＡｄ２ＭＬＰのように同じ配向をしている
ごとく両方のＡｖａＩＩＤフラグメントも配向してい
る。 【００４４】ｐＣＶＳＶＬ２はｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）から誘導されるがしかし、ｐＳＶｏｄからのＳＶ
４０由来物を欠き、アデノウィルスＭＬＰの上流にＳＶ
４０エンハンサーおよび複製の起点を含む。ｐＤ２０
（図１（ｃ）およびｐＤ１７（図１（ｄ））はアデノウ
ィルスファイバータンパク質のためのｃＤＮＡクローン
から誘導されるアデノウィルス第２および第３の２／３
のリーダーをコードする１３８ｂｐＤＮＡ配列（Ｚａｉ
ｎら、Ｃｅｌｌ，１６，８５１−６１ページ（１９７
９））の挿入を除けばｐＡｄ２６ＳＶｐＡ（３）（図１
（ａ））と同一である。ｐＤ２０は５′スプライス部位
に８ｂｐ５′のＰｖｕＩＩ部位に正しい方向で挿入され
た１３８ｂｐ領域を含む。それ故、ｐＤ２０は完全な第
１、第２および第３の２／３のリーダーをコードしたス
プライスした後期ｍＲＮＡからの第１の１７０ｂｐを含
み、第１の後期リーダーから５′スプライス部位へ８ｂ
ｐを含む。ｐＤ１７（図１（ｄ））は反対の向きに１３
８ｂｐフラグメントを含む。ｐＤ６１（図１（ｅ））は
ｐＤ２０（図１（ｃ））に存在する第２および第３のリ
ーダー配列を含む点を除いてｐＣＶＳＶＬ２と同一であ
る。 【００４５】ｐＤ１７およびｐＤ２０、ｐＪＡＷ４３
（Ｚａｉｎら前記文献）を得るため、ＤＮＡをＸｈｏｌ
で消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗフラグ
メントで処理し、その後ＰｖｕＩＩで消化する。１３８
ｂｐフラグメントを単離し、前もってＰｖｕＩＩで消化
したｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）と連結する。ＤＮＡを
大腸菌ＨＢ１０１に移入し、放射性標識したｐＪＡＷ４
３からの１３８ｂｐ Ｘｈｏｌ−ＰｖｕＩＩフラグメン
トでスクリーニングする。陽性のハイブリダイズしたク
ローンからＤＮＡを調整し、ＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化後アクリルアミドゲル電気泳動で向きを検
討する。アデノウィルスＭＬＰの転写方向に対してｐＤ
２０は１３８ｂｐフラグメントを同じ向きに、ｐＤ１７
はそのフラグメントを逆の向きで含有している。ｐＣＶ
ＳＶＬからのＥｃｏＲｌおよびＸｈｏｌ部分約１、１Ｋ
ＢフラグメントをＥｃｏＲ１およびＸｈｏｌで完全に消
化した大きなｐＤ２０からのフラグメントに挿入してｐ
Ｄ６１を構成する。生成したプラスミドｐＤ６１はＳＶ
４０エンハンサーおよび３つの部分のリーダーを持つア
デノウィルスプロモーターを含有する。 【００４６】これらの組み換え体はこれらのｃＤＮＡ遺
伝子の発現に影響を及ぼすアデノウィルス因子の研究の
ために利用する。実験工程にはＤＮＡトランスフェクシ
ョンおよびＣＯＳサル細胞のアデノウィルス重感染が含
まれる。ＤＮＡトランスフェクションの３６時間後、ト
ランスフェクトした細胞をアデノウィルスで感染させ、
１８時間放置してインキュベートする。その後、細胞を
35Ｓメチオニンで１時間標識し、免疫沈降およびポリア
クリルアミドゲル電気泳動でＤＨＦＲ合成を分析する。
結果はＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）およびｐＣＶＳＶＬ２
の両方が偽トランスフェクトした試料に比してＤＨＦＲ
合成できることを示している。偽トランスフェクトした
ＣＯＳ細胞ではマウスＤＨＦＲのすぐ上に移動したサル
ＤＨＦＲを検知することが可能である。 【００４７】ｐＣＶＳＶＬ２およびｐＣＶＳＶＬからの
ＤＨＦＲ発現をＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞の形質転換により
ＣＯＳ細胞と比べると、２つのプラスミド間には何の差
異も観察されなかった。さらに、アデノウィルスによる
重感染もｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）またはｐＣＶＳＶ
Ｌ２からのＤＨＦＲ合成にほとんど効果を示さなかっ
た。しかしながらｐＣＶＳＶＬ２からの発現はｐＡｄＤ
２６ＳＶｐＡ（３）の２倍以上であった。これはｐＣＶ
ＳＶＬ２においてアデノウィルスＭＬＰの上流にＳＶ４
０エンハンサーが導入された結果である。スプライスし
たアデノウィルスの３つに分かれたリーダーからの１３
８ｂｐのリーダー挿入を含むプラスミド（ｐＤ２０，ｐ
Ｄ１７およびｐＤ６１）もまたＤＨＦＲを合成する事が
観察された。さらに、ｐＤ２０およびｐＤ６１の両者
は、別個の実験においてＤＨＦＲ合成が３−１０倍増加
する事によりアデノウィルス感染に反応する。反対に、
逆方向に１３８ｂｐの３つに分かれたリーダーセグメン
トを含むｐＤ１７からの表現はアデノウィルス重感染に
より影響を受けない。これらの結果は３つに分かれた第
２および第３のリーダーセグメント中の配列が方向に依
存した様式でアデノウィルス感染に対し反応する事を示
唆している。 【００４８】ｍＲＮＡレベルがアデノウィルス感染によ
り影響されるかどうかを決定するため、Ｋａｕｆｍａｎ
らによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２ １３０４−
１３１９（１９８２）に記載されているごとく３′Ｓ１
マッピングを実施した。３′末端標識ＤＮＡプローブを
合成し、トランスフェクトおよびアデノウィルス重感染
したＣＯＳサル細胞から単離された全ＲＮＡとハイブリ
ダイズする。プラスミドｐＣＶＳＶＬ２，ｐＤ２０およ
びｐＤ６１では単一の５５０塩基対フラグメントが観察
されそれはＳＶ４０ポリアデニル化部位でポリアデニル
化されたｍＲＮＡに対応する。ＳＶ４０エンハンサーを
欠くｐＤ２０はＳＶ４０エンハンサーを持つプラスミド
に比較して約２倍のより低いＤＨＦＲ特異的ｍＲＮＡを
示す。アデノウィルス重感染によってもどんなｃＤＮＡ
遺伝子からもＤＨＦＲ ｍＲＮＡレベルの変化は認めら
れない。この事はアデノウィルス重感染により観察され
たＤＨＦＲ合成の増加はＤＨＦＲ ｍＲＮＡレベルの上
昇によるものではない事を示している。アデノウィルス
重感染によるＤＨＦＲ合成の増加は増加した翻訳効率の
結果である。 【００４９】実施例２ ＶＡ ＲＮＡの翻訳における効果を分析するため、ヒト
ガンマーインターフェロンを発現するプラスミドの新
しい組（図２（ａ）−２（ｄ））を構成した。オリゴｄ
Ｇ−オリゴｄＣテーリング法（Ｍａｎｉａｔｉｓら）に
よりヒト末梢血液リンパ球から単離されたｍＲＮＡから
クローンしたヒトガンマーインターフェロンをコードし
ているｃＤＮＡはＳ．Ｃｌａｒｋ博士（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から提供を受けた。ガンマーイ
ンターフェロンをコードしているＰｓｔ１クローンは前
もってＳＶ４０ポリアデニル化信号のＰｓｔＩ部位３′
を消失させた。ｐＣＶＳＶＬ２誘導体のＰｓｔＩ部位へ
挿入する。生じるプラスミドｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６
（図２（ａ））はガンマーインタフェロンコード領域Ｄ
ＨＦＲ ｃＤＮＡの５′およびｍＲＮＡ続生のための
３′スプライス部位の３′を含む。３つに分かれたリー
ダーを持つ同様のプラスミドを得るため、ｐ（ガンマー
ＩＦ）Ｄ−６およびｐＤ６１の両方をＳａｌｌおよびＥ
ｇｌＩＩで消化した。Ｓａｌｌは各々のプラスミドをｐ
ＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子内で一度消化
し、ＢｇｌＩＩは各々のプラスミドをイムノグロブリン
遺伝子からの３′スプライス部位のまさしく５′を一度
消化する。ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６からのガンマーＩ
Ｆ含有フラグメントを３部分リーダーを含むフラグメン
トｐＤ６１と連結し、続いてＤＮＡは大腸菌ＨＢ１０１
をテトラサイクリン耐性に形質転換するのに使用する。
ｐＬ５８（図２（ｂ））はアデノウィルスの３つに分か
れたリーダーを含むが他の点ではｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ
−６と同一である。 【００５０】アデノウィルスＶＡ遺伝子はＨｉｎｄＩＩ
ＩＡｄ２Ｂフラグメントから単離されｐＬ５８に導入す
る。アデノウィルスのＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメント
（１７．１ｍｕ−３１．７ｍｕ）は前もってｐＢＲ３２
２中にクローンし、すなわち３１．７ｍｕのＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に結合する。
このプラスミドをＨｐａＩ（２８．０ｍｕ）で消化しＥ
ｃｏＲＩリンカーを加える。ＥｃｏＲＩ消化後、１．４
ＫＢバンドを単離し、ｐＬ５８のＥｃｏＲＩ部位中へク
ローンする。ＰＱ２（図２（ｃ））はベクター内にＶＡ
遺伝子が存在するが、アデノウィルスＭＬＰと逆の方向
に転写する。ｐＱ３（図２（ｄ））はＶＡ遺伝子が逆の
方向性である点を除いてｐＱ２と同一である。 【００５１】ガンマインターフェロン ガンマーインターフェロン検定はＣＣＬ５４細胞（ＡＴ
ＣＣ番号ＣＣＬ５４、継代数２４）に対する小疱口内炎
ウィルスまたは脳心筋炎ウィルスの細胞症効果からの保
護を測定する事により実施する（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｗ．
Ｅ．ＩＩ，インターフェロン体系，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，
Ｂｅｒｌｉｎ．１９７９）。テンマーインターフェロン
単位はＮＩＨアルファーインターフェロン標準品に対し
て表現した。クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼはＣｏｒｍａｎらによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．，２，１０４４−１０５１（１９８２）に記載
されている方法で細胞抽出物から測定した。ガンマーイ
ンターフェロンの発現はＶＡ ＲＮＡの定量的効果の感
度のよい検定を可能にする。ｐ−ガンマーＩＦ−６およ
びｐＬ５８は３′スプライス部位およびＤＨＦＲ ｃＤ
ＮＡの間のｐｓｔＩ部位へ適切な方向性でガンマーイン
ターフェロンｃＤＮＡが挿入されている点を除いてｐＤ
２０およびｐＤ６１と同一である。最後に、ｐＱ２およ
びｐＱ３はＥｃｏＲＩ部位にアデノウィルスＶＡ遺伝子
（アデノウィルスマップユニット２８．０２および３
１．００）が両方の方向に挿入されている点を除いてｐ
Ｌ５８と同一である。 【００５２】ＣＯＳ細胞における形質転換 プラスミドｐＱ２，ｐＱ３，ｐＬ５８およびｐ−ガンマ
ーＩＦ−６は各々ＣＯＳ細胞にトランスフェクトする
（表１Ａ）。３６時間後条件付け培地の試料を検定に供
し、２つの二重のプレートのうちの１つをアデノウィル
スで感染せしめる。感染２０時間後試料は再びガンマー
ＩＦ活性を検定する。ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６は低い
活性を示し、アデノウィルス重感染でもわずかに上昇し
ただけである。ｐＬ５８はｐ６の数倍の活性を示し、ア
デノウィルスの感染によりガンマーＩＦ活性が２倍の増
加を示した。反対に、ｐＱ２およびｐＱ３の両方ともア
デノウィルス重感染なしで、有意に高い水準のガンマー
ＩＦ活性（ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６の５０−７０倍）
を持っていた。アデノウィルス重感染により、ガンマー
ＩＦ活性は減少した。ＶＡ ＲＮＡがガンマーインター
フェロンの発現の増加を媒介しているかどうかを決定す
るため、プラスミドｐＱ２およびｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ
−６を各々ｐＳＶＯｄまたはｐＶＡＳＶＯｄ（アデノウ
ィルスＶＡ遺伝子を含むｐＳＶＯｄの誘導体）と１：１
の比で混合し、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。ト
ランスフェクションして４８時間後、試料はガンマーＩ
Ｆ検定に供した。ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６はｐＶＳＶ
Ｏｄと共トランスフェクトすると活性の２−３倍の増加
を示した。対照的に、ｐＬ５８はｐＶＡＳＶＯｄとの共
トランスフェクションにより１０倍以上の増加を示し
た。最後に、ＶＡ遺伝子を含むｐＱ２はｐＶＡＳＶＯｄ
と共トランスフェクションすると高いガンマーＩＦを持
つ。これらの結果はトランス内のＶＡ遺伝子の存在がア
デノウィルス後期ｍＲＮＡからの３つに分かれたリーダ
ーの大多数を含むｍＲＮＡからの発現を容易にする。 【００５３】表１にみられたｐＱ３重感染によるガンマ
ーＩＦ活性の減少は細胞代謝に対するアデノウィルス感
染による毒性効果またはアデノウィルス後期ｍＲＮＡと
変化したｃＤＮＡ遺伝子からの転写物の競合によるもの
であろう。ガンマーインターフェロン活性を検定した結
果は免疫沈降およびプロティンブロッティング両法でも
共に支持された（データは示していない）。結果はｐＱ
２がトランスフェクション７２時間後１μｇ／ｍｌのガ
ンマーインターフェロンを発現したことを示した。これ
らの結果はアデノウィルス重感染による発現の増加にＶ
Ａ ＲＮＡが対応している事を確認している。アデノウ
ィルスＶＡ ＲＮＡによる翻訳の増加はまたＳＶ４０初
期プロモーターからのクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼの発現を増加させる。ＳＶ４０初期プ
ロモーター制御下細胞クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むプラスミドと
アデノウィルスＶＡ遺伝子を含むプラスミドの共トラン
スフェクションではＶＡ遺伝子を欠くプラスミドとの共
トランスフェクションに比較して５−１０倍高い水準の
ＣＡＴ活性を得る。ＲＮＡブロット分析ではＶＡ遺伝子
との共トランスフェクションによりＣＡＴｍＲＮＡは増
加していないので増加した発現は翻訳の増加のためであ
る。ＳＶ４０初期プロモーターの制御下、細胞キサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドの発現もまたＶＡ遺伝子を含むプラス
ミドのトランスフェクションにより増加する。 【００５４】同様に、例えば組織プラスミノーゲン活性
化因子のごとき他の非定型タンパク質の発現もＶＡ遺伝
子のごとき付帯のＤＮＡを用いると著しく増加できる。
ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするプラスミドで共形質
転換する事によりサルＣＶ１細胞にｐＬ５８およびｐＱ
３を導入すると翻訳効率の同様な増加が観察される。こ
のように、翻訳効率の増加はＣＯＳ細胞に限定されるわ
けではない。さらに、内部および分泌（ＤＨＦＲおよび
ガンマーインターフェロン）両タンパク質の翻訳をＶＡ
ＲＮＡで刺激できる。ガンマーインターフェロンｃＤ
ＮＡ組換え体（ｐＱ２）でトランスフェクトした細胞
は、トランスフェクション７２時間後、１μｇ／１０6
細胞の水準でインターフェロンを産生する。５−１０％
の翻訳効率を仮定するとこれは非常に高い水準の発現で
ある。最後に、翻訳効率の増加はＤＨＦＲおよびガンマ
ーインターフェロンに独特のものではなく、同様のベク
ターでヒトインターロイキン２およびヒトプロインスリ
ンの両者も効率よく発現される。 【００５５】 【表３】【００５６】表１Ａの説明文 トランスフェクトしたおよびアデノウィルスで感染させ
たＣＯＳ細胞におけるγ−インターフェロン活性 Ａ．ＣＯＳ細胞を表示したプラスミドＤＮＡでトランス
フェクトした。前に記載したごとく細胞を続いてアデノ
ウィルスで感染させるかまたは偽感染させる。アデノウ
ィルス感染時（トランスフェクション後３６時間）およ
び感染後１８時間（トランスフェクション後５６時間）
の時γ−インターフェロン検定のため試料を採取する。
前に記載したごとく活性を決定し単位／ｍｌ／１０6 細
胞で表わす。 Ｂ．ＣＯＳ細胞を表示したプラスミドＤＮＡでトランス
フェクトし（２ｕ／ｍｌ、ｐＳＶＯｄまたはｐＶＡＳＶ
Ｏｄ各々と等量で）、トランスフェクションして６０時
間後にγ−インターフェロン検定のため試料を採取す
る。 【００５７】実施例３ ベクターｐ９１０２３（Ｂ）の構成 形質転換ベクターｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）はＫａｕ
ｆｍａｎらによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２（１
１）：１３０４−１３１９（１９８２）に記載されてい
る。それは図３に示した構造を持つ。簡単にいうとこの
プラスミドはアデノウィルス２（Ａｄ２）メジャー後期
プロモーターの転写制御下にあるマウスジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。５′ス
プライス部位はアデノウィルスＤＮＡに含まれており、
３′スプライス部位（イムノグロブリン遺伝子から誘導
される）はＡｄ２メジャー後期プロモーターおよびＤＨ
ＦＲコード配列の間に存在する。ＳＶ４０初期ポリアデ
ニル化部位はＤＨＦＲコード配列の下流に存在する。ｐ
ＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）の原核生物−誘導部はｐＳＶ
Ｏｄからであり（Ｍｅｌｌｏｎ，Ｐ．，Ｐａｒｋｅｒ，
Ｖ．，Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．１９８１，Ｃｅｌｌ ２７：２７９−２８８）哺乳
類細胞の複製を阻害する事が知られているｐＢＲ３２２
配列を含んでいない（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．およびＢｏｔｃ
ｈａｎ，Ｍ．１９８１，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
２９３：７９−８１）。 【００５８】ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）は図３に図示
したごとく、プラスミドｐＴＰＬに変換する。ｐＡｄＤ
２６ＳＶｐＡ（３）の２つのＢｓｔＩ部位の１つを欠失
せしめてｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）をプラスミドｐＡ
ｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）に変換する。これはＰｓ
ｔＩにより部分消化（酵素活性が不十分なものを用いる
ことただ１つのＰｓｔＩ部位が切断された線状にされた
プラスミドの亜集団が得られる）した後、Ｋｌｅｎｏｗ
で処理し、連結してプラスミドを再環化し、大腸菌を形
質転換して、ＳＶ４０ポリアデニル化配列の３′に位置
するＰｓｔＩ部位が欠失しているものをスクリーニング
する事により達成される。 【００５９】アデノウィルスの３つに分かれたリーダー
およびウィルス付随遺伝子（ＶＡ遺伝子）を図３に図示
したごとく、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）に挿入
する。第１にｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）をＰｖ
ｕＩＩで切断し、３つの分かれたリーダーからなる３つ
の要素の第１の３′部分で開いた直線分子となす。その
後、ｐＪＡＷ４３（Ｚａｉｎら、１９７９，Ｃｅｌｌ
１６ ８５１）をＸｈｏＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで処
理し、ＰｖｕＩＩで消化し、アクリルアミドゲル上での
電気泳動（６％トリスホウ酸緩衝液中；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２）前記文献）して第２のリーダーおよび
第３のリーダーの一部を含む１３８塩基対フラグメント
を単離する。１３８ｂｐフラグメントをＰｖｕＩＩ消化
ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）と連結する。連結生
成物は大腸菌をテトラサイクリン耐性に形質転換するの
に使用し、コロニーは１４０塩基対フラグメントとハイ
ブリダイズする32Ｐ標識プローブを使用するＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法を用いてスクリーニングす
る。陽性のハイブリダイズしたコロニーからＤＮＡを調
製し、挿入された１３８塩基対ＤＮＡの５′または３′
が第２または第３のアデノウィルス後期リーダーに特異
的に再構成されたＰｖｕＩＩ部位にあるかどうかを試験
する。ＰｖｕＩＩ部位の正しい方向は挿入した１３８塩
基対の５′末端にあるものである。このプラスミドを図
３のｐＴＰＬと称する。 【００６０】ＳＶ４０ＤＮＡをＡｖａＩＩで消化し、Ｘ
ｈｏＩリンカーをフラグメントに連結し、ＸｈｏＩで消
化してＸｈｏＩ部位を開裂し、ゲル電気泳動により４番
目に大きい（Ｄ）フラグメントを単離することにより、
ＳＶ４０エンハンサー配列を含むＳＶ４０のＡｖａＩＩ
Ｄフラグメントを得る。リンカーを付けたＤフラグメン
トの挿入によりＳＶ４０エンハンサーの単一のダイレク
ト繰返し配列を得る。これは連結においてｐＡｄＤ２６
ＳＶｐＡ（３）の量をＸｈｏＩリンカーを付けたＤフラ
グメントに比例させた結果である。ｐＣＶＳＶＬ２−Ｔ
ＰＬ中のＳＶ４０フラグメントの方向性は、アデノウィ
ルスメジャー後期プロモーターのごとくＳＶ４０後期プ
ロモーターが同じ方向であるのと同じである。 【００６１】ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬにアデノウィルス
付随（ＶＡ）遺伝子を導入するには、第１にアデノウィ
ルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメントを含むプラスミ
ドｐＢＲ３２２を構成する。アデノウィルス２型ＤＮＡ
をＨｉｎｄＩＩＩで消化しゲル電気泳動後Ｂフラグメン
トを単離する。このフラグメントは前もってＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化してあるｐＢＲ３２２に挿入する。大腸菌を
アムピシリン抵抗性に形質転換後、組換え体のＨｉｎｄ
ＩＩＩＢフラグメントの挿入をスクリーニングし、挿入
方向に制限酵素消化により決定する。ｐＢＲ３２２−Ａ
ｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢは図４に描かれた方向でアデノウ
ィルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメントを含む。 【００６２】図４に図示したごとく、プラスミドｐＢＲ
３２２−Ａｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢからＶＡ遺伝子を、Ｈ
ｐａＩによる消化ＥｃｏＲＩリンカーの添加およびＥｃ
ｏＲＩによる消化により便利に得、１．４ｋｂフラグメ
ントとして回収する。ＥｃｏＲＩ付着末端を持つそのフ
ラグメントはｐＴＰＬ（前もってＥｃｏＲＩで消化して
ある）のＥｃｏＲＩ部位に連結する。大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換後、テトラサイクリン耐性で選択し、コロニ
ーはＶＡ遺伝子に特別なＤＮＡプローブへのフィルター
ハイブリゼイションによりスクリーニングする。陽性の
ハイブリダイズクローンからＤＮＡを調製し、制限酵素
消化により確認する。生成プラスミドはｐ９１０２３と
称する。 【００６３】ｐ９１０２３内の２つのＥｃｏＲＩ部位を
除く。ｐ９１０２３はＥｃｏＲＩで完全に切断し、２つ
のＤＮＡフラグメントを発生させる：１つはＡｄＭＬ
Ｐ，ＴＰＬ，ＤＨＦＲ，ＳＶ４０ｐＡ部位、ＳＶ４０Ａ
ｖａＩＩフラグメントおよびｐＢＲ３２２Ｔｅｔ遺伝子
および複製起点（毒領域のない）約７ｋｂのフラグメン
トで他はＶＡ遺伝子を含む１．３ｋｂのフラグメントで
ある。両方のフラグメントの末端をＰｏｌＩのＫｌｅｎ
ｏｗフラグメントで満たし、両フラグメント（即ち、
１．３ｋｂおよび７ｋｂ）を一緒に再連結する。プラス
ミドｐ９１０２３（Ａ）はｐ９１０２３同様にＶＡ遺伝
子を含有しているが、２つのＥｃｏＲＩ部位が欠落して
いる事が、ＶＡ遺伝子を用いるＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈ
ｏｇｎｅｓｓスクリーニングおよび通常の制限部位分析
により同定された。 【００６４】ｐ９１０２３（Ａ）内の単一のＰｓｔＩ部
位を除き、ＥｃｏＲＩ部位に置き換える（図５）。ｐ９
１０２３（Ａ）をＰｓｔＩで完全に切断し、ＰｏｌＩの
Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を発生さ
せる。ＥｃｏＲＩリンカーをｐ９１０２３（Ａ）の切断
したＰｓｔＩ部位に連結する。線状ｐ９１０２３（Ａ）
（切断ＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩリンカーが結合してい
る）を結合していないリンカーから分離し、ＥｃｏＲＩ
で完全に消化し、再連結する。プラスミドｐ９１０２３
（Ｂ）が回収され、ｐ９１０２３（Ａ）と同様の構造を
持つ事が同定されるが、前のＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩ
部位が位置している。ＥｃｏＲＩ部位が挿入された生成
物遺伝子を持つプラスミドｐ９１０２３（Ｂ）はＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，に
大腸菌内ｐＣＳＦ−１としてＡＴＣＣ番号３９７５４で
供託されており、入手可能である。 【００６５】実施例４ 実施例２および３に記載した翻訳活性化因子（アデノウ
ィルスＶＡ遺伝子）を含むベクターの有用性を遷移的に
トランスフェクトした細胞および安定に形質転換した細
胞の両者においてヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩ
ＩＩ）をコードしたｃＤＮＡを用いて実証する。ヒトアンチトロンビンＩＩＩ ｃＤＮＡのクローニング “凝固および線維素溶解の生理的阻害剤”（Ｄ．Ｃｏｌ
ｌｅｎ，Ｂ．ＷｉｍａｎおよびＭ．Ｖｅｒｓｔｖａｅｔ
ｅ編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，４３
−５４ページ）においてのＴ．Ｅ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，
Ｇ．Ｄｕｄｅｋ−Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｓｋａ，Ｌ．Ｓ
ｏｔｔｖｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，およびＳ．Ｍａｇｎｕｓ
ｓｏｎ（１９７９）らによるアミノ酸配列から推論した
特定のオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼ
ーションによりヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからヒト
アンチトロンビンＩＩＩをコードした完全長ｃＤＮＡを
単離する。 【００６６】ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーは常法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら）により調製する。ｐｏｌｙＡ＋ｍＲ
ＮＡをヒト肝臓から単離し、メチル水銀で処理し、第１
のｃＤＮＡ鎖合成は逆転写で実施した。塩基で処理後、
第２鎖の合成はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフ
ラグメントによりなし遂げ、二重鎖ｃＤＮＡは続いてＳ
１ヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩメチラーゼおよびＤＮＡポ
リメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、末
端を切断する。ＥｃｏＲＩリンカーを加え、過剰のリン
カーはＥｃｏＲＩ消化により除去し、ＣＬ４Ｂカラムを
通す。ｃＤＮＡをｇ＋１０に連結し、インビトロでパッ
ケージして平板培養する（Ｃ６００ｈｆｌ，Ｒｏｎ Ｄ
ａｖｉｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙか
ら得た高頻度溶原化剤）。総計５００，０００を２４３
から２４８のアミノ酸（Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）および３０４から３０９のアミノ
酸（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ）から調製された２組のオリゴマーでスクリーンす
る。アミノ酸コードの変性に基づくと、１組のオリゴヌ
クレオチドは８つの異なった１７−ｍｅｒｓからなり、
他のものは１６の異った１７−ｍｅｒｓからなってい
る。 【００６７】５μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む
５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＤおよび５ＸＤｅｎｈａｒｔ
溶液中でハイブリダイゼーションを実施する。両方のプ
ローブに対してハイブリダイズした３８の陽性のものを
単離し、プラークを精製し、オリゴヌクレオチドプロー
ブに再ハイブリダイゼーションして同定する。これらの
実験の経過中に、Ｓ．Ｃ．Ｂｏｃｋら（１９８２）（Ｂ
ｏｃｋ，Ｓ．Ｃ．，Ｗｉｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｖｅｈａｒ，
Ｇ．Ａ．およびＬａｗｎ．Ｒ．Ｍ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ，１０，８１１３−８１２５）によりヒトＡＴ
ＩＩＩのヌクレオチド配列が発表された。従って、完全
長クローンを単離するため、イニシエーターＡＴＧを取
囲む１７−ｍｅｒｓオリゴヌクレオチド（ＴＡＴＴＣＣ
ＡＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧ）を合成し、３８の陽性のもの
とハイブリダイズした。１３の陽性物のうち、１つを調
製し、ラムダーＡＴＩＩＩ−Ｃ３（ＡＴ３−（３）と名
付け、それは約１．４ｋｂ挿入物を含んでいる。 【００６８】発現ベクターへのＡＴＩＩＩｃＤＮＡの挿
入 ＡＴＩＩＩ発現に利用する発現ベクターはｐＱ２（図２
（ｃ））から誘導された。ｐＱ２をＰｓｔＩで消化して
インターフェロンｃＤＮＡを除き、アガロースゲルから
７．５ＫＢフラグメントを単離する。ＡＴＩＩＩのため
のｃＤＮＡは内部にＥｃｏＲＩ部位を含まないので、Ｅ
ｃｏＲＩ消化で切断することが可能であり、アガロース
ゲル電気泳動によりラムダーＡＴ３−Ｃ３から１．４Ｋ
Ｂフラグメントを単離する。前もって合成アダプター： ＰｓｔＩ ５′ＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧ３′ ＥｃｏＲＩ ＡＣＧＴＣＣＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＡ をつけたベクターにＥｃｏＲＩ ＡＴＩＩＩフラグメン
トを挿入する。合成アダプターの付加は１０−ｍｅｒの
５′末端のみをリン酸化して達成される。この事により
形質転換体のバックグラウンドを低下させる非リン酸化
ＥｃｏＲＩ末端を残す。低融点アガロースゲル電気泳動
により過剰のアダプターを除去後、７．５ＫＢフラグメ
ントを抽出し、ＥｃｏＲＩ ＡＴＩＩＩｃＤＮＡフラグ
メントに連結する。連結混合物を大腸菌ＨＢ１０１をテ
トラサイクリン耐性に形質転換するのに使用し、ＡＴＩ
ＩＩｃＤＮＡをコードするＴ４末端標識（Ｅｎｇｌｕｎ
ｄ，Ｐ．Ｔ．（１９７１），Ｊ．Ｂ．Ｃ，２４６，３２
６９−３２７６）ｃＤＮＡフラグメントを利用するＧｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法（１９７５，ＰＮＡ
Ｓ，７２，３９６１−３９６５）でのスクリーニングに
より陽性物を同定する。２つのクローンを得た、ｐ９１
０２３ＡＴＩＩＩ−Ｃ３はＡＴＩＩＩｃＤＮＡをアデノ
ウィルスプロモーターに関して適切な方向で含有し、ｐ
９１０２３ＡＴＩＩＩ−Ｅ１はｃＤＮＡを反対の向きで
含んでいる。プラスミドｐ９１０２３ＡＴＩＩＩ−Ｃ３
（ｐＡＴＩＩＩ−Ｃ３）（図６）は大腸菌−ＨＢ１０１
の株としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ）に受付番号ＡＴＣＣ３９９４１として寄
託されており、入手可能である。 【００６９】ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ−３および
ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｅ１は大腸菌中での生殖の
ためのＰＢＲ３２２由来複製物およびテトラサイクリン
耐性遺伝子およびＣＯＳサル細胞内での複製のためのＳ
Ｖ４０由来物およびｐＢＲ３２２“毒”領域の１．１Ｋ
Ｂ欠失を持つ（Ｌｎｓｋｙ．Ｍ．およびＭ．Ｂｏｔｃｈ
ａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ，２９３，７９−８
１）。ＣＯＳサル細胞内でのｃＤＮＡの発現の活性化の
要素は、アデノウィルスメジャー後期プロモーター（Ａ
ｄＭＬＰ；ＳＶ４０エンハンサー（ＳＶ４０ＡＶＡＩＩ
Ｄフラグメント）；アデノウィルスの３つに分かれたリ
ーダーのｃＤＮＡコピー；３つに分かれたリーダーの第
２のイントロンからの５′スプライス部位およびマウス
イムノグロブリン遺伝子からの３′スプライス部位から
なるハイブリッドイントロン（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．
Ｊ．およびＳｈａｒｐ Ｐ．Ａ．（１９８２）（Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，１３０４−１３１
９）；ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化信号；およびア
デノウィルスＶＡ遺伝子である。ヒトアンチトロンビン
ＩＩＩをコードする１．４Ｋｂ ｃＤＮＡの方向を示し
た。ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３はＡＴＩＩＩ ｃ
ＤＮＡをＡｄＭＬＰからの転写に対し適切な方向で含ん
でいる。 【００７０】ＣＯＳ細胞発現 実施例１に記載したごとく、ＣＯＳサル細胞内へＤＥＡ
Ｅ−デキストラン開始トランスフェクションによりｐ９
１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３およびｐ９１０２３−ＡＴ
ＩＩＩ−Ｅ１を導入した。トランスフェクションして２
４時間後、細胞を無血清Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌ
ｅ培地で洗い、条件付け培地を２４時間後に、ウサギ抗
−ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，より得た）
を用いるラジオイムノアッセイのため採取する。もしく
は、トランスフェクション４８時間後、細胞を35Ｓメチ
オニン（１ｍＣｉ／ｍｌ）で４時間標識する。条件付け
培地を採取し、実施例１に記載したごとく、免疫沈降お
よびＳＤＳゲル電気泳動のため細胞抽出物を調製する。
トランスフェクトしたＣＯＳ細胞条件付け培地中のＡＴ
ＩＩＩの検定結果を表２に示した。 【００７１】 【表４】表 ２ 遺伝子工学による哺乳類細胞中のＡＴＩＩＩはラジオイ
ムノアッセイにより検定された。ＣＨＯ 安定株 条件付け培地中のＡＴＩＩＩ ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂｌｌ ．０２１ｎＭ ＣＨＯ−Ｂｌ−１．０ｎｅｏ ５．２ ｎＭ ＣＨＯ−Ａ１−５．０ｎｅｏ ４．５ ｎＭ ＣＯＳ 遷移的感染 ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｅ１ ．０１８ ｎＭ ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３ １．９２ ｎＭ 【００７２】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺
伝子によるＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡ遺伝子の増幅 ＤＨＦＲが欠落したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞についてはＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｉｎによ
りＰＮＡＳ，７７，４２１６−４２２０（１９８２）に
記載されている。プラスミドｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ
−Ｃ３，ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｅｒｎ，Ｐ．および
Ｐ．Ｂｅｒｇ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，１，３２７−３４１）およびｐＡｄＤ２６Ｓ
ＶｐＡ（３）（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．およびＳｈａ
ｒｐ，Ｐ．Ａ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，（１９８
２），２，１３０４−１３１９）を一緒に混合し（２５
μｇ ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３，２．５μｇ
ｐＳＶ２Ｎｅｏおよび２．５μｇ ｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａ（３））、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を０．３Ｍ
までおよび２．５容量のエタノールを加えて沈殿させ
る。沈殿したＤＮＡは放置して風乾し、Ｋａｕｆｍａｎ
およびＳｈａｒｐらによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５
０：６０１−６２１（１９８２）に記載されているごと
く２ＸＨＥＢＳＳ（．５ｍｌ）（ＣｈｕおよびＳｈａｒ
ｐ Ｇｅｎｅ，１３，１９７−２０２（１９８１））に
再懸濁し、．２５Ｍ ＣａＣｌ2 （．５ｍｌ）と激しく
混合する。 【００７３】カルシウム−リン酸−ＤＮＡ沈殿は３０分
室温でインキベートする。５×１０ 5 細胞／１０ｃｍ皿
で前もって継代培養した（トラインスフェクションの前
に２４時間）ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１細胞の培地を除
き、ＤＮＡ−カルシウムリン酸沈殿を単属の細胞に添加
する。室温で３０分インキュベーション後、５ｍｌの１
０％小牛胎児血清を含むアルファー培地（Ｆｌｏｗ Ｌ
ａｂｓ）を供給し、細胞を３７℃で４．５時間インキュ
ベートする。細胞の単一層から培地を除き、室温（２４
℃）で３分間１０％グリセロールを含む２ｍｌのアルフ
ァー培地を加え、除去後細胞を洗い１０％小牛胎児血
清、各々１０μｇ／ｍｌのチミジン、アデノシン、デオ
キシアデノシン、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を含むアルファー培地に播種する。２日後細胞を１０％
透析小牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシ
ンを含み、ヌクレオサイド類を欠き、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８（ＧＩＢＣＯ）を含有するアルファー培地へ１：
１５で継代培養する。４−５日後細胞を同じ選択培地
（ヌクレオサイドを欠く）に再び播種する。選択培地へ
継代培養して１０−１２日後コロニーが現れる。 【００７４】各々の皿からコロニー（約２０）をプール
し、ｐＳＶ２Ｎｅｏの選択性を保つためのＧ４１８の共
存を除いてメトトレキセートの濃度を増加させて殖や
す。しかしながらｐＳＶ２Ｎｅｏの保持はＡＴＩＩＩ
ｃＤＮＡ遺伝子の増幅には必須ではない。形質転換体の
最初のプールは条件付け培地のラジオイムノアッセイま
たは35Ｓ−メチオニン標識および免疫沈降に続くＳＤＤ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の両方で検定しても
ＡＴＩＩＩ活性を示さない。しかしながら、０．０２、
０．１および１．０μＭメトトレキセート含有培地にお
ける選択後はＡＴＩＩＩは両方の方法で観察できる（表
１）。以後は希釈プレーティングでクローン株を得る。
ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞で産生されたＡＴＩＩＩはその
トロンビンへ結合する能力のため活性であり、ヘパリン
存在下結合が促進される事が示された。 【００７５】実施例５ 組織プラスミノーゲン活性化因子（ヒト）をコードする
ｃＤＮＡ 目的のｍＲＮＡを多量に含む他の細胞に前に使用した常
法に従ってＢｏｗｅｓメラノーマ細胞から単離されたｍ
ＲＮＡから逆転写によりヒトｔＰＡをコードするｃＤＮ
Ａ遺伝子を得た。ｔＰＡタンパク質はＢｏｗｅｓメラノ
ーマ細胞株（Ｒｉｆｋｅｎ博士（ＮｅｗＹｏｒｋ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ）より入手可能）より単離される。ア
ミノ酸配列分析は、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞からの条
件付け培地に見い出されたタンパク質は２つのはっきり
異なったＮ末端を含む事を示し、１つのＮ末端は他のも
のより３つ多くアミノ酸を含む。これらの２つのＮ末端
はグリシンＮ−末端（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｉ
ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ）およびセリン
Ｎ−末端（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−
Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＡＳｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｃｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉ
ｓ）と呼ぶ。 【００７６】Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞からメッセンジ
ャーＲＮＡを単離し、この分野で一般的に知られている
ごとく、ｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用する。
ｃＤＮＡをコピーし、二重鎖を産生する。この分野でよ
く知られている単一ポリマーでのテーリングまたは合成
リンカーでテトラサイクリン低抗プラスミドベクターを
導入する。クローン化したプラスミドのライブラリー
（各々のクローンはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞中に存在
するｍＲＮＡ種の独特のｃＤＮＡコピーを含有してい
る）をベクターで大腸菌を形質転換して調製し、抗生物
質耐性大腸菌細胞を選択する。 【００７７】少くともｔＰＡの一部をコードするｃＤＮ
Ａを含むｃＤＮＡライブラリー中のプラスミドを標準的
なＧｒｕｎｓｔｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓスクリーニン
グ法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、１９７５，ＰＮＡＳ，７
２，３９６１）により同定する。この方法においては、
ＤＮＡを単一鎖の方に固定し、放射性標識したプローブ
へのハイブリダイズまたは結合する能力をスクリーニン
グする。そのようなプローブとはｔＰＡタンパク質の小
さな一部のアミノ酸配列と一致する配列を持つ短いＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドである。ｔＰＡのＮ末端から１５
−２０のアミノ酸のアミノ酸配列を使用する（図７に示
した）。これらのアミノ酸のいくつかは１つ以上の３個
のヌクレオチドコドンでコードされるので、以下の常法
によりすべての可能性にわたる１７−ｍｅｒプローブを
プールする。その後ライブラリー中のクローンがプロー
ブにハイブリダイズする事が観察されるまでＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎおよびＨｏｐｎｅｓｓの方法でｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーンする。プライマーの上流配列を決定
する部分ジデオキシプライマー伸長（Ｗａｌｌａｃｅ
ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，３６４７−３
６５６（１９８１））として知られている通常の方法に
よりクローンがｔＰＡの一部をコードしている事を確認
する。これはクローンがｔＰＡのＮ−末端アミノ酸配列
に対応するコドンを含む事を実証する。 【００７８】クローン中に存在が観察されたｃＤＮＡは
プラスミドから単離し、放射性標識し、順次に、ｃＤＮ
Ａライブラリー中に観察される他の重複したｔＰＡ ｃ
ＤＮＡのフラグメントを同定するプローブとして用い
る。一緒に（２重の、重複した配列は除外して）成熟ｔ
ＰＡタンパク質および非翻訳５′および３′領域の部分
をコードするフラグメントが同定されるまでこの過程を
続ける。２つの異なったライブラリーをスクリーンして
一緒にｔＰＡの完全なコード配列をおおうｃＤＮＡクロ
ーンを得た。ｃＤＮＡクローンｓａｍｌおよびＳ２０が
非対称のリンカーを付けたライブラリーから単離され
た。このライブラリーは以下の常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、分子クローニング−実験用手引書、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（１９８２））により作
製した、即ちＢｏｗｅｓ細胞ｍＲＮＡからのｃＤＮＡを
３′末端でＥｃｏＲＩリンカーと５′末端でＳａｌＩリ
ンカーと連結し、連結したｃＤＮＡを適当なベクターに
挿入する。ｃＤＮＡクローンＥｄｌはＧＣ−テールドｃ
ＤＮＡライブラリー（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記文献）
から単離された。図８ａはｔＰＡ完全コード配列にまた
がり、部分的に重複している組からなるｃＤＮＡクロー
ンＳａｍ１、Ｓ２０およびＥｄ１を図示している。 【００７９】３つのフラグメントから単一コード配列を
一緒に結合するのに用いた技術を図８ｂ、８ｃおよび８
ｄに模式的に示した。図８ｂはフラグメントを受け取る
のに使用し、完全なｃＤＮＡ遺伝子の複製のためのプラ
スミドの構成を図示している。プラスミドＹＩｐ５の構
成はＢｏｔｓｔｅｉｎらによりＧｅｎｅ，８，１７−２
４（１９７９）に記載されている。２ｕイーストプラス
ミドは市販品である。指示“＋”はプラスミド中の制限
酵素部位を示す。制限酵素および／またはＤＮＡポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（以後しばしば
“Ｋｌｅｎｏｗ”と称する）による処理は矢印の次の名
称で示してある。これらの酵素は市販品である。普通の
酵素反応条件を用いる。ある種の制限酵素の消化産物の
連結により他の制限酵素により加水分解されないＤＮＡ
配列ができる事に注意されたい。例えばＹＯｐ４プラス
ミドの構成ではＨｐａＩ部位が消失する。図８ｃおよび
８ｄはライブラリーで同定された３つのｃＤＮＡフラグ
メントからの完全長ｃＤＮＡクローンを含むプラスミド
の構成を図示している。図８（ｃ）においてはプラスミ
ドＹＯｐ４をＸｂａＩで切断し、末端をＫｌｅｎｏｗで
平滑にし、直線状プラスミドは再びＥｃｏＲＩで切断す
る。遺伝子の５′末端を含むｔＰＡｃＤＮＡフラグメン
ト（非翻訳５′末端部分を含む−図７の枠で囲んだＳａ
ｌＩ部位を参照されたい）をＳａｌＩでの消化Ｋｌｅｎ
ｏｗ処理、およびＥｃｏＲＩでの消化によりそのプラス
ミドから単離する。線状ＹＯｐ４およびｔＰＡｃＤＮＡ
５′フラグメントＳａｍＩを連結しプラスミドＩ９０１
を形成するがその際ＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位の連結
によりＳａｌＩ部位が形成される。プラスミドＩ９０１
を大腸菌で連結し、アムピシリン耐性をスクリーニング
する。 【００８０】プラスミドＩ９０１は図８ｂに示したごと
く処理し、ｔＰＡｃＤＮＡの３′フラグメント（Ｅｄ
ｌ）（そのプラスミドの順にＢｇｌＩＩ，Ｋｌｅｎｏｗ
およびＥｃｏＲＩ処理により得る）と連結する。Ｂｇｌ
ＩＩ部位（図７で枠で囲んで示した）をプラスミドＩ９
０１のＣｌａＩ消化物への連結によりこわす。ｔＰＡｃ
ＤＮＡのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ−Ｐｓ
ｔＩ副フラグメントは捨てる、第１のものはなぜなら非
コード領域であり、第２のものは第３のフラグメントＳ
２０（図８ｃ）と重複した領域のためであり、Ｓ２０に
より捨てた配列が供給される。これらの工程によりプラ
スミドＪ１１８を得、それは大腸菌中で複製させ、アン
ピシリン耐性をスクリーンする。プラスミドＪ１１８を
ＥｃｏＲＩで切断し、図８ｃに示した中央のｔＰＡｃＤ
ＮＡフラグメントＳ２０と連結する。Ｊ２０５中のＳ２
０フラグメントの適切な方向は、この分野で一般に知ら
れている非対称エンドヌクレアーゼ消化により確認す
る。このｔＰＡｃＤＮＡ遺伝子は前に発表されたヒトｔ
ＰＡの配列と、ヌクレオチドの数が異なり、図７に示し
たごとく一つのアミノ酸が置換されている。 【００８１】実施例６ 形質転換ベクターｐＬＤＳＧの構成 この実施例の出発プラスミドはｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．２（１１）：１３０４−１３１９（１９８２））と
して知られているものである。それは図９ａに記載した
構造を持つ。簡単に記すと、このプラスミドはアデノウ
ィルス２（Ａｄ２）メジャー後期プロモーターの転写制
御下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。５′プラスミド部位はアデ
ノウィルスＤＮＡに包含されており、イムノグロブリン
遺伝子から誘導された５′スプライス部位はＡｄ２メジ
ャー後期プロモーターおよびＤＨＦＲコード配列の間に
存在する。ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位はＤＨＦＲ
コード配列の下流に存在する。ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）の原核生物誘導部はｐＳＶＯｄ（Ｍｅｌｌｏｎ，
Ｐ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｖ．，Ｇｌｎｚｍａｎ，Ｙ．およ
びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．１９８１，Ｃｅｌｌ，２７，
２７９−２８８）からであり、哺乳類細胞の複製を阻害
する事が知られているｐＢＲ３２２配列（Ｌｎｓｋｙ，
Ｍ．，およびＢａｔｃｈａｎ，Ｍ．１９８１，Ｎａｔｕ
ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２９３，７９−８１）を含んで
いない。 【００８２】ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）を図９ａに示
した第１の工程でプラスミドｐＣＶＳＶＬ２に変換す
る。ＳＶ４０ＤＮＡをＡｖａＩＩで消化し、そのフラグ
メントにＸｈｏＩリンカーを連結し、ＸｈｏＩで消化し
てＸｈｏＩ部位を開裂させ、ゲル電気泳動により４番目
に大きい（Ｄ）フラグメントを単離してＳＶ４０のＡｖ
ａＩＩＤフラグメントを得る。第１の工程に示したごと
くリンカーを結合したＤフラグメントを挿入して、ＳＶ
４０エンハンサーの単一直接繰り返しを得る。これは連
結の時ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）の量とＸｈｏ−Ｉリ
ンカー結合Ｄフラグメントを比例させた結果である。ｐ
ＣＶＳＶＬ２中のＳＶ４０Ｄフラグメントの方向はアデ
ノウィルスメジャー後期プロモーターの様にＳＶ４０後
期プロモーターが同じ向きになっているごとくである。
ｐＣＶＳＶＬ２を実施例５からのＪ２０５ｔＰＡ遺伝子
でのスプライシングのために合致するように計画された
３工程過程によりプラスミドｐＢ２Ｌ２に変換する。第
１に、ｐＣＶＳＶＬ２中の２つのＰｓｔＩ部位の１つを
ＰｓｔＩ（ただ１つのＰｓｔＩ部位が切断された線状プ
ラスミドの亜集団を得る事ができるように酵素活性が低
下したものを用いる）で部分消化して欠失させ、Ｋｌｅ
ｎｏｗで処理し、連結してプラスミドを再環化し、大腸
菌を形質転換させ、ＳＶ４０ポリアデニル化配列の３′
に位置するＰｓｔＩ部位の欠失をスクリーニングする。 【００８３】第２に、プラスミドをＢｇｌＩＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、連結し、大腸菌形質転換体
コロニーのイムノグロブリンイントロンのＢｇｌＩＩ部
位（図３ａの３′スプライス部位）が破壊されたものを
スクリーニングする。第３にＰｓｔＩでの消化、Ｋｌｅ
ｎｏｗ処理、ＢｇｌＩＩリンカーの連結および過剰の
（１００単位／μｇ ＤＮＡ）ＢｇｌＩＩによる消化で
ＰｓｔＩ部位をＢｇｌＩＩ部位に変換する。生じる線状
ＤＮＡをトリス−酢酸緩衝液中低融点アガロース（１．
２％）ゲルでのゲル電気泳動により単離する。このＤＮ
Ａはインビトロで１μｇ／ｍｌの濃度で２４°にて連結
し、大腸菌ＨＢ１０１をトランスフェクトするのに使用
する（Ｈａｎｉａｔｉｓらの前記文献を参照された
い）。テトラサイクリン耐性のコロニーを成長させ、Ｄ
ＮＡを調製し、ＢｇｌＩＩおよびＰｖｕＩＩ消化により
ＤＨＦＲｃＤＮＡの５′末端のＢｇｌＩＩ部位の存在を
分析し、ＰｓｔＩで消化する。多量の規模でのＤＮＡ調
製はＣｓＣｌで２度ＤＮＡをひもで縛って実施した。 【００８４】実施例５からのｐＪ２０５をＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＳａｌＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、Ｂ
ａｍＨＩリンカーを連結した。生成するＤＮＡはフェノ
ール抽出を行い、クロロホルムで抽出し、酢酸ナトリウ
ムを０．３Ｍ（ｐＨ４．５）まで、および２．５容のエ
タノールを添加してエタノール沈殿する。遠心分離によ
りＤＮＡを回収し、ペレットを乾燥する。ペレットを再
懸濁し、ＢａｍＨＩリンカーを切断するためＢａｍＨＩ
（１００単位／ＤＮＡμｇ）で消化する。消化物をアガ
ロースゲルに応用し２．１ｋｂバンドを同定する。バン
ドを回収し、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）およ
び１ｍＭＥＤＴＡを含む等量の緩衝液を加え、６８°で
１５分間加熱してＤＮＡを得る。ＤＮＡをフェノール抽
出し（２Ｘ）、クロロホルム抽出して（２Ｘ）、酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４．５）の０．３Ｍまでの添加および
２．５容のエタノールの添加によりエタノール沈殿させ
る。 【００８５】図９ｂに図示したごとく、ベクターｐＢ２
Ｌ２をＢｇｌＩＩで消化し、ウシアルカリホスファター
ゼで処理し、フェノール（２Ｘ）、クロロホルム（２
Ｘ）で抽出し、０．３ＭまでのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．
５）および２．５容のエタノールの添加によりエタノー
ル沈殿する。この沈殿したＤＮＡをｐＪ２０５からのＢ
ａｍＨＩリンカーを結合した２．１ｋｂフラグメントと
連結する。連結ＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１の形質転換に
使用する。テトラサイクリン耐性のコロニーをＧｒｕｎ
ｓｔｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法によりｔＰＡｃＤＮＡに特
異的な32Ｐ標識プローブを用いてスクリーニングする。
Ｊ２０５をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化し、32
Ｐ−アルファ−ｄｃＴＰを利用してＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで標識してプローブを作製する。陽性のハイブリッ
ドクローンからＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｖ
ｕＩＩおよびＳａｃＩを用いる別々の制限酵素消化によ
りｔＰＡｃＤＮＡの存在をスクリーニングする。これら
の消化によりｔＰＡｃＤＮＡの存在ばかりでなく、ベク
ター内のプロモーターに対するｃＤＮＡの方向もまた示
される。ｐＬＤＳＧは適切な方向のｔＰＡを含むプラス
ミドである。 【００８６】実施例７ 共トランスフェクションおよび増幅 プラスミドｐＬＤＳＧおよびｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）（実施例６）を一緒に混合し（５０μｇ ｐＬＤ
ＳＧおよび０．５μｇ ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３））、０．３ＭまでのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）お
よび２．５容のエタノールの添加により沈殿せしめる。
沈殿ＤＮＡは放置して風乾し、２ｘＨＥＢＳＳ（０．５
ｍｌ）（ＣｈｎおよびＳｈａｒｐ Ｇｅｎｅ，１３，１
９７−２０２（１９８１））に再懸濁しＫａｕｆｍａｎ
およびＳｈａｒｐによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５
０，６０１−６２１（１９８２）に記載されているごと
く０．２５ＭＣａＣｌ2 （０．５ｍｌ）と激しく混合す
る。カルシウム−リン酸−ＤＮＡ沈殿は室温で３０分間
そのまま放置し、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１細胞（Ｃｈａ
ｓｉｎおよびＵｒｌａｕｂ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７７，
４２１６−４２２０（１９８０））に適用する。これら
の細胞の成長の保持はすでに記載されている（Ｋａｕｆ
ｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．前記
文献およびＣｈａｓｉｎおよびＵｒｌａｕｂ前記文
献）。 【００８７】ＤＵＫＸ−Ｂ１細胞はトランスフェクショ
ン２４時間前に５×１０5 ／１０ｃｍ皿で継代培養す
る。培地を除き、ＤＮＡ−カルシウムリン酸沈殿を単層
の細胞に添加する。室温で３０分間インキュベーション
後１０％小牛胎児血清を含むアルファー培地（Ｆｌｏ
ｗ）５ｍｌを加え細胞は３７°で４．５時間インキュベ
ートする。培地を細胞の単一層から除き、１０％グリセ
ロール含有の２ｍｌのアルファ培地（Ｆｌｏｗ）を室温
（２４°）で３分間添加し、除去後細胞を洗い、１０％
小牛胎児血清、各々１０μｇ／ｍｌのチミジン、アデノ
シン、デオキシアデノシン、ペニシリンおよびストレプ
トマイシンを含むアルファー培地に播種する。２日後、
１０％透析小牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプト
マイシンを含むがヌクレオサイドを欠くアルファー培地
に１：１５で継代培養する。４−５日後細胞を、再び同
一の選択培地（ヌクレオサイドを欠く）に播種する。 【００８８】１０−１２日後現れたコロニーを選択培地
へ継代培養する。メトトレキセート（ＭＴＸ）選択およ
び増幅の２つの図式を追いかけた。表３の下に示した第
１の図式では、外来性ＤＮＡ（選択遺伝子）の取り込み
に基づいて単一の独立したクローン化形質転換体を単離
し、続いて各々のクローンは生成物遺伝子の発現を増加
させる条件下殖やす（即ち、メトトレキセートの濃度を
増加させての成長）。第２の図式では、外来性ＤＮＡ
（選択遺伝子）の取り込みに基づいて多くの独立した形
質転換体のプールを単離し、生成物遺伝子の発現を増加
させる条件下殖やす（即ちメトトレキセートの濃度を増
加させての成長）。集団から個々のクローンを単離し、
生成物遺伝子の発現を分析する。生成物遺伝子発現の最
も高い水準を示すクローンはさらに生成物発現が増加す
る条件下再び成長させる（即ち、培養培地中のメトトレ
キセートの濃度を増加させて成長させる）。 【００８９】図式１に従った結果は表４に示した。ヌク
レオサイドなしのアルファー培地で成長できる個々のク
ローンを選択し、殖やし、ｔＰＡ活性を検定する。活性
はＣＴＡミリ単位／細胞／日即ちｍＵ／細胞／日で記録
した。（以下を参照）。ｔＰＡ活性を示すクローンは続
いて０．０２μＭＭＴＸ、０．１μＭＭＴＸおよび０．
５μＭＭＴＸへの連続的耐性で選択した。ＭＴＸ選択下
ではクローン４Ｃ１はｔＰＡ活性の増加がなかった。し
かしながら、ＭＴＸ不在下４Ｃ１を培養して、サブクロ
ーン（Ｈ３ＢおよびＢ１０Ａ）を発生させるとそれらは
ＭＴＸ耐性で選択した場合共増幅し、高水準のｔＰＡを
発現する。ここの方法を特定の仮説に制限する事は望ん
でおらず、これは元々の４Ｃ１形質転換体からの兄弟Ｄ
ＮＡ中のｔＰＡに連結していないＤＨＦＲ遺伝子の分離
のせいであると考えられる。ｔＰＡ遺伝子に連結した単
一のＤＨＦＲ遺伝子を含むサブクローンはＭＴＸ選択に
よりこれらのクローンと一緒にＤＨＦＲおよびｔＰＡ遺
伝子を増幅する。 【００９０】 【表５】 【００９１】 【表６】【００９２】経路２による結果は表５に示す。ヌクレオ
シドを含まない培地中での選択による継代培養で得られ
た約３００のコロニーを持つプールが調製された（選択
プレートからのコロニー）。これらの形質転換体は０．
０２μＭ ＭＴＸおよび０．０５μＭ ＭＴＸに対する
セクエンシャル耐性によってこれら形質転換体を選択し
た。元のプールされた形質転換体は、０，０．０２およ
び０．５μＭ ＭＴＸを含む培地中でのカルチャーにつ
いて、それぞれ０．０３，０．９および１．９ｍＵ／細
胞／日のｔＰＡ活性を得たが、集団内の個々のクローン
は表５に示す量でｔＰＡを発現した。個々のクローンは
０．２ｍＵ／細胞／日から１０ｍＵ／細胞／日の範囲の
５０倍でｔＰＡ発現レベルが変わった。この経路は大量
ｔＰＡ活性を発現するクローンを速かに同定するために
好ましい。経路１は経路２と組合せてより増殖性の形質
転換体を作ることができることは明らかであろう。 【００９３】 【表７】【００９４】ｔＰＡ発現のモニター ｔＰＡをモニターするｔＰＡの存在についての感受性検
定はフイブリンの存在下でのプラスミノーゲンのプラス
ミンへの転化を触媒した。プラスミンは、プラスチック
プレートに固定されている 125Ｉ−フイブリンからの
125Ｉ−フイブリンフラグメントの放出により検出され
る（Ｓｔｒｉｃｋｌｏｎｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｂｅ
ｍ．２５１ ５６９４−５７０２（１９７６）か、また
は色素産性基質の分解によって検出される（Ｄｒａｐｉ
ｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ６１，４０３−４７１（１
９７９）。好適な色素産性基質（Ｓ２２５１と称され
る）はＫａｂｉ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｇ
ｒｅｅｎｗｈｉｃｂ．ＣＴ）から得られる。これらの検
定は当業者には良く知られており、上記Ａｓｔｒｕｐ等
および上記Ｄｒａｐｉｅｒ等に言及されている。ｔＰＡ
活性は無血清培地５ｍｌで細胞を有するプレート（４×
１０5 細胞／１０ｃｍプレート）をゆすぎ、次いで無血
清培地４ｍｌを加えることによって測定された。細胞を
３７℃で２０時間インキュベートし、調質培地中のサン
プルを検定用に取出した。活性の測定はｍＵ／細胞／日
の単位で表わした。このような条件下での検定で、Ｂｏ
ｗｅｓメラノーマ細胞ラインは０．０２ｍＵ／細胞／日
を生産した。ヒトｔＰＡの比活性は１００，０００ユニ
ット／ｍｇであった。 125Ｉ−フイブリンまたはＳ２２
５１の分解速度はプラスミノーゲンからプラスミンへの
転化を触媒したｔＰＡ量に直接相関する。ｔＰＡ発現の
欠損している細胞からの調質培地のサンプルはこれらの
検定には無視し得るバックグラウンドしか生じない。こ
の無視し得るバックグラウンドは活性化されたフイブリ
ンではないプロテアーゼによるものである。何故なら
ば、色素産性基質検定におけるバックグラウンドは、フ
イブリンの除去によっても標準検定から変化しないため
である。 【００９５】これに反して、ｔＰＡ産性ＣＨＯ細胞ライ
ンからの活性はＢｏｗｅｓメラノーマｔＰＡによって示
されるのと極めて似ているフイブリン活性化を示す。ｔ
ＰＡ活性の定量はウロキナーゼを用いる標準曲線と比較
することによって得られる（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ．ベルギー）。活性の単位（ＣＴＡ；血
栓溶解剤委員会）はウロキナーゼのＷＨＯ標準サンプル
と比較することにより定義されている。ｔＰＡの合成
は、単増の細胞（２×１０6 ／１０ｃｍ）を５ｍｌのメ
チオニンを含まない培地で２度洗浄し、１ｍＣｉ35Ｓメ
チオニンを含み通常のメチオニンを含まない培地１ｍｌ
を添加することによりモニターされる。細胞を３７℃で
４時間インキュベートし、調質培地を免疫吸着剤として
スタフィロコッカス アウレウスを用い、うさぎの抗−
ヒトｔＰＡと免疫沈澱させることにより検定した。 【００９６】コローンＨ３Ｂから分泌された標識化され
た全ての蛋白をゲル電気泳動して得られる結果によれ
ば、ヌクレオシドを含まない培地中で増殖された元のＨ
３Ｂサブクローンと０．１μＭ ＭＴＸ中の増殖に関し
て選択されたＨ３Ｂ細胞との間における分泌蛋白の唯一
の大きな差異は６７，０００ダルトンに泳動する強力な
バンドの存在である。このバンドはうさぎの抗−ヒトｔ
ＰＡ抗体と特異的に免疫沈澱し、かつＢｏｗｅｓメラノ
ーマ細胞ラインから同様に調製されたｔＰＡと共泳動す
る。これらの結果は、０．１μＭ ＭＴＸに耐性を持つ
Ｈ３Ｂクローンの選択時に、ヒトｔＰＡの発現が１０倍
増加することを示している。 【００９７】実施例８ 隣接リンクトベクターの造成 この実施例はｔＰＡの停止コドンをＤＨＦＲの開始コド
ンと直接に結合させた形質転換ベクターの造成を説明す
るものである。これは実施例６で造成されたｐＬＤＳＧ
からｔＰＡ３′およびＤＨＦＲ５′非翻訳領域を除去す
るものである。本実施例はＭ１３ファージテンペレート
からＤＮＡ合成をプライミングするためのＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの使用に基いている（Ｗａｌｌａｃｅ等、
「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２０９：１３９６（１９８０）、Ｚ
ｏｌｌｅｒ等「Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ Ｖｏｌ．１００：４６８−５０９）。第１０図を
参照のこと。ｐＬＤＳＧはＢａｍＨＩで分解され、４．
５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動によって単離した。
この領域はｐＬＤＳＧの非ｐＢＲ３２２領域の大部分を
含んでいる。ファージＭ１３ ｍｐ８をＢａｍＨ１で分
解する。次いで、直線化されたファージをｐＬＤＳＧの
４．５ｋｂフラグメントと結合し、Ｍ１３造成物を宿主
菌（ＪＭ１０３）の形質転換に用いる。ｔＰＡ遺伝子と
融合する32Ｐで標識したプローブを用いるＢｅｎｔｏｎ
−Ｄａｖｉｓの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９６（１９８０）
の方法によりプラークをスクリーニングする。正に融合
するクローンを増殖し、複製型ＤＮＡを作製する。ｔＰ
Ａ遺伝子の正しい方向は制限エンドヌクレアーゼによる
分解（ＢａｍＨ１，ＥｃｏＲ１およびＰｖｕＩＩ）を用
いる公知の技術で決定することができる。 【００９８】ファージＤＮＡは、正しい方向を示すプラ
ークから単離される。この一本鎖ＤＮＡは除去されるべ
きファージの領域を架橋する合成プライマーと共に使用
できる。プライマーの機能は５′および３′の除去領域
であるＤＮＡに融合させるものであり、これによって位
置がくるっている望ましくないＤＮＡをループ化し、こ
のようなＤＮＡが後のプライマー延長工程においてテン
ペレートとして作用することを防止する。第１０図にお
いて、プライマーの５′および３′末端およびＭ１３−
ＬＤＳＧにおける対応位置はそれぞれＢおよびＡと命名
する。プライマーは化学合成によって作られ、ＤＨＦＲ
−３′のアミノ末端におけるｔＰＡ遺伝子−ＴＡＡ−Ａ
ＴＧ−これに続く９個の翻訳されたヌクレオチドの５′
−末端の９個の翻訳されたヌクレオチドから成る。ファ
ージＤＮＡおよびプライマーを混合し、プライマーはＴ
４ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅ
ｎｏｗフラグメントによって延ばされる。これは上記Ｗ
ａｌｌａｃｅ等およびＺｏｌｌｅｒ等の文献に一般的に
説明されている。生成物はＪＭ１０３を形質転換するの
に用いられる。プラークからの複製型ファージＤＮＡは
32Ｐ−標識化プライマーに融合され、Ｓａｎｇｅｒによ
って望ましくない領域を除去したジデオキシヌクレオチ
ド配列として確認されており（Ｓａｎｇｅｒ等Ｐｒｏ
ｂ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４ ｐｐ５４６３
−５４６７（１９７７））、これはＢａｍＨ１で分解さ
れ、かつｔＰＡ遺伝子含有フラグメントを電気泳動で単
離する。このフラグメントはゲルから分離され、前記の
ＢａｍＨ１分解で得たｐＬＤＳＧの２．５ｋｂ Ｂａｍ
Ｈ１フラグメントと結合される。結合生成物はＥＣｏｌ
ｉ ＨＢ１０１の形質転換に用いられ、テトラサイクリ
ン耐性クローンを同定し、プラスミドＤＮＡを作り、か
つ特定する。２．５ｋｂおよび４．５ｋｂフラグメント
の方向が正しいプラスミドをｐＬＤＳＧＬとして同定す
る。このプラスミドはｐＬＤＳＧおよびｐＡｄＤ２６Ｓ
ＶｐＡ（３）の代りに、実施例７におけるリンクトベク
ターとして使用できる。 【００９９】実施例９ ｐＬＤＳＧはＢａｍＨ１で分解され、第１０図に示され
るように４．５ｋｂフラグメントが単離される。Ｂａｍ
Ｈ１分解による２．５ｋｂフラグメントと共に、実質
上、全てのｐＢＲ３２２領域が除かれる。ｐＡｄＤ２６
ＳＶｐＡ（３）も同様に分解される。ｔＰＡおよびＤＨ
ＦＲ遺伝子含有フラグメントはｐＬＤＳＧおよびｐＡｄ
Ｄ２６ＳＶｐＡ（３）について実施例７に示すようにＣ
ＨＯ細胞を形質転換するのに用いられる。 【０１００】実施例１０ アデノウィルストリパータイトリーダーおよびＶＡ遺伝
子を含むベクター 本実施例の方法は第１１図に説明されている。アデノウ
ィルストリパータイトリーダーを含むベクターを造成す
るために、ｐＢ２Ｌ２から出発し、これをＰｖｕＩＩで
開裂して直線状分子を作成する。次いで、ｐＪＡＷ４３
（Ｚａｉｎ等「Ｃｅｌｌ」１６，８５１（１９７９）を
ＸｈｏＩで分解し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、ＰｖｕＩＩ
で分解し、更に１３８塩基対フラグメントをアクリルア
ミドによる電気泳動（トリス硼酸塩バッファー中６％；
Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２））で単離する。１３８
ｂｐフラグメントを次いでＰｖｕＩＩ分解ｐＢ２Ｌ２に
結合する。結合生成物をＥＣｏｌｉをテトラサイクリン
耐性に形質転換するのに用いられ、32Ｐで標識化され、
１４０塩基対フラグメントに対して融合するプローブを
用いＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法でスクリー
ニングする。正に融合するコロニーからＤＮＡを作成
し、再生されたＰｖｕＩＩサイトが第２および第３アデ
ノウィルス後リーダーに特異的に挿入された１３８塩基
対ＤＮＡの５′であるかまたは３′であるかを試験す
る。ＰｖｕＩＩサイトの正しい方向では、１３８塩基対
は５′側に挿入されるであろう。このプラスミドはｐＢ
２Ｌ２−ＴＰＬと命名する。 【０１０１】アデノウィルス関連（ＶＡ）遺伝子をｐＢ
２Ｌ２−ＴＰＬに挿入するために、アデノウィルスタイ
プ２ＤＮＡ第１をＨｉｎｄＩＩＩで分解する。公知の方
法によるゲル電気泳動の後に、Ｅフラグメントを単離す
る。このフラグメントをＫｌｅｎｏｗで処理し、Ｈｐａ
Ｉで分解し、ＥｃｏＲＩ部位リンカーに結合させ（協同
的）、ＥｃｏＲＩで分解し、そして１．３ｋｂバンドを
アガロースゲルから分離する。このフラグメントを予じ
めＥｃｏＲＩで分解したｐＢ２Ｌ２−ＴＰＬのＥｃｏＲ
Ｉサイトに結合する。ＥＣｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転
換およびテトラサイクリン耐性による選択後、ＶＡ遺伝
子に特異的なＤＮＡプローブに対するフイルター融合に
よりコロニーをスクリーニングする。正に融合するクロ
ーンからＤＮＡを作成し、制限エンドヌクレアーゼ分解
により特定する。生成プラスミドはｐＢ２Ｌ２−ＴＰＬ
Ｖで分解される。これは実施例６のｐＢ２Ｌ２に代えて
好適に使用され、修飾ｐＬＤＳＧを生成し、この生成物
は実施例７の方法におけるｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）
と共に使用される。 【０１０２】実施例１１ 免疫グロブリンエンハンサーを含むベクターの造成 ベクターｐＳｅｒは記述されている（Ｇｉｌｌｉｅｓ
等、「Ｃｅｌｌ」３３：７１７−７２８（１９８３））
これはＳＶ４０エンハンサーが除去されているｐＳＶ２
ＧＰＴの誘導物である（ＰｖｕＩＩからＳｐｈｌ，塩基
対６４〜２７０）。Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、「Ｓｃｉｅｕ
ｃｅ」２０９：１４２２−１４２７（１９８０）を参照
されたい。このＤＮＡは、細胞がキサンチンおよびヒポ
キサンチンの存在下で増殖される場合、ミコフェノール
酸に対する耐性をコード化している。マウス免疫グロブ
リンの不変部から誘導された免疫グロブリンエンハンサ
ーを含む１ｋｂフラグメントをｐＳｅｒのＥｃｏＲＩサ
イトに挿入し、ｐＳｅｒｘ２／３を誘導した。 【０１０３】このベクターは１個のＢａｍＨＩサイトを
持つ。これをＢａｍＨ１で分解し、塩基性ホスホターゼ
で処理し、次いでｐＬＤＳＧのフラグメントに結合す
る。このフラグメントは実施例８に示すように、Ｂａｍ
Ｈ１による分解および大きな（４．５ｋｂ）フラグメン
トの分離によって作られる。結合されたＤＮＡはアンピ
シリン耐性によって選択されるＥｃｏｌｉ ＨＢ１０１
を形質転換するのに使用され、コロニーは32Ｐ標識化ｔ
ＰＡプローブに対する交雑によるｔＰＡ遺伝子の存在に
よってＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法によりス
クリーニングする。このプローブはＪ２０５をＨｉｎｄ
ＩＩＩおよびＳａｌＩで分解し、32Ｐ−α−ｄＣＴＰお
よび放射性同位元素を含まないｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよ
びｄＧＴＰの存在下にこのＮＤＡにＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼにより標識化することにより作ることができる。正
に交雑するクローンは増殖され、プラスミドは回収され
る。第１２ａ図はこのベクター（ｐ７Ｂ１）を説明して
いる。このＤＮＡは、プロトプラスト融合のＳａｎｄｒ
ｉ−Ｇｏｌｄｉｎ法の変法である前記Ｇｉｌｌｉｅｓ等
に説明されているようなミエローマ細胞Ｊ５５８Ｌ中に
導入される。プロトプラストの融合３６時間後、細胞を
５ｍｇ／ｍｌのミコフェノール酸、２５０μｇ／ｍｌの
キサンチンおよび１５ｍｇ／ｍｌのヒポキサンチンを含
む培地中で増殖され、プラスミドＤＮＡを取込んだ細胞
を選択した。この方法で単離した１つのクローンはｔＰ
Ａを０．０５ｍＵ／細胞／日の割合で発現した。他の適
当な親細胞はＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０または他の非分
泌性ミエローマ細胞株である。 【０１０４】実施例１２ 転写的に活性化されたベクターの造成 転移活性転写性アクチベーターＥ１Ａを、アデノウィル
ス初期領域２プロモーターを含むベクターと共に使用す
る。ｐＣＶＳＶＬはＫａｎｆｍａｎ等「Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌ．Ｂｉｏｌ」２（１１）１３０４−１３１９（１９８
２）に開示されている。ｐＣＶＳＶＬをＢａｌで分解
し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、Ｘｈｏｌリンカー（共働
的）に結合し、Ｘｈｏｌで分解し、ＥｃｏＲＩで分解
し、ゲル電気泳動により４．２ｋｂフラグメントを単離
する。 【０１０５】アデノウィルス２ＤＮＡをＥｃｏＲＩで分
解し、ＥｃｏＲＩ Ｆフラグメント（マップユニット７
０．７〜７５．９）を回収する。ＦフラグメントをＸｈ
ｏｌで分解し、かつＥ２プロモーターサブフラグメント
をゲル電気泳動で単離した。このサブフラグメントはＥ
ｃｏＲｌおよびＸｈｏｌ粘着末端を有し、上記で得られ
たｐＣＶＳＶＬの４．２ｋｂフラグメントのＥｃｏＲｌ
およびＸｈｏｌ末端に結合される。得られるプラスミド
は細菌を形質転換するのに使用される。標識化Ｅ２プロ
ーブに交雑するクローンはｐＥ２−７として回収され
る。ｐＥ２−７はアデノウィルス初期領域プロモーター
を利用するＤＨＦＲｃＤＮＡ遺伝子である。ｐＥ２−７
の造成はＲ．ＫｉｎｇｓｔｏｎおよびＰ．Ｓｈａｒｐの
方法によって与えられる。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ１９７０−１９７７（１９８
４）を参照のこと。ｐＥ２−７はＰｓｔｌで部分分解さ
れ、Ｋｌｅｎｏｗで処理され、ＢｇｌＩＩリンカーに結
合され、ＢｇｌＩＩで分解される。これによって、ｐＪ
２０５（第９ｂ図）からのｔＰＡ遺伝子を常法によりｐ
Ｅ２−７に挿入できる。 【０１０６】ｔＰＡ遺伝子を持つｐＪ２０５の一部を第
９ｂ図に示すようにｐＪ２０５から切除し、ＢａｍＨｌ
粘差末端をｐＥ２−７のＢｇ１ＩＩ接着末端に結合し、
第１２（ｂ）図に示すプラスミドｐＥ２−７ＰＡを得
る。ｐＥ２−７ＰＡはアデノウィルス初期領域２プロモ
ーターを利用するｔＰＡ遺伝子である。Ｅ１Ａ遺伝子お
よびプロモーターはアデノウィルス２のＫｐｎｌフラグ
メント（１０〜５．８マップユニット）として得られ
る。ｐＥ２−７ＰＡ，ｐＥ２−７およびＥ１Ａ遺伝子ベ
クターは２０：１：４のモル比で使用され実施例７に更
に開示されているようにＣＨＯ細胞を形質転換する。こ
のように単離された形質転換体によりｔＰＡ活性が０．
００８ｍＵ／細胞／日生産される。Ｅ１Ａ遺伝子を省略
して得られる形質転換体（２０：１の比率でｐＥ２−７
を持つｐＥ２−７ＰＡ）では僅かに０．０００３ｍＵ／
細胞／日を発現する。 【０１０７】実施例１３ ｔＰＡ発現の増加に関連する細胞形態学における変化 ｔＰＡ合成の最適条件下での増殖および選択により、組
織培養皿に付着できない形態の異った細胞が得られる。
低水準のｔＰＡ（０．０１ｍＵ／細胞／日）を生産する
無ヌクレオシド培地（実施例７、表４に説明されている
ようなもの）中で増殖された３００個の形質転換体のプ
ールでは平らな形態上の特徴を持つＣＨＯ細胞である。
０．０５μＭ以下のＭＴＸ中での増殖について表４に説
明したような選択を行った場合、ｔＰＡの水準は０．６
ｍＵ／細胞／日に増加し、形態上の変化は明らかになっ
た。このような変化は１．２ｍＵ／細胞／日以上を生産
するクローン（例えば、クローン９、１２および２０）
においても明らかである。これらの細胞は組織培養皿に
付着せず、したがってより高い水準のｔＰＡ発現による
選択は困難である。これはアプロチニン（シグマ）を培
地に添加（０．５〜５％Ｖ／Ｖ）することにより、また
はプラスミノーゲンを含まない胎児小牛血清を用いるこ
とによって克服された。これらの処理の結果は、高水準
のｔＰＡを生産する細胞に負荷された毒性を転減するこ
とである。無プラスミノーゲン血清はＤｅｕｔｓｃｂア
ンドＭｅｒｔｚ「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９７０）ｐ１０
９５に説明されるように血清をリジン−セファロース４
Ｂ（ファルマシア社製）のカラムに通過させることによ
って得られる。 【０１０８】実施例１４ ＣＯＳ細胞におけるＥＰＯの発現 エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子を含むクローンを遺
伝子工学的手法によりヒト胎児肝臓ライブラリーから作
成した。ラムダーＨＥＰＯＦＬ１３を命名するＥＰＯク
ローンは第１３図に示すヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を持つ。クローンラムダーＨＥＰＯＦＬ１３はｐ
９１０２３（Ｂ）ベクターに挿入され、当業者には公知
の遺伝子工学的手法を用いてＣＯＳ−１細胞に感染させ
た。精製プラスミドＤＮＡのそれぞれ８μｇを用いてＤ
ＥＡＥ−デキストラン法により５×１０6 ＣＯＳ−１細
胞に感染させた（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ等，「Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」７８：７５７５−７５
７８（１９８１）およびＬｕｔｈｍａｎ等「Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，」１１：１２９５−１３０８（１
９８３））。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン−
（０．１ｍＭ）で２時間、３７℃処理し、再度洗浄し、
１０％胎児牛血清１０％を含む１０ｍｌの培地に２４時
間曝した。この培地を４ｍｌの無血清培地に変え、４８
時間後に回収した。 【０１０９】免疫活性ＥＰＯ（ａ）の生産をＳｈｅｒｗ
ｏｏｄおよびＧｏｌｄｗａｓｓｅｒ（Ｂｌｏｏｄ，５
４：８８５−８９３（１９７９））に説明されているよ
うなラジオイムノアッセイによって定量し、３００ｎｇ
／ｍｌであることが判明した。ラムダーＨＥＰＯＦＬ１
３を含むｐ９１０２３（Ｂ）ベクターも、クロロキン処
理無しでＣＯＳ−１細胞に感染させ、前記と同様に増殖
させた。ＥＰＯのインビトロ生物活性は、ＣＦＵ−Ｅの
供給源であるマウスの胎児肝臓細胞によるコロニー形成
検定によるか、またはフェニルヒドラジン注射マイスか
らの脾細胞を用いる 3Ｈ−チミジン取込み検定によって
測定され、それぞれ２Ｕ／ｍ、および３Ｕ／ｍｌの値を
得た。また、ＥＰＯのインビボ生物活性は、低酸素状マ
ウス法または絶食ラット法を用いて測定し、それぞれ、
１（ＣＦＵ−Ｅ）および２（ 3Ｈ−Ｔｈｙ）Ｕ／ｍｌの
値を得た。 【０１１０】実施例１５ ＣＨＯ細胞におけるＥＰＯの発現 （ベクターＰＫ１−４の造成）マウスのジヒドロ葉酸還
元酵素に隣接するＳＶ４０初期領域プロモータ、ＳＶ４
０エンハンサー、小ｔ抗原イントロンおよびＳＶ４０ポ
リアデニル配列を含むプラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲ（Ｓ
ｕｂｒａｍａｎｉ等、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」
１：８５４−８６４（１９８１）からのＢａｍＨＩ−Ｐ
ｖｕＩＩフラグメント（フラグメントＡ）を単離した。
残りのフラグメントは以下のようにベクターｐ９１０２
３（Ａ）から得た。ｐ９１０２３（Ａ）をアデノウィル
スプロモーター付近の単一ＰｓｔＩサイトにおいてＰｓ
ｔＩ分解してプラスミドを直線化し、次いで合成Ｐｓｔ
Ｉ−ＥｃｏＲＩコンバーターに結合し、再閉環（元のＰ
ｓｔＩサイトにＰｓｔＩ：ＥｃｏＲＩサイトを作る：９
１０２３（Ｂ′））するか、またはＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大フラグメントで処理してＰｓｔＩサイトを消去
し、合成ＥｃｏＲＩリンカーに結合し、再閉環（元のＰ
ｓｔＩサイトにＥｃｏＲＩサイトを作る：９１０２３
（Ｂ））した。ｐ９１０２３（Ｂ））由来のフラグメン
トＡとフラグメントｐ９１０２３（Ｂ′）とを結合し
て、２つの新しいプラスミドを作った。これらのプラス
ミドはＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩサイトかまたはＰｓｔＩ−
ＥｃｏＲＩサイトのいずれかを元のＰｓｔＩサイトに持
っていた。ＰｓｔＩサイトがアデノウィルス主後期プロ
モーターに最も近いＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩサイトを含む
プラスミドをｐ９１０２３（Ｃ）と名付けた。 【０１１１】ベクターｐ９１０２３（Ｃ）をＸｈｏｌで
完全に分解し、接着末端を持つ得られた直線化ＤＮＡ
を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＥｃｏｌｉの大フラグメン
トによる末端フイリング反応で平滑化した。以下のよう
に作られるＳＶ４０エンハンサーを含む３４０ｂｐ Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを上記のＤＮＡ
に結合した。複製のＳＶ４０オリジンを含むＳＶ４０か
らのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをプラス
ミドπｌａｃに挿入した（Ｌｉｔｔｌｅ等、Ｍａｌ Ｂ
ｉｏｌ Ｍｅｄ．１：４７３−４８８（１９８３））。
このπｌａｃベクターは、ＢａｍＨＩでπｌａｃ ＤＮ
Ａを分解し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで
接着末端をフイルインし、このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ
で分解することにより作製された。 【０１１２】得られたプラスミド（πＳＶＨＰｌａｃ）
はＰｖｕＩＩ平滑末端に結合することによってＢａｍＨ
Ｉサイトを再生した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントをＳＶＨＰ ｌａｃから作り、複製のプラスミ
ドオリジンを含むＰＳＶＯｄ（上記Ｍｅｌｌｏｎ等）の
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合し、得
られたプラスミドｐＳＶＨＰｏｄを選択した。ＳＶ４０
オリジン／エンハンサーを含むＰＳＶＨＰｏｄの３４０
ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを作
り、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントでその両末
端を平滑にした。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントの方向は、そのフラグメント内のＢａｍＨＩサイト
がＶＡ遺伝子に最も近いようになっているプラスミド
（ｐ９１０２３（ＣＯ／Ｘｈｏ／平滑化＋ＥｃｏＲＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ／平滑化ＳＶ４０オリジン＋エンハンサ
ー）をｐＥＳ１０５と命名した。プラスミドｐＥＳ１０
５をＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩで、およびＰｖｕＩＩ
単独で分解し、アデノウィルス主後期プロモーターを含
むＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（フラグメント
Ｂ）、および耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）を持
つプラスミドおよびその他のＤＮＡ配列を有するＰｖｕ
ＩＩフラグメント（フラグメントＣ）を単離した。フラ
グメントＡ、ＢおよびＣを結合し、第１４図に示された
得られたプラスミドを単離し、ＲＫ１−４と命名した。
プラスミドＲＫ１−４は米国メリーランド州、ロックビ
ルのＡＴＣＣにＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９４０として寄託
された。 【０１１３】ＥＰＯの発現 クローンラムダＨＥＰＯＦＬ１３からのＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで分解し、ＥＰＯ遺伝子を含む小ＲＩフラグメント
をプラスミドＲＫ１−４のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーンした。このＤＮＡ（ＲＫＦＬ１３）はＤＨＦＲ−欠
損ＣＨＯ細胞を直接に（分解することなく）感染させる
のに使用され、以下のように選択、拡大された。２日間
の増殖の後、少くとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を取込んだ
細胞はヌクレオシドを含まず、１０％透析胎児牛血清を
補充したアルファー培地中で選択した。選択培地中での
２週間の増殖の後、コロニーを元のプレートから除き、
各プール１０−１００コロニーのグループ中にプール
し、再プレートし、ヌクレオシドを含まないアルファー
培地中に全面増殖した。メトトレキゼート選択の前に増
殖されたプールからの培地上清をＲＩＡによりＥＰＯに
関して検定した。陽性のＥＰＯ生産を示したプールは直
ちにサブクローンし、再検定し、更に陽性のものは段階
的選択（以下参照）を行った。 【０１１４】ＲＩＡにより陰性であるプールに関して、
メリトレキゼート（ｍｌｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，０．２
μｍ）の存在において増殖された対応する培養物から得
たメリトレキゼート耐性コロニーはＲＩＡによりプール
中ＥＰＯについて検定した。陽性であったこれらの培養
物をサブクローンし、更にメソトレキゼートの濃度を増
加して増殖させた。段階的メソトレキゼート（ＭＴＸ）
選択を、濃度を増したＭＴＸの存在下に細胞を培養する
繰返しサイクルによって行った。各段階において、ＥＰ
Ｏを、ＲＩＡにより、およびインビトロ生物活性により
培養上清について測定した。各段階の濃度増加に使用さ
れるＭＴＸは０．２μＭ，０．１μＭおよび０．５μＭ
であった。ＲＫＦＬ１３ＤＮＡはミクロインジェクショ
ンによりＣＨＯ細胞内に挿入された。得られたＦＰＯ発
現の程度は表６に示す。 【０１１５】 【表８】【０１１６】本発明の好ましい態様を含み詳細に説明し
た。しかしながら、これらの開示を検討することにより
当業者は、本発明の範囲内で変更および改良を行うこと
ができることが理解されるであろう。
蛋白質の産生に関する。特に、蛋白質および選択しうる
マーカーをコードする遺伝子で形質転換された真核細胞
培養物から分泌された商業的に有用な蛋白質を高収量で
得ることに関し、より詳細には蛋白質の発現を高める補
助ＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ＤＮＡ）と関連させて
蛋白質をコードする遺伝子を含有する形質転換用ベクタ
ーに関する。 【０００２】 【従来の技術】次の定義は本発明の理解を容易にするた
めに提供される。当技術分野で流通している意味から少
しはずれた程度にまで下記の定義は及ぶべきである。増
幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は細胞がそれらの染
色体ＤＮＡ内で遺伝子複製を生ずる過程を意味する。同
時形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は細
胞にとって異質の１つ以上の外来性遺伝子（そのうちの
１つは選択しうる表現型を細胞に付与する）で細胞を形
質転換する過程を意味する。下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａ
ｍ）はヌクレオチド配列の３′末端の方へ行く方向を意
味する。促進因子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は遺伝子の本
性、遺伝子に対するそのヌクレオチド配列の位置または
その配列の方向性とは無関係に遺伝子の転写を増強する
ことができるヌクレオチド配列のことである。遺伝子は
目的の成熟蛋白質をコードするデオキシリボヌクレオチ
ド配列である。本明細書においては、遺伝子はＲＮＡ転
写開始信号、ポリアデニレーション付加部位、プロモー
ターまたは促進因子のような翻訳されない側面領域（ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含まないだろう。 【０００３】選択遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｇｅｎ
ｅ）は検出できる蛋白質として遺伝子を発現する細胞に
表現型を付与する遺伝子のことである。選択因子（ｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）は選択遺伝子の発現を検
出可能にする条件または物質である。表現型（ｐｈｅｎ
ｏｔｙｐｅ）は細胞の遺伝子型により発現した細胞の観
察しうる諸性質を意味する。生産物遺伝子（ｐｒｏｄｕ
ｃｔ ｇｅｎｅ）は診断上または治療上有用であるよう
な望ましい特性を有する蛋白質産物をコードする遺伝子
のことである。遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）は表現型
として観察されるその発現に対立するものとして細胞内
に包含される遺伝情報を意味する。結合（ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ）は２つのＤＮＡ鎖の５′末端と３′末端との間に
ホスホジエステル結合を形成する過程を意味する。これ
はＴ４ＤＮＡリガーゼによる平滑末端の結合を含むいく
つかのよく知られた酵素的操作により達成される。 【０００４】方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）はＤＮ
Ａ配列におけるヌクレオチドの順序を意味する。ＤＮＡ
配列の反対の方向性は、他の配列に関してその配列の
５′−３′順序が、その配列が得られたＤＮＡの基準的
に比較した場合反対になっているものである。この種の
基準点にはＤＮＡ源における他の特定のＤＮＡ配列の転
写方向またはその配列を含む複製可能なベクターの複製
開始点が含まれる。転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ）はＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を意味する。形質
転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は細胞が外来性
ＤＮＡを取り込むことにより細胞の遺伝子型を変化させ
ることを意味する。形質転換は一時的であるかまたは安
定であって、いくつかの場合には細胞の表現型の変化に
より検出できる形質転換された細胞は形質転換体と呼ば
れる。前形質転換細胞は母細胞と称される。 【０００５】翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）はメッセ
ンジャーＲＮＡからのポリぺプチドの合成を意味する。
真核細胞へのＤＮＡの導入は一般によく知られた方法で
あり、各種の標準方法により達成することができる。こ
れらにはプロトプラスト融合、ＤＮＡの微小注射、染色
体トランスフェクション、溶菌および非溶菌ウイルスベ
クター〔例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの“Ｎａｔｕｒ
ｅ”（ロンドン）２７７：１０８〜１１４（１９７
９）〕、細胞−細胞融合〔Ｆｏｕｒｎｉｅｒらの“Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．”７４：３１９〜３
２３（１９７７）〕、脂質構造（米国特許第４３９４４
４８号）およびＤＮＡ沈殿物の細胞エンドサイトーシス
〔Ｂａｃｈｅｔｔｉらの“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．”７４：１５９０〜１５９４（１９７
７）〕の使用が含まれる。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】細胞は一時的にＤＮＡ
を取り込むことができるか、またはそのＤＮＡは取り込
まれて諸条件に応じて安定な細胞系列を産生することが
できる。安定な細胞系列を得るための１つの方法は、目
的の蛋白質遺伝子を含むＤＮＡとともに選択遺伝子を挿
入し、そしてその細胞系列を選択圧力下に保持すること
である。いずれにしても、形質転換された細胞からの蛋
白質の発現を高める方法を見つけることが望ましい。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は真核細胞内での
異種蛋白質の発現を高める手段を提供する。本発明によ
れば、真核細胞内で異種蛋白質の発現を高める方法は、
真核細胞内に異種の非ウイルス性蛋白質をコードするＤ
ＮＡおよび補助ＤＮＡを導入し、そしてその細胞を培養
して前記蛋白質を発現させることから成っている。本発
明はまた異種の非ウイルス性蛋白質を発現させるべく真
核細胞内で使用するための補助ＤＮＡを含む形質転換用
ベクターを提供することである。好適な実施態様におい
ては、増幅しうる選択可能な表現型を発現する遺伝子が
真核細胞内に導入されて、目的の異種蛋白質をコードす
る導入ＤＮＡおよび補助ＤＮＡの増幅が促進される。 【０００８】本発明によれば、補助ＤＮＡおよび目的の
蛋白質をコードするＤＮＡ（すなわち生産物遺伝子）が
真核細胞内に導入される。補助ＤＮＡは意図する蛋白質
の発現を高める。例えば、補助ＤＮＡは転写または翻訳
の効率を増加させるか、または目的の蛋白質の発現を高
めるための他の作用をもつことができる。本発明によれ
ば、補助ＤＮＡは形質転換用ベクター系の一部分であ
る。それは目的の異種蛋白質をコードするＤＮＡの導入
前に、導入と同時に、あるいは導入後に細胞内に導入さ
れる。補助ＤＮＡは形質転換された細胞系列により合成
される生産物の安定性を改善し、その細胞系列内に導入
された外来性遺伝子の増幅を高め、また転写もしくは翻
訳の効率を増すＤＮＡである。補助ＤＮＡは母細胞によ
り認識される諸機能を含む。こうして、補助ＤＮＡは形
質転換において以前に用いられた単なるキャリヤーＤＮ
Ａまたは崇高ＤＮＡ以上のものである。 【０００９】補助ＤＮＡの１つの部類は翻訳活性化因子
をコードするＤＮＡからなる。翻訳活性化遺伝子は蛋白
質、または翻訳の効率を高めるように生産物のためのメ
ッセンジャーＲＮＡと相互に作用する短い非翻訳ＲＮＡ
産物を生ずる。１つの例はウイルスに関係のある（Ｖ
Ａ）ＲＮＡをコードするアデノウイルスＤＮＡである
〔Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａらの“Ｃｅｌｌ”３１：５４
３〜５５１（１９８１）〕。このＤＮＡは小型の非翻訳
ＲＮＡの２つの物質（ＶＡ１およびＶＡ２）を生産す
る。ＶＡ ＤＮＡのＲＮＡ産物は目下のところ不確かな
方法でアデノウイルスの主後期プロモーター（ｍａｊｏ
ｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の３部分リーダー配
列と関係して、そのリーダー配列を含むｍＲＮＡからの
翻訳を高めると考えられる。ＶＡ ＲＮＡはまた他の初
期アデノウイルスｍＲＮＡの翻訳可能性を高める〔Ｓｖ
ｅｎｓｓｏｎおよびＡｋｕｓｊａｒｕの“ＭｏＩ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏ．”４：７３６〜７４２（１９８４）〕。
ＶＡ１またはＶＡ２ ＤＮＡはよく知られている。それ
は、そのプロモーターとともに、連鎖ベクター内に（好
ましくは生産物遺伝子のプロモーターから上流またはポ
リアデニレーション部位から下流に）直接結合される
か、あるいは生産物遺伝子または選択遺伝子へ結合され
ないままでトランスフェクトされてもよい。ＶＡ ＲＮ
Ａにより高められた翻訳は、後期アデノウイルスｍＲＮ
Ａの３部分リーダー構造がそのｍＲＮＡに存在する場
合、最も劇的である。 【００１０】補助ＤＮＡのもう１つの部類は母細胞から
の真核細胞ゲノム性ＤＮＡを含む。このＤＮＡは複製開
始点またはＤＮＡの安定性を促進する配列を含むと考え
られるが、この種のＤＮＡの有益な作用をうながすその
メカニズムは知られていない。このＤＮＡは細胞系列の
ゲノム性ＤＮＡをランダムに切断するかまたはエンドヌ
クレアーゼで消化することにより得ることができる。ゲ
ノム性補助ＤＮＡは大きさが約５０〜５０００塩基対の
断片からなるべきである。これらの断片はその後形質転
換用ベクターのプロモーターから上流（好ましくはいず
れの促進因子からも上流）またはポリアデニレーション
部位から下流の利用しうる制限部位で結合させる。こう
してこれらのベクターは形質転換に適するものとなり、
この後形質転換体は１つまたはそれ以上の望ましい特性
（例えば、形質転換体の段階的培養後の生産物合成の安
定性および／または生産物の高収量）について選別され
る。 【００１１】形質転換体からの生産物の収量は、トラン
ス−作働性転写活性化因子と名づけた１部類の補助ＤＮ
Ａで細胞を形質転換することにより改善できる。この種
のＤＮＡは転写を刺激する蛋白質または蛋白質誘導体を
コードする。転写活性化因子の１つの部類はそれらが無
限の連続した子孫形成を可能にするので不滅性遺伝子と
称され、この種の遺伝子を含む細胞は所定の数の分裂も
死滅しない。これらの活性化因子は転写速度を増すため
に生産物遺伝子と同じＤＮＡ鎖内に結合される必要はな
く、この点においてこれらは促進因子と異なる〔Ｉｍｐ
ｅｒｉａｌｅらの“Ｃｅｌｌ”３５：１２７〜１３６
（１９８３）、Ｇｒｅｅｎらの“Ｃｅｌｌ”３５：１３
７〜１４８（１９８３）〕。本発明で用いる数種のトラ
ンス−作働性転写活性化因子はそれら自体既知であって
クローン化されている。最も広く研究された例にはヒト
Ｃ−ｍｙｃ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、ポリオーマ大型Ｔ抗
原およびアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子が含まれる。 【００１２】使用することができる生産物遺伝子は本質
的に無限である。蛋白質をコードする遺伝子、または酵
素転化のような蛋白質に基づいた反応により作ることが
できる物質をコードする遺伝子が適当である。毒素を合
成するかまたは宿主蛋白質を加水分解することによって
宿主細胞に悪影響を与える蛋白質（例えば原核細胞また
は下等な真核細胞源からのいくつかの酵素）をコードす
る遺伝子は、例えば抗毒素を培地に加えるかまたは最適
と思われるより低い発現レベルを選択するなどの制限を
加えて使用することができる。活性を示す蛋白質または
酵素の遺伝子は、哺乳動物または脊推動物などの高等動
物の細胞内に見出される。大抵の治療用蛋白質をコード
する興味ある遺伝子はこの部類に属するだろう。生産物
遺伝子の例は、血液凝固性または線維素溶解性蛋白質
（例えば抗血友病性因子、組織プラスミノゲン活性化因
子、ウロキナーゼおよび凝血因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、
ＸまたはＸＩＩＩ）、血液蛋白質（例えばフイブロネク
チンまたはアルブミン）、プロテアーゼ阻害因子（例え
ば抗トロンビンＩＩＩ、アルファー１−抗トリプシンお
よび２マクログロブリン）、ホルモンまたは調節蛋白質
（例えばエリスロポエチンおよび他のＴ−細胞活性物質
などのリンフォカイン、成長ホルモンおよび血小板誘導
成長因子）、腫瘍遺伝子産物、細胞表面抗原、免疫蛋白
質（例えばＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）および補体、
ならびに他の商業上興味ある蛋白質をコードする遺伝子
である。 【００１３】形質転換用ベクター 本発明による形質転換に用いるベクターは一般に補助Ｄ
ＮＡと生産物遺伝子とを含むだろう。さらに、形質転換
用ベクターには通常促進因子、プロモーター、イントロ
ン、ポリアデニレーション部位および以下で述べる３′
非コード領域などの他の要素が存在するだろう。選択遺
伝子を用いる場合、それはベクター内の生産物遺伝子へ
結合されるか、またはその生産物遺伝子を含むベクター
と同時形質転換される別のベクター内に存在することが
できる。選択遺伝子は３つのカテゴリー：検出可能に増
幅される選択遺伝子、優性の選択遺伝子、および検出可
能に増幅される優性選択遺伝子に区分される。 【００１４】検出可能に増幅される選択遺伝子は、宿主
細胞を選択因子へさらすことにより増幅を検出し得るも
のである。検出可能に増幅される非優性遺伝子は一般に
遺伝子型として選択遺伝子を欠く母細胞系列を必要とす
る。例としてはアスパラギンシンセターゼ；アスパラギ
ン酸トランスカルバミラーゼ〔Ｋｅｍｐらの“Ｃｅｌ
ｌ”９：５４１（１９７６）〕；アデニル酸デアミナー
ゼ〔ＤｅＢａｔｉｓｓｅらの“Ｍｏｌ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．”２（１１）：１３４６〜１３５３（１
９８２）〕；アデノシンデアミナーゼ〔Ｙｅｕｎｇらの
Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５８：１５１８５（１９８３）〕；マウ
スジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびマウス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）（欠損プロモーターをもつ）
をコードする遺伝子類が含まれる。優性の選択遺伝子は
母細胞の遺伝子型にかかわらず形質転換体において発現
されるものである。大抵の優性選択遺伝子は検出可能に
増幅されない。というのはその表現型が選択因子を処理
するのに非常に効果的であるので、その遺伝子を増幅し
た細胞系列と増幅しなかった細胞系列とに識別するのが
困難であるからである。この型の優性選択遺伝子の例は
キサンチン−グアニン ホスホリボキシルトランスフェ
ラーゼ〔Ｍｕｌｌｉｇａｎらの“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．”７８（４）：２０７２〜２０７６
（１９８１）〕およびアミノグリコシド３′−ホスホト
ランスフェラーゼ〔Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら
の“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”１５０：１〜１４（１９
８１）〕などの原核動物の酵素をコードする遺伝子類で
ある。 【００１５】いくつかの優性選択遺伝子はまた検出可能
に増幅される。適当な例にはＨａｂｅｒらの“Ｓｏｍａ
ｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ”４：４９９〜５０８
（１９８２）に記載された突然変異ＤＨＦＲ遺伝子、Ｈ
ＬＡ抗原のような細胞表面マーカー、および当技術分野
で知られた蛍光原または色素原基質から蛍光産物または
着色産物を生ずる酵素（例えば特異なエステラーゼ類）
をコードする遺伝子が含まれる。本発明においては検出
可能に増幅される優性の選択遺伝子を使用するのが好ま
しい。いくつかの場合の優性選択遺伝子は、その遺伝子
内での適当な突然変異によって、検出可能に増幅される
遺伝子に転化できると理解すべきである。 【００１６】選択因子は選択遺伝子の不存在下で細胞増
殖を抑制するものであるのが好ましい。こうして、選択
遺伝子（および恐らくは生産物遺伝子）を欠くか、また
はその選択遺伝子をもはや発現しない長期培養の復帰突
然変異細胞はその集団を増殖し過ぎることがないだろ
う。しかしながら、治療目的のための蛋白質産物の商業
的生産においては、細胞毒素の使用を避けてその産物の
精製工程を簡単にすることが望ましいだろう。それ故、
望ましい選択遺伝子は、形質転換体が選択遺伝子を欠く
場合に用いることのできない増殖にとって不可欠な栄養
素を形質転換体に使用させ得るものであるだろう。１つ
の例としては先に述べたＴＫ遺伝子がある。 【００１７】選択遺伝子はまた生産物遺伝子であり得る
ことに留意すべきである。例えば、治療剤または診断剤
として使用するための選択遺伝子の生産物を収穫するこ
とが望まれる。生産物遺伝子は、もし形質転換体の環境
が変更されてその生産物が形質転換体にいくつかの選択
利益を付与することができるならば、選択遺伝子として
機能することができるようになるだろう。例えば、生産
物遺伝子は細胞培地中の他の方法では使用できない不可
欠な基質に作用してその不可欠な基質（例えば必須栄養
素）を放出させる酵素を産生することができる。ここで
用いる選択遺伝子および生産物遺伝子はそれらの野性型
の翻訳されない側面配列の全てまたは一部分を同伴して
もよいが、通常この種の配列は以下で述べるように同伴
されないだろう。連鎖ベクターの場合に、生産物収量の
特に有益な結果は選択遺伝子の翻訳領域から上流でかつ
この領域に接近して生産物遺伝子を位置させることによ
り得られる。このことは一般に野性型生産物遺伝子から
下流に見出される３′非翻訳領域および野性型選択遺伝
子から上流に見出される５′非翻訳領域の全部でないと
しても大部分が適当な制限エンドヌクレアーゼによって
切断されるか、あるいは本明細書の他の処で示すＭ１３
でのオリゴヌクレオチドプライミングを経る欠失によっ
て切断されることを意味している。その結果、両方の遺
伝子は生産物遺伝子と選択遺伝子との間にプロモーター
が挿入されることなく直接結合される。 【００１８】ここで用いる遺伝子は一般に成熟生産物の
構造、安定性および／または分泌にとって望ましいプレ
プロ−ポリぺプチド（例えば分泌リーダー）をコードす
る野性型翻訳配列を含むだろう。しかしながら、野性型
の翻訳リーダー配列が形質転換体内で適切に作用しない
場合には、この種のプレプロ配列はベクターへの組み込
みおよびその後の宿主細胞の同時形質転換以前に欠失さ
れるか、またはベクター内で適切に作用する他のプレプ
ロ配列によって置換されてもよい。一般に、ベクターま
たはベクター内に含まれる遺伝子がイントロンで中断さ
れることは、ベクターからのメッセンジャーＲＮＡ転写
物が形質転換体によって適切に切り出されて成熟蛋白質
および目的のリーダー配列へ翻訳されるメッセンジャー
ＲＮＡを生ずる限り、重要なことでない。これは他の高
等真核細胞によりプロセシングされるはずの所定の高等
真核細胞の遺伝子に見出されるイントロンの場合である
だろう。ここで用いる大部分の遺伝子はｃＤＮＡ逆転写
物であるのでイントロンは全く存在せず、まちがった転
写後切り出し（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）の可能性は相当減少するだろ
う。 【００１９】連鎖ベクターの場合、選択遺伝子および生
産物遺伝子のためのコード鎖は生産物遺伝子の停止コド
ンを選択遺伝子の開始コドンへ直接結合することによっ
て接合されるのが好ましい。これとは別に、これらの両
遺伝子はグアニンデオキシリボヌクレオチド（Ｇ）およ
びシトシンデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）に富むオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド橋を介して結合される。こ
の橋はＲＮＡヘアピンループの形成可能性を減ずるため
に、終止コドンおよび開示コドン、ならびにパリンドロ
ーム構造（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｅ）を含まない方がよ
い。“生産物遺伝子”および“選択遺伝子”という用語
は、ただ１個の各遺伝子または単一の各遺伝子コピーの
みがベクター内で使用されるということを意味するもの
ではない。第一に、所定の選択表現型は１つ以上の別個
の蛋白質の合成を必要とするかも知れない。この場合、
例えば各蛋白質の選択遺伝子は生産物遺伝子または他の
どの選択遺伝子にも共有結合で結合されないベクター内
に存在するだろう。また各選択遺伝子は先に述べたごと
くまたは米国特許第４３９９２１６号に記載されるごと
く生産物遺伝子へ結合されるだろう。各選択遺伝子が他
のとの選択遺伝子とも無関係に同じ選択因子のための選
択表現型を与える場合、１個以上の選択遺伝子を使用す
ることは好ましくないだろう。 【００２０】別個の生産物遺伝子を複数含む１つまたは
それ以上のベクターを用いて形質転換するのが望ましい
かも知れない。互いに有益な作用をもつ蛋白質をコード
する別個の生産物遺伝子は特に興味をもたれる。例え
ば、他の蛋白質産物を安定化する蛋白質、または生物学
的に活性な作用をもつ多重蛋白質系の一部をなす蛋白質
を同時発現させることができる。さらに、選択遺伝子お
よび生産物遺伝子のいずれか一方または両方は１つまた
はそれ以上のベクター内で反復されてもよく、すなわち
多重の、一般にはタンデム（直列）のコピーで存在し得
る。このような場合に、反復された遺伝子は各々ただ１
個の遺伝子コピーのみを含むベクター内に存在するＲＮ
Ａプロセシングおよび転写制御配列の全てを含むのが有
利である。 【００２１】ベクターはまた促進因子を含むことができ
る。促進因子はプロモーターと機能的に異なるが、プロ
モーターと協力して作働すると思われる。細胞レベルで
のそれらの機能は十分理解されていないが、それらの特
異な性質は位置や方向性に関係なく転写を活性化させま
た増強させるその能力にある。プロモーターは遺伝子の
上流に存在する必要があり、一方促進因子はプロモータ
ーから上流すなわち５′方向に、イントロンとして遺伝
子内に、または遺伝子とポリアデニレーション部位との
間の遺伝子から下流すなわちポリアデニレーション部位
から３′方向に存在していてもよい。逆転プロモーター
は機能的でないが、逆転促進因子は機能的である。促進
因子はシス−作働性である、すなわちそれらが同一ＤＮ
Ａ分子に存在する時のみプロモーターに効果を及ぼす。
促進因子の一般的概論についてはＫｈｏｕｒｙらの“Ｃ
ｅｌｌ”３３：３１３〜３１４（１９８３）を参照され
たい。 【００２２】好適な促進因子はシミアンウイルス４０、
ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、レトロウイ
ルスまたはアデノウイルスのような動物ウイルスから得
られる。理想的には、促進因子は宿主細胞が許容するウ
イルス、すなわち通常宿主型の細胞に感染するウイルス
からのものである方がよい。ウイルス性促進因子は公然
と入手できるウイルス類から簡単に得ることができる。
例えば、ラウス肉腫ウイルスやシミアンウイルス４０の
ような数種のウイルスの促進因子領域はよく知られてい
る。Ｌｕｃｉｅｗらの“Ｃｅｌｌ”３３：７０５〜７１
６（１９８３）を参照されたい。問題のウイルスの公表
された制限地図に基づいてこれらの領域を切り取り、必
要に応じてそれらの部位を修飾して生産物遺伝子または
選択遺伝子のベクター内にその促進因子をつなぎ合わせ
ることは慣用的な化学手段であるだろう。例えば、Ｋａ
ｕｆｍａｎらのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２ １３
０４〜１３１９頁（１９８２）を参照されたい。別の方
法として、促進因子は配列データから合成することがで
きる。ウイルス性促進因子の大きさ（一般に約１５０塩
基対以下）は十分に小さいので、これは実際に達成でき
るだろう。 【００２３】促進因子はタンデム型（自然界に見出せる
ＳＶ４０ウイルス性促進因子を用いる場合）で、または
先に論じた部位でベクター全体にわたり分離してベクタ
ー内に反復させることができる。好ましくは、促進因子
は野性型源においてその影響下にある遺伝子に関してそ
れがもっていた方向性と同じ方向性を生産物遺伝子およ
び／または選択遺伝子に関してもつ。促進因子はベクタ
ー内に存在する全てのプロモーターから上流に位置する
のが好適である。複数の異なる促進因子を用いてもよ
く、また促進因子は形質転換の際に役に立つために生産
物遺伝子または選択遺伝子へ結合される必要はない。非
連鎖ベクター系において、促進因子は生産物遺伝子を含
むベクターに存在することが好ましい。これは生産物遺
伝子および選択遺伝子が同時形質転換体内で物理的に結
合される可能性を増すだろう。この型においては所定量
の形質転換ＤＮＡに対して約１〜１００倍以上の形質転
換体を、選択遺伝子の転写に用いられるプロモーターに
応じて、得ることができる。 【００２４】促進因子はその野性型環境に見出せる側面
配列（例えばウイルスの複製開始点、ＴＡＴＡボックス
のような関係のあるプロモーター成分、キャップ部位ま
たは転写プライマー配列）のどれも含む必要はない。し
かし、これらの配列の欠失を可能にする制限酵素部位が
存在しない時にはこれらの配列の全てまたは一部分を組
み入れる方が都合がよい。また、促進因子とその促進因
子の野性型制御下にあるプロモーターとの両方を含むＤ
ＮＡ断片を使用することはさらに都合がよいだろう。 【００２５】促進因子および促進因子−プロモーター領
域はウイルスよりもむしろ真核細胞から選択することが
できる。これらは源細胞内で大きな構成量の蛋白質を産
生する遺伝子と関連した促進因子であるのが好ましい。
それらは野性型環境において通常制御される遺伝子以外
の遺伝子から高収量の生産物を同様に産生することを見
出された。形質転換しようとする宿主細胞は好適には促
進因子が得られた細胞と同じ体細胞系列また生殖細胞系
列である。例えば、Ｊｋ−Ｃｋイントロン内の免疫グロ
ブリン遺伝子を活性化または促進する領域（免疫グロブ
リン促進因子）は生産物遺伝子の上流または下流に導入
され、そしてこの構成物は骨髄腫細胞系列内へ選択遺伝
子とともに導入される。この促進因子についての詳細は
Ｇｉｌｌｉｅｓらの“Ｃｅｌｌ”３３：７１７〜７２８
（１９８３）を参照されたい。免疫グロブリン促進因子
は蛋白質産物を産生させるための骨髄腫細胞内に挿入さ
れる予定のベクターにおいて用いられるのが有利であ
る。 【００２６】生産物遺伝子および選択遺伝子は共にプロ
モーターの転写制御下におかれるようにプロモーターへ
結合されるだろう（ただし先に述べた連鎖ベクターの場
合を除く）。プロモーターは問題の遺伝子のための野性
型プロモーターであってもよく、また遺伝子は他の真核
細胞系列または原核生物ウイルスからの形質転換細胞系
列内で他の遺伝子からのプロモーターへ結合されてもよ
い。明らかに、そのプロモーターは形質転換細胞内のプ
ロモーターとの偶発的組み換えなしに形質転換しようと
する宿主によって認識されるべきであるが、その他の場
合はプロモーターの選択は限定的であると考えない。特
に望ましいプロモーターは５′非翻訳リーダーへ結合さ
れて、外来性の因子または条件〔例えば補助遺伝子産物
（転写物およびポリぺプチド）、重金属イオン、熱によ
る衝撃またはウイルス感染〕により転写的にまたは翻訳
的に活性化される。生産物遺伝子発現にとって好適なプ
ロモーターは３部分リーダーをもつアデノウイルスの主
後期プロモーターである。 【００２７】ベクター系は、促進因子と無関係のプロモ
ーター（例えばマウスアルファーグロビンのためのプロ
モーター）が選択される場合に、促進因子を含む必要は
ない。しかし、この種の促進因子−非依存性の強力プロ
モーターよりもむしろ促進因子と促進因子−依存性の強
力プロモーター（例えばアデのウイルス主後期プロモー
ター）とを含むベクターが使用される。強力プロモータ
ーは制御された条件下でＳＶ４０の初期プロモーターと
同じかまたはそれより多い転写物をもたらすものであ
る。ベクター内に存在する方がよい他の要素はポリアデ
ニレーション部位である。これは遺伝子の翻訳領域から
下流に位置するＤＮＡ配列であって、その遺伝子にアデ
ニンリボヌクレオチドが付加してメッセンジャーＲＮＡ
の３′末端にポリアデニレートの尾を形成する。ポリア
デニレーションは細胞の分解、メッセンジャーＲＮＡの
レベルおよび蛋白質産物のレベルを低下させる現象に対
してメッセンジャーＲＮＡを安定化させるのに重要であ
る。 【００２８】真核細胞のポリアデニレーション部位はよ
く知られている。コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）
配列が真核細胞遺伝子の間に存在する：ヘキサヌクレオ
チドの５′−ＡＡＵＡＡＡ−３′はポリアデニレーショ
ンが出発するＲＮＡの１つの点から１１−３０ヌクレオ
チドのところに見出される。ポリアデニレーション部位
を含むＤＮＡ配列は発表された報告書に従ってウイルス
から得ることができる。ポリアデニレーション配列の例
はマウスベーターグロビン、シミアンウイルス４０の後
期または初期領域遺伝子などから得られる。ウイルスの
ポリアデニレーション部位の方が好ましい。これらの配
列は知られているので、インビトロで合成して慣用方法
でベクターへ結合させることができる。ポリアデニレー
ション領域は連鎖または非連鎖ベクター内で生産物遺伝
子から下流に位置するべきである。非連鎖ベクターにお
いてはそれは場合により選択遺伝子から下流に結合され
る。ポリアデニレーション部位を翻訳停止コドンから分
離する配列は好ましくは促進されない真核細胞遺伝子の
ような非翻訳ＤＮＡ領域である。オリゴヌクレオチドは
停止コドンからポリアデニレーション部位まで相当な距
離（約１０００塩基以下）を延びるのが好ましい。この
３′非翻訳ヌクレオチド配列は一般に生産物の収量を増
加させる。ベクターはコンセンサス配列から約３０塩基
対下流から終るが、野性型環境内でポリアデニレーショ
ン部位から下流に見出せる３′配列を保持することが有
利である。これらの配列は一般にポリアデニレーション
部位から下流へ約２００〜６００塩基対延びる。 【００２９】ベクターの非翻訳、転写部分にイントロン
が存在すると生産物の収量が増加するのがわかった。こ
の種のイントロンは宿主細胞または遺伝子源以外の他の
源から得てもよい。例えば、アデノウイルス主後期転写
物の非翻訳領域内にこの転写物のノーマルイントロンの
一部分の代わりに挿入された免疫グロブリン遺伝子から
の３′スプライス部位は、生産物の収量増加をもたらす
ことができる。転写活性化因子、翻訳活性化因子、およ
び強力プロモーターまたはプロモーターと促進因子との
組合せによってトランスフェクトされた細胞は最も高め
られた生産物合成を提供する。カスケード作用はこの転
写および翻訳活性化因子−形質転換細胞から生ずるだろ
う。 【００３０】ベクターは好適にスーパーコイル状の二本
鎖環状構造物であるだろう。これはベクターが標準原核
生物クローニング法（この方法によってベクターは作ら
れる）から得られる形体である。しかし、ベクターは線
状化されていてもよく、すなわちゲノム性補助ＤＮＡへ
の結合のような他の工程に付随して、ある１つの点で共
有結合的に切断されていてもよい。次の表は適当な形質
転換用ベクター系の代表的な例である。 【００３１】 【表１】表 １ 【表２】 【００３２】ＥＰ＝真核宿主細胞によって認識される非
ウィルスプロモーター ＶＰ＝真核宿主細胞によって認識されるウィルスプロモ
ーター ＴＴＡ＝トランス−作働性転写活性化因子 Ｅｎ＝促進因子 ＴＬＡ＝翻訳活性化因子 ｐ（Ａ）＝ポリアデニレーション部位 Ｐｄ＝生産物遺伝子 Ｓ＝選択遺伝子 Ｂ＝オリゴヌクレオチド橋 −＝ホスホジエステル結合 ；＝非結合ベクター成分を表わす ＧＦ＝真核細胞ゲノム性断片 Ｉ＝外来性イントロン Ｒ＝複製成分（合成ベクターからのプラスミドまたはバ
クテリオファージ残部） 【外１】 【００３３】ベクター合成 生産物遺伝子と選択遺伝子との間に短いオリゴヌクレオ
チド配列をもつか、あるいはこれらの間にオリゴヌクレ
オチド配列をもたない連鎖ベクターは、数種の方法で作
ることができる。生産物遺伝子の翻訳停止コドンに隣接
して、あるいはそこから下流の一番近いところに制限部
位が存在しない場合、生産物遺伝子は野生型翻訳停止コ
ドンの上流の制限部位で切断され、その後そのコドンは
合成結合剤を用いて選択遺伝子断片へ結合される。この
ようなベクターの別の作成方法は、架橋ヌクレオチドプ
ローブを使用して生産物遺伝子と選択遺伝子との間にあ
る望ましくない配列を欠失させることである。もう１つ
の方法として、蛋白質産物のカルボキシ末端アミノ酸が
生物学的活性に必要なものでない場合、合成終止コドン
が便利な３′末端へ結合されるだろう。ここで遺伝子断
片を使用することは、自然界に見出せるものと出来るだ
け同一の蛋白質産物を合成することが望まれるので、好
適な実施態様とは言えない。 【００３４】野生型環境内で選択遺伝子の側面にある
５′非翻訳領域は、生産物遺伝子について先に述べた方
法と同じ方法で除去することができ、これは実施例４に
示すごとく生産物遺伝子からの欠失と同時に行われる。
しかしながら、選択遺伝子またはその誘導体によって発
現される蛋白質は野生型と同一である必要はなく、例え
ば増殖制限基質に対してより活性であるかまたは野生型
蛋白質より毒素に対してより抵抗性であってよい。連鎖
ベクターにおいて、選択遺伝子は生産物遺伝子のプロモ
ーターの制御下にあるのが好ましい。これは、生産物遺
伝子を欠く細胞が形質転換体との組み換え現象がない場
合に選択因子から生きのびることはできないので、細胞
の遺伝子型および蛋白質産物の発現を安定化するのに役
立つだろう。非連鎖ベクターの場合に反対のことが見出
されたが、ここでも同じプロモーターを選択遺伝子およ
び生産物遺伝子の両方に使用することができる。 【００３５】この他に、ここに示すベクターは当技術分
野において習熟した者によく知られた技術を用いて合成
することができる。生産物遺伝子、選択遺伝子、促進因
子、プロモーター、および補助ＤＮＡ（例えばトランス
−作働性転写活性化因子、翻訳活性化因子および類似の
もの）などのベクター成分は天然源から得ることがで
き、また先に述べたように合成することもできる。基本
的には、ベクター成分が大量に入手できるＤＮＡ中に見
出される場合（例えばウィルス機能のような成分）、ま
たそれらが合成可能である場合（例えばポリアデニレー
ション部位）、大量のベクターは生物源を培養し、その
ＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで消化し、そのＤＮ
Ａ断片を分離し、興味ある要素を含むＤＮＡを同定し、
そしてそのＤＮＡを当技術分野でよく知られた方法を用
いて回収することにより得ることができる。一般に、形
質転換用ベクターは少量作られ、その後原核生物のプラ
スミドまたはファージのような自律的に複製する合成ベ
クターへ結合される。ｐＢＲ３２２プラスミドは多くの
場合に使用できる。Ｋａｕｆｍａｎらの上記文献（１９
８２）を参照されたい。大きな形質転換用ベクターはコ
スミド（ｃｏｓｍｉｄ；ファージＤＮＡがファージカプ
シド内に封入されているが、受容宿主へトランスフェク
トされた場合プラスミドとして複製するベクター）のよ
うな収容能力の高い合成ベクターを必要とするかも知れ
ない。 【００３６】合成ベクターは慣用方法で、例えば受容原
核生物のトランスフェクション、高いコピー数への合成
ベクターの複製、細胞溶解による合成ベクターの回収、
および当技術分野でよく知られた方法による細胞破片か
らの合成ベクターの分離によって、形質転換用ベクター
をクローン化するのに用いられる。得られた合成ベクタ
ーは真核細胞内へ直接トランスフェクトされるか、ある
いは形質転換用ベクターが適当なエンドヌクレアーゼ消
化、分子量による分離および形質転換用ベクターの回収
により合成ベクターから単離される。形質転換用ベクタ
ーの単離は、合成ベクターの残部が真核細胞遺伝子の増
幅、転写または翻訳に悪影響を及ぼさない限り、必要な
い。例えば、ここで用いる好適な合成ベクターはプラス
ミドｐＳＲ３２２の突然変異体であり、これはプラスミ
ドｐＳＲ３２２中の真核細胞にとって有害な配列が欠失
されたものである。ＬｕｓｋｙらのＮａｔｕｒｅ ２９
３：７９〜８１（１９８１）を参照されたい。この突然
変異体の使用は形質転換前にプラスミドの残部を欠失さ
せる必要性を取り除いた。 【００３７】形質転換 形質転換しようとする細胞は酵母のプロトプラストを含
むどの真核細胞であってもよいが、好適には真菌細胞以
外の細胞である。原始的移植物（幹細胞のような比較的
未分化な細胞を含む）、および不滅性のかつ／または形
質転換された細胞系列が適している。細胞はその選択遺
伝子が、使用された時、優性に作用する限りその選択遺
伝子を遺伝子型として失う必要がない。ある実施態様に
おいては、形質転換された安定な細胞系列を必要としな
い。このような場合に、適当な形質転換用ベクターは哺
乳動物細胞内へのＤＮＡの一時的導入に頼ることができ
る〔Ｐ．Ｍｅｌｌｏｎ，Ｖ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｙ．Ｇｌｕ
ｚｍａｎ，Ｔ．ＭａｎｉａｔｉｓのＣｅｌｌ ２７：２
７９〜２８８（１９８１）〕。目的の形質転換体を単離
するために、その集団の全細胞が目的の蛋白質産物を発
現する外来性遺伝子を安定に含むことは要求されない。
数日間にわたって目的の生産物を発現するような細胞の
サブ集団へ外来性遺伝子を一時的に導入することが可能
である。本発明によるＤＮＡのトランスフェクションお
よび発現系によって選択しうるマーカーは形質転換用ベ
クター内に必要とされないので、外来性遺伝子は１〜２
週間にわたる細胞増殖の際に失われる。しかし、適当な
哺乳動物細胞のトランスフェクションの２〜３日後に、
目的の生産物が合成されたことが見出されそして検出さ
れる。 【００３８】こうして、哺乳動物蛋白質の遺伝子をクロ
ーン化するための宿主−ベクター系は、複製開始点−欠
損ＳＶ４０ＤＮＡ分子で形質転換されたＣＶ−１サル細
胞系列の開発に基づいている〔Ｙ．ＧｌｕｚｍａｎのＣ
ｅｌｌ ２３：１７５〜１８２（１９８１）〕。ＳＶ４
０はサルの細胞内で細胞溶解的に複製する小型のＤＮＡ
腫瘍ウィルスである。ＤＮＡの複製がない場合に、ＳＶ
４０はサルの細胞を形質転換するだろう。欠損ＳＶ４０
ＤＮＡを含む形質転換されたサルＣＶ−１細胞（ＣＯＳ
と称する）はＳＶ４０ゲノムの完全なコピーを含まない
が、高レベルで大型Ｔ抗原を産生しかつＳＶ４０ＤＮＡ
の複製を許容する。それらはまた初期領域の欠失をもつ
ＳＶ４０とＳＶ４０の複製開始点を含む細菌プラスミド
との複製を効率よく支持する〔Ｒ．Ｍ．Ｍｙｅｒｓおよ
びＲ．ＴｊｉａｎのＰＮＡＳ７７：６４９１〜６４９５
（１９８０）〕。それ故、この系は外来性ＤＮＡから発
現される蛋白質とｍＲＮＡのレベルを増加させるため
に、ＳＶ４０仲介ＤＮＡの複製を経てトランスフェクト
された外来性ＤＮＡ（蛋白質遺伝子および補助ＤＮＡ）
を増幅させる手段を提供する。他の実施態様では、細胞
は安定な不滅化した哺乳動物細胞系列である。染色体Ｄ
ＮＡ内に選択遺伝子を安定して組み込むことが知られて
いる細胞系列が好適であり、例えばチャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列である。この他にヒーラ
（Ｈｅｌａ）細胞、ＣＯＳサル細胞、メラノーマ細胞系
列〔例えばバウエス（Ｂｏｗｅｓ）細胞系列〕、マウス
Ｌ細胞、マウス線維芽細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞お
よび類似の細胞が有用である。 【００３９】非連鎖ＤＮＡでの形質転換は段階的にまた
は同時に行われる。細胞によるＤＮＡの取り込みを促進
させる方法が知られている。細胞核内へのベクターの微
小注射は最高の形質転換効率を生ずるが、燐酸カルシウ
ム沈降物の形のＤＮＡを母細胞にさらすことは一般にも
っと都合がよいだろう。生産物を発現する形質転換体の
頻度は、選択遺伝子に対してモル過剰の生産物遺伝子
（約１０：１またはそれ以上）を用いて形質転換するこ
とによりさらに高められる。 【００４０】選択形質転換体はその後それらの染色体内
の生産物遺伝子の結合または生産物それ自体の発現につ
いてスクリーニングされる。前者はサザン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）ブロット分析を用いて達成され、後者は標準的
な免疫検定法または酵素検定法によって達成される。ひ
とたび形質転換体が識別されると、一定量または増加量
の選択遺伝子の存在下にサブクローニングすることによ
り生産物遺伝子の発現をさらに増幅する工程が行われ
る。一般に、これは形質転換体の細胞集団を取り出し、
そして（ａ）その細胞集団の他の細胞に比較した場合に
より優れた方法で生産物を発現する１つまたはそれ以上
の細胞をその集団から選択し；（ｂ）選択した１つまた
はそれ以上の細胞を、表現型発現における変化によって
選択するように設定した条件下で次の細胞集団へと培養
し；そして（ｃ）工程（ｂ）からの集団の他の細胞に比
較した場合により優れた方法で生産物を発現する１つま
たはそれ以上の細胞をその集団からさらに選択する；こ
とを伴う。工程（ｂ）は工程（ａ）からのクローンを多
数用いることにより有利に実施される。この方法は１９
８３年１２月１７日付の係属中の米国特許出願第５６５
６２７号（参照によりここに引用される）に詳しく記載
されている。次の実施例は本発明をさらに例示するため
に提供されるものであり、特許請求の範囲を限定するも
のではない。実施例において用いられる温度は℃であ
る。 【００４１】 【実施例】実施例１ 細胞培養 ＳＶ４０形質転換ＣＯＳサル細胞（クローンＭ６）は
Ｍ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐ．Ｇｅｎｅｔ．２，１４７−９ページ（１９
８３））により提供を受けた。アデノウィルス２はＰ．
Ｓｈａｒｐより提供を受けた。アデノウィルス感染は３
７℃で９０分間２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌを吸収させる事に
より実施した。洗浄後、細胞を３７℃で１８時間インキ
ュベートした。この時間に著しい細胞症効果が観察され
た。 【００４２】ＤＮＡトランスフェクションはＳｏｍｐａ
ｙｒａｃおよびＤａｎｎａによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，７５７５−８ページ（１９
８１）に記載されている方法にクロロキン処理（Ｌｕｔ
ｈｍａｎおよびＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ，１１，１２９５−１３０８ページ（１９８
３））を加えて実施した。細胞を無血清培地で洗浄し、
ｐＨ７．３の０．１Ｍトリスに加えたＤＥＡＥデキスト
ラン（ＮＷ５０００．０００Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２５
０ｍｇ／ｍｌ）および２μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ
を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地中で１
２時間３７度でインキュベートする。インキュベーショ
ン後、細胞を無血清培地で洗浄し、血清含有培地中０．
１ｍＭクロロキンで３７度にて２時間処理する。細胞は
続いて培地に播種し、指定された時間インキュベートす
る。 【００４３】プラスミド構成 アデノウィルス特異的相互作用因子がアデノウィルスＭ
ＬＰに影響しているかを分析するため、一連のＤＨＦＲ
ｃＤＮＡ遺伝子を構成してあり、それらは図１（ａ）−
１（ｅ）に示してある。ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）は
第１のリーダーおよびアデノウィルス後期ｍＲＮＡから
の５′スプライス部位を含むアデノウィルスＭＬＰの制
御下にあるマウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含有している。こ
の５′スプライス部位はマウスイムノグロブリン遺伝子
（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，２，１３０４−１９ページ（１９８
２））から導入される３′スプライス部位と適切にスプ
ライスされる。ＳＶ４０初期ポリアデニル化信号はＤＨ
ＦＲコード領域の３′末端に存在する。ｃＤＮＡ遺伝子
は哺乳類細胞の複製に有害な配列（Ｌｕｓｋｙら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）；２９３，７９−８１ページ
（１９８１））を欠き、ＳＶ４０由来または複製物（Ｍ
ｅｌｌｏｎら）を含むｐＢＲ３２２誘導体（ｐＳＶＯ
ｄ）中にクローンする。プラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａ（３）（図１（ａ））およびｐＣＶＳＶＬ（図１
（ｂ））はすでに記載されている（Ｋａｕｆｍａｎおよ
びＳｈａｒｐ，上記文献）。ｐＣＶＳＶＬ２はＸｈｏｌ
リンカーの添加およびアデノウィルスＭＬＰ上流のＸｈ
ｏｌ部位（１５．８３ｍ．ｕ．）への挿入により導入さ
れた重複したＳＶ４０ＡｖａＩＩＤフラグメントを含む
点を除いてｐＣＶＳＶＬと同一である。ＳＶ４０後期プ
ロモーターがＡｄ２ＭＬＰのように同じ配向をしている
ごとく両方のＡｖａＩＩＤフラグメントも配向してい
る。 【００４４】ｐＣＶＳＶＬ２はｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）から誘導されるがしかし、ｐＳＶｏｄからのＳＶ
４０由来物を欠き、アデノウィルスＭＬＰの上流にＳＶ
４０エンハンサーおよび複製の起点を含む。ｐＤ２０
（図１（ｃ）およびｐＤ１７（図１（ｄ））はアデノウ
ィルスファイバータンパク質のためのｃＤＮＡクローン
から誘導されるアデノウィルス第２および第３の２／３
のリーダーをコードする１３８ｂｐＤＮＡ配列（Ｚａｉ
ｎら、Ｃｅｌｌ，１６，８５１−６１ページ（１９７
９））の挿入を除けばｐＡｄ２６ＳＶｐＡ（３）（図１
（ａ））と同一である。ｐＤ２０は５′スプライス部位
に８ｂｐ５′のＰｖｕＩＩ部位に正しい方向で挿入され
た１３８ｂｐ領域を含む。それ故、ｐＤ２０は完全な第
１、第２および第３の２／３のリーダーをコードしたス
プライスした後期ｍＲＮＡからの第１の１７０ｂｐを含
み、第１の後期リーダーから５′スプライス部位へ８ｂ
ｐを含む。ｐＤ１７（図１（ｄ））は反対の向きに１３
８ｂｐフラグメントを含む。ｐＤ６１（図１（ｅ））は
ｐＤ２０（図１（ｃ））に存在する第２および第３のリ
ーダー配列を含む点を除いてｐＣＶＳＶＬ２と同一であ
る。 【００４５】ｐＤ１７およびｐＤ２０、ｐＪＡＷ４３
（Ｚａｉｎら前記文献）を得るため、ＤＮＡをＸｈｏｌ
で消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗフラグ
メントで処理し、その後ＰｖｕＩＩで消化する。１３８
ｂｐフラグメントを単離し、前もってＰｖｕＩＩで消化
したｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）と連結する。ＤＮＡを
大腸菌ＨＢ１０１に移入し、放射性標識したｐＪＡＷ４
３からの１３８ｂｐ Ｘｈｏｌ−ＰｖｕＩＩフラグメン
トでスクリーニングする。陽性のハイブリダイズしたク
ローンからＤＮＡを調整し、ＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化後アクリルアミドゲル電気泳動で向きを検
討する。アデノウィルスＭＬＰの転写方向に対してｐＤ
２０は１３８ｂｐフラグメントを同じ向きに、ｐＤ１７
はそのフラグメントを逆の向きで含有している。ｐＣＶ
ＳＶＬからのＥｃｏＲｌおよびＸｈｏｌ部分約１、１Ｋ
ＢフラグメントをＥｃｏＲ１およびＸｈｏｌで完全に消
化した大きなｐＤ２０からのフラグメントに挿入してｐ
Ｄ６１を構成する。生成したプラスミドｐＤ６１はＳＶ
４０エンハンサーおよび３つの部分のリーダーを持つア
デノウィルスプロモーターを含有する。 【００４６】これらの組み換え体はこれらのｃＤＮＡ遺
伝子の発現に影響を及ぼすアデノウィルス因子の研究の
ために利用する。実験工程にはＤＮＡトランスフェクシ
ョンおよびＣＯＳサル細胞のアデノウィルス重感染が含
まれる。ＤＮＡトランスフェクションの３６時間後、ト
ランスフェクトした細胞をアデノウィルスで感染させ、
１８時間放置してインキュベートする。その後、細胞を
35Ｓメチオニンで１時間標識し、免疫沈降およびポリア
クリルアミドゲル電気泳動でＤＨＦＲ合成を分析する。
結果はＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）およびｐＣＶＳＶＬ２
の両方が偽トランスフェクトした試料に比してＤＨＦＲ
合成できることを示している。偽トランスフェクトした
ＣＯＳ細胞ではマウスＤＨＦＲのすぐ上に移動したサル
ＤＨＦＲを検知することが可能である。 【００４７】ｐＣＶＳＶＬ２およびｐＣＶＳＶＬからの
ＤＨＦＲ発現をＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞の形質転換により
ＣＯＳ細胞と比べると、２つのプラスミド間には何の差
異も観察されなかった。さらに、アデノウィルスによる
重感染もｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）またはｐＣＶＳＶ
Ｌ２からのＤＨＦＲ合成にほとんど効果を示さなかっ
た。しかしながらｐＣＶＳＶＬ２からの発現はｐＡｄＤ
２６ＳＶｐＡ（３）の２倍以上であった。これはｐＣＶ
ＳＶＬ２においてアデノウィルスＭＬＰの上流にＳＶ４
０エンハンサーが導入された結果である。スプライスし
たアデノウィルスの３つに分かれたリーダーからの１３
８ｂｐのリーダー挿入を含むプラスミド（ｐＤ２０，ｐ
Ｄ１７およびｐＤ６１）もまたＤＨＦＲを合成する事が
観察された。さらに、ｐＤ２０およびｐＤ６１の両者
は、別個の実験においてＤＨＦＲ合成が３−１０倍増加
する事によりアデノウィルス感染に反応する。反対に、
逆方向に１３８ｂｐの３つに分かれたリーダーセグメン
トを含むｐＤ１７からの表現はアデノウィルス重感染に
より影響を受けない。これらの結果は３つに分かれた第
２および第３のリーダーセグメント中の配列が方向に依
存した様式でアデノウィルス感染に対し反応する事を示
唆している。 【００４８】ｍＲＮＡレベルがアデノウィルス感染によ
り影響されるかどうかを決定するため、Ｋａｕｆｍａｎ
らによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２ １３０４−
１３１９（１９８２）に記載されているごとく３′Ｓ１
マッピングを実施した。３′末端標識ＤＮＡプローブを
合成し、トランスフェクトおよびアデノウィルス重感染
したＣＯＳサル細胞から単離された全ＲＮＡとハイブリ
ダイズする。プラスミドｐＣＶＳＶＬ２，ｐＤ２０およ
びｐＤ６１では単一の５５０塩基対フラグメントが観察
されそれはＳＶ４０ポリアデニル化部位でポリアデニル
化されたｍＲＮＡに対応する。ＳＶ４０エンハンサーを
欠くｐＤ２０はＳＶ４０エンハンサーを持つプラスミド
に比較して約２倍のより低いＤＨＦＲ特異的ｍＲＮＡを
示す。アデノウィルス重感染によってもどんなｃＤＮＡ
遺伝子からもＤＨＦＲ ｍＲＮＡレベルの変化は認めら
れない。この事はアデノウィルス重感染により観察され
たＤＨＦＲ合成の増加はＤＨＦＲ ｍＲＮＡレベルの上
昇によるものではない事を示している。アデノウィルス
重感染によるＤＨＦＲ合成の増加は増加した翻訳効率の
結果である。 【００４９】実施例２ ＶＡ ＲＮＡの翻訳における効果を分析するため、ヒト
ガンマーインターフェロンを発現するプラスミドの新
しい組（図２（ａ）−２（ｄ））を構成した。オリゴｄ
Ｇ−オリゴｄＣテーリング法（Ｍａｎｉａｔｉｓら）に
よりヒト末梢血液リンパ球から単離されたｍＲＮＡから
クローンしたヒトガンマーインターフェロンをコードし
ているｃＤＮＡはＳ．Ｃｌａｒｋ博士（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から提供を受けた。ガンマーイ
ンターフェロンをコードしているＰｓｔ１クローンは前
もってＳＶ４０ポリアデニル化信号のＰｓｔＩ部位３′
を消失させた。ｐＣＶＳＶＬ２誘導体のＰｓｔＩ部位へ
挿入する。生じるプラスミドｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６
（図２（ａ））はガンマーインタフェロンコード領域Ｄ
ＨＦＲ ｃＤＮＡの５′およびｍＲＮＡ続生のための
３′スプライス部位の３′を含む。３つに分かれたリー
ダーを持つ同様のプラスミドを得るため、ｐ（ガンマー
ＩＦ）Ｄ−６およびｐＤ６１の両方をＳａｌｌおよびＥ
ｇｌＩＩで消化した。Ｓａｌｌは各々のプラスミドをｐ
ＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子内で一度消化
し、ＢｇｌＩＩは各々のプラスミドをイムノグロブリン
遺伝子からの３′スプライス部位のまさしく５′を一度
消化する。ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６からのガンマーＩ
Ｆ含有フラグメントを３部分リーダーを含むフラグメン
トｐＤ６１と連結し、続いてＤＮＡは大腸菌ＨＢ１０１
をテトラサイクリン耐性に形質転換するのに使用する。
ｐＬ５８（図２（ｂ））はアデノウィルスの３つに分か
れたリーダーを含むが他の点ではｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ
−６と同一である。 【００５０】アデノウィルスＶＡ遺伝子はＨｉｎｄＩＩ
ＩＡｄ２Ｂフラグメントから単離されｐＬ５８に導入す
る。アデノウィルスのＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメント
（１７．１ｍｕ−３１．７ｍｕ）は前もってｐＢＲ３２
２中にクローンし、すなわち３１．７ｍｕのＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に結合する。
このプラスミドをＨｐａＩ（２８．０ｍｕ）で消化しＥ
ｃｏＲＩリンカーを加える。ＥｃｏＲＩ消化後、１．４
ＫＢバンドを単離し、ｐＬ５８のＥｃｏＲＩ部位中へク
ローンする。ＰＱ２（図２（ｃ））はベクター内にＶＡ
遺伝子が存在するが、アデノウィルスＭＬＰと逆の方向
に転写する。ｐＱ３（図２（ｄ））はＶＡ遺伝子が逆の
方向性である点を除いてｐＱ２と同一である。 【００５１】ガンマインターフェロン ガンマーインターフェロン検定はＣＣＬ５４細胞（ＡＴ
ＣＣ番号ＣＣＬ５４、継代数２４）に対する小疱口内炎
ウィルスまたは脳心筋炎ウィルスの細胞症効果からの保
護を測定する事により実施する（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｗ．
Ｅ．ＩＩ，インターフェロン体系，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，
Ｂｅｒｌｉｎ．１９７９）。テンマーインターフェロン
単位はＮＩＨアルファーインターフェロン標準品に対し
て表現した。クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼはＣｏｒｍａｎらによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．，２，１０４４−１０５１（１９８２）に記載
されている方法で細胞抽出物から測定した。ガンマーイ
ンターフェロンの発現はＶＡ ＲＮＡの定量的効果の感
度のよい検定を可能にする。ｐ−ガンマーＩＦ−６およ
びｐＬ５８は３′スプライス部位およびＤＨＦＲ ｃＤ
ＮＡの間のｐｓｔＩ部位へ適切な方向性でガンマーイン
ターフェロンｃＤＮＡが挿入されている点を除いてｐＤ
２０およびｐＤ６１と同一である。最後に、ｐＱ２およ
びｐＱ３はＥｃｏＲＩ部位にアデノウィルスＶＡ遺伝子
（アデノウィルスマップユニット２８．０２および３
１．００）が両方の方向に挿入されている点を除いてｐ
Ｌ５８と同一である。 【００５２】ＣＯＳ細胞における形質転換 プラスミドｐＱ２，ｐＱ３，ｐＬ５８およびｐ−ガンマ
ーＩＦ−６は各々ＣＯＳ細胞にトランスフェクトする
（表１Ａ）。３６時間後条件付け培地の試料を検定に供
し、２つの二重のプレートのうちの１つをアデノウィル
スで感染せしめる。感染２０時間後試料は再びガンマー
ＩＦ活性を検定する。ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６は低い
活性を示し、アデノウィルス重感染でもわずかに上昇し
ただけである。ｐＬ５８はｐ６の数倍の活性を示し、ア
デノウィルスの感染によりガンマーＩＦ活性が２倍の増
加を示した。反対に、ｐＱ２およびｐＱ３の両方ともア
デノウィルス重感染なしで、有意に高い水準のガンマー
ＩＦ活性（ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６の５０−７０倍）
を持っていた。アデノウィルス重感染により、ガンマー
ＩＦ活性は減少した。ＶＡ ＲＮＡがガンマーインター
フェロンの発現の増加を媒介しているかどうかを決定す
るため、プラスミドｐＱ２およびｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ
−６を各々ｐＳＶＯｄまたはｐＶＡＳＶＯｄ（アデノウ
ィルスＶＡ遺伝子を含むｐＳＶＯｄの誘導体）と１：１
の比で混合し、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。ト
ランスフェクションして４８時間後、試料はガンマーＩ
Ｆ検定に供した。ｐ（ガンマーＩＦ）Ｄ−６はｐＶＳＶ
Ｏｄと共トランスフェクトすると活性の２−３倍の増加
を示した。対照的に、ｐＬ５８はｐＶＡＳＶＯｄとの共
トランスフェクションにより１０倍以上の増加を示し
た。最後に、ＶＡ遺伝子を含むｐＱ２はｐＶＡＳＶＯｄ
と共トランスフェクションすると高いガンマーＩＦを持
つ。これらの結果はトランス内のＶＡ遺伝子の存在がア
デノウィルス後期ｍＲＮＡからの３つに分かれたリーダ
ーの大多数を含むｍＲＮＡからの発現を容易にする。 【００５３】表１にみられたｐＱ３重感染によるガンマ
ーＩＦ活性の減少は細胞代謝に対するアデノウィルス感
染による毒性効果またはアデノウィルス後期ｍＲＮＡと
変化したｃＤＮＡ遺伝子からの転写物の競合によるもの
であろう。ガンマーインターフェロン活性を検定した結
果は免疫沈降およびプロティンブロッティング両法でも
共に支持された（データは示していない）。結果はｐＱ
２がトランスフェクション７２時間後１μｇ／ｍｌのガ
ンマーインターフェロンを発現したことを示した。これ
らの結果はアデノウィルス重感染による発現の増加にＶ
Ａ ＲＮＡが対応している事を確認している。アデノウ
ィルスＶＡ ＲＮＡによる翻訳の増加はまたＳＶ４０初
期プロモーターからのクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼの発現を増加させる。ＳＶ４０初期プ
ロモーター制御下細胞クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むプラスミドと
アデノウィルスＶＡ遺伝子を含むプラスミドの共トラン
スフェクションではＶＡ遺伝子を欠くプラスミドとの共
トランスフェクションに比較して５−１０倍高い水準の
ＣＡＴ活性を得る。ＲＮＡブロット分析ではＶＡ遺伝子
との共トランスフェクションによりＣＡＴｍＲＮＡは増
加していないので増加した発現は翻訳の増加のためであ
る。ＳＶ４０初期プロモーターの制御下、細胞キサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドの発現もまたＶＡ遺伝子を含むプラス
ミドのトランスフェクションにより増加する。 【００５４】同様に、例えば組織プラスミノーゲン活性
化因子のごとき他の非定型タンパク質の発現もＶＡ遺伝
子のごとき付帯のＤＮＡを用いると著しく増加できる。
ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするプラスミドで共形質
転換する事によりサルＣＶ１細胞にｐＬ５８およびｐＱ
３を導入すると翻訳効率の同様な増加が観察される。こ
のように、翻訳効率の増加はＣＯＳ細胞に限定されるわ
けではない。さらに、内部および分泌（ＤＨＦＲおよび
ガンマーインターフェロン）両タンパク質の翻訳をＶＡ
ＲＮＡで刺激できる。ガンマーインターフェロンｃＤ
ＮＡ組換え体（ｐＱ２）でトランスフェクトした細胞
は、トランスフェクション７２時間後、１μｇ／１０6
細胞の水準でインターフェロンを産生する。５−１０％
の翻訳効率を仮定するとこれは非常に高い水準の発現で
ある。最後に、翻訳効率の増加はＤＨＦＲおよびガンマ
ーインターフェロンに独特のものではなく、同様のベク
ターでヒトインターロイキン２およびヒトプロインスリ
ンの両者も効率よく発現される。 【００５５】 【表３】【００５６】表１Ａの説明文 トランスフェクトしたおよびアデノウィルスで感染させ
たＣＯＳ細胞におけるγ−インターフェロン活性 Ａ．ＣＯＳ細胞を表示したプラスミドＤＮＡでトランス
フェクトした。前に記載したごとく細胞を続いてアデノ
ウィルスで感染させるかまたは偽感染させる。アデノウ
ィルス感染時（トランスフェクション後３６時間）およ
び感染後１８時間（トランスフェクション後５６時間）
の時γ−インターフェロン検定のため試料を採取する。
前に記載したごとく活性を決定し単位／ｍｌ／１０6 細
胞で表わす。 Ｂ．ＣＯＳ細胞を表示したプラスミドＤＮＡでトランス
フェクトし（２ｕ／ｍｌ、ｐＳＶＯｄまたはｐＶＡＳＶ
Ｏｄ各々と等量で）、トランスフェクションして６０時
間後にγ−インターフェロン検定のため試料を採取す
る。 【００５７】実施例３ ベクターｐ９１０２３（Ｂ）の構成 形質転換ベクターｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）はＫａｕ
ｆｍａｎらによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２（１
１）：１３０４−１３１９（１９８２）に記載されてい
る。それは図３に示した構造を持つ。簡単にいうとこの
プラスミドはアデノウィルス２（Ａｄ２）メジャー後期
プロモーターの転写制御下にあるマウスジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。５′ス
プライス部位はアデノウィルスＤＮＡに含まれており、
３′スプライス部位（イムノグロブリン遺伝子から誘導
される）はＡｄ２メジャー後期プロモーターおよびＤＨ
ＦＲコード配列の間に存在する。ＳＶ４０初期ポリアデ
ニル化部位はＤＨＦＲコード配列の下流に存在する。ｐ
ＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）の原核生物−誘導部はｐＳＶ
Ｏｄからであり（Ｍｅｌｌｏｎ，Ｐ．，Ｐａｒｋｅｒ，
Ｖ．，Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．１９８１，Ｃｅｌｌ ２７：２７９−２８８）哺乳
類細胞の複製を阻害する事が知られているｐＢＲ３２２
配列を含んでいない（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．およびＢｏｔｃ
ｈａｎ，Ｍ．１９８１，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
２９３：７９−８１）。 【００５８】ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）は図３に図示
したごとく、プラスミドｐＴＰＬに変換する。ｐＡｄＤ
２６ＳＶｐＡ（３）の２つのＢｓｔＩ部位の１つを欠失
せしめてｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）をプラスミドｐＡ
ｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）に変換する。これはＰｓ
ｔＩにより部分消化（酵素活性が不十分なものを用いる
ことただ１つのＰｓｔＩ部位が切断された線状にされた
プラスミドの亜集団が得られる）した後、Ｋｌｅｎｏｗ
で処理し、連結してプラスミドを再環化し、大腸菌を形
質転換して、ＳＶ４０ポリアデニル化配列の３′に位置
するＰｓｔＩ部位が欠失しているものをスクリーニング
する事により達成される。 【００５９】アデノウィルスの３つに分かれたリーダー
およびウィルス付随遺伝子（ＶＡ遺伝子）を図３に図示
したごとく、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）に挿入
する。第１にｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）をＰｖ
ｕＩＩで切断し、３つの分かれたリーダーからなる３つ
の要素の第１の３′部分で開いた直線分子となす。その
後、ｐＪＡＷ４３（Ｚａｉｎら、１９７９，Ｃｅｌｌ
１６ ８５１）をＸｈｏＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで処
理し、ＰｖｕＩＩで消化し、アクリルアミドゲル上での
電気泳動（６％トリスホウ酸緩衝液中；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２）前記文献）して第２のリーダーおよび
第３のリーダーの一部を含む１３８塩基対フラグメント
を単離する。１３８ｂｐフラグメントをＰｖｕＩＩ消化
ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）と連結する。連結生
成物は大腸菌をテトラサイクリン耐性に形質転換するの
に使用し、コロニーは１４０塩基対フラグメントとハイ
ブリダイズする32Ｐ標識プローブを使用するＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法を用いてスクリーニングす
る。陽性のハイブリダイズしたコロニーからＤＮＡを調
製し、挿入された１３８塩基対ＤＮＡの５′または３′
が第２または第３のアデノウィルス後期リーダーに特異
的に再構成されたＰｖｕＩＩ部位にあるかどうかを試験
する。ＰｖｕＩＩ部位の正しい方向は挿入した１３８塩
基対の５′末端にあるものである。このプラスミドを図
３のｐＴＰＬと称する。 【００６０】ＳＶ４０ＤＮＡをＡｖａＩＩで消化し、Ｘ
ｈｏＩリンカーをフラグメントに連結し、ＸｈｏＩで消
化してＸｈｏＩ部位を開裂し、ゲル電気泳動により４番
目に大きい（Ｄ）フラグメントを単離することにより、
ＳＶ４０エンハンサー配列を含むＳＶ４０のＡｖａＩＩ
Ｄフラグメントを得る。リンカーを付けたＤフラグメン
トの挿入によりＳＶ４０エンハンサーの単一のダイレク
ト繰返し配列を得る。これは連結においてｐＡｄＤ２６
ＳＶｐＡ（３）の量をＸｈｏＩリンカーを付けたＤフラ
グメントに比例させた結果である。ｐＣＶＳＶＬ２−Ｔ
ＰＬ中のＳＶ４０フラグメントの方向性は、アデノウィ
ルスメジャー後期プロモーターのごとくＳＶ４０後期プ
ロモーターが同じ方向であるのと同じである。 【００６１】ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬにアデノウィルス
付随（ＶＡ）遺伝子を導入するには、第１にアデノウィ
ルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメントを含むプラスミ
ドｐＢＲ３２２を構成する。アデノウィルス２型ＤＮＡ
をＨｉｎｄＩＩＩで消化しゲル電気泳動後Ｂフラグメン
トを単離する。このフラグメントは前もってＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化してあるｐＢＲ３２２に挿入する。大腸菌を
アムピシリン抵抗性に形質転換後、組換え体のＨｉｎｄ
ＩＩＩＢフラグメントの挿入をスクリーニングし、挿入
方向に制限酵素消化により決定する。ｐＢＲ３２２−Ａ
ｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢは図４に描かれた方向でアデノウ
ィルス２型ＨｉｎｄＩＩＩＢフラグメントを含む。 【００６２】図４に図示したごとく、プラスミドｐＢＲ
３２２−Ａｄ ＨｉｎｄＩＩＩＢからＶＡ遺伝子を、Ｈ
ｐａＩによる消化ＥｃｏＲＩリンカーの添加およびＥｃ
ｏＲＩによる消化により便利に得、１．４ｋｂフラグメ
ントとして回収する。ＥｃｏＲＩ付着末端を持つそのフ
ラグメントはｐＴＰＬ（前もってＥｃｏＲＩで消化して
ある）のＥｃｏＲＩ部位に連結する。大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換後、テトラサイクリン耐性で選択し、コロニ
ーはＶＡ遺伝子に特別なＤＮＡプローブへのフィルター
ハイブリゼイションによりスクリーニングする。陽性の
ハイブリダイズクローンからＤＮＡを調製し、制限酵素
消化により確認する。生成プラスミドはｐ９１０２３と
称する。 【００６３】ｐ９１０２３内の２つのＥｃｏＲＩ部位を
除く。ｐ９１０２３はＥｃｏＲＩで完全に切断し、２つ
のＤＮＡフラグメントを発生させる：１つはＡｄＭＬ
Ｐ，ＴＰＬ，ＤＨＦＲ，ＳＶ４０ｐＡ部位、ＳＶ４０Ａ
ｖａＩＩフラグメントおよびｐＢＲ３２２Ｔｅｔ遺伝子
および複製起点（毒領域のない）約７ｋｂのフラグメン
トで他はＶＡ遺伝子を含む１．３ｋｂのフラグメントで
ある。両方のフラグメントの末端をＰｏｌＩのＫｌｅｎ
ｏｗフラグメントで満たし、両フラグメント（即ち、
１．３ｋｂおよび７ｋｂ）を一緒に再連結する。プラス
ミドｐ９１０２３（Ａ）はｐ９１０２３同様にＶＡ遺伝
子を含有しているが、２つのＥｃｏＲＩ部位が欠落して
いる事が、ＶＡ遺伝子を用いるＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈ
ｏｇｎｅｓｓスクリーニングおよび通常の制限部位分析
により同定された。 【００６４】ｐ９１０２３（Ａ）内の単一のＰｓｔＩ部
位を除き、ＥｃｏＲＩ部位に置き換える（図５）。ｐ９
１０２３（Ａ）をＰｓｔＩで完全に切断し、ＰｏｌＩの
Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を発生さ
せる。ＥｃｏＲＩリンカーをｐ９１０２３（Ａ）の切断
したＰｓｔＩ部位に連結する。線状ｐ９１０２３（Ａ）
（切断ＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩリンカーが結合してい
る）を結合していないリンカーから分離し、ＥｃｏＲＩ
で完全に消化し、再連結する。プラスミドｐ９１０２３
（Ｂ）が回収され、ｐ９１０２３（Ａ）と同様の構造を
持つ事が同定されるが、前のＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩ
部位が位置している。ＥｃｏＲＩ部位が挿入された生成
物遺伝子を持つプラスミドｐ９１０２３（Ｂ）はＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，に
大腸菌内ｐＣＳＦ−１としてＡＴＣＣ番号３９７５４で
供託されており、入手可能である。 【００６５】実施例４ 実施例２および３に記載した翻訳活性化因子（アデノウ
ィルスＶＡ遺伝子）を含むベクターの有用性を遷移的に
トランスフェクトした細胞および安定に形質転換した細
胞の両者においてヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩ
ＩＩ）をコードしたｃＤＮＡを用いて実証する。ヒトアンチトロンビンＩＩＩ ｃＤＮＡのクローニング “凝固および線維素溶解の生理的阻害剤”（Ｄ．Ｃｏｌ
ｌｅｎ，Ｂ．ＷｉｍａｎおよびＭ．Ｖｅｒｓｔｖａｅｔ
ｅ編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，４３
−５４ページ）においてのＴ．Ｅ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，
Ｇ．Ｄｕｄｅｋ−Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｓｋａ，Ｌ．Ｓ
ｏｔｔｖｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，およびＳ．Ｍａｇｎｕｓ
ｓｏｎ（１９７９）らによるアミノ酸配列から推論した
特定のオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼ
ーションによりヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからヒト
アンチトロンビンＩＩＩをコードした完全長ｃＤＮＡを
単離する。 【００６６】ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーは常法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら）により調製する。ｐｏｌｙＡ＋ｍＲ
ＮＡをヒト肝臓から単離し、メチル水銀で処理し、第１
のｃＤＮＡ鎖合成は逆転写で実施した。塩基で処理後、
第２鎖の合成はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフ
ラグメントによりなし遂げ、二重鎖ｃＤＮＡは続いてＳ
１ヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩメチラーゼおよびＤＮＡポ
リメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、末
端を切断する。ＥｃｏＲＩリンカーを加え、過剰のリン
カーはＥｃｏＲＩ消化により除去し、ＣＬ４Ｂカラムを
通す。ｃＤＮＡをｇ＋１０に連結し、インビトロでパッ
ケージして平板培養する（Ｃ６００ｈｆｌ，Ｒｏｎ Ｄ
ａｖｉｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙか
ら得た高頻度溶原化剤）。総計５００，０００を２４３
から２４８のアミノ酸（Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）および３０４から３０９のアミノ
酸（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ）から調製された２組のオリゴマーでスクリーンす
る。アミノ酸コードの変性に基づくと、１組のオリゴヌ
クレオチドは８つの異なった１７−ｍｅｒｓからなり、
他のものは１６の異った１７−ｍｅｒｓからなってい
る。 【００６７】５μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む
５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＤおよび５ＸＤｅｎｈａｒｔ
溶液中でハイブリダイゼーションを実施する。両方のプ
ローブに対してハイブリダイズした３８の陽性のものを
単離し、プラークを精製し、オリゴヌクレオチドプロー
ブに再ハイブリダイゼーションして同定する。これらの
実験の経過中に、Ｓ．Ｃ．Ｂｏｃｋら（１９８２）（Ｂ
ｏｃｋ，Ｓ．Ｃ．，Ｗｉｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｖｅｈａｒ，
Ｇ．Ａ．およびＬａｗｎ．Ｒ．Ｍ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ，１０，８１１３−８１２５）によりヒトＡＴ
ＩＩＩのヌクレオチド配列が発表された。従って、完全
長クローンを単離するため、イニシエーターＡＴＧを取
囲む１７−ｍｅｒｓオリゴヌクレオチド（ＴＡＴＴＣＣ
ＡＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧ）を合成し、３８の陽性のもの
とハイブリダイズした。１３の陽性物のうち、１つを調
製し、ラムダーＡＴＩＩＩ−Ｃ３（ＡＴ３−（３）と名
付け、それは約１．４ｋｂ挿入物を含んでいる。 【００６８】発現ベクターへのＡＴＩＩＩｃＤＮＡの挿
入 ＡＴＩＩＩ発現に利用する発現ベクターはｐＱ２（図２
（ｃ））から誘導された。ｐＱ２をＰｓｔＩで消化して
インターフェロンｃＤＮＡを除き、アガロースゲルから
７．５ＫＢフラグメントを単離する。ＡＴＩＩＩのため
のｃＤＮＡは内部にＥｃｏＲＩ部位を含まないので、Ｅ
ｃｏＲＩ消化で切断することが可能であり、アガロース
ゲル電気泳動によりラムダーＡＴ３−Ｃ３から１．４Ｋ
Ｂフラグメントを単離する。前もって合成アダプター： ＰｓｔＩ ５′ＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧ３′ ＥｃｏＲＩ ＡＣＧＴＣＣＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＡ をつけたベクターにＥｃｏＲＩ ＡＴＩＩＩフラグメン
トを挿入する。合成アダプターの付加は１０−ｍｅｒの
５′末端のみをリン酸化して達成される。この事により
形質転換体のバックグラウンドを低下させる非リン酸化
ＥｃｏＲＩ末端を残す。低融点アガロースゲル電気泳動
により過剰のアダプターを除去後、７．５ＫＢフラグメ
ントを抽出し、ＥｃｏＲＩ ＡＴＩＩＩｃＤＮＡフラグ
メントに連結する。連結混合物を大腸菌ＨＢ１０１をテ
トラサイクリン耐性に形質転換するのに使用し、ＡＴＩ
ＩＩｃＤＮＡをコードするＴ４末端標識（Ｅｎｇｌｕｎ
ｄ，Ｐ．Ｔ．（１９７１），Ｊ．Ｂ．Ｃ，２４６，３２
６９−３２７６）ｃＤＮＡフラグメントを利用するＧｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法（１９７５，ＰＮＡ
Ｓ，７２，３９６１−３９６５）でのスクリーニングに
より陽性物を同定する。２つのクローンを得た、ｐ９１
０２３ＡＴＩＩＩ−Ｃ３はＡＴＩＩＩｃＤＮＡをアデノ
ウィルスプロモーターに関して適切な方向で含有し、ｐ
９１０２３ＡＴＩＩＩ−Ｅ１はｃＤＮＡを反対の向きで
含んでいる。プラスミドｐ９１０２３ＡＴＩＩＩ−Ｃ３
（ｐＡＴＩＩＩ−Ｃ３）（図６）は大腸菌−ＨＢ１０１
の株としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ）に受付番号ＡＴＣＣ３９９４１として寄
託されており、入手可能である。 【００６９】ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ−３および
ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｅ１は大腸菌中での生殖の
ためのＰＢＲ３２２由来複製物およびテトラサイクリン
耐性遺伝子およびＣＯＳサル細胞内での複製のためのＳ
Ｖ４０由来物およびｐＢＲ３２２“毒”領域の１．１Ｋ
Ｂ欠失を持つ（Ｌｎｓｋｙ．Ｍ．およびＭ．Ｂｏｔｃｈ
ａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ，２９３，７９−８
１）。ＣＯＳサル細胞内でのｃＤＮＡの発現の活性化の
要素は、アデノウィルスメジャー後期プロモーター（Ａ
ｄＭＬＰ；ＳＶ４０エンハンサー（ＳＶ４０ＡＶＡＩＩ
Ｄフラグメント）；アデノウィルスの３つに分かれたリ
ーダーのｃＤＮＡコピー；３つに分かれたリーダーの第
２のイントロンからの５′スプライス部位およびマウス
イムノグロブリン遺伝子からの３′スプライス部位から
なるハイブリッドイントロン（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．
Ｊ．およびＳｈａｒｐ Ｐ．Ａ．（１９８２）（Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，１３０４−１３１
９）；ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化信号；およびア
デノウィルスＶＡ遺伝子である。ヒトアンチトロンビン
ＩＩＩをコードする１．４Ｋｂ ｃＤＮＡの方向を示し
た。ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３はＡＴＩＩＩ ｃ
ＤＮＡをＡｄＭＬＰからの転写に対し適切な方向で含ん
でいる。 【００７０】ＣＯＳ細胞発現 実施例１に記載したごとく、ＣＯＳサル細胞内へＤＥＡ
Ｅ−デキストラン開始トランスフェクションによりｐ９
１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３およびｐ９１０２３−ＡＴ
ＩＩＩ−Ｅ１を導入した。トランスフェクションして２
４時間後、細胞を無血清Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌ
ｅ培地で洗い、条件付け培地を２４時間後に、ウサギ抗
−ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，より得た）
を用いるラジオイムノアッセイのため採取する。もしく
は、トランスフェクション４８時間後、細胞を35Ｓメチ
オニン（１ｍＣｉ／ｍｌ）で４時間標識する。条件付け
培地を採取し、実施例１に記載したごとく、免疫沈降お
よびＳＤＳゲル電気泳動のため細胞抽出物を調製する。
トランスフェクトしたＣＯＳ細胞条件付け培地中のＡＴ
ＩＩＩの検定結果を表２に示した。 【００７１】 【表４】表 ２ 遺伝子工学による哺乳類細胞中のＡＴＩＩＩはラジオイ
ムノアッセイにより検定された。ＣＨＯ 安定株 条件付け培地中のＡＴＩＩＩ ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂｌｌ ．０２１ｎＭ ＣＨＯ−Ｂｌ−１．０ｎｅｏ ５．２ ｎＭ ＣＨＯ−Ａ１−５．０ｎｅｏ ４．５ ｎＭ ＣＯＳ 遷移的感染 ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｅ１ ．０１８ ｎＭ ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３ １．９２ ｎＭ 【００７２】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺
伝子によるＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡ遺伝子の増幅 ＤＨＦＲが欠落したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞についてはＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｉｎによ
りＰＮＡＳ，７７，４２１６−４２２０（１９８２）に
記載されている。プラスミドｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ
−Ｃ３，ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｅｒｎ，Ｐ．および
Ｐ．Ｂｅｒｇ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，１，３２７−３４１）およびｐＡｄＤ２６Ｓ
ＶｐＡ（３）（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．およびＳｈａ
ｒｐ，Ｐ．Ａ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，（１９８
２），２，１３０４−１３１９）を一緒に混合し（２５
μｇ ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩ−Ｃ３，２．５μｇ
ｐＳＶ２Ｎｅｏおよび２．５μｇ ｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａ（３））、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を０．３Ｍ
までおよび２．５容量のエタノールを加えて沈殿させ
る。沈殿したＤＮＡは放置して風乾し、Ｋａｕｆｍａｎ
およびＳｈａｒｐらによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５
０：６０１−６２１（１９８２）に記載されているごと
く２ＸＨＥＢＳＳ（．５ｍｌ）（ＣｈｕおよびＳｈａｒ
ｐ Ｇｅｎｅ，１３，１９７−２０２（１９８１））に
再懸濁し、．２５Ｍ ＣａＣｌ2 （．５ｍｌ）と激しく
混合する。 【００７３】カルシウム−リン酸−ＤＮＡ沈殿は３０分
室温でインキベートする。５×１０ 5 細胞／１０ｃｍ皿
で前もって継代培養した（トラインスフェクションの前
に２４時間）ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１細胞の培地を除
き、ＤＮＡ−カルシウムリン酸沈殿を単属の細胞に添加
する。室温で３０分インキュベーション後、５ｍｌの１
０％小牛胎児血清を含むアルファー培地（Ｆｌｏｗ Ｌ
ａｂｓ）を供給し、細胞を３７℃で４．５時間インキュ
ベートする。細胞の単一層から培地を除き、室温（２４
℃）で３分間１０％グリセロールを含む２ｍｌのアルフ
ァー培地を加え、除去後細胞を洗い１０％小牛胎児血
清、各々１０μｇ／ｍｌのチミジン、アデノシン、デオ
キシアデノシン、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を含むアルファー培地に播種する。２日後細胞を１０％
透析小牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシ
ンを含み、ヌクレオサイド類を欠き、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８（ＧＩＢＣＯ）を含有するアルファー培地へ１：
１５で継代培養する。４−５日後細胞を同じ選択培地
（ヌクレオサイドを欠く）に再び播種する。選択培地へ
継代培養して１０−１２日後コロニーが現れる。 【００７４】各々の皿からコロニー（約２０）をプール
し、ｐＳＶ２Ｎｅｏの選択性を保つためのＧ４１８の共
存を除いてメトトレキセートの濃度を増加させて殖や
す。しかしながらｐＳＶ２Ｎｅｏの保持はＡＴＩＩＩ
ｃＤＮＡ遺伝子の増幅には必須ではない。形質転換体の
最初のプールは条件付け培地のラジオイムノアッセイま
たは35Ｓ−メチオニン標識および免疫沈降に続くＳＤＤ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の両方で検定しても
ＡＴＩＩＩ活性を示さない。しかしながら、０．０２、
０．１および１．０μＭメトトレキセート含有培地にお
ける選択後はＡＴＩＩＩは両方の方法で観察できる（表
１）。以後は希釈プレーティングでクローン株を得る。
ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞で産生されたＡＴＩＩＩはその
トロンビンへ結合する能力のため活性であり、ヘパリン
存在下結合が促進される事が示された。 【００７５】実施例５ 組織プラスミノーゲン活性化因子（ヒト）をコードする
ｃＤＮＡ 目的のｍＲＮＡを多量に含む他の細胞に前に使用した常
法に従ってＢｏｗｅｓメラノーマ細胞から単離されたｍ
ＲＮＡから逆転写によりヒトｔＰＡをコードするｃＤＮ
Ａ遺伝子を得た。ｔＰＡタンパク質はＢｏｗｅｓメラノ
ーマ細胞株（Ｒｉｆｋｅｎ博士（ＮｅｗＹｏｒｋ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ）より入手可能）より単離される。ア
ミノ酸配列分析は、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞からの条
件付け培地に見い出されたタンパク質は２つのはっきり
異なったＮ末端を含む事を示し、１つのＮ末端は他のも
のより３つ多くアミノ酸を含む。これらの２つのＮ末端
はグリシンＮ−末端（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｉ
ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ）およびセリン
Ｎ−末端（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−
Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＡＳｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｃｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉ
ｓ）と呼ぶ。 【００７６】Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞からメッセンジ
ャーＲＮＡを単離し、この分野で一般的に知られている
ごとく、ｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用する。
ｃＤＮＡをコピーし、二重鎖を産生する。この分野でよ
く知られている単一ポリマーでのテーリングまたは合成
リンカーでテトラサイクリン低抗プラスミドベクターを
導入する。クローン化したプラスミドのライブラリー
（各々のクローンはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞中に存在
するｍＲＮＡ種の独特のｃＤＮＡコピーを含有してい
る）をベクターで大腸菌を形質転換して調製し、抗生物
質耐性大腸菌細胞を選択する。 【００７７】少くともｔＰＡの一部をコードするｃＤＮ
Ａを含むｃＤＮＡライブラリー中のプラスミドを標準的
なＧｒｕｎｓｔｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓスクリーニン
グ法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、１９７５，ＰＮＡＳ，７
２，３９６１）により同定する。この方法においては、
ＤＮＡを単一鎖の方に固定し、放射性標識したプローブ
へのハイブリダイズまたは結合する能力をスクリーニン
グする。そのようなプローブとはｔＰＡタンパク質の小
さな一部のアミノ酸配列と一致する配列を持つ短いＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドである。ｔＰＡのＮ末端から１５
−２０のアミノ酸のアミノ酸配列を使用する（図７に示
した）。これらのアミノ酸のいくつかは１つ以上の３個
のヌクレオチドコドンでコードされるので、以下の常法
によりすべての可能性にわたる１７−ｍｅｒプローブを
プールする。その後ライブラリー中のクローンがプロー
ブにハイブリダイズする事が観察されるまでＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎおよびＨｏｐｎｅｓｓの方法でｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーンする。プライマーの上流配列を決定
する部分ジデオキシプライマー伸長（Ｗａｌｌａｃｅ
ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，３６４７−３
６５６（１９８１））として知られている通常の方法に
よりクローンがｔＰＡの一部をコードしている事を確認
する。これはクローンがｔＰＡのＮ−末端アミノ酸配列
に対応するコドンを含む事を実証する。 【００７８】クローン中に存在が観察されたｃＤＮＡは
プラスミドから単離し、放射性標識し、順次に、ｃＤＮ
Ａライブラリー中に観察される他の重複したｔＰＡ ｃ
ＤＮＡのフラグメントを同定するプローブとして用い
る。一緒に（２重の、重複した配列は除外して）成熟ｔ
ＰＡタンパク質および非翻訳５′および３′領域の部分
をコードするフラグメントが同定されるまでこの過程を
続ける。２つの異なったライブラリーをスクリーンして
一緒にｔＰＡの完全なコード配列をおおうｃＤＮＡクロ
ーンを得た。ｃＤＮＡクローンｓａｍｌおよびＳ２０が
非対称のリンカーを付けたライブラリーから単離され
た。このライブラリーは以下の常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、分子クローニング−実験用手引書、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（１９８２））により作
製した、即ちＢｏｗｅｓ細胞ｍＲＮＡからのｃＤＮＡを
３′末端でＥｃｏＲＩリンカーと５′末端でＳａｌＩリ
ンカーと連結し、連結したｃＤＮＡを適当なベクターに
挿入する。ｃＤＮＡクローンＥｄｌはＧＣ−テールドｃ
ＤＮＡライブラリー（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記文献）
から単離された。図８ａはｔＰＡ完全コード配列にまた
がり、部分的に重複している組からなるｃＤＮＡクロー
ンＳａｍ１、Ｓ２０およびＥｄ１を図示している。 【００７９】３つのフラグメントから単一コード配列を
一緒に結合するのに用いた技術を図８ｂ、８ｃおよび８
ｄに模式的に示した。図８ｂはフラグメントを受け取る
のに使用し、完全なｃＤＮＡ遺伝子の複製のためのプラ
スミドの構成を図示している。プラスミドＹＩｐ５の構
成はＢｏｔｓｔｅｉｎらによりＧｅｎｅ，８，１７−２
４（１９７９）に記載されている。２ｕイーストプラス
ミドは市販品である。指示“＋”はプラスミド中の制限
酵素部位を示す。制限酵素および／またはＤＮＡポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（以後しばしば
“Ｋｌｅｎｏｗ”と称する）による処理は矢印の次の名
称で示してある。これらの酵素は市販品である。普通の
酵素反応条件を用いる。ある種の制限酵素の消化産物の
連結により他の制限酵素により加水分解されないＤＮＡ
配列ができる事に注意されたい。例えばＹＯｐ４プラス
ミドの構成ではＨｐａＩ部位が消失する。図８ｃおよび
８ｄはライブラリーで同定された３つのｃＤＮＡフラグ
メントからの完全長ｃＤＮＡクローンを含むプラスミド
の構成を図示している。図８（ｃ）においてはプラスミ
ドＹＯｐ４をＸｂａＩで切断し、末端をＫｌｅｎｏｗで
平滑にし、直線状プラスミドは再びＥｃｏＲＩで切断す
る。遺伝子の５′末端を含むｔＰＡｃＤＮＡフラグメン
ト（非翻訳５′末端部分を含む−図７の枠で囲んだＳａ
ｌＩ部位を参照されたい）をＳａｌＩでの消化Ｋｌｅｎ
ｏｗ処理、およびＥｃｏＲＩでの消化によりそのプラス
ミドから単離する。線状ＹＯｐ４およびｔＰＡｃＤＮＡ
５′フラグメントＳａｍＩを連結しプラスミドＩ９０１
を形成するがその際ＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位の連結
によりＳａｌＩ部位が形成される。プラスミドＩ９０１
を大腸菌で連結し、アムピシリン耐性をスクリーニング
する。 【００８０】プラスミドＩ９０１は図８ｂに示したごと
く処理し、ｔＰＡｃＤＮＡの３′フラグメント（Ｅｄ
ｌ）（そのプラスミドの順にＢｇｌＩＩ，Ｋｌｅｎｏｗ
およびＥｃｏＲＩ処理により得る）と連結する。Ｂｇｌ
ＩＩ部位（図７で枠で囲んで示した）をプラスミドＩ９
０１のＣｌａＩ消化物への連結によりこわす。ｔＰＡｃ
ＤＮＡのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ−Ｐｓ
ｔＩ副フラグメントは捨てる、第１のものはなぜなら非
コード領域であり、第２のものは第３のフラグメントＳ
２０（図８ｃ）と重複した領域のためであり、Ｓ２０に
より捨てた配列が供給される。これらの工程によりプラ
スミドＪ１１８を得、それは大腸菌中で複製させ、アン
ピシリン耐性をスクリーンする。プラスミドＪ１１８を
ＥｃｏＲＩで切断し、図８ｃに示した中央のｔＰＡｃＤ
ＮＡフラグメントＳ２０と連結する。Ｊ２０５中のＳ２
０フラグメントの適切な方向は、この分野で一般に知ら
れている非対称エンドヌクレアーゼ消化により確認す
る。このｔＰＡｃＤＮＡ遺伝子は前に発表されたヒトｔ
ＰＡの配列と、ヌクレオチドの数が異なり、図７に示し
たごとく一つのアミノ酸が置換されている。 【００８１】実施例６ 形質転換ベクターｐＬＤＳＧの構成 この実施例の出発プラスミドはｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．２（１１）：１３０４−１３１９（１９８２））と
して知られているものである。それは図９ａに記載した
構造を持つ。簡単に記すと、このプラスミドはアデノウ
ィルス２（Ａｄ２）メジャー後期プロモーターの転写制
御下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）ｃＤＮＡ遺伝子を含む。５′プラスミド部位はアデ
ノウィルスＤＮＡに包含されており、イムノグロブリン
遺伝子から誘導された５′スプライス部位はＡｄ２メジ
ャー後期プロモーターおよびＤＨＦＲコード配列の間に
存在する。ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位はＤＨＦＲ
コード配列の下流に存在する。ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）の原核生物誘導部はｐＳＶＯｄ（Ｍｅｌｌｏｎ，
Ｐ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｖ．，Ｇｌｎｚｍａｎ，Ｙ．およ
びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．１９８１，Ｃｅｌｌ，２７，
２７９−２８８）からであり、哺乳類細胞の複製を阻害
する事が知られているｐＢＲ３２２配列（Ｌｎｓｋｙ，
Ｍ．，およびＢａｔｃｈａｎ，Ｍ．１９８１，Ｎａｔｕ
ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２９３，７９−８１）を含んで
いない。 【００８２】ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）を図９ａに示
した第１の工程でプラスミドｐＣＶＳＶＬ２に変換す
る。ＳＶ４０ＤＮＡをＡｖａＩＩで消化し、そのフラグ
メントにＸｈｏＩリンカーを連結し、ＸｈｏＩで消化し
てＸｈｏＩ部位を開裂させ、ゲル電気泳動により４番目
に大きい（Ｄ）フラグメントを単離してＳＶ４０のＡｖ
ａＩＩＤフラグメントを得る。第１の工程に示したごと
くリンカーを結合したＤフラグメントを挿入して、ＳＶ
４０エンハンサーの単一直接繰り返しを得る。これは連
結の時ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）の量とＸｈｏ−Ｉリ
ンカー結合Ｄフラグメントを比例させた結果である。ｐ
ＣＶＳＶＬ２中のＳＶ４０Ｄフラグメントの方向はアデ
ノウィルスメジャー後期プロモーターの様にＳＶ４０後
期プロモーターが同じ向きになっているごとくである。
ｐＣＶＳＶＬ２を実施例５からのＪ２０５ｔＰＡ遺伝子
でのスプライシングのために合致するように計画された
３工程過程によりプラスミドｐＢ２Ｌ２に変換する。第
１に、ｐＣＶＳＶＬ２中の２つのＰｓｔＩ部位の１つを
ＰｓｔＩ（ただ１つのＰｓｔＩ部位が切断された線状プ
ラスミドの亜集団を得る事ができるように酵素活性が低
下したものを用いる）で部分消化して欠失させ、Ｋｌｅ
ｎｏｗで処理し、連結してプラスミドを再環化し、大腸
菌を形質転換させ、ＳＶ４０ポリアデニル化配列の３′
に位置するＰｓｔＩ部位の欠失をスクリーニングする。 【００８３】第２に、プラスミドをＢｇｌＩＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、連結し、大腸菌形質転換体
コロニーのイムノグロブリンイントロンのＢｇｌＩＩ部
位（図３ａの３′スプライス部位）が破壊されたものを
スクリーニングする。第３にＰｓｔＩでの消化、Ｋｌｅ
ｎｏｗ処理、ＢｇｌＩＩリンカーの連結および過剰の
（１００単位／μｇ ＤＮＡ）ＢｇｌＩＩによる消化で
ＰｓｔＩ部位をＢｇｌＩＩ部位に変換する。生じる線状
ＤＮＡをトリス−酢酸緩衝液中低融点アガロース（１．
２％）ゲルでのゲル電気泳動により単離する。このＤＮ
Ａはインビトロで１μｇ／ｍｌの濃度で２４°にて連結
し、大腸菌ＨＢ１０１をトランスフェクトするのに使用
する（Ｈａｎｉａｔｉｓらの前記文献を参照された
い）。テトラサイクリン耐性のコロニーを成長させ、Ｄ
ＮＡを調製し、ＢｇｌＩＩおよびＰｖｕＩＩ消化により
ＤＨＦＲｃＤＮＡの５′末端のＢｇｌＩＩ部位の存在を
分析し、ＰｓｔＩで消化する。多量の規模でのＤＮＡ調
製はＣｓＣｌで２度ＤＮＡをひもで縛って実施した。 【００８４】実施例５からのｐＪ２０５をＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＳａｌＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、Ｂ
ａｍＨＩリンカーを連結した。生成するＤＮＡはフェノ
ール抽出を行い、クロロホルムで抽出し、酢酸ナトリウ
ムを０．３Ｍ（ｐＨ４．５）まで、および２．５容のエ
タノールを添加してエタノール沈殿する。遠心分離によ
りＤＮＡを回収し、ペレットを乾燥する。ペレットを再
懸濁し、ＢａｍＨＩリンカーを切断するためＢａｍＨＩ
（１００単位／ＤＮＡμｇ）で消化する。消化物をアガ
ロースゲルに応用し２．１ｋｂバンドを同定する。バン
ドを回収し、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）およ
び１ｍＭＥＤＴＡを含む等量の緩衝液を加え、６８°で
１５分間加熱してＤＮＡを得る。ＤＮＡをフェノール抽
出し（２Ｘ）、クロロホルム抽出して（２Ｘ）、酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４．５）の０．３Ｍまでの添加および
２．５容のエタノールの添加によりエタノール沈殿させ
る。 【００８５】図９ｂに図示したごとく、ベクターｐＢ２
Ｌ２をＢｇｌＩＩで消化し、ウシアルカリホスファター
ゼで処理し、フェノール（２Ｘ）、クロロホルム（２
Ｘ）で抽出し、０．３ＭまでのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．
５）および２．５容のエタノールの添加によりエタノー
ル沈殿する。この沈殿したＤＮＡをｐＪ２０５からのＢ
ａｍＨＩリンカーを結合した２．１ｋｂフラグメントと
連結する。連結ＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１の形質転換に
使用する。テトラサイクリン耐性のコロニーをＧｒｕｎ
ｓｔｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法によりｔＰＡｃＤＮＡに特
異的な32Ｐ標識プローブを用いてスクリーニングする。
Ｊ２０５をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化し、32
Ｐ−アルファ−ｄｃＴＰを利用してＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで標識してプローブを作製する。陽性のハイブリッ
ドクローンからＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｖ
ｕＩＩおよびＳａｃＩを用いる別々の制限酵素消化によ
りｔＰＡｃＤＮＡの存在をスクリーニングする。これら
の消化によりｔＰＡｃＤＮＡの存在ばかりでなく、ベク
ター内のプロモーターに対するｃＤＮＡの方向もまた示
される。ｐＬＤＳＧは適切な方向のｔＰＡを含むプラス
ミドである。 【００８６】実施例７ 共トランスフェクションおよび増幅 プラスミドｐＬＤＳＧおよびｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）（実施例６）を一緒に混合し（５０μｇ ｐＬＤ
ＳＧおよび０．５μｇ ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３））、０．３ＭまでのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）お
よび２．５容のエタノールの添加により沈殿せしめる。
沈殿ＤＮＡは放置して風乾し、２ｘＨＥＢＳＳ（０．５
ｍｌ）（ＣｈｎおよびＳｈａｒｐ Ｇｅｎｅ，１３，１
９７−２０２（１９８１））に再懸濁しＫａｕｆｍａｎ
およびＳｈａｒｐによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５
０，６０１−６２１（１９８２）に記載されているごと
く０．２５ＭＣａＣｌ2 （０．５ｍｌ）と激しく混合す
る。カルシウム−リン酸−ＤＮＡ沈殿は室温で３０分間
そのまま放置し、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１細胞（Ｃｈａ
ｓｉｎおよびＵｒｌａｕｂ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７７，
４２１６−４２２０（１９８０））に適用する。これら
の細胞の成長の保持はすでに記載されている（Ｋａｕｆ
ｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．前記
文献およびＣｈａｓｉｎおよびＵｒｌａｕｂ前記文
献）。 【００８７】ＤＵＫＸ−Ｂ１細胞はトランスフェクショ
ン２４時間前に５×１０5 ／１０ｃｍ皿で継代培養す
る。培地を除き、ＤＮＡ−カルシウムリン酸沈殿を単層
の細胞に添加する。室温で３０分間インキュベーション
後１０％小牛胎児血清を含むアルファー培地（Ｆｌｏ
ｗ）５ｍｌを加え細胞は３７°で４．５時間インキュベ
ートする。培地を細胞の単一層から除き、１０％グリセ
ロール含有の２ｍｌのアルファ培地（Ｆｌｏｗ）を室温
（２４°）で３分間添加し、除去後細胞を洗い、１０％
小牛胎児血清、各々１０μｇ／ｍｌのチミジン、アデノ
シン、デオキシアデノシン、ペニシリンおよびストレプ
トマイシンを含むアルファー培地に播種する。２日後、
１０％透析小牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプト
マイシンを含むがヌクレオサイドを欠くアルファー培地
に１：１５で継代培養する。４−５日後細胞を、再び同
一の選択培地（ヌクレオサイドを欠く）に播種する。 【００８８】１０−１２日後現れたコロニーを選択培地
へ継代培養する。メトトレキセート（ＭＴＸ）選択およ
び増幅の２つの図式を追いかけた。表３の下に示した第
１の図式では、外来性ＤＮＡ（選択遺伝子）の取り込み
に基づいて単一の独立したクローン化形質転換体を単離
し、続いて各々のクローンは生成物遺伝子の発現を増加
させる条件下殖やす（即ち、メトトレキセートの濃度を
増加させての成長）。第２の図式では、外来性ＤＮＡ
（選択遺伝子）の取り込みに基づいて多くの独立した形
質転換体のプールを単離し、生成物遺伝子の発現を増加
させる条件下殖やす（即ちメトトレキセートの濃度を増
加させての成長）。集団から個々のクローンを単離し、
生成物遺伝子の発現を分析する。生成物遺伝子発現の最
も高い水準を示すクローンはさらに生成物発現が増加す
る条件下再び成長させる（即ち、培養培地中のメトトレ
キセートの濃度を増加させて成長させる）。 【００８９】図式１に従った結果は表４に示した。ヌク
レオサイドなしのアルファー培地で成長できる個々のク
ローンを選択し、殖やし、ｔＰＡ活性を検定する。活性
はＣＴＡミリ単位／細胞／日即ちｍＵ／細胞／日で記録
した。（以下を参照）。ｔＰＡ活性を示すクローンは続
いて０．０２μＭＭＴＸ、０．１μＭＭＴＸおよび０．
５μＭＭＴＸへの連続的耐性で選択した。ＭＴＸ選択下
ではクローン４Ｃ１はｔＰＡ活性の増加がなかった。し
かしながら、ＭＴＸ不在下４Ｃ１を培養して、サブクロ
ーン（Ｈ３ＢおよびＢ１０Ａ）を発生させるとそれらは
ＭＴＸ耐性で選択した場合共増幅し、高水準のｔＰＡを
発現する。ここの方法を特定の仮説に制限する事は望ん
でおらず、これは元々の４Ｃ１形質転換体からの兄弟Ｄ
ＮＡ中のｔＰＡに連結していないＤＨＦＲ遺伝子の分離
のせいであると考えられる。ｔＰＡ遺伝子に連結した単
一のＤＨＦＲ遺伝子を含むサブクローンはＭＴＸ選択に
よりこれらのクローンと一緒にＤＨＦＲおよびｔＰＡ遺
伝子を増幅する。 【００９０】 【表５】 【００９１】 【表６】【００９２】経路２による結果は表５に示す。ヌクレオ
シドを含まない培地中での選択による継代培養で得られ
た約３００のコロニーを持つプールが調製された（選択
プレートからのコロニー）。これらの形質転換体は０．
０２μＭ ＭＴＸおよび０．０５μＭ ＭＴＸに対する
セクエンシャル耐性によってこれら形質転換体を選択し
た。元のプールされた形質転換体は、０，０．０２およ
び０．５μＭ ＭＴＸを含む培地中でのカルチャーにつ
いて、それぞれ０．０３，０．９および１．９ｍＵ／細
胞／日のｔＰＡ活性を得たが、集団内の個々のクローン
は表５に示す量でｔＰＡを発現した。個々のクローンは
０．２ｍＵ／細胞／日から１０ｍＵ／細胞／日の範囲の
５０倍でｔＰＡ発現レベルが変わった。この経路は大量
ｔＰＡ活性を発現するクローンを速かに同定するために
好ましい。経路１は経路２と組合せてより増殖性の形質
転換体を作ることができることは明らかであろう。 【００９３】 【表７】【００９４】ｔＰＡ発現のモニター ｔＰＡをモニターするｔＰＡの存在についての感受性検
定はフイブリンの存在下でのプラスミノーゲンのプラス
ミンへの転化を触媒した。プラスミンは、プラスチック
プレートに固定されている 125Ｉ−フイブリンからの
125Ｉ−フイブリンフラグメントの放出により検出され
る（Ｓｔｒｉｃｋｌｏｎｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｂｅ
ｍ．２５１ ５６９４−５７０２（１９７６）か、また
は色素産性基質の分解によって検出される（Ｄｒａｐｉ
ｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ６１，４０３−４７１（１
９７９）。好適な色素産性基質（Ｓ２２５１と称され
る）はＫａｂｉ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｇ
ｒｅｅｎｗｈｉｃｂ．ＣＴ）から得られる。これらの検
定は当業者には良く知られており、上記Ａｓｔｒｕｐ等
および上記Ｄｒａｐｉｅｒ等に言及されている。ｔＰＡ
活性は無血清培地５ｍｌで細胞を有するプレート（４×
１０5 細胞／１０ｃｍプレート）をゆすぎ、次いで無血
清培地４ｍｌを加えることによって測定された。細胞を
３７℃で２０時間インキュベートし、調質培地中のサン
プルを検定用に取出した。活性の測定はｍＵ／細胞／日
の単位で表わした。このような条件下での検定で、Ｂｏ
ｗｅｓメラノーマ細胞ラインは０．０２ｍＵ／細胞／日
を生産した。ヒトｔＰＡの比活性は１００，０００ユニ
ット／ｍｇであった。 125Ｉ−フイブリンまたはＳ２２
５１の分解速度はプラスミノーゲンからプラスミンへの
転化を触媒したｔＰＡ量に直接相関する。ｔＰＡ発現の
欠損している細胞からの調質培地のサンプルはこれらの
検定には無視し得るバックグラウンドしか生じない。こ
の無視し得るバックグラウンドは活性化されたフイブリ
ンではないプロテアーゼによるものである。何故なら
ば、色素産性基質検定におけるバックグラウンドは、フ
イブリンの除去によっても標準検定から変化しないため
である。 【００９５】これに反して、ｔＰＡ産性ＣＨＯ細胞ライ
ンからの活性はＢｏｗｅｓメラノーマｔＰＡによって示
されるのと極めて似ているフイブリン活性化を示す。ｔ
ＰＡ活性の定量はウロキナーゼを用いる標準曲線と比較
することによって得られる（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ．ベルギー）。活性の単位（ＣＴＡ；血
栓溶解剤委員会）はウロキナーゼのＷＨＯ標準サンプル
と比較することにより定義されている。ｔＰＡの合成
は、単増の細胞（２×１０6 ／１０ｃｍ）を５ｍｌのメ
チオニンを含まない培地で２度洗浄し、１ｍＣｉ35Ｓメ
チオニンを含み通常のメチオニンを含まない培地１ｍｌ
を添加することによりモニターされる。細胞を３７℃で
４時間インキュベートし、調質培地を免疫吸着剤として
スタフィロコッカス アウレウスを用い、うさぎの抗−
ヒトｔＰＡと免疫沈澱させることにより検定した。 【００９６】コローンＨ３Ｂから分泌された標識化され
た全ての蛋白をゲル電気泳動して得られる結果によれ
ば、ヌクレオシドを含まない培地中で増殖された元のＨ
３Ｂサブクローンと０．１μＭ ＭＴＸ中の増殖に関し
て選択されたＨ３Ｂ細胞との間における分泌蛋白の唯一
の大きな差異は６７，０００ダルトンに泳動する強力な
バンドの存在である。このバンドはうさぎの抗−ヒトｔ
ＰＡ抗体と特異的に免疫沈澱し、かつＢｏｗｅｓメラノ
ーマ細胞ラインから同様に調製されたｔＰＡと共泳動す
る。これらの結果は、０．１μＭ ＭＴＸに耐性を持つ
Ｈ３Ｂクローンの選択時に、ヒトｔＰＡの発現が１０倍
増加することを示している。 【００９７】実施例８ 隣接リンクトベクターの造成 この実施例はｔＰＡの停止コドンをＤＨＦＲの開始コド
ンと直接に結合させた形質転換ベクターの造成を説明す
るものである。これは実施例６で造成されたｐＬＤＳＧ
からｔＰＡ３′およびＤＨＦＲ５′非翻訳領域を除去す
るものである。本実施例はＭ１３ファージテンペレート
からＤＮＡ合成をプライミングするためのＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの使用に基いている（Ｗａｌｌａｃｅ等、
「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２０９：１３９６（１９８０）、Ｚ
ｏｌｌｅｒ等「Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ Ｖｏｌ．１００：４６８−５０９）。第１０図を
参照のこと。ｐＬＤＳＧはＢａｍＨＩで分解され、４．
５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動によって単離した。
この領域はｐＬＤＳＧの非ｐＢＲ３２２領域の大部分を
含んでいる。ファージＭ１３ ｍｐ８をＢａｍＨ１で分
解する。次いで、直線化されたファージをｐＬＤＳＧの
４．５ｋｂフラグメントと結合し、Ｍ１３造成物を宿主
菌（ＪＭ１０３）の形質転換に用いる。ｔＰＡ遺伝子と
融合する32Ｐで標識したプローブを用いるＢｅｎｔｏｎ
−Ｄａｖｉｓの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９６（１９８０）
の方法によりプラークをスクリーニングする。正に融合
するクローンを増殖し、複製型ＤＮＡを作製する。ｔＰ
Ａ遺伝子の正しい方向は制限エンドヌクレアーゼによる
分解（ＢａｍＨ１，ＥｃｏＲ１およびＰｖｕＩＩ）を用
いる公知の技術で決定することができる。 【００９８】ファージＤＮＡは、正しい方向を示すプラ
ークから単離される。この一本鎖ＤＮＡは除去されるべ
きファージの領域を架橋する合成プライマーと共に使用
できる。プライマーの機能は５′および３′の除去領域
であるＤＮＡに融合させるものであり、これによって位
置がくるっている望ましくないＤＮＡをループ化し、こ
のようなＤＮＡが後のプライマー延長工程においてテン
ペレートとして作用することを防止する。第１０図にお
いて、プライマーの５′および３′末端およびＭ１３−
ＬＤＳＧにおける対応位置はそれぞれＢおよびＡと命名
する。プライマーは化学合成によって作られ、ＤＨＦＲ
−３′のアミノ末端におけるｔＰＡ遺伝子−ＴＡＡ−Ａ
ＴＧ−これに続く９個の翻訳されたヌクレオチドの５′
−末端の９個の翻訳されたヌクレオチドから成る。ファ
ージＤＮＡおよびプライマーを混合し、プライマーはＴ
４ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅ
ｎｏｗフラグメントによって延ばされる。これは上記Ｗ
ａｌｌａｃｅ等およびＺｏｌｌｅｒ等の文献に一般的に
説明されている。生成物はＪＭ１０３を形質転換するの
に用いられる。プラークからの複製型ファージＤＮＡは
32Ｐ−標識化プライマーに融合され、Ｓａｎｇｅｒによ
って望ましくない領域を除去したジデオキシヌクレオチ
ド配列として確認されており（Ｓａｎｇｅｒ等Ｐｒｏ
ｂ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４ ｐｐ５４６３
−５４６７（１９７７））、これはＢａｍＨ１で分解さ
れ、かつｔＰＡ遺伝子含有フラグメントを電気泳動で単
離する。このフラグメントはゲルから分離され、前記の
ＢａｍＨ１分解で得たｐＬＤＳＧの２．５ｋｂ Ｂａｍ
Ｈ１フラグメントと結合される。結合生成物はＥＣｏｌ
ｉ ＨＢ１０１の形質転換に用いられ、テトラサイクリ
ン耐性クローンを同定し、プラスミドＤＮＡを作り、か
つ特定する。２．５ｋｂおよび４．５ｋｂフラグメント
の方向が正しいプラスミドをｐＬＤＳＧＬとして同定す
る。このプラスミドはｐＬＤＳＧおよびｐＡｄＤ２６Ｓ
ＶｐＡ（３）の代りに、実施例７におけるリンクトベク
ターとして使用できる。 【００９９】実施例９ ｐＬＤＳＧはＢａｍＨ１で分解され、第１０図に示され
るように４．５ｋｂフラグメントが単離される。Ｂａｍ
Ｈ１分解による２．５ｋｂフラグメントと共に、実質
上、全てのｐＢＲ３２２領域が除かれる。ｐＡｄＤ２６
ＳＶｐＡ（３）も同様に分解される。ｔＰＡおよびＤＨ
ＦＲ遺伝子含有フラグメントはｐＬＤＳＧおよびｐＡｄ
Ｄ２６ＳＶｐＡ（３）について実施例７に示すようにＣ
ＨＯ細胞を形質転換するのに用いられる。 【０１００】実施例１０ アデノウィルストリパータイトリーダーおよびＶＡ遺伝
子を含むベクター 本実施例の方法は第１１図に説明されている。アデノウ
ィルストリパータイトリーダーを含むベクターを造成す
るために、ｐＢ２Ｌ２から出発し、これをＰｖｕＩＩで
開裂して直線状分子を作成する。次いで、ｐＪＡＷ４３
（Ｚａｉｎ等「Ｃｅｌｌ」１６，８５１（１９７９）を
ＸｈｏＩで分解し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、ＰｖｕＩＩ
で分解し、更に１３８塩基対フラグメントをアクリルア
ミドによる電気泳動（トリス硼酸塩バッファー中６％；
Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２））で単離する。１３８
ｂｐフラグメントを次いでＰｖｕＩＩ分解ｐＢ２Ｌ２に
結合する。結合生成物をＥＣｏｌｉをテトラサイクリン
耐性に形質転換するのに用いられ、32Ｐで標識化され、
１４０塩基対フラグメントに対して融合するプローブを
用いＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法でスクリー
ニングする。正に融合するコロニーからＤＮＡを作成
し、再生されたＰｖｕＩＩサイトが第２および第３アデ
ノウィルス後リーダーに特異的に挿入された１３８塩基
対ＤＮＡの５′であるかまたは３′であるかを試験す
る。ＰｖｕＩＩサイトの正しい方向では、１３８塩基対
は５′側に挿入されるであろう。このプラスミドはｐＢ
２Ｌ２−ＴＰＬと命名する。 【０１０１】アデノウィルス関連（ＶＡ）遺伝子をｐＢ
２Ｌ２−ＴＰＬに挿入するために、アデノウィルスタイ
プ２ＤＮＡ第１をＨｉｎｄＩＩＩで分解する。公知の方
法によるゲル電気泳動の後に、Ｅフラグメントを単離す
る。このフラグメントをＫｌｅｎｏｗで処理し、Ｈｐａ
Ｉで分解し、ＥｃｏＲＩ部位リンカーに結合させ（協同
的）、ＥｃｏＲＩで分解し、そして１．３ｋｂバンドを
アガロースゲルから分離する。このフラグメントを予じ
めＥｃｏＲＩで分解したｐＢ２Ｌ２−ＴＰＬのＥｃｏＲ
Ｉサイトに結合する。ＥＣｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転
換およびテトラサイクリン耐性による選択後、ＶＡ遺伝
子に特異的なＤＮＡプローブに対するフイルター融合に
よりコロニーをスクリーニングする。正に融合するクロ
ーンからＤＮＡを作成し、制限エンドヌクレアーゼ分解
により特定する。生成プラスミドはｐＢ２Ｌ２−ＴＰＬ
Ｖで分解される。これは実施例６のｐＢ２Ｌ２に代えて
好適に使用され、修飾ｐＬＤＳＧを生成し、この生成物
は実施例７の方法におけるｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）
と共に使用される。 【０１０２】実施例１１ 免疫グロブリンエンハンサーを含むベクターの造成 ベクターｐＳｅｒは記述されている（Ｇｉｌｌｉｅｓ
等、「Ｃｅｌｌ」３３：７１７−７２８（１９８３））
これはＳＶ４０エンハンサーが除去されているｐＳＶ２
ＧＰＴの誘導物である（ＰｖｕＩＩからＳｐｈｌ，塩基
対６４〜２７０）。Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、「Ｓｃｉｅｕ
ｃｅ」２０９：１４２２−１４２７（１９８０）を参照
されたい。このＤＮＡは、細胞がキサンチンおよびヒポ
キサンチンの存在下で増殖される場合、ミコフェノール
酸に対する耐性をコード化している。マウス免疫グロブ
リンの不変部から誘導された免疫グロブリンエンハンサ
ーを含む１ｋｂフラグメントをｐＳｅｒのＥｃｏＲＩサ
イトに挿入し、ｐＳｅｒｘ２／３を誘導した。 【０１０３】このベクターは１個のＢａｍＨＩサイトを
持つ。これをＢａｍＨ１で分解し、塩基性ホスホターゼ
で処理し、次いでｐＬＤＳＧのフラグメントに結合す
る。このフラグメントは実施例８に示すように、Ｂａｍ
Ｈ１による分解および大きな（４．５ｋｂ）フラグメン
トの分離によって作られる。結合されたＤＮＡはアンピ
シリン耐性によって選択されるＥｃｏｌｉ ＨＢ１０１
を形質転換するのに使用され、コロニーは32Ｐ標識化ｔ
ＰＡプローブに対する交雑によるｔＰＡ遺伝子の存在に
よってＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法によりス
クリーニングする。このプローブはＪ２０５をＨｉｎｄ
ＩＩＩおよびＳａｌＩで分解し、32Ｐ−α−ｄＣＴＰお
よび放射性同位元素を含まないｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよ
びｄＧＴＰの存在下にこのＮＤＡにＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼにより標識化することにより作ることができる。正
に交雑するクローンは増殖され、プラスミドは回収され
る。第１２ａ図はこのベクター（ｐ７Ｂ１）を説明して
いる。このＤＮＡは、プロトプラスト融合のＳａｎｄｒ
ｉ−Ｇｏｌｄｉｎ法の変法である前記Ｇｉｌｌｉｅｓ等
に説明されているようなミエローマ細胞Ｊ５５８Ｌ中に
導入される。プロトプラストの融合３６時間後、細胞を
５ｍｇ／ｍｌのミコフェノール酸、２５０μｇ／ｍｌの
キサンチンおよび１５ｍｇ／ｍｌのヒポキサンチンを含
む培地中で増殖され、プラスミドＤＮＡを取込んだ細胞
を選択した。この方法で単離した１つのクローンはｔＰ
Ａを０．０５ｍＵ／細胞／日の割合で発現した。他の適
当な親細胞はＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０または他の非分
泌性ミエローマ細胞株である。 【０１０４】実施例１２ 転写的に活性化されたベクターの造成 転移活性転写性アクチベーターＥ１Ａを、アデノウィル
ス初期領域２プロモーターを含むベクターと共に使用す
る。ｐＣＶＳＶＬはＫａｎｆｍａｎ等「Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌ．Ｂｉｏｌ」２（１１）１３０４−１３１９（１９８
２）に開示されている。ｐＣＶＳＶＬをＢａｌで分解
し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、Ｘｈｏｌリンカー（共働
的）に結合し、Ｘｈｏｌで分解し、ＥｃｏＲＩで分解
し、ゲル電気泳動により４．２ｋｂフラグメントを単離
する。 【０１０５】アデノウィルス２ＤＮＡをＥｃｏＲＩで分
解し、ＥｃｏＲＩ Ｆフラグメント（マップユニット７
０．７〜７５．９）を回収する。ＦフラグメントをＸｈ
ｏｌで分解し、かつＥ２プロモーターサブフラグメント
をゲル電気泳動で単離した。このサブフラグメントはＥ
ｃｏＲｌおよびＸｈｏｌ粘着末端を有し、上記で得られ
たｐＣＶＳＶＬの４．２ｋｂフラグメントのＥｃｏＲｌ
およびＸｈｏｌ末端に結合される。得られるプラスミド
は細菌を形質転換するのに使用される。標識化Ｅ２プロ
ーブに交雑するクローンはｐＥ２−７として回収され
る。ｐＥ２−７はアデノウィルス初期領域プロモーター
を利用するＤＨＦＲｃＤＮＡ遺伝子である。ｐＥ２−７
の造成はＲ．ＫｉｎｇｓｔｏｎおよびＰ．Ｓｈａｒｐの
方法によって与えられる。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ１９７０−１９７７（１９８
４）を参照のこと。ｐＥ２−７はＰｓｔｌで部分分解さ
れ、Ｋｌｅｎｏｗで処理され、ＢｇｌＩＩリンカーに結
合され、ＢｇｌＩＩで分解される。これによって、ｐＪ
２０５（第９ｂ図）からのｔＰＡ遺伝子を常法によりｐ
Ｅ２−７に挿入できる。 【０１０６】ｔＰＡ遺伝子を持つｐＪ２０５の一部を第
９ｂ図に示すようにｐＪ２０５から切除し、ＢａｍＨｌ
粘差末端をｐＥ２−７のＢｇ１ＩＩ接着末端に結合し、
第１２（ｂ）図に示すプラスミドｐＥ２−７ＰＡを得
る。ｐＥ２−７ＰＡはアデノウィルス初期領域２プロモ
ーターを利用するｔＰＡ遺伝子である。Ｅ１Ａ遺伝子お
よびプロモーターはアデノウィルス２のＫｐｎｌフラグ
メント（１０〜５．８マップユニット）として得られ
る。ｐＥ２−７ＰＡ，ｐＥ２−７およびＥ１Ａ遺伝子ベ
クターは２０：１：４のモル比で使用され実施例７に更
に開示されているようにＣＨＯ細胞を形質転換する。こ
のように単離された形質転換体によりｔＰＡ活性が０．
００８ｍＵ／細胞／日生産される。Ｅ１Ａ遺伝子を省略
して得られる形質転換体（２０：１の比率でｐＥ２−７
を持つｐＥ２−７ＰＡ）では僅かに０．０００３ｍＵ／
細胞／日を発現する。 【０１０７】実施例１３ ｔＰＡ発現の増加に関連する細胞形態学における変化 ｔＰＡ合成の最適条件下での増殖および選択により、組
織培養皿に付着できない形態の異った細胞が得られる。
低水準のｔＰＡ（０．０１ｍＵ／細胞／日）を生産する
無ヌクレオシド培地（実施例７、表４に説明されている
ようなもの）中で増殖された３００個の形質転換体のプ
ールでは平らな形態上の特徴を持つＣＨＯ細胞である。
０．０５μＭ以下のＭＴＸ中での増殖について表４に説
明したような選択を行った場合、ｔＰＡの水準は０．６
ｍＵ／細胞／日に増加し、形態上の変化は明らかになっ
た。このような変化は１．２ｍＵ／細胞／日以上を生産
するクローン（例えば、クローン９、１２および２０）
においても明らかである。これらの細胞は組織培養皿に
付着せず、したがってより高い水準のｔＰＡ発現による
選択は困難である。これはアプロチニン（シグマ）を培
地に添加（０．５〜５％Ｖ／Ｖ）することにより、また
はプラスミノーゲンを含まない胎児小牛血清を用いるこ
とによって克服された。これらの処理の結果は、高水準
のｔＰＡを生産する細胞に負荷された毒性を転減するこ
とである。無プラスミノーゲン血清はＤｅｕｔｓｃｂア
ンドＭｅｒｔｚ「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９７０）ｐ１０
９５に説明されるように血清をリジン−セファロース４
Ｂ（ファルマシア社製）のカラムに通過させることによ
って得られる。 【０１０８】実施例１４ ＣＯＳ細胞におけるＥＰＯの発現 エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子を含むクローンを遺
伝子工学的手法によりヒト胎児肝臓ライブラリーから作
成した。ラムダーＨＥＰＯＦＬ１３を命名するＥＰＯク
ローンは第１３図に示すヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を持つ。クローンラムダーＨＥＰＯＦＬ１３はｐ
９１０２３（Ｂ）ベクターに挿入され、当業者には公知
の遺伝子工学的手法を用いてＣＯＳ−１細胞に感染させ
た。精製プラスミドＤＮＡのそれぞれ８μｇを用いてＤ
ＥＡＥ−デキストラン法により５×１０6 ＣＯＳ−１細
胞に感染させた（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ等，「Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」７８：７５７５−７５
７８（１９８１）およびＬｕｔｈｍａｎ等「Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，」１１：１２９５−１３０８（１
９８３））。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン−
（０．１ｍＭ）で２時間、３７℃処理し、再度洗浄し、
１０％胎児牛血清１０％を含む１０ｍｌの培地に２４時
間曝した。この培地を４ｍｌの無血清培地に変え、４８
時間後に回収した。 【０１０９】免疫活性ＥＰＯ（ａ）の生産をＳｈｅｒｗ
ｏｏｄおよびＧｏｌｄｗａｓｓｅｒ（Ｂｌｏｏｄ，５
４：８８５−８９３（１９７９））に説明されているよ
うなラジオイムノアッセイによって定量し、３００ｎｇ
／ｍｌであることが判明した。ラムダーＨＥＰＯＦＬ１
３を含むｐ９１０２３（Ｂ）ベクターも、クロロキン処
理無しでＣＯＳ−１細胞に感染させ、前記と同様に増殖
させた。ＥＰＯのインビトロ生物活性は、ＣＦＵ−Ｅの
供給源であるマウスの胎児肝臓細胞によるコロニー形成
検定によるか、またはフェニルヒドラジン注射マイスか
らの脾細胞を用いる 3Ｈ−チミジン取込み検定によって
測定され、それぞれ２Ｕ／ｍ、および３Ｕ／ｍｌの値を
得た。また、ＥＰＯのインビボ生物活性は、低酸素状マ
ウス法または絶食ラット法を用いて測定し、それぞれ、
１（ＣＦＵ−Ｅ）および２（ 3Ｈ−Ｔｈｙ）Ｕ／ｍｌの
値を得た。 【０１１０】実施例１５ ＣＨＯ細胞におけるＥＰＯの発現 （ベクターＰＫ１−４の造成）マウスのジヒドロ葉酸還
元酵素に隣接するＳＶ４０初期領域プロモータ、ＳＶ４
０エンハンサー、小ｔ抗原イントロンおよびＳＶ４０ポ
リアデニル配列を含むプラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲ（Ｓ
ｕｂｒａｍａｎｉ等、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」
１：８５４−８６４（１９８１）からのＢａｍＨＩ−Ｐ
ｖｕＩＩフラグメント（フラグメントＡ）を単離した。
残りのフラグメントは以下のようにベクターｐ９１０２
３（Ａ）から得た。ｐ９１０２３（Ａ）をアデノウィル
スプロモーター付近の単一ＰｓｔＩサイトにおいてＰｓ
ｔＩ分解してプラスミドを直線化し、次いで合成Ｐｓｔ
Ｉ−ＥｃｏＲＩコンバーターに結合し、再閉環（元のＰ
ｓｔＩサイトにＰｓｔＩ：ＥｃｏＲＩサイトを作る：９
１０２３（Ｂ′））するか、またはＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大フラグメントで処理してＰｓｔＩサイトを消去
し、合成ＥｃｏＲＩリンカーに結合し、再閉環（元のＰ
ｓｔＩサイトにＥｃｏＲＩサイトを作る：９１０２３
（Ｂ））した。ｐ９１０２３（Ｂ））由来のフラグメン
トＡとフラグメントｐ９１０２３（Ｂ′）とを結合し
て、２つの新しいプラスミドを作った。これらのプラス
ミドはＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩサイトかまたはＰｓｔＩ−
ＥｃｏＲＩサイトのいずれかを元のＰｓｔＩサイトに持
っていた。ＰｓｔＩサイトがアデノウィルス主後期プロ
モーターに最も近いＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩサイトを含む
プラスミドをｐ９１０２３（Ｃ）と名付けた。 【０１１１】ベクターｐ９１０２３（Ｃ）をＸｈｏｌで
完全に分解し、接着末端を持つ得られた直線化ＤＮＡ
を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＥｃｏｌｉの大フラグメン
トによる末端フイリング反応で平滑化した。以下のよう
に作られるＳＶ４０エンハンサーを含む３４０ｂｐ Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを上記のＤＮＡ
に結合した。複製のＳＶ４０オリジンを含むＳＶ４０か
らのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをプラス
ミドπｌａｃに挿入した（Ｌｉｔｔｌｅ等、Ｍａｌ Ｂ
ｉｏｌ Ｍｅｄ．１：４７３−４８８（１９８３））。
このπｌａｃベクターは、ＢａｍＨＩでπｌａｃ ＤＮ
Ａを分解し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで
接着末端をフイルインし、このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ
で分解することにより作製された。 【０１１２】得られたプラスミド（πＳＶＨＰｌａｃ）
はＰｖｕＩＩ平滑末端に結合することによってＢａｍＨ
Ｉサイトを再生した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントをＳＶＨＰ ｌａｃから作り、複製のプラスミ
ドオリジンを含むＰＳＶＯｄ（上記Ｍｅｌｌｏｎ等）の
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合し、得
られたプラスミドｐＳＶＨＰｏｄを選択した。ＳＶ４０
オリジン／エンハンサーを含むＰＳＶＨＰｏｄの３４０
ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを作
り、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントでその両末
端を平滑にした。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントの方向は、そのフラグメント内のＢａｍＨＩサイト
がＶＡ遺伝子に最も近いようになっているプラスミド
（ｐ９１０２３（ＣＯ／Ｘｈｏ／平滑化＋ＥｃｏＲＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ／平滑化ＳＶ４０オリジン＋エンハンサ
ー）をｐＥＳ１０５と命名した。プラスミドｐＥＳ１０
５をＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩで、およびＰｖｕＩＩ
単独で分解し、アデノウィルス主後期プロモーターを含
むＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント（フラグメント
Ｂ）、および耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）を持
つプラスミドおよびその他のＤＮＡ配列を有するＰｖｕ
ＩＩフラグメント（フラグメントＣ）を単離した。フラ
グメントＡ、ＢおよびＣを結合し、第１４図に示された
得られたプラスミドを単離し、ＲＫ１−４と命名した。
プラスミドＲＫ１−４は米国メリーランド州、ロックビ
ルのＡＴＣＣにＡＴＣＣ Ｎｏ．３９９４０として寄託
された。 【０１１３】ＥＰＯの発現 クローンラムダＨＥＰＯＦＬ１３からのＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで分解し、ＥＰＯ遺伝子を含む小ＲＩフラグメント
をプラスミドＲＫ１−４のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーンした。このＤＮＡ（ＲＫＦＬ１３）はＤＨＦＲ−欠
損ＣＨＯ細胞を直接に（分解することなく）感染させる
のに使用され、以下のように選択、拡大された。２日間
の増殖の後、少くとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を取込んだ
細胞はヌクレオシドを含まず、１０％透析胎児牛血清を
補充したアルファー培地中で選択した。選択培地中での
２週間の増殖の後、コロニーを元のプレートから除き、
各プール１０−１００コロニーのグループ中にプール
し、再プレートし、ヌクレオシドを含まないアルファー
培地中に全面増殖した。メトトレキゼート選択の前に増
殖されたプールからの培地上清をＲＩＡによりＥＰＯに
関して検定した。陽性のＥＰＯ生産を示したプールは直
ちにサブクローンし、再検定し、更に陽性のものは段階
的選択（以下参照）を行った。 【０１１４】ＲＩＡにより陰性であるプールに関して、
メリトレキゼート（ｍｌｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，０．２
μｍ）の存在において増殖された対応する培養物から得
たメリトレキゼート耐性コロニーはＲＩＡによりプール
中ＥＰＯについて検定した。陽性であったこれらの培養
物をサブクローンし、更にメソトレキゼートの濃度を増
加して増殖させた。段階的メソトレキゼート（ＭＴＸ）
選択を、濃度を増したＭＴＸの存在下に細胞を培養する
繰返しサイクルによって行った。各段階において、ＥＰ
Ｏを、ＲＩＡにより、およびインビトロ生物活性により
培養上清について測定した。各段階の濃度増加に使用さ
れるＭＴＸは０．２μＭ，０．１μＭおよび０．５μＭ
であった。ＲＫＦＬ１３ＤＮＡはミクロインジェクショ
ンによりＣＨＯ細胞内に挿入された。得られたＦＰＯ発
現の程度は表６に示す。 【０１１５】 【表８】【０１１６】本発明の好ましい態様を含み詳細に説明し
た。しかしながら、これらの開示を検討することにより
当業者は、本発明の範囲内で変更および改良を行うこと
ができることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａはプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
（３）の構造を説明するものである。図１ｂはプラスミ
ドｐＣＶＳＶＬの構造を説明するものである。図１ｃは
プラスミドｐＤ２０の構造を説明するものである。図１
ｄはプラスミドｐＤ１７の構造を説明するものである。
図１ｅはプラスミドｐＤ６１の構造を説明するものであ
る。 【図２】図２ａはプラスミドｐＩＦＤ−６の構造を説明
するものである。図２ｂはプラスミドｐＬ５８の構造を
説明するものである。図２ｃはプラスミドｐＱ２の構造
を説明するものである。図２ｄはプラスミドｐＱ３の構
造を説明するものである。 【図３】プラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）からプ
ラスミドｐＴＰＬの造成を図解説明するものである。 【図４】プラスミドｐＴＰＬからプラスミドｐ９１０２
３の造成を図３に引続いて図解説明するものである。 【図５】図４に続く図解図であり、ｐ９１０２３からプ
ラスミドｐ９１０２３（Ｂ）の造成を説明するものであ
る。 【図６】ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩを図解説明するもの
である。 【図７Ａ】図７Ａはヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）およびその非コード化フランキング領
域のヌクレオチド配列を示すものである。 【図７Ｂ】図７Ｂはヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）およびその非コード化フランキング領
域のヌクレオチド配列を示すものである。 【図７Ｃ】図７Ｃはヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）およびその非コード化フランキング領
域のヌクレオチド配列を示すものである。 【図８Ａ】エンティーｔＰＡ蛋白配列をコードする４個
の重なり合うｃＤＮＡクローンを説明する図である。 【図８Ｂ】ヒトｔＰＡの複製型ｃＤＮＡを得るための適
当な方法を図解的に表わす図である。 【図８Ｃ】ヒトｔＰＡの複製型ｃＤＮＡを得るための適
当な方法を図解的に表わす図である。 【図８Ｄ】ヒトｔＰＡの複製型ｃＤＮＡを得るための適
当な方法を図解的に表わす図である。 【図９Ａ】ｔＰＡ形質転換ベクターを作る方法を図解的
に示す図である。 【図９Ｂ】ｔＰＡ形質転換ベクターを作る方法を図解的
に示す図である。 【図１０】リンクされたベクターを作るための方法を図
解的に示す図である。 【図１１】翻訳アクチベーターを含む共形質転換ベクタ
ーを作るための方法を図解的に示す図である。 【図１２】図１２ａは真核生物のエンハンサーを含む形
質転換用ベクターの図解図である。図１２ｂはトランス
−アクティング転写アクチベーターに感受性の領域を含
む形質転換用ベクターの図解図である。 【図１３】ＥＰＯクローンラムダーＨＥＰＯＦＬ１３の
ヌクレオチド配列およびそれから生じるアミノ酸配列を
示す。 【図１４】形質転換用ベクターｐＲＫ１−４を説明する
図解図である。
（３）の構造を説明するものである。図１ｂはプラスミ
ドｐＣＶＳＶＬの構造を説明するものである。図１ｃは
プラスミドｐＤ２０の構造を説明するものである。図１
ｄはプラスミドｐＤ１７の構造を説明するものである。
図１ｅはプラスミドｐＤ６１の構造を説明するものであ
る。 【図２】図２ａはプラスミドｐＩＦＤ−６の構造を説明
するものである。図２ｂはプラスミドｐＬ５８の構造を
説明するものである。図２ｃはプラスミドｐＱ２の構造
を説明するものである。図２ｄはプラスミドｐＱ３の構
造を説明するものである。 【図３】プラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）からプ
ラスミドｐＴＰＬの造成を図解説明するものである。 【図４】プラスミドｐＴＰＬからプラスミドｐ９１０２
３の造成を図３に引続いて図解説明するものである。 【図５】図４に続く図解図であり、ｐ９１０２３からプ
ラスミドｐ９１０２３（Ｂ）の造成を説明するものであ
る。 【図６】ｐ９１０２３−ＡＴＩＩＩを図解説明するもの
である。 【図７Ａ】図７Ａはヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）およびその非コード化フランキング領
域のヌクレオチド配列を示すものである。 【図７Ｂ】図７Ｂはヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）およびその非コード化フランキング領
域のヌクレオチド配列を示すものである。 【図７Ｃ】図７Ｃはヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）およびその非コード化フランキング領
域のヌクレオチド配列を示すものである。 【図８Ａ】エンティーｔＰＡ蛋白配列をコードする４個
の重なり合うｃＤＮＡクローンを説明する図である。 【図８Ｂ】ヒトｔＰＡの複製型ｃＤＮＡを得るための適
当な方法を図解的に表わす図である。 【図８Ｃ】ヒトｔＰＡの複製型ｃＤＮＡを得るための適
当な方法を図解的に表わす図である。 【図８Ｄ】ヒトｔＰＡの複製型ｃＤＮＡを得るための適
当な方法を図解的に表わす図である。 【図９Ａ】ｔＰＡ形質転換ベクターを作る方法を図解的
に示す図である。 【図９Ｂ】ｔＰＡ形質転換ベクターを作る方法を図解的
に示す図である。 【図１０】リンクされたベクターを作るための方法を図
解的に示す図である。 【図１１】翻訳アクチベーターを含む共形質転換ベクタ
ーを作るための方法を図解的に示す図である。 【図１２】図１２ａは真核生物のエンハンサーを含む形
質転換用ベクターの図解図である。図１２ｂはトランス
−アクティング転写アクチベーターに感受性の領域を含
む形質転換用ベクターの図解図である。 【図１３】ＥＰＯクローンラムダーＨＥＰＯＦＬ１３の
ヌクレオチド配列およびそれから生じるアミノ酸配列を
示す。 【図１４】形質転換用ベクターｐＲＫ１−４を説明する
図解図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭59−139324（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−42321（ＪＰ，Ａ)
特開 昭57−28009（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．実質的にプラスミノーゲンを含まない血清培地にお
いて、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子を産生す
る形質転換チャイニーズハムスター卵巣細胞を培養する
ことを特徴とする、該組織プラスミノーゲン活性化因子
の生産方法。 ２．形質転換チャイニーズハムスター卵巣細胞が、少な
くとも０．６ｍＵ／細胞／日の割合いで組織プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生するものである請求項１記載の
組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法。 ３．形質転換チャイニーズハムスター卵巣細胞が、１．
２ｍＵ／細胞／日以上の割合いで組織プラスミノーゲン
活性化因子を産生するものである請求項２記載の組織プ
ラスミノーゲン活性化因子の生産方法。 ４．血清培地が実質的にプラスミンを含まないものであ
る請求項１から３のいずれかに記載の組織プラスミノー
ゲン活性化因子の生産方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56562783A | 1983-12-27 | 1983-12-27 | |
| US06/566,057 US4740461A (en) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US67781384A | 1984-12-04 | 1984-12-04 | |
| US677813 | 1984-12-04 | ||
| US566057 | 1984-12-04 | ||
| US565627 | 1984-12-04 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281862A Division JP2648301B2 (ja) | 1983-12-27 | 1984-12-27 | 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクター |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8215721A Division JPH09107978A (ja) | 1983-12-27 | 1996-08-15 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
| JP9142690A Division JPH1052266A (ja) | 1983-12-27 | 1997-05-30 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06189758A JPH06189758A (ja) | 1994-07-12 |
| JP2693361B2 true JP2693361B2 (ja) | 1997-12-24 |
Family
ID=27415970
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281862A Expired - Lifetime JP2648301B2 (ja) | 1983-12-27 | 1984-12-27 | 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクター |
| JP5256173A Expired - Lifetime JP2693361B2 (ja) | 1983-12-27 | 1993-10-13 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
| JP8215721A Pending JPH09107978A (ja) | 1983-12-27 | 1996-08-15 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
| JP9142690A Pending JPH1052266A (ja) | 1983-12-27 | 1997-05-30 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281862A Expired - Lifetime JP2648301B2 (ja) | 1983-12-27 | 1984-12-27 | 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクター |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8215721A Pending JPH09107978A (ja) | 1983-12-27 | 1996-08-15 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
| JP9142690A Pending JPH1052266A (ja) | 1983-12-27 | 1997-05-30 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (4) | JP2648301B2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62195285A (ja) * | 1986-02-19 | 1987-08-28 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | リンホトキシン発現ベクタ−及びそれを用いるリンホトキシンの製造方法 |
| JPS62269697A (ja) * | 1986-05-19 | 1987-11-24 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
| JP5490972B2 (ja) | 2000-08-04 | 2014-05-14 | 中外製薬株式会社 | タンパク質注射製剤 |
| WO2002013860A1 (fr) | 2000-08-11 | 2002-02-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preparations stabilisees contenant un anticorps |
| WO2002072615A1 (fr) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de purification de proteines |
| JP4236934B2 (ja) | 2001-04-17 | 2009-03-11 | 中外製薬株式会社 | 界面活性剤の定量方法 |
| IL163745A0 (en) * | 2002-03-26 | 2005-12-18 | Oncolytics Biotech Inc | Use of adenoviruses mutated in the va genes for cancer treatment |
| US20060058511A1 (en) | 2002-08-27 | 2006-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for stabilizing protein solution preparation |
| SI1561756T1 (sl) | 2002-09-11 | 2016-02-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Postopek čiščenja proteinov |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT359653B (de) * | 1979-02-15 | 1980-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes |
| AT359652B (de) * | 1979-02-15 | 1980-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes |
| NL8003402A (nl) * | 1980-06-11 | 1982-01-04 | Leuven Res & Dev Vzw | Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. |
| KR840004781A (ko) * | 1982-05-05 | 1984-10-24 | 월터 에이치·드레거 | 인체의 조직 플라스미노겐 활성화제 |
| GR79202B (ja) * | 1982-05-05 | 1984-10-22 | Genentech Inc | |
| NZ206699A (en) * | 1982-12-30 | 1989-08-29 | Bio Response Inc | Process for the production of serum independent cell lines |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP59281862A patent/JP2648301B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-10-13 JP JP5256173A patent/JP2693361B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-15 JP JP8215721A patent/JPH09107978A/ja active Pending
-
1997
- 1997-05-30 JP JP9142690A patent/JPH1052266A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2648301B2 (ja) | 1997-08-27 |
| JPS6112288A (ja) | 1986-01-20 |
| JPH1052266A (ja) | 1998-02-24 |
| JPH09107978A (ja) | 1997-04-28 |
| JPH06189758A (ja) | 1994-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0117058B1 (en) | Methods for producing mature protein in vertebrate host cells | |
| US4740461A (en) | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells | |
| US5112950A (en) | Factor viii analog, preparation process, and pharmaceutical composition containing it | |
| Mulligan et al. | Expression of a bacterial gene in mammalian cells | |
| US5122458A (en) | Use of a bgh gdna polyadenylation signal in expression of non-bgh polypeptides in higher eukaryotic cells | |
| KR100257457B1 (ko) | 인간응집인자 viii 단백질 복합체의 제조방법 | |
| JPH01165395A (ja) | 組換えタンパク質発現のための一時発現系 | |
| JPH0779700B2 (ja) | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 | |
| JP2693361B2 (ja) | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 | |
| US4965196A (en) | Polycistronic expression vector construction | |
| JPH0576374A (ja) | 組織プラスミノーゲンアクチベーターの翻訳後プロセツシングを改変するための方法 | |
| WO1990001550A1 (en) | High efficiency translation of polycistronic messages in eucaryotic cells | |
| JP3456992B2 (ja) | 変異型ｄｈｆｒ遺伝子を使用した発現誘導方法 | |
| WO1986006409A1 (en) | High level amplification and expression of exogenous dna | |
| WO1988000975A1 (en) | High level inducible expression of heterologous genes | |
| JP2619891B2 (ja) | 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 | |
| US5079159A (en) | Method for making tissue plasminogen activator | |
| AU602664B2 (en) | DNA sequence containing the DNA sequence coding for human tissue plasminogen activator originating from human normal cells, recombinant DNA incorporating the DNA sequence, host cells transformed with the recombinant DNA, and process for producing human tissue plasminogen activator by use of the host cells | |
| EP0368926A1 (en) | Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of obtaining the same | |
| FR2642767A1 (fr) | Vecteurs d'expression de proteines heterologues dans les cellules eucaryotes, lignees cellulaires obtenues et procede pour leur preparation | |
| JP2721158B2 (ja) | ヒトアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼（ａｔ▲ｉｉｉ▼）の製造 | |
| NO845186L (no) | Vektorsystem for innfoering av heterolog dna i eykaryotiske celler. | |
| WO1988005466A2 (en) | Tandem gene eukaryotic expression vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |