JPH0576374A - 組織プラスミノーゲンアクチベーターの翻訳後プロセツシングを改変するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベー
ター分子およびその誘導体を均質な集団として組換え的
に生産するための方法に関する。 【構成】 本発明は、宿主細胞から分泌される際に均一
に開裂されるヘテロローガスなプロペプチド領域を使用
するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組換えＤＮＡ技術によって組織
プラスミノーゲンアクチベーター(t-ＰＡ)分子の均質な
集団を生産するための新規な方法に関する。本発明はま
た、幾つかの独特なＤＮＡ化合物、組換えＤＮＡ発現ベ
クター、およびその形質転換体をも提供する。

【０００２】組織プラスミノーゲンアクチベーター分子
は、真核生物宿主細胞からの分泌によって部分的にプロ
セッシングされた形態で見いだされている。この部分的
なプロセッシング形態は、成熟t-ＰＡ分子からプロペプ
チド領域が不完全に除去されることに由来する。インキ
ュベートと精製により、プロペプチド領域の残余部分が
タンパク分解的開裂を受け、完全なプロセッシング型が
蓄積される。従って、t-ＰＡ分子を培養培地から精製し
た後には、完全におよび部分的にプロセッシングされた
t-ＰＡ分子の混合物が存在する。本発明では、細胞関連
プロテアーゼによって均一に開裂することのできる新規
なプロペプチド領域を提供することによってアミノ末端
の異質性が排除される。本発明の発現ベクターは、この
新規なプロペプチドを含有する型の組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターを真核生物宿主細胞で生産するための
簡便な手段を提供するものである。発現後では、これら
新規なt-ＰＡ分子は細胞関連プロテアーゼによって均一
に開裂され、完全にプロセッシングされた形態で宿主細
胞培養培地中に分泌される。

【０００３】プラスミノーゲンアクチベーターは、プラ
スミノーゲンをその活性酵素型であるプラスミンに変換
する独特のクラスの酵素である。プラスミンは、血餅の
フィブリン・ネットワークを崩壊させるセリンプロテア
ーゼである。現在、幾つかのプラスミノーゲンアクチベ
ーターがインビボにおけるフィブリン分解物質として急
性心筋梗塞の処置に使用されている。これらプラスミノ
ーゲンアクチベーターの１つである組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターはフィブリンの存在下、プラスミノー
ゲンを活性化する活性化能が顕著に高い。即ち、t-ＰＡ
をインビボにおけるフィブリン分解物質として使用した
場合、フィブリン血餅に比較的高い選択性を示す。

【０００４】ヒトt-ＰＡは、５２７個のアミノ酸から構
成される成熟t-ＰＡ分子を形成している５つの別個の構
造ドメインを有する多重ドメインセリンプロテアーゼで
ある。この分子は、２７５アルギニン−２７６イソロイ
シンにおけるプラスミン介在性の開裂によって２本鎖型
に変換することのできる１本鎖ポリペプチドとして合成
される。

【０００５】この分子のアミノ末端部分は、フィンガー
・ドメインと呼ばれるジスルフィド連結ループを含有し
ている。このドメインは、フィブロネクチン分子にフィ
ブリン結合性を与えるフィブロネクチンのフィンガード
メインと高い相同性を示す。ＥＧＦドメインと呼ばれる
第２のドメインは、上皮性成長因子(ＥＧＦ)との相同性
が高い。同様の成長因子ドメインが、ウロキナーゼ、プ
ロテインＣおよび第IX凝固因子および第Ｘ凝固因子など
のセリンプロテアーゼに存在している。第３および第４
のドメインは、クリングル(Ｋ１およびＫ２)と呼ばれる
高いジスルフィド連結構造である。同様の相同的クリン
グル構造はプラスミノーゲンおよびプロトロンビンなど
の血漿タンパク質に存在している。これら両クリングル
ドメインがプラスミノーゲンのフィブリン介在性活性化
に関与しているのか、または第２のクリングルだけが関
与しているのかに関する相反する証拠が存在している。
カルボキシ末端に位置する第５のドメインはセリンプロ
テアーゼドメインである。このセリンプロテアーゼドメ
インは、ウロキナーゼ、血漿セリン凝固性プロテアーゼ
およびトリプシンにおける同様のドメインと相同的であ
る。

【０００６】組織プラスミノーゲンアクチベーターのア
ミノ末端をコードしているＤＮＡは、３５アミノ酸(ア
ミノ酸−１から−３５)の前駆領域をコードしている。
この前駆領域のアミノ酸配列(配列認識番号：１)は、配
列：

【化２】 [式中、Ｚは天然t-ＰＡ分子の成熟型をコードしている
アミノ酸配列であり、Ａrgはアルギニン、Ａsnはアスパ
ラギン、Ａspはアスパラギン酸、Ｃysはシステイン、Ｇ
lnはグルタミン、Ｇluはグルタミン酸、Ｇlyはグリシ
ン、Ｈisはヒスチジン、Ｉleはイソロイシン、Ｌeuはロ
イシン、Ｌysはリシン、Ｍetはメチオニン、Ｐheはフェ
ニルアラニン、Ｐroはプロリン、Ｓerはセリン、Ｔhrは
スレオニン、Ｔrpはトリプトファン、Ｔyrはチロシン、
Ｖalはバリンをそれぞれ示す]で示される。ヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターのＤＮＡおよびアミノ酸
配列はペニカ(Pennica)らのNature 301:214(1983)に記
載されている。

【０００７】−１３から−３５のアミノ酸は、t-ＰＡ分
子を宿主細胞から分泌させるシグナル配列を含有する疎
水性アミノ酸である[ベハー(Vehar)らのBIO/TECHNOLOGY
2(12):1051(1984)]。このシグナル配列は分泌過程でt-
ＰＡ分子から開裂され、それにより１２個アミノ酸のプ
ロペプチド伸長部をアミノ末端に有するt-ＰＡ分子が得
られる。t-ＰＡを黒色腫細胞から細胞培養法によって産
生させた場合、その培養培地から単離されるt-ＰＡ分子
は２つの形態で存在している[WallenらのEur.J.Bioche
m.132:681-686(1983)]。１つの形態は、１２個のアミノ
酸のプロペプチド領域のうち９個がt-ＰＡから開裂され
る結果、トリペプチドアミノ末端伸長部、Ｈ₂Ｎ−Ｇly
−Ａla−Ａrgを有しているt-ＰＡ分子である。第２の形
態は、完全にプロセッシングされた成熟t-ＰＡからプロ
ペプチド領域全体が開裂されたものである[Veharら，19
84]。

【０００８】短時間のインキュベートによって培養物か
ら得られる組換え的に調製されたt-ＰＡ変異体を分析す
ると、そのt-ＰＡ分子は部分的なプロセッシング型で分
泌されることが判明した[Burck らのJournal of Biolog
ical Chemistry 265(9):5170(1990)]。しかし、長時間
のインキュベート後の、または培養培地から精製した後
におけるt-ＰＡ分子を分析すると、残りのアミノ末端プ
ロペプチド伸長部がその分子部分から開裂していること
が判明した。従って、t-ＰＡ分子の生産は、部分的なお
よび完全なプロセッシング型の両者を含有している雑種
の最終産物が存在することによって厄介となる。

【０００９】本発明の目的は、細胞からの分泌時に均一
に開裂されるプロペプチド領域を使用することによって
t-ＰＡまたはその誘導体を組換え的に生産する方法を提
供することにある。この方法を使用すれば、組換えＤＮ
Ａ法によって生産されるt-ＰＡ分子の均質な集団を得る
ことができる。

【００１０】本発明の目的に沿って以下に記載の用語を
次のように定義する。 ＡpＲ−アンピシリン耐性表現型またはそれを付与す
る遺伝子。 クローニング−ＤＮＡのセグメントを組換えＤＮＡク
ローニングベクター内に組込む工程。 Ｅ１Ａ−ポリ−ＧＴ要素を活性化してエンハンサー活
性を発現でき、またＢＫウイルスエンハンサーをも活性
化することのできる、アデノウイルスの即時型遺伝子産
物(immediate-early gene product)。 ep−Ｔ抗原遺伝子のＳＶ４０初期プロモーター、Ｔ抗
原結合部位、およびＳＶ４０の複製起点を含有している
ＤＮＡセグメント。 真核生物プロモーター−真核生物細胞内でプロモータ
ーとして機能するあらゆるＤＮＡ配列。

【００１１】ＧＢＭＴ転写制御ユニット−アデノウイ
ルスの主要後期プロモーター(ＭＬＴＦ)の上流調節要素
と近接しているＢＫウイルスのＰ２エンハンサー要素、
アデノウイルス−２型主要後期プロモーター、ならびに
該プロモーターを刺激する位置にあるポリ−ＧＴ要素お
よびアデノウイルス−２型のスプライスされるトリパー
タイト(tripartite)リーダーをコードしているＤＮＡ配
列を含有する修飾された転写制御ユニット。ＧＭＢＴ転
写制御ユニットの最も良好な例は、Ｅ.coliＫ１２ ＡＧ
１／pＧＴＣ(ＮＲＲＬ Ｂ-１８５９３)中に見いだされ
るプラスミドpＧＴＣ中の約９００塩基対のＨindIIIカ
セットである。

【００１２】ＧＴ−エンハンサー系−Ｅ１Ａ遺伝子産
物などの巨大ＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物または
類似の活性ウイルス遺伝子産物によってエンハンサーと
して活性化される、ＭＬＰなどのプロモーターと連結し
ているポリ−ＧＴ要素であって、ポリ−ＧＴ要素単独で
はエンハンサー活性を示さないもの。 ＨmＲ−ハイグロマイシン耐性表現型またはそれを付
与する遺伝子。 ＩＶＳ−イントロンをコードしているＤＮＡであり、
介在配列とも呼ばれる。 巨大ＤＮＡウイルス−真核生物細胞を感染し、〜１０
kb サイズよりも大きなゲノムを有しているウイルスで
あり、例えばポックスウイルス、アデノウイルス、およ
びヘルペスウイルスである。 ＭＬＰ−アデノウイルスの主要後期プロモーターであ
り、本明細書ではアデノウイルス後期プロモーター、ア
デノウイルス２型後期プロモーター、またはＡd２後期
プロモーターとも呼ぶ。

【００１３】ＭＬＴＦ結合部位−主要後期転写因子
(ＭＬＴＦ)が結合するアデノウイルスＤＮＡ内の部位。
ＭＬＴＦはＭＬＰ活性のために必要である。 ＮeoＲ−真核生物宿主細胞においてＧ４１８耐性を付
与するためにも使用することができるネオマイシン耐性
付与遺伝子。 ori−プラスミドの複製起点 pＡ−ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮ
Ａ配列。 ポリ−ＧＴ要素−(ＧＴ)n−(ＣＡ)n のＤＮＡ配列で
あり、本明細書ではｎが２１である配列を例示している
が、ｎが２１よりも大きくまたは小さい種々の長さの配
列をも意味することができ、さらに化学的に合成された
(ＧＴ)n−(ＣＡ)n 配列または(ＧＴ)n−(ＣＡ)n 系を含
有するヒトゲノムのＤＮＡフラグメントをも意味するこ
とができる。

【００１４】プロモーター−ＤＮＡをＲＮＡに転写さ
せるＤＮＡ配列。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１つまたはそれ
以上の付加的なＤＮＡセグメントを加えることができる
か、または既に加えられているＤＮＡ分子を含有する自
律的に複製または組込みを行う物質。 組換えＤＮＡ発現ベクター−有用な産物をコードして
いるＤＮＡ配列を挿入でき、かつ発現することができる
関連挿入部位、およびプロモーターを含有する組換えＤ
ＮＡクローニングベクター。 組換えＤＮＡベクター−組換えＤＮＡクローニングま
たは発現ベクター。 レプリコン−組換えＤＮＡベクターの複製を制御する
ＤＮＡ配列。

【００１５】本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターまたはその誘導体の組換え的生産に組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターの修飾プロペプチド領域を利用
する方法に関する。この修飾プロペプチド領域は、宿主
細胞からの分泌の際にt-ＰＡ分子から均一に開裂され
る。この態様によれば、所望のt-ＰＡ分子の均質な集団
が生産される。

【００１６】本発明はさらに、アミノ末端からカルボキ
シ末端にかけて(a)シグナルペプチド、(b)細胞関連プロ
テアーゼによって均一に開裂することのできる配列を含
有するプロペプチド領域、(c)組織プラスミノーゲンア
クチベーターまたはその誘導体からなるタンパク質をコ
ードしているＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物に関
する。

【００１７】本発明のシグナルペプチド／プロペプチド
領域のアミノ酸配列(配列認識番号：２)は、配列

【化３】 [式中、Ｘは細胞関連プロテアーゼによって均一に開裂
され得るアミノ酸配列である]で示される。

【００１８】本発明の目的は組換え細胞から直接得られ
る組織プラスミノーゲンアクチベーター分子の均質な集
団を生産することなので、本発明の新規なプロペプチド
領域の開裂は、分泌の際に細胞表面か、または細胞内の
いずれかで起こらなければならない。本発明の目的に沿
った細胞関連プロテアーゼには、細胞質または細胞のオ
ルガネラに存在するプロテアーゼばかりでなく、分泌の
際に即座にタンパク質を開裂することのできる細胞膜に
存在するプロテアーゼも包含される。従って、本発明
は、均質な集団の組織プラスミノーゲンアクチベーター
またはその誘導体を生産する目的用の、細胞関連プロテ
アーゼのためのタンパク質分解的開裂部位をコードして
いるＤＮＡ分子を提供するものである。

【００１９】本発明では、新規なプロペプチド領域が組
織プラスミノーゲンアクチベーター誘導体をコードして
いるＤＮＡ配列と機能的に連結されている組換えＤＮＡ
発現ベクターを構築した。以下の実施例に記載している
ように、シグナルペプチド領域および新規なプロペプチ
ド領域をコードしている合成ＤＮＡ配列を種々の発現ベ
クターにクローンした。これらの発現ベクターを使用
し、真核生物宿主細胞を形質転換した。その発現ベクタ
ーにコードされているt-ＰＡ分子を発現でき、そしてそ
れを培養培地中に分泌できる条件下で、その形質転換し
た真核生物宿主細胞を培養した。次に、分泌されたt-Ｐ
Ａ分子を培養培地から単離し、得られた分子のアミノ末
端アミノ酸配列を分析した。

【００２０】シグナルペプチドおよび新規なプロペプチ
ド領域をコードしているＤＮＡ配列を１本鎖デオキシオ
リゴヌクレオチドから当業界周知の方法によって構築し
た。これらデオキシオリゴヌクレオチドはアプライド・
バイオシステムズ[カリホルニア９４４０４、フォスタ
ー・シティー、リンカーン・センター・ドライブ８５０
番]から販売されているβ-シアノエチル ホスホルアミ
ダイトの化学を利用する３８０Ｂ ＤＮＡ 合成装置など
の市販の装置によって構築することができる。ＤＮＡを
合成するための別の方法も当業者に既知であり、イタク
ラ(Itakura)らのScience 198:1056(1977)、クレア(Cre
a)らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75:5765(1978)、シ
ーング(Hsiung)らのNucleic Acids Research 11:3227(1
983)、およびナラング(Narang)らのMethods in Enzymol
ogy 68:90(1980)に記載されている。

【００２１】本発明の目的では、開裂配列とは、細胞関
連プロテアーゼにとっての開裂部位に隣接したアミノ酸
配列である。以下の表１には、本発明の方法および化合
物における細胞関連プロテアーゼのための開裂配列とし
て、好適に使用できる開裂配列を挙げる。

【００２２】

【表１】 細胞開裂プロテアーゼのためのタンパク質分解的開裂配列 起 源 アミノ酸配列 プロテインＣ Ａrg Ｉle Ａrg Ｌys Ａrg (配列認識番号：３) インスリンレセプター Ｓer Ａrg Ｌys Ａrg Ａrg (配列認識番号：４) 第Ｘ因子 Ｇlu Ａrg Ａrg Ｌys Ａrg (配列認識番号：５) プロテインＳ Ｖal Ａrg Ｌys Ａrg Ａrg (配列認識番号：６)

【００２３】他の種々のタンパク質分解的開裂部位が当
業界既知である[Schwartz, FEBS 200(1):1(1986)]。し
かし、組織プラスミノーゲンアクチベーター分子とヘテ
ロローガスなプロペプチド開裂部位を導入することによ
り、真核生物細胞において組換え的に産生されたt-ＰＡ
分子の均質な集団を生産することを可能ならしめたの
は、本発明が最初である。

【００２４】最も好ましい均一に開裂され得る本発明の
細胞関連プロテアーゼ開裂配列は、Ａrg Ｉle Ａrg Ｌy
s Ａrg(配列認識番号：３)を含有するものである。この
タンパク質分解的開裂配列は、シグナルペプチドおよび
プロペプチド領域をコードしているＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ化合物によってコードすることができる。このシグ
ナルペプチド／プロペプチド領域が本発明の発現ベクタ
ーに存在していることにより、成熟t-ＰＡ分子の均質な
集団を発現、分泌させることができる。これら分子のア
ミノ末端アミノ酸は成熟t-ＰＡの最初のアミノ酸(Ｓer)
である。このプロペプチド開裂部位は、ヒトプロテイン
Ｃのプロペプチド領域に存在しているアミノ酸配列に類
似している。ヒトプロテインＣのプロペプチド開裂部位
はＡrgＩle Ａrg Ｌys Ａrg(配列認識番号：３)であ
り、それは分泌の際にプロテインＣのチモーゲン型から
開裂される。

【００２５】上記の表１に示したタンパク質分解的開裂
配列に加えて、以下に記載のタンパク質分解的開裂配列
も本発明に有用である： Ａrg Ｉle Ｘaa Ｘaa Ｘaa (配列認識番号：７)、 Ｓer Ａrg Ｘaa Ｘaa Ｘaa (配列認識番号：８)、 Ｇlu Ａrg Ｘaa Ｘaa Ｘaa (配列認識番号：９)、
および Ｖal Ａrg Ｘaa Ｘaa Ｘaa (配列認識番号：１０) [ここに、Ｘaaで表示された位置にあるアミノ酸はＬys
またはＡrgである]。

【００２６】当業者であれば理解できようが、本発明の
開裂配列におけるアミノ酸残基の数は若干変動すること
ができる。プロペプチド領域の開裂は、ＡrgＩle Ａrg
Ｌys Ａrg(配列認識番号：３)の後で起こる。従って、
この配列と形成期タンパク質のアミノ末端との間に位置
する残基は、その新規なプロペプチド部位での開裂の際
に除去される。それゆえに、本発明の方法および化合物
には、上記の配列(配列認識番号：３)よりも長い開裂配
列を使用することができる。本発明の方法および化合物
はさらに、上記で具体的に挙げた以外のアミノ酸残基を
含有するシグナルペプチド／プロペプチド領域をも包含
する。例えば、上記の新規なプロペプチド領域の機能性
に影響を与えない種々のアミノ酸置換をシグナルペプチ
ド領域内に施すことができる。

【００２７】シグナルペプチド／プロペプチド領域(配
列認識番号：３)は、ＤＮＡ配列(配列認識番号：１
１)：

【化４】 を有するＤＮＡ化合物上にコードされている。ここでは
ＤＮＡ配列の暗号鎖のみを示している。この２本鎖ＤＮ
Ａ化合物の反対側の鎖は、ＤＮＡの相補性から推測する
ことができる。シグナルペプチド／プロペプチド領域の
翻訳は、下線を施したＡＴＧコドンから開始される。こ
の開始コドンの直ぐ上流に先行するＤＮＡ配列を、それ
が開始コドンから最適な転写を開始させる共通配列をコ
ードするように設計した[Kozak,M.のCell 44:283-292(1
986)]。開始コドンに先行する天然に存在しているＤＮ
Ａ配列となるよう、シグナルペプチド／プロペプチド領
域をコードしているＤＮＡ化合物を構築することもでき
る。

【００２８】本発明の方法では、天然t-ＰＡおよび種々
のt-ＰＡ誘導体を使用することができる。遺伝子マッピ
ングの研究により、t-ＰＡをコードしている遺伝子はイ
ントロンによって分離された１２個のエクソンから構成
されていることが判明した[NyらのProc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.81:5355(1984)]。これらのイントロンは、ア
ミノ酸レベルでは部分的にドメイン結合部に相当してい
る。天然t-ＰＡ分子の種々のドメインが欠失された幾つ
かの天然t-ＰＡの誘導体が構築されている[Van Zonneve
ld らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.83:4670(1986)]。t
-ＰＡ誘導体については、ハリス(Harris,T.J.)のProtei
n Engineering 1(6):449(1987)、Van Zonneveld らのFi
brinolysis 2:123(1988)、およびHigginsおよびBennett
のAnnu.Rev.Pharmacol.Toxicol.30:91(1990)にその概要
が記載されている。

【００２９】天然t-ＰＡの１つの誘導体がBurckらのJou
rnal of Biological Chemistry 265(9):5170(1990)に記
載されている。このmt-ＰＡ-６として知られている誘導
体の型は、ヒトt-ＰＡをコードしているcＤＮＡを部位
特異的突然変異することで構築された。アミノ酸４−１
７５をコードしているＤＮＡを欠失させて、発現された
時にt-ＰＡ誘導体がシグナルペプチドおよびプロペプチ
ドならびにクリングル２およびセリンプロテアーゼドメ
インを含有するようにした。この誘導体の型はフィブリ
ン分解的な比活性が天然t-ＰＡよりも高いことが見いだ
された。天然t-ＰＡと同様に、mt-ＰＡ-６は成熟型およ
び部分的にプロセッシングされた型の両者で存在するこ
とが見いだされた。

【００３０】本発明の有効性を示すため、本発明の新規
なプロペプチド領域をmt-ＰＡ-６に連結して組換えＤＮ
Ａ発現ベクターを構築した。従って、本発明のベクター
はシグナルペプチド、修飾プロペプチド領域およびt-Ｐ
Ａまたはその誘導体をコードしているポリペプチドをコ
ードしている。本明細書に例示している本発明t-ＰＡ分
子を発現、分泌させると、新規なプロペプチド領域が均
一に開裂され、分泌された成熟mt-ＰＡ-６の均質な集団
が得られる。本発明はmt-ＰＡ-６に加えて、天然のt-Ｐ
Ａおよびその誘導体にも適用することができる。

【００３１】本発明の新規なプロペプチド領域が連結し
ているmt-ＰＡ-６を高いレベルで発現させるため、プラ
スミドpＳＢＬ-Ｂt６-dを構築した。このプラスミドに
よる発現は、アデノウイルス２型後期主要プロモーター
に近接しているＢＫウイルスのＰ２エンハンサーと連結
したＳＶ４０エンハンサーを含有するＳＢＬユニットに
由来する。ＳＢＬユニットは、適切に配置された有用物
質を高レベルで発現させる。このプラスミドpＳＢＬ-Ｂ
t６-dは、本発明のプロペプチド領域に機能的に連結さ
れたmt-ＰＡ-６を発現できるよう適切に配置されたＳＢ
Ｌユニットを有している。

【００３２】本発明をさらに説明するため、プラスミド
pＧＴ-t６Ｂ-dを構築した。このプラスミドによれば、
本発明のプロペプチド領域に連結したmt-ＰＡ-６を高レ
ベルで発現することができる。このプラスミドによる発
現は、アデノウイルスの主要後期プロモーター(ＭＬＴ
Ｆ)の上流調節要素に近接しているＢＫウイルスのＰ２
エンハンサー、アデノウイルス−２型主要後期プロモー
ター、該プロモーターを刺激する位置にあるポリ−ＧＴ
要素、およびアデノウイルス−２型のトリパータイトリ
ーダー配列をコードしているＤＮＡ配列を含有するＧＢ
ＭＴユニットに由来する。ＧＢＭＴユニットは適切に配
置された場合、有用な物質を高レベルで発現させる。プ
ラスミドpＧＴ-t６Ｂ-dは、本発明のプロペプチド領域
に機能的に連結されたmt-ＰＡ-６を発現するよう適切に
配置されているＧＢＭＴユニットを含有している。

【００３３】上記ベクターに見いだされるＢＫエンハン
サーはＥ１Ａの存在下に最も効率的に発現を増大させる
よう機能するので、アデノウイルスＥ１Ａ即時型遺伝子
産物を発現する宿主細胞に該ベクターを導入するのが好
ましい。当業者ならば、巨大ＤＮＡウイルスの即時型遺
伝子産物は多くの宿主細胞から発現でき、または発現す
るよう当該細胞を操作できることは理解されよう。好ま
しいセルラインは、ゴールデンハムスターセルラインＡ
Ｖ１２−６６４(受託番号ＣＲＬ ９５９５の下でアメリ
カン・タイプ・チッシュ・コレクション(ＡＴＴＣ)[Ｍ
Ｄ２０８５２，ロックビル]から入手可能)、またはヒト
腎２９３セルライン(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３)であ
る。ＡＶ１２−６６４セルラインが最も好ましい。

【００３４】本発明のベクターは種々の真核生物宿主細
胞を形質転換でき、また発現され得る。安定な真核生物
形質転換体を同定し、単離するために使用される選択マ
ーカーを持たない本発明ベクターは、一時的検定のみな
らず、同時形質転換にも有用である(操作は、１９８３
年８月２６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号に
記載されている)。さらに、大腸菌(エシェリヒア・コ
リ、Ｅ.coli）においてプラスミドＤＮＡを調製するほ
うが他の宿主生物におけるよりもより効率的であるのが
通常なので、本発明のベクターは、Ｅ.coli において複
製させ得る配列を含有することもできる。

【００３５】本発明のベクターに見いだされる新規なプ
ロペプチド含有t-ＰＡのコード化配列は、その構造遺伝
子に関連する特定のプロモーターが機能する宿主細胞に
おいて発現される。本発明に使用するのに適した宿主細
胞には例えば、ＢＨＫ−２１細胞(ＡＴＴＣ ＣＲＬ １
０)、ＣＨＯ−Ｋ１細胞(ＡＴＴＣ ＣＲＬ ６１)、およ
びＣ１２７細胞(ＡＴＴＣ ＣＲＬ １６１６)がある。

【００３６】多くの哺乳動物宿主細胞は、本発明の形成
期タンパク質のシグナルペプチドを認識し、かつ適切に
プロセッシングするために必須である細胞機構を有して
おり、またグリコシル化などの翻訳後修飾を行うことが
できる。以下に説明する広範囲のベクターがこのような
真核生物宿主細胞の形質転換するために存在しており、
以下に特定のベクターを例示しているが、これらは本発
明の範囲の限定を意図するものではない。

【００３７】pＳＶ２型ベクターは、規定された真核生
物の転写ユニット−プロモーター(ep)、介在配列(ＩＶ
Ｓ)、およびポリアデニル化(pＡ)部位から構成されるＳ
Ｖ４０ゲノムのセグメントを含有している。プラスミド
pＳＶ２型ベクターはＳＶ４０Ｔ抗原の不存在下では、
哺乳動物および他の真核生物宿主細胞をそれら宿主細胞
の染色体ＤＮＡへの組込みによって形質転換する。種々
のプラスミドpＳＶ２型ベクターが構築されている[Gluz
man編，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー，コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨーク，1
982によって発行されたEukaryotic Viral Vectorsを参
照]。例えば、ＳＶ４０プロモーターが、挿入された遺
伝子を転写させるプラスミドpＳＶ２−gpt、pＳＶ２−n
eo、pＳＶ２−dhfr、pＳＶ２−hyg、およびpＳＶ２−β
−グロビンである。これらのベクターは、本発明のコー
ド化配列と共に使用するのに適しており、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)[メリー
ランド，ロックビル]またはノーザン・リージォナル・
リサーチ・ラボラトリー(ＮＲＲＬ)[イリノイ，ペオリ
ア]から入手することができる。

【００３８】プラスミドpＳＶ２−dhfr(ＡＴＣＣ ３７
１４６)はＳＶ４０初期プロモーター(ep)の制御下にあ
るネズミジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含有して
いる。適当な条件下では、dhfr遺伝子は宿主染色体にお
いて増幅し、または複製することが知られている。Schi
mkeのCell 37:705-713(1984)の概説に記載されているこ
の増幅は、dhfr遺伝子に近接した、例えば本発明のt-Ｐ
Ａ化合物などのＤＮＡ配列に適用することができ、従っ
てそれを使用すれば、本発明のt-ＰＡ分子の生産を拡大
することができる。

【００３９】哺乳動物および他の真核生物宿主細胞にお
いて本発明のt-ＰＡ化合物を発現させるために構築した
プラスミドは、広範な種々のプロモーターを利用するこ
とができる。本明細書では特定の真核生物プロモーター
の使用を例示するが、これらは決して本発明を限定する
ものではない。ＳＶ４０後期プロモーターまたはBucher
らのNuc.Acids Res.14(24):1009(1986)に記載されてい
る真核生物プロモーター、または例えばエストロゲン誘
発性のニワトリオバルブミン遺伝子、インターフェロン
遺伝子、糖質コルチコイド誘発性チロシンアミノトラン
スフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子ならびに
主要初期および後期アデノウイルス遺伝子などの真核生
物遺伝子由来のプロモーター、などのプロモーターは、
容易に単離することができ、またヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターを真核生物宿主細胞で産生するよう
設計した組換えＤＮＡ発現ベクターに使用できるよう修
飾することができる。真核生物プロモーターは、本発明
のコード化配列を発現させるために直列して使用するこ
ともできる。さらには、多数のレトロウイルスが広範囲
の真核生物宿主細胞を感染することが知られている。レ
トロウイルスＤＮＡの長い末端反復配列はプロモーター
活性をコードしていることが多いので、それも本発明の
コード化配列を発現させるために使用することができ
る。

【００４０】プラスミドpＲＳＶcat(ＡＴＣＣ ３７１５
２)は、ニワトリおよび他の宿主細胞を感染することが
知られているウイルスであるラウス肉腫ウイルス(ＲＳ
Ｖ)の長い末端反復配列を含有している。ＲＳＶの長い
末端反復配列は、プラスミドpＲＳＶcatの〜０．７６kb
ＮdeＩ−ＨindIII制限フラグメント上に単離すること
ができる。このＲＳＶの長い末端反復配列内のプロモー
ター(GormanらのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.79:6777(1
982))は、本発明のベクターに使用するのに適してい
る。プラスミドpＭＳＶi(ＮＲＲＬ Ｂ-１５９２９)は、
マウスおよび他の宿主細胞を感染することで知られてい
るネズミ肉腫ウイルス(ＭＳＶ)の長い末端反復配列を含
有している。これらの反復配列は、本発明のベクターに
おいてプロモーターとして使用するのに適している。マ
ウスのメタロチオネイン(ＭＭＴ)プロモーターも真核生
物宿主細胞で使用するための特性化が充分に行われてお
り、それも本発明のベクターに使用するのに適してい
る。ＭＭＴプロモーターは１５kbプラスミドpdＢＰＶ-
ＭＭＴneo(ＡＴＣＣ ３７２２４)に存在しており、これ
は本発明の他のプラスミドを構築するための出発物質と
して使用可能である。

【００４１】本発明のＤＮＡ配列およびプラスミドには
他に多く修飾型および変異型が存在し得る。例えば、遺
伝子コードの同義性により、コードされているポリペプ
チドコード化配列を改変することなく、ポリペプチドコ
ード化領域全体にわたって、および翻訳終止シグナルに
ヌクレオチドの置換を行うことができる。このような置
換可能な配列は、ヒトt-ＰＡの既知のアミノ酸またはＤ
ＮＡ配列から推定することができ、以下に記載の通常の
合成法または部位特異的突然変異法によって構築するこ
とができる。合成法は、イタクラ(Itakura)らのScience
198:1056(1977)およびクレア(Crea)らのProc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A.75:5765(1978)の操作法に実質的に従って
実施することができる。従って、本発明は具体的に例示
したＤＮＡ配列およびプラスミドに限定されるものでは
ない。

【００４２】本発明のベクターで真核生物宿主細胞を形
質転換した後では、選択表現型に基づいて形質転換体を
選択することができる。この表現型は、発現ベクターま
たはこの発現ベクターと共に宿主細胞に同時形質転換す
る他のベクターのいずれかによって付与することができ
る。形質転換体を選択したなら、発現ベクターにコード
されている所望のタンパク質を最も高レベルで発現して
いる形質転換体を同定する。選択マーカーを含有するプ
ラスミドだけでなく発現ベクターをも受け入れる多くの
形質転換体が生成される同定形質転換法を行った後では
特に、このような同定は重要である。

【００４３】遺伝子またはプラスミドをdhfr欠損セルラ
インに導入するために選択マーカーとしてジヒドロ葉酸
還元酵素(dhfr)遺伝子を使用し、その後にプラスミドの
コピー数を増幅させるためにメトトレキセートを使用す
ることは、文献中で充分に確立されている。dhfr産生細
胞において選択および増幅マーカーとしてdhfrを使用す
るための研究は充分ではないが、霊長類細胞において効
率的に同時増幅するには、メトトレキセートを使用する
同時増幅の前に直接的な選択マーカーを使用して最初に
選択する必要がある。本発明の利用性は、使用する選択
マーカーによって限定されない。さらに、メタロチオネ
イン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、またはＰ
−糖タンパク質に例示される多重遺伝子耐性族の遺伝子
などの増幅マーカーを利用することができる。

【００４４】以下に実施例を挙げて本発明の理解の一助
とする。使用している具体的な材料、菌株、および条件
は本発明を説明するためのものであり、本発明の妥当な
範囲を限定するものではない。本実施例で引用している
すべての酵素は特に明記しない限り、ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリー(ＢＲＬ)、ゲインサースブルグ、ＭＤ
２０８７７、ニュー・イングランド・バイオラブス Ｉ
nc(ＮＥＢ)、バーバリー、ＭＡ ０１９１５、またはベ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、カストル
ウエイ・ドライブ７９４１番、インディアナポリス、Ｉ
Ｎ ４６２５０から入手することができ、それらは製造
元の教示に実質的に従って使用している。

【００４５】実施例１ pＬＰ５３−ＴＬＢの構築 Ａ．ＢamＨＩ−ＢglII消化pＬＰ５３の調製 プラスミドpＬＰ５３は実施例１Ｆの方法に従って、Ｅ.
coli (大腸菌)Ｋ１２ＡＧ１／pＬＰ５３から常法により
単離することができる。Ｅ.coli Ｋ１２ ＡＧ１／pＬＰ
５３は１９９０年９月２１日に寄託され、受託番号ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１８７１４の下、ノーザン・リージォナル・
リサーチ・センター(ＮＲＲＬ)[イリノイ、ペオリア、
米国農務省、農業研究局]のパーマネント・ストック・
カルチャー・コレクションを構成している。pＬＰ５３
の制限部位および機能地図を添付の図１に示す。

【００４６】５０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０[トリス
とはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンである]、
１０mＭ ＭgＣl₂および５０mＭ ＮaＣl を含有する反応
液５０μl 中、pＬＰ５３ ＤＮＡ(５μl、５μg)をＢam
ＨＩ(２μl、２０単位)およびＢglII(２μl、２０単位)
で完全に消化する。その反応物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。試料を同量のフェノールおよびクロロホ
ルム(５０：５０)混液で２回抽出し、水層を回収した。
その水層に０．１容量の３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび
２．５容量の無水エタノールを加えてＤＮＡを回収し
た。消化したＤＮＡを遠心によって集め、上清を除去
し、ＤＮＡを乾燥して、水中に再懸濁した。

【００４７】Ｂ．ＴＬＢリンカーの調製 以下に示す１本鎖ＤＮＡセグメントを当業界周知の方法
によって、β-シアノエチル・ホスホロアミダイトの化
学を利用する自動ＤＮＡ合成装置[３８０Ｂ型、アプラ
イド・バイオシステムズ、ＣＡ ９４４０４、フォスタ
ー・シティー、リンカーン・センター・ドライブ８５０
番]により常法どおり合成する：

【化５】

【００４８】ＢＧＴ３およびＢＧＴ４は相補的なＤＮＡ
分子である。これら合成ＤＮＡセグメントをＴＥ緩衝液
[ＴＥは１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４および１mＭ
エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)である]５０μl に
溶解し、０℃で保存した。これらのＤＮＡ鎖を以下のよ
うにしてアニーリングした。ＢＧＴ３およびＢＧＴ４そ
れぞれ５０pmol を混合し、１５分間９５℃に加熱し
た。その混合物をゆっくりと室温に戻し、２つの相補的
な鎖がアニーリングし、ＴＬＢとして知られている２本
鎖ＤＮＡリンカー[配列認識番号：１１]を形成するよう
にした。

【００４９】Ｃ．pＬＰ５３−ＴＬＢの最終的な構築 実施例１Ａによって調製したＤＮＡをＴＬＢ(配列認識
番号：７)と連結した。実施例１ＡのＤＮＡ(１μl)およ
びＴＬＢ(１μl)を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(１０単
位)、６６mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．６、６．６mＭ Ｍg
Ｃl₂、１０mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)および６６m
Ｍ アデノシン５'−三リン酸(ＡＴＰ)を総容量１０μl
で含有する反応液中で連結させる。その混合物を４℃で
１６時間インキュベートした。得られた連結混合物を使
用し、以下に記載するようにしてＥ.coli Ｋ１２ ＡＧ
１を形質転換した。

【００５０】Ｄ．形質転換操作 凍結したコンピーテントなＥ.coli Ｋ１２ ＡＧ１細胞
をストラタジーン[Stratagene，カリホルニア９２１２
１、サンジェゴ、タンセイ・ロード３７７０番]から入
手した。上記の連結反応物約５μlをコンピーテントな
細胞１００μl と混合物した後、細胞−ＤＮＡ混合物を
氷上で１時間インキュベートし、４２℃で４５秒間熱シ
ョックを与え、次いで氷上で約２分間冷凍した。この細
胞−ＤＮＡ混合物をファルコン２０５９チューブ[Curti
n Matheson, シカゴ，ＩＬ]中のＳＯＣ培地[２％トリプ
トン、０．０５％酵母エキス、１０mＭ ＮaＣl、２．５
mＭＫＣl、１０mＭ ＭgＣl₂、１０mＭ ＭgＳＯ₄、２０m
Ｍ グルコースおよび蒸留水]１ml 中に希釈し、３７℃
で１時間インキュベートした。その試料約１００μl を
１００μｇ/ml アンピシリンを含有するＬＢ−寒天平板
[１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮaＣl お
よび１．５％寒天、pＨ７．０]にプレートし、コロニー
が現れるまで３７℃でインキュベートした。

【００５１】あるいは、細胞を形質転換に対してコンピ
ーテントにするには以下のようにすることもできる。
Ｅ.coli Ｋ１２ ＡＧ１細胞培養物５０ml をＬ−ブロス
[水１リットル当たりトリプトン１０ｇ、ＮaＣl １０ｇ
および酵母エキス５ｇとし、pＨ７．５に調節する]中
で、Ｏ.Ｄ.₅₉₀が０．５吸光単位となるまで増殖させ
る。この培養物を氷上で１０分間冷凍し、次いで遠心に
より細胞を採取する。得られた細胞ペレットを５０mＭ
ＣaＣl₂：１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０の冷混液２
５ml 中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートす
る。遠心によって細胞を採取し、得られた細胞ペレット
を５０mＭ ＣaＣl₂：１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０
の冷混液２．５ml 中に再懸濁し、試料を４℃に１６時
間保持させればよい。得られたコンピーテント細胞を上
記のようにして形質転換する。

【００５２】Ｅ．ＤＮＡの単離 形質転換した後、アンピシリン耐性細胞を取り上げ、そ
れを１００μｇ/mlアンピシリンを含有するＴＹブロス
(１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮaＣl、p
Ｈ７．４)２ml に接種した。得られた培養物を通気下、
３７℃で１６時間増殖させた。その培養物から次のよう
にしてプラスミドＤＮＡを単離した。以下の操作は特に
明記しない限りすべて環境温度で行った。各培養物１．
５mlを微小遠心管に移した。１分間の遠心によって細胞
を集めた。微細な先端を有するアスピレーターによって
上清を除去し、得られた細胞ペレットを、５０mＭ グル
コース、１０mＭ ＥＤＴＡおよび２５mＭ トリス-ＨＣl
pＨ８．０を含有する溶液１００μl に懸濁した。室温
で５分間インキュベートした後、アルカリ性ドデシル硫
酸ナトリウム(ＳＤＳ)溶液(０．２ＮＮaＯＨ、１％ＳＤ
Ｓ)２００μlを加えた。そのチューブを穏やかに反転さ
せて内容物を混合し、氷上で５分間維持させた。次い
で、酢酸カリウム溶液(氷酢酸１１．５ml および水２
８．５mlを５Ｍ 酢酸カリウム６０ml に加えて調製。こ
れはカリウムについて３Ｍ、酢酸について５Ｍ の溶液
となっている)１５０μl を加え、穏やかに旋回させて
チューブの内容物を混合した。得られた試料を氷上で５
分間維持させた後、１０分間遠心した。その上清を別の
遠心管に移し、フェノール(０．１Ｍ トリス(pＨ８．
０)で飽和させたもの)およびクロロホルムの混液を等量
加えた。それを混合し、次いで５分間遠心した。上清を
集めた。氷冷した無水エタノール１ml をその上清に加
えた。それを混合し、室温に５分間放置した後、５分間
の遠心によってＤＮＡを集める。吸引により上清を除去
し、７０％エタノール５００μl を得られたＤＮＡペレ
ットに加えた。それを穏やかに旋回させ、ペレットを洗
浄して２分間遠心した。上清を除去し、減圧下にＤＮＡ
ペレットを乾燥する。得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液５０
μl に溶解して、４℃で保存する。pＬＰ５３−ＴＬＢ
の制限部位および機能地図を添付の図２に示す。

【００５３】Ｆ．プラスミドＤＮＡの大規模な単離 プラスミドＤＮＡの大規模な単離は以下の操作によって
行うことができる。Ｅ.coli Ｋ１２ ＡＧ１／pＬＰ５３
−ＴＬＢの一晩培養物を少量、１００μｇ/ml アンピシ
リンを含有するＬ−寒天上に広げ、単一のコロニー単離
物が得られるようにする。得られた単一コロニーを１０
０μｇ/ml アンピシリンを含有するＬ−ブロス１０ml
中に接種し、激しく振盪させながら３７℃で一晩インキ
ュベートした。一晩培養物１０ml を、１００μｇ/ml
アンピシリンを含有するＬ−ブロス５００ml に接種
し、培養が定常期に達するまで激しく振盪させながら３
７℃でインキュベートした。

【００５４】次に記載の操作は、マニアチス(Maniatis)
らのMolecular Cloning (コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー),1982を改変したものである。４０
００×Ｇの１０分間の遠心(４℃)によって細胞を採取
し、上清を廃棄した。得られた細胞ペレットを氷冷ＳＴ
Ｅ緩衝液(０．１Ｍ ＮaＣl、１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ
７．８、および１mＭ ＥＤＴＡ)１００ml で洗浄した。
洗浄した後、細胞ペレットを、５μｇ/ml リゾチームを
含有する溶液１(５０mＭ グルコース、２５mＭ トリス-
ＨＣl pＨ８．０、１０mＭ ＥＤＴＡ)１０ml 中に再懸
濁し、室温に１０分間放置した。次いで、溶液２(０．
２Ｎ ＮaＯＨおよび１％ＳＤＳ)２０mlをリゾチーム処
理細胞に加え、得られた溶液を反転させて穏やかに混合
した。その混合物を氷上で１０分間インキュベートし
た。

【００５５】氷冷した５Ｍ 酢酸カリウム(pＨ４．８)１
５ml を細胞溶解した細胞混合物に加え、反転させて混
合した。得られた溶液を氷上で１０分間インキュベート
した。水２８．５ml および５Ｍ 酢酸カリウム６０ml
に氷酢酸１１．５ml を加え、５Ｍ 酢酸カリウム溶液を
調製した。得られた溶液はカリウムについて３Ｍ、酢酸
について５Ｍ の溶液となっている。

【００５６】細胞溶解した細胞混合物をベックマンＳＷ
２７(または同等の装置)で遠心する(２０，０００rpm、
２０分、４℃)。細胞ＤＮＡおよび細胞残骸がチューブ
の底にペレットとして残る。上清約３６ml を回収し、
０．６容量のイソプロパノールを加え、混合し、得られ
た溶液を室温に１５分間放置する。１２，０００Ｇ、３
０分の遠心(室温)によってプラスミドＤＮＡを採取す
る。上清は廃棄し、室温において７０％エタノールでＤ
ＮＡペレットを洗浄する。エタノール洗液をデカント
し、真空乾燥器で乾燥する。次いで、ペレットをＴＥ緩
衝液８ml に再懸濁する。

【００５７】塩化セシウム(ＣsＣl)８ｇをＤＮＡ溶液に
加える。１０μｇ/ml 臭化エチジウム水溶液約０．８ml
を各ＣsＣl−ＤＮＡ溶液１０ml に加える。この溶液の
最終密度は約１．５５ｇ／ml であり、臭化エチジウム
濃度は約６００μｇ/ml である。その溶液をベックマン
５０型遠心管に移し、パラフィン油で上部まで満たし、
封管し、４５，０００rpmで２４時間遠心した(２０
℃)。遠心した後、普通光で２つのＤＮＡバンドが認め
られた。栓をチューブからはずし、２１番皮下注射針を
遠心管の側面から挿入し、下方のＤＮＡバンドを取り出
した。水飽和１−ブタノールで数回抽出し、臭化エチジ
ウムを除去する。ＴＥ緩衝液に対して透析し、ＣsＣlを
除去する。緩衝化フェノール、次いでクロロホルムで抽
出した後、ＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄
し、乾燥する。

【００５８】実施例２ pmt６-hdの構築 Ａ．中間プラスミドpＴＰＡ１０３の構築 プラスミドpＴＰＡ１０２は、ヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターのコード化配列を含有している。プラ
スミドpＴＰＡ１０２は、ノーザン・リージォナル・リ
サーチ・ラボラトリーから受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１５８
３４の下で入手される菌株であるＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ
２９４／pＴＰＡ１０２から単離することができる。プ
ラスミドpＴＰＡ１０２の制限部位および機能地図を添
付の図３に示す。実施例１Ｆに記載の操作法に実質的に
従って、Ｅ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ１０２か
らプラスミドpＴＰＡ１０２を単離する。

【００５９】プラスミドpＴＰＡ１０２(ＴＥ緩衝液約５
０μl 中)５０μgを１０×ＴthlllI緩衝液(０．５Ｍ Ｎ
aＣl、８０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４、８０mＭ Ｍg
Ｃl₂、８０mＭ ２−メルカプトエタノールおよび１mｇ/
ml ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン))１０μl および水８０
μl に加えた。制限酵素ＴthlllI(１０μl、〜５０単
位)をＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を６５℃で
２時間インキュベートした。このインキュベート時間の
経過後、ローディング緩衝液(laoding buffer)をそれに
加えた(ローディング緩衝液の終濃度は２．５％v/vグリ
セリン、０．００５％w/vブロムフェノールブルー、お
よび０．０５％v/vキシレンシアノールである)。その試
料をアガロースゲルのゲル電気泳動によって分画化し
た。電気泳動した後、得られたゲルを臭化エチジウムの
希薄溶液で染色した。消化されたＤＮＡを３００nm Ｕ
Ｖ光で視覚化し、t-ＰＡコード化配列を含有する〜４．
４kb Ｔthlll制限フラグメントをそのゲルから単離し
た。調製用ゲル電気泳動の方法は当業者に既知である。
その多くの方法は、マニアチスらのMolecular Cloning:
ALaboratory Manual,コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク(2版，1989)に記載されており、それ
は上記の操作を行うための指針として有用である。所望
の〜４．４kb Ｔthlll制限フラグメント約１０μgを入
手し、それをＴＥ緩衝液１０μl 中に懸濁した。

【００６０】１０×クレノー緩衝液(５００mＭ リン酸
カリウム(pＨ７．５)、３０mＭ ＭgＣl₂および１０mＭ
２−メルカプトエタノール)約５μl および水３０μl
を、上記の〜４．４kb Ｔthlll制限フラグメントを含有
する溶液に加え、クレノー酵素約５μl (〜５単位)をさ
らに添加した後、得られた反応混合物を１６℃で３０分
間インキュベートした。クレノー反応した後、エタノー
ルによりＤＮＡを沈殿させ、１０×リガーゼ緩衝液(６
６０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．６、６６mＭＭgＣl₂、１
００mＭ ＤＴＴ、および１０mＭ ＡＴＰ)３μl および
水１４μl 中に再懸濁した。

【００６１】以下の配列：

【化６】 で示されるＢamＨＩリンカー(Ｎ.Ｅ.Ｂ.から入手可能)
を以下に記載のようにしてキナーゼ処理し、連結用に調
製した。ＢamＨＩリンカー(〜２μg)４μl を水２０．
１５μl、および１０×キナーゼ緩衝液(５００mＭ トリ
ス-ＨＣlpＨ７．６および１００mＭ ＭgＣl₂)５μl に
溶解し、９０℃で２分間インキュベートし、次いで室温
にまで冷す。この混合物に、γ-³²Ｐ−ＡＴＰ(〜２０μ
Ｃi)、１ＭＤＴＴ２．５μl およびポリヌクレオチドキ
ナーゼ(〜１０単位)５μl を加え、次いで３７℃で３０
分間インキュベートした。次いで、０．０１Ｍ ＡＴＰ
(３．３５μl)およびキナーゼ５μl を加え、３７℃で
反応をさらに３０分間続行した。放射活性ＡＴＰは、リ
ンカーが標的ＤＮＡと連結したか否かを確かめるのに役
立つ。

【００６２】キナーゼ処理したＢamＨＩリンカー約１０
μl を〜４．４kb ＴthlllI制限フラグメントの溶液に
加え、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼ(〜１０００単位)２
μlおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼ(〜２単位)１μl を加え
た後、得られた連結反応物を４℃で一晩インキュベート
した。連結されたＤＮＡをエタノールによって沈殿さ
せ、それを１０×ＨindIII緩衝液(５００mＭ トリス-Ｈ
Ｃl pＨ８．０、１００mＭ ＭgＣl₂および５００mＭ Ｎ
aＣl)５μl および水４０μl 中に再懸濁した。そのＤ
ＮＡ溶液に制限酵素ＨindIII約５μl (〜５０単位)を加
え、得られた反応物を３７℃で２時間インキュベートし
た。

【００６３】実施例１Ａに記載のようにしてＨindIII消
化ＤＮＡを抽出し、エタノールで沈殿させ、採取し、そ
れを１０×ＢamＨＩ緩衝液(５００mＭ トリス-ＨＣl p
Ｈ８．０、１００ＭgＣl₂、１Ｍ ＮaＣl)１０μl およ
び水９０μl に再懸濁した。制限酵素ＢamＨＩ約１０μ
l (〜１００単位)をそのＤＮＡ溶液に加え、得られた反
応物を３７℃で２時間インキュベートした。ＢamＨＩ消
化した後、その反応混合物をアガロースゲルに供し、上
記のようにして〜２．０kb ＢamＨＩ−ＨindIII制限フ
ラグメントを単離した。所望のフラグメント約４μgを
得、それをＴＥ緩衝液約５μl 中に懸濁した。

【００６４】プラスミドpＴＰＡ１０３を構築するた
め、プラスミドpＴＰＡ１０２から誘導した〜２．０kb
ＢamＨＩ−ＨindIII制限フラグメントを、ＢamＨＩ−Ｈ
indIII消化プラスミドpＲＣに挿入した。プラスミドpＲ
Ｃは、Ｅ.coli trpオペロンのプロモーターおよびオペ
レーター(trpＰＯ)配列を含有する〜２８８bp ＥcoＲＩ
−ＣlaＩ制限フラグメントを、ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プ
ラスミドpＫＣ７に挿入することによって構築した。プ
ラスミドpＫＣ７は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから受託番号ＡＴＣＣ ３７０８４の
下、Ｅ.coli Ｋ１２Ｎ１００／pＫＣ７中から入手する
ことができる。このtrpＰＯを含有する〜２８８bp Ｅco
ＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントは、プラスミドpＴＰＡ
１０２から単離することができる。プラスミドpＫＣ７
およびプラスミドpＴＰＡ１０２ ＤＮＡは実施例１Ｆの
操作に実質的に従って、それらのセルラインから入手す
ることができる。このプラスミドpＴＰＡ１０２の〜
０．２９kb ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントは、Ｅ.
coli trp遺伝子のほとんどの翻訳活性化配列および転写
活性化配列を含有しており、配列式(配列認識番号：１
４)：

【化７】 で示される配列を有している。ＤＮＡの相補性により、
この２本鎖ＤＮＡ化合物の反対の鎖は推定することがで
きる。

【００６５】従って、プラスミドpＲＣを構築するた
め、ＴＥ緩衝液１０μl 中、プラスミドpＫＣ７約２μg
を１０×ＣlaＩ緩衝液(０．５Ｍ ＮaＣl、６０mＭ トリ
ス-ＨＣl pＨ７．９、６０mＭ ＭgＣl₂、および１mｇ/m
l ＢＳＡ)２μl および水６μl に加えた。制限酵素Ｃl
aＩ約２μl (〜１０単位)をそのプラスミドpＫＣ７ Ｄ
ＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。ＣlaＩ消化プラスミドpＫＣ７ ＤＮ
Ａをエタノール沈殿によって精製し、採取した。得られ
たＤＮＡを１０×ＥcoＲＩ緩衝液(５００mＭ トリス-Ｈ
Ｃl pＨ８．０、１００mＭ ＭgＣl₂および１Ｍ ＮaＣl)
２μl および水１６μl 中に再懸濁した。制限酵素Ｅco
ＲＩ約２μl (〜１０単位)をＣlaＩ消化プラスミドpＫ
Ｃ７ ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３７℃で
２時間インキュベートした。ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プラ
スミドpＫＣ７ ＤＮＡを抽出し、エタノールで沈殿さ
せ、１０×リガーゼ緩衝液３μl および水２０μl 中に
再懸濁した。プラスミドpＫＣ７の制限部位および機能
地図は、マニアチスらのMolecular Cloning (コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８２)の
８頁に見いだすことができる。

【００６６】ＴＥ緩衝液約２０μl 中、プラスミドpＴ
ＰＡ１０２(約２０μg)を１０×ＣlaＩ緩衝液１０μl
および水６０μl に加えた。制限酵素ＣlaＩ約１０μl
(〜５０単位)をプラスミドpＴＰＡ１０２ ＤＮＡの溶液
に加え、得られた反応物を３７℃で２時間インキュベー
トした。ＣlaＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０２ ＤＮ
Ａをエタノールで沈殿させ、１０×ＥcoＲＩ緩衝液１０
μl および水８０μl中に再懸濁した。制限酵素ＥcoＲ
Ｉ約１０μl (〜５０単位)をＣlaＩ消化プラスミドpＴ
ＰＡ１０２ ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３
７℃で２時間インキュベートした。

【００６７】ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プラスミドpＴＰＡ
１０２ ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、７％ポリア
クリルアミドゲルに供し、trpＰＯを含有する〜２８８b
p ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントが他の消化産物と
分離するまで電気泳動した。得られた〜２８８bp Ｅco
ＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントをそのゲルから単離し
(調製用アクリルアミドゲル電気泳動の方法は、マニア
チスらの１９８９に記載されている)、所望のフラグメ
ント約１μgを得、それをＴＥ緩衝液５μl に懸濁し
て、上記のようにして調製したＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プ
ラスミドpＫＣ７ ＤＮＡの溶液に加えた。次いで、得ら
れたＤＮＡ混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ約２μｌ
（〜１０００単位）を加え、その連結反応物を１６℃で
２時間インキュベートした。連結されたＤＮＡは所望の
プラスミドpＲＣ ＤＮＡを構成していた。

【００６８】実施例１Ｄの操作に実質的に従って、得ら
れた連結ＤＮＡをＥ.coli Ｋ１２ＨＢ１０１のコンピー
テント細胞(ＢＲＬから入手)に形質転換した。形質転換
細胞を１００μｇ/ml アンピシリンを含有するＬ寒天に
プレートし、アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤ
ＮＡを制限酵素分析することによって当該耐性コロニー
をスクリーニングし、所望のＥ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０
１／pＲＣのコロニーを同定した。実施例１Ｆの操作法
に実質的に従って、そのＥ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１／p
ＲＣ形質転換体からプラスミドpＲＣ ＤＮＡを入手し
た。

【００６９】ＴＥ緩衝液約２μl 中、プラスミドpＲＣ
ＤＮＡ(約２μg)を１０×ＨindIII緩衝液２μl および
水１６μl に加えた。制限酵素ＨindIII約２μl (〜１
０単位)をプラスミドpＲＣ ＤＮＡの溶液に加え、得ら
れた反応物を３７℃で２時間インキュベートした。Ｈin
dIII消化したプラスミドpＲＣ ＤＮＡをエタノールで沈
殿させ、１０×ＢamＨＩ緩衝液２μl および水１６μl
中に再懸濁した。制限酵素ＢamＨＩ約２μl (〜１０単
位)をＨindIII消化プラスミドpＲＣ ＤＮＡの溶液に加
え、得られた反応物を３７℃で２時間インキュベートし
た。

【００７０】ＢamＨＩ−ＨindIII消化プラスミドpＲＣ
ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、次いでクロロホルム
で２回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、１０
×リガーゼ緩衝液３μl および水２０μl 中に再懸濁し
た。次いで、プラスミドpＴＰＡ１０２の〜２．０kb Ｈ
indIII−ＢamＨＩ制限フラグメント(〜４μg、ＴＥ緩衝
液〜５μl 中)をＢamＨＩ−ＨindIII消化プラスミドpＲ
Ｃ ＤＮＡの溶液に加えた。得られたＤＮＡ混合物にＴ
４ ＤＮＡリガーゼ約２μl (〜１０００単位)を加え、
その反応物を１６℃で２時間インキュベートした。連結
されたＤＮＡは所望のプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡ
を構成していた。

【００７１】望ましくない形質転換体を少なくするた
め、プラスミドpＲＣは切断するが、プラスミドpＴＰＡ
１０３は切断しない制限酵素ＮcoＩによって上記連結Ｄ
ＮＡを消化した。即ち、Ｅ.coli(大腸菌)が形質転換さ
れる頻度は閉じた環状ＤＮＡによる頻度よりも線状ＤＮ
Ａのそれのほうが低いので、連結ＤＮＡをＮcoＩで消化
することによって望ましくない形質転換体が減少する。
連結ＤＮＡを消化するには、まずそのＤＮＡをエタノー
ルで沈殿させ、次いで１０×ＮcoＩ緩衝液(１．５Ｍ Ｎ
aＣl、６０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．８、６０mＭ Ｍg
Ｃl₂、および１mｇ/ml ＢＳＡ)２μl および水１６μl
に再懸濁する。そして、そのＤＮＡ溶液に制限酵素Ｎco
Ｉ約２μl (〜１０単位)を加え、得られた反応物を３７
℃で２時間インキュベートする。

【００７２】連結し、次いでＮcoＩ消化したＤＮＡを
Ｅ.coli Ｋ１２ ＲＶ３０８(ＮＲＲＬＢ−１５６２４)
に形質転換する。Ｅ.coli Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞を、
実施例１Ｄの操作法に実質的に従ってコンピーテントに
し、形質転換した。得られた形質転換混合物を１００μ
ｇ/ml アンピシリンを含有するＬ寒天上にプレートし
た。プラスミドpＲＣはカナマイシン耐性を付与する
が、プラスミドpＴＰＡ１０３は付与しないので、カナ
マイシンに対する感受性についてアンピシリン耐性形質
転換体を試験した。次いで、アンピシリン耐性でありカ
ナマイシン感受性である形質転換体を使用し、プラスミ
ドＤＮＡを調製し、制限酵素分析によってそのプラスミ
ドＤＮＡを調査することにより、Ｅ.coli Ｋ１２ ＲＶ
３０８／pＴＰＡ１０３形質転換体を同定した。プラス
ミドpＴＰＡ１０３の制限部位および機能地図を添付の
図４に示す。実施例１Ｆの操作法に実質的に従って、
Ｅ.coli Ｋ１２ＲＶ３０８／pＴＰＡ１０３細胞からプ
ラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡを単離した。

【００７３】Ｂ．中間プラスミドpＴＰＡ６０２の構築 ガラス蒸留水４５μl 中、プラスミドpＴＰＡ１０３(約
５０μg)を１０×ＥcoＲＩ(３０μl)および水２２５μl
に加えた。制限酵素ＥcoＲＩ約１０μl (〜８０単位)
をプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に加え、得ら
れた混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。Ｅ
coＲＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡをエタ
ノールで沈殿させ、１×ローディング緩衝液(１０％グ
リセリンおよび０．０２％ブロモフェノールブルー)５
０μl中に再懸濁し、アガロースゲルに供して、〜１．
１kb ＥcoＲＩ制限フラグメントが他の反応産物と分離
するまで電気泳動した。t-ＰＡアミノ末端をコードして
いるＤＮＡを含有する〜１．１kb ＥcoＲＩ制限フラグ
メントをそのゲルから単離し、水１６０μl 中に再懸濁
した。

【００７４】その〜１．１kb ＥcoＲＩ制限フラグメン
トの溶液に、１０×ＨgaＩ緩衝液(０．５Ｍ ＮaＣl、６
０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４および０．１Ｍ ＭgＣ
l₂)約４０μl、ガラス蒸留水２００μl、および制限酵
素ＨgaＩ(２０μl、約１０単位)を加え、得られた反応
物を３７℃で４時間インキュベートした。ＨgaＩ消化し
たＤＮＡをエタノールによって沈殿させ、次いで５％ア
クリルアミドゲルの電気泳動で分離し、そのゲルからt-
ＰＡのアミノ末端をコードしている〜５２０bp 制限フ
ラグメントを単離した。〜５２０bp ＨgaＩフラグメン
ト約５μgを入手し、それを水５０μl 中に懸濁した。

【００７５】１０×クレノー緩衝液(０．５Ｍ トリス-
ＨＣlpＨ７．４、および０．１ＭＭgＣl₂)約１２．５μ
l、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸がそれぞれ
６．２５mＭ である溶液２μl、０．２Ｍ ＤＴＴ(２μ
l)、７μｇ/ml ＢＳＡ(１μl)、ガラス蒸留水５７．５
μl、およびクレノー酵素２μl (〜１０単位)を、上記
の〜５２０bp ＨgaＩ制限フラグメントの溶液に加え、
得られた反応物を２０℃で３０分間インキュベートし
た。そのクレノー処理ＤＮＡを７０℃で１５分間インキ
ュベートし、エタノールで沈殿させた。

【００７６】ポリヌクレオチドキナーゼを使用し、総反
応容量２５μl 中で、約５００ピコモルのＢamＨＩリン
カーをリン酸化した。この反応は実施例２Ａに記載の操
作法に実質的に従って行った。キナーゼ処理ＢamＨＩリ
ンカーを、クレノー処理した〜５２０bp ＨgaＩ制限フ
ラグメントの溶液に加え、同時に１０×リガーゼ緩衝液
１５μl、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ７μl (〜７Ｗeiss単
位)、および反応容量１５０μl とするに充分な量のガ
ラス蒸留水を加えた。

【００７７】この連結反応物を熱-不活化し、エタノー
ルでＤＮＡを沈殿させ、１０×ＢamＨＩ緩衝液５μl お
よび水４５μl 中に再懸濁した。制限酵素ＢamＨＩ約１
μl(〜１６単位)をそのＤＮＡ溶液に加え、得られた反
応物を３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、
ＢamＨＩ酵素をさらに１６単位加え、得られた反応物を
３７℃でさらに９０分間インキュベートした。次いで、
その反応混合物を５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動にかけ、次いでゲルからＢamＨＩ末端を有している〜
５３０bp ＨgaＩ制限フラグメントを精製した。所望の
フラグメント約２μgを入手し、水２０μl に懸濁し
た。

【００７８】ＢamＨＩ消化し、脱リン酸化したプラスミ
ドpＢＲ３２２ ＤＮＡは、ニュー・イングランド・バイ
オラブスから入手することができる。ＢamＨＩ消化し、
脱リン酸化したプラスミドpＢＲ３２２約０．１μg(水
２μl 中)を、ＢamＨＩ末端を有するプラスミドpＴＰＡ
１０３の〜５３０bp ＨgaＩ制限フラグメント１μl、水
１４μl、１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液２μl、お
よびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl (〜１Ｗeiss単位)に加
え、得られた反応物を１６℃で一晩インキュベートし
た。連結されたＤＮＡは、所望のプラスミドpＴＰＡ６
０２、およびpＴＰＡ６０１と呼ばれる等価プラスミド
を構成していた。これらは、挿入される〜５３０bp 制
限フラグメントの方向性においてのみ相違している。プ
ラスミドpＴＰＡ６０２の制限部位および機能地図を添
付の図５に示す。

【００７９】実施例１Ｄの操作法に実質的に従って、連
結されたＤＮＡを使用し、Ｅ.coliＫ１２ ＭＭ２９４
(ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２５)を形質転換した。形質転換
された細胞をアンピシリンを含有するＬ寒天上にプレー
トし、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってＥ.col
i Ｋ１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ６０２およびＥ.coli Ｋ
１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ６０１細胞を同定した。〜５
３０bp ＢamＨＩ制限フラグメントが存在することは、
そのプラスミドがpＴＰＡ６０２またはプラスミドpＴＰ
Ａ６０１のいずれかであることを示している。

【００８０】Ｃ．中間プラスミドpＴＰＡ６０３の構築 プラスミドpＴＰＡ６０２約５μgを１０×ＢglII緩衝液
(５００mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０、１００mＭ ＭgＣ
l₂、１Ｍ ＮaＣl)２０μl および水１８０μlに溶解し
た。制限酵素ＢglII約３μl (〜２４単位)をプラスミド
pＴＰＡ６０２ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を
３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、その反
応混合物に１０×ＢamＨＩ緩衝液〜１３μl を加え、反
応混合物中の塩濃度をＳalＩ消化に推奨される濃度と
し、そして制限酵素ＳalＩ(２μl、〜２０単位)を加え
た。得られた反応物を３７℃でさらに２時間インキュベ
ートし、次いでエタノールによってＤＮＡを沈殿させ、
１×ローディング緩衝液７５μl 中に再懸濁し、アガロ
ースゲルに供して電気泳動し、〜４．２kb ＢglII−Ｓa
lＩ制限フラグメントを他の消化産物と分離した。〜
４．２kb ＢglII−ＳalＩ制限フラグメントを含有する
ゲル領域を切除して冷凍し、冷凍したセグメントをプラ
スチックで包み、圧搾して〜４．２kb フラグメントを
取り出す。そのＤＮＡを沈殿させ、水２０μl 中に再懸
濁すると、所望のフラグメント約２００nｇが入手され
た。

【００８１】プラスミドpＴＰＡ１０３(約１２μg)を１
０×ＢglII緩衝液１５μl および水１３５μl に溶解し
た。制限酵素ＢglII約２μl (〜１６単位)をそのプラス
ミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応
物を３７℃で９０分間インキュベートした。そのＢglII
消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に１０
×ＢamＨＩ緩衝液約１０μl を加え、ＳalＩ消化に要求
される反応混合物中塩濃度とした。次いで、制限酵素Ｓ
alＩ約２μl (〜２０単位)をそのＢglII消化プラスミド
pＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を
３７℃でさらに９０分間インキュベートした。エタノー
ル沈殿によりＢglII−ＳalＩ消化プラスミドpＴＰＡ１
０３ ＤＮＡを濃縮し、次いでアガロースゲルに供し、t
-ＰＡのアミノ末端以外のすべてをコードしている〜
２．０５kb ＢglII−ＳalＩ制限フラグメントをそのゲ
ルから単離してエタノール沈殿し、水２０μl に再懸濁
した。これにより、所望のフラグメント約２μgが得ら
れた。

【００８２】プラスミドpＴＰＡ６０２の〜４．２kb Ｂ
glII−ＳalＩ制限フラグメント約５μl およびプラスミ
ドpＴＰＡ１０３の〜２．０５kb ＢglII−ＳalＩ制限フ
ラグメント２μl を１０×リガーゼ緩衝液２μl、水１
０μl およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl (〜１Ｗeiss単
位)に加え、得られた連結反応物を１６℃で一晩インキ
ュベートした。連結されたＤＮＡは、所望のプラスミド
pＴＰＡ６０３を構成していた。プラスミドpＴＰＡ６０
３の制限部位および機能地図を添付の図６に示す。実施
例１Ｄの操作法に実質的に従って、得られた連結ＤＮＡ
を使用してＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４を形質転換し
た。形質転換細胞をアンピシリンを含有するＬ寒天上に
プレートし、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって
アンピシリン耐性Ｅ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ
６０３を同定した。

【００８３】Ｄ．プラスミドpmt６-hdの最終的構築 t-ＰＡのコード化領域の部位特異的突然変異およびプラ
スミドpmt６-hdの構築は、以下のようにして行った。蒸
留水１０μl 中、プラスミドpＴＰＡ１０３ 約５μgを
１０×ＨindIII緩衝液約１０μl および蒸留水８０μl
に加えた。制限酵素ＨindIII １μl (２０単位)をプラ
スミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶液に加え、得られた反
応物を３７℃で９０分間インキュベートした。そのＨin
dIII消化プラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に制限
酵素ＳstＩ１μl (２０単位)および１Ｍ トリス-ＨＣl
(pＨ７．６)１０μl を加え、得られた反応物を３７℃
で９０分間インキュベートした。１．４kb ＨindIII−
ＳstＩ制限フラグメントを調製用ゲル電気泳動によって
単離した。

【００８４】蒸留水３５μl 中、Ｍ１３mp１８ ＤＮＡ
(ＮＥＢから入手)の複製型(ＲＦ)約４．５μgを１０×
ＨindIII緩衝液１０μl および蒸留水５５μl に加え
た。制限酵素ＨindIII(１μl、約２０単位)をＭ１３mp
１８ ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３７℃で
１時間インキュベートした。ＨindIII消化したＭ１３mp
１８ ＤＮＡの溶液に制限酵素ＳstＩ(１μl、約２０単
位)および１Ｍ トリス-ＨＣl pＨ７．６(１０μｌ)を加
え、得られた反応物を３７℃で１時間インキュベートし
た。調製用ゲル電気泳動によってＭ１３mp１８の大きな
ＨindIII−ＳstＩ制限フラグメントを入手し、蒸留水２
０μl 中に懸濁した。Ｍ１３mp１８のその大きなＨindI
II−ＳstＩ制限フラグメント約２μl、１０×Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ緩衝液２μl、蒸留水１２μl、およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ〜１μl (約１Ｗeiss単位)を、プラスミ
ドpＴＰＡ１０３の〜１．４kb ＨindIII−ＳstＩ制限フ
ラグメント３μl に加え、得られた連結反応物を１６℃
で一晩インキュベートした。

【００８５】大腸菌ＪＭ１０３細胞をコンピーテントに
し、それを、ＢＲＬ Ｍ１３クローニング／ジデオキシ
配列決定教示マニュアル(BRL M13Cloning/'Dideoxy' Se
quencing Instruction Manual)に記載の操作法に実質的
に従って連結混合物でトランスフェクトした[ただし、
１トランスフェクション当たりに使用するＤＮＡ量は変
動させた。この操作法ではＪＭ１０３以外の宿主細胞を
も使用できる。適当な宿主細胞については、マニアチス
らの１巻４１４−４１５頁(１９８９)を参照のこと]。
この方法は、マニアチスらの1:4.37(1989)にも記載され
ている。組換えプラークの同定は、Ｘ-ガル(５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド)をそのインジゴ染色開裂産物に開裂する開裂能
を喪失させる、β-ガラクトシダーゼα-フラグメントを
コードしている遺伝子の挿入不活化(insertional inact
ivation)によって行う。このスクリーニング目的のた
め、幾つかの白色プラークをＬブロス２．５ml 中に取
り上げ、それに対数増殖期にあるＥ.coli Ｋ１２ ＪＭ
１０３(０．４ml)を加え、そして最小培地ストック中で
培養させてproＡＢを担うＦエピソームを保持させる。
プラークを含有する細胞懸濁液２．５ml を３７℃で８
時間空気振盪装置中でインキュベートする。１．５ml試
料から得た細胞をペレット化し、実施例１Ｅのアルカリ
ミニスクリーニング操作に実質的に従ってＲＦ ＤＮＡ
を単離する。各培養物の残りをストック用に４℃で保存
する。ＭＰ１８ＢＷ４７と命名された所望のファージ
は、Ｍ１３mp１８の〜７．２kb ＥcoＲＩ−ＨindIII制
限フラグメントに連結されているプラスミドpＴＰＡ１
０３の〜１．４kb ＨindIII−ＳstＩ制限フラグメント
を含有している。

【００８６】対数期Ｅ.coli ＪＭ１０３(約５０ml)をＭ
Ｐ１８ＢＷ４７で感染し、３７℃で１８時間、空気振盪
装置でインキュベートする。感染細胞を低速遠心によっ
てペレット化し、上記教示マニュアルの操作をスケール
アップして培養上清から１本鎖ＭＰ１８ＢＷ４７ ＤＮ
Ａを調製した。クレノー反応を室温で３０分間、次いで
３７℃で６０分間、次いで１０℃で１８時間行う以外
は、アデルマン(Adelman)らのDNA (2)3:183-193(1983)
の教示に実質的に従って１本鎖ＭＰ１８ＢＷ４７を突然
変異した。さらに、Ｓ１処理を２０℃で行い、緩衝液の
塩濃度を製造元の教示の１．５倍にし、Ｍ１３配列決定
用プライマー(ＢＲＬ)を使用した。合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチドプライマー：

【化８】 を使用し、天然t-ＰＡのアミノ酸残基４から１７５のコ
ード化配列を欠失させた。

【００８７】得られた突然変異混合物を使用し、上記の
感染操作に実質的に従ってＥ.coliＫ１２ ＪＭ１０３を
トランスフェクトした。ＲＦ ＤＮＡの制限酵素分析お
よびマキサムとギルバートのＤＮＡ配列決定法[Maxam,
A.M.およびGilbert,W.のProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.7
4:560(1980)]によって所望の突然変異体を同定した。天
然t-ＰＡの４から１７５のアミノ酸残基をコードしてい
るコード化配列が欠失された所望の突然変異体をＭＰ１
８ＢＷ５２と命名した。

【００８８】プラスミドpmt６-hdを以下のようにして構
築した。まず、プラスミドpＴＰＡ６０３を上記のよう
にしてＢamＨＩで完全に消化し、調製用ゲル電気泳動に
よって〜１．９kb ＢamＨＩフラグメントを単離した。
次いで、プラスミドpＡc３７３[ミヤモト(Miyamoto)ら
のMol.Cell.Biol.5:2860-2865(1985)]をＢamＨＩ消化
し、抽出し、エタノール沈殿した。ＢamＨＩ消化pＡc３
７３ ＤＮＡをプラスミドpＴＰＡ６０３の〜１．９kb
ＢamＨＩフラグメントと連結し、中間プラスミドpＬ１
００を調製した。プラスミドpＡc３７３を使用したの
は、このプラスミドには便利なクローニング部位が存在
しているからである。プラスミドpＡc３７３の替わりに
他のプラスミドを使用してもプラスミドpＬ１００を調
製することができる。そのようなプラスミドとしては、
pＢＲ３２２、pＵＣ１８、およびpＵＣ１９があり、そ
れらはすべて公に入手可能である。実施例１Ｄの操作法
に実質的に従って、得られた連結ＤＮＡを使用してＥ.c
oli Ｋ１２ ＭＭ２９４を形質転換した。形質転換細胞
をアンピシリンを含有するＬ寒天上にプレートし、プラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によって、アンピシリン耐
性のＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４／pＬ１００形質転換体
を同定した。

【００８９】プラスミドpＬ１００ ＤＮＡを制限酵素Ｂ
glIIおよびＳstＩで完全に消化し、調製用ゲル電気泳動
によって９．７kbＢglII−ＳstＩフラグメントを単離し
た。先に得たＭＰ１８ＢＷ５２ ＤＮＡを制限酵素ＢglI
IおよびＳstＩで消化し、調製用ゲル電気泳動によって
〜７１８bp ＢglII−ＳstＩフラグメントを単離した。
このフラグメントを実施例１Ｃの方法に従ってプラスミ
ドpＬ１００の９．７kb ＢglII−ＳstＩフラグメントと
連結し、中間プラスミドpＬ２２９を調製した。実施例
１Ｄの操作に実質的に従って、Ｅ.coli Ｋ１２ ＭＭ２
９４をプラスミドpＬ２２９で形質転換した。得られた
形質転換細胞をアンピシリンを含有するＬ寒天上にプレ
ートし、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアン
ピシリン耐性のＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４／pＬ２２９
形質転換体を同定した。プラスミドpＬ２２９ ＤＮＡを
実施例１Ｅに記載のようにして単離し、次いで制限酵素
ＢamＨＩで消化した。調製用ゲル電気泳動によって〜
１．４kb ＢamＨＩフラグメントを単離した。

【００９０】Ｅ.coli Ｋ１２ ＧＭ４８／phd細胞をノー
ザン・リージォナル・リサーチ・ラボラトリーから受託
番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５２５の下に凍結乾燥品として
入手した。凍結乾燥した細胞を１００μｇ/ml アンピシ
リンを含有するＬ−寒天平板上にプレートし、３７℃で
インキュベートして単一のコロニー単離体を得た。実施
例１Ｆに記載の方法によって、その細胞からプラスミド
ＤＮＡを入手することができる。プラスミドphdの制限
部位および機能地図を添付の図７に示す。プラスミドph
dをＢclＩで消化し、精製し、エタノール沈殿によって
採取した。ＢclＩ消化phd ＤＮＡをプラスミドpＬ２２
９の〜１．４kb ＢamＨＩフラグメントと連結し、所望
のプラスミドpmt６-hdを調製した。実施例１Ｄの操作法
に実質的に従ってＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４を、連結
されたＤＮＡによって形質転換した。得られた形質転換
細胞をアンピシリン含有Ｌ寒天上にプレートし、プラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐性
Ｅ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４／pmt６-hd形質転換体を同
定した。pmt６-hdの制限部位および機能地図を添付の図
８に示す。

【００９１】実施例３ pＴＬＢ−t６の構築 Ａ．pＬＰ５３−ＴＬＢの３２７３塩基対ＢglII−Ｘma
Ｉ制限フラグメントの調製 ５０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０、１０mＭ ＭgＣl₂、
および５０mＭ ＮaＣlを含有する反応容量２００μl 中
において、プラスミドpＬＰ５３−ＴＬＢＤＮＡ(実施例
１で調製)１μgをＢglII(１μl、１０単位)およびＸma
Ｉ(９μl、９単位)で完全消化した。得られた試料を３
７℃で２時間インキュベートした。実施例１Ａに記載の
ようにして消化ＤＮＡを精製し、採取した。

【００９２】Ｂ．pmt６-hdの１０７３塩基対ＢglII−Ｘ
maＩ制限フラグメントの調製 実施例３Ａに記載の緩衝条件下、反応容量２５０μl 中
において、プラスミドpmt６-hd ＤＮＡ(実施例２で調
製)３０μgをＢglII(２μl、２０単位)およびＸmaＩ(２
５μl、２５単位)で完全消化した。インキュベートした
後、ローディング緩衝液(２５％v/vグリセリン、０．０
５％w/vブロムフェノールブルー、および０．５％v/vキ
シレンシアノール)２５μlを加え、消化ＤＮＡをゲル電
気泳動によって画分化した。１０７３塩基対のＢglII−
ＸmaＩ制限フラグメントを回収し、ゲルから精製した。
回収したＤＮＡフラグメントを水２０μl に溶解した。

【００９３】Ｃ．pＴＬＢ−t６の最終的構築 プラスミドpＬＰ５３−ＴＬＢ ＤＮＡの３２７３bp Ｂg
lII−ＸmaＩ制限フラグメント(実施例３Ａにおいて調
製)５０nｇを、実施例１Ｃの連結操作に従って、プラス
ミドpmt６-hd ＤＮＡの１０７３塩基対ＢglII−ＸmaＩ
制限フラグメント(実施例３Ｂで調製)０．２μgと連結
した。実施例１Ｄに記載の方法に従い、コンピーテント
なＥ.coli Ｋ１２ ＡＧ１細胞を連結混合物で形質転換
した。１００μｇ/ml アンピシリンを含有するＬＢ寒天
平板上において３７℃で一晩増殖させ、形質転換体を選
択する。実施例１ＥのＤＮＡ単離操作によって、アンピ
シリン耐性クローンからプラスミドＤＮＡを単離した。
プラスミドpＴＬＢ−t６を制限酵素分析によって同定し
た。pＴＬＢ−t６の制限部位および機能地図を添付の図
９に示す。

【００９４】実施例４ pＢＫneo１およびpＢＫneo２の構築 Ａ．ＢＫウイルスＤＮＡの調製 ＢＫウイルスは、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８３７の
下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションか
ら入手する。このウイルスを凍結乾燥品として譲り受
け、ハンクスの平衡化塩[Hank's balanced salts、ギブ
コ、ＮＹ１４０７２、グランド・アイランド、スタレイ
・ロード３１７５番]中に再懸濁し、約１０⁵プラーク形
成単位(pfu)／ml の力価とする。ＢＫウイルスＤＮＡの
調製のために選択する宿主は、幼若ヒト胎児腎(ＰＨＥ
Ｋ)細胞であり、これはカタログ番号０−１００の下、
フロー・ラボラトリーズ[Flow Laboratories,Inc.,VA22
101,マクレーン,オールド・スプリングハウス・ロード765
5番]、またはカタログ番号７０−１５１の下、バイオプ
ロダクツ[M.A.Bioproducts]から入手することができ
る。あるいは、ＢＫウイルスはＶero細胞(ＡＴＣＣカタ
ログ番号ＣＣＬ８１)において増殖させることができ
る。

【００９５】ＰＨＥＫ細胞約１０⁶個の全面成長の単層
を含むおよそ５つの７５mm²ポリスチレンフラスコをウ
イルスの調製用に使用する。力価１０⁵pfu／ml のＢＫ
ウイルス約１ml を各フラスコに加え、次いで３７℃で
１時間インキュベートし、新鮮な培養培地[１０％ウシ
胎仔血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地(ギ
ブコ)]を加え、ウイルスの完全な細胞変性効果が認めら
れるまで、感染細胞を３７℃で１０−１４日間インキュ
ベートした。この細胞変性効果はセルラインごとに、ま
たウイルスごとに変わるが、通常は細胞の隆起、凝集、
および培養ディスクの剥離(sloughing off)として認め
られる。

【００９６】凍結−解凍サイクルを３回行ってウイルス
を細胞から遊離させ、５０００×Ｇの遠心によって細胞
残骸を除去した。上清液１リットル中のウイルスを沈降
させ、ＰＥＧ−６０００(１００ｇ)を添加して集め、得
られた溶液を４℃で２４時間インキュベートし、５００
０×Ｇで２０分間遠心した。得られたペレットを０．１
×ＳＳＣ緩衝液[１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮaＣl およ
び０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、pＨ＝７]に溶解
し、初期容量の１／１００とした。そのウイルス懸濁液
をチューブ中の飽和ＫＢr溶液１５ml 上に重層し、７
５，０００×Ｇで３時間遠心した。遠心後、ＫＢr溶液
中には２つのバンドが認められた。完全なビリオンを含
有する下方のバンドを集め、溶出緩衝液としてＴＥを使
用するセファデックス^RＧ−５０カラム[シグマ・ケミカ
ル,カンパニー、ＭＯ63178,セントルイス,P.O.ボックス
14508番]により脱塩した。

【００９７】そのカラムから得られた精製ビリオンの溶
液にドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を濃度１％までで
加え、プロナーゼを濃度１００μｇ/ml で加え、得られ
た溶液を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、
その溶液に塩化セシウムを１．５６ｇ／ml の密度にな
るまで加え、臭化エチジウムを終濃度１００μｇ/mlに
なるまで加えた。その溶液をＳorvall[DuPont Inst.Pro
ducts, Biomedical Division,CT06470,ニュートン]の８
６５ローターまたは類似の垂直ローターによって２６
０，０００×Ｇで２４時間遠心した。遠心後、ウイルス
ＤＮＡのバンドを単離し、１００mＭ トリス-ＨＣl pＨ
７．８で飽和させたイソアミルアルコールで５回抽出し
た。得られたＢＫウイルスのＤＮＡ溶液をＴＥ緩衝液に
対して透析し、ＤＮＡの２６０nm／２８０nm吸光比が
１．７５から１．９０の間になるようにした。ＮaＣl
濃度を０．０５Ｍ に調節し、２容量のエタノールを加
え、得られた溶液を−７０℃で少なくとも２時間インキ
ュベートすることによりＤＮＡを沈殿させ、その溶液を
１２，０００×Ｇで１０分間遠心した。得られたＢＫウ
イルスＤＮＡのペレットを濃度１mｇ/ml でＴＥ緩衝液
に懸濁した。

【００９８】Ｂ．プラスミドpＢＫneo１およびpＢＫneo
２の構築 Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１／pdＢＰＶ−ＭＭＴneo細胞
をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから
受託番号ＡＴＣＣ ３７２２４の下に凍結乾燥品として
入手した。その凍結乾燥細胞を１００μｇ/ml アンピシ
リンを含有するＬ−寒天平板上にプレートし、３７℃で
インキュベートして単一のコロニー単離体を入手した。
実施例１Ｆに記載のプラスミドの単離操作法に従って、
細胞からプラスミドＤＮＡを単離することができる。

【００９９】先に調製したプラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴ
neo ＤＮＡ約５μg(５μl)および実施例４Ａで調製した
ＢＫウイルスＤＮＡ５μg(５μl)をそれぞれ、１０×Ｂ
amＨＩ緩衝液(１．５Ｍ ＮaＣl、６０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．９、６０mＭ ＭgＣl₂、および１mｇ/ml ＢＳ
Ａ)２μl、制限酵素ＢamＨＩ(１μl)、および水７μlを
含有する溶液中、３７℃で２時間消化した。等量のフェ
ノールで抽出して反応を停止させ、次いでクロロホルム
で２回抽出した。各ＢamＨＩ消化ＤＮＡを沈殿させ、遠
心によって集め、水５μlに再懸濁した。

【０１００】１０×リガーゼ緩衝液約１μlを、ＢamＨ
Ｉ消化プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo(１μl)およびＢ
amＨＩ消化ＢＫウイルスＤＮＡ(１μl)の混合物に加え
た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜１０００単位)および
水６μl をそのＤＮＡ混合物に加えた後、得られた反応
物を１６℃で一晩インキュベートした。連結されたＤＮ
Ａは、ＢＫウイルスＤＮＡの方向性の点でのみ異なる所
望のプラスミドpＢＫｎｅｏ１およびｐＢＫneo２を構成
していた。プラスミドpＢＫneo１の制限部位および機能
地図を添付の図１０に示す。

【０１０１】Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１細胞をノーザ
ン・リージォナル・リサーチ・ラボラトリーから受託番
号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２６の下で凍結乾燥品として入
手した。Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１細胞を培養し、形
質転換するためにコンピーテントにし、実施例１Ｄに記
載の操作に実質的に従って、先に調製した連結ＤＮＡで
形質転換した。形質転換細胞を１００μｇ/ml アンピシ
リンを含有するＬ−寒天平板上にプレートし、アンピシ
リン耐性表現型およびプラスミドＤＮＡの制限酵素分析
によって、Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１／pＢＫneo１お
よびＥ.coli Ｋ１２ ／pＢＫneo２を同定した。

【０１０２】実施例５ Ａ．中間プラスミドpＬＰcatの構築 アデノウイルス２型(Ａd２)のビリオンＤＮＡは、サイ
ズが約３５．９４kb の２本鎖線状分子である。Ａd２後
期プロモーターは、Ａd２ゲノムの〜０．３１６kb Ａcc
Ｉ−ＰvuII制限フラグメント上に単離することができ
る。この〜０．３２kb 制限フラグメントは、Ａd２ゲノ
ムの５７５５位および６０７１位ヌクレオチド間の配列
に相当している。所望の〜０．３２kb ＡccＩ−ＰvuII
制限フラグメントを単離するには、Ａd２ ＤＮＡをまず
制限酵素ＢalＩで消化し、〜０．３２kb ＡccＩ−ＰvuI
I制限フラグメントの全配列を含有する〜２．４kb Ｂal
Ｉ制限フラグメントを単離する。次いで、〜２．４kb
ＢalＩ制限フラグメントをＡccＩおよびＰvuIIで消化
し、所望のフラグメントを入手する。

【０１０３】Ａd２ ＤＮＡ(ＢＲＬから入手可能)約５０
μgを水８０μl および１０×ＢalＩ緩衝液(１００mＭ
トリス-ＨＣl pＨ７．６、１２０mＭ ＭgＣl₂、１００m
ＭＤＴＴ、および１mｇ/ml ＢＳＡ)１０μl に溶解す
る。得られたＡd２ ＤＮＡの溶液に制限酵素ＢalＩ約１
０μl(〜２０単位)を加え、その反応物を３７℃で４時
間インキュベートする。

【０１０４】ＢalＩ消化したＤＮＡをアガロースゲルに
載せ、制限フラグメントが充分に分離するまで電気泳動
にかける。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液(０．５μ
ｇ/ml)で染め、長波長紫外(ＵＶ)光線を照射することに
より、電気泳動したＤＮＡを視覚化した。アガロースか
らＤＮＡを単離するための１つの方法は次ぎのようであ
る。所望のフラグメントのゲル上の前方に小さなスリッ
トを作り、ＮＡ−４５ＤＥＡＥ膜[Schleicher and Schu
ell,NH 03431,キーン]の小片を各スリットの中に入れ
る。さらに電気泳動をかけると、ＤＮＡがＤＥＡＥ膜に
非共有結合的に結び付く。所望のフラグメントがＤＥＡ
Ｅ膜に結合した後、その膜を取り出し、低塩緩衝液(１
００mＭ ＫＣl、０．１mＭ ＥＤＴＡ、および２０mＭ
トリス-ＨＣl pＨ８．０)ですすぐ。次いで、その膜を
小チューブに入れ、高塩緩衝液(１Ｍ ＮaＣl、０．１m
Ｍ ＥＤＴＡ、および２０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０)
に浸した後、６５℃で１時間インキュベートしてＤＥＡ
Ｅ紙からＤＮＡを取り外す。６５℃でインキュベートし
た後、インキュベート緩衝液を集め、そして膜を高塩緩
衝液ですすぐ。この高塩すすぎ液を高塩インキュベート
緩衝液とともにプールする。

【０１０５】高塩−ＤＮＡ溶液の容量を、ＮaＣl 濃度
が０．２５Ｍ となるように調節し、次いで冷無水エタ
ノール３容量を加える。得られた溶液を混合し、−７０
℃で１０−２０分間放置する。次いで、その溶液を１
５，０００rpmで１５分間遠心する。さらに沈殿させて
残留塩を除去し、得られたＤＮＡペレットをエタノール
ですすいで乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μl に再懸濁する。
それはＡd２の所望の制限フラグメント約３μgを構成し
ている。得られた精製フラグメントをＴＥ緩衝液１０μ
l に溶解する。

【０１０６】Ａd２の〜２．４kb ＢalＩ制限フラグメン
トの溶液に、水約６μl および１０×ＡccＩ緩衝液(６
０mＭ ＮaＣl、６０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、６０
mＭＭgＣl₂、６０mＭ ＤＴＴ、および１mｇ/ml ＢＳＡ)
２μlを加える。そのＤＮＡ溶液に制限酵素ＡccＩ約２
μl (〜１０単位)を加えた後、反応物を３７℃で２時間
インキュベートする。ＡccＩ消化した後、エタノール沈
殿によってＤＮＡを採取し、水１６μl および１０×Ｐ
vuII緩衝液(６００mＭ ＮaＣl、６０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．５、６０mＭ ＭgＣl₂、６０mＭ ＤＴＴ、および
１mｇ/ml ＢＳＡ)２μl に再懸濁する。制限酵素ＰvuII
約２μl (約１０単位)をそのＤＮＡ溶液に加えた後、得
られた反応物を３７℃で２時間インキュベートする。

【０１０７】ＡccＩ−ＰvuII消化したＡd２の〜２．４k
b ＢalＩ制限フラグメントを〜６％ポリアクリルアミド
ゲル上に載せ、Ａd２後期プロモーターを含有する〜
０．３２kb ＡccＩ−ＰvuII制限フラグメントが他の消
化産物と分離するまで、電気泳動にかける。ゲルを臭化
エチジウムで染め、ＵＶ光で視覚化し、〜０．３２kbＡ
ccＩ−ＰvuII制限フラグメントを含有するゲルのセグメ
ントをゲルから切除し、粉砕し、そして抽出緩衝液(５
００mＭ ＮＨ₄ＯＡc、１０mＭ ＭgＯＡc、１mＭＥＤＴ
Ａ、および０．１％ＳＤＳ)〜２５０μl 中に室温で一
晩浸漬しておく。翌朝、その混合物を遠心し、ペレット
を廃棄する。上清中のＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
tＲＮＡ約２μgを加えて所望のフラグメントを完全に沈
殿させる。〜０．３２kb ＡccＩ−ＰvuII制限フラグメ
ント約０．２μgを入手し、それを水７μl 中に懸濁さ
せる。

【０１０８】実施例２に記載の操作に実質的に従ってキ
ナーゼ処理したＢclＩリンカー(５'−ＣＴＧＡＴＣＡＧ
−３'、ＮＥＢから入手可能)約０．２５μg(０．５μl
中)を、上記の〜０．３２kb ＡccＩ−ＰvuII制限フラグ
メントの溶液に加え、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl
(〜１０００単位)および１０×リガーゼ緩衝液１μl を
そのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応物を１６℃で一晩
インキュベートした。ＢclＩリンカーは、ＡccＩ−Ｐvu
II制限フラグメントのＰvuII末端とのみ連結することが
できた。その後、ＤＮＡの配列決定を行い、ＡccＩ−Ｐ
vuII制限フラグメントのＰvuII末端に結合した４つのＢ
clＩリンカーが確認された。この過剰のＢclＩリンカー
はＢclＩ消化および再連結によって除去することができ
る。しかし、この過剰のＢclＩリンカーは、それを含有
するベクターの適切な機能を妨害することがないので、
その過剰リンカーは除去しなかった。

【０１０９】Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１／pＳＶ２cat
細胞を受託番号ＡＴＣＣ３７１５５の下にＡＴＣＣから
凍結乾燥形態で入手し、実施例１Ｆの操作に実質的に従
ってその細胞からプラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡを単離
した。プラスミドpＳＶ２catの制限部位および機能地図
を添付の図１１に示す。プラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡ
約１mｇを得、それをＴＥ緩衝液１ml に溶解した。プラ
スミドpＳＶ２cat ＤＮＡ約３μg(３μl)を１０×Ａcc
Ｉ緩衝液２μl および水１６μl に加え、次いでそのp
ＳＶ２cat ＤＮＡの溶液に制限酵素ＡccＩ３μl(約９単
位)を加え、得られた反応物を３７℃で２時間インキュ
ベートした。次いで、１０×ＳtuＩ緩衝液(１．０Ｍ Ｎ
aＣl、１００mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０、１００mＭ
ＭgＣl₂、６０mＭ ＤＴＴ、および１mｇ/ml ＢＳＡ)３
μl、水５μl、および制限酵素ＳtuＩ約２μl(約１０単
位)を加え、ＡccＩ消化プラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡを
制限酵素ＳtuＩで消化した。得られた反応物を３７℃で
２時間インキュベートした。その反応混合物をフェノー
ルで１回、クロロホルムで２回抽出することで、反応を
停止させた。所望のフラグメント約０．５μgを入手
し、ＴＥ緩衝液２０μlに溶解した。

【０１１０】ＡccＩ−ＳtuＩ消化プラスミドpＳＶ２cat
ＤＮＡ約４μl をＡd２の〜０．３２kb ＡccＩ−ＰvuII
(ＢclＩリンカーが結合)制限フラグメント約７μlと混
合し、１０×リガーゼ緩衝液３μl、水１５μl および
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２μl(約１０００単位)を添加した
後、得られた連結反応物を１６℃で一晩インキュベート
した。連結されたＤＮＡは所望のプラスミドpＬＰcatを
構成しており、このプラスミドは、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を転写し、従って
発現させる位置にあるＡd２後期プロモーターを含有し
ている。プラスミドpＬＰcatの制限部位および機能地図
を添付の図１２に示す。

【０１１１】実施例１Ｄの操作に実質的に従い、得られ
た連結ＤＮＡを使用してＥ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１細
胞を形質転換した。形質転換された細胞を５０μｇ/ml
アンピシリンを含有するＬ寒天上にプレートし、プラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析により、Ｅ.coli Ｋ１２ Ｈ
Ｂ１０１／pＬＰcat形質転換体の同定を行った。実施例
１Ｆに記載のプラスミドの単離操作に実質的に従って、
プラスミドpＬＰcatＤＮＡを以後の構築に使用するため
形質転換体から単離した。

【０１１２】Ｂ．プラスミドpＢＬcatの構築 ＴＥ緩衝液５０μl 中、プラスミドpＢＫneo１ ＤＮＡ
(実施例４Ｂで調製)約８８μgを、１０×ＡccＩ緩衝液
７．５μl、水３０μl および制限酵素ＡccＩ１５μl
(約７５単位)に加え、得られた反応物を３７℃で２時間
インキュベートした。ＡccＩ消化したＢＫウイルスＤＮ
Ａをアガロースゲル上に載せ、ＢＫエンハンサーを含有
する〜１．４kb フラグメントを他の消化産物から分離
した。次いで、〜１．４kb ＡccＩ制限フラグメントを
ゲルから単離した。そのフラグメント約５μgを１０×
ＰvuII緩衝液５μl、水４５μl および制限酵素ＰvuII
５μl(約２５単位)に懸濁し、得られた反応物を３７℃
で２時間インキュベートした。次いで、ＰvuII消化ＤＮ
Ａを精製し、エタノール沈殿した。所望の〜１．２８kb
ＡccＩ−ＰvuIIフラグメント約２μgを入手し、ＴＥ緩
衝液５μl に溶解した。

【０１１３】プラスミドpＬＰcat ＤＮＡ約１μgを１０
×ＡccＩ緩衝液５μl および水４０μl に溶解した。制
限酵素ＡccＩ約５μl(〜２５単位)をプラスミドpＬＰca
t ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３７℃でイン
キュベートした。ＡccＩ消化したプラスミドpＬＰcat
ＤＮＡをエタノールで沈殿し、１０×ＳtuＩ緩衝液５μ
l、水４０μl、および制限酵素ＳtuＩ５μl(約２５単
位)中に再懸濁し、得られた反応物を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。ＡccＩ−ＳtuＩ消化したプラスミド
pＬＰcat ＤＮＡをエタノールで数回沈殿させることに
より、Ｅ.coli 複製起点およびＡd２後期プロモーター
を含有する〜４．８１kb ＡccＩ−ＳtuＩ制限フラグメ
ントを約１６bp の大きさの制限フラグメントである他
の消化産物から分離し、精製した。所望の〜４．８１kb
制限フラグメント約１μgを得、それをＴＥ緩衝液２０
μl 中に溶解した。

【０１１４】プラスミドpＬＰcatの〜４．８１kb Ａcc
Ｉ−ＳtuＩ制限フラグメント約５μlを、プラスミドpＢ
Ｋneo１の〜１．２８kb ＡccＩ−ＰvuII制限フラグメン
ト５μl に加えた。そのＤＮＡの混合物に１０×リガー
ゼ緩衝液３μl、水１５μl、およびＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ２μl(約１０００単位)を添加した後、得られた連結
反応物を１６℃で一晩インキュベートした。連結された
ＤＮＡは、所望のプラスミドpＢＬcatを構成していた。
プラスミドpＢＬcatの制限部位および機能地図を添付の
図１３に示す。

【０１１５】実施例１Ｄに記載の操作に実質的に従い、
Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１細胞をその連結ＤＮＡで形
質転換した。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、
Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１／pＢＬcat形質転換体を同
定した。実施例１Ｆの操作に実質的に従い、プラスミド
pＢＬcat ＤＮＡを以後の構築のために調製した。

【０１１６】Ｃ．プラスミドpＳＢＬcatの最終的構築 プラスミドpＢＬcat ＤＮＡ約１００μgを１０×ＨindI
II緩衝液(０．５Ｍ ＮaＣl、０．１Ｍ トリス-ＨＣl p
Ｈ８．０、０．１Ｍ ＭgＣl₂、および１mｇ/mlＢＳＡ)
１０μl および水８０μl に溶解した。制限酵素ＨindI
II約１０μl (約１００単位)をそのプラスミドpＢＬcat
ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３７℃で２時
間インキュベートした。ＨindIII消化プラスミドpＢＬc
at ＤＮＡをアガロースゲル上に載せ、ＢＫエンハンサ
ーおよびＡd２後期プロモーターを含有する〜０．８７k
b ＨindIII制限フラグメントが他の消化産物から充分に
分離するまで電気泳動した。次いで、そのゲルから〜
０．８７kb フラグメントを単離し、精製し、エタノー
ル沈殿した。所望のフラグメント約１０μgを入手し、
それをＴＥ緩衝液５０μl 中に溶解した。

【０１１７】ＴＥ緩衝液１μl 中、プラスミドpＳＶ２c
at ＤＮＡ約１μgを１０×ＨindIII緩衝液２μl および
水１６μl に溶解した。制限酵素ＨindIII約１μl(約１
０単位)をそのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応物を３
７℃で２時間インキュベートした。反応混合物をフェノ
ールで１回、次いでクロロホルムで２回抽出し、反応を
停止させた。ＨindIII消化プラスミドpＳＶ２cat ＤＮ
Ａをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液１００μl 中に
再懸濁した。その溶液に子牛腸内アルカリホスファター
ゼ約０．０６単位を加え、得られた混合物を３７℃で３
０分間インキュベートした。その溶液を、１×ＳＥＴ
(５mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．８、５mＭＥＤＴＡ、およ
び１５０mＭ ＮaＣl)、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび
０．０５％ＳＤＳを含有するように調節し、次いで６５
℃で４５分間インキュベートした。フェノールで２回、
次いでクロロホルムでＤＮＡを抽出した。実施例１に記
載のようにしてＤＮＡをエタノール沈殿し、ＴＥ緩衝液
１０μl に再懸濁した。ホスファターゼ処理し、pＳＶ
２cat ＤＮＡが自己連結しないようにした。

【０１１８】プラスミドpＢＬcatの〜０．８７kb Ｈind
III制限フラグメント約５μl をＨindIII消化プラスミ
ドpＳＶ２cat１０μl に加え、次いで１０×リガーゼ緩
衝液３μl、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２μl(約１０００単
位)２μl、および水１３μl をそのＤＮＡ溶液に加え、
得られた反応物を１６℃で２時間インキュベートした。
連結されたＤＮＡは所望のプラスミドpＳＢＬcatを構成
していた。実施例１Ｄの操作に実質的に従って、得られ
た連結ＤＮＡでＥ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１細胞を形質
転換した。形質転換された細胞をアンピシリンを含有す
るＬ寒天上にプレートし、アンピシリン耐性形質転換体
のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析することにより、
Ｅ.coli Ｋ１２ ＨＢ１０１／pＳＢＬcat形質転換体を
同定した。ＢＫエンハンサーおよびＡd２後期プロモー
ターをコードしている〜０．８７kb ＨindIII制限フラ
グメントは、２方向性の一方でＨindIII消化プラスミド
pＳＢＬcatに挿入することができ、１つの方向のみによ
ってプラスミドpＳＢＬcatが得られた。pＳＢＬcatの制
限部位および機能地図を添付の図１４に示す。

【０１１９】実施例６ pＳＢＬ−Ｂt６−dの構築 Ａ．pmt６−hdの３８６５塩基対ＡatII−ＸmaＩ制限フ
ラグメントの調製 １０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、５０mＭ ＫＣl、１
０mＭ ＭgＣl₂、および１mＭ ＤＴＴからなる反応容量
１５０μl 中、pmt６−hd(実施例２で調製)２０μgをＡ
atII１０μl(２０単位)で完全消化した。それを３７℃
で３時間インキュベートした。インキュベートした後、
実施例１Ａに記載のようにして、得られた試料をエタノ
ール沈殿によって精製し、採取し、それを水２１０μl
中に再懸濁した。

【０１２０】そのＤＮＡをＸmaＩを使用し、次ぎのよう
にして完全消化した。試料に１０×ＢＲＬ Ｃore緩衝液
(５００mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０、１００mＭ ＭgＣ
l₂、および５００mＭ ＮaＣl)２５μlおよびＸmaＩ(１
５μl、１５単位)を加えた。次いで、それを混合し、３
７℃で１６時間インキュベートした。インキュベートし
た後、実施例１Ａに記載のようにして精製し、採取し、
水２１０μl 中に再懸濁した。

【０１２１】得られたＤＮＡをＭstIIでさらに消化し、
所望の３８６５塩基対のＡatII−ＢglII制限フラグメン
トをゲル電気泳動にて分離した。１０×ＭstII緩衝液
(１００mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、１．５Ｍ ＮaＣ
l、１０mＭＭgＣl₂、および２mＭ β-メルカプトエタノ
ール)２５μl およびＭstII(ｘ単位)１５μl を試料に
加えた。次いで、それを混合し、３７℃で２時間インキ
ュベートした。インキュベート後、調製用ゲル電気泳動
によって３８６５塩基対ＡatII−ＢglII制限フラグメン
トを単離した。

【０１２２】Ｂ．pＳＢＬcatの３２２８塩基対ＡatII−
ＢclＩ制限フラグメントの調製 プラスミドpＳＢＬから３２２８塩基対ＡatII−ＢclＩ
制限フラグメントを単離した。プラスミドpＳＢＬは、
実施例５に記載したプラスミドpＳＢＬcatの誘導体であ
る。pＳＢＬcatからクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子を欠失させ、pＳＢＬを
調製する。あるいは、３２２８塩基対ＡatII−ＢclＩ制
限フラグメントは、以下のようにしてpＳＢＬcatから単
離することができる。

【０１２３】１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、５０m
Ｍ ＫＣl、１０mＭ ＭgＣl₂、および１mＭ ＤＴＴから
なる反応容量２００μl 中、pＳＢＬcat(実施例４で調
製)２５μgをＡatII２０μl(４００単位)で完全消化す
る。それを３７℃で３時間インキュベートする。インキ
ュベートした後、１０×Ｃore緩衝液(５００mＭ トリス
-ＨＣl pＨ８．０、１００mＭ ＭgＣl₂、および５００m
Ｍ ＮaＣl)３０μl、水６０μl、およびＢclＩ１０μl
(１００単位)を加える。得られた試料を３７℃で３時間
インキュベートする。インキュベートした後、３２２８
塩基対ＡatII−ＢclＩ制限フラグメントを調製用ゲル電
気泳動によって単離する。

【０１２４】Ｃ．pＴＬＢ−t６の１１９０塩基対ＢamＨ
Ｉ−ＸmaＩ制限フラグメントの調製 ＸmaＩ２０μl(２０単位)、ＢamＨＩ(５μl、５０単
位)、１０×Ｃore緩衝液(５００mＭ トリス-ＨＣl pＨ
８．０、１００mＭ ＭgＣl₂、および５００mＭ ＮaＣl)
２０μl、および水８０μl からなる反応液中で、pＴＬ
Ｂ−t６(実施例３で調製)２５μgを完全消化した。試料
は３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート
後、調製用ゲル電気泳動によって、１１９０塩基対Ｂam
ＨＩ−ＸmaＩ制限フラグメントを各試料から分離した。

【０１２５】Ｄ．プラスミドpＳＢＬ−Ｂt６−dの最終
的調製 実施例１Ｃの連結法に実質的に従って、プラスミドpmt
６-hdの３８６５塩基対ＡatII−ＸmaＩ制限フラグメン
ト(実施例６Ａで調製)５０nｇを３２２８塩基対ＡatI−
ＢclＩ制限フラグメント(実施例６Ｂで調製)０．１μg
およびpＴＬＢ−t６の１１９０塩基対ＢamＨＩ−ＸmaＩ
制限フラグメント(実施例６Ｃ)０．０５μgと連結す
る。実施例１Ｄに記載の方法に従って、この連結混合物
を使用してＥ.coli Ｋ１２ ＡＧ１を形質転換した。１
００μｇ/ml アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上に
おいて３７℃で一晩増殖させ、形質転換体を選択する。
実施例１ＥのＤＮＡ単離操作法によって、プラスミドＤ
ＮＡをアンピシリン耐性クローンから単離する。pＳＢ
Ｌ−Ｂt６−dの制限部位および機能地図を図１５に示
す。

【０１２６】実施例７ プラスミドpＧＴ−t６Ｂ−dの構築 Ａ．pmt６-hdの３８６５塩基対ＡatII−ＸmaＩ制限フラ
グメントの調製 pmt６-hdの３８６５塩基対ＡatII−ＸmaＩ制限フラグメ
ントを実施例６Ａに記載のようにして単離した。 Ｂ．pＧＴＣの３５６０塩基対ＢclＩ−ＡatII制限フラ
グメントの調製 プラスミドpＧＴＣは、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９
３の下、ノーザン・リージォナル・リサーチ・センター
(ＮＲＲＬ)、農芸研究所[農務省、イリノイ６１６０
４、ペオリア]から常法により単離することができる。p
ＧＴＣの制限部位および機能地図を添付の図１６に示
す。

【０１２７】実施例１Ｄに記載のようにして、プラスミ
ドpＧＴＣをdam-セルラインＥ.coliＫ１２ ＧＭ４８に
形質転換した。Ｅ.coli Ｋ１２ ＧＭ４８は、受託番号
ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５の下、ＮＲＲＬから入手する
ことができる。他のdam-セルラインも使用することがで
きる。実施例１Ｅに記載のようにして得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを単離した。

【０１２８】１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、５０m
Ｍ ＫＣl、１０mＭ ＭgＣl₂、および１mＭ ＤＴＴから
なる反応容量２００μl中、pＧＴＣ２５μgをＡatII２
０μl(４０単位)で完全消化した。試料を３７℃で３時
間インキュベートする。インキュベート後、１０×Ｃor
e緩衝液３０μl、水６０μl、およびＢclＩ１０μl(１
００単位)を加えた。得られた試料を３７℃で３時間イ
ンキュベートした。インキュベート後、調製用ゲル電気
泳動によって３５６０塩基対ＡatII−ＢclＩ制限フラグ
メントを単離した。

【０１２９】Ｃ．pＴＬＢ−t６の１１２０塩基対ＢamＨ
Ｉ−ＸmaＩ制限フラグメントの調製 pＴＬＢ−t６の１１２０塩基対ＢamＨＩ−ＸmaＩ制限フ
ラグメントを実施例６Ｃに記載のようにして単離した。 Ｄ．pＧＴ−t６Ｂ−dの最終的構築 実施例１Ｃの連結法に実質的に従って、pmt６−hdのＡa
tII−ＸmaＩ制限フラグメント(実施例７Ａで調製)５０n
ｇをpＧＴＣのＢclＩ−ＡatII制限フラグメント(実施例
７Ｂで調製)５０nｇおよびpＴＬＢ−t６のＢamＨＩ−Ｘ
maＩ制限フラグメント(実施例７Ｃで調製)５０nｇと連
結した。実施例１Ｄに記載の方法に従い、その連結混合
物によりＥ.coli Ｋ１２ ＡＧ１を形質転換した。１０
０μｇ/ml アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上にお
いて３７℃で一晩増殖させ、形質転換体を選択した。実
施例１ＥのＤＮＡ単離操作法により、アンピシリン耐性
クローンからプラスミドＤＮＡを単離した。pＧＴ−t６
Ｂ−dの制限部位および機能地図を添付の図１７に示
す。

【０１３０】実施例８ 形質転換および培養法 Ａ．ＡＶ１２−６６４細胞の形質転換 以下に記載の形質転換操作では、宿主セルラインとして
ＡＶ１２−６６４細胞を引用しているが、この操作法は
ほとんどの真核生物セルラインに一般に適用することが
できる。ＡＶ１２−６６４細胞を、受託番号ＣＲＬ ９
５９５の下、ＡＴＣＣから入手し、それを１０％熱不活
化ウマ血清を含有するイーグルの最小必須培地中、約
５．５×１０⁶個細胞の全面成長単層を含有した２５mm²
フラスコに入れた。このフラスコを３７℃でインキュベ
ートし、培地を１週間に２回交換する。培地を除去して
細胞を継代培養し、ハンクスの平衡塩溶液[Hank's Bala
nced Salts solution、ギブコ(Ｇibco)、ニューヨーク
１４０７２、グランド・アイランド、スタレー・ロード
３１７５番]ですすぎ、０．２５％トリプシンを１−２
分間加え、新鮮な培地ですすぎ、吸引し、継代培養率
１：５または１：１０で新たなフラスコ中に分散させ
た。

【０１３１】形質転換する前日、１００mmまたは５５cm
²さら１つ当たり０．７×１０⁶個の細胞を接種する。形
質転換する４時間前に培地を交換する。滅菌したエタノ
ール沈殿プラスミドＤＮＡを水に溶かし、それを使用し
て、２０μｇ/ml ＤＮＡおよび２５０mＭ ＣaＣl₂を含
有する２×ＤＮＡ−ＣaＣl₂溶液を調製する。２８０mＭ
ＮaＣl、５０mＭ ヘペス(Ｈepes、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸)、およ
び１．５mＭ リン酸ナトリウムを含有する２×ＨＢＳを
調製し、そのpＨを７．０５−７．１５に調節する。２
×ＤＮＡ−ＣaＣl₂溶液を綿プラグを有する１ml 容量滅
菌プラスチック製ピペットで等量の滅菌２×ＨＢＳに滴
加し、同時に溶液にゆっくりと空気を泡だたさせる。さ
らに３０−４５分間撹拌することなく室温に放置し、リ
ン酸−カルシウム−ＤＮＡ沈殿物を形成させる。

【０１３２】次いで、プラスチック製ピペットを用いて
静かにピペッティングすることにより、得られた沈殿物
を混合し、平板１個当たり０．５ml の沈殿物を、受容
細胞で覆った増殖培地１０ml に直接加えた。３７℃で
４時間インキュベートした後、培地を１０％ウシ胎仔血
清を含有するＤＭＥＭと置き換え、選択圧を与える前に
細胞をさらに７２時間インキュベートした。真核生物細
胞内で機能する選択マーカーを含有していないプラスミ
ドの場合は、形質転換操作には、プラスミドの混合物、
すなわち選択マーカーを欠いている本発明の発現ベクタ
ーおよび真核生物細胞内で機能する選択マーカーを含有
する発現ベクターを利用する。この同時形質転換法によ
れば、選択圧の存在下に増殖するコロニーを単離し、そ
して有用タンパク質を検定することによって、これら両
方の形質転換用プラスミドを含む細胞を同定することが
できる。

【０１３３】ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有す
るプラスミドでトランスフェクトした細胞の場合は、得
られた増殖培地にハイグロマイシンを終濃度約２００か
ら４００μｇ/ml で加える。ネズミdhfr遺伝子を含有す
るベクターで形質転換した場合、ＡＶ１２−６６４細胞
はメトトレキセート(２００−５００nＭ)によっても直
接選択することができる。次いで、３から４日間隔で培
地を交換しながら細胞を３７℃で２−４週間インキュベ
ートする。得られたハイグロマイシン耐性またはメトト
レキセート耐性コロニーを特性化するために個々の培養
フラスコに移す。

【０１３４】実施例９ 精製および分析 ブルック(Burck)らのJ.Biol.Chem.265(9):5170(1990)に
記載されてる方法などの、当業者に周知の方法によっ
て、組織プラスミノーゲンアクチベーター分子を培養培
地から単離し、精製する。t-ＰＡ分子のプラスミノーゲ
ンアクチベーター活性は、VerheijenらのThrombol.Haem
ostas.48:226(1982)に記載されている間接分光検定によ
って測定することができる。

【０１３５】分泌タンパク質を単離精製する際には、ア
プライド・バイオシステムズ[ＣＡ９４４０４、フォス
ター・シティー、リンカーン・センター・ドライブ８５
０番]の４７０Ａ型タンパク質配列決定装置を使用し、
そのアミノ末端アミノ酸配列を分析した。精製していな
い粗製の培地から単離した分子についても、アミノ末端
アミノ酸配列を決定した。その配列決定法は、実質的に
はHewickらのJ.Biol.Chem.256:7990(1981)に記載されて
いるエドマン分解法である。ＴＬＢプロペプチド領域
(配列認識番号：３)を有するプラスミドを含有する形質
転換体により、末端アミノ酸にmt-ＰＡ-６タンパク質の
成熟型の第１アミノ酸であるＳerを有するmt-ＰＡ-６分
子の均質な集団が発現され、分泌された。このことは、
本発明のプロペプチド開裂配列は均一に開裂され、t-Ｐ
Ａ分子の均質な集団が産生されることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 pＬＰ５３の制限部位および機能地図を示し
ている。

【図２】 pＬＰ５３−ＴＬＢの制限部位および機能地
図を示している。

【図３】 pＴＰＡ１０２の制限部位および機能地図を
示している。

【図４】 pＴＰＡ１０３の制限部位および機能地図を
示している。

【図５】 pＴＰＡ６０２の制限部位および機能地図を
示している。

【図６】 pＴＰＡ６０３の制限部位および機能地図を
示している。

【図７】 phdの制限部位および機能地図を示してい
る。

【図８】 pmt６−hdＬＰ５３の制限部位および機能地
図を示している。

【図９】 pＴＬＢ−t６の制限部位および機能地図を示
している。

【図１０】 pＢＫneo１の制限部位および機能地図を示
している。

【図１１】 pＳＶ２catの制限部位および機能地図を示
している。

【図１２】 pＬＰcatの制限部位および機能地図を示し
ている。

【図１３】 pＢＬcatの制限部位および機能地図を示し
ている。

【図１４】 pＳＢＬcatの制限部位および機能地図を示
している。

【図１５】 pＳＢＬ−Ｂt６−dの制限部位および機能
地図を示している。

【図１６】 pＧＴＣの制限部位および機能地図を示し
ている。

【図１７】 pＧＴ−t６Ｂ−dの制限部位および機能地
図を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/64 Ｚ 7823−4Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ブライアン・ウイリアム・グリンネル アメリカ合衆国46220インデイアナ州イン デイアナポリス、イースト・セブンテイー フアースト・ストリート3625番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ末端からカルボキシ末端にかけ
   て、 (a)シグナルペプチド、 (b)細胞関連プロテアーゼによって均一に開裂すること
   のできる配列を含有するプロペプチド領域、 (c)組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはその誘
   導体 からなるタンパク質をコードしているＤＮＡを含有する
   組換えＤＮＡ化合物。
2. 【請求項２】 プロペプチド領域が、Ａrg Ｉle Ａrg
   Ｌys Ａrg(配列認識番号：３)、Ｇlu Ａrg Ａrg Ｌys
   Ａrg(配列認識番号：５)、Ｓer Ａrg Ｌys Ａrg Ａrg
   (配列認識番号：４)、およびＶal Ａrg Ｌys Ａrg Ａrg
   (配列認識番号：６)の中から選ばれるアミノ酸配列を含
   有している請求項１に記載のＤＮＡ化合物。
3. 【請求項３】 組織プラスミノーゲンアクチベーターま
   たはその誘導体がmt-ＰＡ-６である請求項１または請求
   項２に記載の組換えＤＮＡ化合物。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３に記載のＤＮＡを
   含有している組換えＤＮＡ発現ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換えＤＮＡ発現ベク
   ターによって形質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 配列： 【化１】 [式中、Ｘは、Ａrg Ｉle Ａrg Ｌys Ａrg(配列認識番
   号：３)、 Ｇlu Ａrg Ａrg Ｌys Ａrg(配列認識番号：５)、 Ｓer Ａrg Ｌys Ａrg Ａrg(配列認識番号：４)、および Ｖal Ａrg Ｌys Ａrg Ａrg(配列認識番号：６) の中から選ばれる細胞関連プロテアーゼによって均一に
   開裂され得るアミノ酸配列であり、Ｚはmt-ＰＡ-６であ
   る]で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。