KR0162021B1

KR0162021B1 - 에리트로포이에틴의 제조방법

Info

Publication number: KR0162021B1
Application number: KR1019950022441A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 김윤규; 류춘제; 김상직; 박흥록; 이상철
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970006499A

Abstract

본 발명은 플라스미드 pCMV-dhfr 및 이것을 이용하여 에리트로포이에틴(Erythropoietin;이하 EPO라고 약칭한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 pRc/CMV에 삽입하여 발현벡타 pCMV-dhfr을 만들고 여기에 인간 EPO 유전자를 클로닝하여 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr을 만든후 이것으로 CHO 세포를 형질전환시켜 얻은 세포주 g2 또는 ECl으로부터 2nM 이하의 낮은 농도의 MTX 함유 α-MEM 배지에서 고역가의 EPO를 경제적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

에리트로포이에틴의 제조방법

제1도는 발현벡터 pCMV-dhfr의 제작과정을 나타낸 것이고,

제2도는 EPO 발현벡터인 pEpoG-dhfr과 pEpoC-dhfr의 제작과정을 나타낸 것이고,

제3도는 EPO cDNA의 합성 제작과정을 나타낸 것이고,

제4도는 EPO 정제도를 확인하기 위해 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿팅을 실시한 결과를 나타낸 것이고,

제5도는 EP-EDC-P₂세포에서 EPO 활성을 MTT 방법으로 조사한 결과를 나타낸 것이고,

제6도는 생쥐 비장세포를 이용하여 EPO 활성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

[발명의 목적]

본 발명은 플라스미드 pCMVg-dhfr 및 이것을 이용하여 에리트로포이에틴(Erythropoietin;이하 EPO라고 약칭한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 인간 EPO 유전자서열을 발현벡타 pCMV-dhfr에 클로닝한 후 CHO 세포를 형질전환시켜 얻은 세포주 g2 또는 ECl으로부터 생물학적으로 활성을 갖는 인간 EPO를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 pRc/CMV에 삽입하여 발현벡타 pCMV-dhfr을 만들고 여기에 인간 EPO 유전자를 클로닝하여 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr을 만든후 이것으로 CHO 세포를 형질전환시켜 얻은 세포주 g2 또는 ECl으로부터 낮은 농도의 MTX 함유 α-MEM 배지에서 고역가의 EPO를 경제적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 이용분야 및 배경]

에리트로포이에틴(EPO)은 혈액내의 적혈구 수의 조절에 관여하는 당단백으로서 적혈구 형성 자극인자라고도 불리운다.

인체에서 적혈구 생성은 일생을 통하여 계속적으로 일어나며, 골수로부터 생성된 적아구가 분화증식되어 적혈구로 되는데 EPO는 이러한 적아구를 적혈구로 분화되도록 자극하는 호르몬이다.

건강한 사람의 경우 혈액내에 10∼20밀리유니트/밀리터가 존재하며, 다량의 출혈 등으로 인체내의 산소농도가 감소하면 EPO 생산이 자극되어 최소 1000배까지 증가된다.

이러한 에리트로포이에틴은 인체에서 신장의 상피세포에서 생성되므로, 신장에 이상이 있는 경우 EPO의 생성이 감소되어 극심한 빈혈을 초래하게 된다(Jacobson, L.O., et al., Nature, 179;633, 1947).

EPO는 겸상 적혈구성 빈혈, 적혈구 용해증, 혈우병, 생리적 빈혈, 수술전후의 과다출혈과 특히 만성 신부전증으로 신장이 크게 손상되어 EPO를 생성하지 못해서 생기는 빈혈증의 치료에 유효하다.

이와같은 빈혈치료제로서 뛰어난 효과를 갖고 있는 EPO는, FDA에서 신부전증, 혈우병, 생리적 빈혈 등에 의한 악성빈혈 치료제로 1989년 승인되었고, AZT를 사용하는 후천성 면역결핍증 환자의 악성빈혈치료제로서 1991년 허가를 받았다.

이외에 EPO는 약물치료를 받는 류마치스성 관절염 환자나 암환자의 빈혈중 치료, 수술전후의 수혈대체 등에 이용되고 있으며, 적용 범위가 점점 확대되는 추세에 있다.

[종래기술]

인체 EPO는 산성 당단백질의 호르몬으로서 166개의 아미노산으로 구성되며 탄수화물의 조성이 약간 다른 α-형과 β-형이 존재하는데 생물학적 활성에는 차이가 없다.

EPO를 얻기 위하여 처음에는 추출방법이 시도되었다. 양의 혈장으로부터 추출하는 방법(미국특허 3, 033, 753호), 사람의 오줌으로부터 추출하는 방법(미국특허 3, 865, 801호) 등이 시도되었으나, 분리정제되어지는 EPO의 양은 충분하지 못하였다. 또한, 양의 혈장으로부터 회수한 EPO는 인체에 항원으로 작용할 수 있다.

그후, 재생불량성 빈혈환자의 뇨로부터 비교적 순수한 EPO를 분리 정제하였으나(Miyake 등, J. Biol. Chem. 252(15);5558, 1977), 치료목적에 이용될 수 있는 정도로 충분하지는 못하였다.

그후 유전공학적 방법의 발달에 힘입어, 사람 EPO 유전자의 cDNA가 클로닝되었고, 뒤이어 사람 EPO 유전자의 DNA 염기서열이 밝혀져 대량생산이 가능케 되었다(미극특허 4, 703, 008호). 즉, 인간 EPO 유전자를 분리하고 이를 벡터에 삽입시킨 후 포유동물 세포를 형질전환시킴으로서, 대량의 순수한 인간 EPO를 생산하게 된 것이다(Jacovs, K.. et al., Nature 313;806, 1985;Lin et al., Proc. Natl. Sci. U.S.A 82. 7580. 1985).

그후 유전공학적 방법을 이용한 인간 EPO의 제조방법은 순도높은 제품을 경제적으로 대량생산할 수 있는 방향으로 개량을 거듭해 오고 있다.

그중 형질전환된 dhfr변이 포유배양세포를 메토트렉세이트(methotrexate;이하;MTX라고 약칭함)가 첨가된 세포배양액에서 적응시켜 유전자를 증폭시킴으로써 EPO를 경제적으로 대량생산할 수 있다(Urlaub and Chasin Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216, 1980;Malik et al. DNA and Cell Biology 1, 453-459, 1992).

그러나, 종래의 EPO 생산에 사용되는 CHO 유래의 형질전환세포주들로부터 EPO를 대량생산하기 위하여서는 배양시 단계적으로 MTX의 농도를 높여 가며 오랜기간 배양해야 하므로 EPO를 대량생산 하기까지 생산시간이 많이 걸리고 생산비용이 높아지며 세포의 성장이 저하되는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 낮은 MTX 농도에서 MTX 적응기간을 줄이면서 고역가의 인간 EPO를 경제적으로 얻을 수 있는 재조합 세포주들을 개발하고 이 세포주로부터 EPO를 제조하는 방법에 대하여 연구한 결과, dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV40 프로모터의 128-270 부위를 제거하여 발현벡터 pRc/CMV에 삽입하여 발현벡터 pCMV-dhfr를 제조하여으며, 이 pCMV-dhfr에 인간 EPO 유전자를 클로닝하여 CHO 세포에 형질전환시켰을 때, 보다 낮은 농도의 MTX 힘유배지에서도 충분량의 고역가의 인간 EPO를 생성함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

[발명의 구성]

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV 40 프로모터는 강력하고 발현이 용이하므로 여러가지 생리활성 물질의 제조에 사용될 수 있다. 그러나, dhfr 유전자가 들어있는 세포를 증폭시키기 위해서는 MTX 농도를 낮은 농도에서 점점 고농도로 올려가면서 세포주를 적응시켜야 하는데 이와같이 MTX 농도를 고농도로 하여 증폭시키기 위해서는 많은 시간이 걸리며, 또한 고농도의 MTX 농도에서는 세포의 생장이 저해된다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자는 dhfr 유전자가 저농도의 MTX에서 발현될 수 있는 방법을 연구한 결과 dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV 40 프로모터의 128-270 부위를 제거하여 pRc/CMV에 삽입하여 만든 발현벡타 pCMV/dhfr를 이용하면 저농도의 MTX 함유배지에서도 원하는 물질이 발현되고 증폭됨을 발견하였다. 다시 말하면, dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV 40 프로모터의 인핸서 부위를 제거하면 증폭을 위한 세포의 적응시 MTX의 낮은 농도에서 시작할 수 있으며, 또한 시작후 낮은 농도에서 곧 증폭이 이루어짐을 발견하였다.

이와같이 본 발명에 의한 pCMV/dhfr은 여러가지 생리활성 물질의 제조에 이용할 수 있으니, pCMV/dhfr에 희망하는 생리활성 물질의 유전자를 연결하여 발현벡타를 만든후 이것으로 형질전환시켜 얻은 세포를 배양하면 희망하는 물질을 만들 수 있다.

본 발명에서는 상기한 pCMV/dhfr을 제작하고, 이것을 이용하여 EPO를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

EPO에는 두가지 타입의 유전자, 즉 유전자형 EPO(genomic EPO)와 cDNA형 EPO가 존재하므로 각각을 pCMV-dhfr에 클로닝하여 발현벡터 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr를 얻고, 이 발현벡터로 CHO세포주를 형질전환시켜서 얻은 세포주 g2 또는 EC1을 MTX를 함유하는 α-MEM 배지에서 배양하여 생물학적 특성을 갖는 인간 EPO를 얻는다.

본 발명의 내용을 실시예에 의거하여 상세히 설명하고자 한다.

아래 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐, 본 발명의 내용이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

1. 벡터 pCMV-dhfr의 제조

[실시예 1]

(벡터 pCMV-dhfr의 제조)

dhfr cDNA가 연결되어 있는 공지의 pSV2-dhfr(Subramani 등, Molecular and Cellular Biology 1, 854-864(1981)에서 SB40 promoter의 인핸서를 제거하기 위하여 pSV2-dhfr를 제한효소 SphⅠ로 처리하여 SV40 프로모터의 128-270 부위를 제거하고 양끝을 수식하여 단면말단(blunt end)으로 만들어 준 다음 XbaⅠ 링커를 붙이고 XbaⅠ 제한효소로 절단하고 다시 라이게이션하여 pSV2-dhfrΔE를 제조하였다. 다시 이 플라스미드 pSV2-dhfrΔE를 XbaI과 BamHI으로 절단하여 얻은 XbaⅠ-BamHI DNA 절편을 Klenow로 처리한 후 BamHI 링커를 이용하여 pRC/CMV(Invitro사 제품)의 Bg1 II 제한효소 위치에 CMV 프로모터의 전사방향과 반대방향으로 삽입하여 pRC/CMV-dhfr를 제조하였다. 이 플라스미드의 다클로닝부위(multicloning site)를 더 보강해주기 위하여 pcDNA(Invitro사 제품)의 HindIII-SmaI 절편을 pRc/CMV-dhfr의 HindIII-SmaI 위치에 대치시켰다. 그 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr이라 명명하고(제1도 참조), 1995년 6월 22일에 한국과학기술원에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 8671P).

Ⅱ. 유정자형 EPO 유전자(EpoG)의 분리

[실시예 2]

(게놈클론의 분리)

EPO 유전자가 클로닝되어 있는 Lambda hEl DNA(ATCC 40381)를 제한효소 HindIII와 BamHI으로 절단하여 얻은 5.4kb의 EPO 유전자를 pBlue KS(Stratagene사 제품)에 끼워넣어 EPO 유전자를 갖고 있는 플라스미드 pBlue KS/EpoG를 제조하였다.

[실시예 3]

(EpoG 제한절편의 분리)

실시예 2에서 얻은 플라스미드 pBlue KS/EpoG를 제한효소 BstEII, BgIII로 절단하고, klenow로 EPO를 함유하고 있는 DNA 조각을 수식하였다. 이를 EpoG로 명명하여다(제2도 참조).

Ⅲ. cDNA형 EPO 유전자(EpoC)의 형성

[실시예 4]

(EPO cDNA의 합성)

EPO cDNA를 합성하기 위하여, 10쌍의 올리고 DNA를 합성하고 정제한 후, 카이네이션(kination)하여 어닐링(annealing)시킨 다음, 각가의 카세트를 만들었다. 10개의 카세트를 45℃로 3분동안 가열하고, T4 DNA 리가제로, 25℃에서 가이게이션하여 아가로오스젤에서 전기영동을 하였다. 600dp 부근의 DNA를 회수하고, 프라이머 1과 2를 사용하여 PCR 반응을 한 후 합성된 600dp DNA를 pBluescrip SK+(Stratagene사 제품)의 SmaI에 끼워 넣었다. 이를 pBlue SK+/EpoC로 명명하였다(제3도 참조).

[실시예 5]

(EpoC 제한절편의 분리)

Kozak 염기서열의 일부와 제한효소 HindIII의 절단부위를 포함하도록 프라이머 21을 제조하였다. 프리이머 21:5'-GGA AGC TTA GGC GCG GAG ATG GGG GTG CAC GAA TGT-3'

제한효소 ApaI의 절단부위를 포함하도록 프라이머 22를 제조하였다. 프라이머 22:5'-ACT GGG CCC TGG TCA TCT GTC CCC TGT CCT-3' 상기 두 개의 프라이머를 이용하여 상기 EpoC를 PCR 방법으로 증폭하고, 제한효소 HindIII와 ApaI으로 절단하여 EpoC를 얻었다(제2도 참조).

Ⅳ. 발현벡타 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr의 제조

실시예 1에서 얻은 플라스미드 pCMV-dhfr에 실시예 3에서 얻은 유전자형 EPO 유전자인 EpoG 또는 실시예 5에서 얻은 cDNA형 유전자인 EpoC를 클론하여 발현벡타 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr를 얻었다.

[실시예 6]

(pEpoG-dhfr의 제조)

플라스미드 pCMV-dhfr를 제한효소 HindIII와 ApaI으로 절단하고 klenow로 수식하고, 실시예 3에서 준비한 EpoG를 첨가하여 플라스미드 pEpoG-dhfr를 얻었다(제2도 참조). 이것을 1995년 7월 18일에 한국과학기술원에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 0181BP호).

[실시예 7]

(pEpoC-dhfr의 제조)

실시예 1에서 얻은 플라스미드 pCMV-dhfr에 실시예 5에서 얻은 EpoC를 연결하여, 플라스미드 pEpoc-dhfr를 얻었다(제2도 참조). 이것을 1995년 7월 18일에 한국과학기술원에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 0180BP호).

Ⅴ. 형질전환체 g2 또는 ECl의 제조

실시예 6 및 실시예 7에서 얻은 발현벡터 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr로 세포주 CHO dhfr 돌연변이체(ATCC CRL 9096) 세포에 형질 전환시켜 인간 EPO 생성능력을 가진 형질전환체 g2 또는 ECl를 얻었다. 이 세포들을 MTX를 함유하는 α-MEM배지에서 배양하였다.

[실시예 8]

(변이주 CHO 세포의 배양)

배양액-송아지 혈청 10%가 첨가된 DMEM/F12 배지(기브코사 제품)에 hypoxanthin 10ug/ml, thymidine 10ug/ml, glycine 50ug/ml, glutamine 587ug/ml, glucose 4.5mg/ml, penicillin-streptomycin 100IU/ml(시그마사 제품)를 첨가하였다-에 탄산개스가 5% 유지되도록 37℃에서 계대배양한 CHO(dhfr 변이주) 세포를 원심분리기를 이용하여 회수하였다. 지름 6cm의 접시에 5×10⁵cells/ml 되도록 접종하고, 다음날 OPTI MEM I(기브코사 제품)으로 2회 세척하였다.

[실시예 9]

(형질저노한체 g2 또는 ECl의 제조)

실시예 6 및 7의 플라스미드 5ug을 OPTI MEM I 1.5ml에 희석하고, 동량으로 희석한 Lipofectin(기브코사 제품) 20ug을 혼합하여 10분간 방치한 뒤, 준비한 CHO 세포 위에 골고루 넣어주었다. 37℃, 5% 탄산개스 항온기에서 6시간 배양하고, 송아지 혈청 20%를 포함하는 DMEM/F12 배지를 3ml 첨가하고, 24시간 더 배양하였다. .25% 트립신(기브코사 제품)을 처리하고, 원심 분리하여 얻어진 세포를 웰당 2×10⁴cell 되도록 96웰 플레이트에 분주하였다. 투석된 혈청(기브코사 제품 26300-020) 10%, G418 550ug/ml을 함유하는 α-MEM 배지(기브코사 제품)를 펌가하여 배양하고 4일 간격으로 배지를 갈아주면서 2주간 배양하였다. 생존한 각 클론들을 수십개 얻었고, 각 클론의 EPO 생산능력을 측정하기 위하여 생쥐 항-인간 EPO 항체(ATCC CRL8164)의 하이브리도마의 배양액을 본 연구실에서 분리·정제한 것임)와 과산화효소와 결합된 염소 항-생쥐 IgG 항체(Sigma사 제품)를 이용하여 간접 이라이자 방법(Engvall perlman, J. Immunol. 109, 129(1972)을 행한 결과, 상기 발현벡터 pEpoG-dhfr이나 pEpoC-dhfr를 함유한 형질전환체들 중에서 EPO를 가장 많이 생산하는 세포주 g2나 ECl을 선별하였다.

상기 세포주 g2 또는 ECl을 1995년 7월 19일에 한국과학기술원에 기탁하였다(KCTC 0183BP호, 0182BP호).

[실시예 10]

(세포주 g2 또는 ECl의 인간 EPO의 생산량측정)

실시예 9에서 선별한 세포주 g2, EC1 각각을 1×10⁶cell 취하여 지름 10cm 접시에 옮기고, 메토트렉세이트(MTX) 20nM을 함유하는 α-MEM배지에서 4일 간격으로 배지를 교환하면서 2주간 배양하였다. 이 농도의 MTX에서 적용한 세포들을 각각 g2-20과 ECl-20이라 명명하였다.

이 g2-20과 ECl-20의 EPO 생산량을 측정한 결과, g2-20은 23μg/10⁶cell1s/24hr을, ECl-20은 45μg/10⁶cells/24hr의 특이적 생산성을 나타내었다. 이 EPO의 정량은 세포배양애을 실시예 11에서와 같은 정량방법을 이용하여 결정하였다.

[실시예 11]

(EPO의 정량방법)

베링거 만하임사의 EPO-ELISA 키트를 사용하여 EPO를 정량하였다.

EPO에 대한 항체를 코팅한 플레이트에 세포배양액을 몇 개의 농도로 첨가하고, 퍼옥시다제가 결합된 EPO 모노클로날 항체를 첨가하였다. ABTS로 발색시킨 후 405nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이때, 배양액에 존재하는 EPO의 양을 정량하기 위하여 키트에서 제공하는 정제된 EPO의 표준량을 배양액 시료들과 같이 정량하고, 이들로부터 표준곡선(standard curve)을 구한 후 시료의 EPO가 나타내는 ELISA 값에 해당하는 EPO의 양을 결정하였다.

Ⅵ. 인간 EPO의 분리 및 정제

[실시예 12]

(인간 EPO 정제)

실시예 10에서 얻은 형질전환체 g2-20 또는 ECl-20 각각을, 투석시킨 혈청이 10% 함유된 α-MEM에서 1∼2일 배양한 후 무혈청배지인 SFMII(기브코사 제품) 배지로 치환하여 5일간 배양하였다. 배양애에 동량의 황산암모늄 포화용액을 첨가하여 얻은 침전물을 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.6)에 녹이고, 이틀간 동일한 완충액에 투석하였다. 모노-Q 칼럼을(Pharmacia사 제품)을 이용하여 FPLC에서 염기올기법에 의해 0.25M 소금에 첨가된 완충액을 이용하여 EPO을 1차로 분리하였다. 1차 분리된 EPO의 시료를 더 정제하기 위하여 다시 세파크릴-200 칼럼에 주입하고 세척액(50mM 트리스완충액에 0.5M 소금, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF를 첨가한 것, pH 7.5)으로 세척하여 gel filtration을 수행하여 EPO를 정제하였다. EPO의 정제도는 15% SDS-PAGE(A)와 웨스턴 블럿팅(B)에 의해 확인되었다(제4도 참조).

제4도에서 레인 M은 단백질 분자량에 대한 기준이고, 레인1은 모노-Q컬럼 후에 분리된 EPO이고, 레인2는 세파크릴-200컬럼 후에 정제된 EPO이다.

Ⅶ. 인간 EPO의 생물학적 특성의 검정

EPO의 활성검정은 EPO에 민감하게 반응하여 증식하는 세포주를 이용하는 방법과 생쥐의 비장세포 증식에 따라 활성을 측정하는 방법으로 실시되었다.

[실시예 13]

(EP-FDC-P₂세포주를 이용하여 검정하는 방법)

먼저 EPO에 대해 민감하게 반응하여 증식하는 세포주로써 EP-FDC-P₂세포(Dr, Ryuzo Sasaki, 일본 교토대학 식품공학과 교수로부터 받음)를 이용하여 MTT방법(Tasuda et al. Acta Haematol. JPN, 53, 1045, 1990 )에 의한 EPO의 생체외 세포활성을 조사하였다(제5도). 96웰 플레이트에 4×10⁴cells/well로 세포를 현탁시키고 각 웰에 EPO 표준품(베링거 만하임사)과 본 발명에서의 시험액을 첨가하였다. 37℃, CO₂인큐베이터에서 20시간 배양시킨 뒤 MTT용액(5mg/ml)을 각 웰에 10μl씩 첨가하고 다시 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 0.04N 염산을 녹인 이소프로판을 용액을 0.1ml씩 넣은 후 20분 뒤 3% SDS 용액을 다시 첨가하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 본 발명을 통하여 얻은 EPO가 EPO 표준폼과 거의 동일한 생물학적 활성을 갖음을 확인하였다(제5도).

[실시예 14]

EPO 활성검정을 위해 생쥐의 비장세포에 대한 증식활성을 측정하였다(Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7972, 1987)(제6도). C57BL/6과 C3 11의 F1 교잡종 생쥐에 체중 kg당 페닐히드라진을 60mg씩 이틀간 투여하고, 3일후 생쥐를 희생하여 비장을 적출하였다. 인산완충액으로 호모게나이즈시키고, 1:2의 비율로 lymphopreparation soluton에 적가한 후 2000rpm에서 원심분리하여 경계면에 모인 세포들을 회수하였다. 24웰 플레이트에 4×10⁴cells/ml 되도록 lymphopreparation solution 배지에 현탁시키고, EPO 표준물질(베링거만하임사)과 본 발명에서의 시험액을 처리하였다. 22시간 후³H-thymidine(2uCi/well)을 첨가하고, 2시간 후 세포를 회수하였다. 인산완충액으로 2회 세척하고, 메탄올로 고정시킨 후, 0.1% SDS를 함유하고 있는 0.3N 가성소다액으로 세포를 파쇄하였다. LSC solution을 가하고, Liquid Scintillation Counter 기계로 정량하였다.

그 결과 본 발명을 통하여 얻은 EPO가 EPO 표준품과 거의 동일한 생물학적 활성을 갖음을 확인하였다(제6도).

실시예 13 및 실시예 14에서 알 수 있는 바와같이, 본 발명에 따라 제조된 EPO는 인간 EPO의 생물학적 특성을 가지고 있다.

본 발명의 방법에 따라, dhfr 유전자를 SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 만든 프로머트를 연결시켜서 제조한 발현 벡타 pCMV-dhfr의 CMV 프로모터에 유전자형 EPO 또는 cDNA형 EPO 유전자를 클로닝하여 얻은 발현벡터 pEpoG-dhfrR 또는 pEpoC-dhfr로 dhfr 변이주 CHO 세포를 형질전환시켜 얻은 재조합 세포주 g2 또는 ECl을 선별하여, 이 재조합 세포주 g2 또는 ECl을 20nM MXT가 함유된 α-MEM 배지에서 적응시켜 배양하면, 인간 EPO의 생물학적 특성을 갖는 EPO를 g2-20은 23μg/10⁶cells/24hr 그리고 ECl-20은 45μg/10⁶cells/24hr의 고농도로 얻을 수 있다.

dhfr 유전자를 발현벡터로 하여 같은 종류의 dhfr-CHO 세포주에서 EPO 유전자를 발현시킨 경우에는, 30nM, 50nM, 100nM, 200nM, 1μM까지의 MTX 농도에서 단계별로 적용시켜가며 배양시킨 후 1μM MTX 농도에서 적용한 세포의 생산성은 21μg/10⁶cells/48hrs이었다(W0 85/02610), 기린-암젠 특허, 특허명 에리트로포이에틴의 제조).

이와같은, 본 발명의 방법에 의하여 얻은 g2-2-과 ECl -20의 생산성은 종래의 방법으로부터 얻은 CHO 세포주의 EPO 생산성보다 약 50-110%의 높음을 알 수 있다.

dhfr 유전자를 갖고 있는 세포주에서 원하는 유전자를 발현시키기 위해서는 MTX 농도에 적용시키는 단계, 즉 MTX 농도를 높여가면서 유전자를 증폭시키는 과정이 필요한데, 보통 1단계에서 농도를 4배씩 올리며 2주일∼1개월 정도 배양해야 한다. 종래의 방법에서는 30nM에서 1μM까지 증폭시키는 데 6개월 이상의 기간이 소요된다. 그러나 본발명의 방법에 의하면 시작농도가 낮고 20nM에서 곧 증폭이 많이 되므로 소요시간이 1개월 미만으로 줄게되므로 매우 간단하고 용이하고 경제적으로 고농도의 EPO를 생산할 수 있다는 장점이 있다.

상기한 바와같이, 본 발명의 발현벡터 pCMV-dhfr을 이용하여 얻은 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr로 형질전환 세포주 g2 또는 ECl을 저농도의 MTX가 함유된 배지에서 배양하여 EPO를 제조할 경우, 종래의 방법에 비하여 고역가의 EPO를 간단하고, 용이하게 경제적으로 얻을 수 있다.

Claims

SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 만든 프로모터에 연결시킨 dhfr 유전자를 함유하며 CMV 프로모터에 다클로닝부위(multi cloning site)를 연결시킨 벡터 pCMV-dhfr(KCTC 8671P).
제1항의 벡터 pCMV-dhfr에 유전자형 EPO 유전자를 삽입시켜 얻은 pEpoG-dhfr 플라스미드(KCTC 0181BP).
제1항의 벡터 pCMV-dhfr에 cDNA형 EPO 유전자를 삽입시켜 얻은 pEpoC-dhfr 플라스미드(KCTC 0180BP).
제2항 또는 제3항의 플라스미드로 안정하게 형질전환되어 인간 에리트로포이에틴을 생성하는 능력을 갖는 포유류 유래 진핵세포인 형질전환체.
제4항에 있어서, pEpoC-dhfr 플라스미드로 형질전환된 것을 특징으로 하는 g2 형질전환체(KCTC 0183BP).
제4항에 있어서, pEpoC-dhfr 플라스미드로 형질전환되 것을 특징으로 하는 ECl 형질전환체(KCTC 0182BP).
제4항에 있어서, 진핵세포가 dhfr CHO 변이 세포주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제4항의 형질전환체를 배양하여 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 배양액이 MTX가 함유된 α-MEM 배지인 것을 특징으로 하는 인간 에리트포포이에틴을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, MTX 농도를 20nM 이하로 유지하는 조건으로 세포주 g2-20을 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 세포주로 g2-20은 MTX 농도에서 적응된 g2 형질전환체인 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, MTX 농도를 20nM 이하로 유지하는 조건으로 세포주 ECl-20을 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.
제12항에 있어서, 세포주 ECl-20은 MTX 농도에서 적응된 ECl 형질전환체인 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.