KR20120043657A

KR20120043657A - 인간 혈액응고 7인자의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR20120043657A
Application number: KR1020110109882A
Authority: KR
Inventors: 김창환; 홍성갑; 이병선; 홍성환; 권세창
Original assignee: 한미사이언스 주식회사
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2012-05-04
Also published as: ES2597966T3; TW201307382A; JP2013544080A; TWI541252B; WO2012057527A2; AR083569A1; EP2633058A4; EP2633058A2; JP2017042168A; JP6088974B2; US20130273634A1; US9243237B2; WO2012057527A3; KR101380728B1; EP2633058B1

Abstract

본 발명은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주에 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법 및 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 DHFR 프로모터 부위의 GC-리치(rich) 반복서열이 결실된 벡터를 이용하여 인간 혈액응고인자 7인자를 고효율 및 대량으로 발현시킬 수 있으므로, 혈우병 치료제의 제조에 유용하게 응용될 수 있다.

Description

인간 혈액응고 7인자의 대량 생산 방법{Method for mass production of Factor VII/VIIa}

본 발명은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주에 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법 및 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 세포주에 관한 것이다.

인간 혈액응고 7인자(Factor VII; FVII)는 간에서 생산되어 혈액으로 분비되어 혈액응고 10인자(Factor X) 또는 혈액응고 9인자(Factor IX)를 활성화시킴으로 혈액을 응고시키는 세린 프로테아제(serine protease)의 전구체이며, 분자량 50,000 Da인 단일 사슬 당단백질이다. FVII은 10a인자(Factor Xa), 12a인자(Factor XIIa), 9a인자(Factor IXa), 트롬빈(Thrombin)에 의해 두 개의 사슬 형태로 분해된 7a인자(Factor VIIa)으로 활성화 형태가 된다. 7a인자는 조직인자(tissue factor), 음전하를 띤 인지질 A에 결합함으로써 효소 활성이 강화된다고 알려져 있다(Nemerson et al, Thromb. Res, 1985, 40:351~358).

생체 내에서 7a인자(Factor VIIa)는 조직인자, 칼슘이온 존재하에서 10인자를 10a인자로 전환시키고, 10a인자는 5a인자, 칼슘이온, 인지질의 존재하에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전화되어 혈액응고가 일어나게 된다.

7인자는 총 406개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 아르기닌 (152)과 아이소루우신 (153)사이의 단일 펩타이드 본드 사이의 잘림에 의해서 7a인자로 전환된다. 그 결과 light 체인 (152개의 아미노산 잔여물)과 heavy 체인 (254개의 아미노산 잔여물)이 다이설파이드 결합으로 연결된 구조를 가지게 된다. light 체인은 감마 카르복실 글루타민산 도메인 (Gla)와 2개의 EGF(epidermal growth factor) 도메인이 있으며 heavy 체인은 세린 프로테아제 작용부위가 있다.

7a인자의 생물학적 활성에 관여하는 N-말단의 10개 감마 카르복실 글루타민산을 형성시키기 위해서는 비타민 K가 요구되어 진다.(Hagen et al, Natl.Acad. SC. U.S.A, 1986, 83:2412~2416). 이 Gla-도메인은 조직인자를 포함하고 있는 세포 표면에 7인자가 결합하는데 관여하는 것으로 알려져 있다.(Sakai et al, J.Biol Chem, 1990, 265:1890~1894)

현재 7a인자를 생산하는 방법은 두 가지가 있다. 첫 번째 방법은 혈장으로부터 7인자를 분리 정제한 후 7a 인자로 활성화시키는 것이며(Broze et al, J. Biol.Chem, 1980, 225:1242~1247), 두 번째 방법은 7인자에 해당하는 DNA 서열을 주입한 동물세포의 배양을 통하여 얻는 것이다(Europena patent application no,86302855.1).

혈장 유래 제품은 제조 시 낮은 효율성과 공급의 불안정성을 갖고 있으며, 특히 안전성의 측면에서 많은 위험성을 내포하고 있다. 이에 반해, 유전자 재조합 제품은 유전공학 기술을 이용해 혈장 유래 제품의 단점을 극복할 수 있다.

하지만, 7인자를 유전자 재조합 기술을 이용하여 동물 세포주에서 생산하는 경우 대부분 발현 양이 적어 높은 생산성을 나타내기 어려운 문제점이 있다. 따라서 7인자를 치료제로서 사용하기 위해서는 안정적으로 대량 생산이 가능한 세포주의 확보가 필수적이며, 이런 세포주를 확보하기 위해서는 고효율로 발현할 수 있는 발현 벡터의 개발 또한 필수 불가결하다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 혈액응고 7인자를 대량 생산할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터 부위의 GC-리치(rich) 반복서열이 결실된 벡터를 이용하여 Factor VII를 고효율로 발현시킬 수 있는 동물 세포주용 발현 벡터를 제작하고, 이러한 발현 벡터로 동물 세포주를 형질 전환하여 Factor VII를 안정적으로 대량 생산할 수 있는 단클론 형질 전환체를 제작하고, 단클론으로부터 Factor VII의 생산 양을 증가시키기 위해 소디움부틸레이트를 저농도에서 고농도까지 다양한 농도로 첨가하여 배양한 결과 비교적 고농도의 소디움부틸레이트를 첨가하였을 때, Factor VII의 발현이 현저히 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주에 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 세포주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주에 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게 본 발명의 (a) 단계는 i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계를 포함하는 발현벡터를 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "GC-풍부 영역(GC-Rich region)"은 디하이드로폴레이트 환원효소의 전사조절인자인 프로모터에 포함된 CCGCCC 반복 서열을 의미하는 것으로, 이 반복서열을 전부 또는 일부를 결실, 변이 등에 의한 방법으로 인위적으로 결손시키면 디하이드로폴레이트 환원효소의 발현은 최소한으로 이루어지게 된다. 이 때, 발현이 최소로 유지된 상태에서 디하이드로폴레이트 저해제를 첨가하는 경우, 세포는 생존을 위하여 더 많은 수의 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자를 증폭하게 되고, 따라서, 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자를 포함하는 발현 벡터 내에 포함된 목적 재조합 유전자 또한 동시에 증폭되어 고발현되는 것으로 관찰되었다.

따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, CCGCCC 반복서열이 하나 이상 제거된 프로모터를 포함하는 디하드로폴레이트 환원효소 유전자의 염기서열을 포함하는 고발현 유도 카세트를 제공한다. 바람직하게, 상기 고발현 유도 카세트는 6 개 이하의 CCGCCC 반복서열을 포함하는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터를 포함하며, 더욱 바람직하게는 3 개 이하의 CCGCCCC 반복 서열을 포함하는 프로모터를 포함하고, 특히 바람직하게는 1 개 이하의 CCGCCC 반복 서열을 포함하는 프로모터를 포함하며, 더욱 특히 바람직하게는 CCGCCC 반복 서열 전부가 제거된 프로모터를 포함한다.

이들 CCGCCC 반복서열의 제거는, 당 업계에 널리 알려져 있는 유전자 재조합 기술에 따른 염기서열의 치환이나 결실 등의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시예에서는 CCGCCC 반복서열을 포함하는 염기 서열의 일부를 결실시키는 방법에 의하여 프로모터 내 GC-풍부 서열의 일부 또는 전부를 제거하였다.

본 발명에서 용어, "디하이드로 폴레이트 환원효소"는 NADPH를 전자공여체로, 디하이드로폴릭 산을 테트라하이드로폴릭 산으로 환원하는 효소를 말한다. 인간에서는 DHFR 유전자에 의해 암호화되어 있다.

본 발명에서 용어, "인간 혈액응고 인자"는 상처로 인한 출혈 시 혈액 응고를 통해 신체를 보호하는 작용을 하는 혈액응고 관련 단백질로, 혈액응고는 이러한 단백질의 12인자가 관여하여 일어나는 일련의 반응이다. 본 발명의 목적상 본 발명은 혈액 응고인자 중 7인자를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "인간 혈액응고 7인자"는 프로콘버틴(Proconvertin)이라고도 하며, 간에서 합성하며 분자량은 50,000 Da를 갖는 열에 불안정한 단백질로 혈액 내 농도는 20~40 mg/㎖인 단백질이다. 이와 같은 7인자는 7a로 활성화시켜 혈액 응고를 시킬 수 있는 혈액 응고제로 사용할 수 있다. 혈액응고 7인자는 혈액 응고 7인자의 활성을 나타낼 수 있는 공지의 서열과 70%, 80%, 90%, 95% 바람직하게는 97%의 서열 상동성을 갖는 유전자를 제한 없이 포함한다. 바람직하게는 서열번호 3일 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64). 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "발현벡터"는 상기 혈액응고 인자들을 발현시킴으로써 목적하는 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있는 것으로, i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터일 수 있으며 바람직하게는 도 1에 기재된 pXOGC-FVII인 것을 특징으로 하는 벡터일 수 있다. 그 예로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.

상기 발현 벡터는 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 더 포함할 수 있으며, 이러한 발현 벡터를 발현시킴으로써 목적하는 인간 혈액응고 7인자를 고효율로 발현시킬 수 있다.

상기 인간 혈액응고 7인자는 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 혈액응고 7인자는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절된다. 이러한 프로모터로는 당 업계에 널리 알려진 것으로서, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터 및 TK 프로모터로 구성되는 군으로부터 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이며, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 발현 벡터는 동물세포주에서의 고발현을 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게 동물세포에서의 영구적인 발현을 위한 선택 표지 인자로 사용되는 동물세포주용 저항성 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 동물세포주용 저항성 유전자로는 통상적으로 당업계에서 사용하는 동물세포주용 저항성 유전자인 네오마이신 저항성 유전자, 제오신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자 및 블라스시스틴 저항성 유전자 등이 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이 외에도, 본 발명의 발현 벡터는 또한 일반적인 벡터의 구성요소들, 예를 들어 복제원점 및 다중 아데닐레이션 신호와 기타 전사 조절인자 등을 더 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

바람직하게 본 발명의 (b) 단계는 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "형질전환" 또는 "형질감염"은 외부 유전자가 숙주세포로 도입되어 도입된 유전자가 그 자체로 복제될 수 있거나, 숙주 게놈안으로 삽입되어 일어나는 인공적 유전적 변이를 모두 가리킨다.

상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

구체적으로 본 발명에서는 CHO 세포에 리포펙타민을 이용하여 재조합 단백질을 발현하는 벡터를 세포 안으로 형질전환하였다.

또한, 본 발명에서 동물세포주의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 동물세포주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을, 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 세포주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

동물세포 배양에 있어 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산과 같은 유기산이 포함된다, 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.

또한 상기 배지에는 메토트렉세이트(Methotrexate)와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제가 첨가될 수 있다. 이는 상기한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 단백질 재조합 방법은 디하이드로폴레이트 환원효소가 결실된 동물세포주에 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환하고, 재조합 유전자를 증폭하기 위해 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 첨가하여 벡터 내의 디하이드로폴레이트 환원효소가 증폭되어 선택될 수 있도록 하는 시스템을 단기간에 효율적으로 구현하는데 그 목적이 있기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 디하이드로폴레이트 저해제의 경우 세포주의 안정성과 경제성을 고려하여 가급적 낮은 농도로 짧게 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 낮은 농도로 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 사용함으로써 대량 생산을 하는 경우의 안정성과 짧은 생산 세포주 개발 기간을 가능하게 한다. 구체적으로, 본 발명은 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 중국 햄스터 난소 세포주에 상기의 재조합 단백질 발현벡터를 형질전환하여 100nM 이하의, 바람직하게는 50nM 이하 농도의 메토트렉세이트를 사용하는 인간 혈액응고 7인자의 제조방법을 제공한다.

이들 목적하는 재조합 단백질은 동물세포주에서의 발현이 요구되는 것으로서, 이러한 목적에 비추어, 본 발명에서 사용 가능한 바람직한 동물세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO : Chinese hamster ovarian cacer)세포주, 원숭이 신장 세포 7(COS7 : Monkey kidney cells) 세포주, NSO 세포주, SP2/0 세포주, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : Baby hamster kidney) 세포주, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포등을 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 기술자라면 본 발명의 디하이드로폴레이트 환원 효소를 이용한 증폭 기술에 적용가능한 적절한 동물세포주를 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 바람직하게 본 발명에서는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자가 결핍된 것을 특징으로 하는 세포주일 수 있다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 재조합 포유동물 세포, 설치류 세포, 바람직하게는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 CHO 세포일 수 있다. 숙주 세포가 CHO 세포인 경우, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포내에서의 유전자의 카피 수(copy number)의 증폭을 목적으로 하기 때문에, 염기 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)에 의해 증폭시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "숙주"는 동물을 포함한다. 동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다. 또한, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를 삽입한 바큘로바이러스(Baculovirus)를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다(Nature, Vol.315, p.592-594, 1985). 바람직하게 본 발명에서는 CHO 세포를 숙주로 사용하였다.

보다 구체적으로는 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 중국 햄스터 난소 세포주(CHO/dhfr-)를 사용하였다. 즉, 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 CHO 세포주에 인간 혈액응고 7인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환하여, 100nM 이하의, 보다 바람직하게는 50nM 이하의 낮은 메토트렉세이트 농도에서도 충분한 수의 유전자가 증폭되어 생산성이 검증된 동물 세포주를 제공한다.

바람직하게 본 발명의 (c) 단계는 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자를 발현하는 세포주를 선별하는 단계이다.

바람직하게, 선별된 세포주는 HMF708 (KCTC 11779BP) 일 수 있다. 상기 HMF708 균주를 2010년 10월 25일에 한국생명공학연구원 생물자원센터(대한민국 대전시 유성구 과학로 111 한국생명공학연구원)에 기탁번호 KCTC 11779BP로 기탁하였다. 선별된 세포주는 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 14360C)를 이용하여 부유배양에 적응시켰다.

또한, 바람직하게 본 발명의 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 선별된 동물 세포주에 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "소디움부틸레이트"는 히스톤 디아세틸라아제의 억제를 통한 히스톤의 과아세틸레이션을 야기하는 것으로 알려진 물질로, 세포의 분화 및 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 인간 혈액응고 7인자를 대량으로 생산하기 위한 배지 첨가제로 사용되었으며, 첨가량은 배양조건에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있으며, 바람직하게 0.1 내지 3.0 mM의 농도로 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1.5 mM의 농도로 첨가될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 CCGCCC 반복서열을 하나만 가지는 고발현 유도 카세트 및 CCGCCC 반복서열을 전혀 포함하지 않는 고발현 유도 카세트를 각각 제조하였으며, 이들 발현카세트를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 E.coli 세포주를 제공한다. 이들 세포주는 본 발명자들의 선행 발명을 통해 2006년 10월 2일자로 대한민국 대전시 유성구에 소재하는 생명공학연구원 내 유전자은행에 수탁번호 KCTC 10991 BP 및 KCTC 10992 BP로서 각각 기탁하였다. 이들 세포주는, 원하는 목적 재조합 단백질의 고발현을 유도하기 위하여, 상기 세포주로부터 상기한 고발현 유도 카세트를 포함하는 발현벡터를 분리하여 유전자 재조합 기술 등에 의한 클로닝 방법으로, 인간 혈액응고 7인자 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 발현벡터의 제작에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용된 발현벡터는 바람직하게 도 1에 기재된 pXOGC-FVII 벡터를 제작하고, 소디움부틸레이트가 첨가된 배양배지에서, CHO세포를 이용하여 원하는 인간 혈액응고 7인자를 대량으로 생산하였다.

본 발명에서 생산되는 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열은 바람직하게 서열번호 3의 염기서열일 수 있다.

상기 인간 혈액응고 7인자 단백질은 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 혈액응고 7인자 단백질은 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절된다. 이러한 프로모터로는 당 업계에 널리 알려진 것으로서, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터 및 TK 프로모터로 구성되는 군으로부터 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이며, 이들에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기에서 기술한 세포주로부터 인간 혈액응고 7인자를 생산하는 경우, 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하여 생산한 인간 혈액응고 7인자를 대량으로 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 생산된 인간 혈액응고 7인자를 활성화하는 단계를 포함하는 활성화된 인간 혈액응고 7인자를 제조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 GC-풍부 서열을 인위적으로 결손시켜 발현이 최소한으로 이루어 질 수 있게 한 후 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 첨가하여 유전자를 증폭시켰다. 유전자 증폭이 이루어진 세포주들 중 한 개의 세포로부터 기원한 클론을 얻기 위하여 한계 희석을 실시하여 단클론 세포주를 획득하고, 이를 대량 배양하여 무혈청 배지에서 소디움부틸레이트를 첨가하여 인간 혈액응고 7인자를 생산하였다. 아울러, 정제 및 활성화된 인간 혈액응고 7인자를 생산하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 혈액응고 7인자를 생산하는 세포주를 제공한다. 바람직하게는 HMF708(기탁번호 KCTC 11779BP) 세포주일 수 있다.

본 발명은 DHFR 프로모터 부위의 GC-리치(rich) 반복서열이 결실된 벡터를 이용하여 인간 혈액응고인자 7인자를 고효율 및 대량으로 발현시킬 수 있으므로, 혈우병 치료제의 제조에 유용하게 응용될 수 있다.

도 1은 hFVII 발현 벡터의 제조과정 및 지도(map)를 나타낸 것이다.
도 2은 hFVII 발현 벡터로 형질전환된 세포주로부터 얻은 콜로니들의 효소면역측정법에 의한 hFVII 발현량을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 Factor VII 발현을 위한 발현 벡터( pX0GC - FVII )의 제조

<1-1> Factor VII 유전자의 증폭

동물세포 내에서 재조합 Fcator VII의 과 발현을 유도하기 위한 발현 벡터를 제작하였다. 인간의 Factor VII 유전자는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 기법을 이용하여 신호 서열을 포함하는 인간의 Factor VII 유전자 획득 하였다. Fcator VII 유전자 증폭을 위하여, 클론텍사(clontech, USA, 지금은 TAKARA BIO USA)로부터 구입한 인간 태아의 간(fetal liver) cDNA 라이브러리를 주형으로 하였고 서열번호 1 및 2의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. 클로닝 작업을 용이하게 하기 위하여 Factor VII 정방향 프라이머에는 제한 효소 BamH I 인식 부위를 삽입하였고, 역방향 프라이머에는 제한 효소 XhoI 인식부위를 삽입하였다. 상기 프라이머는 표 1에 나타내었다.

인간 Fcator VII 유전자 증폭을 위한 프라이머

Factor VII 프라이머	염기서열	서열 번호
정방향 프라이머 (VIIBHISS)	Cccggatccatggtctcccaggccctcaggctcc	1
역방향 프라이머 (VIIXhoIAS)	gggctcgagctagggaaatggggctcgcagg	2

중합 효소 연쇄 반응 튜브에 cDNA 라이브러리(100 ng), 프라이머, dNTP 및 pFX 폴리머라아제(Invitrogen)를 첨가하고, 95℃에서 1분간 변성 시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 68℃에서 90초간의 반응을 30회 반복한 뒤에, 최종적으로 68℃에서 5분간 반응시켰다. 얻어진 약 1.3kb의 PCR 산물을 DNA 시퀀싱을 통해 염기서열을 확인하였고, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것으로 확인하였다.

<1-2> 재조합 Factor VII 발현 벡터( pX0GC - FVII )의 제작

실시예 <1-1>에서 증폭된 Factor VII PCR 산물을 CMV 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 동물 세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터와 라이게이션(ligation)시켰다. 상기에서 사용된 pX0GC 벡터는 하나 이상의 CCGCCC 반복서열이 제거된 DHFR 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 DHFR을 암호화하는 염기서열을 포함하는 발현 벡터로서, 재조합 단백질의 고발현 유도를 위하여 제작된 벡터이다(대한민국 등록특허 제880509호 참조).

상기의 중합효소 연쇄반응을 통하여 획득한 약 1.3kb의 Factor VII 유전자를 제한효소 BamHI과 XhoI으로 처리하여 37℃에서 2시간 효소 반응 유도한 뒤, 퀴아젠(Qiagen, USA)사의 PCR 정제 키트를 사용하여 목적 DNA를 순수 분리 정제하였다. 또한 동물세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터를 상기와 동일한 조건에서 동일한 제한 효소 BamHI와 XhoI으로 처리하고, 전기 영동하여 분리 정제하였다. 상기 절편들을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 서로 연결하고, 이를 pX0GC-FVII로 명명하였다.

실시예 2: human factor VII 발현 세포주의 제조

<2-1> 세포주의 형질전환

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 human factor VII 발현벡터(pX0GC-FVII)를 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 CHO 세포주(CHO/dhfr-)(Urlaub et al., Somat . Cell . Mol . Genet ., 12, 555-566, 1986)에 형질도입시켜 human factor VII 단백질을 대량 생산할 수 있는 세포주를 제조하였다. 구체적으로, 배양중인 DG44-CHO(dhfr 결손) 세포(콜럼비아 대학의 Chasin 박사로부터 구입)를 T75 배양 용기에서 배양하며, 배양 용기 바닥의 80 내지 90 % 정도를 덮을 정도로 세포가 증식하였을 때, 리포펙타민(Gibco사, cat. no. 18324-012)을 이용하여 형질전환시켰다. 즉, 두 개의 튜브에 각각 3 mL의 Opti-MEM(Gibco사, cat. No. 51985034)을 넣고, 하나의 튜브에는 5 μg의 DNA를 넣고, 또 하나의 튜브에는 20 μL의 리포펙타민을 넣어 상온에서 30분 동안 각 용액을 정치한 후, 두 용액을 섞어 미리 Opti-MEM 배지로 3회 수세한 세포에 넣어 주었다. 상기 세포를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 약 18시간 동안 배양한 후, 다시 10% 우태아혈청(BSA)이 포함된 DMEM-F12(Gibco사, cat. no. 11330)로 3번 세척한 뒤, 배양 배지로 바꾸어 48시간 동안 배양하였다. 배양 용기 바닥에 거의 꽉차게 증식한 세포들을 트립신 처리를 통해 수득한 후, 형질도입된 세포만을 선별하기 위해 10%의 투석된 우태아혈청 및 1 mg/mL의 G418(Cellgro사, cat. no. 61-234 -RG)이 포함된 HT 보충제(Hypoxanthine-Thymidine)가 없는 MEM-α 배지(WELGENE사, cat. no. LM008-02)가 담긴 새로운 배양 용기로 옮겨 배양하였다. 형질도입된 세포들만이 살아남아 콜로니를 형성하여 증식할 때까지 2일 또는 3일 간격으로 배지를 교환하며 배양하였다.

<2-2> 효소면역 측정법을 이용한 human factor VII 발현 확인

상기 실시예 <2-1>에서 형질도입된 세포들의 일부를 24-웰 플레이트에 2×10⁴ 세포수/웰의 농도로 옮겨 배양 용기의 바닥을 거의 덮을 정도로 배양한 후, 0.3 mM의 소디움부틸레이트(sodium butyrate; Sigma사, cat. no. B5887)가 첨가된 무혈청 배지 CHO-A-SFM(Gibco사, cat. no. 05-5072EF)를 웰 당 200 μL씩 넣고 33℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 세포의 배양액을 1.5 mL 튜브로 옮긴 후 원심분리를 하여 상등액만 다시 모아서 human factor VII의 발현량을 측정하였다. 발현량 측정은 제조사의 프로토콜에 따라 효소면역 측정키트(American Diagnostica, cat. no. 877)를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 먼저 세포배양액과 키트에 들어있는 표준물질을 0.05%의 트윈-20이 첨가되어 있는 생리 식염수로 일정하게 희석한 후 키트의 웰에 100 μL씩 첨가하고, 상온에서 1시간동안 플레이트 진탕기 (plate shaker)에서 반응 시켰다. 이후, 제조사의 세척액을 사용하여 웰을 4회씩 세척한 후, 항-human factor VII 항체를 웰에 100 μL씩 첨가하여 상온에서 1시간 동안 플레이트 진탕기 (plate shaker)를 이용하여 반응시켰다. 다시 제조사의 세척액으로 4번 세척한 후, HRP (horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 항-human factor VII 항체에 대한 항체를 역시 웰당 100 μL씩 첨가한 후, 같은 방법으로 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 4회 세척한 후, 기질액을 100 μL씩 넣어 상온에서 정치하며 반응시켰다. 약 5분 후에 50 μL의 반응정지액을 넣어 반응을 정지시킨 다음 450nm의 흡광도로 측정하였다. 키트 제조사에서 제공하는 표준액의 농도와 얻어진 흡광도 값을 이용하여 표준곡선 및 함수를 얻은 뒤에, 이를 이용하여 human factor VII의 양을 정량화 하였다. 그 결과, 형질도입되어 선별된 세포들이 일정량의 human factor VII를 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

<2-3> human factor VII 발현 세포주의 선별

상기 실시예 <2-2>에서 human factor VII 발현이 확인된 세포들의 human factor VII 발현량을 증가시키기 위해, 10 nM의 MTX(Methotrexate, Sigma사, cat. no. M8407)가 포함된 선별배지를 이용하여 선별된 세포들을 T75 배양 용기에서 2주 동안 3일마다 계대 배양하고, 각 웰의 일부의 세포들을 실시예 <2-2>에서와 같은 방법으로 24-웰 플레이트로 옮겨 배양한 후, human factor VII 발현량을 측정하였다. 10 nM 이상의 농도에서는 더 이상 human factor VII의 발현량이 증가하지 않아 이 단계에서 이종성(heterogeneity)을 줄이기 위해 한계희석법(limiting dilution method)을 이용한 단일 클론 선별을 실시하였다. 즉, 불균일한 human factor VII 발현률을 나타내는 클론들을 한계희석법을 이용하여 human factor VII 발현률이 균일하고 생산성이 우수한 단일세포를 분리하는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트의 세포들 중에서 가장 발현량이 높았던 웰의 세포들을 96-웰 플레이트에 세포를 웰당 1개 이하로 접종되도록 희석한 후 세포가 1개만 접종된 플레이트를 선별해 2-3주 배양하였다. 그리고 나서, 콜로니를 형성하는 웰 플레이트의 세포를 분리한 다음 계대 배양하여 human factor VII의 발현량을 효소면역 측정법으로 측정하였다(도 2). 한계 희석법을 통해 분리된 세포주들 중 10 nM MTX에서 안정한 증식 특성과 human factor VII 고생산성을 나타내는 재조합 CHO 세포주를 최종 선별하여 HMF708이라고 명명하였다. 상기 HMF708 균주를 2010년 10월 25일에 한국생명공학연구원 생물자원센터(대한민국 대전시 유성구 과학로 111 한국생명공학연구원)에 기탁번호 KCTC 11779BP로 기탁하였다. 선별된 세포주는 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 14360C)를 이용하여 부유배양에 적응시켰다.

실시예 3: 소디움 부티레이트 첨가에 따른 세포주의 성장 및 hVII 생산량 측정(1)

<3-1> 종균 및 본배양

실시예 <2-3>에서 선별된 후 부유 배양에 적응되어 액체질소 탱크에 보관 중인 hFVII 발현 세포주 1바이알(1×10⁷ 세포/㎖)을 꺼내어 37℃ 항온수조에서 최대한 신속히 녹인 후, 종균배양배지(글루타민 0.3g/L가 첨가된 EX-CELL CHO 배지(Sigma사, cat. no. 63225C)로 1회 세척하고 90×g에서 5분 동안 원심분리하여 종균배양배지 50 mL이 들어있는 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; 미국 Corning사 cat# 431144)에 접종하였다. CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 세포 농도가 10×10⁵ 세포/㎖가 될 때까지 1~2일간 배양한 다음, 위에서와 같은 방법으로 원심분리하여 신선한 종균배양배지 100 mL이 들어있는 새로운 삼각 플라스크로 계대 배양하였다. 같은 방법으로 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 2배씩 배양 부피를 늘려가며 계대 배양하였다.

<3-2> 생산배지 내 소디움부틸레이트의 첨가에 따른 세포주의 성장 및 hFVII 의 생산량 측정

생산배지 내 소디움부틸레이트의 첨가가 hFVII의 생산량에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 배양 중인 재조합 CHO 세포주 약 5.0×10⁶ 세포/㎖를 3개의 삼각 플라스크에 50 mL의 배양 부피로 접종하였다. 이 때, 배양배지에 소디움부틸레이트(cat. no. B5887, 시그마사, 미국)가 각각 0.3, 1.0, 1.5 mM이 되도록 첨가하였으며, 소디움부틸레이트 0.3mM을 넣은 플라스크 대조군으로 배양을 시작하였다. hFVII의 생산을 위해 배양 온도를 30.0℃로 맞추어 4일 동안 배양하였다. 배양 4일 째에 배양액을 회수하여 세포주의 세포농도와 세포활성도를 관찰한 결과 소디움부틸레이트에 의한 세포농도 및 세포활성도의 변화는 없었다.

한편, 배양 4일 째에 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 실시예 <2-2>에서와 같이 효소면역법을 이용하여 각 배양 상등액에 발현된 hFVII의 양을 측정하였다. 측정된 값을 대조군 대비 생산량(%)으로 계산하여 하기 표 2에 나타내었다.

소디움부틸레이트 첨가 농도에 따른 hFVII 생산량(%)

소디움부틸레이트의 첨가 농도 ( mM )	FVII 생산량 (대조군 대비 %)	최종 세포농도 (대조군 대비 %)	세포활성도 (대조군 대비 %)
0.3	100.0	100.0	100.0
1.0	164.9	106.8	100.2
1.5	190.1	108.5	99.9

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 소디움부틸레이트 첨가 농도가 증가할수록 hFVII 생산량이 증가함을 알 수 있었다.

실시예 4: 소디움 부티레이트 첨가에 따른 세포주의 성장 및 hFVII 생산량 측정 (2)

<4-1> 종균 및 본배양

<4-2> 배양기에서 소디움부틸레이트의 첨가에 따른 세포주의 성장 및 hFVII 의 생산량 측정

배양기에서 소디움부틸레이트의 첨가가 hFVII의 생산량에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 작업 부피 4L 배양기에서 재조합 CHO 세포주 약 1.2×10⁷ 세포/㎖의 농도로 배양 한 3대의 배양기를 준비하였다. 그리고 배양배지에 소디움부틸레이트(cat. no. B5887, 시그마사, 미국)가 각각 0.3, 1, 1.5, 2.0 mM이 되도록 첨가하였으며, 소디움부틸레이트 0.3 mM을 넣은 배지를 공급하는 배양기를 대조군으로 배양을 시작하였다. hFVII의 생산을 위해 배양 온도를 30.0℃로 맞추어 11~18일 동안 배지를 0.5~1.0 VVD로 연속적으로 공급하여 배양하였으며 세포활성도가 80% 이하게 되면 배양을 종료하였다. 생산기 동안에 일정량의 배양액을 회수하여 세포주의 세포농도와 세포활성도를 관찰하였다.

또한 생산기 동안 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 실시예 <2-2>에서와 같이 효소면역법을 이용하여 각 배양 상등액에 발현된 hFVII의 양을 측정하였다. 측정된 값을 대조군 대비 생산량(%)으로 계산하여 하기 표 3에 나타내었다.

소디움부틸레이트 첨가 농도에 따른 hFVII 생산량(%)

소디움부틸레이트의 첨가 농도 ( mM )	FVII 생산량 (대조군 대비 %)	생산일 (대조군 대비 %)
0.3	100.0	100.0
1	154.5	83.3
1.5	157.7	72.2
2.0	127.6	61.1

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 소디움부틸레이트 첨가 농도가 증가할수록 짧은 생산기간에 불구하고 보다 많은 hFVII을 생산할 수 있어 소디움부틸레이트의 FVII 생산성 향상 기능을 볼 수 있었다.

실시예 5 : 배양배지에서 FactorVII 정제 방법

한외 여과막(SARTOCON Slice Cassette, PESU, Sartorius사, MWCO 30 K)을 1L의 1N NaOH로 1시간 이상 세척하고 5 L 멸균수를 이용하여 세척하였다. 이후 1차 정제컬럼의 평형 버퍼로 한외 여과막을 평형시킨 후, FactorⅦ 생산 세포 배양액을 주입하여 10 배 농축하였다. 농축된 배양액에 동일 부피의 1 차 정제컬럼 평형 버퍼를 첨가하여 2 배 희석하고 이를 다시 초기 농축부피까지 농축하였다. 이러한 희석-농축 과정을 7회 이상 반복하여 배양액을 1 차 정제컬럼 평형로 정용여과 하였으며 이때 FactorⅦ 의 손실은 거의 없고, 농축된 FactorⅦ 의 최종 농도는 0.3 mg/ml로 유지되었다. 한외여과 및 정용여과 과정은 4 ℃ 조건에서 수행되었다. 정용여과된 FactorⅦ 배양액은 0.22 ㎛ (NALGENE, PES) 여과 필터로 최종 여과하여 음이온 교환 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 음이온 교환 크로마토그래피로 큐 세파로스 (Q Sepharose Fast Flow, GE　Healthcare) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고, 부하된 시료는 평형버퍼 A (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine) 및 세척버퍼 B (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 0.2 M NaCl) 와 세척버퍼 C (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 0.1 M NaCl) 및 용출버퍼 D (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 25 mM NaCl + 35 mM CaCl₂) 용액을 이용하여 세척버퍼 C에서 용출버퍼 D 에 이르도록 2.5 컬럼 용량으로 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하였다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 통해 용출된 FactorⅦ 포함 단백질 용출액은 용출이 끝난 후 바로 크기 배체 크로마토그래피를 통해 20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine 버퍼로 버퍼교환 하였다. 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배체 크로마토그래피 과정은 4 ℃ 조건에서 수행되었다. 크기 배체 크로마토그래피를 통해 버퍼교환된 시료를 음이온 교환 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 큐 세파로스 (Q Sepharose High Performance, GE Healthcare) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고 부하된 시료는 평형버퍼 A (20 mM Tris pH 8.0 + 2 mM Benzamidine) 와 용출버퍼 B (20 mM Tris pH 8.0 + 2 mM Benzamidine + 1 M NaCl) 용액을 이용하여 용출버퍼 B의 농도가 20 %에서 35 % 에 이르도록 15 컬럼 용량으로 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 FactorⅦ 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 20 mM 인산칼륨 pH 5.5 버퍼로 제형화 하였으며 모든 과정은 4 ℃ 조건에서 수행되었다. 상기와 같이 Factor VII은 비활성활된 형태로 정제 후 보관이 가능하며 필요시 실시예 6에서와 같이 활성화한 Factor VIIa로의 전환이 가능하다.

실시예 6 정제된 Factor Ⅶ 의 활성화 단계

FactorⅦ 단백질을 활성화 (activation) 시키기 위해 정제된 FactorⅦ 시료를 평형버퍼 A (20 mM Tris pH 8.0 + 2 mM Benzamidine)로 평형화된 음이온 교환 크로마토그래피에 부하하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 소스 15큐(Source 15Q, GE Healthcare) 레진이 충진된 컬럼이 사용되었고 부하된 시료는 평형버퍼 A 와 용출버퍼 B (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 25 mM NaCl + 35 mM CaCl₂) 를 이용하여 5 % 용출버퍼 B 의 농도로 40 분간 on-column 활성화 과정을 거친 후, 용출버퍼 B를 이용하여 등용매 용리 방법으로 단백질을 용출하였다. 정제된 Factor Ⅶ의 활성화 단계는 상온에서 수행되었다.

한국생명공학연구원

KCTC11779BP

20101025

<110> Hanmi Holdings Co., Ltd. <120> Method for mass production of factor VII/VIIa <130> PA110816/KR <150> KR10-2010-0104403 <151> 2010-10-26 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VIIBHISS <400> 1 cccggatcca tggtctccca ggccctcagg ctcc 34 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VIIXhoIAS <400> 2 gggctcgagc tagggaaatg gggctcgcag g 31 <210> 3 <211> 8299 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gacggatcgg gagatccgac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta 60 gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa 120 ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg 180 ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg 240 ctgattatga tctctagtca aggcactata catcaaatat tccttattaa cccctttaca 300 aattaaaaag ctaaaggtac acaatttttg agcatagtta ttaatagcag acactctatg 360 cctgtgtgga gtaagaaaaa acagtatgtt atgattataa ctgttatgcc tacttataaa 420 ggttacagaa tatttttcca taattttctt gtatagcagt gcagcttttt cctttgtggt 480 gtaaatagca aagcaagcaa gagttctatt actaaacaca gcatgactca aaaaacttag 540 caattctgaa ggaaagtcct tggggtcttc tacctttctc ttcttttttg gaggagtaga 600 atgttgagag tcagcagtag cctcatcatc actagatggc atttcttctg agcaaaacag 660 gttttcctca ttaaaggcat tccaccactg ctcccattca tcagttccat aggttggaat 720 ctaaaataca caaacaatta gaatcagtag tttaacacat tatacactta aaaattttat 780 atttacctta gagctttaaa tctctgtagg tagtttgtcc aattatgtca caccacagaa 840 gtaaggttcc ttcacaaaga tccaaagcca gcaaaagtcc catggtctta taaaaatgca 900 tagctttagg aggggagcag agaacttgaa agcatcttcc tgttagtctt tcttctcgta 960 gacttcaaac ttatacttga tgcctttttc ctcctggacc tcagagagga cgcctgggta 1020 ttctgggaga agtttatatt tccccaaatc aatttctggg aaaaacgtgt cactttcaaa 1080 ttcctgcatg atccttgtca caaagagtct gaggtggcct ggttgattca tggcttcctg 1140 gtaaacagaa ctgcctccga ctatccaaac catgtctact ttacttgcca attccggttg 1200 ttcaataagt cttaaggcat catccaaact tttggcaaga aaatgagctc ctcgtggtgg 1260 ttctttgagt tctctactga gaactatatt aattctgtcc tttaaaggtc gattcttctc 1320 aggaatggag aaccaggttt tcctacccat aatcaccaga ttctgtttac cttccactga 1380 agaggttgtg gtcattcttt ggaagtactt gaactcgttc ctgagcggag gccagggtag 1440 gtctccgttc ttgccaatcc ccatattttg ggacacggcg acgatgcagt tcaatggtcg 1500 aaccatgatg gcagcgggga taaaatccta ccagccttca cgctaggatt gccgtcaagt 1560 ttggcgcgaa atcgcagccc tgagctgtgg atctcccgat cccctatggt gcactctcag 1620 tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga 1680 ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa 1740 ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgcgatg tacgggccag 1800 atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 1860 agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 1920 ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 1980 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 2040 ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 2100 atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 2160 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 2220 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 2280 gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 2340 attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctctctg 2400 gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga 2460 gacccaagct tggtaccgag ctcggatcca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc 2520 ttctgcttgg gcttcagggc tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg 2580 gcgtcctgca ccggcgccgg cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc 2640 tggagaggga gtgcaaggag gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg 2700 acgcggagag gacgaagctg ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa 2760 gtccatgcca gaatgggggc tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc 2820 tccctgcctt cgagggccgg aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga 2880 acgagaacgg cggctgtgag cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc 2940 ggtgccacga ggggtactct ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat 3000 atccatgtgg aaaaatacct attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa 3060 ttgtgggggg caaggtgtgc cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga 3120 atggagctca gttgtgtggg gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc 3180 actgtttcga caaaatcaag aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc 3240 tcagcgagca cgacggggat gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca 3300 cgtacgtccc gggcaccacc aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg 3360 tcctcactga ccatgtggtg cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc 3420 tggccttcgt gcgcttctca ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca 3480 cggccctgga gctcatggtc ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc 3540 agtcacggaa ggtgggagac tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact 3600 cggatggcag caaggactcc tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc 3660 ggggcacgtg gtacctgacg ggcatcgtca gctggggcca gggctgcgca accgtgggcc 3720 actttggggt gtacaccagg gtctcccagt acatcgagtg gctgcaaaag ctcatgcgct 3780 cagagccacg cccaggagtc ctcctgcgag ccccatttcc ctagctcgag catgcatcta 3840 gagggcccta ttctatagtg tcacctaaat gctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 3900 ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 3960 ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 4020 aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 4080 gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc 4140 agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4200 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4260 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4320 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4380 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4440 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4500 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4560 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag 4620 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 4680 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 4740 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 4800 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 4860 aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 4920 gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga tctgatcaag 4980 agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 5040 ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 5100 atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 5160 tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 5220 cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 5280 tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 5340 tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 5400 tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 5460 tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 5520 ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 5580 tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 5640 gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 5700 gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 5760 gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat 5820 gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta 5880 tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg 5940 ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta 6000 caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 6060 ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag 6120 ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 6180 aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 6240 gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 6300 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 6360 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 6420 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 6480 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 6540 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 6600 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 6660 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 6720 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 6780 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 6840 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 6900 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 6960 gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 7020 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 7080 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 7140 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 7200 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 7260 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 7320 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 7380 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 7440 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 7500 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 7560 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 7620 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 7680 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 7740 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 7800 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 7860 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 7920 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 7980 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 8040 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 8100 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 8160 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 8220 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 8280 aaaagtgcca cctgacgtc 8299

Claims

a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및
ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계;
c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주에 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 GC-풍부 영역이 1개 이하의 CCGCCC 반복서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 인간 혈액응고 7인자를 코딩하는 염기서열은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터가 도 1에 기재된 pXOGC-FVII인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 동물 세포주가 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주, 원숭이 신장 세포 7(COS7 : Monkey kidney cells) 세포주, NSO 세포주, SP2/0 세포주, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : Baby hamster kidney) 세포주, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 동물 세포주는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자가 결핍된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 c)단계의 선별된 세포주는 HMF708(기탁번호 KCTC 11779BP)인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 d) 단계의 소디움부틸레이트의 농도는 0.1 내지 3.0 mM인 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 소디움부틸레이트의 농도는 0.3 내지 1.5 mM인 것인 방법.
제1항에 있어서, 인간 혈액응고 7인자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 인간 혈액응고 7인자를 활성화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
인간 혈액응고 7인자를 생산하는 HMF708(기탁번호 KCTC 11779BP) 세포주.