CN106497977A

CN106497977A - 一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用

Info

Publication number: CN106497977A
Application number: CN201611078870.6A
Authority: CN
Inventors: 韦丹; 赵礼军; 连杰; 李德志; 付苏雷; 吴雷振
Original assignee: HENAN HUALONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HENAN HUALONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-03-15

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述重组载体介导的荧光素酶基因在raji细胞中表达荧光素酶，利用酶催化底物反应原理，应用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪，从而评判CAR‑T细胞的靶向杀伤效果。

Description

一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组载体及其应用，具体涉及一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用。

背景技术

荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因。近年来，光学报告基因成像因具有灵敏度高、无放射性、成像迅速且可实时监测等诸多优点，成为分子影像学研究中的热点，并因此成为体内示踪细胞的理想成像方法。光学报告基因成像技术主要包括生物发光成像和荧光成像两大类。

Raji细胞为人B淋巴瘤白血病细胞，该细胞系最初来源于一名黑人男性Burkitt淋巴瘤患者的左上颌骨，由R.J.v.Pulvertaft在1963年建立；为B淋巴细胞来源，表达B系相关表型，呈淋巴母细胞形态；2倍体核型，EBV(+)；体外培养呈悬浮生长。CD19为B细胞表面分化抗原，只在正常和恶性B细胞表达，几乎不在其他组织表达。

到目前为止，淋巴瘤的治疗以化疗为主，但大部化疗药物均有局限性，且对病人的免疫系统产生很大的损害，疗效往往不尽人意。因此副作用小，治愈率高的靶向性生物治疗给患者带来了希望，成为近年来研究的热点问题。

CN 103468730A公开了一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体的构建及应用，其可用于检测候选microRNAs对猪CD163基因表达的调控活性及用于筛选抑制猪CD163基因表达的microRNAs等。但目前的荧光素酶基因并没有相关报道与pCDH载体相连，也没有将荧光素酶基因用于CD19的追踪。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用，通过该重组载体介导的荧光素酶基因在raji细胞中表达荧光素酶，利用酶催化底物反应原理，应用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪，从而评判CAR-T细胞的靶向杀伤效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体(pCDH-Luc)，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明中，所述慢病毒载体pCDH可用现有技术中存在的慢病毒载体pCDH即可。

所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列见序列表。

优选地，所述荧光素酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.2的氨基酸序列如下：

MADAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV.

优选地，所述荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列见序列表。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据序列设计引物，以pET28-Luc为模板进行扩增，得到一个替换了酶切位点的基因片段；

(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段连接到pCDH载体中，构建重组质粒；

(3)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

优选地，步骤(1)所述引物为SEQ ID NO.4-5所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO.4-5所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.4：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT；

SEQ ID NO.5：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA。

优选地，步骤(3)所述将扩增得到的基因片段连接到pCDH载体的BamHI和NotI克隆位点。

第三方面，本发明提供一种重组慢病毒，如第一方面所述的重组载体与pFUGW表达载体及包膜载体pVSV-G载体进行共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，包括如第一方面所述的重组载体或如第三方面所述的重组慢病毒。

优选地，所述宿主细胞为293T、293FT或293LTV中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组载体，如第三方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的宿主细胞用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中荧光素酶报告基因是生物发光成像的报告基因，生物发光成像较荧光成像具有更高的灵敏度，无明显自发荧光，背景噪声低，图像信噪比更高；将慢病毒表达载体pCDH作为活体成像示踪载体，具有高感染力的特点，可有效地感染各种类型的细胞，尤其是一些难感染的细胞，比如表达CD19的Raji细胞，而荧光素酶在生物体内具有高度催化荧光反应的功能，两者结合构建的重组载体有两方面优势：一是容易制得大量重组载体pCDH-Luc，二是可精准直观的示踪生物体内CD19⁺细胞的变化。

附图说明

图1为本发明pCDH-Luc质粒图谱；

图2为本发明pET28-Luc质粒的酶切鉴定结果图；

图3为本发明pCDH质粒的酶切鉴定结果图；

图4为本发明pCDH-Luc质粒的酶切鉴定结果图；

图5为本发明pCDH-Luc重组载体序列鉴定结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1：构建pCDH-CAR19慢病毒载体

pCDH-Luc慢病毒载体，如图1所示：

(1)根据已知pET28-Luc为模板进行酶切位点引物更换设计引物如下：

上游引物：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT(BamHI-Luc-A)；

下游引物：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA(Luc-NotI-S)；

为了方便构建重组载体pCDH-Luc，我们在合成Luc时人为的加入了载体构建时所需的酶切位点BamHI和NotI。

PCR扩增反应体系如下：

其中，一组以水为样本的阴性对照。

反应条件如下：

获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，加入NotI和BamHI进行酶切反应，得到的Luc片段与pCDH进行连接反应，反应体系如下：

37℃恒温水浴锅中反应3h，酶切产物经胶纯化回收，酶切电泳结果图如图2-3所示。

将酶切后的载体与基因进行连接，反应体系如下：

轻轻混匀组分，置于16℃水浴锅反应2h，得到重组载体。

(2)将重组载体转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切测序验证，结果如图4-5所示，克隆序列与原始序列完全一致。

实施例2：pCDH-Luc质粒大量提取

从-80℃取出相应的菌株，进行平板划线，培养过夜(12-24h)；次日挑取单克隆(2-4个)，进行小体积(5ml)摇菌(6-8h)；从小摇的体系中取菌液，按体积比1:100转大摇；然后进行质粒大提：

首先确认在Solution1中是否已经加入了RNaseA(加入RNaseA后4℃保存)；DNAWashBuffer中是否已经加入了无水乙醇。

实验操作前可先将BufferN3置于冰中预冷后使用；Solution1若非首次使用，需将其从4℃中取出在室温下平衡。

(1)取适量的菌液置于新的50mL的离心管中，在室温条件下以4900g进行离心10min，弃上清后继续加入适量菌液至菌液全部离心得到沉淀；

(2)加入10mL的Solution1/RNaseA于离心后的菌体沉淀中，于振荡器上进行重悬；

(3)继加入10mL的Solution2溶液，之后进行上下颠倒10-15次后置于室温下2min；

(4)继加入5mL的BufferN3溶液，之后进行颠倒后置于室温下2min；

(5)将4中得到的溶液移入带滤膜的注射器中，将溶液压置于另一个新的50mL的离心管中；

(6)在5中得到的溶液中加入0.1体积的ETR溶液，上下颠倒7-10次混匀后置于冰中10-20min，之后转至42℃水浴中放置5min(可同时做步骤7)之后以4900g离心5min，之后将上层溶液移至新的50mL的离心管中，避免吸入下层蓝色液体；

(7)准备HiBindMaxiColumn，加入5mL的BufferGPS于上层滤管中，室温下静置3-10min，之后以4900g离心5min，弃滤液，滤管备用；

(8)在步骤6中得到的上清溶液中加入0.5体积的无水乙醇，混匀后室温下放置2min；

(9)将步骤8中的液体用步骤7中备用的滤管以4900g离心4min，弃滤液直至全部通过滤膜；

(10)滤管中加入10mL的BufferHB，以4900g离心4min，弃滤液；

(11)再次加入15mL的DNAWashBuffer，以4900g离心4min，弃滤液；

(12)再次加入10mL的DNAWashBuffer，以4900g离心4min，弃滤液；

(13)将上步的滤管以5900g离心10-15min，之后将滤管转移至新的50mL的离心管中；

(14)向上步得到的滤膜中加入1-3mL的Endotoxin-FreeElutionBuffer，室温静置2min后以5900g离心5min以收集DNA溶液。

实施例4：慢病毒的包装和细胞转染

慢病毒包装：用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，病毒液收集和浓缩，储存和稀释，并进行滴度检测和MOI值的测定，滴度>1.00E+08TU/mL，MOI值在5-10之间。

细胞转染：(1)转染前24h，用胰蛋白酶(0.125％)消化对数生长期的293T细胞(细胞融合度为85％-95％)，以含完全培养基(DMEM：4.5g/Lglucose,含NaHCO₃或丙酮酸钠+5％或10％血清+1mg/ml双抗)调整细胞密度(1:4-5)传代，重新接种于培养器皿(T75瓶或d15培养皿)培养(37℃、5％CO2、饱和湿度)；

(2)24h后转染，细胞融合度密度达45-65％；

(3)转染前0.5-1.5h将细胞培养基更换为新鲜纯培养，DMEM:4.5g/Lglucose,含NaHCO₃或丙酮酸钠+无血清+无双抗；

(4)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液，与相应体积的CaCl₂混合均匀，在室温下温育5min，构成DNA-氯化钙溶液；

(5)将DNA-氯化钙溶液(缓慢逐滴吹泡)加入BBS液混匀(不要振荡)；室温孵育10-20min，构成DNA-氯化钙-BBS溶液；

(6)将DNA-氯化钙-BBS溶液平均并均匀滴加于293T细胞的培养液中(尽量不要晃动培养器皿)，培养(37℃、5％CO₂、饱和湿度)4-16h(一般为8-10h)。弃去含磷酸钙沉淀的培养液(轻轻摇动培养板数次以充分悬浮磷酸钙钙沉淀)，换新鲜完全培养液，继续培养；

(7)24或36h观察转染效果90％以上48h-54h后可进行病毒的收集。

从转染结果可以看出，转染效率85％以上，细胞状态良好。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省华隆生物技术有限公司

<120> 一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用

<130> 2016

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9037

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840

gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900

taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960

acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020

cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140

tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200

gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260

aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320

gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380

aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

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aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1980

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2040

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2100

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2160

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tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2280

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tcatcatgga ctctaagacc gactaccagg gcttccagag catgtacaca ttcgtgacat 2820

ctcatctgcc tcctggcttc aacgagtacg acttcgtgcc agagtctttc gacagggaca 2880

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tgcctcatcg caccgcctgt gtgcgcttct ctcacgcccg cgaccctatt ttcggcaacc 3000

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gctttcatct gccaggcatc cgccagggct acggcctgac cgagacaacc agcgccattc 3360

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tgtgtgtgcg cggccctatg attatgtccg gctacgtgaa taaccctgag gccacaaacg 3540

ccctgatcga caaggacggc tggctgcact ctggcgacat tgcctactgg gacgaggacg 3600

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ccccagccga gctggagtct atcctgctgc agcaccctaa cattttcgac gccggagtgg 3720

ccggcctgcc cgacgacgat gccggcgagc tgcctgccgc cgtcgtcgtg ctggaacacg 3780

gcaagaccat gaccgagaag gagatcgtgg actatgtggc cagccaggtg acaaccgcca 3840

agaagctgcg cggcggagtg gtgttcgtgg acgaggtgcc caagggcctg accggcaagc 3900

tggacgcccg caagatccgc gagatcctga tcaaggctaa gaaaggcggc aagatcgccg 3960

tgtaagcggc cgcgaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca 4020

tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga 4080

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ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg 4200

tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc 4260

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ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc 4380

ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc ggctctccac gctttgcctg 4440

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gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga 5040

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caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 6840

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 6900

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 6960

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 7020

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 7080

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 7140

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 7200

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 7260

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 7320

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 7380

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 7440

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 7500

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 7560

ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 7620

tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 7680

accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 7740

atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 7800

cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 7860

tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 7920

tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 7980

gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 8040

agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 8100

aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 8160

gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 8220

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 8280

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 8340

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 8400

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 8460

catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 8520

acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 8580

tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg 8640

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 8700

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 8760

gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 8820

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc 8880

attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 8940

gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 9000

gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctg 9037

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Ala Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

20 25 30

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu

35 40 45

Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala

50 55 60

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val

65 70 75 80

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu

85 90 95

Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg

100 105 110

Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val

115 120 125

Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro

130 135 140

Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe

165 170 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile

180 185 190

Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val

195 200 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

210 215 220

Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val

225 230 235 240

Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu

245 250 255

Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val

275 280 285

Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

290 295 300

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser

305 310 315 320

Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile

325 330 335

Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe

355 360 365

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

370 375 380

Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

405 410 415

Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

420 425 430

Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln

435 440 445

Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile

450 455 460

Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu

465 470 475 480

Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

485 490 495

Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu

500 505 510

Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly

515 520 525

Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Lys Ile Ala Val

545 550

<210> 3

<211> 4955

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

ggtaccgagt ttctagacgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgactcgag 60

cggagtactg tcctccgatc ggagtactgt cctccgcgaa ttccggagta ctgtcctccg 120

aagacgctag cggggggcta taaaaggggg tgggggcgtt cgtcctcact ctagatctgc 180

gatctaagta agcttggcat tccggtactg ttggtaaagc caccatggaa gacgccaaaa 240

acataaagaa aggcccggcg ccattctatc cgctggaaga tggaaccgct ggagagcaac 300

tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac aattgctttt acagatgcac 360

atatcgaggt ggacatcact tacgctgagt acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag 420

ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc 480

ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga 540

acgacattta taatgaacgt gaattgctca acagtatggg catttcgcag cctaccgtgg 600

tgttcgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt gcaaaaaaag ctcccaatca 660

tccaaaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca gggatttcag tcgatgtaca 720

cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata cgattttgtg ccagagtcct 780

tcgataggga caagacaatt gcactgatca tgaactcctc tggatctact ggtctgccta 840

aaggtgtcgc tctgcctcat agaactgcct gcgtgagatt ctcgcatgcc agagatccta 900

tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg 960

gttttggaat gtttactaca ctcggatatt tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt 1020

atagatttga agaagagctg tttctgagga gccttcagga ttacaagatt caaagtgcgc 1080

tgctggtgcc aaccctattc tccttcttcg ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt 1140

tatctaattt acacgaaatt gcttctggtg gcgctcccct ctctaaggaa gtcggggaag 1200

cggttgccaa gaggttccat ctgccaggta tcaggcaagg atatgggctc actgagacta 1260

catcagctat tctgattaca cccgaggggg atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg 1320

ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc 1380

aaagaggcga actgtgtgtg agaggtccta tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg 1440

aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact 1500

gggacgaaga cgaacacttc ttcatcgttg accgcctgaa gtctctgatt aagtacaaag 1560

gctatcaggt ggctcccgct gaattggaat ccatcttgct ccaacacccc aacatcttcg 1620

acgcaggtgt cgcaggtctt cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg 1680

ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc gccagtcaag 1740

taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc 1800

ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg 1860

gaaagatcgc cgtgtaattc tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca gacatgataa 1920

gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 1980

gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 2040

acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt 2100

aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta aaatcgataa ggatccgtcg accgatgccc 2160

ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc 2220

gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctcttc 2280

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 2340

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 2400

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 2460

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 2520

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 2580

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 2640

ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 2700

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 2760

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 2820

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 2880

ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 2940

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 3000

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 3060

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 3120

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 3180

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 3240

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 3300

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 3360

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 3420

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 3480

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 3540

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 3600

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 3660

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 3720

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 3780

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 3840

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 3900

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 3960

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 4020

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 4080

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4140

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4200

gccacctgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 4260

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 4320

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 4380

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 4440

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 4500

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 4560

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 4620

aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca atttcccatt cgccattcag 4680

gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagcccaa 4740

gctaccatga taagtaagta atattaaggt acgggaggta cttggagcgg ccgcaataaa 4800

atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatcgat agtactaaca 4860

tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt 4920

gcaagtgcag gtgccagaac atttctctat cgata 4955

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

cgcggatcca tggccttacc agtgaccgct ccggt 35

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

ccagcggccg caatcgctcc cccgtcccgg a 31

Claims

1.一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体，其特征在于，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和荧光素酶基因串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述荧光素酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述引物为SEQ ID NO.4-5所示的序列。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述将扩增得到的基因片段连接到pCDH载体的BamHI和NotI克隆位点。

7.一种重组慢病毒，其特征在于，如权利要求1-3中任一项所述的重组载体与pFUGW表达载体及包膜载体pVSV-G载体进行共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的重组载体或如权利要求7所述的重组慢病毒。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为293T、293FT或293LTV中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。

10.一种如权利要求1-3中任一项所述的重组载体，如权利要求7所述的重组慢病毒或如权利要求8或9所述的宿主细胞用于模式动物活体成像研究中CD19的追踪。