CN105602991A - 一种乙脑假病毒及其制备方法 - Google Patents

一种乙脑假病毒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105602991A
CN105602991A CN201511033119.XA CN201511033119A CN105602991A CN 105602991 A CN105602991 A CN 105602991A CN 201511033119 A CN201511033119 A CN 201511033119A CN 105602991 A CN105602991 A CN 105602991A
Authority
CN
China
Prior art keywords
encephalitis
pseudovirus
spme
cell
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201511033119.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105602991B (zh
Inventor
曹三杰
文心田
刘瀚扬
伍锐
黄小波
文翼平
袁磊
冯瑶
周玉鹏
曹玉琴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201511033119.XA priority Critical patent/CN105602991B/zh
Publication of CN105602991A publication Critical patent/CN105602991A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105602991B publication Critical patent/CN105602991B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/36052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种重组载体，它是中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC？NO：M2015570的重组菌DH5α/pcDNA3.1-SPME携带的重组质粒pcDNA3.1-SPME。本发明还公开了一种制备乙脑假病毒的试剂盒及其用途。本发明还公开了一种乙脑假病毒的制备方法，一种重组菌。本发明构建的重组载体pcDNA3.1-SPME，可以高效的获得乙脑假病毒，获得的乙脑假病毒滴度高，具有良好的应用前景。

Description

一种乙脑假病毒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种乙脑假病毒及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
流行性乙型脑炎(epidemicencephalitisB)，又称乙脑、日本乙型脑炎(JapanesetypeBencephalitis)，是由乙脑病毒(JEV，Japaneseencephalitisvirus)引起的一种人畜共患的虫媒传染病，可引起儿童的非化脓性脑炎以及母猪的流产，给人类健康及养殖业带来极大的危害。
在对乙脑进行药物筛选和科学试验时，需要直接使用JEV，但由于JEV传染性强、致病性高，属于危害等级为II级的病毒，给研究者带来极大的潜在感染风险。因此，急需开发安全有效的JEV研究手段。
假病毒是指一种反转录病毒能够整合另外一种病毒的囊膜糖蛋白,从而形成的具有外源性病毒囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒。假病毒具备和真病毒一样的感染性，但不具有复制产生病毒的能力，安全性好，因而在研究病毒与宿主细胞之间相互关系、乙脑血清学诊断、乙脑药物筛选等方面能够发挥重要作用。
JEV是单股正链的RNA病毒，编码C、prM/M、E结构基因和NSl、NS2A、NS2B等非结构蛋白。目前针对JEV病毒建立假病毒载体系统的研究较少，感染细胞后得到的乙脑假病毒滴度均极低，限制了乙脑假病毒的应用。例如曹齐树使用JEVP3毒株的E基因构建的乙脑假病毒，对293细胞的感染滴度最高为1.5×103TU/ml，在BHK21细胞上不能检测到阳性荧光信号【曹齐树，猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因假病毒的构建[D]，华中农业大学，2011年】；Leeet等使用JEVBeijing株的ME基因构建的乙脑假病毒，对293T和BHK-21细胞的感染滴度分别为2.05×102TU/ml及7.91×103TU/ml【TheprM-independentpackagingofpseudotypedJapaneseencephalitisvirus[J].Leeetal.,2009】；而且两种方法建立的慢病毒系统均为单基因报告系统，要么不方便观察目的蛋白的荧光，要么不便于量化分析。
发明内容
本发明提供了一种滴度较高的乙脑假病毒及其制备方法。
本发明提供了一种重组载体，它是中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO：M2015570的重组菌DH5α/pcDNA3.1-SPME携带的重组质粒pcDNA3.1-SPME。
本发明还提供了一种制备乙脑假病毒的试剂盒，它是由权利要求1所述的重组质粒pcDNA3.1-SPME和慢病毒包装质粒组成。
其中，它还包括宿主细胞。
其中，所述慢病毒包装质粒为pCDH-CMV-Luc–copGFP和psPAX2.1；
所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明还提供了上述试剂盒在制备乙脑假病毒中的用途。
本发明还提供了一种乙脑假病毒的制备方法，它包括如下步骤：
a.将权利要求1所述的重组质粒pcDNA3.1-SPME和慢病毒包装质粒共转染宿主细胞；
b.培养宿主细胞48h；
c.收获细胞培养的上清液，即得乙脑假病毒。
其中，所述慢病毒包装质粒为pCDH-CMV-Luc–copGFP和psPAX2.1；所述宿主细胞为293T细胞；所述转染采用阳离子脂质体法转染；转染时pCDH-CMV-Luc–copGFP、psPAX2.1、pcDNA3.1-SPME的重量比为4:3:2。
本发明还提供了上述制备方法得到的乙脑假病毒。
本发明还提供了上述乙脑假病毒在乙脑病毒中和抗体研究或乙脑药物筛选中的用途。
本发明还提供了一种重组菌，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO：M2015570的重组菌DH5α/pcDNA3.1-SPME。
大肠杆菌DH5α/pcDNA3.1-SPMEEscherichiacoliDH5α/pcDNA3.1-SPME已于2015年9月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学；其保藏编号为：CCTCCNO：M2015570。
本发明从乙脑病毒SCYA201201株中克隆了M基因和E基因，并构建了携带上述基因的重组载体pcDNA3.1-SPME；以重组载体pcDNA3.1-SPME作为慢病毒载体，和慢病毒辅助质粒一起制备乙脑假病毒用的试剂盒，可以高效的得到乙脑假病毒，而且操作简单、成本低，取得了预料不到的技术效果。
本发明制备的假病毒带有绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)双标记，可以直观的观察假病毒的制备效果，而且方便对后续研究定量分析。本发明制备的乙脑假病毒可以用于乙脑血清学诊断例如病毒中和抗体评价、病毒入侵宿主细胞机制模型研究及抗JEV药物的筛选，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是乙脑病毒的SPME基因插入pcDNA3.1载体后PCR鉴定结果图；其中，泳道2为乙脑病毒SPME基因(2086bp)PCR鉴定的电泳结果。
图2是乙脑病毒带信号肽的SPME基因插入pcDNA3.1载体后酶切鉴定结果图，其中，泳道1为重组载体的双酶切鉴定结果。
图3是乙脑假病毒的包装过程图。
图4是乙脑假病毒电镜检测结果(40000×)。
图5是乙脑假病毒免疫印迹检测结果图，蛋白Marker为Bio-Rad的PrecisionPlusProtein。
图6是标准品质粒PCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体的扩增曲线图。
图7是乙脑假病毒感染HEK293细胞的倒置荧光显微镜照相结果，其中，(A)为HEK293细胞对乙脑假病毒的感染效果图，(B)及未感染的阴性对照。
图8是乙脑假病毒感染BHK-21细胞的倒置荧光显微镜照相结果，其中，(A)为HEK293细胞对乙脑假病毒的感染效果图，(B)及未感染的阴性对照。
图9是乙脑假病毒感染293细胞的流式细胞仪荧光计数结果，其中，(A)感染乙脑假病毒后表达绿色荧光蛋白细胞，(B)及未感染的阴性对照。
图10是乙脑假病毒感染BHK-21细胞的流式细胞仪荧光计数结果，其中，(A)感染乙脑假病毒后表达绿色荧光蛋白细胞，(B)及未感染的阴性对照。
图11是乙脑假病毒对不同稀释梯度已知阳性血清中和抗体评价的荧光强度读数统计结果图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒说明书选择。
实验试剂：总RNA提取试剂盒及荧光定量PCR试剂盒RealMasterMix(SYBRGreen)，购自北京天根公司；限制性内切酶，RNA反转录试剂盒购自大连宝生物公司；Lipofectamine3000及DMEM购自上海英潍捷基公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物有限公司。
实验仪器：Bio-radT100PCR仪；Bio-radCFX96荧光定量PCR仪；BDFACSCaliburflowcytometer流式细胞仪；ThermoMultifugeX1R高速离心机。
实验细胞：HEK293T、HEK293及BHK-21细胞均购自ATCC，由四川农业大学猪病传染中心保存。
实施例1本发明重组载体的制备
1、设计引物
设计JEVSCYA201201株的扩增引物，该引物可以扩增JEVSCYA201201株的E基因和带有信号肽的M基因(以下简称SPME)。
2、SPME基因的扩增和克隆
以冻存的经纯化过的JEVSCYA201201株病毒液为模板，按照北京天根公司总RNA提取试剂盒说明书提取病毒液RNA，经过反转录合成SPME基因的cDNA，以JEVSPME基因cDNA作为模板，以设计的SPME基因扩增引物，进行JEV的SPME基因的PCR扩增，扩增反应条件为：95℃2min；94℃1min，57℃30s，72℃120s，35次循环；72℃延伸10min。
扩增完后取5μLPCR产物以1.0％的琼脂糖进行凝胶电泳并于凝胶成像系统下进行结果观察，再将PCR产物胶回收进行T-A克隆，测序鉴定。
3、重组载体pcDNA3.1-SPME的构建
将SPME基因的T-A克隆质粒T-E和pcDNA3.1质粒同时进行EcoRI和BamHI的双酶切，37℃，3h，得酶切产物；将两种酶切产物以T4DNA连接酶4℃下过夜连接。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp平板，37℃倒置培养16h。
随机挑取平板上的单个菌落接种于5mL含Amp(50μg/ml)的LB液体培养基，振摇培养后小量提取质粒，进行质粒PCR与双酶切的双重鉴定(结果间图1和图2)。将PCR鉴定和双酶切鉴定均正确的重组载体命名为pcDNA3.1-SPME，携带重组载体pcDNA3.1-SPME的重组菌命名为DH5α/pcDNA3.1-SPME。
实施例2本发明乙脑假病毒试剂盒的制备
按照实施例1方法，制备重组载体pcDNA3.1-SPME；
取慢病毒包装质粒pCDH-CMV-Luc–copGFP与psPAX2.1，与本发明的重组载体pcDNA3.1-SPME共同构成本发明试剂盒。
实施例3本发明乙脑假病毒的制备及鉴定
一、乙脑假病毒的制备
1、共转染
用实施例2方法制备的试剂盒，采用阳离子脂质体法转染。
转染时所用质粒的重量比为：包装质粒pCDH-CMV-Luc–copGFP：辅助质粒psPAX2.1：重组质粒pcDNA3.1-SPME为4:3:2；
按照所用质粒的总重量：转染试剂Lipofectamine3000为1μg:1.5μl，共转染293T细胞。
2、收获乙脑假病毒
培养宿主细胞48h，离心收集上清(离心条件为：4℃、8000g、10min)，使用无菌0.45μm滤器过滤上清，即得本发明的乙脑假病毒上清液。假病毒包装过程见图3。
使用病毒浓缩试剂(病毒浓缩试剂的配制如下：取NaCl8.766g、PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中)，按假病毒上清液：病毒浓缩试剂的体积比4：1混合，4℃过夜；然后离心(离心条件为：4℃，7000g，30min)弃上清，按病毒上清液原体积的1/100～1/50加入DMEM重悬，获得浓缩后的病毒液，分装后于-70℃保存。
二、乙脑假病毒的鉴定
1、电镜检测
将乙脑假病毒转染后培养48h后的HEK293T宿主细胞用枪头轻轻刮下，收集于2ml离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，用戊二醛固定细胞，交由电镜室进行负染电镜检测如图4所示，视野中出现乙脑病毒样颗粒，周围包围稠密包膜，直径120-200nm左右。
可见本发明的假病毒颗粒成功获得了包装。
2、蛋白印迹检测
将浓缩后的病毒液加入5×LoadingBuffer，100℃煮沸5min；将样品加入到加样孔中，进行12％的SDS-PAGE，分离蛋白。电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，使用NC膜进行转印处理。转印后以1％BSA室温封闭2h。弃封闭液，用PBS洗膜后加入一抗(兔抗JEV多克隆抗体，1:200稀释比例，用0.01MPBS稀释)，37℃2h。弃一抗后用PBS洗膜，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(羊抗兔多克隆抗体，按1:3000稀释比例，用0.01MPBS稀释)，室温2h。弃二抗，用PBS洗膜后加入显色液，避光显色至出现条带时照相分析。
如图5所示，在56kd处有特异性条带，与乙脑病毒E蛋白文献报道大小相一致，可见，本发明的乙脑假病毒具有乙脑病毒的囊膜结构。
3、RealtimeRT-PCR检测GFP基因的拷贝数
取浓缩后的病毒液100ul，用TRIZOL试剂按产品说明书提取总RNA，反转录后检测病毒中的GFP基因表达水平。
以质粒PCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP的GFP基因为靶基因，使用Primerpremier5.0软件设计一对特异性引物，扩增片段大小为161bp。
上游引物(P1):5’—GTGATGGGCTACGGCTTCTAC—’3
下游引物(P2):5’—GGCGTTGCTGCGGATGA—’3
反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性15s，57℃退火20s，68℃延伸20s，读取荧光值，共循环40次。
对标准品质粒PCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体进行质粒抽提，酶切鉴定。将标准品质粒用核酸蛋白仪测定其OD260和OD280，然后换算出浓度(ng/μl)。按公式换算成质粒的拷贝数：拷贝数＝质粒浓度×6.02×1023/(660×质粒总长度),其中6.02×1023为阿佛加德罗常数；660为每个碱基的平均分子量；重组质粒的总长度单位为bp。
将标准品质粒作10倍梯度稀释，将浓度梯度起始模板数的对数值设为Y轴，相应的循环数Ct值为X轴作回归曲线，由MiniopticonReal-TimePCRDetectionSystem(Bio-Rad,USA)绘制定量PCR动力学曲线和标准曲线的表达方程式(见图6)。检测样品时，将相应的Ct值带入方程，即可得出样品的初始拷贝数。
结果见表1。
表1不同包装策略获得的假病毒GFP基因拷贝数(log10)变化
由表1可见，目的基因的拷贝数达到了3.63×107。证明包装出的乙脑假型病毒成功携带了报告基因GFP且具有很高的拷贝数。
4、乙脑假病毒滴度的测定
将HEK293细胞、BHK-21细胞分别以5×104-1×105个细胞/孔平行接种于6孔细胞培养板，细胞长至80％时，将浓缩并已经荧光定量的乙脑假病毒按EGFP基因拷贝数1×108/100ul稀释，每种细胞平行感染3孔，96h后荧光显微镜下观察照相。之后使用胰酶消化细胞，将细胞收集至2ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，使用500ulDMEM重悬后使用流式细胞仪对荧光细胞进行计数，对比不同细胞系对乙脑假病毒的敏感性。
倒置荧光显微镜照相结果如图7、图8所示，流式细胞仪分析如图9、图10所示。
结果显示乙脑假病毒能成功感染HEK293及BHK-21两种细胞，其中BHK-21细胞对乙脑假病毒最为敏感，流式细胞仪分析荧光率能达到12.3％，根据该结果使用公式(TU):TU/ml＝[(GFP计数呈阳性的细胞百分数/100)×转染时的总数×假病毒稀释倍数]/感染时假病毒液的体积(ml)可以计算出病毒滴度。
计算出乙脑假病毒对293细胞的感染滴度为(8.55±0.77)×104TU/ml，对BHK-21细胞的感染滴度为(1.48±0.39)×105TU/ml。
综上，通过电镜检测、蛋白印迹检测、RealtimeRT-PCR检测，证明本发明制备了乙脑假病毒，而且本发明的乙脑假病毒携带报告基因GFP且具有很高的GFP拷贝数，可以感染HEK293细胞和BHK-21细胞，对细胞的感染滴度高，取得了预料不到的技术效果。
实施例四本发明乙脑假病毒的应用：用于中和抗体评价的快速荧光抑制
试验
将BHK-21细胞以5×103-1×104个细胞/孔平行接种于96孔细胞培养板，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，细胞长至80％时即可用于试验。
将ELISA检测猪乙脑抗体呈阳性的血清样品作1:2倍比稀释(如表2所示)，每个稀释度作8个重复；将乙脑假病毒浓缩液按GFP基因拷贝数稀释至1×107/50ul，作为乙脑假病毒工作液。
在37℃下将血清样品与乙脑假病毒工作液各50ul在EP管中混合，然后依次加入96孔板中孵育，1h后弃去换含5％胎牛血清的DMEM培养液。96h后，用荧光素酶检测试剂盒裂解细胞，加显色液后用化学发光检测仪读数，读数结果见表2。
其中阴性血清为ELISA猪乙脑抗体呈阴性的血清样品，细胞对照为只有细胞和培养基，不加入病毒和血清的对照。
表2不同稀释梯度中和抗体评价的荧光强度读数
由表2可见，读取数值有较好的重复性，说明该方法可靠有效。统计结果见图11。稀释梯度为21-26时，假病毒被抗JEV阳性抗体完全中和，因此荧光强度读数与阴性对照相当，而在之后荧光强度读数随着血清的稀释比例逐渐增强，在血清稀释1024倍(210)也可检测出抑制效果，可见该方法有较高的灵敏性，同时可通过快速荧光灶抑制试验RFFIT结果计算公式求取中和抗体效价。适用于高通量的乙脑病病毒中和抗体检测。
综上，本发明从乙脑病毒SCYA201201株中克隆了M基因和E基因，并构建了重组载体pcDNA3.1-SPME。以重组载体pcDNA3.1-SPME作为慢病毒载体，和慢病毒辅助质粒一起制备乙脑假病毒用的试剂盒，可以高效的获得乙脑假病毒，获得的乙脑假病毒滴度高，取得了预料不到的技术效果。而且本发明的乙脑假病毒带有GFP和Luciferase双标记，可以直观的观察假病毒的制备效果，可以用于乙脑血清学诊断例如病毒中和抗体评价、病毒入侵宿主细胞机制模型研究及抗JEV药物的筛选，具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于：它是中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO：M2015570的重组菌DH5α/pcDNA3.1-SPME携带的重组质粒pcDNA3.1-SPME。
2.一种制备乙脑假病毒的试剂盒，其特征在于，它是由权利要求1所述的重组质粒pcDNA3.1-SPME和慢病毒包装质粒组成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：它还包括宿主细胞。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：
所述慢病毒包装质粒为pCDH-CMV-Luc–copGFP和psPAX2.1；
所述宿主细胞为HEK293T细胞。
5.权利要求2-4任意一项所述的试剂盒在制备乙脑假病毒中的用途。
6.一种乙脑假病毒的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a.将权利要求1所述的重组质粒pcDNA3.1-SPME和慢病毒包装质粒共转染宿主细胞；
b.培养宿主细胞48h；
c.收获细胞培养的上清液，即得乙脑假病毒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒包装质粒为pCDH-CMV-Luc–copGFP和psPAX2.1；所述宿主细胞为293T细胞；所述转染采用阳离子脂质体法转染；转染时pCDH-CMV-Luc–copGFP、psPAX2.1、pcDNA3.1-SPME的重量比为4:3:2。
8.权利要求6或7所述制备方法得到的乙脑假病毒。
9.权利要求8所述的乙脑假病毒在乙脑病毒中和抗体研究或乙脑药物筛选中的用途。
10.一种重组菌，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCCNO：M2015570的重组菌DH5α/pcDNA3.1-SPME。
CN201511033119.XA 2015-12-31 2015-12-31 一种乙脑假病毒及其制备方法 Expired - Fee Related CN105602991B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511033119.XA CN105602991B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种乙脑假病毒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511033119.XA CN105602991B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种乙脑假病毒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105602991A true CN105602991A (zh) 2016-05-25
CN105602991B CN105602991B (zh) 2020-06-02

Family

ID=55983333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511033119.XA Expired - Fee Related CN105602991B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种乙脑假病毒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105602991B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106497977A (zh) * 2016-11-30 2017-03-15 河南省华隆生物技术有限公司 一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
CN114573668A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种乙脑病毒样颗粒及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106497977A (zh) * 2016-11-30 2017-03-15 河南省华隆生物技术有限公司 一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
CN114573668A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种乙脑病毒样颗粒及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105602991B (zh) 2020-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Belova et al. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks–Evidence of virus replication and changes in tick behavior
CN103751774B (zh) 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用
CN109254155A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用
CN103966358B (zh) 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN107937349A (zh) 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN103122352A (zh) 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用
Uryvaev et al. Contamination of cell cultures with bovine viral diarrhea virus (BVDV)
CN105602991A (zh) 一种乙脑假病毒及其制备方法
CN107056898A (zh) 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用
CN107619822A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用
CN109402069A (zh) 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN103450355B (zh) 重组牛alpha干扰素及其应用
Liu et al. Recombinant bovine herpesvirus type I expressing the bovine viral diarrhea virus E2 protein could effectively prevent infection by two viruses
CN103539839A (zh) 肠道病毒71型的vp2抗原的中和表位多肽及其用途
CN106399365A (zh) 一种表达载体及表达猪氨肽酶N的Vero细胞系
CN113604438A (zh) 一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用
CN103255111B (zh) 绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用
CN106929487A (zh) 一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒及其制备方法
Lukač et al. Molecular detection of PCV2 and PPV in pigs in Republic of Srpska, Bosnia and Herzegovina
Zhu et al. Identification and rapid diagnosis of the pathogen responsible for haemorrhagic disease of the gill of Allogynogenetic crucian carp
CN106636149A (zh) 斯氏副柔线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表达方法及应用
CN105738624A (zh) 一种裂谷热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法
Zhou et al. Establishment of an efficient and flexible genetic manipulation platform based on a fosmid library for rapid generation of recombinant pseudorabies virus
CN105963682B (zh) 鸟苷酸结合蛋白5在制备抗病毒药物中的应用
CN116203245A (zh) 一种盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200602

Termination date: 20201231

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee