CN114573668A

CN114573668A - 一种乙脑病毒样颗粒及其制备方法

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Publication number: CN114573668A
Application number: CN202110269976.9A
Authority: CN
Inventors: 谷宏婧; 王慧; 赵忠鹏; 杨晓岚; 张良艳
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN114573668B

Abstract

本发明涉及一种乙脑病病毒颗粒及其制备方法，属于生物技术领域。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用昆虫表达系统，获得稳定表达蛋白的杆状病毒，扩大培养表达蛋白浓缩后得到一种乙脑病毒颗粒。

Description

一种乙脑病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种乙脑病毒样颗粒及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

控制病毒的主要措施是主动免疫预防，而预防性疫苗是其中重要表现形式。目前针对不同病毒类的储备疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗及亚单位疫苗等。其中传统的灭活疫苗及裂解疫苗存在免疫效果局限、动物安全性差及具有副反应等问题，逐渐被取代；减毒活疫苗存在安全隐患、病毒返祖风险；亚单位疫苗避免毒力恢复的风险，但体外表达蛋白难以保持自然构象不能激活机体产生完全体液免疫或细胞免疫。因此，快速研制出能够诱导保护性免疫应答、安全、高效的疫苗对疫苗产业仍是巨大挑战。

病毒样颗粒(VLPs)是由多个病毒的一种或几种结构蛋白组装而成的大颗粒，不含病毒核酸，不能进行自主复制，具有与病毒颗粒类似的整体结构。VLPs 由于具有安全性高，在结构上与病毒粒子相似，可通过与病毒粒子相同的途径激起免疫系统的有效应答。生产基于VLPs的生物药物，关键在于能够大规模制备得到高质量的VLPs。VLPs的制备主要包括病毒结构基因的克隆与表达、选取宿主表达系统、纯化和鉴定等。由于不同VLPs的构建在结构和组成上并不相同，每种VLPs的表达、纯化及鉴定方法会存在个性问题，尽管VLPs的研究越来越多，但其生产过冲依然面临很多挑战，如表达过程中表达量不够，不能形成正确的组装体，纯化过程难以同时兼顾高的收率和纯度等。

乙型脑炎病毒(JEV)简称乙脑病毒，是乙型脑炎的病原体，主要流行在东南亚和太平洋地区，在全球范围内每年引起约68,000例乙脑病例，死亡约10,000 例。病毒感染严重危害中枢神经系统，约有50％的幸存者患有伴随终生的神经系统后遗症。近年来，乙脑病毒引起的感染范围正在扩大。目前尚无关于乙脑病毒样颗粒的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乙脑病毒颗粒及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种乙脑病毒样颗粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种乙脑病毒样颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种乙脑病毒样颗粒的制备方法，所述方法步骤如下：

(1)利用分子生物学方法，利用限制性内切酶XhoⅠ与BamHⅠ合成所示的基因序列SEQ ID No.1，双酶切片段连接，挑选阳性克隆，构建重组穿梭质粒；

(2)经穿梭质粒转座，用PCR方法对转座菌株进行鉴定，挑选纯化菌株；

(3)提取重组杆粒，转染昆虫细胞，观察细胞状态，当细胞有破碎现象时，收集细胞上清液即为P1代病毒，按照MOI＝0.5传代，获得P3代稳定表达蛋白的病毒株；将表达蛋白浓缩纯化后得到一种乙脑病毒样颗粒。

附图说明

图1为实施例1中pFastBacI-JEV-E-Ferrin菌株的PCR鉴定结果；

图2为实施例1中转座菌株的PCR鉴定结果；

图3为实施例1中转染空白杆粒72小时细胞病变图；

图4为实施例1中重组杆粒转染SF9细胞病变图；

图5为实施例1中Western blot检测目的蛋白示意图；

图6为实施例1中制备得到的病毒样颗粒示意图；

图7为实施例1中制备得到的病毒样颗粒的粒径分布图；

图8为实施例1中免疫小鼠血清特异性JEV特异性抗体效价结果；

图9为实施例1中免疫小鼠血清特异性JEV特异性抗体中和效价结果；

图10为实施例1中免疫小鼠细胞免疫应答分泌IL-4淋巴细胞计数结果；

图11为实施例1中免疫小鼠细胞免疫应答分泌IFN-γ淋巴细胞计数结果；

图12为实施例1中小鼠保护性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例方式对本发明的内容作出进一步详细说明。

实施例1基于乳铁蛋白乙脑病毒样颗粒(E-Ferrin)制备及免疫保护性评价

本实施例提供了基于乳铁蛋白的乙脑病毒样颗粒，该病毒样颗粒表达名称为JEV-E-Ferrin,所述的JEV-E-Ferrin的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，合成的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。

一、JEV-E-Ferrin病毒样颗粒的序列设计

合成如SEQ ID NO.1所示的基因，其中，SEQ ID No.1中自5’端起第1 位至第6位为酶切位点Xho1，SEQ ID NO.1第7-528为人乳铁蛋白轻链的522 个核苷酸，SEQ ID NO.1第523-573位为3个重复GGGGS的linker，SEQ ID NO.1 第574-854位为乙型脑炎E蛋白的MHCIII的抗原区(即为E蛋白的307-398位氨基酸，参考序列NP_775666.1)。

SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.2：

二、重组JEV-E-Ferrin杆状病毒的制备

以人乳铁蛋白轻链为骨架嵌合靶基因的靶点，构建重组穿梭质粒 pFastBacI-JEV-E-Ferrin。

利用分子生物学方法，利用限制性内切酶XhoⅠ与BamHⅠ合成所示的基因序列SEQID No.1，双酶切片段连接至载体pFastBacI，挑选阳性克隆，构建重组穿梭质粒pFastBacI-JEV-E-Ferrin，利用鉴定PCR引物进行鉴定(图1)与测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变，将经鉴定正确的重组质粒命名为pFastBacI-JEV-E-Ferrin。鉴定PCR的反向引物5’到3’的序列为 GGATCCTTATTTGTGCCAATGGTGG，正向引物5’到3’的序列AGATGTCCCAGATTCGTCAGA。

反应体系如下：

2×PCR mix Reaction:10微升

鉴定PCR反向引物：1微升

鉴定PCR正向引物：1微升

模板菌液：1微升

水：7微升

总体积：20微升

经穿梭质粒转座感受态DH10，用PCR方法对转座菌株进行鉴定。图2所示，挑选5株菌株进行鉴定，在3058bp出现阳性条带，选择2号 Bacmid-JEV-E-Ferrin菌株进行划线纯化。挑选纯化菌株，送生工测序，测序成功。

提取重组杆粒Bacmid-JEV-E-Ferrin，转染SF9细胞，观察细胞状态。24小时后，细胞不再生长，与正常细胞(图3)比较数目减少。72小时后，细胞有破碎现象(图4)。这时，收集细胞上清液即为P1代病毒。按照MOI＝0.5传代，获得P3代稳定病毒株。浓缩P3代稳定病毒株，进行WB的检测，如图5 所示，利用乳铁蛋白的抗体与JEV E蛋白抗体检测出30KD蛋白条带，说明成功表达出此融合蛋白。

将稳定的病毒株扩大培养收集上清液，超速离心20000rpm，4小时。利用 PBS缓冲液重悬，配置20％、40％、60％的蔗糖，在离心管中依次加入3ml 20％蔗糖、3ml40％蔗糖及3ml60％蔗糖，加入4ml上样样品，超速离心20000rpm， 8小时，按照分层进行取样品。将取出样品与PBS缓冲液按照1:9的比例进行混合，超速离心20000rpm，4小时,用1ml PBS进行重悬。

将上述纯化的重组蛋白颗粒，利用戊二醛固定进行电镜观察。镜下观察 JEV-E-Ferrin样品中形成类似病毒的颗粒物质，病毒的形态均一，颗粒直径集中在30nm(如图6和图7所示)。

三、重组JEV-E-Ferrin病毒样颗粒免疫小鼠效果评价

选取免疫系统成熟6-8周龄BALB/C雌性(试验稳定性佳)小鼠作为受试动物，体重控制16-18g。但考虑到体重、饲养环境等这个非实验因素会影响试验，将小鼠分层随机化(计算机实现)分为不同剂量JEV-E-Ferrin与pbs组，纳米颗粒的剂量为5、10、20μg/只，肌肉注射，体积为100μL，两次免疫时间间隔为21天。首次免疫为0天，14天，35天进行尾静脉采血，35天取小鼠脾细胞进行相关细胞因子的检测。小鼠统一饲养于丰台区实验动物中心，动物进食、饲养环境等非实验因素对本实验影响。

(1)免疫小鼠血清E蛋白特异性IgG效价测定。

采用ELISA方法检测滴鼻免疫小鼠血清中RSV特异性IgG的抗体含量。

具体方法如下：

a用包被液将E蛋白稀释成1μg/mL浓度，100l/孔，4℃过夜。

b弃去液体，加200L/孔静置5分钟，再弃去液体，甩干，重复3次。

c加入200L/孔封闭液，37℃孵育2小时。

d稀释一抗：将采集血清稀释50倍，随后进行倍比稀释。

e孵育一抗：每孔加入100L待测血清，37℃孵育1小时。

f弃去一抗，步骤同b。

g孵育二抗，按照1:20,000稀释二抗，每孔加入100L稀释的二抗，37℃孵育40分钟。

h弃去二抗，步骤同b。

i配制显色液：底物液9.5mL,TMB 0.5mL,0.75％双氧水32L。加入100L显色液，37℃孵育，观察颜色变化，直至颜色变为蓝色，加入50l2mol硫酸终止液。

j读取波长为450nm吸光度。

k数据计算：

不同剂量的JEV-E-Ferrin与PBS三组实验中，二次免疫(28天)，20μg剂量组IgG抗体效价达到10240，均显著高于10μg组(p<0.001)与5μg剂量组 (p<0.001)如图8所示。5μg与10μg组28天的效价为960与2560。

(2)CPE方法测定中和滴度

分离二免后的14天的血清，采用CPE方法测定中和效价。血清56℃，30 分钟灭活，用MEM将灭活的血清从1:10开始，2倍比连续稀释，与含有100TCID50的JEV的病毒液等体积混合，将混合液孵育到细胞上，72小时记录病变程度，利用Reed and Mench方法换算中和滴度。

如图9所示，20μg组中和滴度均值为112；10μg的中和滴度均值为52；5μg 的中和滴度均值为10；可见20μg组的中和滴度约是10μg组的2倍。

(3)测定免疫小鼠后的细胞免疫

首先分离小鼠淋巴细胞具体方法如下：

a断颈处死小鼠，取脾脏，研磨，利用小鼠淋巴细胞分离液(达优，7211011) 分离淋巴细胞。

b.用PBS对IL-4和IFN-捕捉抗体进行1:200稀释，每孔加入100L，4℃包被过夜。

c.弃去封闭液，每孔加入106个细胞。

d配制5μg/mL的ConA溶液,每孔加入100L。

e放入37℃，5％CO₂培养箱，IFN-培养24小时，IL-4培养48小时。

f弃去细胞悬液，每孔加入200L预冷的去离子水，4℃冰浴10分钟。加入无菌水200L每孔，放置3-5分钟，弃去上清，重复两次。

g每孔加入200L洗涤液，放置5分钟，甩干，重复3次。注意：确保孔无液体。

h用含有10％PBS的血清的PBS 1:250稀释IL-4和IFN-的检测抗体，每孔加入100L，室温孵育2小时。

i弃去检测抗体，每孔加入200l PBST,静置5分钟，重复3次，弃掉洗液。

j用含有10％PBS的血清的PBS 1:10稀释结合酶，每孔加入100L，室温孵育1小时。

k弃去结合酶，每孔加入200L PBST，放置5分钟，甩干，重复4次。

l每孔加入200LPBS，放置5分钟，扣干。

m每孔加入100L已配好的AEC显色液，室温静置，注意避光。观察斑点。

n待斑点生长到合适大小时，弃去显色液，用去离子水洗涤2次，终止显色过程，将板内液体在吸水纸上扣干，取下保护层，置于通风处，使膜自然晾干。

o将ELISPOT板放在自动读板机，进行计数，绘图并分析。

如图10所示，20μg剂量组免疫产生能够分泌IL-4淋巴细胞数目为134±7， 10ug剂量组免疫产生能够分泌IL-4淋巴细胞数目为121±7，5μg剂量组免疫产生能够分泌IL-4淋巴细胞数目为92±7，可见20μg剂量组显著高于5μg组。

如图11所示，20μg剂量组免疫产生能够分泌IFN-γ淋巴细胞数目为184 ±14，10μg剂量组免疫产生能够分泌IFN-γ淋巴细胞数目诶126±2,5μg剂量组免疫产生能够分泌IFN-γ淋巴细胞数目为101±4，可见20μg剂量组显著高于5μg组。

比较中剂量组的IL-4与IFN-γ分泌的淋巴细胞数目相近，高剂量组的IL-4 比IFN-γ数目多，但无显著性差异，说明病毒样颗粒并无细胞免疫偏好。

(4)JEV-E-Ferrin对致死性JEV p3株感染的保护性

为了评价JEV-E-Ferrin激发保护性免疫的效果，经过两次免疫后，利用JEV P3株致死剂量(2×10⁵TCID₅₀)腹腔注射小鼠，观察5μg、10μg、20μg及PBS 生存率。

如图12所示，5μg组存活率为20％，10μg存活率为60％，20μg剂量组存活率为100％，说明高剂量20μg组能够完全保护P3毒株的感染。

综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

核苷酸和氨基酸序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种乙脑病毒样颗粒及其制备方法

<160> 14

<210> 1

<211> 859

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223>

<400> 1

gtcgagatgt cccagattcg tcagaattat tccaccgacg tggaggcagc cgtcaacagc 60

ctggtcaatt tgtacctgca ggcctcctac acctacctct ctctgggctt ctatttcgac 120

cgcgatgatg tggctctgga aggcgtgagc cacttcttcc gcgaattggc cgaggagaag 180

cgcgagggct acgagcgtct cctgaagatg caaaaccagc gtggcggccg cgctctcttc 240

caggacatca agaagccagc tgaagatgag tggggtaaaa ccccagacgc catgaaagct 300

gccatggccc tggagaaaaa gctgaaccag gcccttttgg atcttcatgc cctgggttct 360

gcccgcacgg acccccatct ctgtgacttc ctggagactc acttcctaga tgaggaagtg 420

aagcttatca agaagatggg tgaccacctg accaacctcc acaggctggg tggcccggag 480

gctgggctgg gcgagtatct cttcgaaagg ctcactctca agcacgacgg aggaggagga 540

tggggaggag gaggatgggg aggaggagga tggaaattct cgttcgcgaa aaatccggcg 600

gacactggcc acggaacagt tgtcattgaa ctatcctact ctgggagtga tggcccctgc 660

aaaattccga ttgtctccgt tgcgagcctc aatgacatga cccccgttgg gcggctggtg 720

acagtgaacc ctttcgtcgc gacttccagt gccaactcaa aggtgctggt cgagatggaa 780

ccccccttcg gagactccta catcgtggtt gggaggggag acaagcagat caaccaccat 840

tggcacaaat aaggatcc 859

<210> 1

<211> 250

<212> Amino acid sequence;

<213>Artificial sequence

<220>

<223>

<400> 2

SQIRQNYSTD VEAAVNSLVN LYLQASYTYL SLGFYFDRDD VALEGVSHFF RELAEEKREG 60

YERLLKMQNQ RGGRALFQDI KKPAEDEWGK TPDAMKAAMA LEKKLNQALL DLHALGSART 120

DPHLCDFLET HFLDEEVKLI KKMGDHLTNL HRLGGPEAGL GEYLFERLTL KHDGGGGSGG 180

GGSGGGGSKF SFAKNPADTG HGTVVIELSY SGSDGPCKIP IVSVASLNDM TPVGRLVTVN 240

PFVATSSANS KVLVEMEPPF GDSYIVVGRG DKQINHHWHK 250

Claims

1.一种乙脑病毒样颗粒，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种乙脑病毒样颗粒，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种如权利要求1所述的乙脑病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

(1)利用分子生物学方法，利用限制性内切酶XhoⅠ与BamHⅠ合成所示的基因序列SEQ IDNo.1，双酶切片段连接，挑选阳性克隆，构建重组穿梭质粒；

(3)提取重组杆粒，转染昆虫细胞，观察细胞状态，当细胞有破碎现象时，收集细胞上清液即为P1代病毒，按照MOI＝0.5传代，获得P3代稳定表达蛋白的病毒株；将表达蛋白浓缩纯化后获得一种乙脑病毒样颗粒。