CN105400798A

CN105400798A - 引起对抗黄病毒的免疫应答的抗原及其应用方法

Info

Publication number: CN105400798A
Application number: CN201510712955.4A
Authority: CN
Inventors: M.P.拉曼纳森; N.Y.萨德塞
Original assignee: VGX Pharmaceuticals LLC
Current assignee: VGX Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2009-11-17
Publication date: 2016-03-16
Also published as: BRPI0921359A2; EP2358733B1; WO2010057159A3; EP2358733A2; CN102292345A; EP2358733A4; CA3001374A1; WO2010057159A2; AU2009313714A1; AU2009313714B2; US8961994B2; CA2740598C; CN102292345B; JP5763541B2; CA2740598A1; KR20110086610A; US20110262394A1; JP2012509067A; KR101667069B1

Abstract

本发明的各方面涉及编码蛋白E的共有DIII域的分离核酸，和利用该分离核酸制备的疫苗，以及利用上述核酸和疫苗在宿主中产生对抗黄病毒、特别是西尼罗河病毒和日本脑炎病毒的多种血清型的免疫应答的方法。

Description

引起对抗黄病毒的免疫应答的抗原及其应用方法

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2009年11月17日；申请号：200980145447.5；发明名称：同上。

技术领域

本发明涉及引起对抗黄病毒的免疫应答的抗原及其应用方法。

背景技术

日本脑炎病毒(JEV)血清复合组(serocomplex-group)由包含西尼罗河病毒(WNV)和JEV的蚊传播黄病毒组成，这两种病毒均可引起人类的严重脑炎。自从1999年WNV进入美国以来，其迅速传遍美国，其在西半球的地理分布预计将进一步扩大，而JEV是东南亚、中国和印度的病毒脑炎的最常见原因。目前，尽管在努力开发针对这两种病毒的疫苗，但对二者还没有FDA批准的特定治疗。

黄病毒西尼罗河病毒(WNV)和日本脑炎病毒(JEV)是引起人类大部分病毒性脑炎的原因。WNV感染广泛的禽类和包括人在内的哺乳动物物种。已显示，WNV可通过输血、器官移植和哺乳来传播。西尼罗河脑炎(WNV)病毒覆盖了包括南欧、非洲、中亚以及最近的北美的广大地理区域。该病毒在以色列、埃及、印度和巴基斯坦通常造成脑膜脑炎的症状。在埃及，该病毒是所有脑膜炎和无菌性脑炎中3％的原因。JEV是亚洲的病毒性脑炎的最重要的单种原因，病死率平均为30％。JEV是东南亚、印度和中国的主要问题，该病毒是这些地区的地方病。近年来，JEV已传播到其他地理区域，例如澳大利亚和巴基斯坦，并且因此造成这些地区的重要新兴病毒感染。

日本脑炎(JE)是包括大脑、小脑和脊髓在内的中枢神经系统的炎症。已显示，利用来源于小鼠脑的灭活疫苗进行针对JEV的接种非常有效并减少了疾病负担。然而，对该疫苗的免疫原性和安全性还有担忧。我们由原代仓鼠肾(PHK)细胞产生的活减毒的基于细胞培养的JEV疫苗在中国已经获得批准，该疫苗显示安全有效。然而，由于PHK不是经证实可产生人疫苗的细胞系，许多国家不使用这种JEV疫苗。

JEV感染被看作是脑炎的最严重病毒性原因之一，死亡率达到30-50％，并且幸存者中有高百分比的神经后遗症[8]。因此，地区和国内公共卫生机构(包括WHO)通常推荐病区的居民进行针对日本脑炎的大规模免疫程序。在发达的非病区国家，JE被看作是罕见的外来疾病。但近几十年来，来自非病区的游客和其他旅行者中的感染病例报告几乎每年都有报道。然而，有危险的国际旅游者人群中疫苗覆盖率非常低，这不仅是因为部分旅行者及其旅行健康顾问缺乏对该病的认识，还因为惧怕与目前批准的小鼠脑来源的JEV疫苗JE-VAXR相关的潜在有害反应[33]。

JE-VAXR是由小鼠脑产生的福尔马林灭活的疫苗，在日本批准用于儿童，在美国和一些欧洲国家批准用于旅行者和军人。对多剂量方案的需要和与反应原性相关的问题使其应用复杂化。在发展中国家，需要无需频繁加强即可引起持续免疫的可负担的疫苗来控制JE。小鼠脑来源的JEV疫苗几十年来已广泛用于亚洲各国和一些发达国家。在澳大利亚、欧洲和北美接受免疫的成人中，已报道了严重的副反应，所述副反应由风疹或血管性水肿构成，在某些情况中还有呼吸困难。这些副反应的出现率不一，为每10000次注射中小于1至104次，其中过敏反应是所涉及的主要原因之一。

黄病毒的E蛋白最具有免疫原性，适于疫苗开发。蛋白E由3个结构域(DI、DII和DIII)组成，其中DIII主要含有亚复合体和类型特异性表位。数种基于DIII的疫苗在某些情况下已显示出具有免疫原性和有效性。

DIII蛋白在若干WNV和JEV株之间高度保守。WNV的DIII与JEV的DIII的整体氨基酸同一性和相似性的值分别大约为81％和94％。DIII充当受体结合域，形成可独立折叠的连续多肽部分。当然，DIII内的突变已显示出影响黄病毒的毒力和趋向性。rDIII是较稳定的蛋白，因此可成为具有吸引力的抗原。由于天然DIII也不被糖基化，因此在原核细胞中细菌表达过程中蛋白糖基化的缺乏很可能不影响其抗原性。在受各毒力病毒侵染的小鼠中，JEV和登革热病毒的重组DIII已显示了免疫原性和保护性，表明DIII基疫苗制剂抗黄病毒的适合性。然而，在前期尝试中，可以清楚看到需要相对高浓度的rDIII来诱导中和抗体应答，表明rDIII免疫原性较差。

最近对来自亚洲的JEV株的分子分析将该株分为4个不同基因型群[37]。由于现有的JEV疫苗只是基于JE的一个株，因此这种高度的序列多样性带来了对抗循环株JEV的JEV疫苗的交叉保护效果的问题和担心[12,13]。

与例如免疫疗法中的活减毒病毒和基于重组蛋白的疫苗等传统疫苗相比，DNA疫苗具有若干优势[24-26]。人体中DNA疫苗表现出极好的耐受性。临床前安全性研究表明，没有质粒整合的证据，并且由于质粒载体的功效不受预先存在的中和抗体的影响，DNA疫苗还可用于反复施用。此外，DNA疫苗似乎非常稳定并且制备简单。然而，最初研究报告DNA疫苗在大型动物和人中显示了较低效价。

使疫苗开发的问题复杂化的是，虽然通常认为循环中的所有株都属于由中和限定的单一血清型[37]，但黄病毒RNA基因组具有较高突变率，因此亚洲和澳大利亚人群中循环的JEV具有遗传多样性[35,36]。

仍然需要安全有效的JEV疫苗来保护哺乳动物对抗多种JEV和WNV血清型。还仍然需要可有效增强DNA疫苗的免疫应答的有效佐剂。

发明内容

本发明的一个方面包括编码蛋白E的共有DIII域的分离核酸。这些核酸可以包括核苷酸序列：(a)SEQIDNO:12、13或14；(b)编码氨基酸序列SEQIDNO:9、10或11的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的互补物。在本发明的另一方面，提供了包含本文提供的分离核酸的遗传构建体。在一些实施方式中，遗传构建体可包括Kozak序列GGTACCGCCACC(SEQIDNO.15)和/或选自IgG或IgE的一部分的前导序列。

在本发明的另一方面，提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有:(a)SEQIDNO:9、10或11；或(b)(a)的片段。

还有下述的本发明的方面，即能够在宿主中产生对抗多种WNV和JEV血清型的免疫应答的DNA疫苗，所述疫苗包含:(a)包含启动子的遗传构建体，所述启动子与含有本文提供的分离核酸的编码序列可操纵连接；和(b)药学上可接受的赋形剂；其中，所述遗传构建体能够在宿主细胞中以效引起免疫应答的量表达蛋白E抗原的共有DIII域。

在本发明的一个方面，提供了在宿主中引起对抗多种黄病毒的病毒血清型的免疫应答的方法，所述方法包括：(a)将本文提供的疫苗递送到宿主的组织中；和(b)利用递送能量脉冲的电穿孔设备将组织的细胞电穿孔，所述能量脉冲有效地使疫苗的遗传构建体进入细胞。

附图说明

本领域技术人员参考附图可以更好理解本发明的多个目标和优势，在附图中：

图1A-E:图1A，具有由病毒和宿主细胞蛋白酶催化的切割位点的黄病毒多蛋白的组织结构。黄病毒的E的三维构象显示具有3个不同域，即域I、II和III。右侧，质粒图谱揭示了该研究中所用的疫苗构建体的各种元件。图1B，给出了DV-U的共有氨基酸序列。对使分泌过程最大化的IgE-前导序列下划线。图1C，JEVDIII、嵌合JE/WNVDIII和WNVDIIIJE/WNVDIII片段的限制性消化表明了DIII编码区的长度(435bp)。泳道左端，显示了DNA梯形带。图1D，DNA疫苗构建体的体外表达。DNA疫苗构建体产生的35S-标记的基因产物在SDS凝胶中进行解析，如“材料与方法”中所述。蛋白产物对应于质量约16.5kDa的迁移率。缺乏对应于pVAX空载体的蛋白产物表明该反应的特异性。图1E，RD细胞中DIII-疫苗构建体的表达分析。以疫苗构建体转染细胞，在转染后2天，通过RT-PCR分析细胞中是否存在DIII-特异性mRNA转录物。假转染细胞不能出现适当的扩增产物。利用适当的引物，在DIII-构建体转染的细胞中观察到约435-bp的产物，这证实了相应DIII-编码转录物的存在。

图2A-C:图2A.3种不同IL15同种型的定位。将HeLa细胞转染表达SSP或LSP或OPTIL15同种型的质粒，并在转染36小时后通过免疫荧光测试进行分析。将细胞固定、与单克隆抗-IL15抗体温育，然后与抗小鼠FITC-偶联二抗温育。用DAPI对细胞的核内容物进行复染色。将空载体用作负对照，假转染细胞未产生任何特异性染色(a-c)。IL15-SSP同种型不分泌，而是储存在细胞内并出现在核组分中(d-f)，但IL15-LSP同种型(g-i)和人密码子优化的IL15(j-1)与分泌的IL15关联，清楚显示在细胞质区域中。图2B，IL15同种型的分泌水平。RD细胞以IL15表达构建体(1μg/孔)转染，两天后通过ELISA分析上清中是否存在分泌的IL15蛋白。IL15ECRO表达构建体产生最高水平的IL15分泌。图2C，为了比较分泌水平，将IL15LSP和OPT构建体分泌的量显示为相对于SSP形式的增长倍数。

图3：DIII蛋白片段的细菌生产和纯化。将DIII-编码区克隆到pQE30-表达载体，按照“材料与方法”中所述从细菌裂解物中纯化蛋白样品。对PAGE的考马斯染色显示了在细菌表达体系中纯化过程的不同阶段收集的样品。与Ni-柱结合之后，含有20mM-咪唑的洗脱缓冲液不能将DIII片段释放，250mM的咪唑有效地选择性洗脱了组氨酸标记-DIII片段。标出了具有合适分子量(16.5kDa)的纯化DIII片段的明显条带。

图4A-B:图1A.显示了接种和免疫的流程计划。通过电穿孔仪(VGXPharmaceuticals,BlueBellPA)对BALB/c小鼠以20Xg疫苗构建体或pVAX空载体相隔2周进行免疫，并在一周后处死。图1B，抗-DIII血清与纯化DIII片段特异性反应。将DIIIDNA-接种的小鼠的血清在37℃在96-孔Ni-螯合板上与1μg/孔的纯化DIII蛋白样品温育1小时。利用抗小鼠IgGHRP通过常规显色程序检测适当抗体的生成。在450nm读取平板。值表示3个重复孔的平均值(±}S.D)。

图5A-B：用DNA-接种的小鼠的血清对DIII-转染细胞进行染色。以表达疫苗构建体的pVAX或pWNVDIII(图5A中的片)或pJEVDIII(图5B中的片)转染HeLa细胞。转染后2天，将细胞固定，并以用这些DNA疫苗构建体免疫的BALB/c小鼠的血清进行温育。然后将细胞与FITC-偶联的抗小鼠二抗以及将细胞核内容物复染色的DAPI进行温育。各组下方给出了缺乏适当染色的pVAX-血清样品。

图6:EDIIIELISpot。用20μgpVAX载体或DIII-表达构建体对BALB/c小鼠免疫3次，每次相隔2周，1周后处死。收集脾细胞，在R10(阴性对照)或2μg/ml的3种纯化DIII蛋白样品中的任何一种的存在下过夜培养。利用自动ELISPOT读板器对点形成单位(Spotformingunit)进行定量，并将原始值相对于每一百万个脾细胞的SFU进行标准化。值表示3个重复孔的平均值(±}S.D.)。

图7：显示了DNA构建体pVAXl-WNVDIII、pVAXl-JEVDIII和嵌合构建体pVAXl-JWDIII的质粒图谱。

具体实施方式

给出以下简要或短小的定义来帮助理解本发明的优选实施方式。本文给出的简要定义是非穷尽性的，并且不与本领域所理解的定义或工具书解释相抵触。本文给出的简要定义是为了补充本领域已知定义或使本领域已知定义更清楚。

定义

本文所用的核苷酸和氨基酸的序列同源性可利用FASTA、BLAST和GappedBLAST(Altschul等人,Nuc.AcidsRes.,1997,25,3389，通过参考将其整体并入本文)以及PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)确定。简而言之，BLAST算法(表示BasicLocalAlignmentSearchTool)适合于确定序列相似性(Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410,通过参考将其整体并入本文)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。BLAST算法所提供的相似性的一个度量是最小和值概率(P(N))，其表明了两个核苷酸序列之间偶然发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与另一核酸相比时最小和值概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与另一核酸相似。可利用PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)计算"相似性百分率"。计算共有序列与进化树中所有序列相比的平均相似性。

本文所用的"互补物"或"互补的"是指可以在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间进行Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对的核酸。

本文所用术语"可表达形式"是指含有必需的调控元件的核酸构建体，所述调控元件与编码蛋白的编码序列可操纵连接，因此当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

术语"恒定电流"在本文中用于定义在递送至组织的电脉冲持续时间里，所述组织或限定所述组织的细胞所接受或经历的电流。电脉冲由本文所述的电穿孔设备递送。由于本文提供的电穿孔设备具有反馈元件，所述反馈元件优选具有即时反馈，因此所述电流在电脉冲的持续时间里在所述组织中保持恒定安培值。反馈元件在脉冲持续时间里可测定组织(或细胞)的电阻，并使电穿孔设备改变其电能输出(例如，增加电压)，从而使同一组织中的电流在整个电脉冲(微秒的级别)中和不同脉冲之间保持恒定。在一些实施方式中，反馈元件包含控制器。

术语"反馈"或"电流反馈"可以互换使用，并且表示所提供电穿孔设备的积极响应，这包括测定电极间组织中的电流，并相应改变EP设备所递送的能量输出，从而保持恒定水平的电流。这种恒定水平在开始脉冲顺序或电治疗之前由使用者预设定。优选的是，反馈由电穿孔设备的电穿孔部件(例如控制器)完成，这是由于其中的电路能够连续监测电极间组织中的电流，并将所监测到的电流(或组织中的电流)与预设定电流比较，和连续进行能量输出调节从而使所监测到的电流保持预设定水平。在一些实施方式中，反馈回路由于是模拟闭合回路反馈，因而是即时的。

术语"电穿孔"、"电通透化"或"电动增强"("EP")在本文可互换使用，是指使用跨膜电场脉冲来引起生物膜中的显微通路(孔)；这些通路的存在可以使诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水等生物分子由细胞膜的一侧到达另一侧。

术语"分散电流"在本文中用于限定由本文所述电穿孔设备的各针状电极阵列递送的电流模式，其中该模式使接受电穿孔的组织的任何区域上与热压力相关的电穿孔的发生最小化，或优选将其消除。

本文所用术语"反馈机制"是指由软件或硬件(或固件)进行的过程，该过程接受所需组织的阻抗(递送能量脉冲之前、过程中和/或之后)，并将其与预设定值(优选电流)进行比较，并调整递送的能量脉冲，从而取得预设定值。术语"阻抗"在本文中讨论反馈机制时使用，可以根据欧姆定律将其转换为电流值，从而能够与预设定电流进行比较。在优选实施方式中，"反馈机制"由模拟闭合回路电路进行。

术语"免疫应答"在本文中用于表示宿主免疫系统的激活，例如响应于经由所提供的DNA质粒疫苗而引入的黄病毒共有抗原的哺乳动物免疫系统的激活。免疫应答可以为细胞应答形式和/或体液应答形式。

术语"共有的"或"共有序列"在本文中用于表示合成核酸序列，或相应的多肽序列，所述序列基于对黄病毒抗原多种亚型的比对分析而构建。共有黄病毒抗原包括西尼罗河病毒(WNV)和日本脑炎病毒(JEV)的E蛋白的DIII域或组合了2种序列的元件的嵌合序列。

本文所用术语"片段"表示编码多肽的核酸或其一部分，所述多肽能够引起哺乳动物中的基本与共有DIII抗原中的至少一种的非片段相似的免疫应答。所述片段可以是选自本发明的各种编码核苷酸序列中的至少一种的DNA片段，包括SEQIDNO:12、13和14。DNA片段的长度可以为30个或更多个核苷酸、45个或更多个、60个或更多个、75个或更多个、90个或更多个、120个或更多个、150个或更多个、180个或更多个、210个或更多个、240个或更多个、270个或更多个、300个或更多个、360个或更多个或者400个或更多个核苷酸。DNA片段可包含诸如IgE或IgG序列等免疫球蛋白前导序列的编码序列。

DNA片段可以小于10个核苷酸、小于20、小于30、小于40、小于50、小于60、小于75、小于90、小于120、小于150、小于180、小于210、小于240、小于270、小于300、小于360或小于400个核苷酸。

"片段"还可以表示多肽片段，所述多肽片段能够引起哺乳动物中的基本与至少一种DIII蛋白(或抗原)的非片段相似的免疫应答。片段可以是选自本发明的各种编码多肽序列中的至少一种的多肽片段，包括SEQIDNO:9、10和11。可以对多肽片段进行分析从而将其与公用数据库提供的至少一种抗原性表位相联系。多肽DIII片段还可以包含诸如IgE或IgG等免疫球蛋白前导序列的氨基酸序列。多肽片段的长度可以为30个或更多个氨基酸、45个或更多个、60个或更多个、75个或更多个、90个或更多个、120个或更多个或者130个或更多个氨基酸。

多肽片段的长度可以小于10个氨基酸、小于20、小于30、小于40、小于50、小于60、小于75、小于90、小于120或小于130个氨基酸。

术语"佐剂"在本文中用于表示添加在本文所述DNA质粒疫苗中从而增强所需抗原、优选为共有抗原的免疫原性的任何分子，所述抗原由DNA质粒编码并编码下述核酸序列。

术语"亚型"或"血清型"在本文中可互换使用，表示病毒或其中表位的遗传变体，因此一个亚型以与不同亚型不同的方式被免疫系统识别，或者换而言之，一个亚型具有与另一亚型不同的免疫原性特征。

三种类型的DIII序列：共有JEVDIII、共有WNVDIII和嵌合序列JEV序列，该嵌合序列中在相应位置引入的WNVDIII残基(表示为JWDIII或JEV/WNDIII或WN/JEVDIII)[16,17]已显示是在抗WNV的中和抗体的诱导中的决定簇。所有这些序列在20个独立株间是共有的。利用共有序列开发DNA疫苗是抗击传染病的最前沿技术之一[22,23]。基于共有序列，制备合成的人密码子优化序列用于在该研究中进行免疫。

编码核苷酸

本发明的一个方面包括编码蛋白E的共有DIII域的分离核酸。这些核酸可以包括核苷酸序列：(a)SEQIDNO:12、13或14；(b)编码氨基酸序列SEQIDNO:9、10或11的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的互补物。在本发明的另一方面，提供了包含本文提供的分离核酸的遗传构建体。在一些实施方式中，遗传构建体可包括Kozak序列GGTACCGCCACC(SEQIDNO.15)和/或选自IgG或IgE(优选IgE，更优选具有序列SEQIDNO:8的IgE)的一部分的前导序列。

共有DIII蛋白可以由共有DIII核酸、其变体或其片段编码。可以对共有DIII核酸进行密码子优化和/或RNA优化。共有DIII核酸序列可含有前导序列。前导序列可以在DIII编码序列的5'。由该序列编码的共有DIII蛋白可以含有N-末端前导部，和其后的共有DIII蛋白。N-末端前导部可以为IgE或IgG。

多肽/抗原

本文提供了能够引起哺乳动物的免疫应答的抗原，所述免疫应答对抗一种或多种黄病毒血清型、特别是西尼罗河病毒和日本脑炎病毒的各种血清型。所述抗原能够引起哺乳动物的免疫应答，所述免疫应答对抗一种或多种黄病毒血清型，包括对抗一种或多种流行株。所述抗原可以包含下述表位，所述表位使所述抗原作为可以诱导抗-黄病毒免疫应答的免疫原特别有效。

在本发明的一个方面，提供了包含作为共有DIII蛋白的氨基酸序列的多肽。所述DIII蛋白可以含有:(a)SEQIDNO:9、10或11；或(b)(a)的片段。共有DIII蛋白在其N-末端还可以含有IgE或IgG前导氨基酸序列。IgE前导氨基酸序列可以如SEQIDNO:7所示。带有IgE前导序列的共有DIII蛋白可以具有氨基酸序列SEQIDNO:1、2或3，所述序列还可以分别含有JEVDIII、WNVDIII或JWDIII。

疫苗

本发明的一些方面是能够在宿主中产生对抗多种WNV和JEV血清型的免疫应答的DNA疫苗，所述疫苗包含:(a)包含启动子的遗传构建体，所述启动子与含有本文提供的分离核酸的编码序列可操纵连接；和(b)药学上可接受的赋形剂；其中，所述遗传构建体能够在宿主细胞中以有效引起免疫应答的数量表达蛋白E抗原的共有DIII域。

在一些实施方式中，本发明的DNA疫苗包括具有为核酸分子基因表达所必需的调控元件的遗传构建体。

在本发明的一些实施方式中，DNA疫苗还可以含有佐剂。佐剂可选自：α-干扰素、γ-干扰素、血小板来源的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞俘获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、包含删除了信号序列并可选含有IgE信号肽的IL-15的CD86、IL-12、IL-15、CTACK、TECK、血小板来源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-28、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2和其功能性片段或其组合。还可以将疫苗与CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或其功能性片段组合施用。

在一些优选实施方式中，佐剂是IL-15以及一种或多种其他佐剂。

遗传构建体

本文提供了可包含编码DIII抗原的核酸的遗传构建体。该遗传构建体可存在于细胞中，充当包含编码DIII抗原的核酸的染色体外分子，优选DNA质粒。该包含编码DIII抗原的核酸的遗传构建体可以是含有着丝粒、端粒的线性小型染色体。该遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。遗传构建体可以是减毒活微生物中的遗传物质的一部分，或生活在细胞中的重组微生物载体。遗传构建体可含有用于DIII核酸的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。编码目标蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。可以将这些元件可操纵地连接于编码所需蛋白的序列，调控元件可以在所施用的个体中具有功能性。

遗传构建体或载体还可以包含可操纵地连接于DIII编码序列的启动子。所述可操纵地连接于DIII编码序列的启动子可以是来自猿病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子、例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(例如CMV即早期启动子)、埃巴病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸或人金属硫蛋白(metalothionein)等人类基因的启动子。所述启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，所述启动子可以是天然的或合成的。这些启动子的实例在美国专利申请公开号US20040175727中有所描述，将其内容整体并入本文。

载体还可以包含聚腺苷酸化信号，所述聚腺苷酸化信号可以位于DIII编码序列的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,SanDiego,CA)的聚腺苷酸化信号。

载体可以含有DIII编码上游的增强子。DNA表达可能需要增强子。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸的或是病毒增强子，例如CMV、HA、RSV或EBV之一。多核苷酸功能增强在美国专利号5,593,972、5,962,428和WO94/016737中有所描述，将上述各篇文献内容通过参考完整并入。

遗传构建体可以具有哺乳动物复制起点，从而使构建体保持在染色体外，并在细胞中产生构建体的多个拷贝。Invitrogen(SanDiego,CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有埃巴病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区，这无须整合就可以产生高拷贝的游离复制。载体的骨架可以是pAV0242。所述载体可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)载体。

载体还可以含有非常适合于在载体所施用的哺乳动物或人细胞中进行基因表达的调控序列。DIII编码序列可以含有优化密码子，这可以使编码序列在宿主细胞中更高效地转录。

载体可以是pSE420(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，该载体可用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白。载体还可以是pYES2(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，该载体可用于在酵母菌的酿酒酵母株(Saccharomycescerevisiae)中生产蛋白。载体还可以是MAXBAC^TM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，该载体可用于在昆虫细胞中生产蛋白。载体还可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，该载体可用于在如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等哺乳动物细胞中生产蛋白。载体可以是通过常规技术和易得原材料(包括Sambrook等人，MolecularCloninganLaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor(1989)，通过参考将其完整并入)制备蛋白的表达载体或系统。

为了使蛋白生产最大化，可以选择非常适合于在构建体所施用的细胞中进行基因表达的调控序列。而且，可以选择在宿主细胞中最有效转录的编码所述蛋白的密码子，即，优化的密码子。本领域普通技术人员可制备在细胞中有功能的DNA构建体。

在一些实施方式中，可以提供其中本文所述蛋白的编码序列与IgE信号肽连接的核酸构建体。在一些实施方式中，本文所述蛋白与IgE信号肽连接。

所述载体可以是pVAX1-WNVDIII、pVAX1-JEVDIII或pVAX1-JWDIII，这些载体均可用于表达相应的DIII抗原。载体pVAX1-WNVDIII包含核苷酸序列SEQIDNO:5或13；载体pVAXl-JEVDIII包含核苷酸序列SEQIDNO:4或12；载体pVAXl-JWDIII包含核苷酸序列SEQIDNO:6或14。

免疫方法

可以将疫苗施用于哺乳动物，从而引起哺乳动物的免疫应答。所述哺乳动物可以是人、非人的灵长类动物、奶牛、猪、牛(cattle)、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛(bovid)、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，优选人、奶牛、猪或鸡。

可以利用数种公知技术中的任何一种来递送DNA疫苗，所述公知技术包括用和不用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)、脂质体介导、纳米颗粒辅助、重组载体(例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘)。优选的是，通过DNA注射以及体内电穿孔来递送核酸分子，如本文所述的DNA质粒。

施用途径包括但不限于，肌肉内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口腔施用，以及局部施用、透皮施用、吸入或栓剂或对粘膜组织施用，例如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织。优选的施用途径包括肌肉内、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建体的施用方法可以包括但不限于常规注射器、无针注射设备、"微弹轰击基因枪"或其他物理方法，如电穿孔("EP")、"流体力学方法"或超声。

优选用于辅助递送本发明的DNA疫苗的电穿孔设备和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人的美国专利公开号2005/0052630中描述的那些设备和方法，将所述文献的内容通过引用整体并入本文。还优选的是2007年10月17日递交的共同待审并且共同所有的美国专利申请序列号11/874072中提供的辅助DNA疫苗递送的电穿孔设备和电穿孔方法，该申请在35USC119(e)下要求2006年10月17日递交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日递交的美国临时申请序列号60/978,982的权益，将所述文献整体并入本文。

Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了标准电极系统，及其辅助将生物分子导入体内或植物中所选组织的细胞中的应用。该标准电极系统包括多个针状电极；皮下用针；提供从程序化恒流脉冲控制器到所述多个针状电极的导电性连接的电连接器；和电源。操作者可控制安装在支持结构体上的多个针状电极，并将它们紧紧插入体内或植物中所选组织里。然后经由皮下用针将生物分子递送到所选组织。将程序化恒流脉冲控制器激活，并将恒流电脉冲施加在多个针状电极上。所施加的恒流电脉冲帮助将生物分子导入所述多个电极之间的细胞内。在此将美国专利号7,245,963的全部内容通过参考方式并入本文。

Smith等人递交的美国专利公开号2005/0052630描述了可用来有效地辅助将生物分子导入体内或植物中所选组织的细胞中的电穿孔设备。该电穿孔设备包括运行由软件或固件规定的电动装置("EKD装置")。该EKD装置根据使用者控制和脉冲参数输入，在阵列中的电极间产生一系列程序性恒流脉冲模式，并且可以储存和获取电流波形数据。该电穿孔设备还包括具有针状电极阵列的可替换电极盘、注射针的中央注射通道和可移除的导向盘。在此将美国专利公开号2005/0052630的全部内容通过参考方式并入本文。

美国专利号7,245,963和美国专利公开号2005/0052630中论述的电极阵列和方法不仅适合于深深透入诸如肌肉等组织，还适合于深深透入其他组织或器官。由于电极阵列的构造，注射针(递送选择的生物分子)也完全插入目标器官，并且注射在电极预先限定的区域内垂直于目标器官进行。美国专利号7,245,963和美国专利公开号2005/005263中描述的电极优选长20mm，并且为21号(gauge)。

以下是本发明的方法实例，并且在上述专利参考文献中进行了更详细论述：可以构造电穿孔设备，从而向哺乳动物的所需组织递送产生与使用者输入的预设定电流相同的恒定电流的能量脉冲。所述电穿孔设备包括电穿孔部件和电极组件或控制组件。电穿孔部件包括且并入电穿孔设备的各种元件中的一个或多个，上述各种元件包括：控制器、电流波形产生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通讯接口、存储部件、电源和电源开关。电穿孔部件可以充当电穿孔设备的一个元件，并且其他元件是与电穿孔部件通讯的单独元件(或部件)。在一些实施方式中，电穿孔部件可充当电穿孔设备的多于一个元件，这些元件可以同与电穿孔部件分离的电穿孔设备的另外的元件通讯。本发明不限于作为一种电化学或机械设备的部分存在的电穿孔设备的元件，因为这些元件可充当一个设备或充当相互通讯的分开的元件。电穿孔部件能够递送在所需组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件包括在空间设置上具有多个电极的电极阵列，其中，电极组件接受来自电穿孔部件的能量脉冲，并将其通过电极递送至所需组织。多个电极中的至少一个在是能量脉冲的递送中是中性的，并且测定所需组织中的阻抗和将阻抗向电穿孔部件通讯。反馈机制可接受所测定的阻抗，并且可以调整电穿孔部件所递送的能量脉冲，从而保持恒定电流。

在一些实施方式中，所述多个电极可以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方式中，所述多个电极可通过程序化顺序对电极的控制以分散模式递送能量脉冲，并且所述程序化顺序由使用者输入到电穿孔部件。在一些实施方式中，所述程序化顺序包含顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的各脉冲由至少2个有源电极递送，所述至少2个有源电极中的一个是测定阻抗的中性电极，并且其中多个脉冲中的后续脉冲由至少2个有源电极中的另一个递送，所述至少2个有源电极中的一个是测定阻抗的中性电极。

在一些实施方式中，所述反馈机制通过硬件或软件进行。优选，所述反馈机制由模拟闭合回路电路执行。优选，该反馈每50μs、20μs、10μs或1μs进行，但优选为实时反馈或即时性的(即，通过测定响应时间的现有技术测定为基本即时性)。在一些实施方式中，中性电极测定所需组织中的阻抗，并将阻抗向反馈机制通讯，反馈机制响应于阻抗并调整能量脉冲，从而将恒定电流保持在与预设定电流相同的值。在一些实施方式中，在能量脉冲的递送过程中，反馈机制连续且即时地保持恒定电流。

实施例

在以下实施例中对本发明进行进一步说明。应该理解的是，这些实施例给出了本发明的优选实施方式，但仅是为了说明的目的而给出。从以上描述和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本发明的实质特征，并且可以不背离本发明的精神和范围而对本发明做出各种变化和改变，从而使其适合于各种用途和情况。因此，通过上述描述，除本文展示和描述的实施方式之外的对本发明的各种改变对本领域技术人员是显而易见的。这些改变也处于所附权利要求的范围之内。

与本发明EP装置一同使用的DNA质粒可利用已知装置和技术的组合来进行配制或制造，但优选其利用2007年5月23日递交的普通所有的共同待审美国临时申请美国序列号60/939,792中描述的优化质粒制造技术来制造。在一些实施例中，这些研究中所用的DNA质粒可配制为大于或等于10mg/mL的浓度。制造技术还包括或引入了本领域普通技术人员公知的各种设备和规程，除美国系列号60/939792中所描述的设备和规程之外，还包括2007年7月3日授权的共同所有的专利即美国专利号7,238,522中所描述的设备和规程。在此将美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522整体并入本文。

细胞系

HeLa细胞和RD细胞获得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。37℃，5CO2，在补充有10％热灭活胎牛血清、青霉素G(100U/ml)、链霉素(100ug/ml)的DMEM培养基中维持细胞。

间接免疫荧光测定

使用HeLa细胞进行间接免疫荧光测定。将细胞接种在2-室载玻片中，并在将其用于转染之前培养过夜。利用FuGENE6转染试剂(Roche)以疫苗构建体或pVAX(1mg/孔)转染细胞。转染后36小时，将细胞用甲醇室温固定20分钟，并以PBS温和洗涤。将细胞与来自已接种小鼠的抗小鼠血清温育90分钟，并再次洗涤。然后，将样品与FITC-偶联的二抗(Sigma-Aldrich)温育45分钟。向二抗溶液中加入40,6-二酰胺-2-苯基吲哚盐酸盐(Sigma-Aldrich)对核内容物进行复染色，从而显示给定视野中存在的细胞总数。利用荧光显微镜的相3Pro程序(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)获取图像。

统计分析

将所有值表示为各实验组的一式三份样品计算出的平均数±平均数的标准误(SEM)。适当时，利用双尾配对的学生t检验评估统计学差异，并产生各实验组的特定p值。通常，所示数据是一式两份或一式三份进行的至少3次独立实验的代表数据。

实施例1共有DNA疫苗构建体及合成

为了制备JEV和WNVEDIII共有序列，从GeneBank(NCBI)的不同地理区域收集了约15种不同序列，以避免采样偏差，并利用MegAlign(DNASTAR,Madison,WI)进行比对。在所得共有序列的氨基端添加IgE-前导序列，并在开放阅读框的末端添加2个终止密码子。5'端和3'端分别标记KpnI和PstI位点。利用GeneOptimizer(GENEART,Regensburg,Germany)对完整序列进行密码子优化和RNA优化。然后将经密码子优化的合成序列克隆到本文所述的pVAX1表达载体(Invitrogen)中。

将人IL-15ECRO克隆到pVAX1载体中和IL-15表达分析

天然IL-15含有2个不但涉及于IL-15翻译调控而且指导其细胞内运输的可变前导肽。经典长度(48aa)的信号肽与所有分泌形式的IL-15有关，但含有短的21aa信号肽的IL-15不分泌而是在细胞内储存(1-4)。质粒形式的优化人IL-15(pIL15ECRO)的设计需要将LSP替换为我们实验室设计用于增加蛋白表达的"优化的"IgE前导部分(5,6)。另外，改变密码子应用以适应人类基因的密码子偏好，从而得到较高的CAI值(未优化的:0.66；优化的:0.98)。由于人和小鼠基因具有73％同源性，因此我们在使用小鼠模型的情况下体内应用了pIL15ECRO。对于设计和合成，选择密码子以在可能情况下避免极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区域。对于这一点，已经确定野生型IL15基因使用了高频率的稀有密码子，并且GC含量相当低(35％)，这有助于快速mRNA周转。因此，增加GC-含量(57％)来延长mRNA半衰期。在优化过程中，避免以下顺式作用序列基序：内部TATA框、chi-位点和核糖体进入位点、富含AT或富含GC的序列区、ARE、INS、CRS序列元件、重复序列和RNA二级结构、(隐藏的)剪接供体位点和受体位点以及分支点。经过分析，确认并去除了3个负性顺势作用基序。最终设计的基因与其中IgE前导部分替换了野生型LSP形式的成熟形式的人IL15具有100％一致性(congruence)。合成的高度优化人IL15基因由Geneart,Inc.(Germany)的合成寡核苷酸组装。引入Kozak序列以增加翻译起始，引入2个终止密码子以确保有效终止。利用EcoRI和XhoI限制位点将该片段克隆到pVAX1中。通过测序确认最终构建体，发现100％一致。转染前一天，将D10培养基(DMEM,20％FBS,1％抗生素)中生长的7.0x10⁵HeLa细胞或RD细胞接种在60mm培养皿(Falcon)中。

然后，通过DOTAP脂质体转染试剂盒(RocheBiochemicals,CA)按照制造商的规程以5μg的IL-15构建体转染细胞。转染后24、48和72小时收集上清液，并按照制造商的规程通过ELISA(R&D)分析蛋白水平。

共有抗原的验证

在通过测序确认插入物序列后，在应用于接种研究中之前，验证DIII疫苗构建体表达具有适当分子量的基因产物的能力。利用体外翻译/转录系统(Promega,Madison,WI)，由这些构建体产生35S-标记的放射性蛋白产物，进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE进行解析。这些质粒产生了与开放阅读框的预测长度相对应质量的约16.5kDa的基因产物(图1D)。为了在细胞内表达过程中通过RT-PCR证实合适的mRNA转录物的存在，以空载体或携带DIII域的pVAX1构建体转染RD细胞。在表达各DIII-构建体的转染细胞里，仅在转染有DIII构建体的细胞中观察到约420bp的cDNA存在。假转染细胞中缺少相应信号，证实了该测试的特异性(图1E)。这些结果共同验证了JEV、WNV和JE/WNVDIII构建体，因此对它们进一步进行免疫研究。

IL-15ECRO构建体的表达分析

为了证实IL15的定位模式，将各所述IL15构建体转染HeLa细胞，并利用单克隆抗IL15抗体进行免疫荧光分析。与预期相同，IL15SSP保留在核区域中，而IL15LSP和IL15ECRO显示出细胞质定位模式(图2A)。接下来，进行RD细胞中的转染测试，以比较IL15-构建体的效率，即其表达和分泌功能性IL15的能力。所示数据显示，通过特异性ELISA分析[33](图2B和图2C)，观察到人优化构建体IL15ECRO的蛋白产生和分泌有显著增加(比天然IL-15高87倍，比IL-15-LSP构建体高5.7倍)。这些数据清楚表明，pIL15ECRO构建体比我们此前报道的所有IL15表达质粒更高效地表达和分泌IL15。

实施例2疫苗构建体的体外表达

在将构建体用于接种研究之前，证实了其产生具有预测分子量的基因产物的能力。通过在pVAX1骨架中利用T7-启动子，使用TNTT7体外转录/翻译试剂盒(Promega,Madison,WI)按照供应商的规程产生了35S-甲硫氨酸标记的蛋白样品。放射性标记的蛋白样品被免疫沉淀抗-WNVE或抗JEVE抗体，然后免疫沉淀的复合物在15％SDS-PAGE凝胶(BioRad)上电泳。利用磷强化(phosphoenhancer)溶液(Amersham)固定凝胶，并利用真空干燥器(Biorad)干燥。进行放射性自显影来检测所掺入的S35-标记的基因产物。

图1A示意性显示了黄病毒多肽的组织结构和E蛋白的构象特征。在开发能够引起高交叉反应性细胞应答的免疫原的工作中，从公共数据库下载了氨基酸序列JEV和WNVEDIII域。该序列选自不同地理区域并且是非-重组的。利用MegAlign(DNASTAR,Madison,WI)程序来比对氨基酸序列，并选择各位置的最常见氨基酸。我们制备了3个构建体，即，共有WNVDIII构建体、共有JEVDIII构建体和嵌合JEV构建体，在所述嵌合JEV构建体中在JEVDIII的相应位置引入了WNVDIII中显示为诱导中和抗体的决定簇的数个残基，并且不改变DIII片段的长度；该抗原称为JE/WNVDIII域(图1B)。该嵌合克隆的原理是具有可对WNV和JEV二者一起提供增强的免疫的单一疫苗构建体，而不是2个单独的疫苗构建体。产生共有序列之后，将IgE前导序列与DIII域编码序列的氨基端融合。根据氨基酸序列，构建并产生了所有3个疫苗构建体的人优化合成基因序列，并且将其克隆到pVAX载体中(图1C)。

实施例3细菌表达EDIII蛋白

通过用KpnI/PstI进行消化，将DIII编码区从其pVAX骨架中释放。将所释放的片段用凝胶纯化，然后连接到用KpnI/PstI消化的pQE-30中。将连接产物转化到JM109细胞中，将细胞铺在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。37℃下过夜形成菌落。从各菌落制备甘油储备物。对于蛋白表达，将3μl等分试样的甘油储备物加入到具有6毫升LB肉汤(含50μg/ml氨苄青霉素)的16x150mm试管中。按照标准规程，对得到的细菌沉淀进行处理，并将裂解物通过Ni-柱，以便纯化蛋白样品。将所得的经纯化的蛋白样品用作ELISA以及B-细胞增殖ELISpot测试的包被抗原。

JEV、WNV和JE/WNVDIII蛋白的制备

将DIII编码片段亚克隆到细菌表达载体中，并如本文所述利用Ni螯合柱纯化蛋白片段。图3显示了不同纯化步骤的DIII片段的纯化水平。含有表达DIII的细菌细胞的粗裂解物的泳道表明，即使不经IPTG诱导，DIII片段的表达水平也非常突出。与全粗样品泳道中存在的样品的多条带相比，在含有250mM咪唑的洗脱级分中观察到质量为16kDa的清晰的单一条带，表明所表达DIII片段的高纯度水平。20mM的咪唑不能充分将His标记的DIII样品从Ni螯合基质中释放。因此，洗脱缓冲液中咪唑的选择对His标记的蛋白的洗脱具有极高特异性。对纯化级分进行透析，并在确定浓度后以等分试样储存，以便后续将其在该研究中用作包被抗原。

实施例4小鼠和免疫

雌性6至8周龄C57BL/6小鼠购自Jackson实验室。对6至8周龄雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)的四头肌进行3次注射和电穿孔，每次用10μg的DNA，间隔2周。对于DNA免疫，将小鼠分组(每组5只小鼠)，并通过电穿孔分别以pIL15ECRO和pVAX(对照组)或pJEVDIII、pJE/WNVDIII、pWNVDIII和pJEVDIII+pWNVDIII进行免疫。

简而言之，通过恒流电穿孔仪(VGXPharmaceuticalsInc.,BlueBell,PA)使用方形波脉冲，并进行递送。使用3电极阵列(3-EA)，该阵列由3个26-号实心不锈钢电极组成，该3个电极呈等腰三角形形式，2个长边为0.5mm长，短边为0.3mm长，由非导电塑料保持在一起。质粒施用/EP的事件顺序如下：将一次性电极阵列放置在手柄的插孔中，按压手柄上的启动按钮，并输入动物实验组数，利用胰岛素注射器注射DNA质粒，立即将阵列放置在注射位点周围的区域，按压手柄上的启动按钮，4秒倒计时之后将开始递送脉冲。EP条件为0.2Amp、2个脉冲、52ms/脉冲、脉冲间隔1秒。所有电极在所有治疗过程中均完全插入肌肉中。所有DNA均利用无内毒素的Qiagen柱制备。小鼠在宾夕法尼亚大学饲养和治疗，并根据NIH和宾夕法尼亚大学动物关爱和使用委员会(IACUC)的指南进行照顾。

DNA接种的血清的抗DIII抗体的滴定

将递送DNA疫苗的体内电穿孔(IVE)与共有抗原组合，从而诱导对抗合成DNA抗原的有力免疫应答。在存在或不存在pIL15ECRO的情况下，用各疫苗候选物中的每一种对Balb/c小鼠进行免疫和电穿孔(图4A)。对于第三次加强后一周获得的DNA接种小鼠的血清样品，通过ELISA测定是否存在抗JEV和WNV的相应抗体。所有经接种的小鼠均产生了抗DIII域的抗体。针对JEVDIII、WNVDIII和JE/WNVDIII这3种抗原，分别评估了全部DNA接种小鼠的血清。

如图4B所示，ELISA数据得到了令人感兴趣的结果。首先，该测试表明，DIII构建体与IL15-质粒的共免疫显著增强了针对JEV和WNVDIII抗原的抗体生成。相比而言，加入IL15引起了针对WNVDIII的最高水平的应答。其次，在未用IL15共免疫的动物组中，与用JEV和WNVDIII这两种疫苗构建体单独引起的应答相比，JEV和WNVDIII表达质粒的组合引起了更高水平的抗体生成。再次，对于嵌合JEV/WNV构建体，发现抗体生成明显更低。IL15对该嵌合构建体未显示出发挥了其积极效果。因此，不仅对于对抗JEVDIII和WNVDIII，而且对于对抗嵌合蛋白本身，该嵌合JEV/WNV抗原均不能充当引起强抗体免疫应答的有力抗原。总之，接受了WNVDIII和IL15构建体的鸡尾酒式混合物的动物的抗体滴度非常高，并且最重要的是，该组的血清能够一致性地结合所有3种抗原，这表明了该构建体引起的广泛反应性。

实施例5DIII抗体ELISA测试

将DIII蛋白悬浮液融化，对试管涡旋从而悬浮细蛋白颗粒。将小份等分试样的重悬蛋白样品溶解在缓冲液TU(62mMTris-HCl/8M脲,pH8.0)中，得到10μg/ml溶液。将100μl(1μg)等分试样的稀释蛋白样品应用于Pierce的His结合铜包被高结合容量板(PierceHisGrabCopperCoatedHighBindingCapacityPlate)的孔中，并在4℃温育过夜。第二天，用PBST(PBS,0.05％Tween20)洗涤平板，用PBST中的3％BSA封闭1小时，并与经免疫的小鼠和首次用于实验的小鼠的梯度稀释血清在37℃温育1小时。利用1:10,000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(ResearchDiagnostics,NJ)检测所结合的IgG。通过加入色原底物溶液四甲基联苯胺(TMB；R&DSystems)检测所结合的酶，并在BiotekEL312eBio-Kinetics读板器上在450nm读数。所有血清样品测试2次。

抗DIII血清对表达DIII的转染细胞的特异性

还对经DNA接种的小鼠的血清进行测试，从而验证其是否能够结合以这些疫苗构建体转染的细胞中所表达的DIII抗原。为此，以所有3种编码DIII的pVAX表达构建体瞬时转染HeLa细胞，转染后36小时，固定细胞以进行免疫荧光分析(见上述方法)。将细胞首先与适当的血清样品温育，然后以FITC-偶联的抗小鼠二抗温育。以DAPI对细胞的核内容物进行复染色，从而了解给定视野中存在的细胞总数。经DNA接种的小鼠的抗DIII血清仅使表达WNV(图5A)和JEVDIII(图5B)的转染细胞染色。染色模式类似于黄病毒E的原型表达[35]。最重要的是，表达DIII的细胞显示了主要为细胞质的定位模式。对于未转染HeLa细胞或pVAX1转染HeLa细胞，抗DIII血清未显示任何显著染色。

实施例6脾细胞纯化

第三次免疫后1周处死小鼠，收集各小鼠的脾脏，并储集在15ml的含RPMI1640的圆锥形容器中(每个实验组一个试管)。在无菌组织培养罩内，将各实验组储集的脾脏放置在皮氏培养皿中，并利用Stomacher混合机(BrinkmannInstruments,Inc)在无菌袋中捣碎。洗涤并沉淀(1200rpm)脾细胞；用ACK裂解缓冲液(Biosource)处理沉淀5-10分钟，然后洗涤，沉淀(1200rpm)并使其通过70μm细胞滤器以去除任何残留的脾脏基质。将脾细胞在RPMI1640中洗涤2次，并重悬浮在R10培养基(RPMI1640加10％FBS)中，利用血球计计数(用台盼蓝染色确定细胞活力)。

实施例7记忆性B细胞ELISpot测试

用100μl(2μg/ml)的纯化蛋白包被ELISpot96孔板(Millipore)，并在4℃温育过夜。各包被抗原使用不同平板。第二天，洗涤平板，并用1％BSA封闭2小时。每孔加入经免疫小鼠的25万个脾细胞，并在RPMI1640(阴性对照)存在下在37℃在5％CO2中刺激5-6小时。温育后，洗涤细胞，并用生物素化抗小鼠抗体(R&DSystems)在4℃温育过夜。洗涤平板，并在各孔中加入链亲和素-碱性磷酸酶(R&DSystems)，室温温育2小时。再次洗涤平板，并在各孔中加入5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸对甲苯胺盐和氯化硝基四氮唑蓝(色原颜色试剂；R&DSystems)。然后以蒸馏水漂洗平板，并室温干燥。由自动ELISPOT读板器(CellularTechnologyLimited)对点进行计数。结果表示为分泌抗原特异性抗体的细胞(ASC)数量。

IL15增强对抗JEV和WNV抗原的记忆性B-细胞激活

以适当抗原进行刺激之后诱导B记忆性细胞体外分化为分泌抗体的浆细胞，从而可以用B细胞ELISPOT技术定量抗原特异性记忆性B细胞。为了进一步评估由IL15佐剂诱导的免疫应答的质量，评估了小鼠的B记忆性应答。如“方法”中所述，制备小鼠脾脏，以测定能够产生抗DIII蛋白的抗体的B细胞的频率。令人感兴趣的是，ELISpot测试结果与上述DIII抗体ELISA数据一致。与单独接受DIIIDNA疫苗的组相比，以IL15共刺激的小鼠中观察到更高频率的DIII特异性的小鼠抗体分泌细胞(图6)。该测试还提示，IL15明显增强了抗pWNVDIII疫苗的抗体分泌细胞应答，证据是该组显示出最高水平的抗体分泌细胞。最重要的是，由WNVDIII+IL15组动物血清的ELISA数据观察到，WNVDIII+IL15组的B细胞能够结合所有3种抗原。紧接着该组，JEVDIII+IL15显示了比仅接受JEVDIII的小鼠更强水平的B-细胞应答。与嵌合JE/WNVDIII接种的小鼠的ELISA结果一致，该组小鼠的B细胞不仅不能结合JEV或WNVDIII-接种的小鼠，并且还不能结合接受嵌合抗原本身的组。总之，ELISpot结果提示，对应于ELISA研究测定的DIII特异性抗体的滴度的高亲和性抗原特异性B细胞的激活。

我们研究的结果表明了DIII蛋白样品可能不是更好的候选疫苗。一个可能的解释是，正确折叠的可溶蛋白的百分数可能较低，而且不同研究者进行的纯化程序也可影响rDIII的免疫原性。没有IL15支持，使用单体DIII表达构建体，我们不能发现令人满意的抗体应答。该研究中，我们利用每只动物仅20μgDNA就显示了增强水平的B-细胞增殖以及抗体产生。因此，对于对抗JEV和WNV的免疫，与IL15质粒组合的DNA疫苗能够代表更好的成本有效的替代方案。

总体而言，本研究所获结果表明，与可使用的良好佐剂组合的情况下，DIII是用于诱导对抗WNV和JEV保护性免疫的有前景的充分明确的候选疫苗。抗体生成细胞的水平由于IL15的共刺激而增加4-5倍，直接表明了IL15可通过增强对抗WNV以及JEV的抗体生成记忆性B细胞而诱导中和抗体的产生。与我们对制造嵌合DIII蛋白而提出的原理相反，由失败的抗体应答和最少数量的抗体生成记忆性B细胞可知，所得到的嵌合蛋白不能充当更好的抗原。一个可能的原因是将WNVDIII的表位引入JEVDIII中可能影响了构象状态，而所述构象状态是引发免疫应答的适当递呈所需要的。这就是为什么该嵌合蛋白与其前体分子(如天然JEV和WNVDIII)相比不能诱导免疫应答的原因。在迄今为止的任何人类研究中还未系统性使用过IL-15。还应该注意，最近表明IL-15是滑膜炎、类风湿性关节炎、自体免疫性甲状腺炎和自体免疫性糖尿病的介体。McInnes等人以及其他实验室已报道了类风湿性关节炎的关节的滑膜液中高浓度的IL-15，并表明IL-15由滑膜衬的细胞表达。目前，尚未有将IL-15与引发自身免疫性疾病的因果关系直接关联的人类研究。我们已经确定，注射pIL-15-Opt可导致小鼠血清中不可检测水平的抗-人IL-15Ab，并且我们不能检测接种小鼠血清中的人IL-15(未公开的观察结果)，表明以pIL-15-Opt接种后产生的IL-15水平极低，但在局部足以增强本研究中观察到的DIII特异性免疫应答。

本报告证明了这样一种方法：通过该方法，优化细胞因子质粒递送的IL-15可增强对黄病毒DIII(已知黄病毒DIII在诱导中和抗体应答中起作用)特异的记忆性B细胞。

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序列表

<110>VGXPharmaceuticals,LLC

<120>引起对抗黄病毒的免疫应答的抗原及其应用方法

<130>VGX0107WO

<150>US61/115,535

<151>2008-11-17

<160>15

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>JEVDIII共有序列

<400>1

MetAspTrpThrTrpIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrArgVal

151015

HisSerAlaLeuLysGlyThrThrTyrGlyMetCysThrGluLysPhe

202530

SerPheAlaLysAsnProAlaAspThrGlyHisGlyThrValValIle

354045

GluLeuSerTyrSerGlySerAspGlyProCysLysIleProIleVal

505560

SerValAlaSerLeuAsnAspMetThrProValGlyArgLeuValThr

65707580

ValAsnProPheValAlaThrSerSerAlaAsnSerLysValLeuVal

859095

GluMetGluProProPheGlyAspSerTyrIleValValGlyArgGly

100105110

AspLysGlnIleAsnHisHisTrpHisLysAlaGlySerThrLeuGly

115120125

LysAlaPheSerThrThrLeuLysGlyAlaGln

130135

<210>2

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>WNVDIII共有序列

<400>2

MetAspTrpThrTrpIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrArgVal

151015

HisSerGlnLeuLysGlyThrThrTyrGlyValCysSerLysAlaPhe

202530

LysPheLeuGlyThrProAlaAspThrGlyHisGlyThrValValLeu

354045

GluLeuGlnTyrThrGlyThrAspGlyProCysLysValProIleSer

505560

SerValAlaSerLeuAsnAspLeuThrProValGlyArgLeuValThr

65707580

ValAsnProPheValSerValAlaThrAlaAsnAlaLysValLeuIle

859095

GluLeuGluProProPheGlyAspSerTyrIleValValGlyArgGly

100105110

GluGlnGlnIleAsnHisHisTrpHisLysSerGlySerSerIleGly

115120125

LysAlaPheThrThrThrLeuLysGlyAlaGln

130135

<210>3

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>JWDIII共有序列

<400>3

MetAspTrpThrTrpIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrArgVal

151015

HisSerAlaLeuLysGlyThrThrTyrGlyMetCysThrSerLysPhe

202530

SerLysAlaLysAsnProProAspThrGlyHisGlyThrValValIle

354045

GluLeuSerTyrSerThrSerThrGlyProCysLysIleProIleVal

505560

SerValAlaSerLeuAsnAspMetThrProValGlyArgLeuValThr

65707580

ValAsnProPheValAlaThrSerSerAlaAsnSerLysValLeuVal

859095

GluMetGluProProPheGlyAspSerTyrIleValValGlyArgGly

100105110

AspLysGlnIleAsnHisHisTrpHisLysAlaGlySerThrLeuGly

115120125

LysAlaPheSerThrThrLeuLysGlyAlaGln

130135

<210>4

<211>423

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JEVDIII

<400>4

atggactggacctggatcctgttcctggtggctgctgccactagagtgcacagcgccctg60

aagggcaccacctacggcatgtgcaccgagaagttcagcttcgccaagaaccccgccgac120

accggccacggcaccgtggtgatcgagctgtcctacagcggcagcgacggcccctgcaag180

atccccatcgtgagcgtggccagcctgaacgacatgacccccgtgggccggctggtgacc240

gtgaaccccttcgtggccacctccagcgccaacagcaaggtgctggtcgagatggaaccc300

cccttcggcgacagctacatcgtggtgggcaggggcgacaagcagatcaaccaccactgg360

cacaaggccggcagcaccctgggcaaggccttcagcaccacactgaagggcgcccagtga420

tga423

<210>5

<211>423

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WNVDIII

<400>5

atggactggacctggatcctgttcctggtggctgctgccactagggtgcacagcctccag60

ctgaagggcaccacctacggcgtgtgcagcaaggccttcaagttcctgggcacccctgcc120

gataccggccacggcaccgtggtgctggaactccagtacaccggcaccgacggcccctgc180

aaggtgcccatcagcagcgtggccagcctgaacgacctgacccccgtgggccggctggtg240

accgtgaaccccttcgtgagcgtggccaccgccaacgccaaggtgctgatcgagctggaa300

ccccccttcggcgacagctacatcgtggtgggcaggggcgagcagcagatcaaccaccac360

tggcacaagagcggcagcagcatcggcaaggcctttaccaccaccctgaagggcgcctga420

tga423

<210>6

<211>423

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JWDIII

<400>6

atggactggacctggatcctgttcctggtggctgctgccactagagtgcacagcgccctg60

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accggccacggcaccgtggtgatcgagctgtcctacagcaccagcaccggcccctgcaag180

atccccatcgtgagcgtggccagcctgaacgacatgacccccgtgggccggctggtgacc240

gtgaaccccttcgtggccacctccagcgccaacagcaaggtgctggtcgagatggaaccc300

cccttcggcgacagctacatcgtggtgggcaggggcgacaagcagatcaaccaccactgg360

cacaaggccggcagcaccctgggcaaggccttcagcaccacactgaagggcgcccagtga420

tga423

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgE前导部

<400>7

MetAspTrpThrTrpIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrArgVal

151015

HisSer

<210>8

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IgE前导部

<400>8

ggtaccggatccgccaccatggactggacctggattctgttcctcgtggctgctgctaca60

agagtgcacagc72

<210>9

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>JEVDIII共有序列

<400>9

MetAlaLeuLysGlyThrThrTyrGlyMetCysThrGluLysPheSer

151015

PheAlaLysAsnProAlaAspThrGlyHisGlyThrValValIleGlu

202530

LeuSerTyrSerGlySerAspGlyProCysLysIleProIleValSer

354045

ValAlaSerLeuAsnAspMetThrProValGlyArgLeuValThrVal

505560

AsnProPheValAlaThrSerSerAlaAsnSerLysValLeuValGlu

65707580

MetGluProProPheGlyAspSerTyrIleValValGlyArgGlyAsp

859095

LysGlnIleAsnHisHisTrpHisLysAlaGlySerThrLeuGlyLys

100105110

AlaPheSerThrThrLeuLysGlyAlaGln

115120

<210>10

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>WNVDIII共有序列

<400>10

MetGlnLeuLysGlyThrThrTyrGlyValCysSerLysAlaPheLys

151015

PheLeuGlyThrProAlaAspThrGlyHisGlyThrValValLeuGlu

202530

LeuGlnTyrThrGlyThrAspGlyProCysLysValProIleSerSer

354045

ValAlaSerLeuAsnAspLeuThrProValGlyArgLeuValThrVal

505560

AsnProPheValSerValAlaThrAlaAsnAlaLysValLeuIleGlu

65707580

LeuGluProProPheGlyAspSerTyrIleValValGlyArgGlyGlu

859095

GlnGlnIleAsnHisHisTrpHisLysSerGlySerSerIleGlyLys

100105110

AlaPheThrThrThrLeuLysGlyAlaGln

115120

<210>11

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>JWDIII共有序列

<400>11

MetAlaLeuLysGlyThrThrTyrGlyMetCysThrSerLysPheSer

151015

LysAlaLysAsnProProAspThrGlyHisGlyThrValValIleGlu

202530

LeuSerTyrSerThrSerThrGlyProCysLysIleProIleValSer

354045

ValAlaSerLeuAsnAspMetThrProValGlyArgLeuValThrVal

505560

AsnProPheValAlaThrSerSerAlaAsnSerLysValLeuValGlu

65707580

MetGluProProPheGlyAspSerTyrIleValValGlyArgGlyAsp

859095

LysGlnIleAsnHisHisTrpHisLysAlaGlySerThrLeuGlyLys

100105110

AlaPheSerThrThrLeuLysGlyAlaGln

115120

<210>12

<211>372

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JEVDIIIDNA

<400>12

atggccctgaagggcaccacctacggcatgtgcaccgagaagttcagcttcgccaagaac60

cccgccgacaccggccacggcaccgtggtgatcgagctgtcctacagcggcagcgacggc120

ccctgcaagatccccatcgtgagcgtggccagcctgaacgacatgacccccgtgggccgg180

ctggtgaccgtgaaccccttcgtggccacctccagcgccaacagcaaggtgctggtcgag240

atggaaccccccttcggcgacagctacatcgtggtgggcaggggcgacaagcagatcaac300

caccactggcacaaggccggcagcaccctgggcaaggccttcagcaccacactgaagggc360

gcccagtgatga372

<210>13

<211>372

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WNVDIIIDNA

<400>13

atgctccagctgaagggcaccacctacggcgtgtgcagcaaggccttcaagttcctgggc60

acccctgccgataccggccacggcaccgtggtgctggaactccagtacaccggcaccgac120

ggcccctgcaaggtgcccatcagcagcgtggccagcctgaacgacctgacccccgtgggc180

cggctggtgaccgtgaaccccttcgtgagcgtggccaccgccaacgccaaggtgctgatc240

gagctggaaccccccttcggcgacagctacatcgtggtgggcaggggcgagcagcagatc300

aaccaccactggcacaagagcggcagcagcatcggcaaggcctttaccaccaccctgaag360

ggcgcctgatga372

<210>14

<211>372

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JWDIIIDNA

<400>14

atggccctgaagggcaccacctacggcatgtgcaccagcaagttcagcaaggccaagaac60

ccccccgacaccggccacggcaccgtggtgatcgagctgtcctacagcaccagcaccggc120

ccctgcaagatccccatcgtgagcgtggccagcctgaacgacatgacccccgtgggccgg180

ctggtgaccgtgaaccccttcgtggccacctccagcgccaacagcaaggtgctggtcgag240

atggaaccccccttcggcgacagctacatcgtggtgggcaggggcgacaagcagatcaac300

caccactggcacaaggccggcagcaccctgggcaaggccttcagcaccacactgaagggc360

gcccagtgatga372

<210>15

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Kozak序列

<400>15

ggtaccgccacc12

Claims

1.一种编码蛋白E的共有DIII域的分离核酸，所述分离核酸包括：

(a)SEQIDNO:12、13或14；

(b)编码氨基酸序列SEQIDNO:9、10或11的核苷酸序列；或

(c)(a)或(b)的互补物。

2.根据权利要求1所述的分离核酸序列，其中所述核酸是SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14。

3.一种遗传构建体，其包含根据权利要求1所述的分离核酸序列。

4.根据权利要求3所述的遗传构建体，其还包含Kozak序列SEQIDNO.15。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的遗传构建体，其还包含选自IgG或IgE的一部分的前导序列。

6.根据权利要求5所述的遗传构建体，其中所述前导序列包含核酸序列SEQIDNO.8。

7.一种包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含：

(a)SEQIDNO:9、10或11；或

(b)(a)的片段。

8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽还包含选自IgG和IgE的一部分的N-末端前导氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述N-末端前导氨基酸序列包含序列SEQIDNO:7。

10.一种能够在宿主中产生对抗多种WNV和JEV血清型的免疫应答的DNA疫苗，所述疫苗包含：

(a)包含启动子的遗传构建体，所述启动子与含有根据权利要求1所述的核酸的编码序列可操纵地连接；和

(b)药学上可接受的赋形剂，

其中，所述遗传构建体能够在所述宿主的细胞中以有效引起免疫应答的数量表达蛋白E抗原的共有DIII域。

11.根据权利要求10所述的疫苗，其中所述遗传构建体还包含在所述编码序列的3'端之后的聚腺苷酸化序列。

12.根据权利要求10所述的疫苗，其中所述遗传构建体经密码子优化。

13.根据权利要求10所述的疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂是佐剂。

14.根据权利要求13所述的疫苗，其中所述佐剂选自IL-2、IL-15、IL-28和RANTES。

15.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂是转染辅助剂。

16.一种在宿主中引起对抗多种黄病毒的病毒血清型的免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)将根据权利要求10所述的疫苗递送到所述宿主的组织中；和

(b)利用递送能量脉冲的电穿孔设备将所述组织的细胞电穿孔，所述能量脉冲有效地使所述疫苗的遗传构建体进入所述细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)包括将所述疫苗注射到皮内、皮下或肌肉组织中。

18.根据权利要求16所述的方法，其中将所述电流预设定，从而以与所述预设定的电流相等的恒定电流将能量脉冲递送到所述组织中。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述电穿孔步骤还包括：

(a)测定所述经电穿孔的细胞中的阻抗；

(b)相对于所述测定的阻抗调整所述能量脉冲的能量水平，从而保持所述经电穿孔的细胞中的恒定电流；

其中，所述测定和调整步骤在所述能量脉冲的寿命时间内进行。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲顺序模式将所述能量脉冲递送至多个电极。