KR20110086610A

KR20110086610A - 플라비바이러스에 대한 면역반응을 유발하는 항원 및 이를 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20110086610A
Application number: KR1020117013778A
Authority: KR
Inventors: 마투라 피. 라마나탄; 니란잔 와이. 사르데사이
Original assignee: 이노비오 파마수티컬즈, 인크.
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2009-11-17
Publication date: 2011-07-28
Also published as: AU2009313714B2; EP2358733A4; CN102292345A; JP5763541B2; CA3001374A1; AU2009313714A1; CN105400798A; EP2358733A2; WO2010057159A2; EP2358733B1; CA2740598A1; US8961994B2; WO2010057159A3; KR101667069B1; CN102292345B; JP2012509067A; BRPI0921359A2; CA2740598C; US20110262394A1

Abstract

본 발명의 관점은 단백질 E의 공통 DIII 도메인을 코드화한 분리된 핵산, 및 이들을 사용하여 제조된 백신, 및 또한 전술한 것을 사용하여 숙주 내에서 플라비바이러스, 특히 웨스트 나일 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스의 다수의 혈청형에 대한 면역반응을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

Description

플라비바이러스에 대한 면역반응을 유발하는 항원 및 이를 사용하는 방법{ANTIGENS THAT ELICIT IMMUNE RESPONSE AGAINST FLAVIVIRUS AND METHODS OF USING SAME}

일본 뇌염 바이러스 (JEV) 세로컴플렉스 (serocomplex)-그룹은 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus; WNV) 및 JEV를 포함하는 모기 매개된 플라비바이러스 (flaviviruses)로 구성되며, 이들 둘은 모두 인간에게서 심각한 뇌염을 야기할 수 있다. WNV는 1999년에 그의 도입 이래 미국 전역에 빠르게 확산되었으며, 서반구에서의 그의 지리학적 분포는 더 확장될 것으로 예상되는 반면에, JEV는 동남 아시아, 중국 및 인도에서 바이러스성 뇌염의 가장 통상적인 원인이다. 이들 두 가지 바이러스에 대한 백신을 개발하기 위한 시도는 있지만, 현재 둘 다에 대해서 FDA 승인된 특정한 치료방법은 없다.

플라비바이러스 웨스트 나일 바이러스 (WNV) 및 일본 뇌염 바이러스 (JEV)는 인간에게서 바이러스성 뇌염의 대부분에 대한 원인이 된다. WNV는 광범한 조류 및 인간을 포함한 포유동물 종을 감염시킨다. WNV는 또한, 수혈, 장기 이식 및 모유-영양을 통해서 전염되는 것으로 나타났다. 웨스트 나일 뇌염 (WNV) 바이러스는 유럽 남부, 아프리카, 중앙 아시아, 및 더욱 최근에는 북아메리카를 포함하는 넓은 지리학적 지역에 걸쳐 있다. 바이러스는 종종 이스라엘, 이집트, 인도 및 파키스탄에서 수막뇌염의 증상을 야기한다. 이집트에서, 이것은 모든 수막염 및 무균성 뇌염의 3%의 원인이 된다. JEV는 아시아에서 바이러스성 뇌염의 단일한 가장 중요한 원인이며, 그의 치사율은 평균 30%이다. JEV는 동남 아시아, 인도 및 중국에서 주되 문제이며, 여기에서 바이러스는 풍토병이다. 최근에, JEV는 오스트레일리아 및 파키스탄과 같은 다른 지리학적 지역으로 확산하였으며, 따라서 이들 도메인에서 중요한 신생 바이러스 감염이 되고 있다.

일본 뇌염 (JE)은 대뇌, 소뇌 및 척수를 포함하는 중추신경계에서의 염증성 질환이다. 마우스 뇌 유도된 불활성화 백신을 사용하는 JEV에 대한 백신 접종은 매우 효과적인 것으로 나타났으며, 감소된 질병 부담 (disease burden)을 유도하였다. 그러나, 여기에서는 이 백신의 면역원성 및 안전성에 대한 우려가 있다. 일차 햄스터 신장 (PHK) 세포 상에서 생산된 생-약독화 및 세포 배양계 JEV 백신은 중국에서 본 발명자들에게 승인되었으며, 안전하고 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, PHK는 인간 백신의 생산을 위해서 승인된 세포주가 아니기 때문에, 대부분의 국가는 이 JEV 백신을 사용할 수 없을 것이다.

JEV 감염은 30-50%까지의 사망율 및 생존자에게서 높은 비율의 신경학적 후유증을 갖는 뇌염의 가장 심각한 바이러스성 원인 중의 하나인 것으로 간주된다 [8]. 따라서, 일본 뇌염에 대한 집단 면역화 프로그램은 일반적으로, WHO를 포함한 지역 또는 내부 공중보건 기관에 의해 풍토지역 (endemic area)에 거주하는 인구에 대해서 추천된다. 개발된 비-풍토 국가에서 JE는 드문 외래 질병으로 간주된다. 그러나, 최근 몇십 년 동안에, 비-풍토 지역으로부터의 관광객 및 그 밖의 다른 여행자들에게서 감염의 증례 보고가 거의 매년 보고되고 있다. 그러나, 여행자 및 그들의 여행 건강 상담자의 일부에 의한 질병에 대한 경각심의 결여에 기인하는 것뿐만 아니라 현재 승인된 마우스-뇌 유도된 JEV 백신 JE-VAXR와 연관된 잠재적인 부작용의 두려움으로 인하여 위험이 있는 국제 여행자들의 집단에서 백신 접종은 매우 낮다[33].

JE-VAXR는 마우스 뇌로부터 생산되고, 일본에서 소아 및 미국 및 일부의 유럽 국가에서 여행자 및 군대 인력에 대한 사용이 승인된 포르말린 불활성화된 백신이다. 수회-용량 레지멘 (regimen)에 대한 필요성 및 반응원성 (reactogenicity)에 의한 문제는 그의 사용을 곤란하게 하였다. 빈번한 추가접종 (booster)에 대한 필요성이 없이 영속적인 면역성을 유발하는 알맞은 백신이 개발도상국에서 JE를 제어하는데 필요하다. 마우스-뇌 유도된 JEV 백신은 수십 년 동안 아시아의 여러 국가 및 일부의 개발 국가에서 광범하게 사용되어 왔다. 오스트레일리아, 유럽 및 북아메리카에서 면역된 성인에게서는 담마진 또는 혈관부종, 및 일부의 경우에는 호흡곤란을 포함한 심각한 부작용이 보고되었다. 이들 부작용의 출현은 다양하고, 10000 주사당 1 미만으로부터 104까지의 범위로서 아나필락시스 (anaphylaxis)가 주된 우려의 원인 중의 하나이다.

플라비바이러스의 E 단백질은 가장 면역원성이며, 백신 개발의 목적에 적합하다. 단백질 E는 3 개의 구조 도메인 (DI, DII 및 DIII)으로 구성되며, 이들 중에서 DIII는 주로 서브-컴플렉스 (sub-complex) 및 타입 특이적 에피토프를 함유한다. DIII를 기초로 하는 몇 개의 백신이 특정의 조건 하에서 면역원성이며 효과적인 것으로 나타났다.

DIII 단백질은 몇 가지의 WNV 및 JEV 스트레인 사이에서 고도로 보존된다. 대체로 WNV DIII은 각각 81 및 94%인 JEV DIII와의 전반적인 아미노산 동일성 및 유사성 값을 공유한다. DIII은 독립적으로 접힐 수 있는 연속적 폴리펩타이드 절편을 형성하는 수용체 결합 도메인으로서의 기능을 한다. 확실히 DIII 내에서의 돌연변이는 플라비바이러스의 균력 및 향성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. rDIII은 사실상 안정한 단백질이며, 따라서 매력적인 항원이 될 수 있다. 천연 DIII도 마찬가지로 글리코실화되지 않기 때문에, 원핵세포 내에서의 박테리아 발현 중에 단백질의 글리코실화의 결여는 아마도 그의 항원성에 영향을 미치지 않는다. JEV와 뎅기열 바이러스 (dengue virus)의 재조합 DIII은 각각의 독성 바이러스로 공격한 마우스에서 면역원성이며 방어적인 것으로 나타났고, 이것은 플라비바이러스에 대한 DIII 기본 백신 제제의 적합성을 뒷받침한다. 그러나, 더 초기의 시도에서는 중화성 항체 반응의 유도를 위해서 rDIII의 비교적 높은 농도가 필요하였음이 명백하였으며, 이것은 rDIII가 면역원성이 약함을 시사한다.

아시아로부터의 JEV 스트레인의 최근의 분자 분석은 스트레인을 4 가지의 별개의 유전자형 그룹으로 분류하였다 [37]. 현재 이용할 수 있는 JEV 백신은 단지 JE의 하나의 스트레인을 기초로 하기 때문에, 서열 다양성의 이렇게 높은 레벨은 순환 스트레인 JEV에 대한 JEV 백신의 교차-보호효과에 관한 문제 및 우려를 유도하였다 [12, 13].

DNA 백신은 면역요법의 맥락에서 생약독화 바이러스 및 재조합 단백질계 백신과 같은 통상적인 백신에 비해 몇 가지 이점을 갖는다 [24-26]. DNA 백신은 인간에게서 매우 좋은 내성이 있는 것으로 보인다. 전임상 안전성 검정은, 여기에서 플라스미드 통합의 증거가 거의 없었으며, 플라스미드 벡터의 효능은 기존의 중화성 항체에 의해서 영향을 받지 않기 때문에 DNA 백신은 또한 반복 투여를 위해서 사용될 수 있음을 나타낸다. 더구나, DNA 백신은 매우 안정하며 생산이 간단한 것으로 보인다. 그러나, 초기 검정은 DNA 백신이 대형 동물 및 인간에게서 낮은 효력을 나타내었음을 보고하였다.

백신 개발에 관한 문제를 복잡하게 하는 것으로, 플라비바이러스의 RNA 게놈은 높은 돌연변이율을 가지며, 따라서 비록 순환계 내의 모든 스트레인은 중화에 의해서 정의된 단일 혈청형에 속하는 것으로 일반적으로 인정되지만 [37], 아시아 및 오스트레일리아의 인간 집단에서 순환하는 JEV는 유전적으로 다양하다 [35,36].

다수의 JEV 및 WNV 혈청형으로부터 포유동물을 보호하기 위한 안전하고 효과적인 JEV 백신에 대한 필요성은 여전히 남아있다. 또한, DNA 백신의 면역반응을 효과적으로 증진시킬 수 있는 효과적인 보조제에 대한 필요성도 존재한다.

발명의 요약

본 발명의 한 관점은 단백질 E의 공통 DIII 도메인을 코드화한 분리된 핵산을 포함한다. 이들 핵산은 다음의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다: (a) SEQ ID NOS: 12, 13, 또는 14; (b) SEQ ID NOS: 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 코드화한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 보체. 본 발명의 또 다른 관점에서는, 본 발명에서 제공된 분리된 핵산을 포함하는 유전적 구성체가 제공된다. 일부의 구체예에서, 유전적 구성체는 코작 (Kozak) 서열 GGT ACC GCC ACC (SEQ ID NO.15), 및/또는 IgG 또는 IgE의 일부분으로부터 선택된 리더 (leader) 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서는, (a) SEQ ID NOS: 9, 10 또는 11; 또는 (b) (a)의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.

본 발명의 관점은 숙주에서 다수의 WNV 및 JEV 혈정형에 대한 면역반응을 생성시킬 수 있는 DNA 백신이며, 여기에서 백신은 (a) 본 발명에서 제공된 분리된 핵산을 포함하는 코드화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 유전적 구성체; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하며, 여기에서 유전적 구성체는 면역반응을 유발하는데 효과적인 양으로 숙주의 세포 내에서 단백질 E 항원의 공통 (consensus) DIII 도메인을 발현할 수 있다.

본 발명의 관점에서는, (a) 본 발명에서 제공된 백신을 숙주의 조직에 전달하는 단계; 및 (b) 세포 내로 백신의 유전적 구성체의 유입을 허용하는데 효과적인 에너지의 펄스 (pulse)를 전달하는 전기천공 장치를 사용하여 조직의 세포를 전기천공시키는 단계를 포함하는, 숙주 내에서 다수의 플라비바이러스 바이러스 혈청형에 대한 면역반응을 유발시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 다수의 목적 및 이점은 첨부된 다음의 도면을 참고로 하여 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 더 잘 이해될 수 있다:
도 1a-e: 도 1a는 바이러스 및 숙주세포 프로테아제에 의해서 촉진된 분할 부위를 갖는 플라비바이러스 다단백질 (polyprotein)의 조직화 (organization)를 나타낸다. 플라비바이러스 E의 삼차원적 배좌는 3 개의 별개의 도메인 I, II 및 III을 갖는 것으로 나타난다. 우측에서, 플라스미드 지도 (map)는 이 검정에서 사용된 백신 구성체의 다양한 요소를 나타낸다. 도 1b에는 DV-U의 공통 아미노산 서열이 제시된다. 분비 과정을 최대화하기 위한 IgE-리더 서열은 밑줄을 쳤다. 도 1c에서 JEV DIII, 키메릭 JE/WNV DIII 및 WNV DIII JE/WNV DIII 단편의 제한 분해는 DIII 코드화 부분의 길이 (435bp)를 나타낸다. 레인의 왼쪽 끝에는 DNA 래더 (ladders)를 나타낸다. 도 1d는 DNA 백신 구성체의 검정관내 발현을 나타낸다. 재료 및 방법에 기술된 바와 같이, DNA 백신 구성체로부터 생성된 35S-표지된 유전자 생성물이 SDS 겔에서 분리되었다. 단백질 생성물은 질량이 약 16.5 kDa인 이동성 (mobility)에 해당하였다. pVAX 빈 벡터 (empty vector)로부터의 상응하는 단백질 생성물의 결여는 이 반응의 특이성을 나타낸다. 도 1e는 RD 세포에서의 DIII-백신 구성체의 발현 분석을 나타낸다. 세포를 백신 구성체로 형질감염시키고, 형질감염시킨 지 2일 후에 이들을 RT-PCR에 의해서 DIII 특이적 mRNA 전사물의 존재에 관해 분석하였다. 모의-형질감염된 세포는 적절한 증폭 생성물을 나타내는데 실패하였다. 적절한 프라이머를 사용하여 DIII-구성체 형질감염된 세포로부터 약 435-bp 생성물이 관찰되었으며, 이것은 상응하는 DIII 코드화 전사물의 존재를 뒷받침한다.
도 2a-c: 도 2a는 3 가지 상이한 IL15 이소형태의 국재화를 나타낸다. HeLa 세포를 SSP 또는 LSP 또는 OPT IL15 이소형태를 발현하는 플라스미드로 형질감염시키고, 형질감염의 36 시간 후에 면역형광검정에 의해서 분석하였다. 세포를 고정시키고, 모노클로날 항-LI15 항체와 함께 배양하고, 이어서 항-마우스 FITC 컨주게이트된 이차 항체와 함께 배양하였다. DAPI를 사용하여 세포의 핵 내용물을 반대 염색하였다. 빈 벡터를 음성 대조군으로 사용하였으며, 모의-형질감염된 세포는 어떤 특이적 염색도 제공하지 않았다 (a-c). IL15-SSP 이소형태는 분비되지 않으며, 오히려 세포 내로 저장되어 핵 성분 중에 나타나는 반면에 (d-f), 세포질 부분에서 명백히 나타나는 바와 같이 IL15-LSP 이소형태 (g-i) 및 인간 코돈 최적화된 IL15 (j-1)는 분비된 IL15와 연관된다. 도 2b는 IL15 이소형태의 분비 레벨을 나타낸다. RD 세포를 IL15 발현 구성체 (1 ㎍/웰)로 형질감염시키고, 2일 후에 상등액을 ELISA에 의해서 분비된 IL15 단백질의 존재에 관해 분석하였다. IL15 ECRO 발현 구성체는 최고 레벨의 IL15 분비를 제공하였다. 도 2c는 분비의 레벨을 비교하기 위해서 IL15 LSP 및 OPT 구성체로부터 분비된 양을 SSP 형태를 초과한 폴드 증가 (fold increase)로 나타내었다.
도 3: DIII 단백질 단편의 박테리아 생산 및 정제. DIII 코드화 부분을 pQE30 발현 벡터 내로 클로닝하고, 단백질 샘플을 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 박테리아 용해물로부터 정제하였다. PAGE의 쿠마시 (Coomassie) 염색은 박테리아 발현 시스템에서 정제 과정의 다양한 단계로부터 수집된 샘플을 나타낸다. Ni-칼럼에 결합시킨 후에, 2O mM-이미다졸을 함유하는 용출 완충액은 DIII 단편을 유리시키지 못하였으며, 25O mM에서의 이미다졸은 히스티딘 태깅된-DIII 단편을 선택적으로 용출시키는데 효과적이었다. 적절한 분자 질량 (16.5 kDa)을 갖는 정제된 DIII 단편의 두드러진 밴드를 표시하였다.
도 4a-b: 도 1a는 백신 접종 및 면역화를 위한 조직도 (schematic plan)이다. BALB/c 마우스를 셀렉트라 (CELLECTRA®) 전기천공기 (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell PA)를 사용하여 20Xg 백신 구성체 또는 pVAX 빈 벡터로 2 주일 차이를 두고 면역시키고, 1 주일 후에 희생시켰다. 도 1b는 항-DIII 혈청이 정제된 DIII 단편과 특이적으로 반응하는 것을 나타낸다. DIII DNA-백신 접종한 마우스로부터의 혈청을 1 ㎍/웰의 정제된 DIII 단백질 샘플과 함께 96-웰 Ni-킬레이트화된 플레이트 상에서 37℃로 1 시간 동안 배양하였다. 적절한 항체의 생산은 항-마우스 IgG HRP를 사용하여 일상적인 발색 절차에 의해서 검출하였다. 플레이트는 450 ㎚에서 판독하였다. 값은 3중 웰의 평균 (±S.D.)을 나타낸다.
도 5a-b: DNA-백신 접종된 마우스로부터의 혈청에 의한 DIII-형질감염된 세포의 염색. HeLa 세포를 백신 구성체를 발현하는 pVAX 또는 pWNV DIII (도 5a에서의 슬라이드) 또는 pJEV DIII (도 5b에서의 슬라이드)로 형질감염시켰다. 형질감염의 2일 후에 이들을 고정시키고, 이들 DNA 백신 구성체로 면역된 BALB/c 마우스로부터의 혈청과 함께 배양하였다. 이어서, 이들을 FITC 컨주게이트된 항-마우스 이차 항체, 및 세포의 핵 내용물을 반대 염색하는 DAPI와 함께 배양하였다. pVAX-혈청 샘플에 의한 적절한 염색의 결여는 각각의 세트 아래에 나타낸다.
도 6: E DIII ELISpot. BALB/c 마우스를 20 ㎍ pVAX 벡터 또는 DIII 발현 구성체로 각각 2 주일 간격을 두고 3 회 면역시키고, 1 주일 후에 희생시켰다. 비장세포를 수확하고, R10 (음성 대조군) 또는 2 ㎍/㎖의 3 가지 정제된 DIII 샘플 중의 하나의 존재 하에서 밤새 배양하였다. 스포트 형성 유니트는 자동화 ELISPOT 판독기에 의해서 정량화하였으며, 원값 (raw values)을 100만 비장세포당 SFU로 표준화하였다. 값은 3중 웰의 평균 (±S.D.)을 나타낸다.
도 7: DNA 구성체 pV AXl -WNV DIII, pVAXl-JEV DIII, 및 키메릭 구성체 pVAXl-JW DIII에 대한 플라스미드 지도를 나타낸다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
이하의 단축되거나 축소된 정의는 본 발명의 바람직한 구체예의 이해를 돕기 위해서 제시된다. 여기에 제시된 단축된 정의는 배타적인 의미도 아니고, 이들이 분야적 또는 사전적 의미로서의 정의에 반하는 것도 아니다. 단축된 정의는 여기에서 본 기술분야에서 공지된 정의를 보충하거나 더 명확하게 정의하기 위해서 제시된다.
정의
본 발명에서 사용된 것으로서 뉴클레오타이드 및 아미노산에 대한 서열 상동성은 FASTA, BLAST 및 Gapped BLAST [Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 및 PAUP* 4.Ob1O 소프트웨어 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 결정될 수 있다. 간략하면, 기본적 국소 정렬 탐색도구 (Basic Local Alignment Search Tool)를 의미하는 BLAST 알고리듬 (algorithm)은 서열 유사성을 측정하는데 적합하다 [Altschul et al., J. MoI. Biol., 1990, 215, 403-410; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다]. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)으로부터 대중적으로 이용할 수 있다. BLAST 알고리듬에 의해서 제공된 유사성의 한가지 척도는 두 개의 뉴클레오타이드 서열 사이에서 우연히 매치가 나타날 수 있는 확률의 표시를 제공하는 최소 합계 확률 (smallest sum probability (P(N))이다. 예를 들어, 검정 핵산과 다른 핵산의 비교에 있어서의 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이라면 핵산은 또 다른 핵산과 유사한 것으로 간주된다. "유사성의 백분율"은 PAUP* 4.ObIO 소프트웨어 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 계산할 수 있다. 공통 서열의 평균 유사성은 계통수 (phylogenic tree) 내의 모든 서열에 비교하여 계산한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, "보체" 또는 "상보적"은 핵산이 뉴클레오타이드들 또는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 유사체들 사이에서 왓슨-크릭 (Watson-Crick) (예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴 (Hoogsteen) 염기 짝짓기를 가질 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "발현가능한 형태"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우에 코드화 서열이 발현될 수 있도록 단백질을 코드화한 코드화 서열에 작동적으로 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 핵산 구성체를 나타낸다.
용어 "정전류 (constant current)"는 본 발명에서 조직, 또는 상기 조직을 규정하는 세포에 의해서, 동일한 조직에 전달된 전기적 펄스의 지속기간에 걸쳐 수용되거나 경험하게 되는 전류를 정의하기 위해서 사용된다. 전기적 펄스는 본 발명에 기술된 전기천공 장치로부터 전달된다. 본 발명에서 제공된 전기천공 장치는 바람직하게는 순간 피드백 (instantaneous feedback)을 갖는 피드백 요소를 갖기 때문에, 이 전류는 전기적 펄스의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 일정한 암페어를 유지한다. 피드백 요소는 펄스의 지속기간 전체에 걸친 조직 (또는 세포)의 저항성의 척도일 수 있으며, 전기천공 장치가 그의 전기적 에너지 출력을 변화시키도록 하여 (예를 들어, 전압 증가) 동일 조직에서 전류가 전기적 펄스 전체 (대략 마이크로초 정도)에 걸쳐서, 및 펄스마다 일정하게 유지되도록 한다. 일부의 구체예에서, 피드백 요소는 제어기 (controller)를 포함한다.
용어 "피드백 (feedback)" 또는 "전류 피드백 (current feedback)"은 상호교환적으로 사용되며, 전류를 일정한 레벨로 유지시키기 위해서 전극들 사이의 조직에서 전류를 측정하고, 이에 따라 EP 장치에 의해서 전달된 에너지 출력을 변화시키는 것을 포함하여, 제공된 전기천공 장치의 활성 반응을 의미한다. 이러한 일정한 레벨은 펄스 시퀀스 (pulse sequence) 또는 전기적 처리의 개시 전에 사용자에 의해서 미리 설정된다. 바람직하게는, 피드백은 전기천공 장치의 전기천공 성분, 예를 들어, 제어기에 의해서 성취되는데, 이는 그 안의 전기회로가 전극들 사이의 조직에서 전류를 연속적으로 모니터링하고, 에너지-출력을 연속적으로 조정하여 그렇게 모니터링된 전류 (또는 조직 내의 전류)를 미리 설정된 레벨로 유지시킬 수 있기 때문이다. 일부의 구체예에서, 피드백 루프는 아날로그 폐쇄-루프 (analog closed-loop) 피드백이기 때문에, 이것은 순간적이다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용된 것으로서 용어 "전기천공", ""전기-투과화 (electro-permeabilization)" 또는 "동전기 증진 (electro-kinetic enhancement)" ("EP")은 바이오-막에서 현미경적 경로 (공극)을 유도하기 위한 경막 전기장 펄스의 사용을 나타내며; 이들의 존재는 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온 및 물과 같은 생물분자가 세포막의 한 면으로부터 다른 면으로 통과하도록 허용한다.
용어 "분산된 전류 (decentralized current)"는 본 발명에 기술된 전기천공 장치의 다양한 니들 전극 어레이 (needle electrode arrays)로부터 전달된 전류의 패턴을 정의하기 위해서 사용되며, 여기에서 패턴은 전기천공되는 조직의 어떤 도메인 상에서 전기천공 관련된 스트레스의 출현을 최소화하거나, 바람직하게는 제거한다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "피드백 기전"은 소프트웨어 또는 하드웨어 (또는 펌웨어 (firmware))를 나타내며, 이 과정은 원하는 조직의 임피던스 (에너지의 펄스를 전달하기 전, 중 및/또는 후)를 수용하여 현재의 값과 비교하고, 전달된 에너지의 펄스를 미리 설정된 값을 달성하도록 조정한다. 용어 "임피던스"는 본 발명에서 피드백 기전을 거론하는 경우에 사용되며, 옴의 법칙 (Ohm's law)에 따라 전류값으로 전환될 수 있어서 미리 설정된 전류와 비교할 수 있다. 바람직한 구체예에서, "피드백 기전"은 아날로그 폐쇄 루프 회로에 의해서 수행된다.
용어 "면역반응"은 본 발명에서 제공된 DNA 플라스미드 벡터에 의한 플라비바이러스 공통 항원의 도입에 대한 반응으로 숙주의 면역계, 예를 들어, 포유동물의 면역계의 활성화를 의미하는 것으로 사용된다. 면역반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다.
용어 "공통 (consensus)" 또는 "공통 서열"은 본 발명에서 플라비바이러스 항원의 다수의 서브타입의 정렬의 분석을 기초로 하여 구성된 합성 핵산 서열, 또는 상응하는 폴리펩타이드 서열을 의미하는 것으로 사용된다. 공통 플라비바이러스 항원은 웨스트 나일 바이러스 (WNV) 및 일본 뇌염 바이러스 (JEV)의 E 단백질의 DIII 도메인, 또는 두 가지 서열의 요소를 조합한 키메릭 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "단편"은 공통 DIII 항원 중의 적어도 하나에 대한 비-단편의 면역반응과 실질적으로 유사한 포유동물에서의 면역반응을 야기할 수 있는 폴리펩타이드를 코드화한 핵산, 또는 그의 일부분을 의미한다. 단편은 SEQ ID NOS: 12, 13, 및 14를 포함하는 본 발명의 다양한 코드화 뉴클레오타이드 서열 중의 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. DNA 단편은 길이가 30 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 45 또는 그 이상, 60 또는 그 이상, 75 또는 그 이상, 90 또는 그 이상, 120 또는 그 이상, 150 또는 그 이상, 180 또는 그 이상, 210 또는 그 이상, 240 또는 그 이상, 270 또는 그 이상, 300 또는 그 이상, 360 또는 그 이상, 또는 400 또는 그 이상의 길이일 수 있다. DNA 단편은 IgE 또는 IgG 서열과 같은 면역글로불린 리더에 대한 코드화 서열을 포함할 수 있다.
DNA 단편은 10 미만, 20 미만, 30 미만, 40 미만, 50 미만, 60 미만, 75 미만, 90 미만, 120 미만, 150 미만, 180 미만, 210 미만, 240 미만, 270 미만, 300 미만, 360 미만 또는 400 미만의 뉴클레오타이드일 수 있다.
"단편"은 또한, 적어도 하나의 DIII 단백질 (또는 항원)에 대한 비-단편의 면역반응과 실질적으로 유사한 포유동물에서의 면역반응을 유발할 수 있는 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 단편은 SEQ ID NOS: 9, 10, 및 11을 포함하는 다양한 코드화 폴리펩타이드 서열 중의 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩타이드 단편일 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 대중적으로 이용할 수 있는 데이터베이스에 의해서 제공된 것으로서 적어도 하나의 항원성 에피토프와 접촉하도록 분석할 수 있다. 폴리펩타이드 DIII 단편은 IgE 또는 IgG와 같은 면역글로불린 리더에 대한 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 길이가 30 또는 그 이상의 아미노산, 45 또는 그 이상, 60 또는 그 이상, 75 또는 그 이상, 90 또는 그 이상, 120 또는 그 이상, 또는 130 아미노산 또는 그 이상의 길이일 수 있다.
폴리펩타이드 단편은 길이가 10 미만의 아미노산, 20 미만, 30 미만, 40 미만, 50 미만, 60 미만, 75 미만, 90 미만, 120 미만, 또는 130 미만의 아미노산일 수 있다.
용어 "보조제"는 본 발명에서, DNA 플라스미드에 의해서 코드화되고, 이하에 기술된 핵산 서열을 코드화한 원하는 항원, 바람직하게는 공통 항원의 항원성을 증진시키도록 본 발명에 기술된 DNA 플라스미드 벡터에 첨가된 모든 분자를 의미하는 것으로 사용된다.
용어 "서브타입 (subtype)" 또는 "혈청형 (serotype)"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용되며, 하나의 서브타입이 상이한 서브타입과는 별개의 면역 시스템에 의해서 인식되도록, 즉 하나의 서브타입이 또 다른 서브타입과는 상이한 면역원성 특징을 갖도록 하는 바이러스의 유전적 변이체, 또는 그 안의 에피토프를 의미한다.
3 가지 타입의 DIII 서열: 공통 JEV DIII, 공통 WNV DIII, 및 WNV에 대한 중화 항체의 도입 시에 결정인자인 것으로 나타난 WNV DIII 잔기 (JW DIII 또는 JEV/WN DIII 또는 WN/JEV DIII로 표시됨) [16, 17]가 상응하는 위치에 혼입된 키메릭 서열 JEV 서열. 이들 모든 서열은 각각 20 개의 스트레인에 걸쳐서 공통적이다. DNA 백신 개발을 위한 공통 서열의 사용은 감염성 질환에 대한 투쟁에서 최신의 커팅 에지 (cutting edge) 기술 중의 하나이다 [22, 23]. 공통 서열을 기초로 하여, 합성 인간 코돈 최적화 서열이 이 검정에서 면역화를 위해서 생성되었다.
코드화 뉴클레오타이드
본 발명의 한 관점은 단백질 E의 공통 DIII 도메인을 코드화한 분리된 핵산을 포함한다. 이들 핵산은 다음의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다: (a) SEQ ID NOS: 12, 13, 또는 14; (b) SEQ ID NOS: 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 코드화한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 보체. 본 발명의 또 다른 관점에서는, 본 발명에서 제공된 분리된 핵산을 포함하는 유전적 구성체가 제공된다. 일부의 구체예에서, 유전적 구성체는 코작 서열 GGT ACC GCC ACC (SEQ ID NO.15) 및/또는 IgG 또는 IgE, 바람직하게는 IgE, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 8의 서열을 갖는 IgE의 일부분으로부터 선택된 리더 서열을 포함할 수 있다.
공통 DIII 단백질은 공통 DIII 핵산, 그의 변이체 또는 그의 단편에 의해서 코드화될 수 있다. 공통 FIII 핵산은 코돈 최적화될 수 있고/있거나 RNA 최적화될 수 있다. 공통 DIII 핵산 서열은 리더 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열은 DIII 코드화 서열의 5'일 수 있다. 이 서열에 의해서 코드화된 공통 DIII 단백질은 N-말단 리더에 이어서 공통 DIII 단백질을 포함할 수 있다. N-말단 리더는 IgE 또는 IgG일 수 있다.
폴리펩타이드/ 항원
본 발명에서는 포유동물에게서 하나 또는 그 이상의 플라비바이러스 혈청형, 특히 웨스트 나일 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스의 다양한 혈청형에 대한 면역반응을 유발할 수 있는 항원이 제공된다. 항원은 포유동물에게서 하나 또는 그 이상의 범유행성 (pandemic) 스트레인에 대한 것을 포함하는 하나 또는 그 이상의 플라비바이러스 혈청형에 대한 면역반응을 유발할 수 있다. 항원은 이들이 항-플라비바이러스 면역반응을 유도할 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이 되도록 만드는 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명의 한가지 관점에서는, 공통 DIII 단백질인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. DIII 단백질은 (a) SEQ ID NOS: 9, 10 또는 11; 또는 (b) (a)의 단편을 포함할 수 있다. 공통 DIII 단백질은 그의 N-말단 상에 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. IgE 리더 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에 설명된 것일 수 있다. IgE 리더 서열을 갖는 공통 DIII 단백질은 각각 JEV DIII, WNV DIII, 또는 JW DIII을 또한 포함하는 SEQ ID NO: 1, 2, 또는 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
백신
본 발명의 관점은 (a) 본 발명에 제공된 분리된 핵산을 포함하는 코드화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 유전적 구성체; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 다수의 WNV 및 JEV 혈청형에 대한 면역반응을 숙주에서 생성시킬 수 있는 DNA 백신이며, 여기에서 유전적 구성체는 면역반응을 유발하는데 효과적인 양으로 숙주의 세포 내에서 단백질 E 항원의 공통 DIII 도메인을 발현할 수 있다.
일부의 구체예에서, 본 발명의 DNA 백신은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 갖는 유전적 구성체를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에서, DNA 백신은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 보조제는 α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장인자 (EGF), 피부 T 세포 유인 케모킨 (CTACK), 상피 흉선 발현 케모킨 (TECK), 점막 연관된 상피 케모킨 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 신호 서열이 결실되고, 임의로 IgE, IL-12, IL-15, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장인자 (EGF)로부터의 신호 펩타이드를 포함하는 IL-15를 포함하는 CD86, IL-I, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO, IL-12, IL-18, IL-28, MCP-I, MIP-Ia, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-I, VLA-I, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장인자, 섬유아세포 성장인자, IL-7, 신경성장인자, 혈관 내피 성장인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-I, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, 킬러 (KILLER), TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPl, TAP2 및 이들의 기능적 단편 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 백신은 또한 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 또는 그의 기능적 단편과 함께 투여될 수 있다.
일부의 바람직한 구체예에서, 보조제는 하나 또는 그 이상의 추가의 보조제와 함께 IL-15이다.
유전적 구성체
본 발명에서는 DIII 항원을 코드화한 핵산을 포함할 수 있는 유전적 구성체가 제공된다. 유전적 구성체는 DIII 항원을 코드화한 핵산을 포함하는 기능적 염색체외 분자, 바람직하게는 DNA 플라스미드로 세포 내에 존재할 수 있다. DIII 항원을 코드화한 핵산을 포함하는 유전적 구성체는 중심절 (centromere), 텔로머 (telomers)를 포함하는 선형 미니염색체일 수 있다. 유전적 구성체는 또한, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 게놈의 일부분일 수 있다. 유전적 구성체는 세포 내에서 생존하는 재조합 미생물 벡터 또는 약독화된 생 미생물 내의 유전적 물질의 일부분일 수 있다. 유전적 구성체는 DIII 핵산의 유전자 발현을 위한 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서 (enhancer), 개시 코돈, 정지 코돈, 또는 폴리아데닐화 시그날일 수 있다. 인핸서는 종종, 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코드화한 서열의 유전자 발현에 필요하다. 이들 요소는 원하는 단백질을 코드화한 서열에 작동적으로 연결될 수 있으며, 조절 요소는 이들이 투여되는 개체에게서 기능적일 수 있다.
유전적 구성체 또는 벡터는 또한, DIII 코드화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. DIII 코드화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 시미안 (simian) 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 소 면역결핍 바이러스 (BIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 몰로니 (Moloney) 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 프로모터, CMV 즉시 조기 프로모터와 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 엡스타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 (EBV) 프로모터, 또는 로우스 (Rous) 육종 바이러스 (RSV) 프로모터로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한, 천연 또는 합성인 근육 또는 피부 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 그의 내용이 본 발명에 온전히 포함된 미국 특허출원 공개 제US20040175727호에 기술된다.
벡터는 또한, DIII 코드화 서열의 하류일 수 있는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그날은 SV40 폴리아데닐화 시그날, LTR 폴리아데닐화 시그날, 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 시그날, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 시그날, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 시그날일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 시그날은 pCEP4 벡터 (Invitrogen, San Diego, CA)로부터의 폴리아데닐화 시그날일 수 있다.
벡터는 또한, DIII 코드화의 상류에 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA 발현을 위해서 필수적 일 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 CMV, HA, RSV 또는 EBV 중의 하나와 같은 바이러스 인핸서일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 각각의 내용이 완전히 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972, 5,962,428호, 및 WO94/016737에 기술되어 있다.
유전적 구성체에는 구성체를 염색체외적으로 유지시키고, 세포 내에서 구성체의 다수의 카피를 생산하기 위해서 복제의 포유동물 기원이 제공될 수 있다. 플라스미드 pVAXl, pCEP4 및 pREP4 (Invitrogen, San Diego, CA)는 복제의 엡스타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 기원, 및 통합이 없이 높은 카피의 에피좀성 복제를 제공하는 핵 항원 EBNA-1 코드화 부분을 함유한다. 벡터의 골격은 pAV0242일 수 있다. 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 타입 5 (Ad5) 벡터일 수 있다.
벡터는 또한, 벡터가 투여된 포유동물 또는 인간 세포 내에서 유전자 발현에 상당히 적합할 수 있는 조절 서열을 포함할 수 있다. DIII 코드화 서열은 숙주 세포 내에서 코드화 서열의 더 효율적인 전사를 허용할 수 있는 최적화 코돈을 포함할 수 있다.
벡터는 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli (E.coli))에서 단백질 생산을 위해서 사용될 수 있는 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 벡터는 또한, 효모의 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 스트레인에서 단백질 생산을 위해서 사용될 수 있는 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 벡터는 또한, 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해서 사용될 수 있는 MAXBAC™ 완전 바큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, Calif.)의 것일 수 있다. 벡터는 또한, 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary (CHO)) 세포와 같은 포유동물 세포에서 단백질 생산을 위해서 사용될 수 있는 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 벡터는 완전히 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning an Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)]을 포함하여 쉽게 이용할 수 있는 출발물질 및 일상적인 기술에 의해 단백질을 생산하는 발현 벡터 또는 시스템일 수 있다.
단백질 생산을 최대화하기 위해서, 구성체가 투여된 세포 내에서 유전자 발현에 상당히 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 또한, 숙주 세포 내에서 가장 효율적으로 전사되는, 즉 코돈 최적화된, 상기 단백질을 코드화한 코돈이 선택될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 세포 내에서 기능적인 DNA 구성체를 생산할 수 있다.
일부의 구체예에서는, 본 발명에 기술된 단백질에 대한 코드화 서열이 IgE 신호 펩타이드에 연결된 핵산 구성체가 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 본 발명에 기술된 단백질은 IgE 신호 펩타이드에 연결된다.
벡터는 pVAXl-WNV DIII, pVAXl-JEV DIII, 또는 pVAXl-JW DIII일 수 있으며, 이들은 모두 각각의 DIII 항원을 발현시키기 위해서 사용될 수 있다. 벡터 pVAXl-WNV DIII은 SEQ ID NO: 5 또는 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 벡터 pVAXl-JEV DIII은 SEQ ID NO: 4 또는 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 벡터 pVAXl-JW DIII은 SEQ ID NO: 6 또는 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
면역화의 방법
본 발명의 한가지 관점에서는, (a) 본 발명에서 제공된 백신을 숙주의 조직에 전달하는 단계; 및 (b) 세포 내로 백신의 유전적 구성체의 유입을 허용하는데 효과적인 에너지의 펄스를 전달하는 전기천공 장치를 사용하여 조직의 세포를 전기천공시키는 단계를 포함하는, 숙주 내에서 다수의 플라비바이러스 바이러스 혈청형에 대한 면역반응을 유발시키는 방법이 제공된다.
백신은 포유동물에게 투여하여 포유동물에게서 면역반응을 유발시킬 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 암소 (cow), 돼지, 축우 (cattle), 양, 염소, 영양, 바이슨 (bison), 물소, 바이슨, 소과 동물 (bovids), 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 랫트, 또는 닭, 바람직하게는 인간, 암소, 돼지 또는 닭일 수 있다.
DNA 백신은 생체내 전기천공이 있거나 없는 DNA 주사 (또한, DNA 백신 접종으로 불림), 리포좀 매개되고, 나노입자 촉진된 재조합 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 몇 가지의 잘 알려진 기술 중의 어느 것을 사용하여서도 전달될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 기술된 DNA 플라스미드와 같은 핵산 분자는 DNA 주사에 의해서, 및 생체내 전기천공과 함께 전달된다.
투여의 경로에는 근육내, 비내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내, 및 경구뿐만 아니라 국소적, 경피적으로, 흡입 또는 좌제에 의해서, 또는 질, 직장, 요도, 구강 및 설하 조직에 대한 세정에 의한 것과 같은 점막 조직에 대한 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 투여의 바람직한 경로는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사를 포함한다. 유전적 구성체는 전통적인 시린지, 무침 주사 장치, "미세입자 투사 곤건즈 (microprojectile bombardment gone guns)", 또는 전기천공 ("EP"), "유체역학적 방법 (hydrodynamic method)", 또는 초음파와 같은 그 밖의 다른 물리적 방법을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 수단에 의해서 투여될 수 있다.
본 발명의 DNA 백신의 전달을 촉진시키는데 바람직한 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예로는 이들의 내용이 이에 의해서 온전히 참고로 포함된 미국 특허 제7,245,963호 (Draghia-Akli, et al), 미국 특허공개 제2005/0052630호 (Smith, et al.)에 기술된 것이 포함된다. 또한, 바람직한 것은 35 USC 119(e)에 따라 미국 가출원 제60/852,149호 (2006년 10월 17일 출원) 및 제60/978,982호 (2007년 10월 10일 출원)의 특전을 청구하는, 공동-계류 중이고 공동-소유된 미국 특허출원 제11/874072호 (2007년 10월 7일 출원)에서 제공된 DNA 백신의 전달을 촉진시키는 전기천공 장치 및 전기천공 방법이며, 이들 문헌은 모두 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 (Draghia-Akli, et al.)에는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생물분자의 도입을 촉진시키기 위한 모듈형 전극 (modular electrode) 시스템 및 그들의 사용이 기술되어 있다. 모듈형 전극 시스템은 다수의 니들 (needle) 전극; 피하 니들; 프로그램식 정전류 펄스 제어기로부터 다수의 니들 전극으로의 전도성 링크 (link)를 제공하는 전기 커넥터 (connector); 및 동력원을 포함한다. 오퍼레이터 (operator)는 지지 구조체에 장착된 다수의 니들 전극을 잡아서 이들을 신체 또는 식물 내의 선택된 조직 내로 단단히 삽입할 수 있다. 그 후, 생물분자를 피하 니들을 통해서 선택된 조직 내로 전달한다. 프로그램식 정전류 펄스 제어기를 작동시키고, 정전류 전기적 펄스를 다수의 니들 전극에 적용한다. 적용된 정전류 전기적 펄스는 다수의 전극들 사이에서 세포 내로 생물분자의 도입을 촉진시킨다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 이에 의해서 참고로 포함된다.
미국 특허공개 제2005/0052630호 (Smith, et al.)는 신체 또는 식물 내의 선택된 조직의 세포 내로의 생물분자의 도입을 효과적으로 촉진시키기 위해서 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 전기천공 장치는 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해서 그의 작동이 명시되는 동전기적 (electro-kinetic) 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라메터의 입력을 기반으로 하는 어레이 내의 전극들 사이에서 일련의 프로그램식 정전류 펄스 패턴을 생산하며, 전류 파형 데이터의 저장 및 포착을 허용한다. 전기천공 장치는 또한, 니들 전극의 어레이를 갖는 대체가능한 전극 디스크, 주입 니들을 위한 중앙 주입 채널, 및 제거가능한 가이드 디스크를 포함한다. 미국 특허공개 제2005/0052630호의 전체 내용은 이에 의해서 참고로 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허공개 제2005/0052630호에 기술된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로의 심부 침투에 적합하다. 전극 어레이의 배열로 인하여, 주입 니들 (선택된 생물분자의 전달을 위함)은 또한 표적 기관 내로 완전히 삽입되며, 주입은 전극에 의해서 전-묘사된 도메인 내에서 표적 조직에 대해 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허공개 제2005/005263호에 기술된 전극은 바람직하게는 길이가 20 ㎜이고, 21 게이지 (gauge)이다.
이하의 것은 본 발명의 방법의 예이며, 상기에 거론된 특허 문헌에서 더 상세히 거론된다: 전기천공 장치는 포유동물의 원하는 조직에 사용자에 의한 미리 설정된 전류 입력과 유사한 정전류를 생성시키는 에너지의 펄스를 전달하도록 배열될 수 있다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 (assembly) 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 성분은 제어기, 전류 파형 생성기, 임피던스 테스터 (tester), 파형 로거 (logger), 입력 요소, 상태 보고 요소 (status reporting element), 통신 포트, 기억 성분, 동력원, 및 동력 스위치를 포함하는 전기천공 장치의 다수의 요소들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하고 통합시킬 수 있다. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 요소로서 기능을 할 수 있으며, 다른 요소는 전기천공 성분과 소통하는 별개의 요소 (또는 성분)이다. 일부의 구체예에서, 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나 이상의 요소로서 기능을 할 수 있으며, 이것은 전기천공 성분과는 별개의 전기천공 장치의 다른 요소와 여전히 소통할 수 있다. 요소들은 하나의 장치로서, 또는 또 다른 것과 소통하는 별개의 요소로서 기능을 할 수 있기 때문에, 본 발명은 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 일부분으로 존재하는 전기천공 장치의 요소에 의해서 제한되지 않는다. 전기천공 성분은 원하는 조직 내에서 정전류를 생성시키는 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 피드백 기전을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간적 배열로 다수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함하며, 여기에서 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 수용하여 이것을 전극을 통해서 원하는 조직에 전달한다. 다수의 전극 중의 적어도 하나는 에너지의 펄스를 전달하는 중에 중성 (neutral)이며, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 전기천공 성분에 전달한다. 피드백 기전은 측정된 임피던스를 수용할 수 있고, 전기천공 성분에 의해서 전달된 에너지의 펄스를 조정하여 정전류를 유지시킬 수 있다.
일부의 구체예에서는, 다수의 전극은, 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 일부의 구체예에서는, 다수의 전극이 프로그램된 시퀀스 하에서 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 프로그램된 시퀀스는 사용자에 의해서 전기천공 성분에 입력된다. 일부의 구체예에서, 프로그램된 시퀀스는 차례로 전달된 다수의 펄스를 포함하며, 여기에서 다수의 펄스 중의 각각의 펄스는 임퍼던스를 측정하는 하나의 중성 전극 (neutral electrode)을 갖는 적어도 2 개의 활성 전극에 의해서 전달되고, 다수의 펄스의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2 개의 활성 전극 중의 상이한 하나에 의해서 전달된다.
일부의 구체예에서, 피드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 피드백 기전은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 이 피드백은 매 50 ㎲, 20 ㎲, 10 ㎲ 또는 1 ㎲ 마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백 또는 순간적 (즉, 반응 시간을 결정하기 위해서 이용가능한 기술에 의해서 측정된 것으로 실질적으로 순간적)일 수 있다. 일부의 구체예에서, 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하며, 임피던스는 피드백 기전에 전달하고, 피드백 기전은 임피던스에 반응하고 에너지의 펄스를 조정하여 정전류를 미리 설정된 전류와 유사한 값으로 유지시킨다. 일부의 구체예에서, 피드백 기전은 에너지의 펄스의 전달 중에 정전류를 연속적이고 순간적으로 유지시킨다.
실시예
본 발명은 이하의 실시예에서 더 설명된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내지만 단지 설명을 위해서 제시된 것으로 이해되어야 한다. 상기한 검토 및 이들 실시예로부터, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있으며, 그의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 이것이 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명에 나타내고 기술된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 자명할 것이다. 이러한 변형도 또한 첨부된 특허청구의 범위의 범주 내에 포함시키고자 한다.
본 발명의 EP 장치에서 사용하기 위한 DNA 플라스미드는 공지의 장치 및 기술의 조합을 사용하여 조제되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이들은 공통적으로 소유되고 공동-계류 중인 미국 가출원인 미국 특허출원 제60/939,792호 (2007년 5월 23일 출원)에 기술된 최적화 플라스미드 제조기술을 사용하여 제조된다. 일부의 실시예에서, 이들 검정에 사용된 DNA 플라스미드는 10 ㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 조제될 수 있다. 제조 기술은 또한, 공통적으로 소유된 특허인 미국 특허 제7,238,522호 (2007년 7월 3일에 허여됨)에 기술된 것을 포함하여, 미국 특허출원 제60/939792호에 기술된 것 이외에 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 통상적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 통합시킨다. 미국 특허출원 제60/939,792호 및 미국 특허 제7,238,522호는 모두 이에 의해서 온전히 포함된다.
세포주
HeLa 및 RD 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터 수득하였다. 세포는 10% 열불활성화된 태자소혈청, 페니실린 G (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)이 보충된 DMEM 배지 내에서 5 CO₂ 하에 37℃로 유지되었다.
간접 면역형광 검정
HeLa 세포를 사용하여 간접 면역형광 검정을 수행하였다. 세포를 2-챔버 슬라이드 내에 접종하고, 이들을 형질감염에 사용하기 전에 밤새 성장시켰다. 이들을 푸젠 (FuGENE) 6 형질감염 시약 (Roche)을 사용하여 백신 구성체 또는 pVAX (1 ㎎/웰)로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 지 36 시간 후에, 세포를 메탄올로 실온에서 20 분 동안 고정시키고, 온화하게 PBS로 세척하였다. 이들을 백신접종된 마우스로부터의 항-마우스 혈청과 함께 90 분 동안 배양하고, 다시 세척하였다. 이어서, 샘플을 FITC 컨주게이트된 이차 항체 (Sigma-Aldrich)와 함께 45 분 동안 배양하였다. 소정의 도메인에서 이용할 수 있는 세포의 총 수를 나타내기 위해서 40,6-디아미도-2-페닐인돌 하이드로클로라이드 (Sigma-Aldrich)를 이차 항체의 용액에 첨가하여 핵 내용물을 반대 염색하였다. 영상은 형광 현미경을 위한 3 상 프로 프로그램 (Phase 3 Pro program) (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)을 사용하여 획득하였다.
통계학적 분석
모든 값은 각각의 실험군으로부터의 3 중 샘플로부터 계산된 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. 적절한 경우에, 통계학적 차이는 2-꼬리, 대응 스투던트 t 검정 (two-tailed, paired Student's t Test)을 사용함으로써 평가되었으며, 각각의 실험군에 대한 특정의 p 값을 수득하였다. 일상적으로, 나타낸 데이터는 이중 또는 삼중으로 수행된 적어도 3 개의 독립적인 실험을 대표하는 것이다.
실시예 1: 공통 DNA 백신 구성체 및 합성
JEV 및 WNV E DIII 공통 서열을 생성시키기 위해서, 약 15 개의 상이한 서열을 GeneBank (NCBI)로부터의 상이한 지리학적 지역으로부터 수집하여 샘플링 편향을 피하였으며, MegAlign (DNASTAR, Madison, WI)을 사용하여 정렬하였다. IgE-리더 서열을 생성된 공통 서열의 아미노 말단에 부가하고, 2 개의 정지 코돈을 개방 판독 프레임의 말단에 부가하였다. KpnI 및 PstI 부위를 각각 5' 및 3' 말단에 태깅하였다. 완전한 서열을 GeneOptimizer (GENEART, Regensburg, Germany)를 사용한 코돈 최적화 및 RNA 최적화에 적용하였다. 그 후, 코돈 최적화 합성 서열을 본 발명에 기술된 바와 같이 pVAXl 발현 벡터 (Invitrogen) 내에 클로닝하였다.
인간 IL -15 ECRO 의 pVAXl 벡터 내로의 클로닝 및 IL -15 발현 분석
천연 IL-15는 IL-15 해독의 조절에 연루될 뿐만 아니라 그의 세포내 트래피킹 (trafficking)을 지시하는 2 개의 대체 리더 펩타이드를 함유한다. 전형적인 길이 (48 aa)의 신호 펩타이드는 IL-15의 모든 분비된 형태와 연관되는 반면에, 짧은 21 aa 신호 펩타이드를 함유하는 IL-15는 분비되지 않고 오히려 세포 내로 저장된다 (1-4). 최적화 인간 IL-15의 플라스미드 형태 (pIL15 ECRO)를 위한 디자인은 LSP를 증가된 단백질 발현을 위해서 본 발명자들의 실험실에 의해 디자인된 "최적화" IgE 리더로 대체시키는 것을 필요로 한다 (5, 6). 또한, 코돈 용법은 호모 사피엔스 (Homo sapiens) 유전자의 코돈 편향에 적합하도록 되어 높은 CAI 값 (비 최적화: 0.66; 최적화: 0.98)을 제공하였다. 인간과 마우스 유전자는 73% 상동성을 공유하기 때문에, 본 발명자들은 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 pIL15 ECRO를 이용하였다. 디자인 및 합성을 위해서, 코돈은 가능한 경우에 매우 높거나 (> 80%) 매우 낮은 (< 30%) GC 함량의 부분이 회피되도록 선택하였다. 이에 관해서, 야생형 IL15 유전자는 높은 빈도로 희귀 코돈을 사용하며, GC 함량은 매우 낮아 (35%) 빠른 mRNA 턴오버 (turnover)를 촉진시키는 것으로 결정되었다. 따라서, GC-함량을 증가시켜 (57%) mRNA 반감기를 연장시켰다. 최적화 과정 중에, 다음의 시스-작용성 서열 모티프는 회피하였다: 내부 TATA 박스 (boxes), 카이 (chi)-부위 및 리보좀 유입 부위, AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치 (stretches), ARE, INS, CRS 서열 요소, 반복 서열 및 RNA 이차 구조, (암호화) 스플리스 공여체 및 수용체 부위 및 분기점. 분석 후에, 3 개의 반대 시스-작용성 모티프를 확인하고 제거하였다. 유전자의 최종 디자인은 야생형 LSP 형태를 대체시킨 IgE 리더를 갖는 인간 IL15의 성숙한 형태와 100% 합동을 함유하였다. 고도로 최적화된 합성 인간 IL15 유전자를 합성 올리고뉴클레오타이드 (Geneart, Inc., Germany)로부터 조립하였다. 코작 서열을 도입시켜 해독 개시를 증가시켰으며, 2 개의 정지 코돈을 부가하여 효율적인 종료를 보장하였다. 단편은 EcoRI 및 XhoI 제한부위를 사용하여 pVAXl 내로 클로닝하였다. 최종 구성체는 서열 분석에 의해서 확인하였으며, 100% 합동인 것으로 밝혀졌다. 형질감염시키기 1일 전에, DlO 배지 (DMEM, 20% FBS, 1% 항생제) 중에서 성장시킨 7.0×10⁵ HeLa 또는 RD 세포를 60 ㎜ 배양 접시 (Falcon) 상에 접종하였다.
그 후, 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 DOTAP 리포좀 형질감염 키트 (Roche Biochemicals, CA)를 사용하여 5 ㎍의 IL-15 구성체로 형질감염시켰다. 상등액을 형질감염시킨 후 24, 48, 및 72 시간에 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA (R & D)에 의해서 단백질 레벨에 대해 분석하였다.
공통 항원의 입증
서열 분석에 의해서 삽입물의 서열을 확인한 후에 이들을 백신접종 검정에서 적용하기 전에, DIII 백신 구성체를 적절한 분자 질량을 갖는 이들의 유전자 생성물을 발현하는 이들의 능력에 대해서 입증하였다. 검정관내 해독/전사 시스템 (Promega, Madison, WI)을 사용하여, 이들 구성체로부터 35S-표지된 방사성 단백질 생성물을 생성시키고, 면역침전시키고, SDS-PAGE에 의해서 분해시켰다. 이들 플라스미드는 개방 판독 프레임의 예상된 길이에 상응하는 질량으로 약 16.5 kDa의 유전자 생성물을 생성시켰다 (도 1d). 세포 내에서 이들의 발현 중에 RT-PCR에 의해 적절한 mRNA 전사물의 존재를 확인하기 위해서, RD 세포를 빈 벡터 또는 pVAXl-보유 DIII 도메인 구성체로 형질감염시켰다. 개개 DIII-구성체를 발현하는 형질감염된 세포로부터 약 420bps의 cDNA의 존재는 단지 DIII 구성체에 의해서 형질감염된 세포로부터만 관찰되었다. 모의-형질감염된 세포로부터 상응하는 시그날의 결여는 이 검정의 특이성을 뒷받침한다 (도 IE). 이들 결과는 함께 JEV, WNV 및 JE/WNV DIII 구성체를 입증하였으며, 따라서 이들을 면역화 검정에 더 적용하였다.
IL -15 ECRO 구성체의 발현 분석
ILl5의 국재화 패턴을 확인하기 위하여, HeLa 세포를 이들 IL15 구성체 각각으로 형질감염시키고, 모노클로날 항-IL15 항체를 사용한 면역형광 분석에 적용하였다. 예상된 바와 같이, IL15 SSP는 핵 부분 내에 유지되었으며, IL15 LSP 및 IL15 ECRO는 둘 다 세포질 국재화 패턴을 나타내었다 (도 2a). 다음으로, RD 세포에서의 형질감염 검정을 수행하여 기능적 IL15를 발현하고 분비하는 이들의 능력에 있어서의 IL15-구성체의 효율을 비교하였다. 데이터는 단백질 생산 및 분비의 실질적인 증가 (천연 IL-15보다 87-배 더 크고, IL-15-LSP 구성체보다 5.7-배 더 크다)가 특이적 ELISA 분석에 의해서 측정된 바와 같이 인간-최적화 구성체 IL15 ECRO로부터 관찰되었다 [33](도 2b, C). 이들 데이터는 pIL15 ECRO 구성체가 본 발명자들이 이전에 보고한 모든 IL15 발현 플라스미드보다 IL15를 발현 및 분비시키는데 매우 효율적임을 명백하게 입증한다.
실시예 2: 백신 구성체의 검정관내 발현
구성체가 예상된 분자 질량을 갖는 이들의 유전자 생성물을 생성시키는 능력은 백신접종 검정에서 이들을 사용하기 전에 확인하였다. pVAXl 골격에서 T7-프로모터를 이용함으로써, TNT T7 검정관내 전사/해독 키트 (Promega, Madison, WI)를 사용하여 공급자의 프로토콜에 따라 35S-메티오닌 표지된 단백질 샘플을 생성시켰다. 방사성표지된 단백질 샘플은 면역침전된 항-WNV E 또는 항 JEV E 항체였으며, 면역침전된 컴플렉스를 15% SDS-PAGE 겔 (BioRad) 상에서 전기영동하였다. 겔을 포스포인핸서 (phosphoenhancer) 용액 (Amersham)을 사용하여 고정시키고, 진공 건조기 (Biorad)를 사용하여 건조시켰다. 자가방사기록을 수행하여 혼입된 S35-표지된 유전자 생성물을 검출하였다.
도 1a는 플라비바이러스 폴리펩타이드의 조직화 및 E 단백질의 배좌 특징을 개략적으로 나타낸다. 고도로 교차-반응성인 세포성 반응을 유도하는 능력을 갖는 면역원을 개발하기 위한 노력으로, 아미노산 서열 JEV 및 WNV E DIII 도메인을 공공의 데이터베이스로부터 다운로드하였다. 서열은 다양한 지리학적 위치로부터 선택되었으며, 비-재조합체였다. MegAlign (DNASTAR, Madison, WI) 프로그램이 아미노산 서열을 정렬하기 위해서 사용되었으며, 각각의 위치에서 가장 공통적인 아미노산이 선택되었다. 본 발명자들은 DIII 단편의 길이를 변화시키지 않으면서 3 개의 구성체, 즉 공통 WNV DIII 구성체, 공통 JEV DIII 구성체, 및 중화성 항체를 유도하는데 결정인자인 것으로 나타난 WNV DIII으로부터의 몇 개의 잔기가 JEV DIII의 그들의 상응하는 위치에 혼입된 키메릭 JEV 구성체를 생성시켰으며; 이 항원은 JE/WNV DIII 도메인으로 불린다 (도 1b). 이 키메릭 클론에 대한 이론적 설명은 두 개의 개개 백신 구성체 대신에 WNV 및 JEV 둘 다에 대한 증진된 면역성을 함께 제공할 수 있는 단일 백신 구성체를 갖는 것이었다. 공통 서열의 생성 후에, IgE 리더 서열을 DIII 도메인 코드화 서열의 아미노 말단에 융합시켰다. 아미노산 서열을 기초로 하여, 인간 최적화 합성 유전자 서열을 구성하고, 3 가지 백신 구성체 모두를 생성시키고, pVAX 벡터 내로 클로닝하였다 (도 1c).
실시예 3: 박테리아 발현 E DIII 단백질
DIII 코드화 부분은 KpnI/PstI에 의한 분해로 그들의 pVAX 골격으로부터 유리되었다. 유리된 단편을 겔-정제한 다음에, KpnI/PstI 분해된 pQE-30 내에 접합시켰다. 접합 생성물을 JM 109 세포 내로 형질전환시키고, 이것을 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 콜로니를 37℃에서 밤새 형성시켰다. 개별적인 콜로니로부터 글리세롤 원액 (stocks)을 제조하였다. 단백질 발현을 위해서, 글리세롤 원액의 3 ㎕ 분취액을 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 6 밀리리터의 LB 육즙을 함유하는 16×150 ㎜ 튜브에 첨가하였다. 생성된 박테리아 펠릿을 처리하고, 용해물을 단백질 샘플의 정제를 수행하는 표준 프로토콜에 따라 Ni-칼럼을 통과시켰다. 생성된 정제된 단백질 샘플을 ELISA뿐만 아니라 B-세포 증식 ELISpot 검정을 위한 코팅 항원으로 사용될 수 있다.
JEV , WNV 및 JE / WNV DIII 단백질의 생산
DIII 코드화 단편을 박테리아 발현 벡터 내로 서브클로닝하고, 단백질 단편을 본 발명에 기술된 바와 같은 Ni-킬레이트화 칼럼을 사용하여 정제하였다. 도 3은 상이한 정제단계로부터의 DIII 단편의 순도 레벨을 설명한다. DIII 발현 박테리아 세포로부터의 조 용해물을 함유하는 레인은, IPTG 도입이 없이도 DIII 단편의 발현의 레벨은 매우 탁월하였음을 나타내었다. 전체 조 샘플 레인으로부터 존재하는 샘플의 래더에 비해서, 16 kDa의 질량에 상응하는 뚜렷한 단일 밴드가 250 mM 이미다졸을 함유하는 용출된 분획으로부터 관찰되었으며, 이것은 발현된 DIII 단편의 순도의 높은 레벨을 나타낸다. 20 mM의 이미다졸은 Ni-킬레이트화 매트릭스로부터 His-태깅된 DIII 샘플을 유리시키는데 충분하지 않았다. 따라서, 용출 완충액 중에서 이미다졸의 선택은 His-태깅된 단백질의 용출에 매우 특이적이었다. 정제된 분획을 투석하고, 이 검정에서 코팅 항원으로서의 그들의 후속 적용을 위한 그들의 농도의 결정을 위해서 분취액으로 저장하였다.
실시예 4: 마우스 및 면역화
6-8-주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 Jackson laboratory로부터 구입하였다. 6-8-주령의 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River, Wilmington, MA)의 대퇴사두근에 격주 간격으로 각각 10 ㎍의 DNA를 3 회 주입하고, 전기천공하였다. DNA 면역화를 위해서, 마우스를 각각 5 마리의 마우스의 그룹으로 분리시키고, 각각 pIL15 ECRO 및 pVAX (대조군) 또는 pJEV DIII, pJE/WNV DIII, pWNV DIII, 및 pJEV DIII + pWNV DIII로 전기천공함으로써 면역시켰다.
간략하면, 구형파 (square-wave) 펄스가 사용되었으며, 정전류 셀렉트라 (CELLECTRA®) 전기천공기 (VGX Pharmaceuticals Inc., Blue Bell, PA)에 의해서 전달되었다. 3 전극 어레이 (3-EA)가 사용되었으며, 이것은 2 개의 긴 면의 길이가 0.5 ㎜이고, 짧은 면의 길이가 0.3 ㎜인 이등변삼각형을 형성하고, 비전도성 플라스틱에 의해서 함께 유지된 3 개의 26-게이지 고체 스테인레스 스틸 전극으로 구성되었다. 플라스미드 투여/EP를 위한 이벤트 (events)의 시퀀스는 다음과 같았다: 핸들의 리셉터클 (receptacle) 내에 일회용 전극 어레이를 배치하고, 핸들 상의 개시 버튼을 누르고, 동물 실험군 번호를 기입하고, 인슐린 시린지를 사용하여 DNA 플라스미드를 주입하고, 어레이를 주입 부위 주변의 도메인 내에 즉시 배치하고, 핸들 상의 개시 버튼을 누르고, 4초 카운트다운 후에 펄스가 전달될 것이다. EP 조건은 0.2 Amps, 2 펄스, 52 ㎳/펄스, 펄스 간격은 1 s였다. 모든 전극은 모든 처리 중에 근육 내로 완전히 삽입하였다. 모든 DNA는 무-내독소 퀴아겐 (Qiagen) 칼럼을 사용하여 제조하였다. 마우스는 펜실바니아 대학 (University of Pennsylvania)에서 수용하고 처리하였으며, NIH 및 펜실바니아 대학 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 보호하였다.
DNA 백신접종 혈청으로부터 항- DIII 항체의 적정
DNA 백신의 전달을 위한 생체내 전기천공 (IVE)을 공통 항원과 조합하여 합성 DNA 항원에 대한 강력한 면역반응을 유도하였다. Balb/c 마우스를 pIL15 ECRO의 존재 또는 부재 하에서 개별적인 백신 후보물질 각각으로 면역화시키고 전기천공하였다 (도 4a). 3차 추가접종 후 1 주일에 수득한 DNA-백신접종 마우스로부터의 혈청 샘플을 ELISA에 의해서 JEV 및 WNV에 대한 각각의 항체의 존재에 대하여 검정하였다. 백신접종 마우스는 모두 DIII 도메인에 대한 항체를 생산하였다. 전체 DNA 백신접종 마우스로부터의 혈청을 다음의 3 개의 항원 모두에 대해서 개별적으로 평가하였다: JEV DIII, WNV DIII 및 JE/WNV DIII.
도 4b에 나타낸 바와 같이, ELISA 데이터는 흥미로운 결과를 제공하였다. 첫째로, 이 검정은 IL15-플라스미드에 의한 DIII 구성체의 공동면역화가 JEV 및 WNV DIII 항원 둘 다에 대한 항체 생산을 상당히 증진시켰음을 나타내었다. 비교해보면, IL15의 첨가는 WNV DIII에 대한 최고 레벨의 반응을 유도하였다. 둘째로, IL15로 공동면역되지 않은 동물 그룹에서 JEV와 WNV DIII 발현 플라스미드의 조합은 이들 두 개의 백신 구성체 각각에 의해서 유발된 반응보다 더 높은 레벨의 항체 생산을 유도하였다. 셋째로, 키메릭 JEV/WNV 구성체에 관해서 항체 생산은 상당히 더 낮은 것으로 밝혀졌다. IL15는 이 키메릭 구성체 상에서 그의 양성 효과를 나타내는 것으로 보이지 않았다. 따라서, 이 키메릭 JEV/WNV 항원은 JEV DIII 및 WNV DIII에 대해서뿐만 아니라 키메릭 단백질 자체에 대해서 강력한 항체 면역반응을 유도하는 잠재적인 항원으로서 작용하지 못하였다. 전반적으로, WNV DIII 및 IL15 구성체의 칵테일을 투여한 동물로부터의 항체 역가는 매우 높았으며, 가장 중요하게는 그룹으로부터의 혈청은 3 개의 항원 모두에 대해서 일관되게 결합할 수 있었고, 이것은 이 구성체에 의해서 유도된 광범한 반응성을 입증한다.
실시예 5: DIII 항체 ELISA 검정
DIII 단백질 현탁액을 해동시키고, 튜브를 회전시켜 미세한 단백질 미립체로 현탁시켰다. 재현탁된 단백질 샘플의 작은 분취액을 완충액 TU (62 mM 트리스-HCl/8 M 우레아, pH 8.0)에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 용액을 생산하였다. 희석된 단백질 샘플의 100 ㎕ (1 ㎍)의 분취액을 피어스 히스그라브 (Pierce HisGrab) 구리 코팅된 고결합능 플레이트의 웰에 적용하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날에, 플레이트를 PBST (PBS, 0.05% 트윈 20)로 세척하고, PBST 중의 3% BSA로 1 시간 동안 차단하고, 면역 및 순수한 마우스로부터의 혈청의 계열 희석액과 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 결합된 IgG를 1:10,000의 희석도로 염소 항-마우스 IgG-HRP (Research Diagnostics, NJ)를 사용하여 검출하였다. 결합된 효소는 색원체 기질 용액인 테트라메틸벤지딘 (TMB; R&D Systems)을 첨가하여 검출하고, 비오텍 (Biotek) EL312e 바이오-키네틱스 (Bio-Kinetics) 판독기 상에서 450 ㎚로 판독하였다. 모든 혈청 샘플은 이중으로 검정하였다.
DIII 발현 형질감염 세포에 대한 항- DIII 혈청의 특이성
DNA 백신접종 마우스로부터의 혈청은 또한, 이것이 이들 백신 구성체로 형질감염된 세포에서 발현된 DIII 항원에 결합할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 검정하였다. 이를 위해서, HeLa 세포를 3 개의 DIII 코드화 pVAX 발현 구성체 모두로 일시적으로 형질감염시키고, 형질감염시킨 지 36 시간 후에 세포를 면역형광 분석 (상술한 방법 참조)을 위해서 고정시켰다. 세포를 우선 적절한 혈청 샘플에 이어서 FITC 컨주게이트된 항마우스 이차 항체와 함께 배양하였다. 소정의 도메인에서 이용할 수 있는 세포의 총수를 알기 위해서 세포의 핵 내용물을 DAPI로 반대 염색하였다. DNA 백신접종 마우스로부터의 항-DIII 혈청은 WNV (도 5a) 및 JEV DIII (도 5b)을 발현한 형질감염 세포만을 염색시켰다. 염색 패턴은 플라비바이러스 E의 원형 발현의 패턴과 유사하였다 [35]. 가장 중요하게, DIII 발현 세포는 주로 세포질 국재화 패턴을 나타내었다. 항-DIII-혈청은 비형질감염되거나 pVAX1-형질감염된 HeLa 세포에 의해서는 어떤 상당한 염색도 나타내지 않았다.
실시예 6: 비장 세포 정제
3차 면역시킨 지 1 주일 후에 마우스를 희생시키고, 각각의 마우스로부터 비장을 수확하여 RPMI 1640을 함유하는 15 ㎖ 원뿔형 튜브 (각각의 실험군당 1 개의 튜브) 내에 모았다. 멸균 조직 배양 후드 (hood) 내에서, 각각의 실험군으로부터 모은 비장을 페트리 접시 내에 배치하고, 스토마허 블렌더 (Stomacher blender; Brinkmann Instruments, Inc)를 사용하여 멸균 백 내에서 분쇄하였다. 비장 세포를 세척하여, 펠릿화하고 (1200 rpm); 펠릿을 ACK 용해 완충액 (Biosource)으로 5-10 분 동안 처리한 다음에, 세척하고 펠릿화하여 (1200 rpm) 70 ㎛ 세포 여과기 (strainer)를 통해 통과시켜 잔류하는 모든 비장 기관 기질을 제거하였다. 비장 세포를 RPMI 1640 내에서 2 회 세척하고, R10 배지 (RPMI 1640 + 10% FBS) 내에 재현탁시키고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다 (세포 생존도는 트립판 블루 염색을 사용하여 결정된다).
실시예 7: 기억 B 세포 ELISpot 검정
ELISpot 96-웰 플레이트 (Millipore)를 100 ㎕ (2 ㎍/㎖)의 정제된 단백질로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 각각의 코팅 항원에 대해서 별도의 플레이트를 사용하였다. 다음날, 플레이트를 세척하고, 1% BSA로 2 시간 동안 차단하였다. 면역된 마우스로부터의 250,000 개의 비장 세포를 각각의 웰에 첨가하고, RPMI 1640 (음성 대조군)의 존재 하에 5% CO₂ 중에서 37℃로 5-6 시간 동안 자극하였다. 배양 후에, 세포를 세척하고, 비오티닐화 항-마우스 항체 (R&D Systems)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 (R&D Systems)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염 및 니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드 (색원체 발색시약; R&D Systems)를 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 증류수로 세정하고, 실온에서 건조시켰다. 스포트를 자동화 ELISPOT 판독기 (Cellular Technology Limited)에 의해서 계수하였다. 결과는 항원 특이적 항체 분비 세포 (ASCs)의 수로 표현된다.
IL15 는 JEV 및 WNV 항원에 대한 기억 B-세포 활성화를 증진시켰다.
B 세포 ELISPOT 기술은 적절한 항원에 의한 자극에 따라 B-기억 세포의 항체 분비 형질세포로의 검정관내 분화를 유도함으로써 항원 특이적 기억 B 세포의 정량화를 허용한다. IL15 보조제에 의해서 유도된 면역반응의 품질을 더 평가하기 위해서, B-기억 반응을 마우스에서 평가하였다. 마우스 비장을 제조하여 "방법"에 기술된 바와 같이 DIII 단백질에 대해 지시된 항체를 생산할 수 있는 B 세포의 빈도를 측정하였다. 흥미롭게도, ELISpot 검정 결과는 상술한 DIII-항체 ELISA 데이터와 일치한다. DIII에 대해서 특이적인 마우스 항체 분비 세포의 더 높은 빈도는 DIII DNA 백신을 단독으로 투여한 그룹보다 IL15로 공동-자극된 마우스에서 관찰되었다 (도 6). 이 검정은 또한, 이 그룹이 최고 레벨의 항체 분비 세포를 나타냈음을 입증함으로써 IL15가 pWNV DIII 백신에 대한 항체 분비 세포 반응을 명백하게 증가시켰음을 시사하였다. 가장 중요하게는, WNV DIII + IL15 그룹으로부터의 B 세포는, 이 그룹의 동물의 혈청으로부터의 ELISA 데이터에 의해서 관찰되는 바와 같이, 3 개의 항원 모두에 결합할 수 있었다. 이 그룹 다음으로, JEV DIII + IL15는 JEV DIII를 단독으로 투여한 마우스보다 증진된 레벨의 B-세포 반응을 나타내었다. 키메릭 JE/WNV DIII 백신접종 마우스로부터의 ELISA 결과와 일치하여, 이 그룹의 마우스로부터의 B 세포는 JEV 또는 WNV DIII-백신접종 마우스에 대해서뿐만 아니라 키메릭 항원 그 자체를 투여한 그룹에 대해서도 결합하지 못하였다. 종합적으로, ELISpot 결과는 ELISA 검정에 의해서 결정된 바와 같이, DIII 특이적 항체의 역가에 상응하는 고-친화성 항원 특이적 B 세포의 활성화를 나타내었다.
본 발명자들의 검정으로부터의 결과는 DIII 단백질 샘플이 더 우수한 백신 후보물질이 아닐 수 있다는 이 가능성과 일치한다. 한가지 가능한 해석은 정확하게 접힌 가용화 단백질의 백분율이 낮을 수 있고, 상이한 연구자들에 의해서 수행된 정제과정이 또한 rDIII의 면역원성에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. IL15 지지가 없이, 본 발명자들은 모노머성 DIII 발현 구성체의 사용으로부터 만족스러운 항체 반응을 얻을 수 없었다. 이 검정에서, 본 발명자들은 동물당 단지 20 ㎍ DNA를 사용함으로써 B-세포 증식뿐만 아니라 항체 생산의 증진된 레벨을 나타내었다. 따라서, IL15 플라스미드와 조합한 DNA 백신은 JEV 및 WNV에 대한 면역화를 위한 더 우수하고, 비용 효과가 큰 대안을 나타낼 수 있다.
총체적으로, 본 검정에서 수득된 결과는 DIII가 우수한 보조제와 함께 WNV 및 JEV에 대한 방어적 면역성의 유도를 위해서 사용될 수 있는 잘 정의된 유망한 백신 후보물질임을 나타낸다. IL15의 공동자극에 기인한 항체 생산 세포의 레벨의 4 내지 5-배 증가는, IL15가 WNV뿐만 아니라 JEV에 대한 항체 생산 기억 B 세포를 증진시킴으로써 중화 항체의 생산을 유도할 수 있다는 직접적인 증가를 제공하였다. 본 발명자들이 키메릭 DIII 단백질을 제조하는데 관해 설명한 이론적 설명에 반하여, 생성된 키메릭 단백질은 실패한 항체 반응 및 최소 수의 항체-생산 기억 B 세포로부터 알 수 있는 바와 같이, 더 우수한 항원으로서 작용하지 않았다. 한가지 가능한 이유는, WNV DIII으로부터의 에피토프의 JEV DIII 내로의 도입은 면역반응을 유발하는데 적절한 제시를 위해서 필요한 배좌 상태에 영향을 미칠 수 있었다는 것일 수 있다. 그런 이유로 이 키메릭 단백질은 천연 JEV 및 WNV DIIIs와 같은 그의 전구체 분자에 비해 면역반응을 유도하는데 있어서 기대 이하로 작용하였다. IL-15는 현재까지의 모든 인간 검정에서 전신적으로 사용되지 않았다. 최근에, IL-15는 활액 염증, 류마티스 관절염, 자가면역 갑상선염 및 자가면역 당뇨병의 매개물질로서 연루되었음에 특히 주의하여야 한다. Mclnnes 등뿐만 아니라 다른 실험실도 류마티스 관절염성 관절의 활액에서 IL-15의 높은 농도를 보고하였으며, IL-15가 활막 라이닝의 세포에 의해서 발현된다는 것을 나타내었다. 현재까지, 자가면역 질환의 유도에 대한 IL-15의 인과관계를 직접적으로 상호 연관시키는 인간 검정은 없었다. 본 발명자들은 pIL-15-Opt의 주입이 마우스의 혈청에서 검출할 수 없는 레벨의 항-인간 IL-15 Ab를 제공하는 것으로 결정하였으며, 본 발명자들은 백신접종 마우스의 혈청에서 인간 IL-15를 검출할 수 없고 (공개되지 않은 소견), 이것은 pIL-15-Opt에 의한 백신접종 후에 생산된 IL-15의 레벨이 매우 낮지만, 이 검정에서 관찰된 DIII 특이적 면역반응을 증진시키는 데는 국소적으로 충분함을 시사한다.
이 보고는 최적화된 사이토킨 플라스미드-전달된 IL-15가 중화 항체반응을 유도하는데 있어서의 그의 역할이 공지된 플라비바이러스 DIII에 대해서 특이적인 기억 B 세포를 증진시킬 수 있는 방법을 입증한다.
참고문헌
[1] Solomon T. Exotic and emerging viral encephalitides. Curr Opin Neurol 2003;16(3):411-8.
[2] Solomon T. Recent advances in Japanese encephalitis. J Neurovirol 2003;9(2):274-83.
[3] Harrington T, Kuehnert MJ, Kamel H, Lanciotti RS, Hand S, Currier M, et al. West Nile virus infection transmitted by blood transfusion. Transfusion 2003 Aug;43(8): 1018-22.
[4] Armstrong WS, Bashour CA, Smedira NG, Heupler FA, Hoeltge GA, Mawhorter SD, et al. A case of fatal West Nile virus meningoencephalitis associated with receipt of blood transfusions after open heart surgery. The Annals of thoracic surgery 2003 Aug;76(2):605-7.
[5] Shepherd JC, Subramanian A, Montgomery RA, Samaniego MD, Gong G, Bergmann A, et al. West Nile virus encephalitis in a kidney transplant recipient. Am J Transplant 2004 May;4(5):830-3.
[6] Pealer LN, Marfin AA, Petersen LR, Lanciotti RS, Page PL, Stramer SL, et al. Transmission of West Nile virus through blood transfusion in the United States in 2002. The New England journal of medicine 2003 Sep 25;349(13): 1236-45.
[7] Kumar R, Tripathi P, Singh S, Bannerji G. Clinical features in children hospitalized during the 2005 epidemic of Japanese encephalitis in Uttar Pradesh, India. Clin Infect Dis 2006 JuI 15;43(2): 123-31.
[8] Murgod UA, Muthane UB, Ravi V, Radhesh S, Desai A. Persistent movement disorders following Japanese encephalitis. Neurology 2001 Dec 26;57(12):2313-5.
[9] Schioler KL, Samuel M, Wai KL. Vaccines for preventing Japanese encephalitis. Cochrane database of systematic reviews (Online) 2007(3):CD004263.
[10] Appaiahgari MB, Saini M, Rauthan M, Jyoti, Vrati S. Immunization with recombinant adenovirus synthesizing the secretory form of Japanese encephalitis virus envelope protein protects adenovirus-exposed mice against lethal encephalitis. Microbes and infection/Institut Pasteur 2006 Jan;8(l):92-104.
[11] Bharati K, Vrati S. Japanese encephalitis: development of new candidate vaccines. Expert review of anti-infective therapy 2006 Apr;4(2):313-24.
[12] Hoke CH, Nisalak A, Sangawhipa N, Jatanasen S, Laorakapongse T, Innis BL, et al. Protection against Japanese encephalitis by inactivated vaccines. The New England journal of medicine 1988 Sep 8;319(10):608-14.
[13] Takahashi H, Pool V, Tsai TF, Chen RT. Adverse events after Japanese encephalitis vaccination: review of post-marketing surveillance data from Japan and the United States. The VAERS Working Group. Vaccine 2000 JuI l;18(26):2963-9.
[14] Diagana M, Preux PM, Dumas M. Japanese encephalitis revisited. Journal of the neurological sciences 2007 Nov 15;262(l-2):165-70.
[15] Heinz FX, Mandl CW, Holzmann H, Kunz C, Harris BA, Rey F, et al. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization. Journal of virology 1991 Oct;65(10):5579-83.
[16] Nybakken GE, Oliphant T, Johnson S, Burke S, Diamond MS, Fremont DH. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody. Nature 2005 Sep 29;437(7059):764-9.
[17] Oliphant T, Engle M, Nybakken GE, Doane C, Johnson S, Huang L, et al. Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus. Nature medicine 2005 May;11(5):522-30.
[18] Martina BE, Koraka P, van den Doel P, Rimmelzwaan GF, Haagmans BL, Osterhaus AD. DC-SIGN enhances infection of cells with glycosylated West Nile virus in vitro and virus replication in human dendritic cells induces production of IFN-alpha and TNF-alpha. Virus research 2008 Apr 9.
[19] Martina BE, Koraka P, van den Doel P, van Amerongen G, Rimmelzwaan GF, Osterhaus AD. Immunization with West Nile virus envelope domain III protects mice against lethal infection with homologous and heterologous virus. Vaccine 2008 Jan 10;26(2):153-7.
[20] Chu JH, Chiang CC, Ng ML. Immunization of flavivirus West Nile recombinant envelope domain III protein induced specific immune response and protection against West Nile virus infection. J Immunol 2007 Mar l;178(5):2699-705.
[21] Mota J, Acosta M, Argotte R, Figueroa R, Mendez A, Ramos C. Induction of protective antibodies against dengue virus by tetravalent DNA immunization of mice with domain III of the envelope protein. Vaccine 2005;23(26):3469-76.
[22] Yan J, Yoon H, Kumar S, Ramanathan MP, Corbitt N, Kutzler M, et al. Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther 2007 Feb;15(2):411-21.
[23] Laddy DJ, Yan J, Corbitt N, Kobasa D, Kobinger GP, Weiner DB. Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine 2007 Apr 20;25(16):2984-9.
[24] Weiner DB, Kennedy RC. Genetic vaccines. Scientific American 1999;281(l):50-7.
[25] Schoenly KA, Weiner DB. Human immunodeficiency virus type 1 vaccine development: recent advances in the cytotoxic T-lymphocyte platform "spotty business". Journal of virology 2008 Apr;82(7):3166-80.
[26] Boyer JD, Robinson TM, Kutzler MA, Vansant G, Hokey DA, Kumar S, et al. Protection against simian/human immunodeficiency virus (SHIV) 89.6P in macaques after coimmunization with SHIV antigen and IL-15 plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007 Nov 20;104(47):18648-53.
[27] Draghia-Akli R, Khan AS, Brown PA, Pope MA, Wu L, Hirao L, et al. Parameters for DNA vaccination using adaptive constant-current electroporation in mouse and pig models. Vaccine 2008 Apr 15.
[28] Nishimura H, Fujimoto A, Tamura N, Yajima T, Wajjwalku W, Yoshikai Y. A novel autoregulatory mechanism for transcriptional activation of the IL-15 gene by a nonsecretable isoform of IL-15 generated by alternative splicing. Faseb J 2005 Jan;19(l):19-28.
[29] Yajima T, Nishimura H, Sad S, Shen H, Kuwano H, Yoshikai Y. A novel role of IL-15 in early activation of memory CD8+ CTL after reinfection. J Immunol 2005 Mar 15;174(6):3590-7.
[30] Ugen KE, Kutzler MA, Marrero B, Westover J, Coppola D, Weiner DB, et al. Regression of subcutaneous B16 melanoma tumors after intratumoral delivery of an IL-15-expressing plasmid followed by in vivo electroporation. Cancer gene therapy 2006 Oct;13(10):969-74.
[31] Kutzler MA, Robinson TM, Chattergoon MA, Choo DK, Choo AY, Choe PY, et al. Coimmunization with an optimized IL-15 plasmid results in enhanced function and longevity of CD8 T cells that are partially independent of CD4 T cell help. J Immunol 2005 JuI 1;175(1):112-23.
[32] Schluns KS, Lefrancois L. Cytokine control of memory T-cell development and survival. Nature reviews 2003 Apr;3(4):269-79.
[33] Oya A, Kurane I. Japanese encephalitis for a reference to international travelers. J Travel Med 2007 Jul-Aug;14(4):259-68.
[34] Hemmerter S, Slapeta J, van den Hurk AF, Cooper RD, Whelan PI, Russell RC, et al. A curious coincidence: mosquito biodiversity and the limits of the Japanese encephalitis virus in Australasia. BMC evolutionary biology 2007;7:100.
[35] Solomon T, Dung NM, Wills B, Kneen R, Gainsborough M, Diet TV, et al. Interferon alfa-2a in Japanese encephalitis: a randomised double-blind placebo-controlled trial. Lancet 2003 Mar 8;361(9360):821-6.
[36] Solomon T, Ni H, Beasley DW, Ekkelenkamp M, Cardosa MJ, Barrett AD. Origin and evolution of Japanese encephalitis virus in southeast Asia. Journal of virology 2003 Mar;77(5):3091-8.
[37] Tsarev SA, Sanders ML, Vaughn DW, Innis BL. Phylogenetic analysis suggests only one serotype of Japanese encephalitis virus. Vaccine 2000 May 26;18 Suppl 2:36-43.

SEQUENCE LISTING <110> VGX Pharmaceuticals, LLC <120> ANTIGENS THAT ELICIT IMMUNE RESPONSE AGAINST FLAVIVIRUS AND METHODS OF USING SAME <130> VGX0107 WO <150> US61/115,535 <151> 2008-11-17 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JEV DIII consensus sequence <400> 1 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe 20 25 30 Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile 35 40 45 Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val 50 55 60 Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr 65 70 75 80 Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val 85 90 95 Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly 100 105 110 Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly 115 120 125 Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 130 135 <210> 2 <211> 139 <212> PRT 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Leu Val Glu 65 70 75 80 Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp 85 90 95 Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys 100 105 110 Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 115 120 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WNV DIII consensus sequence <400> 10 Met Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys 1 5 10 15 Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu 20 25 30 Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser 35 40 45 Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val 50 55 60 Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu 65 70 75 80 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu 85 90 95 Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys 100 105 110 Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 115 120 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JW DIII consensus sequence <400> 11 Met Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Ser Lys Phe Ser 1 5 10 15 Lys Ala Lys Asn Pro Pro Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu 20 25 30 Leu Ser Tyr Ser Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser 35 40 45 Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val 50 55 60 Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu 65 70 75 80 Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp 85 90 95 Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys 100 105 110 Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 115 120 <210> 12 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEV DIII DNA <400> 12 atggccctga agggcaccac ctacggcatg tgcaccgaga agttcagctt cgccaagaac 60 cccgccgaca ccggccacgg caccgtggtg atcgagctgt cctacagcgg cagcgacggc 120 ccctgcaaga tccccatcgt gagcgtggcc agcctgaacg acatgacccc cgtgggccgg 180 ctggtgaccg tgaacccctt cgtggccacc tccagcgcca acagcaaggt gctggtcgag 240 atggaacccc ccttcggcga cagctacatc gtggtgggca ggggcgacaa gcagatcaac 300 caccactggc acaaggccgg cagcaccctg ggcaaggcct tcagcaccac actgaagggc 360 gcccagtgat ga 372 <210> 13 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WNV DIII DNA <400> 13 atgctccagc tgaagggcac cacctacggc gtgtgcagca aggccttcaa gttcctgggc 60 acccctgccg ataccggcca cggcaccgtg gtgctggaac tccagtacac cggcaccgac 120 ggcccctgca aggtgcccat cagcagcgtg gccagcctga acgacctgac ccccgtgggc 180 cggctggtga ccgtgaaccc cttcgtgagc gtggccaccg ccaacgccaa ggtgctgatc 240 gagctggaac cccccttcgg cgacagctac atcgtggtgg gcaggggcga gcagcagatc 300 aaccaccact ggcacaagag cggcagcagc atcggcaagg cctttaccac caccctgaag 360 ggcgcctgat ga 372 <210> 14 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JW DIII DNA <400> 14 atggccctga agggcaccac ctacggcatg tgcaccagca agttcagcaa ggccaagaac 60 ccccccgaca ccggccacgg caccgtggtg atcgagctgt cctacagcac cagcaccggc 120 ccctgcaaga tccccatcgt gagcgtggcc agcctgaacg acatgacccc cgtgggccgg 180 ctggtgaccg tgaacccctt cgtggccacc tccagcgcca acagcaaggt gctggtcgag 240 atggaacccc ccttcggcga cagctacatc gtggtgggca ggggcgacaa gcagatcaac 300 caccactggc acaaggccgg cagcaccctg ggcaaggcct tcagcaccac actgaagggc 360 gcccagtgat ga 372 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 15 ggtaccgcca cc 12

Claims

(a) SEQ ID NOS: 12, 13, 또는 14;
(b) SEQ ID NOS: 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 코드화한 뉴클레오타이드 서열; 또는
(c) (a) 또는 (b)의 보체를 포함하는,
단백질 E의 공통 DIII 도메인을 코드화한 분리된 핵산.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 또는 SEQ ID NO: 14인 분리된 핵산 서열.
청구항 1의 분리된 핵산 서열을 포함하는 유전적 구성체.
청구항 3에 있어서, 코작 서열 SEQ ID NO: 15를 추가로 포함하는 유전적 구성체.
청구항 3 또는 4에 있어서, IgG 또는 IgE의 일부분으로부터 선택된 리더 서열을 추가로 포함하는 유전적 구성체.
청구항 5에 있어서, 상기 리더 서열이 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열을 포함하는 유전적 구성체.
(a) SEQ ID NOS: 9, 10 또는 11; 또는
(b) (a)의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
청구항 7에 있어서, IgG 및 IgE의 일부분으로부터 선택된 N-말단 리더 아미노산 서열을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
청구항 8에 있어서, 상기 N-말단 리더 아미노산 서열이 서열 SEQ ID NO: 7을 포함하는 폴리펩타이드.
(a) 청구항 1의 핵산을 포함하는 코드화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 유전적 구성체; 및
(b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하며,
여기서, 상기 유전적 구성체는 면역반응을 유발하는데 효과적인 양으로 숙주의 세포 내에서 단백질 E 항원의 공통 DIII 도메인을 발현할 수 있는,
숙주에서 다수의 WNV 및 JEV 혈정형에 대한 면역반응을 생성시킬 수 있는 DNA 백신.
청구항 10에 있어서, 상기 유전적 구성체가 코드화 서열의 3' 말단 이후에 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하는 백신.
청구항 10에 있어서, 상기 유전적 구성체가 코돈 최적화된 백신.
청구항 10에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제가 보조제인 백신.
청구항 13에 있어서, 상기 보조제가 IL-2, IL-15, IL-28 및 RANTES로 구성된 그룹으로부터 선택되는 백신.
청구항 14에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제가 형질감염 촉진제인 백신.
(a) 청구항 10의 백신을 숙주의 조직에 전달하는 단계; 및
(b) 세포 내로 백신의 유전적 구성체의 유입을 허용하는데 효과적인 에너지의 펄스를 전달하는 전기천공 장치를 사용하여 조직의 세포를 전기천공시키는 단계를 포함하는,
숙주 내에서 다수의 플라비바이러스 바이러스 혈청형에 대한 면역반응을 유발시키는 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 단계 (a)가 백신을 피내, 피하 또는 근육 조직 내로 주입하는 것을 포함하는 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 전류가 미리 설정된 전류와 동등한 정전류에서 에너지의 펄스를 조직에 전달하기 위해 미리 설정되는 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 전기천공 단계가,
(a) 전기천공된 세포에서 임피던스를 측정하는 단계;
(b) 측정된 임피던스에 관하여 에너지의 펄스의 에너지 레벨을 조정하여 전기천공된 세포 내에서 정전류를 유지시키는 단계를 추가로 포함하며,
여기서 상기 측정 및 조정 단계는 에너지의 펄스의 수명 내에서 일어나는 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 전기천공 단계가 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달하는 펄스 시퀀스 패턴에 따라 에너지의 펄스를 다수의 전극에 전달하는 것을 포함하는 방법.