KR20190116251A - 마르부르그바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 작제물 및 백신, 그리고 이를 사용하는 방법 - Google Patents

마르부르그바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 작제물 및 백신, 그리고 이를 사용하는 방법

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KR20190116251A
KR20190116251A KR1020197018764A KR20197018764A KR20190116251A KR 20190116251 A KR20190116251 A KR 20190116251A KR 1020197018764 A KR1020197018764 A KR 1020197018764A KR 20197018764 A KR20197018764 A KR 20197018764A KR 20190116251 A KR20190116251 A KR 20190116251A
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데이비드 비. 웨이너
사라 엘리엇
아미 파텔
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지
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Abstract

공통 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 면역원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 조성물. 면역조절 방법 및 마르부르그바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 개시되어 있다. 마르부르그바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법 및 마르부르그바이러스에 의해 감염된 개체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 공통 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 면역원이 개시되어 있다.

Description

마르부르그바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 작제물 및 백신, 그리고 이를 사용하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/429,473호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 면역 반응을 유도하기 위한 그리고 마르부르그바이러스(Marburgvirus) 감염을 예방하고/하거나 마르부르그바이러스에 의해 감염된 개체를 치료하기 위한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 공통 마르부르그바이러스 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
필로비리다에(Filoviridae)는 마르부르그바이러스(Marburgvirus: MARV) 및 에볼라바이러스(Ebolavirus: EBOV)인 2개의 다양한 속을 함유하는 비절편화, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 각각으로부터의 구성원은 치유 또는 허가 받은 백신이 없는 중증의 매우 치사인 출혈성 열 질환을 야기할 수 있다(Bradfute S.B., et al. (2011) Filovirus vaccines. Hum Vaccin 7: 701-711; Falzarano D., et al. (2011) Progress in filovirus vaccine development: evaluating the potential for clinical use. Expert Rev Vaccines 10: 63-77; 및 Towner J.S., et al. (2006) Marburgvirus genomics and association with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola. J Virol 80: 6497-6516).
출혈성 열 질환은 캐리어 상태가 없는 급성 감염이지만, 이것은 오염된 체액, 혈액 및 조직과의 직접 접촉에 의해 인간 및 비인간 영장류 중에 쉽게 전파 가능하다(Feldmann H., et al. (2003) Ebola virus: from discovery to vaccine. Nat Rev Immunol 3: 677-685). 발병 상황 동안, 의학 설비의 재사용, 제한된 자원을 갖는 건강 관리 시설 및 궁극적으로 예방 조치의 적용은 질환의 전파를 확대시켜서, 의학 환경에서 감염의 증폭을 허용한다.
이 인수감염 병원균의 천연 저장소가 아마도 아프리카 박쥐 및 돼지이므로(Kobinger G.P., et al. (2011) Replication, pathogenicity, shedding, and transmission of Zaire ebolavirus in pigs. J Infect Dis 204: 200-208)(후자는 가능하게는 숙주를 더 증폭시킴), 바이러스가 발병의 출발 시 처음에 나타나는 방식은 감염된 동물과의 인간 접촉을 통해 생기는 것으로 생각된다. 이 질환의 필리핀, 가능하게는 유럽, 및 주로 아프리카에서의 예측 불가능한 풍토성 부상은 추가로 주요 공공 건강 관심을 구성한다(Outbreak news. (2009) Ebola Reston in pigs and humans, Philippines. Wkly Epidemiol Rec 84: 49-50).
백신 유도된 적응성 면역 반응은 다수의 전임상 동물 모델에서 기재되어 있다(Blaney JE, et al. (2011). Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses. Nat Med 11: 786-790; Kalina WV, Warfield KL, Olinger GG, Bavari S (2009). Discovery of common marburgvirus protective epitopes in a BALB/c mouse model. Virol J 6: 132; Grant-Klein RJ et al. (2012) A multiagent filovirus DNA vaccine delivered by intramuscular electroporation protects mice from ebola and Marburg virus challenge. Hum Vaccin Immunother 8.; 1703-6; Geisbert TW et al. (2010) Vector choice determines immunogenicity and potency of genetic vaccines against Angola Marburg virus in nonhuman primates. J Virol 84: 10386-10394). 바이러스 백신은 유망한 것으로 밝혀졌고, 주로 재조합 아데노바이러스 및 수포성 구내염 바이러스를 포함한다. 비감염성 전략, 예컨대 재조합 DNA 및 항원 커플링된 바이러스 유사 입자(virus-like particle: VLP) 백신은 전임상 효율의 수준을 또한 입증하였고, 일반적으로 바이러스 기반 플랫폼보다 안전한 것으로 생각된다. (Warfield KL, Olinger GG (2011) Protective role of cytotoxic T lymphocytes in filovirus hemorrhagic fever. J Biomed Biotechnol 2011: 984241). T 세포는 또한 넉다운 마우스에서 수행된 연구, NHP에서의 결실 연구 및 적응성 전달된 CD8+ T 세포의 용해 작용과 효율이 크게 연관된 쥣과 적응성 전달 연구에 기초하여 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 보호성 백신에 의해 추진된 바와 같은 이 반응의 적은 상세한 분석이 보고되어 있다.
따라서, 당해 분야에서 마르부르그바이러스에 대한 보호 백신에 대한 수요가 존재한다. 본 발명은 이 충족되지 않은 수요를 충족시킨다.
합성 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 제공된다. 합성 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 단편, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열은 통상적으로 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 단편, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열의 단편은 통상적으로 600개 이상, 637개 이상 또는 670개 이상의 아미노산이다. 아미노산 서열은 임의로 리더 서열, 예를 들어 서열 번호 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IgE 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
마르부르그 마르부르그바이러스(Marburg marburgvirus) 제1 공통 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열, 마르부르그 마르부르그바이러스 제2 공통 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열 및 마르부르그 마르부르그바이러스 제3 공통 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 마르부르그 마르부르그바이러스 제1 공통 외피 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 2의 단편, 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열은 통상적으로 서열 번호 2과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호 2의 단편, 또는 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열의 단편은 통상적으로 600개 이상, 637개 이상 또는 670개 이상의 아미노산이다. 마르부르그 마르부르그바이러스 제2 공통 외피 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호 4, 서열 번호 4의 단편, 서열 번호 4와 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 4와 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호 4와 상동성인 아미노산 서열은 통상적으로 서열 번호 4와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호 4의 단편, 또는 서열 번호 4와 상동성인 아미노산 서열의 단편은 통상적으로 600개 이상, 637개 이상 또는 670개 이상의 아미노산이다. 마르부르그 마르부르그바이러스 제3 공통 외피 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 6의 단편, 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열은 통상적으로 서열 번호 6과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호 6의 단편, 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열의 단편은 통상적으로 600개 이상, 637개 이상 또는 670개 이상의 아미노산이다. 아미노산 서열은 임의로 리더 서열, 예를 들어 서열 번호 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IgE 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 단편, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열은 통상적으로 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 단편, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 상동성인 아미노산 서열의 단편은 통상적으로 600개 이상, 630개 이상 또는 660개 이상의 아미노산이다.
공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5, 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 단편, 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5와 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5와 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5와 상동성인 아미노산 서열은 통상적으로 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 단편, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5와 상동성인 아미노산 서열의 단편은 통상적으로 1800개 이상, 1890개 이상 또는 1980개 이상의 뉴클레오타이드이다.
각각의 상이한 핵산 서열은 단일 핵산 분자에 있을 수 있고, 각각 별개의 핵산 분자 또는 다양한 순열에 있을 수 있고. 핵산 분자는 플라스미드일 수 있다.
상기 조성물은 전기천공을 이용하여 개체에 대한 전달을 위해 제제화될 수 있다.
상기 조성물은 IL-12, IL-15 및 IL-28로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 마르부르그바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용될 수 있다.
치료적 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 마르부르그바이러스에 의해 진단된 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
개체에서 마르부르그바이러스 감염을 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 예방학적 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1a 내지 도 1b를 포함하는 도 1은 전기천공(electroporation: EP)에 의한 플라스미드 DNA 전달 후 유전자 발현을 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 도 1a는 실험 설계를 도시한다. GFP 플라스미드는 대상체에게 전달되고, 이후 GFP 발현에 대해 평가되었다. 도 1b는 GFP 발현의 영상을 도시한다. GFP 플라스미드는 EP 없는 IM 주사(상부 패널) 또는 EP에 의한 IM 주사(하부 패널)를 통해 토끼 근육에게 전달되었다. 근육은 수확되고 1㎜ 두께 절편으로 절편화되어 주변 광(근육 + GFP) 하에 또는 UV 램프(GFP) 하에 GFP 발현을 시각화하였다. GFP 발현은 DNA가 EP를 통해 전달될 때에만 관찰되어서, 표적 조직에 대한 유전자 전달에서의 100배 내지 1000배 증대를 나타낸다(Sardesai et al., Curr Opin Immunol, 2011 Jun; 23(3):421-9).
도 2는 합성 공통 마르부르그 당단백질의 설계를 위한 계통발생학적 나무를 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 고도로 다양한 RAVV 바이러스를 포함하는 MARV 바이러스 당단백질(GP)의 3개의 지리학적으로 구별되는 계통의 서열은 정렬되고 합성 GP Con1(서열 번호 1/서열 번호 2), Con2(서열 번호 3/서열 번호 4) 및 Con3(서열 번호 5/서열 번호 6) 항원을 설계하도록 사용되었다. 이들 항원 서열은 합성되고 포유류 발현 플라스미드로 클로닝되어서, 생체내 합성 공통 항원의 발현을 위해 플라스미드 DNA 작제물을 생성하였다.
도 3a 내지 도 3b를 포함하는 도 3은 MARV 당단백질 공통 작제물이 형질주입된 세포에서 발현된다는 것을 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 도 3a는 MARV GP 공통 DNA 작제물(Con1-Con3) 또는 빈 플라스미드(Ctrl)에 의해 형질주입된 293T 세포에서 MARV 당단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 도시힌다. 항-MARV-Angola-GP 항체는 GP 발현을 검출하도록 사용되었다. 웨스턴 블롯은 2개의 농도로 겔에 로딩된 정제된 재조합 Angola MARV GP(rGP)와 비교하여 감소된 세포 용해물을 보여준다. 도 3b는 빈 플라스미드에 의해 형질주입된 세포에 대한 발현(회색)에 대한 세포 표면에서의 MARV GP 공통 발현(검정)의 FACS 분석을 도시한다.
도 4a 내지 도 4b를 포함하는 도 4는 항-MARV GP 항체가 MARV 공통 GP 작제물에 의해 백신접종된 마우스의 혈청에서 생성된다는 것을 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 도 4a는 실험 설계를 도시한다. BALB/c 마우스는 40㎍의 플라스미드 DNA를 받은 후, 근육내 전기천공되었다. 2주 후, 혈청은 항체 분석에 수집되었다. 도 4b는 재조합 MARV GP Angola에 대한 마우스 IgG 결합이 ELISA에 의해 결정된다는 것을 보여주는 실험 데이터를 도시한다(N=5, 평균 ± SD). 도 4c는 MARV GP Con1에 의해 백신접종된 마우스로부터의 혈청이 작제물 Con1-Con3에 의해 형질주입된 293T 세포를 염색하도록 사용된다는 것을 도시한다. 결합은 FACS에 의해 분석되었다.
도 5a 내지 도 5e를 포함하는 도 5는 단일 백신접종이 T 세포 IFNγ 반응을 유도한다는 것을 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 도 5a는 백신접종 스케줄을 도시한다. 도 5b는 Angola MARV GP의 완전 서열을 나타내는 6개의 상이한 풀에서 중첩하는 선형 펩타이드에 의해 자극되는 마우스 비장세포를 도시한다. IFN 반응은 ELISPOT에 의해 측정되었다. (그룹마다 N = 5마리 동물, 동물마다 3회 반복, 평균 SD). 도 5c는 Angola MARV GP 펩타이드에 의해 자극되고 FACS 에 의해 분석된 비장세포를 도시한다(그룹마다 N = 5마리 동물, 평균 SD). 도 5d는 ELISA에 의해 측정된 바대로 백신접종 후 14일에 수집된 혈청에서 마우스 항-Angola-MARV GP IgG 항체 종점 결합 역가를 도시한다(그룹마다 N = 5마리 동물, 평균 SD). 도 5e는 각각의 공통 항원을 발현하는 293T 세포 용해물(Con1, Con2, Con3), 대조군 용해물(pVax), 또는 재조합 단백질 Angola MARV GP(N = 5마리 동물)에 대해 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바대로 백신접종 후 14일에 수집된 풀링된 혈청에서 마우스 항-MARV GP 항체를 도시한다. GP0는 전장 GP이고, GP2는 GP의 아단위 절단 형태를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6e를 포함하는 도 6은 부스팅된 백신접종 이후에 다양한 펩타이드 및 항원에 대한 T 세포 및 항체 반응의 폭을 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 도 6a는 백신접종 스케줄 및 실험에 사용된 샙플 수집을 도시한다. 도 6b는 Angola MARV GP의 완전 서열을 나타내는 6개의 상이한 풀에서 중첩하는 선형 펩타이드에 의해 자극되는 마우스 비장세포를 도시한다. IFN 반응은 ELISPOT에 의해 측정되었다. (그룹마다 N = 5마리 동물, 동물마다 3회 반복, 평균 SD). 도 6c는 Ravn MARV GP의 완전 서열을 나타내는 6개의 상이한 풀에서 중첩하는 선형 펩타이드에 의해 자극되는 마우스 비장세포를 도시한다. IFN 반응은 ELISPOT에 의해 측정되었다. (그룹마다 N = 5마리 동물, 동물마다 3회 반복, 평균 SD). 도 6d는 재조합 Angola GP 단백질에 대한 ELISA 결합에 의해 측정된 바와 같은 마우스 항-MARV GP IgG 항체 종점 역가를 도시한다(그룹마다 N = 5마리 동물). 도 6e는 Musoke MARV 바이러스-유사-입자에 대한 ELISA 결합에 의해 측정된 바와 같은 마우스 항-MARV GP IgG 항체 종점 역가를 도시한다(그룹마다 N = 5마리 동물).
도 7a 내지 도 7e를 포함하는 도 7은 조합된 공통 작제물의 부스팅된 백신접종 이후에 다양한 펩타이드 및 항원에 대한 T 세포 및 항체 반응의 폭을 나타내는 예시적인 실험 데이터를 제공한다. 도 7a는 백신접종 스케줄 및 동일한 주사 부위 또는 별개의 주사 부위에 대한 플라스미드의 동시전달에 의해 용량 1(D1) 및 용량 2(D2) 이후에 샘플 수집을 도시한다. 도 7b 및 도 7c는 Angola MARV GP 또는 Ravn MARV GP의 완전 서열을 나타내는 6개의 상이한 풀에서 중첩하는 선형 펩타이드에 의해 자극되는 마우스 비장세포를 도시한다. IFN 반응은 ELISPOT에 의해 측정되었다. (그룹마다 N = 5마리 동물, 동물마다 3회 반복, 평균 SD). 도 7d는 재조합 Angola GP 단백질에 대한 ELISA 결합에 의해 측정된 바와 같은 마우스 항-MARV GP IgG 항체 종점 역가를 도시한다(그룹마다 N = 5마리 동물). 도 7e는 Musoke MARV 바이러스-유사-입자에 대한 ELISA 결합에 의해 측정된 바와 같은 마우스 항-MARV GP IgG 항체 종점 역가를 도시한다(그룹마다 N = 5마리 동물).
마르부르그 바이러스(MARV)는 또한 90% 이상 치사일 수 있다. 현재, 이것이 Ravn 바이러스(RAVV)를 포함하는 2개의 바이러스를 함유한다는 최근의 수정 목적에도 불구하고 마르부르그 마르부르그바이러스(이전에 레이크 빅토리아(Lake Victoria) 마르부르그바이러스)인 오직 하나의 분류된 종이 있다.
마르부르그 마르부르그바이러스(MARV)에 대한 합성 DNA 백신이 개발되었다. 신규한 백신은 마르부르그 마르부르그바이러스(MARV)의 합성 공통 외피 당단백질(GP)을 코딩하는 DNA 플라스미드를 포함한다. 백신 후보로서, 증대된 DNA(DNA) 바이어싱된 플랫폼은 유전자 최적화 및 전달 기법에서의 최근의 진보를 고려하여 많은 이점을 나타낸다(Bagarazzi ML, et al. (2012). Immunotherapy Against HPV16/18 Generates Potent TH1 and Cytotoxic Cellular Immune Responses. Sci Transl Med 4 : 155ral38; Kee ST, Gehl J, W. LE (2011). Clinical Aspects of Electroporation, Springer, New York, NY.; Hirao LA, et al. (2011). Multivalent smallpox DNA vaccine delivered by intradermal electroporation drives protective immunity in nonhuman primates against lethal monkeypox challenge. J Infect Dis 203: 95-102). 그러므로, 각각의 GP는 유전자 최적화되고, 변형된 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되고, 이후 생체내 전기천공(EP)을 이용하여 전달되었다.
전임상 연구는 설치류-적응된 바이러스를 사용하여 마우스에서 수행되었다. 마우스에 대한 공통 마르부르그 당단백질 작제물의 단일 전달이 항-MARV 항체 및 튼튼한 IFNγ T 세포 반응을 생성하므로, 전임상 설치류 연구에서의 백신접종은 가장 강력하였다.
가장 높은 인간 사례-치명률에 책임 있는 바이러스에 대한 보호를 제공하는 전략을 개발하는 데에서, 이 연구는 MARV에 초점을 두었다.
몇몇 실시형태에서, 전략은 MARV로부터 생성된 합성 공통 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 이용한다. 3개의 MARV 면역원이 제공된다. Angola, D.R. Congo 또는 Ravn인 3개의 계통군으로부터 유래된 공통 당단백질이 설계되었다.
몇몇 실시형태에서, 전략은 MARV로부터 생성된 단일 합성 공통 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 이용한다. 몇몇 실시형태에서, 전략은 MARV로부터 생성된 다수의 합성 공통 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 이용한다.
백신에 대한 후보로서, DNA 백신은 신속하고 저렴한 업-스케일 제조, 실온에서의 안정성 및 수송 용이성(이들 모두 경제적 및 지리학적 관점으로부터 이 플랫폼을 추가로 증대시킴)을 포함하는 다수의 이점을 나타낸다. 플라스미드의 합성 성질로 인해, 항원 서열은 새로 생긴 종에 반응하여 빠르고 쉽게 변형되고/되거나, 아웃브레이크 환경 동안 신속한 반응을 위해 추가적 백신 성분 및/또는 섭생을 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 MARV 전략은 다른 계통발생 클러스터에 대해 공통 MARV GP(MGP) 면역원을 코딩하는 추가적 플라스미드의 동시투여에 의해 더 큰 커버리지를 위해 쉽게 확장될 수 있다.
'제1 세대' DNA 백신이 불량하게 면역원성인 한편, 최근의 기술적 진보는 임상 실험에서 이의 면역원성을 극적으로 개선하였다. 플라스미드 DNA 벡터 및 이의 코딩된 항원 유전자의 최적화는 생체내 면역원성을 증가시켰다. 세포 흡수 및 후속하는 항원 발현은 고도로 농축된 플라스미드 백신 제제가 일시적으로 투과성인 세포로 플라스미드를 추진시키는 백신접종 자리 내에 짧은 구형파 전기 펄스를 이용하는 기술인 생체내 전기천공에 의해 투여될 때 실질적으로 증폭된다. 이론상, DNA 플라스미드의 칵테일은 임의의 수의 가변 항원에 대한 고도로 특수화된 면역 반응을 지시하기 위해 조립될 수 있다. 면역력은 종 특이적 사이토카인 유전자를 코딩하는 플라스미드 분자 애주번트에 의한 동시전달, 및 특정한 균주를 향한 백신 유도된 면역을 바이어싱시키는 것을 돕도록 항원 아미노산 서열의 '공통 조작화'에 의해 추가로 지시될 수 있다. 이 전략은 인플루엔자 바이러스 및 HIV의 다양한 균주 중에 보호를 증대시키는 것으로 밝혀졌다. 부분적으로 이의 기술적 진보로 인해, 이 DNA 백신을 포함하는 면역화 섭생은 매우 다양하고 극도로 맞춤 가능하다.
1. 정의.
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충의 경우에, 정의를 포함하는 본 문헌이 지배할 것이다. 바람직한 방법 및 재료는 하기 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 출원 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서에 개시된 재료, 방법 및 예는 오직 예시적이고, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "포함한다", "수반한다", "갖는", "갖는다", "할 수 있다", "함유한다" 및 이의 변형어는 추가적인 작용 또는 구조의 가능성을 못하게 하지 않는 개방 말단 이행 구절, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태 "일", "및" 및 "이"는, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 명확히 기재되든 또는 아니든, 본 명세서에 제시된 실시형태 또는 부재를 "포함하는", "이것으로 이루어진" 및 "본질적으로 이것으로 이루어진" 다른 실시형태를 고려한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "애주번트"는 이하 기재된 코딩 핵산 서열 및 DNA 플라스미드에 의해 코딩된 하나 이상의 공통 필로바이러스 면역원의 항원성을 증대시키도록 본 명세서에 기재된 DNA 플라스미드 백신에 첨가된 임의의 분자를 의미할 수 있다.
"항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단쇄 항체, 다이아바디, 이중특이적 항체, 이작용성 항체 및 이들의 유도체를 포함하는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체, 또는 단편, 이의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유류의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다중클론 항체, 친화도 정제된 항체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환되어 사용되는 바와 같은, "항체 단편" 또는 "항체의 단편"은 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 부분을 의미한다. 그 부분은 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 아이소타입에 따라 CH2, CH3 또는 CH4)을 포함하지 않는다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 다이아바디, 단일-사슬 Fv (scFv) 분자, 오직 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일-사슬 폴리펩타이드, 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 단일-사슬 폴리펩타이드, 오직 1개의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단일-사슬 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 함유하는 단일-사슬 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"항원"은 숙주에서 면역 반응을 생성하는 능력을 갖는 단백질을 의미한다. 항원은 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있다. 항원은 신체 내로부터 또는 외부 환경으로부터 기원할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "코딩 서열" 또는 "암호화 핵산"은 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미할 수 있다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 촉진자 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 유전요소에 작동 가능하게 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 코딩 서열은 N 말단 메티오닌을 코딩하는 시작 코돈 또는 신호 펩타이드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 임의로 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "보체" 또는 "상보성"은 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이의 왓슨-클릭(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 의미할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "공통" 또는 "공통 서열"은, 특정한 필로바이러스 항원의 복수의 아형 또는 혈청형에 대하여 광범위한 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있는, 특정한 필로바이러스 항원의 다수의 아형의 정렬의 분석에 기초하여 작제된, 합성 핵산 서열, 또는 상응하는 폴리펩타이드 서열을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "정전류"는 조직 또는 상기 조직을 정의하는 세포가 동일한 조직에 전달되는 전기 펄스의 기간에 걸쳐 수신하거나 경험하는 전류를 정의하기 위한 것이다. 전기 펄스는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 이 전류는 본 명세서에서 제공된 전기천공 장치가 피드백 요소, 바람직하게는 즉각적인 피드백을 가지므로, 전기 펄스의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 일정한 암페어 수로 유지된다. 피드백 요소는 펄스의 기간에 걸쳐 조직(또는 세포)의 저항을 측정하고, 전기천공 장치가 그 전기 에너지 출력을 변경하도록(예컨대, 전압을 증가하도록) 할 수 있어서, 동일한 조직에서의 전류가 (마이크로초 수준에서) 전기 펄스에 걸쳐 그리고 펄스마다 일정하게 있게 한다. 몇몇 실시형태에서, 피드백 요소는 컨트롤러를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "전류 피드백" 또는 "피드백"은 상호 교환되어 이용될 수 있고, 제공된 전기천공 장치의 능동 반응을 의미할 수 있으며, 이는 전극 사이에 조직에서 전류를 측정하는 단계 및 전류를 일정한 수준에서 유지하기 위해 이에 따라 EP 장치에 의해 전달되는 에너지 출력을 변경하는 단계를 포함한다. 이 일정한 수준은 펄스 순서 또는 전기 처리의 개시 전에 사용자에 의해 사전 설정된다. 내부에서 전기 회로가 전극 사이에 조직 내에 전류를 연속적으로 모니터링하고 이 모니터링된 전류(또는 조직 내의 전류)를 사전 설정된 전류와 비교하여 모니터링된 전류를 사전 설정된 수준으로 유지하기 위해 연속적으로 에너지-출력 조정을 수행할 수 있으므로, 피드백은 전기천공 장치의 전기천공 성분, 예를 들어 컨트롤러에 의해 달성될 수 있다. 피드백 루프는 이것이 아날로그 폐쇄 루프 피드백이므로 즉각적일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "분산된 전류"는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달되는 전기 전류의 패턴을 의미할 수 있고, 이 패턴은 조직이 전기천공되는 임의의 영역에서 전기천공 관련된 열 스트레스의 발생을 최소화하거나 바람직하게 제거한다.
본 명세서에서 상호 교환되어 사용되는 "전기천공", "전기-투과화" 또는 "전기-역학 증강"("EP")은 생체막에서 미시적 경로(구멍)를 유도하기 위한 막관통 전기장 자극의 이용을 나타낼 수 있고; 이들의 존재는 생체분자, 예를 들어 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한쪽에서 다른 쪽으로 이동할 수 있게 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "내인성 항체"는 체액 면역 반응의 유도에 대해 항원의 유효량이 투여된 개체에서 생성된 항체를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "피드백 메커니즘"은 소프트웨어 또는 하드웨어(또는 펌웨어)에 의해 수행되는 공정을 나타낼 수 있고, 이 절차는 현재 값, 바람직하게는 전류로 원하는 조직의 임피던스를 (에너지의 펄스의 전달 전에, 동안에, 및/또는 후에) 수신하고 비교하며, 사전 설정된 값을 달성하기 위해 전달된 에너지 자극을 조정한다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄 루프 회로에 의해 수행될 수 있다.
"단편"은 전장 폴리펩타이드 서열 또는 핵산 서열의 백분율을 의미할 수 있다. 단편은 모 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 변이체의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본 명세서에 사용된 바와 같은 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 기재된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 기재된 백분율을 가진다는 것을 의미할 수 있다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 기재된 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 서열 둘 다에서 동일한 잔기가 생기는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 생성하고, 매칭된 위치의 수를 기재된 영역에서 위치의 전체 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성 백분율을 생성함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열이 상이한 길이이거나, 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고, 기재된 비교 영역이 오직 단일 서열을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교하는 경우, 타이민(T) 및 유라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "임피던스"는 피드백 메커니즘을 논의할 때 사용될 수 있고, 옴의 법칙에 따라 전류 값으로 전환되어 사전 설정된 전류와의 비교를 가능하게 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "면역 반응"은 제공된 DNA 플라스미드 백신을 통한 하나 이상의 필로바이러스 공통 항원의 도입에 반응한 숙주의 면역계, 예를 들어 포유류의 면역계의 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응의 형태, 또는 둘 다일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 도시는 또한 상보성 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체가 소정의 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수도 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA 또는 하이브리드일 수 있고, 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합 및 유라실, 아데닌, 타이민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 아이소사이토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 촉진자의 제어 하에 있다는 것을 의미할 수 있다. 촉진자는 이의 제어 하에 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 촉진자와 유전자 사이의 거리는 촉진자가 유래된 유전자에서 이것이 제어하는 유전자와 촉진자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상기 거리의 변동은 촉진자 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "펩타이드", "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성 또는 변형 또는 천연 및 합성의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "촉진자"는 세포 내에 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 증대시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미할 수 있다. 촉진자는 발현을 추가로 증대시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정한 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 촉진자는 또한 원위 인핸서 또는 억제 유전요소를 포함할 수 있고, 이는 전사의 개시 부위에서 수천 개 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있다. 촉진자는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원에서 유래될 수 있다. 촉진자는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대 생리적 스트레스, 병원균, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여 본질적으로 또는 차별적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 촉진자의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 촉진자, 박테리오파지 T3 촉진자, SP6 촉진자, lac 작동자-촉진자, tac 촉진자, SV40 후기 촉진자, SV40 조기 촉진자, RSV-LTR 촉진자, CMV IE 촉진자, SV40 조기 촉진자 또는 SV40 후기 촉진자 및 CMV IE 촉진자를 포함한다.
"신호 펩타이드" 및 "리더 서열"은 본 명세서에서 상호 교환되어 사용되고, 본 명세서에 기재된 단백질의 아미노 말단에서 연결될 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 통상적으로 단백질의 국재화를 지시한다. 본 명세서에 사용되는 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생성된 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 세포로부터의 분비 시 단백질의 나머지로부터 대개 절단되어, 대개 성숙 단백질이라 불린다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 N 말단에서 연결된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "엄격한 혼성화 조건"은 예컨대 핵산의 복합한 혼합물에서 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)에 혼성화하는 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 한정된 이온 농도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮게 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, Tm에서, 프로브의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(한정된 이온 농도, pH 및 핵산 농도 하에)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예컨대 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 초과 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 폼아마이드의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50% 폼아마이드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리하거나, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리하고, 65℃에서 0.2×SSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.
본 명세서에서 상호 교환되어 사용되는 "대상체" 및 "환자"는 임의의 척추동물, 예를 들어 포유류(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 고양이, 개, 래트 및 마우스, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 예컨대 사이아노몰거스 또는 레서스원숭이, 침팬지 등) 및 인간)(이들로 제한되지는 않음)를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "실질적으로 상보성"은 제1 서열이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역에 걸쳐 제2 서열의 보체에 대해서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 2개의 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 보체에 실질적으로 상보성인 경우, 제1 및 제2 서열이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역에 걸쳐, 또는 핵산에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 질환을 예방, 억제, 진압 또는 완전히 제거하는 수단을 통해 질환으로부터 대상체를 보호하는 것을 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 발병 전에 대상체에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다. 질환의 억제는 질환의 유도 후 그러나 이의 임상 출현 전에 대상체에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다. 질환의 진압은 질환의 임상 출현 후 대상체에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다.
핵산에 대해 본 명세서에서 사용된 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이의 보체, 또는 이것과 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산을 이용한 아미노산 대체는 당해 분야에서 전형적으로 작은 변화를 수반하는 것으로 인식된다. 이러한 작은 변화는, 부분적으로 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 아미노산의 수치 지수를 고려함으로써 확인될 수 있다[Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)]. 아미노산의 수치 지수는 그 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 일 양태에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성하는 치환을 밝히기 위해 이용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성 고려는 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 그 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다. 본 명세서에 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호. 당해 분야에서 이해되는 바와 같은, 유사한 친수화도 값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산에 의해 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수화도 값 둘 다는 그 아미노산의 특정한 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 아미노산의 상대 유사성, 특히 소수화도, 친수화도, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄에 따라 달라지는 것으로 이해된다.
변이체는 완전 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 대해 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈으로 통합하는 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 숫자 범위의 언급에 대해, 동일한 정확성 정도에 의해 이들 사이의 각각의 개재하는 숫자는 명확히 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 대해, 번호 7 및 8이 6 및 9 이외에 고려되고, 6.0 내지 7.0의 범위에 대해, 번호 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0은 명확히 고려된다.
2. 설명
본 발명은 마르부르그바이러스 항원을 코딩하는 최적화된 공통 서열을 제공한다. 일 실시형태에서, 최적화된 공통 서열에 의해 코딩된 마르부르그바이러스 항원은 포유류에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 일 실시형태에서, 최적화된 공통 서열에 의해 코딩된 마르부르그바이러스 항원은 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이게 만드는 에피토프(들)를 포함할 수 있다.
최적화된 공통 서열은 2개 이상의 마르부르그바이러스 단백질로부터 유래된 공통 서열일 수 있다. 최적화된 공통 서열은 개선된 발현을 위해 공통 서열 및/또는 변형(들)을 포함할 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역 개시를 위한 kozak 서열의 첨가, 및/또는 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 리더 서열의 첨가를 포함할 수 있다. 최적화된 공통 서열에 의해 코딩된 마르부르그바이러스 항원은 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 E(IgE) 또는 면역글로불린(IgG) 신호 펩타이드(이들로 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 최적화된 공통 서열에 의해 코딩된 항원은 혈구응집소(HA) 태그를 포함할 수 있다. 최적화된 공통 서열에 의해 코딩된 항원은 상응하는 비최적화된 항원보다 더 강한 세포 및/또는 체액 면역 반응을 유발하도록 설계될 수 있다.
마르부르그바이러스의 다수의 아형 또는 혈청형에 대해 광범위한 면역력을 유도하도록 사용될 수 있는 마르부르그바이러스 면역원이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 마르부르그바이러스에 대해 포유류에서 면역 반응을 생성할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 마르부르그바이러스에 대해 포유류에서 면역 반응을 생성할 수 있는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 공통 마르부르그바이러스 면역원을 코딩하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
마르부르그바이러스 면역원에 대한 공통 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 이들의 변이체 및 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6의 단편 및 이들의 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 제1 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원(서열 번호 1)을 코딩하는 핵산 서열, 제2 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열(서열 번호 3) 및 제3 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열(서열 번호 5)이 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원 Con1인 서열 번호 2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1이다.
일 실시형태에서, 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원 Con2인 서열 번호 4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3이다.
일 실시형태에서, 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원 Con3인 서열 번호 6을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5이다.
일 실시형태에서, 최적화된 공통 코딩된 마르부르그바이러스 항원은 하나 이상의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일 실시형태에서, 조절 요소는 리더 서열이다. 일 실시형태에서, 리더 서열은 IgE 리더 서열이다. 일 실시형태에서, IgE 리더 서열은 서열 번호 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 따라서 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 8을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 조절 요소는 개시 코돈이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 5' 말단에서 개시 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5에 기재된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 N 말단에서 개시 코돈(예를 들어, 메티오닌)에 의해 코딩된 아미노산에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 조절 요소는 적어도 하나의 중단 코돈이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 3' 말단에서 적어도 하나의 중단 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5에 기재된 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 동족체에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 번역 종결의 효율을 증가시키도록 2개의 중단 코돈에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5에 기재된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 DNA 서열로부터의 전사체인 RNA 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 서열은 전장 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩할 수 있다. 핵산 분자는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 임의로 신호 펩타이드, 예를 들어 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드 등을 코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다.
공통-마르부르그바이러스 항원은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 면역원성 단편은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 전장의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.
서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 면역원성 단편과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 95% 상동성인 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태는 본 명세서에서 공통 단백질 서열의 면역원성 단편과 96%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서에서 공통 단백질 서열의 면역원성 단편과 97%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서에서 공통 단백질 서열의 면역원성 단편과 98%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는 본 명세서에서 공통 단백질 서열의 면역원성 단편과 99%의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.
일 실시형태에서, 핵산 분자의 면역원성 단편은 전장 최적화된 공통 마르부르그바이러스 항원의 적어도 하나의 면역우세 또는 준면역우세 에피토프를 코딩한다.
몇몇 실시형태는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 전장의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함하는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 면역원성 단편에 관한 것이다. 면역원성 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 단편과 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더 등을 코딩하는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 리더 서열을 코딩하는 코딩 서열이 없다.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5과 적어도 90% 상동성인 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산 서열은 본 명세서에 기재된 공통 마르부르그바이러스 면역원 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다. 예를 들어, 핵산은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 하나 이상을 코딩하는 RNA 서열, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 분자는 코딩 서열의 N 말단 끝에서 IgE 리더 서열 마이너스 마르부르그바이러스 항원을 코딩하는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, DNA 핵산 분자는 코딩 서열의 N 말단 끝에 부착되고 촉진자에 작동 가능하게 연결된 IgE 리더 서열을 추가로 포함한다.
핵산 분자는 코딩 서열의 C 말단 끝에 부착된 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는 코돈 최적화된다.
면역원성 조성물
최적화된 공통 서열, 최적화된 공통 코딩된 항원, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이들의 조합을 포함하는, 면역원성 조성물, 예컨대 백신이 제공된다. 면역원성 조성물은 마르부르그바이러스 면역원에 대한 면역원성 조성물이 투여된 대상체의 면역 반응을 상당히 유도할 수 있다.
면역원성 조성물은 DNA 백신, RNA 백신, 펩타이드 백신, 또는 조합 백신일 수 있다. 백신은 항원을 코딩하는 최적화된 공통 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결된 링커, 리더, 또는 태그 서열을 코딩하는 추가적인 서열을 또한 포함할 수 있다. 펩타이드 백신은 항원, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 조합 DNA 및 펩타이드 백신은 상기 기재된 최적화된 공통 뉴클레오타이드 서열 및 코딩된 항원을 포함할 수 있다.
백신은 약독화된 생 백신, 항원을 전달하도록 재조합 벡터를 사용하는 백신, 아단위 백신 및 당단백질 백신, 예를 들어 미국 특허 제4,510,245호; 제4,797,368호; 제4,722,848호; 제4,790,987호; 제4,920,209호; 제5,017,487호; 제5,077,044호; 제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제5,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,3 64호; 제5,462,734호; 제5,470,734호; 제5,474,935호; 제5,482,713호; 제5,591,439호; 제5,643,579호; 제5,650,309호; 제5,698,202호; 제5,955,088호; 제6,034,298호; 제6,042,836호; 제6,156,319호 및 제6,589,529호(각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 백신(이들로 제한되지는 않음)일 수 있다.
본 발명의 백신은 효과적인 백신에 필요한 특징, 예컨대 백신 자체가 병 또는 사망을 야기하지 않도록 안전함; 병에 대해 보호적임; 중화 항체의 유도; 보호 T 세포 반응의 유도; 및 투여의 용이, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 저비용의 제공을 가질 수 있다.
상기 조성물은 단일 핵산 분자, 예컨대 단일 플라스미드의 복수의 카피, 2개 이상의 상이한 핵산 분자, 예컨대 2개 이상의 상이한 플라스미드의 복수의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 또는 이것 초과의 상이한 핵산 분자의 복수를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 이것 초과의 상이한 플라스미드의 복수를 포함할 수 있다.
조성물은 총체적으로 단일 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 함유하는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드를 포함할 수 있다. 조성물은 다수의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 총체적으로 함유하는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드를 포함할 수 있다.
조성물은 제1 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원, 제2 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원 및 제3 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원의 조합을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
각각의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원에 대한 각각의 코딩 서열은 바람직하게는 별개의 플라스미드에 포함된다.
따라서, 다수의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물은 단일 플라스미드에 있을 수 있지만, 바람직하게는 2개 이상의 별개의 플라스미드에 있다.
포유류에서 마르부르그바이러스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 면역원성 조성물이 본 명세서에 제공된다. 면역원성 조성물은 상기 기재된 바와 같은 각각의 플라스미드를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 복수의 플라스미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 치료학적 또는 예방학적 면역 반응을 유도하도록 제공될 수 있다.
면역원성 조성물은 하나 이상의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 외피 당단백질 면역원을 코딩하는 핵산 분자를 전달하도록 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 바람직하게는 플라스미드를 포함하는 조성물이다.
면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예를 들어 비히클, 애주번트, 담체 또는 희석제일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 표면 활성제, 예컨대 면역 자극 복합체(immune-stimulating complex: ISCOMS), 프로인트 불완전 애주번트, LPS 유사체, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제를 포함하는 형질주입 촉진제일 수 있다.
형질주입 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예를 들어 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질이다. 형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 가장 바람직하게는, 폴리-L-글루타메이트는 6㎎/㎖ 미만의 농도로 면역원성 조성물에 존재한다. 형질주입 촉진제는 또한 표면 활성제, 예컨대 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 애주번트, LPS 유사체, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포체, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 히알루론산은 또한 유전자 작제물과 함께 투여되어 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, DNA 플라스미드 면역원성 조성물은 또한 형질주입 촉진제, 예컨대 지질, 리포좀, 예를 들어 레시틴 리포솜 또는 DNA-리포솜 혼합물로서 당해 분야에 공지된 다른 리포솜(예를 들어, WO 제9324640호 참조), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형질주입 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예를 들어 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질이다. 면역원성 조성물 내의 형질주입 제제의 농도는 4㎎/㎖ 미만, 2㎎/㎖ 미만, 1㎎/㎖ 미만, 0.750㎎/㎖ 미만, 0.500㎎/㎖ 미만, 0.250㎎/㎖ 미만, 0.100㎎/㎖ 미만, 0.050㎎/㎖ 미만, 또는 0.010㎎/㎖ 미만이다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의 애주번트일 수 있다. 애주번트는 이로부터 또는 대안적인 플라스미드로부터 발현되거나, 면역원성 조성물에서 상기 플라스미드와 조합되어 단백질로서 전달된 다른 유전자일 수 있다. 하나 이상의 애주번트는 CCL20, α-인터페론(IFN- α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선 발현된 케모카인(TECK), 점막 연관된 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, 예를 들어 신호 서열 또는 결실된 신호 서열을 코딩하는 코딩 서열을 갖고 임의로 상이한 신호 펩타이드를 포함하는 IL-15, 예컨대 IgE 또는 차이 신호 펩타이드를 코딩하는 코딩 서열로부터의 것, 예컨대 IgE, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8, L-설렉틴, P-설렉틴, E-설렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이체, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2로부터의 것 및 이들의 기능성 단편 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 단백질 및/또는 핵산 분자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 애주번트는 CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 또는 RANTES로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 단백질 및/또는 핵산 분자일 수 있다. IL-12 작제물 및 서열의 예는 2011년 12월 12일자로 제출된 PCT 출원 제PCT/US1997/019502호 및 대응 미국 출원 제08/956,865호 및 미국 가출원 제61/569600호(각각 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. IL-15 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US04/18962호 및 대응 미국 출원 제10/560,650호 및 PCT 출원 제PCT/US07/00886호 및 대응 미국 출원 제12/160,766호, 및 PCT 출원 제PCT/US10/048827호(각각 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. IL-28 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US09/039648호 및 대응 미국 출원 제12/936,192호(각각 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US1999/004332호 및 대응 미국 출원 제09/622452호(각각 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US11/024098호(본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US1999/004332호 및 대응 미국 출원 제09/622452호(각각 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US11/024098호(본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 케모카인 CTACK, TECK 및 MEC 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US2005/042231호 및 대응 미국 출원 제11/719,646호(각각 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. OX40 및 다른 면역조정제의 예는 미국 출원 제10/560,653호(본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. DR5 및 다른 면역조정제의 예는 미국 출원 제09/622452호(본 명세서에서 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
면역원성 조성물은 1994년 4월 1일자로 출원된 미국 제021,579호(참고로 완전히 포함됨)에 기재된 바와 같은 유전자 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 보다 바람직하게는 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램인 양으로 공통 항원 및 플라스미드를 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이크로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350마이크로그램의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램, 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램, 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램, 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500마이크로그램, 약 1 내지 약 350마이크로그램, 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램의 공통 항원 및 이의 플라스미드를 함유한다.
면역원성 조성물은 사용되는 투여의 방식에 따라 제제화될 수 있다. 주사용 면역원성 조성물 약제학적 조성물은 무균이고 발열원이 없고 입자가 없을 수 있다. 등장성 제제 또는 용액을 사용할 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 혈관수축 물질을 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물 제제에 LGS 또는 다중 양이온 또는 다중 음이온과 같은 안정화제는 연장된 시간 기간 동안 실온 또는 상온에서 제제가 안정하게 허용할 수 있다.
면역원성 조성물은 실온(25℃)에서 1주 초과 동안, 몇몇 실시형태에서 2주 초과 동안, 몇몇 실시형태에서 3주 초과 동안, 몇몇 실시형태에서 4주 초과 동안, 몇몇 실시형태에서 5주 초과 동안, 및 몇몇 실시형태에서 6주 초과 동안 안정할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 백신은 1개월 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 5개월 초과, 6개월 초과, 7개월 초과, 8개월 초과, 9개월 초과, 10개월 초과, 11개월 초과, 또는 12개월 초과 동안 안정하다. 몇몇 실시형태에서, 백신은 1년 초과, 2년 초과, 년 초과 또는 5년 초과 동안 안정하다. 일 실시형태에서, 면역원성 조성물은 냉동(2 내지 8℃) 하에 안정하다. 따라서, 일 실시형태에서, 면역원성 조성물은 냉동된 저온 유통을 요하지 않는다. 면역원성 조성물은 이의 의도된 사용을 허용하기에(예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 생성시키기에) 충분한 기간 동안 이의 생물학적 활성을 보유하는 경우 안정하다. 예를 들어, 저장, 선적 등이 되는 면역원성 조성물의 경우, 면역원성 조성물이 수개월 내지 수년 동안 안정하게 있는 것이 바람직할 수 있다.
면역 반응
면역원성 조성물은 조성물이 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 면역 반응은 마르부르그바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 면역 반응은 최적화된 공통 코딩된 항원과 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 관련된 항원은 최적화된 공통 코딩된 항원의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항원을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 관련된 항원은 본 명세서에 개시된 최적화된 공통 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 항원을 포함한다.
면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 체액 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 체액 면역 반응은 마르부르그바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 체액 면역 반응은 최적화된 공통 코딩된 항원과 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 체액 면역 반응은 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 유도될 수 있다. 체액 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배 또는 적어도 약 16.0배만큼 유도될 수 있다.
면역원성 조성물에 의해 유도된 체액 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 중화 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 중화 항체는 최적화된 공통 코딩된 항원과 관련된 마르부르그바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 중화 항체는 최적화된 공통 항원과 유전적으로 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 중화 항체는 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 종양 성장, 전이 또는 병인학과 관련된 종양의 보호 및/또는 치료를 제공할 수 있다.
면역원성 조성물에 의해 유도된 체액 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 IgG 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 이 IgG 항체는 최적화된 공통 항원에 유전적으로 관련된 마르부르그바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 이 IgG 항체는 최적화된 공통 항원과 유전적으로 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 IgG 항체의 수준은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 증가할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 IgG 항체의 수준은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배 또는 적어도 약 16.0배만큼 증가할 수 있다.
면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 최적화된 공통 코딩된 항원과 관련된 마르부르그바이러스 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 최적화된 공통 코딩된 항원과 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 유발된 CD8+ T 세포 반응은 최적화된 공통 항원과 유전적으로 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 유발된 CD8+ T 세포 반응은 다기능성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 CD8+ T 세포는 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터류킨-2 (IL-2), 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생성한다.
유도된 세포 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 증가된 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD8+ T 세포 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배 또는 약 4배 내지 약 20배만큼 증가할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD8+ T 세포 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 16.0배, 적어도 약 17.0배, 적어도 약 18.0배, 적어도 약 19.0배, 적어도 약 20.0배, 적어도 약 21.0배, 적어도 약 22.0배, 적어도 약 23.0배, 적어도 약 24.0배, 적어도 약 25.0배, 적어도 약 26.0배, 적어도 약 27.0배, 적어도 약 28.0배, 적어도 약 29.0배 또는 적어도 약 30.0배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 마르부르그바이러스 항원에 반응성인 CD107a/IFNγ/T-bet 삼중 양성 CD8 T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD107a/IFNγ/T-bet 삼중 양성 CD8 T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 마르부르그바이러스 항원에 반응성인 CD107a/IFNγ 이중 양성 CD8 T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD107a/IFNγ 이중 양성 CD8 T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배 또는 14배만큼 증가할 수 있다.
면역원성 조성물에 의해 유도된 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 유발된 CD4+ T 세포 반응은 최적화된 공통 항원과 유전적으로 관련된 마르부르그바이러스 항원과 반응성일 수 있다. 유발된 CD4+ T 세포 반응는 다기능성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 CD4+ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생성한다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생성하는 CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD4+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생성하는 CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD4+TNF-α+ T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배 또는 22배만큼 증가할 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ 및 TNF-α 둘 다를 생성하는 CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 연관된 CD4+IFN-γ+TNF-α+의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 마르부르그바이러스 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10.0배, 10.5배, 11.0배, 11.5배, 12.0배, 12.5배, 13.0배, 13.5배, 14.0배, 14.5배, 15.0배, 15.5배, 16.0배, 16.5배, 17.0배, 17.5배, 18.0배, 18.5배, 19.0배, 19.5배, 20.0배, 21배, 22배, 23배 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배 또는 35배만큼 증가할 수 있다.
면역원성 조성물은 상이한 조직, 예컨대 근육 또는 피부에 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다. 면역원성 조성물은 전기천공 또는 주사를 통해, 또는 피하로 또는 근육내로 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다.
벡터
상기 기재된 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 벡터에 위치할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 재조합 "네이키드 DNA" 벡터의 임의의 형태 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다, "벡터"는 세포를 감염시키거나, 형질주입하거나, 일시적으로 또는 영구적으로 형질도입할 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터가 네이키드 핵산 또는 단백질 또는 지질과 복합화된 핵산일 수 있다는 것이 인식될 것이다. 벡터는 임의로 바이러스 또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막(예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 엔벨로프 등)을 포함한다. 벡터는 DNA의 단편이 부착되고 복제될 수 있는 레플리콘(예를 들어, RNA 레플리콘, 박테리오파지)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 벡터는 따라서 RNA, 자율 자가-복제 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등, 예를 들어 미국 특허 제5,217,879호 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 발현 및 비발현 플라스미드 둘 다를 포함한다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"를 숙주화하는 것으로 기술되는 경우에, 이는 염색체외 원형 및 선형 DNA 및 숙주 염색체(들) 내에 도입된 DNA 둘 다를 포함한다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우에, 벡터는 자율 구조(autonomous structure)로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정적으로 복제될 수 있거나 숙주 게놈 내에 도입된다.
하나 이상의 벡터는 표적 세포로 특이적 유전자를 도입하도록 사용된 일반적으로 플라스미드인 발현 작제물일 수 있다. 발현 벡터가 세포 내에 있으면, 유전자에 의해 코딩된 단백질은 세포-전사 및 번역 기계 리보솜 복합체에 의해 생산된다. 플라스미드는 흔히 인핸서 및 촉진자 영역으로서 작용하고 발현 벡터에 보유된 유전자의 효율적인 전사를 발생시키는 조절 서열을 함유하도록 조작된다. 본 발명의 벡터는 량의 안정한 메신저 RNA, 및 따라서 단백질을 발현한다.
벡터는 발현 신호, 예컨대 강한 촉진자, 강한 종결 코돈, 촉진자와 클로닝된 유전자 사이의 거리의 조정, 및 전사 종결 서열 및 PTIS(portable translation initiation sequence: 포터블 번역 개시 서열)의 삽입일 수 있다.
(1) 발현 벡터
하나 이상의 벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정한 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물을 포함하는 하나 이상의 벡터는 키메라일 수 있고, 이는 이의 성분 중 적어도 하나가 이의 다른 성분 중 적어도 하나와 관련하여 비상동성이라는 것을 의미한다.
(2) 플라스미드
하나 이상의 벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 세포를 형질주입하는 데 유용할 수 있다. 플라스미드는 대상체로 재조합 핵산 서열 작제물을 도입하는 데 유용할 수 있다. 플라스미드는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있는 조절 서열을 또한 포함할 수 있다.
플라스미드는 염색체외로 플라스미드를 유지시키고 세포에서 플라스미드의 복수의 카피를 생성하도록 포유류 복제 기원을 또한 포함할 수 있다. 플라스미드는 Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고)으로부터의 pVAX1, pCEP4 또는 pREP4일 수 있고, 이것은 엡스테인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역(통합 없이 고카피 에피솜 복제를 생성할 수 있음)을 포함할 수 있다. 플라스미드의 골격은 pAV0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 타입 5(Ad5) 플라스미드일 수 있다.
플라스미드는 에스체리치아 콜라이(이. 콜라이)에서 단백질 생산에 유용할 수 있는 pSE420(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 플라스미드는 또한 효모의 사카로마이세스 세레비시아에 균주에서 단백질 생산에 유용할 수 있는 pYES2(Invitrogen(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 플라스미드는 또한 곤충 세포에서 단백질 생산에 유용할 수 있는 MAXBAC(상표명) 완전 바큘로바이러스 발현 시스템(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다. 플라스미드는 또한 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary: CHO)에서 단백질 생산에 유용할 수 있는 pcDNAI 또는 pcDNA3(캘리포니아주 샌 디에고))일 수 있다.
(3) RNA
일 실시형태에서, 핵산은 RNA 분자이다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 본 명세서에 기재된 DNA 서열로부터 전사된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, RNA 분자는 서열 번호 1, 3 또는 5 중 하나에 적어도 90% 상동성인 DNA 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2, 4 또는 6의 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 DNA 서열에 의해 전사된 RNA 서열, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 DMAb를 코딩하는 RNA 분자를 제공한다. RNA는 플러스 가닥일 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, RNA 분자는 임의의 개재하는 복제 단계, 예컨대 역전사를 필요로 하지 않으면서 세포에 의해 번역될 수 있다. 본 발명에 의해 유용한 RNA 분자는 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아노신)을 가질 수 있다. 이 캡은 RNA의 생체내 번역을 증대시킬 수 있다. 본 발명에 의해 유용한 RNA 분자의 5' 뉴클레오타이드는 5' 트라이포스페이트기를 가질 수 있다. 캡핑된 RNA에서, 이것은 5'-대-5' 브릿지를 통해 7-메틸구아노신에 연결될 수 있다. RNA 분자는 3' 폴리-A 꼬리를 가질 수 있다. 이것은 이의 3' 말단 근처에 폴리-A 중합효소 인식 서열(예를 들어 AAUAAA)을 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 유용한 RNA 분자는 단일 가닥일 수 있다. 본 발명에 의해 유용한 RNA 분자는 합성 RNA를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, RNA 분자는 네이키드 RNA 분자이다. 일 실시형태에서, RNA 분자는 벡터 내에 포함된다.
일 실시형태에서, RNA는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 실시형태에서, 5' UTR은 0개 내지 3000개의 뉴클레오타이드 길이이다. 코딩 영역에 첨가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 상이한 방법, 예를 들어 UTR의 상이한 영역을 어닐랑하는 PCR에 대한 프라이머의 설계(이것으로 제한되지는 않음)에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 이용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질주입 이후에 최적 번역 효율을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 대상의 유전자에 대한 천연 발생 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 대상의 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 정방향 및 역방향 프라이머로의 UTR 서열의 도입에 의해 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 대상의 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열에서 AU 농후 요소가 RNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 당해 분야에 널리 공지된 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 실시형태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 대상의 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기재된 바대로 PCR에 의해 첨가될 때, 공통 Kozak 서열은 5' UTR 서열을 첨가함으로써 재설계될 수 있다. Kozak 서열은 몇몇 RNA 전사체의 번역의 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역이 가능하게 하는 데 필요한 것으로 보이지 않는다. 많은 RNA에 대한 Kozak 서열에 대한 요건은 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 전달될 수 있다. 다른 실시형태에서, 다양한 뉴클레오타이드 유사체는 RNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키도록 3' 또는 5' UTR에서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, RNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서의 RNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 꼬리에서 캡 둘 다를 갖는다.
일 실시형태에서, RNA는 뉴클레오사이드 변형된 RNA이다. 뉴클레오사이드 변형된 RNA는 비변형된 RNA에 비해 예를 들어 안정성의 증가, 낮은 또는 부재한 선천성 면역원성 및 번역의 증대와 같은 특정한 이점을 갖는다.
(4) 원형 및 선형 벡터
하나 이상의 벡터는 세포 게놈으로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외로 존재(예를 들어, 복제 기원을 갖는 자율 복제 플라스미드)할 수 있는 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터는 pVAX, pcDNA3.0 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
선형 핵산 또는 선형 발현 카세트("LEC")가 또한 본 명세서에 제공되고, 이것은 전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달되고 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. LEC는 임의의 포스페이트 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 포스페이트 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 항원 유전자 별현과 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드에서 유래될 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP(Puerto Rico/34) 또는 pM2(New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 코딩된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(Puerto Rico/34) 및 pM2(New Caledonia/99)로부터 유래될 수 있다.
(5) 바이러스 벡터
일 실시형태에서, 세포로 본 발명의 핵산을 전달할 수 있는 바이러스 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 Sambrook 등(2001) 및 Ausubel 등(1997)의 문헌, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 복제 기능의 기원, 촉진자 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 제01/96584호; WO 제01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호). 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용된 방법이 된다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련된 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
(6) 벡터를 제조하는 방법
재조합 핵산 서열 작제물이 위치할 수 있는 하나 이상의 벡터를 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양물을 접종하도록 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 하나 이상의 전기천공(EP) 장치와 사용될 수 있다. EP 장치는 하기 더 자세히 기재되어 있다.
하나 이상의 벡터는 공지된 장치 및 기법의 조합을 이용하여 제제화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이들은 2007년 5월 23일자로 출원된 허가 받은 계류 중인 미국 가출원 제60/939,792호에 기재된 플라스미드 제조 기법을 이용하여 제조된다. 몇몇 예에서, 본 명세서에 기재된 DNA 플라스미드는 10㎎/㎖ 이상의 농도에서 제제화될 수 있다. 제조 기법은 또한, 2007년 7월 3일자로 허가된 미국 특허 제7,238,522호인 허가 받은 특허에 기재된 것을 포함하여, 미국 제60/939792호에 기재된 것 이외에 당업자에게 흔히 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하고 도입한다. 상기 언급된 출원 및 특허, US 제60/939,792호 및 US 특허 제7,238,522호는 각각 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
다수의 벡터
면역원성 조성물은 단일 핵산 분자, 예컨대 단일 플라스미드의 복수의 카피 또는 2개 이상의 상이한 핵산 분자, 예컨대 2개 이상의 상이한 플라스미드의 복수의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 또는 이것 초과의 상이한 핵산 분자의 복수를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 복수의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 이것 초과의 상이한 플라스미드를 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 마르부르그바이러스 항원에 대한 코딩 서열을 총체적으로 함유하는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 다수의 항원에 대한 코딩 서열을 총체적으로 함유하는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 항원은 마르부르그바이러스 항원 및 하나 이상의 추가적인 암 항원이다. 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 암 항원에 대한 코딩 서열을 총체적으로 함유하는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드를 포함할 수 있다.
방법
대상체에게 면역원성 조성물을 투여함으로써 이를 요하는 대상체에서 질환을 치료하고/하거나, 보호하고/하거나, 예방하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 대상체에 대한 면역원성 조성물의 투여는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 유발할 수 있다. 유도된 면역 반응은 마르부르그 바이러스 감염 또는 마르부르그 바이러스 감염과 연관된 출혈성 열과 같은 질환을 치료하고/하거나, 보호하고/하거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.
면역 반응이 유도될 수 있는 마르부르그바이러스에 대하여 백신이 특히 효과적이게 만드는 에피토프를 포함하는 유전자 작제물 및 공통 항원의 단백질을 제공하기 위해 면역원성 조성물을 전달하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 면역원성 조성물을 전달하는 방법 또는 백신접종은 치료학적 및 예방학적 면역 반응을 유도하도록 제공될 수 있다. 백신접종 과정은 마르부르그바이러스에 대하여 포유류 면역 반응에서 생성할 수 있다. 면역원성 조성물은 포유류의 면역계의 활성을 조정하고 면역 반응을 증대시키도록 개체에게 전달될 수 있다. 세포에서 발현되고 면역계가 인식한 세포의 표면에 전달된 핵산 분자가 세포, 체액, 또는 세포 및 체액 반응을 유도하면서, 면역원성 조성물의 전달은 공통 항원의 형질주입일 수 있다. 면역원성 조성물의 전달은 상기 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포유류에게 투여함으로써 마르부르그바이러스에 대하여 포유류에서 면역 반응을 유도하거나 유발하기 위해 사용될 수 있다.
포유류의 세포로의 면역원성 조성물 및 플라스미드의 전달 시, 형질주입된 세포는 면역원성 조성물로부터 주사된 각각의 플라스미드에 대해 공통 항원을 발현하고 분비할 것이다. 이 단백질은 면역계에 의해 외래로서 인식될 것이고, 항체는 이에 대해 제조될 것이다. 이 항체는 면역계에 의해 유지되고, 마르부르그바이러스에 의한 후속하는 감염에 대한 효과적인 반응을 허용할 것이다.
포유류에서 면역 반응을 유발하도록 면역원성 조성물을 포유류에게 투여할 수 있다. 포유류는 인간, 영장류, 비인간 영장류, 젖소, 육우, 양, 염소, 영양, 유럽들소, 물소, 유럽들소, 소과, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 래트 및 닭일 수 있다.
유도된 면역 반응은 유도된 체액 면역 반응 및/또는 유도된 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. 체액 면역 반응은 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 유도될 수 있다. 유도된 체액 면역 반응은 항원에 반응성인 IgG 항체 및/또는 중화 항체를 포함할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약25배 또는 약 4배 내지 약 20배만큼 유도되는 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다.
면역원성 조성물 용량은 1㎍ 내지 10㎎의 활성 성분/체중(㎏)/시간일 수 있고, 20㎍ 내지 10㎎의 성분/체중(㎏)/시간일 수 있다. 면역원성 조성물은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 면역원성 조성물의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
면역원성 조성물은 약학 분야의 당업자에게 널리 공지된 표준 기법에 따라 제제화될 수 있다 이러한 조성물은 특정한 대상체의 연령, 성별, 체중 및 컨디션, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의학 분야의 당업자에게 널리 공지된 기법에 의해 투약량으로 투여될 수 있다.
면역원성 조성물은 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있다. 예방학적 투여에서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료학적 분야에서, 면역원성 조성물은 치료학적 효과를 유발하기에 충분한 양으로 이를 요하는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료학적 유효 용량"으로 정의된다. 이의 사용에 효과적인 양은 예를 들어 투여되는 면역원성 조성물 섭생의 특정한 조성물, 투여의 방식, 질환의 상태 및 중증도, 대상체의 건강의 일반 상태 및 처방의의 판단에 따라 달라질 것이다.
면역원성 조성물은 문헌[Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner 등(미국 특허 제5,580,859호, 1996년 12월 3일 등록); Felgner (미국 특허 제5,703,055호, 1997년 12월 30일 등록); 및 Carson 등(미국 특허 제5,679,647호, 1997년 10월 21일 등록)](이들 모두의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다. 면역원성 조성물의 DNA는 예를 들어 백신 총을 사용하여 개체에게 투여될 수 있는 입자 또는 비드와 복합체 형성될 수 있다. 당업자는 생리학적으로 허용 가능한 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체의 선택이 예를 들어 발현 벡터의 투여의 경로에 따라 달라진다는 것을 알 것이다.
면역원성 조성물은 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 통상적인 전달 경로는 비경구 투여, 예를 들어 피내, 근육내 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내 및 질내 경로를 포함한다. 특히 면역원성 조성물의 DNA에 대해, 면역원성 조성물은 개체의 조직의 간질성 공간으로 전달될 수 있다(Felgner et al., 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,703,055호(이들 모두의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨). 면역원성 조성물은 또한 근육으로 투여될 수 있거나, 피내 또는 피하 주사를 통해, 또는 경피로, 예컨대 이온도입법에 의해 투여될 수 있다. 면역원성 조성물의 표피 투여가 또한 이용될 수 있다. 표피 투여는 자극제에 면역 반응을 자극하기 위해 표피의 최외각 층을 기계적으로 또는 화학적으로 자극하는 것을 수반할 수 있다(Carson 등, 미국 특허 제5,679,647호(이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)).
면역원성 조성물은 또한 비강 통로를 통해 투여에 제제화될 수 있다. 비강 투여에 적합한 제제(여기서, 담체는 고체임)는 예를 들어 코가 취하는 방식으로, 즉 코에 가깝게 유지되는 분말의 용기로부터 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의해 투여되는 약 10 내지 약 500마이크론의 범위의 입자 크기를 갖는 조악한 분말을 포함할 수 있다. 제제는 비강 스프레이, 비강 드롭, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여일 수 있다. 제제는 면역원성 조성물의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 액체 제제, 예컨대 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르일 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여(예를 들어, 주사용 투여), 예컨대 무균 현탁액 또는 에멀션에 대한 제제일 수 있다.
면역원성 조성물은 리포솜, 마이크로구 또는 다른 중합체 매트릭스로 도입될 수 있다(Felgner 등, 미국 특허 제5,703,055호; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨). 리포솜은 인지질 또는 다른 지질로 이루어질 수 있고, 비교적 만들고 투여하기 단순한 비독성의 생리학적으로 허용 가능한 및 대사 가능한 캐리어일 수 있다.
병용 치료
면역원성 조성물은 CCL20, α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선 발현된 케모카인(TECK), 점막 연관된 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, 예를 들어 결실된 신호 서열을 갖고 임의로 상이한 신호 펩타이드를 포함하는 IL-15, 예컨대 IgE 신호 펩타이드, MHC, CD80, CD86, IL-28, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8, RANTES, L-설렉틴, P-설렉틴, E-설렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이체, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능성 단편 또는 이들의 조합을 코딩하는 다른 단백질 및/또는 유전자와 조합되어 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역원성 조성물은 하기 핵산 분자 및/또는 단백질 중 하나 이상과 조합되어 투여된다: CCL20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 및 RANTES 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자 또는 이들의 기능성 단편, 및 CCL02, IL-12 단백질, IL-15 단백질, IL-28 단백질, CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 또는 RANTES 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 기능성 단편.
면역원성 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 경막내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 용도를 위해, 조성물은 정상적인 수의학적 관례에 따라 적합하게 허용 가능한 제제로 투여될 수 있다. 수의사는 특정한 동물에 가장 적절한 투약 섭생 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 면역원성 조성물은 전통적인 주사기, 무침 주사 장치, "마이크로돌출형 폭탄 곤 건", 또는 다른 물리적 방법, 예컨대 전기천공("EP"), "수력학적 방법", 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.
면역원성 조성물의 플라스미드는 생체내 전기천공, 리포솜 매개된, 나노입자 촉진된, 재조합 벡터, 예컨대 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아와 함께 및 이것 없이 DNA 주사(DNA 백신접종이라고도 칭함)를 포함하는 몇몇 널리 공지된 기술에 의해 포유류에게 전달될 수 있다. 공통 항원은 DNA 주사를 통해 생체내 전기천공과 함께 전달될 수 있다.
전기천공
면역원성 조성물의 플라스미드의 전기천공을 통한 면역원성 조성물의 투여는 가역적 구멍을 세포막에 형성하기 위해 효과적인 에너지의 펄스를 포유류의 원하는 조직으로 전달하도록 배치될 수 있는 전기천공 장치를 사용해서 달성될 수 있고, 바람직한 에너지의 펄스는 사용자에 의해 사전 설정된 전류 입력과 유사한 정전류이다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 성분은 하기를 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소의 하나 이상을 포함하고 이를 도입할 수 있다: 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 평가기, 파형 로거(logger), 입력 부재, 상태 보고 부재, 소통 포트, 메모리 성분, 전원 및 전력 스위치. 전기천공은 플라스미드에 의한 세포의 형질주입을 촉진시키기 위해 생체내 전기천공 장치, 예를 들어 CELLECTRA EP 시스템(VGX Pharmaceuticals(펜실베니아주 블루 벨)) 또는 Elgen 전기천공기(Genetronics(캘리포니아주 샌디에고))를 사용해서 달성될 수 있다.
전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 부재로 작용할 수 있고, 다른 부재는 전기천공 성분과 통신하는 별개의 부재(또는 성분)이다. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나 초과의 부재로 작용할 수 있고, 이것은 전기천공 성분과 별도의 전기천공 장치의 더욱 다른 부재와 통신할 수 있다. 부재가 하나의 장치로서 또는 서로 통신하는 별개의 부재로서 작용할 수 있으므로, 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 일부로서 존재하는 전기천공 장치의 부재는 제한되지 않을 수 있다. 전기천공 성분은 원하는 조직에서 정전류를 생성하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있고, 피드백 메커니즘을 포함한다. 전극 어셈블리는 복수의 전극을 공간적 배열로 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있고, 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 수신하고, 전극을 통해 이를 원하는 조직으로 전달한다. 적어도 하나의 복수의 전극은 에너지의 펄스의 전달 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 전기천공 성분에 임피던스와 소통한다. 피드백 메커니즘은 측정된 임피던스를 수신할 수 있고, 정전류를 유지하기 위해 전기천공 성분에 의해 전달된 에너지의 펄스를 조정할 수 있다.
복수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그래밍된 순서로 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있고, 프로그래밍된 순서는 사용자에 의해 전기천공 성분에 입력된다. 프로그래밍된 순서는 순서대로 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있고, 복수의 펄스의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되고, 복수의 펄스의 후속하는 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 상이한 것에 의해 전달된다.
피드백 메커니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50㎲, 20㎲, 10㎲ 또는 1㎲마다 발생하지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다(즉, 반응 시간을 결정하기 위해 이용 가능한 기법에 의해 결정되는 바에 따라 실질적으로 순간적임). 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 피드백 메커니즘에 임피던스와 통신할 수 있고, 피드백 메커니즘은 임피던스에 반응하고 정전류를 사전 설정된 전류와 유사한 값에서 유지하기 위해 에너지의 펄스를 조정한다. 피드백 메커니즘은 에너지의 펄스의 전달 동안 연속적으로 및 순간적으로 정전류를 유지할 수 있다.
본 발명의 DNA 면역원성 조성물의 전달을 촉진할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등), 미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등)(이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 것들이 포함한다. DNA 면역원성 조성물의 전달을 촉진하기 위해 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은 2006년 10월 17일자로 출원된 미국 가출원 제60/852,149호 및 2007년 10월 10일자로 출원된 제60/978,982호에 대해 35 USC 119(e) 하에 이익을 청구하는, 2007년 10월 17일자로 출원된 공동 계류중이고 공동 소유된 미국 특허 출원 제11/874072호(이들 모두 본 명세서에 그 전문이 포함됨)에 제공된 것을 포함한다.
미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등)는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포로 생체분자의 도입을 촉진하기 위한 모듈형 전극 시스템 및 이의 용도를 기재한다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 오퍼레이터는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 쥐고 이들을 신체 또는 식물에서 선택된 조직으로 단단히 삽입할 수 있다. 이후, 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직으로 전달된다. 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러를 활성화하고 정전류 전기 펄스가 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 세포로 생체분자의 도입을 촉진한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다.
미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등)는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포로 생체분자의 도입을 효과적으로 촉진하기 위해 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기재한다. 전기천공 장치는 그 작동이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 특정되는 전기-역학 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 펄스 파라미터의 입력 및 사용자 제어에 기초하여 어레이 내의 전극 사이에 일련의 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이, 주입 바늘을 위한 중심 주입 채널, 및 제거 가능한 가이드 디스크를 갖는 대체 가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 제2005/0052630호의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/0052630호에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로의 심부 침투를 위해 채택될 수 있다. 전극 어레이의 구조로 인해, (선택한 생체분자의 전달을 위한) 주입 바늘도 표적 기관 내로 완전히 삽입되고, 주입은 전극에 의해 미리 기술된 영역에서 표적 조직에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/005263호에 기재된 전극은 바람직하게는 20㎜ 길이 및 21 게이지이다.
추가적으로, 전기천공 장치 및 이의 용도를 도입하는 몇몇 실시형태에, 하기 특허에 기재된 것인 전기천공 장치가 고려된다: 1993년 12월 28일자로 허여된 미국 특허 제5,273,525호, 2000년 8월 29일자로 허여된 미국 특허 제6,110,161호, 2001년 7월 17일자로 허여된 제6,261,281호, 및 2005년 10월 25일자로 허여된 제6,958,060호, 및 2005년 9월 6일자로 허여된 미국 특허 제6,939,862호. 또한, 임의의 다양한 장치를 이용한 DNA 전달에 관한 2004년 2월 24일자로 허여된 미국 특허 제6,697,669호, 및 DNA의 주입 방법에 대한 2008년 2월 5일자로 허여된 미국 특허 제7,328,064호에서 제공된 대상을 포괄하는 특허가 본 명세서에서 고려된다. 상기 특허는 이의 전문이 참고로 포함된다.
시험관내 및 생체외 항원의 생성
일 실시형태에서, 최적화된 공통 마르부르그바이러스 항원은 시험관내 또는 생체외 생성된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 최적화된 공통 마르부르그바이러스 항원을 코딩하는 핵산은 시험관내 또는 생체외 세포에서 도입되고 발현될 수 있다.
세포로 유전자를 도입하고 발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당해 분야에서 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
숙주 세포로 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 마이크로주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다. 숙주 세포로의 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위한 인산칼슘 형질주입이다.
관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용된 방법이 된다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련된 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
숙주 세포로 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 화학 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 마크로분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구, 비드 및 지질계 시스템, 예를 들어 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포솜을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 베시클)이다.
비바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 숙주 세포로의 핵산의 도입에 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 배치되고, 리포솜 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 복합체 형성되고, 지질을 함유하는 용액 중에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질 중 현탁액으로서 함유되고, 마이셀에 의해 함유되거나 복합체 형성되고, 또는 달리 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관된 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에서, 마이셀로서 또는 "붕괴된" 구조에 의해 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액 중에 단순히 배치될 수 있어서, 가능하게는 크기 또는 형상에서 균일하지 않는 응집체를 형성한다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 천연으로 발생하는 지방 액적, 및 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데하이드를 함유하는 화합물의 종류를 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시된다. 이러한 실시예가 본 발명의 바람직한 실시형태를 명시하지만, 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 이의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 이용 및 조건에 이를 채택하기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 수행할 수 있다. 따라서 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 부가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1: 마르부르그 바이러스를 표적화하는 DNA 백신
마르부르그(MARV) 바이러스를 표적화하는 DNA 백신이 개발되었다. 마르부르그 바이러스의 3개의 다양한 계통의 각각을 나타내는 최적화된 합성 공통 MARV 당단백질(GP) 서열은 포유류 발현-플라스미드 DNA로 개별적으로 클로닝되고, 근육내 전기천공을 통해 마우스로 전달되었다. 단일 면역화 후 2주에, DNA 백신 작제물은 마르부르그 GP에 대해 튼튼한 항체 및 T 세포 반응을 생성하였다.
방법
MARV GP 서열 및 클로닝 : 공개된 MARV GP 아미노산 서열을 정렬하여 합성 공통 항원을 생성하였다. 서열은 DNA 코돈 최적화되고 RNA 최적화되고, 변형된 pVax-1(Invitrogen) 포유류 발현 플라스미드로 클로닝되었다.
형질주입: 대략 0.5x106개의 293T 세포를 GeneJammer(Agilent Technologies)를 사용하여 0.5㎍ 플라스미드 DNA에 의해 형질주입하였다. 세포 상청액 및 용해물을 48시간 후 수집하였다.
DMAb 전기천공: BALB/c 마우스는 사두근에 i.m. 전달된 40㎍의 플라스미드 DNA를 받은 후, CELLECTRA(등록상표) 3P 장치(Inovio Pharmaceuticals(펜실베니아주 플레이마우스 미팅))에 의해 EP 되었다.
ELISA: 96웰 플레이트를 재조합 Angola MARV GP(IBT Bioservices)에 의해 코팅하였다. 마우스 혈청을 표시된 희석에서 첨가하였다. 결합된 항체는 HRP에 접합된 항-마우스-IgG 2차 항체에 의해 검출되었다.
웨스턴 블롯 : 293T 세포 용해물을 4% 내지 12% BisTris 겔에서 흐르게 하고 PVDF로 옮겼다. 항원을 토끼 항-MARV GP Angola 항체(IBT Bioservices), 이어서 항-토끼 2차 800㎚ 형광 항체(Licor)에 의해 검출하였다.
유세포분석법 및 ELISPOT: 293T 세포를 2mM EDTA를 사용하여 현탁시켰다. 혈청 및/또는 토끼 항-MARV GP Angola 항체, 이어서 2차 항-마우스 또는 항-토끼 FITC 접합된 항체를 1시간 동안 첨가하였다. 비장세포를 수확하고, MARV GP Angola 펩타이드에 의해 5시간 동안 모의하였다. 데이터는 BD LSR에서 획득되고 FlowJo에서 분석되었다. 세포를 싱글렛, 살은/죽은, 림프구, CD3+에서 게이팅하였다. 별개의 비장세포를 계수하고 96웰 마우스 IFN ELISPOT 플레이트(Mabtech)로 플레이팅한 후, 중첩하는 선형 펩타이드 풀에 의해 밤새 자극하였다.
결과
백신 작제 및 발현
계통발생학적 분석은 MARV GP(MGP)가 다양하다(약 70% 보존됨)는 것을 밝혀냈다. 따라서, 3개의 상이한 공통 MARV GP 면역원이 개발되었다(도 2). 각각의 GP 전이유전자는 유전자 최적화되고, 상업적으로 합성되고, 이후 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. HEK 293T 세포를 각각의 플라스미드에 의해 별개로 형질주입하고, GP 발현을 웨스턴 면역블로팅(도 3a) 및 FACS(도 3b)에 의해 평가하였다.
마우스에서의 '단일-용량' T 세포 반응
마우스에서의 백신 반응을 다음에 평가하였다. BALB/c 마우스를 40㎍의 플라스미드 DNA에 의해 오직 1회 면역화시키고, 혈청 비장세포를 주사 후 14일에 평가하였다(도 4a). 혈청 Ab를 평가하고, 도 4b 및 도 4c에 도시된 바대로, Ab 결합의 증가된 수준은 모든 백신(Con1-Con3)에 의해 검출되었다.
이후, GP 특이적 T 세포 반응의 생성이 평가되었다. 도 5a 및 도 5b는 '단일-용량' 백신접종에 의한 T 세포 유도를 보여준다. IFNγ 생성 T 세포는 모든 동물에서 검출되고, Con1 및 Con2에 의해 면역화된 동물은 대조군 세포에 비해 IFNγ 생성 T 세포의 유의미한 백분율 증가를 갖는다.
공통 마르부르그 당단백질 작제물이 형질주입된 세포에서 발현된다는 것이 본 명세서에서 입증된다. 마우스에 대한 공통 마르부르그 당단백질 작제물의 단일 전달은 항-MARV 항체 및 튼튼한 IFNγ T 세포 반응을 생성한다.
도 5는 개별 작제물에 의한 단일 백신접종이 마우스에서의 T 세포 IFNγ 반응 및 항체 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 6 및 도 7은 MARV 공통 백신 작제물에 대한 T 세포 및 항체 반응의 폭을 나타낸다.
상기 상세한 설명 및 동반된 실시예가 단지 예시적이고 첨부된 청구항 및 이의 등가물에 의해 오직 한정되는 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 취해지지 않아야 한다고 이해된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변화 및 변형이 당업자에게 명확할 것이다. 제한 없이 화학 구조, 치환기, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 본 발명의 제조 또는 사용 방법에 관한 것을 포함하는 이러한 변화 및 변형은 이의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.
<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA THE WISTAR INSTITUTE OF ANATOMY AND BIOLOGY <120> MARBURGVIRUS CONSENSUS ANTIGENS, NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND VACCINES MADE THEREFROM, AND METHODS OF USING SAME <130> MPI19-018 <140> PCT-US2017-064135 <141> 2017-12-01 <150> US 62/429,473 <151> 2016-12-02 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Marburg marburgvirus consensus envelope glycoprotein immunogen (Con1) <400> 1 aagaccacat gcctgttcat cagcctgatc ctgatccagg gcgtgaagac cctgccaatc 60 ctggagatcg cctccaacaa tcagccccag aacgtggaca gcgtgtgctc tggcaccctg 120 cagaagacag aggatgtgca cctgatgggc ttcacactga gcggacagaa ggtggcagac 180 tccccactgg aggcctctaa gaggtgggcc tttagaaccg gcgtgccccc taagaacgtg 240 gagtacaccg agggcgagga ggccaagaca tgctataata tctccgtgac cgatcccagc 300 ggcaagtccc tgctgctgga cccacccaca aacatcaggg attaccctaa gtgtaagacc 360 atccaccaca tccagggcca gaatccacac gcacagggaa tcgccctgca cctgtggggc 420 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sequence of Marburg marburgvirus consensus envelope glycoprotein immunogen (Con 3) <400> 6 Lys Thr Ile Tyr Phe Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Ser Ile Lys 1 5 10 15 Thr Leu Pro Val Leu Glu Ile Ala Ser Asn Ser Gln Pro Gln Asp Val 20 25 30 Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His Leu 35 40 45 Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu Glu 50 55 60 Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Thr Gly Val Pro Pro Lys Asn Val 65 70 75 80 Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val 85 90 95 Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Ser Asn Ile 100 105 110 Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Val His His Ile Gln Gly Gln Asn 115 120 125 Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe Leu 130 135 140 Tyr Asp Arg Val Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe Thr 145 150 155 160 Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Arg Met 165 170 175 Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr Ser 180 185 190 Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Glu Thr Gln Arg Asn Asp Thr 195 200 205 Gly Cys Phe Gly Ile Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Asn Asn Gln Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Ser Leu Lys Pro Pro Ser Leu Pro Thr Val Thr Pro Ser 225 230 235 240 Ile His Ser Thr Asn Thr Gln Ile Asn Thr Ala Lys Ser Gly Thr Met 245 250 255 Asn Pro Ser Ser Asp Asp Glu Asp Leu Met Ile Ser Gly Ser Gly Ser 260 265 270 Gly Glu Gln Gly Pro His Thr Thr Leu Asn Val Val Thr Glu Gln Lys 275 280 285 Gln Ser Ser Thr Ile Leu Ser Thr Pro Ser Leu His Leu Ser Thr Ser 290 295 300 Gln His Glu Gln Asn Ser Thr Asn Pro Ser Arg His Ala Val Thr Glu 305 310 315 320 His Asn Gly Thr Asp Pro Thr Thr Gln Pro Ala Thr Leu Leu Asn Asn 325 330 335 Thr Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Asn Thr Leu Lys Tyr Asn Leu Ser Thr 340 345 350 Pro Ser Pro Pro Thr Arg Asn Ile Thr Asn Asn Asp Thr Gln Arg Glu 355 360 365 Leu Ala Glu Ser Glu Gln Thr Asn Ala Gln Leu Asn Thr Thr Leu Asp 370 375 380 Pro Thr Glu Asn Pro Thr Thr Gly Gln Asp Thr Asn Ser Thr Thr Asn 385 390 395 400 Ile Ile Met Thr Thr Ser Asp Ile Thr Ser Lys His Pro Thr Asn Ser 405 410 415 Ser Pro Asp Ser Ser Pro Thr Thr Arg Pro Pro Ile Tyr Phe Arg Lys 420 425 430 Lys Arg Ser Ile Phe Trp Lys Glu Gly Asp Ile Phe Pro Phe Leu Asp 435 440 445 Gly Leu Ile Ser Thr Glu Ile Asp Phe Asp Pro Ile Pro Asn Thr Glu 450 455 460 Thr Ile Phe Asp Glu Ser Pro Ser Phe Asn Thr Ser Thr Asn Glu Glu 465 470 475 480 Gln His Thr Pro Pro Asn Ile Ser Leu Thr Phe Ser Tyr Phe Pro Asp 485 490 495 Lys Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys Asp 500 505 510 Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala Gly 515 520 525 Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr Thr 530 535 540 Ala Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg Arg 545 550 555 560 Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val Thr 565 570 575 Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp Phe 580 585 590 Leu Leu Thr Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp Cys 595 600 605 Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Lys Asn Ile Ser Glu Gln Ile Asp 610 615 620 Lys Ile Arg Lys Asp Glu Gln Lys Glu Glu Thr Gly Trp Gly Leu Gly 625 630 635 640 Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly Ile 645 650 655 Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile Cys 660 665 670 Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly 675 680 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding an IgE signal peptide <400> 7 atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagc 54 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for the IgE signal peptide <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser

Claims (26)

  1. 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 포함하는 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
    d) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자 및 RNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열,
    b) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및
    d) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 개시 코돈, IgE 리더 서열 및 중단 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 포함하는 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
    d) 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열,
    b) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및
    d) 서열 번호 8을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자로 도입되는, 면역원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  11. 핵산 분자로서,
    a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 포함하는 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
    d) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자 및 RNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열,
    b) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및
    d) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  14. 제11항에 있어서, 상기 코딩된 펩타이드는 개시 코돈, IgE 리더 서열 및 중단 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 포함하는 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
    d) 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
    a) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열,
    b) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및
    d) 서열 번호 8을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  17. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 핵산 분자.
  18. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자를 포함하는, 핵산 분자.
  19. 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 펩타이드는,
    a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 포함하는 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
    d) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  20. 펩타이드로서,
    a) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    b) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 포함하는 면역원성 단편,
    c) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
    d) 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%를 포함하는 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드.
  21. 마르부르그바이러스 항원(Marburgvirus antigen)에 대한 면역 반응의 유도를 요하는 대상체에서 마르부르그바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 제1항의 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 마르부르그바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 투여는 전기천공 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 마르부르그바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  23. 마르부르그바이러스 연관된 병리학의 치료 또는 예방을 요하는 대상체에서 마르부르그바이러스 연관된 병리학을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항의 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 마르부르그바이러스 연관된 병리학을 치료하거나 예방하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 투여는 전기천공 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 마르부르그바이러스 연관된 병리학을 치료하거나 예방하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 마르부르그바이러스 연관된 병리학은 마르부르그바이러스 감염 및 출혈성 열 중 적어도 하나인, 마르부르그바이러스 연관된 병리학을 치료하거나 예방하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 대상체는 마르부르그바이러스 감염의 고위험에 있는, 마르부르그바이러스 연관된 병리학을 치료하거나 예방하는 방법.
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