KR20240010758A - 필로바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 구조체 및 백신, 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

필로바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 구조체 및 백신, 및 이를 사용하는 방법 Download PDF

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데이비드 비 웨이너
데본 쉐드락
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

공통 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 MARV GP 면역원, 공통 에볼라바이러스 수단 필로바이러스 당단백질 SEBOV GP 면역원 및 공통 에볼라바이러스 자이레 당단백질 ZEBOV GP 면역원을 포함하는 공통 필로바이러스 면역원을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 조성물이 기재되어 있다. 코딩 서열은 시그날 서열을 인코딩하는 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 임의로 포함한다. 면역조절 방법 및 필로바이러스, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 기재되어 있다. 필로바이러스 감염, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레에의한 감염을 예방하는 방법 및 필로바이러스 감염, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레에 감염된 개체를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 공통 필로바이러스 단백질이 기재되어 있다.

Description

필로바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 구조체 및 백신, 및 이를 사용하는 방법 {FILOVIRUS CONSENSUS ANTIGENS, NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND VACCINES MADE THEREFROM, AND METHODS OF USING SAME}
본 발명은 면역 반응을 유도하고 필로바이러스 감염을 예방하고/하거나 필로바이러스로 감염된 개체, 특히 마르부르그바이러스(Marburgvirus), 에볼라바이러스 수단(Ebolavirus Sudan) 및 에볼라바이러스 자이레(Ebolavirus Zaire )에 의한 감염을 치료하기 위한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 공통(consensus) 필로바이러스 단백질, 특히 마르부르그 바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레 필로바이러스 단백질 및 이를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
필로비리다에는 2개의 다양한 속, 마르부르그 바이러스 (MARV) 및 에볼라바이러스 (EBOV)를 함유하는 분절화되지 않은, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 각각으로부터의 구성원들은 치유되거나 승인된 백신이 존재하지 않는 심각하고 매우 치명적인 출혈열 질병을 유발할 수 있다[참조: Bradfute S.B., 등 (2011) Filovirus vaccines. Hum Vaccin 7: 701-711; Falzarano D., 등 (2011) Progress in filovirus vaccine development: evaluating the potential for clinical use. Expert Rev Vaccines 10: 63-77; Fields B.N., 등 (2007) Fields' virology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2 v. (xix, 3091, I-3086 p.); Richardson J.S., 등 (2009) Enhanced protection against Ebola virus mediated by an improved adenovirus-based vaccine. PLoS One 4: e5308; 및 Towner J.S., 등 (2006) Marburgvirus genomics and association with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola. J Virol 80: 6497-6516].
90%까지의 치사율로 인하여, 이들은 "세계 보건 기구"에 의해 "사람에게 알려진 가장 치명적인 바이러스 질환 중의 하나"로 기술되어 왔다. 미국 질병관리예방센터(US Centers for Disease Control and Prevention)는 부분적으로 무기화할 경우 국가 안전보장에 대한 이들의 잠재적인 위협으로 인하여 이들을 '범주 A 생물테러제(Category A Bioterrorism Agents)'로 분류하여 왔다(참조: Burki T.K. (2011) USA focuses on Ebola vaccine but research gaps remain. Lancet 378: 389). 이들 '고 우선권' 제제는 이론적으로 용이하게 전파될 수 있고, 높은 사망률을 초래할 수 있으며주요한 공공의 건강 충격 및 공황을 유발할 수 있으며, 공공의 건강 준비를 위한 특수한 작용을 필요로 한다(참조: CDC (2011) Bioterrorism Agents/Diseases. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention).
출혈열 질병은 오염된 체액, 혈액, 및 조직과의 직접적인 접촉에 의해 인간 및 비인간 영장류 중에서 용이하게 전염될 수 있지만, 담체 상태가 없는 급성의 감염성이다[참조: Feldmann H., 등 (2003) Ebola virus: from discovery to vaccine. Nat Rev Immunol 3: 677-685]. 발생 상황(outbreak situation) 동안, 의료 장비의 재사용, 자원이 제한된 건강 보호 시설, 및 궁극적으로 예방 척도의 적용은 질병의 전파를 확대시켜, 의료용 셋팅에서 감염의 증폭을 허용한다.
이들 동물매개 감염 병원균의 천연 저장소는 아프리카 박쥐 및 돼지인 경향이 있으며 [참조: Kobinger G.P., 등 (2011) Replication, pathogenicity, shedding, and transmission of Zaire ebolavirus in pigs. J Infect Dis 204: 200-208], 돼지가 가능하게는 보다 더 증폭 숙주이고, 바이러스가 발생 시기에처음으로 나타나는 방식은 감염된 동물과 접촉한 인간을 통해 발생하는 것으로 고려된다. 이러한 질병의 필리핀, 잠재적으로 유럽, 및 주로 아프리카에서 직면하는 예측치못한 풍토병은 또한 주요 공중 보건 관심을 구성한다[참조: Outbreak news. (2009) Ebola Reston in pigs and humans, Philippines. Wkly Epidemiol Rec 84: 49-50].
설치류 전임상 연구에서의 실험을 포함하는 보호 효능 및 광범위한 CTL을 유도하기 위한 백신의 능력을 측정하기위한 실험이 수행되어 왔다. [참조: Fenimore PW, 등 (2012). Designing and testing broadly-protective filoviral vaccines optimized for cytotoxic T-lymphocyte epitope coverage. PLoS ONE 7: e44769; Hensley LE, 등 (2010). Demonstration of cross-protective vaccine immunity against an emerging pathogenic Ebolavirus Species. PLoS Pathog 6: el000904; Zahn R, 등 (2012)]. Ad35 and ad26 vaccine vectors induce potent and cross-reactive antibody and T-cell responses to multiple filovirus species. PLoS ONE 7: e44115; Geisbert TW, Feldmann H (2011). Recombinant vesicular stomatitis virus-based vaccines against Ebola and Marburg virus infections. J Infect Dis 204 Suppl 3: S1075-1081; 및 Grant-Klein RJ, Van Deusen NM, Badger CV, Hannaman D, Dupuy LC, Schmaljohn CS (2012). A multiagent filovirus DNA vaccine delivered by intramuscular electroporation completely protects mice from ebola and Marburg virus challenge. Hum Vaccin Immunother 8; Grant-Klein RJ, Altamura LA, Schmaljohn CS (2011). Progress in recombinant DNA-derived vaccines for Lassa virus and filoviruses. Virus Res 162: 148-161].
백신-유도된 조정된 면역 반응은 다수의 전임상 동물 모델에서 기술되어 왔다[참조: Blaney JE, 등 (2011). Inactivated or live-attenuated bivalent vaccines that confer protection against rabies and Ebola viruses. J Virol 85: 10605-10616; Dowling W, 등 (2007). Influences of glycosylation on antigenicity, immunogenicity, and protective efficacy of ebola virus GP DNA vaccines. J Virol 81: 1821-1837; Jones SM, 등 (2005). Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses. Nat Med 11: 786-790; Kalina WV, Warfield KL, Olinger GG, Bavari S (2009). Discovery of common marburgvirus protective epitopes in a BALB/c mouse model. Virol J 6 : 132; Kobinger GP, 등 (2006). Chimpanzee adenovirus vaccine protects against Zaire Ebola virus. Virology 346: 394-401; Olinger GG, 등 (2005). Protective cytotoxic T-cell responses induced by Venezuelan equine encephalitis virus replicons expressing Ebola virus proteins. J Virol 79: 14189-14196; Rao M, Bray M, Alving CR, Jahrling P, Matyas GR (2002). Induction of immune responses in mice and monkeys to Ebola virus after immunization with liposome-encapsulated irradiated Ebola virus: protection in mice requires CD4(+) T cells. J Virol 76: 9176-9185; Rao M, Matyas GR, Grieder F, Anderson K, Jahrling PB, Alving CR (1999). Cytotoxic T lymphocytes to Ebola Zaire virus are induced in mice by immunization with liposomes containing lipid A. Vaccine 17: 2991-2998; Richardson JS, 등 (2009). Enhanced protection against Ebola virus mediated by an improved adenovirus-based vaccine. PLoS One 4: e5308; Vanderzanden L, 등 (1998). DNA vaccines expressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethal challenge. Virology 246: 134-144; Warfield KL, 등 (2005). Induction of humoral and CD8+ T cell responses are required for protection against lethal Ebola virus infection. J Immunol 175: 1184-1191; Jones SM, 등 (2007). Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebola virus hemorrhagic fever. J Infect Dis 196 Suppl2: S404-412 Grant-Klein RJ, Van Deusen NM, Badger CV, Hannaman D, Dupuy LC, Schmaljohn CS (2012). A multiagent filovirus DNA vaccine delivered by intramuscular electroporation completely protects mice from ebola and Marburg virus challenge. Hum Vaccin Immunother 8.; Geisbert TW, 등 (2010). Vector choice determines immunogenicity and potency of genetic vaccines against Angola Marburg virus in nonhuman primates. J Virol 84: 10386-10394.] 바이러스 백신은 촉망되는 것으로 밝혀졌으며 주로 재조합체 아데노바이러스 및 수포성 구내염 바이러스를 포함한다. 재조합체 DNA 및 Ag-커플링된 바이러스-유사 입자(VLP) 백신과 같은 비-감염성 전략은 전임상 효능의 수준을 또한 입증하여 왔으며 일반적으로 바이러스계 플랫폼(virus-based platform)보다 더 안전한 것으로 고려된다. 바이러스-특이적인 Ab는, 수동적으로 적용되는 경우, 감염 전 또는 감염 직후에 적용시 보호성일수 있다[참조: Gupta M, Mahanty S, Bray M, Ahmed R, Rollin PE (2001). Passive transfer of antibodies protects immunocompetent and imunodeficient mice against lethal Ebola virus infection without complete inhibition of viral replication. J Virol 75: 4649-4654; Marzi A, 등 (2012). Protective efficacy of neutralizing monoclonal antibodies in a nonhuman primate model of Ebola hemorrhagic fever. PLoS ONE 7: e36192; Parren PW, Geisbert TW, Maruyama T, Jahrling PB, Burton DR (2002). Pre- and postexposure prophylaxis of Ebola virus infection in an animal model by passive transfer of a neutralizing human antibody. J Virol 76: 6408-6412; Qiu X, 등 (2012). Ebola GP-Specific Monoclonal Antibodies Protect Mice and Guinea Pigs from Lethal Ebola Virus Infection. PLoSNegl Trop Dis 6: el575; Wilson JA, 등 (2000). Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus. Science 287: 1664-1666; Sullivan NJ, 등 (2011). CD8(+) cellular immunity mediates rAd5 vaccine protection against Ebola virus infection of nonhuman primates. Nat Med 17: 1128-1131; Bradfute SB, Warfield KL, Bavari S (2008). Functional CD8+ T cell responses in lethal Ebola virus infection. J Immunol 180: 4058-4066; Warfield KL, Olinger GG (2011). Protective role of cytotoxic T lymphocytes in filovirus hemorrhagic fever. J Biomed Biotechnol 2011: 984241]. T 세포는 녹아웃 마우스(knockout mice)에서 수행된 연구, NHP에서 고갈 연구, 및 쥐 입양 전달연구(murine adoptive transfer study)를 기준으로 한 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 효능은 입양으로-전달된 CD8+ T 세포의 분해 기능과 크게 관련되었던 것으로 또한 밝혀졌다. 그러나, 보호성 백신에 의해 구동된 당해 반응의 상세한 분석은 보고되어 있지 않다.
보호조치 발달은 궁극적으로 보호성 면역이 연관되는 것 및 이들이 감염 동안 조절되는 방법의 개선된 이해를 필요로 할 것이다. 이는, 필로바이러스 질병으로 쓰러진 감염된 개체가 조기 면역 반응을 시작하는데 실패하는 경우 어려움을 입증한다. 이러한 신속하게 이동하는 출혈열 질병은 바이러스 특이적인 Ab 반응의 결여 및 전체 T 세포 구성원에 있어서의 큰 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 면역 조절장애를 생성하여 조절되지 않은 바이러스 복제 및 다중-기관 감염 및 부전을 초래한다. 역으로, 에볼라 바이러스(EBOV) 질병의 생존자는 조기 및 일시적인 IgM 반응을 나타내며, 이는증가하는 수준의 바이러스-특이적인 IgG 및 CTL을 빠르게 동반한다. 이러한 관찰은, 체액성 및 세포-매개된 면역 반응이 질병에 대한 보호를 부여하는데 있어 역할을담당함을 제안한다. 이러한 데이터는 또한 치명적인 챌린지(lethal challenge)에 대해 백신-유도된 조정된 면역성의 기여를 입증하는 다수의 전임상 효능 연구에 의해 지지된다. 그러나, 증가하는 증거는 보호를 제공하는데 있어서 T 세포에 대한 중요한 역할을 입증하여 왔으며, 여기서 효능은 CD8+ T 세포의 기능성 표현형과 크게 연관되었다. 이들 최근 연구들이 보호를 제공하는데 있어서 T 세포의 중요성을 강조하고 있지만, 이들의 상세한 기여는 특성화되어 있지 않고 논란이 많다. 더욱이, 보호성 백신에 의해 구동된 당해 반응의 상세한 분석은 거의 보고되지 않아 왔다.
발명의 요약
공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 제공된다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 1(ZEBOV CON), 서열 번호: 1 의 단편, 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 1에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 1의 단편 또는 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산이다. 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 2 (SUDV CON), 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 2의 단편 또는 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산이다. 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 3(MARV ANG), 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 3에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 3의 단편 또는 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 637개 이상, 또는 670개 이상의 아미노산이다. 아미노산 서열은 IgE 선도와 같은 선도 서열을 임의로 포함할 수 있다.
공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 마르부르그 마르부르그 바이러스 제1의 공통 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 마르부르그 마르부르그바이러스 제2의 공통 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 및 마르부르그 마르부르그 바이러스 제3의 공통 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 1(ZEBOV CON), 서열 번호: 1 의 단편, 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 1에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 1의 단편 또는 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산이다. 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 2 (SUDV CON), 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 2의 단편 또는 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산이다. 마르부르그 마르부르그바이러스 제1의 공통 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 4(MARV RAV), 서열 번호: 4의 단편, 서열 번호: 4에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 4에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 4에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 4에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 4의 단편 또는 서열 번호: 4에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 637개 이상, 또는 670개 이상의 아미노산이다. 마르부르그 마르부르그바이러스 제2의 공통 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 5(MARV OZO), 서열 번호: 5의 단편, 서열 번호: 5에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 5에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 5에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호 4에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 5의 단편 또는 서열 번호: 5에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 637개 이상, 또는 670개 이상의 아미노산이다. 마르부르그 마르부르그바이러스 제3의 공통 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 6(MARV MUS), 서열 번호: 6의 단편, 서열 번호: 6에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 6에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 6에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 6에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 6의 단편 또는 서열 번호: 6에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 637개 이상, 또는 670개 이상의 아미노산이다. 아미노산 서열은 IgE 선도와 같은 선도 서열을 임의로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 3(MARV ANG), 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 3에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 3의 단편 또는 서열 번호: 3에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 637개 이상, 또는 670개 이상의 아미노산이다. 아미노산 서열은 IgE 선도와 같은 선도 서열을 임의로 포함할 수 있다.
공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 및 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 1(ZEBOV CON), 서열 번호: 1 의 단편, 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 1에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 1의 단편 또는 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산이다. 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열은 서열 번호: 2 (SUDV CON), 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 1에 대해 상동성인 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 2의 단편 또는 서열 번호: 2에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 전형적으로 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산이다. 아미노산 서열은 IgE 선도와 같은 선도 서열을 임의로 포함할 수 있다.
공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 제공된다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호: 64, 서열 번호: 64의 단편, 서열 번호: 64에 대해 상동성인 핵산 서열, 또는 서열 번호: 64에 대해 상동성인 뉴클레오타이드 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 64에 대해 상동성인 핵산 서열은 서열 번호: 64에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 64의 단편 또는 서열 번호: 64에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 서열 번호: 64에 의해 인코딩된 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산을 전형적으로 인코딩한다. 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호: 65, 서열 번호: 65의 단편, 서열 번호: 65에 대해 상동성인 핵산 서열, 또는 서열 번호: 65에 대해 상동성인 뉴클레오타이드 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 65에 대해 상동성인 핵산 서열은 서열 번호: 65에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 65의 단편 또는 서열 번호: 65에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 서열 번호: 65에 의해 인코딩된 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 600개 이상, 630개 이상, 또는 660개 이상의 아미노산을 전형적으로 인코딩한다. 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호: 66, 서열 번호: 66의 단편, 서열 번호: 66에 대해 상동성인 핵산 서열, 또는 서열 번호: 66에 대해 상동성인 뉴클레오타이드 서열의 단편일 수 있다. 서열 번호: 66에 대해 상동성인 핵산 서열은 서열 번호: 66에 대해 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 99% 이상 상동성이다. 서열 번호: 66의 단편 또는 서열 번호: 66에 대해 상동성인 아미노산 서열의 단편은 서열 번호: 66에 의해 인코딩된 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 600개 이상, 630개 이상, 또는 670개 이상의 아미노산을 전형적으로 인코딩한다. 핵산 서열은 면역원을 인코딩하는 서열에 연결된 IgE 선도와 같은 선도 서열을 인코딩하는 서열을 임의로 포함할 수 있다.
각각의 상이한 핵산 서열은 단일의 핵산 분자 위에 존재할 수 있고, 각각 별도의 핵산 분자 또는 다양한 순위에 존재할 수 있다. 핵산 분자는 플라스미드일 수 있다.
조성물은 전기천공(electroporation)을 사용하여 개체에게 전달하기 위해 제형화될 수 있다.
조성물은 IL-12, IL-15 및 IL-28로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 필로바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용될 수 있다. 필로바이러스는 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
치료학적 유효량의 조성물을 필로바이러스로 진단된 개체에게 투여함을 포함하여 당해 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 필로바이러스는 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
개체에서 필로바이러스 감염을 예방하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 예방학적 유효량의 조성물을 개체에게 투여함을 포함한다. 필로바이러스는 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.
도 1a 내지 도 1c는 실시예 1에서 다가-백신 작제 전략 및 발현 실험에 관한 것이다. 도 1a는 MGP(상단), SGP(하류 우측), 및 ZGP(하류 좌측)에 대한 계통수를 나타낸다. 유의적인 지지값은 부트트랩 분석으로 입증되는 바와 같이 (*)으로 나타낸다. 공통 전략은 ZGP 및 SGP 면역원(CON VACCINE)을 위해 채택하였다. 기준자는 부위당 아미노산의 거리를 나타내며 분석은 MEGA 버전 5 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. GP 이식유전자는 상업적으로 합성되고, 유전적으로 최적화되어 변형된 pVAX1 포유동물 발현벡터내로 아클로닝된다. 항원 발현은 웨스턴 면역블롯팅 및 FACS에 의해 HEK 293T 세포의 형질감염후 분석되었다. 웨스턴 면역블롯팅 결과는 도1b 및, 도 1c의 FACS에서 나타낸다. 비교 대조군을 위해, MGP, SGP, 또는 ZGP를 발현하는 rVSV를 각각의 GP 시료와 동시에 이동시키고 종-특이적인 항-GP1 mAb를 검출에 사용하였다. 크기를 나타낸다(kDa). FACS의 경우, 형질감염된 세포는 마우스-기원한 GP-특이적인 혈청 시약에 이어 완전히 세척하고 염소 항-마우스 IgG 및 MHC 제I 부류로 간접적으로 염색하였다. 웨스턴 면역블롯팅 및 FACS 실험을 유사한 결과와 함께 적어도 3회 반복하였다. 뿌리가 없는 계통수(unrooted phylogenetic tree)는 최대-경향성 방법으로 측정하고 부트스트랩 분석으로 입증하였으며 유의적인 지지값(≥80%; 1,000개의 부트스트랩 반복물)은 MEGA 버전 5 소프트웨어로 측정하였다.
도 2a 내지 도2h는 실시예 1에서의 실험으로부터의 결과를 나타내며, 여기서 MARV 및 ZEBOV 챌린지에 대한 완전한 보호가 관찰되었다. 동물 생존 데이터는 도 2a 및 도 2e에 나타낸다. 도 2a는, 3가의 예방접종된 동물이 MARV 챌린지 후 생존하였지만 대조군 동물은 10일까지 모두죽었음을 나타낸다. 도 2e는, 3가의 예방접종된 동물이 ZEBOV 챌린지 후 생존하였지만 대조군 동물은 7일까지 모두죽었음을 나타낸다. 예방접종된 동물 및 대조군 동물에 대한 체중에 있어서 변화 %에 대한 데이터는 MARV로 예방접종되고 챌린지된 것에 대해 도 2b에서 나타낸다. y 축은 도 2f에 나타낸 것으로서 체중에 있어서의 변화를 나타낸다. 밝은 실선은 3가의 예방접종된 동물에 대한 것이다. 밝은 사선은 TriAVE에 대한 것이며 3가의 예방접종된 동물의 평균 결과이다. 어두운 실선은 대조군 동물에 대한 것이다. 어두운 사선은 대조군 AVE, 대조군 동물에 대한 평균 결과에 대한 것이다. 밝은 실선 및 밝은 사선은 챌린지 후 경과 일수에서 그래프 상에 변화없이 유지되며 이는 예방접종된 동물 중에서 유의적인 체중 손실이 없음을 나타낸다. 단도(dagger)로 끝나는 챌린지 후 0 내지 9일째로부터 그래프 상의 어두운 실선 및 어두운 사선 감소는 10일까지 질병으로 쓰러진 동물을 나타낸다. 예방접종된 동물 및 대조군 동물에 대한 체중에 있어서 변화%에 대한 데이터는 ZEBOV로 예방접종되고 챌린지된 것에 대한 도 2f에 나타낸다. y 축은 백분율로서 체중에 있어서의 변화를 나타낸다. 밝은 실선은 3가의 예방접종된 동물에 대한 것이다. 밝은 사선은 TriAVE에 대한 것이며 3가의 예방접종된 동물의 평균 결과이다. 어두운 실선은 대조군 동물에 대한 것이다. 어두운 사선은 대조군 AVE, 대조군 동물에 대한 평균 결과에 대한 것이다. 밝은 실선 및 밝은 사선은 챌린지 후 경과 일수에서 그래프 상에 변화없이 유지되며 이는 예방접종된 동물 중에서 유의적인 체중 손실이 없음을 나타낸다. 단도로 끝나는 챌린지 후 0 내지 6일째로부터의 그래프에서 어두운 실선 및 어두운 사선 감소는 8일 전에 질병으로 쓰러진 동물을 나타낸다. (gpMARV에 대해 n=3 및 gpZEBOV에 대해 n=6). 결합하는 Ab(도 2c 및 도 2g) 및 NAb(도 2d 및 도 2h)는 제1의(1X) 및 제2의(2X) 면역화 전(Pre) 및 후에 예방접종된 동물로부터의 혈청 속에서 측정하였다. 분석은 혼주된 혈청에서 수행하였다(도 2h). *p < 0.1; ***p < 0.001; ****p < 0.0001.
도 3a 내지 도3c는 중화 Ab의 유도를 입증하는 실시예 1로부터의 결과를 나타낸다 B 세포 반응은 40 μg의 E-DNA 예방접종을 사용한 주사 사이에 3주의 간격으로, 각각 2회의 예방접종 후 20일째에 마우스(n=5/그룹)에서 평가하였다. 도 3a는 ELISA에 의해 측정된 예방접종된(실선) 마우스 또는 방혈전(점선) 마우스로부터의 혈청 GP-특이적인 IgG 반응을 나타낸다. 데이터는 도 3b에 요약한다. pEBOS- 및 pEBOZ-면역화된 동물로부터의 모든 반응은, SGP가 당해 연구에 이용가능하지 않았으므로, 슈크로즈-정제된 ZGP에 대해 측정하였다. pMARV-면역화된 마우스로부터의 IgG 반응을 MARV-오졸린 GP에 대해 또는 음성 대조군 슈크로즈-정제된 니파(Nipah) G 단백질에 대해 측정하였으며, 혈청 시료의 중화 활성은 ZEBOV-EGFP에 대해 측정하였고, BSL-4 시설 및 NAb 역가에 있어서 SUDV-보니페이스(Boniface) 및 MARV-안골라 역가는 도 3c에 나타낸다. SUDV-보니페이스에 대한 Nab는 CV-1 세포에서 세포변성 효과(CPE)를 기준으로 평가하였고 MARV-안골라에 대한 세포변성 효과는 면역형광성 검정을 사용하여 평가하였다. 평균은 도 3b 및 도 3c에 나타내고 오차 바아는 SEM을 나타낸다. 그룹 분석은 일치된, 2개-테일(two-tailed), 쌍을 이루지 않은 t 시험으로 완료하였다. 실험은 유사한 결과 및 *p < 0.1; **p < 0.01;***p<0.001과 함께 적어도 2회 반복하였다.
도 4a 내지 도 4d는 예방접종으로 생성된 광범위한 T 세포 반응을 나타낸다. 도 4a에서 H-2b(밝은 바아) 및 H-2d(어두운 바아) 마우스(n=5/그룹)를 pMARV, pEBOS 또는 pEBOZ DNA로 2회 면역화시키고, IFNγ 반응을 IFNγ ELISPOT 검정으로 측정하였다. 제2의 면역화 후 8일째에 수거한 비장세포를 개개의 GP 펩타이드(9개의 아미노산에 의해 오우버랩된 15-머)의 존재하에서 항온처리하고 결과를 중첩 막대 그래프로 나타낸다. 에피토프를 함유하는 펩타이드를 확인하고(≥10 AVE 스폿 및 ≥80% 반응율), 유동 세포분석기로 확인하며 전체의 활성화된 IFNγ+ 및 CD44+ CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 집단 속에서 특성화하고(표 1 내지 6), 양성 유도인자의 펩타이드 수를 바아 위에 나타낸다. CD4+ 에피토프 단독, CD8+ 에피토프 단독(*), 및 이중 CD4+ 및 CD8+ 에피토프(**) 를 함유하는 펩타이드의 번호를 매긴다. 추정의 공유되고/되거나 부분적인 에피토프를 연속적인 양성 펩타이드 반응에 대해 탐험하였다(표 1 내지 6). 도 4b는 도 1a에 나타낸 MARV, SUDV, 및 ZEBOV 바이러스로부터 GP 서열을 비교하는 아미노산 유사성 플롯을 나타낸다. 도 4c는 ZEBOV GP(진뱅크 #VGP_EBOZM)내의 추정되는 도메인을 나타내는 도표이다. SP, 신호 펩타이드; RB, 수용체 결합; MUC, 무친-유사 영역; FC, 푸린 절단 부위; TM, 막통과영역. 도 4d에서, 전체 아우성(subdominant)(짙은 색조) 및 면역우세(보다 밝은 색조) T 세포 에피토프반응은 각각의 백신에 의해 생성된 전체 IFNγ 반응의 백분율로 나타낸다. 실험은 유사한 결과와 함께 적어도 2회 반복하였다.
도 5a 내지 5d는 보호성의 '단일-투여량' 예방접종 유도된 중화 Ab 및 CTL을 평가하는 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. H-2k 마우스(n=10/그룹)을 pEBOZ E-DNA로 1회 근육내 예방접종한 후 BSL-4 설비 속에서 1,000 LD50의 mZEBOV를 사용하여 28일 후 챌린지하였다. 마우스를 매일 칭량하고 질병 진행에 대해 모니터링하였다. 도 5a에서의 동물 생존 데이터. 예방접종된 동물은 챌린지에서 생존하였지만 대조군 동물은 7일까지 죽었다. 도 5b는 챌린지된 동물에서 체중의 변화%에 대한 데이터를 나타낸다. 면역화된 동물로부터의 데이터는 밝은 실선으로 나타내고; 면역화된 동물에 대한 평균 데이터는밝은 사선으로 나타낸다. 대조군 동물로부터의 데이터는 어두운 실선으로 나타내고; 대조군 동물에 대한 평균 데이터는 어두운 사선으로 나타낸다. 밝은 실선 및 어두운 사선은 챌린지 후 경과일에 그래프상에서 약 85% 내지 120%의 범위 내에서 변함없이 유지되며, 이는 예방접종된 동물 중에 유의적인 체중 감소가 없음을 나타낸다. 단검으로 끝나는 챌린지 후 0 내지 6일째로부터 그래프 상에서 어두운 실선 및 어두운 사선 감소는 7일째까지 질병으로 죽은 동물을 나타낸다. Nab는 챌린지 전 측정하였으며; 데이터는 도 5c에 나타낸다. FACS에 의해 측정된 것으로서 단일의 pEBOZ 면역화 후 T 세포 반응을 도 5d에서 전체 CD44+/IFNγ+ CD4+(어두운) 또는 CD8+(밝은) 세포의 AVE %로서 요약한다. Thl-유형 효과기 마커를 평가하고(TNF 및 T-bet) CD44+/IFNγ+ CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 데이터를 다음과 같은 전체 T 세포 데이터와 비교하였다: 전체 세포의 경우: TNF 2.9±0.8, Tbet 13.0±1.1. CD4+/CD44+/IFNγ+ 세포의 경우: TNF 61.4±3.1, Tbet 72.6±2.0. CD8+/CD44+/IFNγ+ 세포의 경우: TNF 33.0±3.3, Tbet 992.1±1.4 (*p < 0.1; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). 그룹 분석은 일치된, 2개-테일, 쌍을 이루지 않은 t 시험으로 완료하였으며 생존 곡선은 로그-순위(Mantel-Cox) 시험으로 분석하였다. 실험을 유사한 결과로 2회 수행하였고 오차 바아는 SEM을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에 기재된 GP-특이적인 T 세포 게이팅(gating)을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 실시예 1에서 예방접종 실험이 풍부한 T 세포를 생성하였음을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 실시에 1에 기재된 '단일-투여량' 예방접종에 의한 T 세포 유도를 나타낸다.
바람직한 양태의 상세한 설명
본 발명의 하나의 국면에서, 공통 항원이 다음 중 하나 이상을 갖는 것을 포함하는, 개선된 전사 및 해독을 제공하는 것이 바람직하다: 전사를 증가시키기 위한 낮은 GC 함량 선도 서열; mRNA 안전성 및 코돈 최적화; 가능한 정도까지 시스-작용하는 서열 모티프(즉, 내부 TATA-박스)의 제거.
본 발명의 일부 국면에서, 다음 중의 하나 이상을 가짐을 포함하는, 다수의 균주에 걸쳐 광범위한면역 반응을 생성하는 공통 항원을 생성하는 것이 바람직하다: 모든 이용가능한 완전한 길이의 서열의 통합; 각각의 위치에서 가장 일반적으로 존재하는 아미노산을 이용하는 컴퓨터 생성 서열; 및 균주들 사이의 교차-반응성의 증가.
필로비리다에 중에서의 다양성은 비교적 높다. 집중적인 노력은 최대의 인간의 경우-치사율에 관여하는 다수의 종에 대한 보호를 이상적으로 제공할 수 있는 공통이고 광범위한 반응성의 필로바이러스 백신을 개발하는데 목표를 두어 왔다. 그러나, 이는 필로비리다 중에서 비교적 높은 수준의 다양성으로 인한 곤란성을 입증한다. EBOV는 5개의 명확한 종, 자이레 에볼라바이러스 (ZEBOV), 수단 에볼라바이러스 (SUDV), 레스톤(Reston) 에볼라바이러스 (RESTV), 분디부기오(Bundibugyo) 에볼라바이러스 (BDBV) 및 타이 포레스트() 에볼라바이러스 [TAFV; 이전에는 코트 디브와르 (Cote d'Ivoire) 에볼라바이러스]으로 현재 분류되어 있으며, 처음 2개의 바이러스가 최대의 치사율에 관여하며 무기화하기 위한 가장 가능한 후보물이다. 다양성은 마르부르그 바이러스(MARV) 중에서 더 낮으며 이는 90% 이하의 치사율일 수 있다. 현재, 단지 하나의 분류된 종, 마르부르그 마르부르그바이러스 (이전에 레이크 빅토리아 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus))가 존재하지만, 최근 보정은, 이것이 라븐 바이러스(RAVV)를 포함하는 2개의 바이러스를 함유함을 제안한다. 다가-백신 개발을 위한 복잡성에 더하여, MARV 및 EBOV는 고도로 다양성이며, 여기서 뉴클레오타이드 수준에서 약 67%의 다양성이 존재한다. 또한, 필로바이러스 GP 중에서 계통발생 다양성은 또한 매우 높다(전체 82%). 이것은 2007년 BDBV의 최근 출현에 의해 입증되는 바와 같이, 진화하는 필로바이러스의 잠재능을 암시한다. 따라서, 필로비리다에 중에서의 상대적인 다양성으로 인하여, 본 출원인은, 효과적인 다가-필로바이러스 백신의 개발이 면역원성 성분의 콕테일(cocktail)을 필요로 하는 경향이 있을 것이라고 가정하였다.
마르부르그 마르부르그바이러스 (MARV), 자이레 에볼라바이러스 (ZEBOV), 및 수단 에볼라바이러스 (SUDV)에 대한 합성의 다가-필로바이러스 DNA 백신이 개발되었다. 신규한 다가의-필로바이러스 백신은 다중제제 시도를 채택하여, 마르부르그 마르부르그바이러스 (MARV), 수단 에볼라바이러스 (SUDV) 또는 자이레 에볼라바이러스 (ZEBOV)의 엔벨로프 당단백질(GP) 유전자를 인코딩하는 3개의 DNA 플라스미드를 포함하였다. 필로바이러스 백신 후보물로서, 향상된 DNA(DNA)-계 플랫폼은 유전적 최적화 및 전달 기술에서 최근의 진전을 제공하는 많은 장점을 나타낸다[참조: Bagarazzi ML, 등 (2012). Immunotherapy Against HPV16/18 Generates Potent TH1 and Cytotoxic Cellular Immune Responses. Sci Transl Med 4 : 155ral38; Kee ST, Gehl J, W. LE (2011). Clinical Aspects of Electroporation, Springer, New York, NY.; Hirao LA, 등 (2011). Multivalent smallpox DNA vaccine delivered by intradermal electroporation drives protective immunity in nonhuman primates against lethal monkeypox challenge. J Infect Dis 203: 95-102]. 이와 같이, 각각의 GP는 유전적으로-최적화되어, 변형된 포유동물 발현 벡터내로 아클로닝(subcloning)된 후, 생체내 전기천공(EP)을 사용하여 전달된다.
전임상 효능 연구를 기니아 피그 및 마우스에서 설치류-적응된 바이러스를 사용하여 수행하는 한편, 쥐 T 세포 반응을 본원에 기술된 신규한 변형된 검정을 사용하여 집중적으로 분석하였다. 본원에 기술된 에피토프 확인 및 특성화를 위한 신규 방법의 사용을 포함하는, T 세포 반응을 집중적으로 분석하였다. 당해 모델은 존재하는 플랫폼에 적용될 수 있는 보호성 면역 상관관계를 연구하기 위한 중요한 전임상 도구를 제공한다.
전임상 설치류 연구에서 예방접종은 매우 강력한, 유발된 풍부한 중화 항체 (NAbs) 및 CTL 발현 Thl-형 마커이고, MARV 및 ZEBOV 챌린지에 대해 완전히 보호한다. 본원에 기술된 신규한 변형된 검정을 사용하여 집중적으로 분석된 바와 같이 종합적인 T 세포 분석(참조: Shedlock DJ, 등 (2012). Vaccination with synthetic constructs expressing cytomegalovirus immunogens is highly T cell immunogenic in mice. Hum Vaccin Immunother 8: 1668 - 1681) 은 큰크기의, 에피토프 폭의 세포독성 T 림프구, 및 Thl-형 마커 발현을 나타내었다. 전체적으로, 2개의 상이한 마우스 유전적 배경으로부터 52개의 신규한 T 세포 에피토프를 확인하였으며 (20개의 MARV 에피토프 중의 19개, 16개의 SUDV 중 15개, 및 22개의 ZEBOV중 18개) 이들의 각각의 당단백질들(GPs)의 고도로 보존된 영역에서 주로 발생하였다. 이들 데이터는 지금까지 전임상 당단백질 에피토프의 가장 종합적인 보고임을 나타낸다.
최대의 인간 치사율에 관여하는 다수의 종들에 대해 보호를 제공하기 위한 전략을 개발하는데 있어서, 본 발명자들은 MARV, SUDV, 및 ZEBOV에 집중하였다. 이들의 상대적인 다양성으로 인하여, 본 발명자들은, 다가의 필로바이러스 백신의 개발이 미래의발생 균주 및/또는 종에 대한 반응시 신속하고 용이하게 적응될 수 있는 성분들의 콕테일을 필요로 할 수 있다고 가정하였다. EBOV 중에서 전체적인 다양성은 약 33%이지만, 아미노산 동일성은, SUDV 및 ZEBOV를 별도로 분석하는 경우 실질적으로 증가한다(각각의 종 내에서 ~94% 동일성). 따라서, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 대부분의 치사 EBOV에 적용가능한 2개 성분 전략, 즉 SUDV에 대한 하나의 프라스미드 GP 백신 및 ZEBOV에 대한 다른 것을 설계하였다. 각각의 종들 중에서 GP 다양성은 비교적 낮았으므로(SUDV의 경우 5.6% 및 ZEBOV의 경우 7.1%), 공통 면역원을 인플루엔자 및 HIV의 다양한 균주 중에서 보호를 향상시키기 위해 앞서 나타낸 전략인, 증가된 종간 적용 범위를 개발하였다. 이들 GP 서열은 벡터 NTI 소프트웨어(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아 소재)를 사용한 정렬에 의해 측정된 것으로서 모든 보고된 발생 서열(GenBank)에 대해 공통이었다. 비-공통 잔사, SUDV (95, 203, 261, 및 472) 및 ZEBOV (314, 377, 430, 및 440) 각각에서 4개 아미노산을 각각 굴루 및 엠보모/엠반드자에 대해 칭량하였다. 굴루는 어떠한 필로비리다에 발생(n=425)의 최대 인간 경우-치사율에 관여하였으므로, 선택한 반면, 엠보모/엠반드자는 발표된 서열 데이터와 함께 가장 최근의 및 치명적인 발생이었으므로 선택하였다. SUDV (SUDV CON VACCINE) 및 ZEBOV (ZEBOV CON VACCINE)에 대한 공통 GP는 이들의 계통 발생론적으로 중재자인 이들의 모계로 정렬된 균주였다.
도 1a에서 단백질의 확인은 다음과 같다: MARV 두르바(Durba)(05DRC99) '99: ABE27085; 우간다(Uganda)(01Uga07) '07: ACT79229; 두르바(Durba)(07DRC99) '99: ABE27078; 오졸린(Ozolin) '75: VGP_MABVO; 무소케(Musoke) '80: VGP_MABVM; 폽프(Popp) '67: VGP_MABVP; 라이덴(Leiden) '08: AEW11937; 안골라 '05: VGP_MABVA; 라븐(Ravn) '87: VGP_MABVR; 두르바(09DRC99) '99; ABE27092; 우간다(02Uga07) '07: ACT79201. SUDV: 보니페이스(Boniface) '76 : VGP_EBOSB; 말레오(Maleo) '79 : VGP_EBOSM; 얌비오(Yambio) '04 : ABY75325; 굴루(Gulu) '00 : VGP_EBOSU. ZEBOV: 부우에(Booue) '96: AAL25818; 마이보우트(Mayibout) '96: AEK25495; 멜코우카(Mekouka) '94: AAC57989, VGP_EBOG4; 키크위트(Kikwit) '95: VGP_EBOZ5; 얌부쿠(에크론)(Yambuku)(Ekron)) '76: VGP_EBOEC; 얌부쿠(마인가)(Yambuku(Mayinga)) '76: VGP_EBOZM; 카사이(Kasai) '08: AER59712; 카사이 '07: AER59718; 에토움비(Etoumbi) '05 : ABW34742; 엠보모/엠반드자(Mbomo/Mbandza) '03: ABW34743.
이와 함께 제공된 서열 목록은 다음을 포함하는 66개의 서열의 목록을 함유한다
서열 번호: 1은 ZEBOV CON의 아미노산 서열이며, 이는 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이다.
서열 번호: 2는 SUDV CON의 아미노산 서열이며, 이는 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이다.
서열 번호: 3은 MARV 또는 MARV ANG의 아미노산 서열이며, 이는 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 4는 MARV CON1의 아미노산 서열이며, 이는 제1의 공통 마르부르그마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이다.
서열 번호: 5는 MARV CON2의 아미노산 서열이며, 이는 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이다.
서열 번호: 6은 MARV CON3의 아미노산 서열이며, 이는 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이다.
서열 번호: 7 내지 25는 MARV ANG로부터 기원한 펩타이드이다.
서열 번호: 26 내지 41은 SUDV CON으로부터 기원한 펩타이드이다.
서열 번호: 42 내지 62는 ZEBOV CON으로부터 기원한 펩타이드이다.
서열 번호: 63은 IgE 신호 펩타이드: MDWTWILFLVAAATRVHS의 서열이다.
서열 번호: 64는 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 플라스미드 pEBOZ내의 뉴클레오타이드 서열 삽입물이다.
서열 번호: 65는 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 pEBOS 내의 뉴클레오타이드 서열 삽입물이다.
서열 번호: 66은 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질을 인코딩하는 플라스미드 pMARZ ANG내의 뉴클레오타이드 서열 삽입물이다.
일부 구현예에서, 당해 전략은 3개의 필로바이러스 면역원: MARV, SUDV, 및 ZEBOV에 대한 코딩 서열을 사용한다. MARV 면역원은 안골라 2005 분리체의 당단백질이다. SUDV 및 ZEBOV의 경우, 공통 당단백질 서열이 설계되었다.
일부 구현예에서, 당해 전략은 5개의 필로바이러스 면역원에 대한 코딩 서열을 사용한다. 3개의 MARV 면역원이 제공된다. 3개의 집단으로부터 기원한 공통 당단백질 오졸린, 무소케, 또는 라븐을 설계하였다. 이들 3개의 MARV 면역원은 설계된 SUDV 및 ZEBOV 공통 당단백질 서열과 함께 면역반응에 대한 표적이다.
일부 구현예에서, 당해 전략은 6개의 필로바이러스 면역원에 대한 코딩 서열을 사용한다. 4개의 MARV 면역원이 제공된다: 3개의 집단으로부터 기원한 3개의 공통 당단백질이 설계되었다. 이들 3개의 MARV 면역원들은 설계된 SUDV 및 ZEBOV 공통 당단백질 서열과 함께 면역 반응에 대한 표적이고 MARV 면역원은 안골라 2005 분리체의 당단백질이다.
필로바이러스 백신에 대한 후보물로서, DNA 백신은 실온에서 신속하고 저렴한 확대된-규모의 생산, 및 수송의 용이성을 포함하는 다수의 장점을 나타내며, 이들 모두는 경제적이고 지리적인 관점으로부터 이러한 플랫폼을 추가로 향상시킨다. 플라스미드의 합성 특성으로 인하여, Ag 서열은 새로이 출현한 종에 대한 반응시 신속하고 용이하게 변형될 수 있고/있거나 추가의 백신 성분 및/또는 발생 셋팅 동안 신속한 반응에 대한 요법을 포함하도록 확장된다. 예를 들어, 본원의 MARV 전략은 다른 계통발생 클러스터에 대한 공통 MARV GP (MGP) 면역원을 인코딩하는 추가의 플라스미드의 동시-투여에 의해 보다 큰 적용범위를 위해 용이하게 확장될 수 있다.
'제1-세대' DNA 백신이 불량한 면역원성이라고 해도, 최근의 기술적 진전은 임상 시험에서 이들의 면역원성을 현저하게 개선시켰다. 플라스미드 DNA 벡터 및 이들의 인코딩된 Ag 유전자의 최적화는 생체내 면역원성에 있어서의 증가를 초래한다. 세포 흡수 및 후속적인 Ag 발현은, 고도로 농축된 플라스미드 백신 제형을 예방접종 부위 내의 짧은 구형파 전기 펄스를 사용함으로써 플라스미드가 세포를 일시적으로 침투하도록 하는 기술인, 생체내 전기천공으로 투여한다. 이론적으로, DNA 플라스미드의 콕테일은 어떠한 수의 다양한 Ag에 대한 고도로-특수화된 면역 반응을 지시하기 위해 조립될 수 있었다. 면역성은 종-특이적인 사이토킨 유전자를 인코딩하는 플라스미드 분자 아쥬반트(adjuvant)의 동시-전달 및 특수 균주에 대한 성향 백신-유도된 면역성을 돕기 위한 Ag 아미노산 서열의 '공통-가공'에 의해 추가로 지시될 수 있다. 당해 전략은 인플루엔자 바이러스 및 HIV의 다양한 균주 중에서 보호를 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 부분적으로 이들 기술적 진전으로 인하여, 이들 DNA 백신을 포함하는 면역화 요법은 고도로 다능성이고 극도로 주문제작가능하다.
1. 정의
본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확히 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에서 수치적 범위의 설명을 위해, 동일한 정도의 정확성으로 이들 사이에 각각 개재하는 숫자가 명백하게 고려된다. 예를 들면, 6-9의 범위의 경우, 6 및 9 외에도 숫자 7 및 8이 고려되며, 범위 6.0-7.0의 경우, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, 및 7.0이 명백하게 고려된다.
a. 아쥬반트
본원에 사용된 것으로서 "아쥬반트"는 본원에 기술된 DNA 플라스미드 백신에 첨가되어 당해 DNA 플라스미드 및 이후 기술된 인코딩 핵산 서열에 의해 인코딩된 하나 이상의 공통 필로바이러스 면역원의 면역원성을 향상시킬 수 있다.
b. 항체
"항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단쇄 항체, 디아바디(diabody), 이중특이적 항체, 이작용기 항체 및 그의 유도체를 포함하는, 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 또는 단편의 항체, 이의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 상기 항체는 포유동물의 혈청 샘플로부터 분리된 항체, 폴리클로날 항체, 친화도 정제된 항체, 또는 원하는 에피토프 또는 이들로부터 유래된 서열에 대해 충분한 결합 특이성을 나타내는 그의 혼합물일 수 있다.
c. 코딩 서열
본원에서 사용된 바와 같이 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 지칭하는 것을 의미할 수 있다. 코딩 서열은, 핵산이 투여된 개체 또는 포유동물의 세포내에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 성분에 작동적으로 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드 또는 N 말단 메티오닌을 인코딩하는 출발 코돈을 추가로 포함할 수 있다.
d. 보체
본원에 사용된 것으로서 "보체" 또는 "상보성"는, 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이에 왔슨-크릭(Watson-Crick) (예를 들면, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍화를 의미할 수 있음을 의미할 수 있다.
e. 공통 또는 공통 서열
본원에 사용된 것으로서 "공통" 또는 "공통 서열"는 특수 필로바이러스 항원의 다수의 아형의 정렬의 분석을 기준으로 작제된, 합성 핵산 서열, 또는 상응하는 폴리펩타이드 서열을 의미할 수 있으며, 이는 특수한 필로바이러스 항원의 다수의 아형 또는 혈청형에 대한 광범위한 면역성을 유도하는데 사용될 수 있다.
공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원은 서열 번호: 1, 서열번호: 1의 단편, 서열 번호: 1의 변이체 및 서열 번호: 1의 변이체의 단편을 말한다. (ZEBOV 또는 ZEBOV CON 또는 ZEBOV CON 백신). 서열 번호: 1의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 pZEBOV 또는 pEBOZ로 언급될 수 있다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열은 서열 번호: 64, 서열 번호: 64의 단편, 서열 번호: 64의 변이체 및 서열 번호: 64의 변이체의 단편을 포함한다. 플라스미드 pEBOZ는 서열 번호: 64를 포함한다.
공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원은 서열 번호: 2, 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2의 변이체 및 서열 번호: 2의 변이체의 단편을 말한다. (SUDV 또는 SUDV CON 또는 SUDV CON 백신) 서열 번호: 2의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 pSUDV 또는 pEBOS로 언급될 수 있다. 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열은 서열 번호: 65, 서열 번호: 65의 단편, 서열 번호: 65의 변이체 및 서열 번호: 65의 변이체의 단편을 포함한다. 플라스미드 pEBOS는 서열 번호: 65를 포함한다.
마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질은 공통이 아니지만 분리체로부터 기원한 단백질 서열이다. 이는 서열 번호: 3의 서열을 갖는다. 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원은 서열 번호: 3, 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3의 변이체 및 서열 번호: 3의 변이체의 단편을 말한다. (MARV 또는 MARV ANG 또는 MARV ANG 또는 MARV ANG 백신) 서열 번호: 3의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 pMARV 또는 pMARV-ANG로서 언급될 수 있다. 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원에 대한 코딩 서열은 서열 번호: 66, 서열 번호: 66의 단편, 서열 번호: 66의 변이체 및 서열 번호: 66의 변이체의 단편을 포함한다. 플라스미드 pMARV ANG는 서열 번호: 66을 포함한다.
제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원은 서열 번호: 4, 서열 번호: 4의 단편, 서열 번호: 4의 변이체 및 서열 번호: 4의 변이체의 단편을 말한다. 서열 번호: 4는 라븐 집단 공통 (라븐, 두르바(09DRC99) 및 우간다(02Uga07Y)로부터의 마르부르그 마르부르그바이러스 공통 서열이다. (MARV CON1 또는 MARV-RAV CON 또는 MARV-RAV CON 백신) 서열 번호: 4의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 pMARV-RAV로서 언급될 수 있다.
제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원은 서열 번호: 5, 서열 번호: 5의 단편, 서열 번호: 5의 변이체 및 서열 번호: 5의 변이체의 단편을 말한다. 서열 번호: 5는 오졸린 집단 공통 (오졸린, 우간다(01Uga07), 및 두르바(05 및 07DRC99))로부터의 마르부르그 마르부르그바이러스 공통 서열이다. (MARV CON2 또는 MARV-OZO CON 또는 MARV-OZO CON 백신) 서열 번호: 5의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 pMARV-OZO로 언급될 수 있다.
제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원은 서열 번호: 6, 서열 번호: 6의 단편, 서열 번호: 6의 변이체 및 서열 번호: 6의 변이체의 단편을 말한다. 서열 번호: 6은 무소케 집단 공통 (무소케, 폽프, 및 라이덴)로부터의 마르부르그 마르부르그바이러스 공통 서열이다. (MARV CON1 또는 MARV-MUS CON 또는 MARV-MUS CON 백신) 서열 번호: 6의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드는 pMARV-MUS로서 언급될 수 있다.
f. 정전류
본원에서 사용된 바와 같이 "정전류"는 조직에 전달된 전기적 펄스의 지속시간 동안, 조직 또는 상기 조직을 한정하는 세포가 받거나 경험하는 전류를 정의한다. 상기 전기적 펄스는 본원에서 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 본원에 제공된 전기천공 장치가 바람직하게는 즉각적인 피드백을 갖는 피드백 요소를 갖기 때문에, 이 전류는 전기적 펄스의 존재 동안 상기 조직에서 일정한 암페어수를 유지한다. 상기 피드백 요소는 펄스의 지속시간 내내 조직(또는 세포)의 저항성을 측정할 수 있고 전기천공 장치가 그의 전기적 에너지 출력을 변경하게 할 수 있어서 (예를 들면, 전압 증가), 동일한 조직 내의 전류는 전기 펄스 내내 (대략 마이크로초), 및 펄스 내내 일정하게 유지된다. 일부 구현예에서, 상기 피드백 요소는 컨트롤러를 포함한다.
g. 전류 피드백 또는 피드백
본원에서 사용된 바와 같이 "전류 피드백" 또는 "피드백"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 제공된 전기천공 장치의 활성 반응을 의미할 수 있으며, 이는 전극 사이의 조직 내 전류를 측정하고, 전류를 일정한 수준으로 유지하기 위해 EP 장치에 의해 전달된 에너지 출력을 변경하는 것을 포함한다. 이 일정한 수준은 펄스 시퀀스 또는 전기적 처리의 개시 전에 사용자에 의해 미리 조정된다. 상기 피드백은, 내부의 전기적 회로가 전극 사이의 조직 내 전류를 지속적으로 모니터링하고 상기 모니터링된 전류 (또는 조직 내의 전류)를 미리 조정된 전류와 비교하고 상기 모니터링된 전류를 미리 조정된 수준으로 유지시키기 위해 에너지-출력을 지속적으로 조절하므로, 상기 피드백은 상기 전기천공 장치의 전기천공 성분, 예컨대 컨트롤러에 의해 달성될 수 있다. 상기 피드백 루프는, 아날로그 폐루프 피드백이므로, 즉각적일 수 있다.
h. 분산된 전류
본원에서 사용된 바와 같이 "분산된 전류"는 본원에서 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달된 전기적 전류의 패턴을 의미할 수 있으며, 여기서 상기 패턴은 전기천공될 조직의 임의의 영역 상에서 전기천공 관련된 열 스트레스의 발생을 최소화하거나 바람직하게는 제거한다.
i. 전기천공
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "전기천공," "전기-투과화," 또는 "전기-동력학 향상"("EP")은 바이오-막에 현미경적 경로 (기공)를 유도하기 위해 막통과 전기장을 사용하는 것을 지칭할 수 있으며, 이들의 존재는 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온, 및 물과 같은 생체분자가 세포성 막의 한쪽 면으로부터 다른 쪽 면으로 지나가게 한다.
j. 피드백 기전
본원에서 사용된 바와 같이 "피드백 기전"은 소프트웨어 또는 하드웨어 (또는 펌웨어)에 의해 수행되는 공정을 지칭할 수 있고, 이 공정은 원하는 조직의 임피던스를 받고, 이를 현재의 값, 바람직하게는 전류와 비교하고(에너지의 펄스의 전달 전, 동안, 및/또는 이후), 미리조정된 값을 달성하기 위해 전달된 에너지의 펄스를 조절한다. 피드백 기전은 아날로그 폐루프 회로에 의해 수행될 수 있다.
k. 단편
"단편"은 특수한 필로바이러스 항원을 인지함으로써 필로바이러스에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 필로바이러스 면역원의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 필로바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원은, 각 경우에 1번 위치에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없는, 본원에 설정된 공통 서열에 대해 98% 이상 상동성인 단백질, 본원에 설정된 공통 서열에 대해 99% 이상 상동성인 단백질, 및 본원에 설정된 공통 서열에 대해 100% 동일한 단백질을 임의로 포함할 수 있다. 단편은 예를 들면, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 신호 펩타이드 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드에 연결된 필로바이러스 면역원의 단편을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
각 경우에 1번 위치에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없는 ZEBOV CON, SUDV CON, MARV ANG, MARV-RAV CON, MARV-OZO CON 또는 MARV-MUS CON 또는 이의 변이체의 단편은 특수한 완전한 길이의 ZEBOV CON, SUDV CON, MARV ANG, MARV-RAV CON, MARV-OZO CON 또는 MARV-MUS CON 또는 이의 변이체의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 각각의 경우에 1번 위치에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없는, 서열 ZEBOV CON, SUDV CON, MARV ANG, MARV-RAV CON, MARV-OZO CON 또는 MARV-MUS CON에 대해 100% 동일한 단편 폴리펩타이드를 말한다. 단편은 또한, 각 경우에 1번 위치에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없는, 변이체의 단편, 즉, 서열 ZEBOV CON, SUDV CON, MARV ANG, MARV-RAV CON, MARV-OZO CON 또는 MARV-MUS CON에 대해 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 펩타이드를 말한다. 단편은 서열 번호: 1 내지 6에 설정된 필로바이러스 면역원에 대해 98% 이상 상동성이거나, 99% 이상 상동성이거나, 100% 동일한 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있으며 상동성 백분율을 계산하는 경우 포함되지 않는 면역글로불린 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1 내지 6의 단편은 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 신호 펩타이드 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드에 연결된다. 단편은 N 말단 메티오닌을 포함하는 서열 번호: 1 내지 6의 단편을 포함할 수 있다. 단편은 또한 서열 번호: 1 내지 6에 기재된 서열에 대해 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 폴리펩타이드의 단편을 말한다. 신호 펩타이드가 존재하는 경우, 이는 상동성 백분율의 계산 시 포함되지 않는다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 1 내지 6의 단편 또는 이의 단편은 서열 번호: 1 내지 6 중의 어느것의 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670개 이상의 연속된 아미노산 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1 내지 6의 단편 또는 이의 변이체는 서열 번호: 1 내지 6 중의 어느 것의 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 675개 이하의 연속된 아미노산 또는 이의 변이체를 포함한다.
"단편"은 또한 필로바이러스 면역원을 인코딩하는 핵산 서열의 단편, 특수한 필로바이러스 항원을 인식함으로써 필로바이러스에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 필로바이러스 면역원의 단편을 인코딩하는 핵산 단편을 의미할 수 있다. 각 경우에 1번 위치에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있거나 없는, 필로바이러스 면역원 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 단편의 단편은 필로바이러스 면역원 또는 이의 변이체를 인코딩하는 특수한 완전한 길이의 핵산 서열의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 서열 번호: 1 내지 6에 설정된 필로바이러스 면역원에 대해 98% 이상 상동성이거나, 99% 이상 상동성이거나, 100% 동일한 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편을 포함할 수 있고 상동성 백분율 계산시 포함되지 않는 면역글로불린 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1 내지 6의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편은 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면, IgE 신호 펩타이드 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드에 연결된다. 신호 펩타이드의 코딩 서열이 존재하며 이는 상동성 백분율 계산시 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1 내지 6 또는 이의 변이체 의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편은 서열 번호: 1 내지 6 중 어느 것 또는 이의 단편의 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670개 이상의 연속된 아미노산을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1 내지 6 또는 이의 변이체의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편은 서열 번호: 1 내지 6 중의 어느것 또는 이의 변이체의 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 675개 이하의 연속된 아미노산을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단편은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66의 단편이다. 각각의 경우에 1번 위치에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 존재하거나 존재하지 않는 서열 번호: 64, 서열 번호: 65 또는 서열 번호: 66의 단편은 필로바이러스 면역원 또는 이의 변이체를 인코딩하는 특수한 완전한 길이의 핵산 서열의 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 서열 번호: 64, 서열 번호: 64, 또는 서열 번호: 66의 단편은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66에 의해 암호화된 필로바이러스 면역원에 대해 98% 이상 상동성이거나, 99% 이상 상동성이거나, 100% 동일한 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편을 포함할 수 있으며 상동성 백분율의 계산시 포함되지 않는 면역글로불린 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66의 단편은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66 또는 이의 변이체의 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670개 이상이 연속된 아미노산을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66의 단편은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66 또는 이의 변이체의 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 675개 이하의 연속된 아미노산을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
l. 동일한
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 본원에서 사용된 바와 같이, "동일한" 또는 "동일성"는 상기 서열이 명시된 영역에 대해 동일한 명시된 백분율의 잔기를 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 상기 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 대해 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 상기 일치된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이이거나 상기 정렬이 하나 이상의 어긋난(staggered) 말단을 생성하고 비교하는 상기 명시된 영역이 단지 하나의 서열을 포함하는 경우, 하나의 서열의 잔기들이 분모에 포함되지만 계산의 분자에 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 동등한 것으로 고려될 수 있다. 동일성은 수작업으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
m. 임피던스
본원에서 사용된 바와 같이 "임피던스"는 피드백 기전을 논의할 때 사용될 수 있으며, 옴의 법칙(Ohm's law)에 따라 전류 값으로 변환될 수 있어서 미리 조정된 전류와 비교할 수 있다.
n. 면역 반응
본원에 사용된 것으로서 "면역 반응"는 제공된 DNA 플라스미드 백신을 통해 하나 이상의 필로바이러스 공통 항원의 도입에 대한 반응시, 숙주의 면역 반응, 예를 들면, 포유동물의 면역 반응의 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응의 형태, 또는 둘다의 형태일 수 있다.
o. 핵산
본원에 사용된 바와 같이 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체들이 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이중가닥 및 단일가닥 서열 둘 다의 일부을 함유할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 모두, RNA, 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
p. 작동적으로 연결된
본원에 사용된 것으로서 "작동적으로 연결된"는, 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 이의 제어 하에 있는 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 간의 거리는, 프로모터가 유도된 유전자 내에서 그것이 제어하는 프로모터와 유전자 간의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
q. 프로모터
본원에서 사용된 바와 같이 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연적으로-유도된 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 더 향상시키고/시키거나 이의 공간 발현 및/또는 일시적 발현을 변경하는 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위(distal) 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위로부터 수천개의 염기쌍 정도로 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기와 관련하여, 또는 발현이 일어나는 발달 단계와 관련하여, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제와 같은 외부 자극에 대한 반응으로, 항시적으로, 또는 차별적으로 유전자 구성요소의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
r. 엄격한 혼성화 조건
본원에서 사용된 바와 같이 "엄격한 혼성화 조건"는 핵산의 복합 혼합물에서와 같이, 제1 핵산 서열 (예를 들면, 프로브)이 제2 핵산 서열 (예를 들면, 표적)에 혼성화할 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특수한 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 5-10 ℃ 낮도록 선택할 수 있다. Tm는 평형시 표적 서열에 혼성화하는 표적에 대해 프로브의 50%가 상보성인 온도(정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도하에서)일 수 있다(표적 서열이 과량으로 존재하는 경우, Tm에서, 프로브의 50%가 평형에 관여한다). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 나트륨 이온, 예를 들면, 약 0.01 내지 1.0M의 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예를 들면, 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 30 ℃고 긴 프로브(예를 들면, 약 50개 이상의 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 60 ℃인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호가 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42 ℃, 또는, 5x SSC, 1% SDS에서 항온처리, 65 ℃에서 항온처리, 및 65 ℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS 속에서 세척.
s. 실질적으로 상보적
본원에서 사용된 바와 같이 "실질적으로 상보적"는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해 제1 서열이 제2 서열의 보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 상기 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 것을 의미할 수 있다.
t. 실질적으로 동일한
본원에서 사용된 바와 같이 "실질적으로 동일한"는, 만약 제1 서열이 제2 서열의 보체에 실질적으로 상보적이면, 제1 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해 또는 핵산에 대해, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
u. 변이체
핵산과 관련하여 본원에 사용된 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이의 보체, 또는 이에 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예를 들면, 친수성, 전하를 띠는 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 치환하는 것은 전형적으로 작은 변화를 수반하는 것으로 당해 기술분야에서 인식된다. 이들 작은 변화는 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려함으로써, 부분적으로 확인될 수 있다[참조: Kyte 등, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)]. 아미노산의 상기 수치요법 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치요법 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다는 것이 당해기술분야에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 수치요법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 야기할 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩타이드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 매우 상관관계이 있다고 보고된 유용한 수단인, 상기 펩타이드의 가장 큰 국소적 평균 친수성의 계산을 가능하게 한다. 전문이 참고로 본원에 통합된, 미국 특허 제4,554,101호. 친수성 값이 유사한 아미노산의 치환은 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성을 유지하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산을 사용하여 수행할 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다는 당해 아미노산의 특수한 측쇄에 의해 영향받는다. 이러한 관찰과 일치하여, 생물학적 기능과 혼용성인 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 나타나는 바와 같이, 아미노산의 상대적 유사성, 및 특히 이들 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다. 변이체는 바람직하게는 서열 번호: 1 내지 6에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상또는 99% 이상까지 상동성이다.
동일한 특수 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열과 관련하여 "변이체"는 상이한 코돈의 사용에 의해 뉴클레오타이드 서열에 있어서 상이하다. 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66에 의해 인코딩된 것과 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66의 변이체는 특정 정도의 상동성, 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는, 전형적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 아미노산 서열를 지닌 참조 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산을 지닌 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66에 의해 인코딩된 단백질의 변이체인 단백질을 인코딩하는 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66의 변이체일 수 있다.
v. 벡터
본원에 사용된 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제되는 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈내로 통합되는 벡터일 수 있다.
2. 단백질
특수한 필로바이러스 항원의 다수의 아형 또는 혈청형에 대해 광범위한 면역성을 유도하는데 사용될 수 있는 필로바이러스 면역원이 본원에 제공된다. 공통 필로바이러스 항원은 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 MARV RAV 면역원의 공통 아미노산 서열, 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 MARV OZO 면역원의 공통 아미노산 서열, 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 MARV MUS 면역원의 공통 아미노산 서열, 마르부르그바이러스 필로바이러스 당단백질 MARV ANG 면역원의 분리체 아미노산 서열, 자이레 에볼라바이러스 당단백질 ZEBOV 면역원의 공통 아미노산 서열 및 수단 에볼라바이러스 당단백질 SUDV 면역원의 공통 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원은 면역글로불린 단백질, 예를 들면, IgE 신호 펩타이드 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 상이한 단백질로부터의 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
면역원에 대한 아미노산 서열은 임의로 예를 들면, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 포함하는, 서열 번호: 1 내지 6, 이의 변이체 및 서열 번호: 1 내지 6의 단편 및 이의 변이체를 포함한다.
3. 단백질을 인코딩하는 코딩 서열
본원에 설정된 단배질을 인코딩하는 코딩 서열은 통상의 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 제공되며 제1의 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열, 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 기재된 아미노산 서열을 기준으로 생성시킬 수 있다.
핵산 서열은 완전한 길이의 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 완전한 길이의 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 완전한 길이의 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 완전한 길이의 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 완전한 길이의 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 또는 완전한 길이의 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65 또는 서열 번호: 66을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 예를 들면, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열을 임의로 포함할 수 있다.
핵산 서열은 완전한 길이의 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편, 완전한 길이의 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편, 완전한 길이의 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편, 완전한 길이의 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편, 완전한 길이의 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편, 또는 완전한 길이의 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편을 인코딩할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 단편을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65 또는 서열 번호: 66의 단편을 포함할 수 있다. 단편 크기는 "단편" 표제의 단락에 설정된 바와 같이 본원에 기재되어 있다. 핵산 서열은 예를 들면, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같이 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열을 임의로 포함할 수 있다.
핵산 서열은 완전한 길이의 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대해 상동성인 단백질, 또는 완전한 길이의 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원에 대해 상동성인 단백질을 인코딩할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6에 대해 상동성인 단백질을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65 또는 서열 번호: 66에 대해 상동성일 수 있다. 상동성 정도는 변이체에 대해 언급한 단락에서와 같이 본원에 논의되어 있다. 핵산 서열은 예를 들면, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열을 임의로 포함할 수 있다.
핵산 서열은 완전한 길이의 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편에 대해 상동성인 단백질, 완전한 길이의 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편에 대해 상동성인 단백질, 또는 완전한 길이의 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 단편에 대해 상동성인 단백질을 인코딩할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6의 단편에 대해 상동성인 단백질을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 서열 번호: 64, 서열 번호: 65 또는 서열 번호: 66에 대해 상동성인 단편을 포함할 수 있다. 상동성 정도는 변이체에 대해 언급한 단락에서와 같이 본원에 논의되어 있다. 핵산 서열은 예를 들면, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열을 임의로 포함할 수 있다.
서열 번호: 64는 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 플라스미드 pEBOZ내의 뉴클레오타이드 서열 삽입물이다.
서열 번호: 65는 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 pEBOS 내의 뉴클레오타이드 서열 삽입물이다.
서열 번호: 66은 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질을 인코딩하는 플라스미드 pMARZ ANG내의 뉴클레오타이드 서열 삽입물이다.
4. 플라스미드
플라스미드는 필로단백질에 대해 면역 반응을 유발할 수 있는 합성의, 공통 항원을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 상기 논의한 각종 항원들 중의 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
단일의 플라스미드는 단일의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열, 2개의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열, 3개의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열, 4개의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열, 5개의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열 또는 6개의 필로 단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 단일의 플라스미드는 함께 제형화될 수 있는 단일의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 IL-12, IL-15 및/또는 IL-28을 인코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다.
플라스미드는 코딩 서열의 상류일 수 있는, 개시 코돈, 및 코딩 서열의 하류일 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 상기 개시 및 종료 코돈은 코딩 서열과 틀이 맞을 수 있다.
상기 플라스미드는 또한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 유인원 바이러스 40 (SV40), 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 예컨대 소 면역결핍 바이러스 (BIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈증 바이러스 (ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 전초기 프로모터, 엡슈타인 바르 바이러스 (EBV) 프로모터, 또는 루(Rous) 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 유래의 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 또한 인간 유전자, 예컨대 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오네인 유래의 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 또한 천연 또는 합성의, 근육 또는 피부 특이적인 프로모터와 같은 조직 특이적인 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 이의 전문의 내용이 본원에 참조로 통합된 미국 특허원 공보 제 US20040175727호에 기술되어 있다.
상기 플라스미드는 코딩 서열의 하류일 수 있는, 폴리아데닐화 신호를 또한 포함할 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 상기 SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, San Diego, CA) 유래의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
상기 플라스미드는 또한 코딩 서열의 상류에 인핸서를 포함할 수 있다. 상기 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, FMDV, RSV 또는 EBV일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 미국 특허 제 5,593,972호, 제5,962,428호, 및 제WO94/016737호에 기술되어 있으며, 각각의 내용은 참조로 완전히 통합된다.
상기 플라스미드는 또한 포유동물 복제 기원을 포함함으로써 플라스미드를 염색체외적으로 유지시켜 세포내에서 플라스미드의 다중 카피를 생산할 수 있다. 상기 플라스미드는 Invitrogen (San Diego, CA)으로부터의 pVAX1, pCEP4 또는 pREP4일 수 있으며, 이는 엡슈타인 바르 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함할 수 있고, 이는 통합없이 고 카피의 에피솜 복제를 생산할 수 있다. 상기 플라스미드의 골격은 pAV0242일 수 있다. 상기 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5 (Ad5) 플라스미드일 수 있다.
상기 플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있으며, 이는 플라스미드가 투여되는 세포 내에서의 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다. 상기 코딩 서열은 숙주세포에서 코딩 서열의 보다 효율적인 전사를 가능하게 할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
상기 코딩 서열은 또한 Ig 선도 서열을 포함할 수 있다. 상기 선도 서열은 코딩 서열의 5'일 수 있다. 이 서열에 의해 인코딩된 공통 항원은 N-말단 Ig 선도 다음으로 공통 항원 단백질을 포함할 수 있다. 상기 N-말단 Ig 선도는 IgE 또는 IgG일 수 있다.
상기 플라스미드는 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이)내에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있는, pSE420(Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 상기 플라스미드는 또한 효모의 사카로마이세스 세레비시애 균주에서의 단백질 생산에 사용될 수 있는, pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 상기 플라스미드는 또한 곤충 세포 내에서 단백질 생산에 사용될 수 있는, MAXBACTM 완전 바쿨로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 상기 플라스미드는 또한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포 내에서 단백질 생산에 사용될 수 있는, pcDNA I 또는 pcDNA3(Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다.
5. 조성물
핵산 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 단일의 플라스미드와 같은 단일의 핵산 분자의 다수의 카피, 2개 이상의 상이한 플라스미드와 같은 2개 이상의 상이한 핵산 분자의 복수의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 핵산 분자 복수를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 상이한 플라스미드 복수를 포함할 수 있다.
조성물은 하나 이상의 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단일의 필로단백질 면역원에 대한 코딩 서열을 총괄적으로 함유하는, 플라스미드와 같은 핵산 분자를 포함할 수 있다.
조성물은 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원; 또는 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질; 또는 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원; 또는 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 각각의 필로단백질 면역원에 대한 각각의 코딩 서열은 바람직하게는 별개의 플라스미드 위에 포함된다. 따라서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물은 단일 플라스미드 상에 존재할 수 있지만 바람직하게는 2개의 별개의 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물은 어떠한 순열의 단일의 플라스미드 또는 2개의 플라스미드 상에 존재할 수 있지만 바람직하게는 3개의 별개의 플라스미드 상에 존재한다. 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물은 단일의 플라스미드 또는 어떠한 순열의 2개의 플라스미드, 또는 어떠한 순열의 3개의 플라스미드 도는 어떠한 순열의 4개의 플라스미드 상에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 5개의 별개의 플라스미드 상에 존재한다. 유사하게, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물은 단일의 플라스미드 또는 어떠한 순열의 2개의 플라스미드, 또는 어떠한 순열의 3개의 플라스미드 또는 어떠한 순열의 4개의 플라스미드 또는 어떠한 순열의 5개의 플라스미드 상에 존재할 수 있지만 바람직하게는 6개의 별개의 플라스미드 상에 존재한다.
6. 백신
포유동물에서 필로바이러스, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및/또는 에볼라바이러스 자이레에 대해 면역 반응을 생성할 수 있는 백신이 본원에 제공된다. 백신은 위에서 논의한 바와 같은 각각의 플라스미드를 포함할 수 있다. 상기 백신은 복수의 플라스미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 백신은 치료학적 또는 예방학적 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다.
백신은 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 백신은 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 백신은 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 백신은 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질, 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 백신은 바람직하게는 플라스미드를 포함하는 조성물이다.
백신은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제는 비히클, 아쥬반트, 담체, 또는 희석제로서 기능적 분자일 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제는 형질감염 촉진제일 수 있으며, 이는 계면 활성제, 예컨대 면역-자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 아쥬반트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진제를 포함할 수 있다.
상기 형질감염 촉진제는 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중양이온, 또는 지질이다. 상기 형질감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이며, 더욱 바람직하게는, 상기 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 백신 내에 존재한다. 상기 형질감염 촉진제는 또한 계면 활성제, 예컨대 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 아쥬반트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 및 히알루론산을 포함할 수 있고, 히알루론산이 상기 유전적 컨스트럭트와 함께 투여되어 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 플라스미드 백신은 또한 형질감염 촉진제, 예컨대 지질, DNA-리포좀 혼합물 (예를 들면 W09324640 참고)로서 레시틴 리포좀 또는 본 기술분야에 공지된 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질감염 촉진제는 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중양이온, 또는 지질이다. 백신 중의 형질감염제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.
약제학적으로 허용되는 부형제는 하나 이상의 아쥬반트일 수 있다. 아쥬반트는 동일하거나 대체의 플라스미드로부터 발현된 다른 다른 유전자일 수 있거나 백신 속에 상기 플라스미드와 함께 단백질로서 전달된다. 하나 이상의 아쥬반트는 단백질 및/또는 CCL20, α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 기원한 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자(EGF), 피하 T 세포-유집 케모킨(CTACK), 상피 가슴샘-발현된 케모킨(TECK), 점막-관련 상피 케모킨(MEC), IL-12, 신호 서열 또는 결실된 신호 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 갖고, IgE로부터의 것과 같은 상이한 신호 펩타이드 또는 IgE, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-lα, MIP-1β, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능성 단편, 또는 이의 조합과 같은 상이한 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열을 임의로 포함하는 IL-15를 포함하는 IL-15로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질을 인코딩하는 핵산 분자일 수 있다. 일부 구현예에서 아쥬반트는 하나 이상의 단백질 및/또는 CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 또는 RANTES로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질을 인코딩하는 핵산 분자일 수 있다. IL-12 구조체 및 서열의 예는 PCT 특허원 제PCT/US1997/019502호 및 상응하는 미국 출원 일련번호 제08/956,865호, 및 2011년 12월 12일자로 출원된 미국 가특허원 제61/569600호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 참조로 본원에 통합되어 있다. IL-15 구조체 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US04/18962호 및 상응하는 미국 출원일련번호제10/560,650호, 및 PCT 출원 제PCT/US07/00886호 및 상응하는 미국 출원 일련 번호 제12/160,766호, 및 PCT 출원 제PCT/US10/048827호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참조로 통합되어 있다. IL-28 구조체 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US09/039648호 및 상응하는 미국 출원 일련번호 제12/936,192호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참조로 통합되어 있다. RANTES 및 다른 구조체 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US1999/004332호 및 상응하는 미국 출원 일련 번호 제09/622452호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참조로 통합되어 있다. RANTES 구조체 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US11/024098호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합되어 있다. RANTES 및 다른 구조체 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US1999/004332호 및 상응하는 미국 출원 일련 번호 제09/622452호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합되어 있다. RANTES 구조체 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US11/024098호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합되어 있다. 케모킨 CTACK, TECK 및 MEC 구조체 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US2005/042231호 및 상응하는 미국 출원 일련번호 제11/719,646호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합되어 있다. OX40 및 다른 면역조절인자의 예는 미국 출원 일련번호 제10/560,653호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합되어 있다. DR5 및 다른 면역조절인자의 예는 미국 출원 일련번호 제09/622452호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 통합되어 있다.
백신은, 본원에 전문이 참조로 통합되어 있는, 1994년 4월 1일자로 출원된 미국 일련번호 제021,579호에 기술된 바와 같은 유전 백신 촉진인자 제제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 백신은 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 더 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램의 양의 공통 항원 및 플라스미드를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램, 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램, 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램, 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램, 약 1 내지 약 350 마이크로그램, 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 이의 공통 항원 또는 플라스미드를 함유한다.
상기 백신은 사용될 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 백신 약제학적 조성물은 멸균되고, 발열물질이 없고 미립자가 없을 수 있다. 등장성 제형 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스를 포함할 수 있다. 상기 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충된 염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다중양이온 또는 다중음이온과 같은 안정화제는 상기 백신 제형에 대해 연장된 기간 동안 실온 또는 주위 온도에서 제형을 안정화시킬 수 있다.
7. 백신의 전달 방법
이에 대해 면역 반응이 유도될 수 있는, 필로바이러스, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및/또는 에볼라바이러스 자이레의 면역원에 대해 특히 효과있도록 하는 에피토프를 포함하는 공통 항원의 유전 구조체 및 단백질을 제공하기 위한 백신을 전달하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 백신을 전달하는 방법 또는 예방접종은 치료학적 및 예방학적 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 예방접종 공정은 포유동물에서 필로바이러스, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및/또는 에볼라바이러스 자이레에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 백신은 포유동물의 면역계의 활성을 조절하고 면역 반응을 향상시키기 위해 전달될 수 있다. 백신의 전달은 세포내에서 발현되고 세포 표면으로 전달될 때 면역계가 인식하여 세포성, 체액성, 또는 세포성 및 체액성 반응을 유도하는 핵산 분자로서 공통 항원의 형질감염일 수 있다. 백신의 전달은 포유동물에게 위에서 논의한 바와 같은 백신을 투여함으로써 필로바이러스, 특히마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및/또는 에볼라바이러스 자이레에 대해 포유동물내 면역 반응을 유도하거나 유발하는데 사용될 수 있다.
백신 및 플라스미드를 포유동물의 세포내로 전달 시, 형질감염된 세포는 백신으로부터 주사된 플라스미드 각각에 대한 공통 항원을 발현하여 분비할 것이다. 당해 단백질은 면역계에 의해 외부인자로 인식될 것이며 항체가 이에 대해 제조될 것이다. 당해 항체는 면역계에 의해 유지될 것이며 필로바이러스, 특히 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및/또는 에볼라바이러스 자이레에 의한 후속적인 감염에 대해 효과적인 반응을 허용할 것이다.
백신은 포유동물에서 면역 반응을 유발하기 위해 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 영장류, 비-인간 영장류, 젖소, 소, 양, 염소, 영양, 들소, 물소, 들소, 소과, 사슴, 헤지혹(hedge hog), 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 랫트, 및 닭일 수 있다.
a. 조합 치료
백신은 다른 단백질 및/또는 CCL20, α-인터페론, γ-인터페론, 혈소판 기원한 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유집 케모킨(CTACK), 상피 가슴샘-발현된 케모킨(TECK), 점막-관련된 상피 케모킨(MEC), IL-12, 결실된 신호 서열을 갖고 IgE 신호 펩타이드와 같은 상이한 신호 펩타이드를 임의로 포함하는 IL-15를 포함하는 IL-15, MHC, CD80, CD86, IL-28, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-lα, MIP-1β, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이체형, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능성 단편 또는 이의 조합을 인코딩하는 유전자와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 다음의 핵산 분자 및/또는 단백질중의 하나 이상과 함께 투여된다: 하나 이상의 CCL20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 및 RANTES 또는 이의 기능성 단편을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 핵산 분자, 및 CCL02, IL-12 단백질, IL-15 단백질, IL-28 단백질, CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 또는 RANTES 단백질 또는 이의 기능성 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질.
백신은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통해, 볼내 투여를 통해, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 척추강내, 및 동맥내 또는 이의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의과 용도의 경우, 조성물은 정상의 수의과 실시에 따라서 적합하게 허용되는 제형으로서 투여될 수 있다. 수의사는 특수 동물에 가장 적절한 투여 요법 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 백신은 전통적인 주사, 무침 주사 장치, "미세투사물 충격 곤 건(microprojectile bombardment gone guns)", 또는 전기천공("EP"), "수력학적 방법", 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
백신의 플라스미드는 생체내 전기천공, 리포좀 매개된, 나노입자 촉진된, 재조합체 벡터, 예를 들면, 재조합체 아데노바이러스, 재조합체 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합체 박시니아의 존재 및 부재하에서 DNA 주사(또한 DNA 예방접종으로 언급됨)를 포함하는 수개의 잘-공지된 기술에 의해 포유동물에게 전달될 수 있다. 공통 항원은 DNA 주사를 통해서 및 생체내 전기천공과 함께 전달될 수 있다.
b. 전기천공
백신의 플라스미드의 전기천공을 통한 백신의 투여는, 가역적 기공이 세포막에 형성되게 하는데 효과적인 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 이용하여 달성될 수 있고, 바람직한 에너지의 펄스는 사용자에 의해 입력된 미리 조정된 전류와 유사한 정전류다. 상기 전기천공 장치는 전기천공 구성요소 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 구성요소는 조절기, 정전류형 생성기, 임피던스 시험기, 파형 로거(waveform logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 기억 구성요소, 파워력, 및 파워 스위치를 포함하는 전기천공 장치의 각종 요소 중 하나 이상을 포함하거나 통합할 수 있다. 전기천공은 생체내 전기천공 장치, 예를 들면, CELLECTRA EP 시스템(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) 또는 엘겐 전기천공기(Genetronics, San Diego, CA)를 사용하여 플라스미드에 의한 세포의 형질감염을 촉진시킬 수 있다.
전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 하나의 요소로서 기능할 수 있으며, 다른 요소는 전기천공구성요소와 통신하는 별개의 요소(또는 구성요소)이다. 상기 전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 하나를 초과하는 요소로서 기능할 수 있고, 이는 상기 전기천공 구성요소와 구별되는 전기천공 장치의 또 다른 요소와 교통할 수 있다. 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 일부로서 존재하는 전기천공 장치의 요소들은, 상기 요소들이 하나의 장치로서 또는 서로 교통하는 별개의 요소로서 기능할 수 있으므로, 제한되지 않을 수 있다. 상기 전기천공 구성요소는 원하는 조직에서 정전류를 생산하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 피드백 기전을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간 배열 내에 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 전극 어셈블리는 전기천공 구성요소로부터 에너지의 펄스를 받고 전극을 통해 원하는 조직에 이를 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지의 펄스가 전달되는 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 전기천공 구성요소에 임피던스를 전달한다. 상기 피드백 기전은 측정된 임피던스를 받을 수 있고 전기천공 구성요소에 의해 전달된 에너지의 펄스가 정전류를 유지하도록 조절할 수 있다.
복수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그램된 순서 하에 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있고, 상기 프로그램된 순서는 사용자에 의해 전기천공 구성요소에 입력된다. 상기 프로그램된 순서는 순서대로 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 펄스 중 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되고, 여기서 복수의 펄스 중 후속적인 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전국 중 상이한 하나에 의해 전달된다.
상기 피드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 상기 피드백 기전은 아날로그 폐-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 상기 피드백은 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백 또는 즉각적이다 (즉, 반응 시간을 결정하는 이용가능한 기술에 의해 결정된 바와 같이 실질적으로 즉각적임). 중성 전극은 원하는 조직 내의 임피던스를 측정할 수 있고, 상기 임피던스를 피드백 기전에 전달하고, 상기 피드백 기전은 임피던스에 반응하여 에너지의 펄스를 미리 조정된 전류와 유사한 값으로 정전류를 유지시킨다. 상기 피드백 기전은 에너지의 펄스의 전달 동안 연속적으로 그리고 즉각적으로 정전류를 유지할 수 있다.
본 발명의 DNA 백신의 전달을 촉진할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는, 이들의 내용 전체가 본원에 참조로써 통합되어 있는, 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli, 등,), 미국 특허공개공보 제2005/0052630호 (Smith, 등에 의해 제출됨)에 기술된 것을 포함한다. DNA 백신의 전달을 촉진하는데 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은, 제60/852,149호(2006년 10월 17일 출원), 및 제60/978,982호(2007년 10월 10일 출원)에 대해 35 USC 119(e) 하에 이익을 주장하는, 공동계류중이고 공동소유인 미국 특허출원 제11/874072호(2007년 10월 17일 출원)에 제공된 것을 포함하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 통합되어 있다.
미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli, 등)는 몸 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈식 전극 시스템 및 그의 용도를 기술하고 있다. 상기 모듈식 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사침; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극까지 전도성 링크를 제공하는 전기적 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 올려진 복수의 바늘 전극을 붙잡아 몸 또는 식물에서 선택된 조직 내로 이들을 단단하게 삽입할 수 있다. 이후에, 생체분자는 선택된 조직 내로 피하 주사침을 통해 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 바늘 전극에 적용된다. 상기 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 있는 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 참고로 본원에 통합되어 있다.
미국 특허 공개공보 제2005/0052630호(Smith, et al에 의해 출원됨)는 몸 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 효과적으로 촉진하는데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 상기 전기천공 장치는, 작업이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 지정되는 전기-동력학 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라미터의 입력에 기초한 어레이(array) 내의 전극 사이에 일련의 프로그램가능한 정전류 펄스 패턴을 생산하고, 전류 파형 데이타의 저장 및 취득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극, 주사 바늘용 중심 주사 통로, 및 제거가능한 가이드 디스크의 어레이를 갖는 교체가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개공보 제2005/0052630호의 전체 내용은 참고로 본원에 통합되어 있다.
미국 특허 제7,245,963 및 미국 특허 공개공보 제2005/0052630호에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직 뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로 깊이 침투시키기 위해 조정될 수 있다. 전극 어레이의 배치 때문에, 주사 바늘(선택한 생체분자를 전달함)은 또한 표적 장기 내로 완전히 삽입되며, 주사는 전극에 의해 미리 기술된 영역 내에서, 표적 조직에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/005263호에 기술된 전극은 바람직하게는 20 mm 길이 및 21 게이지이다.
또한, 전기천공 장치 및 이의 용도를 포함하는 고려된 일부 구현예에서, 하기 특허들에 기재된 것들인 전기천공 장치가 존재한다: US 특허 제5,273,525호(1993년 12월 28일 허여됨), US 특허 제6,110,161호(2000년 8월 29일 허여됨), 제6,261,281호(2001년 7월 17일 허여됨), 및 제6,958,060호(2005년 10월 25일 허여됨), 및 US 특허 제6,939,862호(2005년 9월 6일 허여됨). 더욱이, 다양한 장치 중 어느 것을 사용한 DNA의 전달에 관한, 2004년 2월 24일자로 허여된 미국 특허 제6,697,669호에 제공된 주제를 포함하는 특허, 및 DNA를 주사하는 방법에 관한, 2008년 2월 5일자로 허여된 미국 특허 제7,328,064호가 본원에서 고려된다. 상기-특허들은 그 전체가 본원에 참고로 통합되어 있다.
c. DNA 플라스미드를 제조하는 방법
본원에 논의된 DNA 백신을 포함하는 DNA 플라스미드를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공된다. DNA 플라스미드는, 포유동물 발현 플라스미드내로 최종의 아클로닝 단계 후, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 대규모 발효 탱크 속에서 세포 배양물을 접종하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 EP 장치를 사용하기 위한 DNA 플라스미드는 공지된 장치 및 기술의 조합을 이용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이들은 라이센스된, 공동계류중인 미국 가출원 제60/939,792호(2007년 5월 23일 출원)에 기재된 최적화된 플라스미드 제조 기술을 이용하여 제조된다. 일부 예에서, 이들 연구에 사용된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한 라이센스된 특허, US 특허 제7,238,522호(2007년 7월 3일 허여됨)에 기재된 것을 포함하여, 미국 출원 제60/939792호에 기재된 것 이외에도, 당해 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 혼입한다. 위에서 언급된 특허원 및 특허, 미국 출원 일련번호 제60/939,792호 및 미국 특허 제7,238,522호 각각은, 이의 전문이 본원에 참조로 통합되어 있다.
실시예
본 발명은 다음의 실시예에서 추가로 설명된다. 이들 실시예들은, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 단지 설명하기 위해 제공되는 것으로이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당해분야의 숙련가는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 이의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고, 그것을 다양한 용법 및 조건에 맞추기 위해 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서, 본원에 나타내고 기술된 것 외에 본 발명의 다양한 변형이 앞서의 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 특허청구범위의 영역 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1
방법
플라스미드 백신 작제
pMARV, pEBOS, 및 pEBOZ 플라스미드 DNA 구조체는 완전한 길이의 GP 단백질을 인코딩한다. 아미노산 공통 전략을 pEBOS 및 pEBOZ에 사용하였지만, pMARV의 경우 2005년 안골라 발생 균주로부터 유형-일치된 서열을 사용하였다(진뱅크 #VGP_MABVR)[참조: Towner JS, 등 (2006). Marburgvirus genomics and association with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola. J Virol 80: 6497-6516]. 공통 서열은 우세한 ZEBOV 및 SUDV GP 아미노산 서열을 정렬하여 각각에 대해 공통을 생성함으로써 측정하였다. 각각의 백신 GP 유전자를 사람내에서 발현을 위해 유전적으로 최적화하고[단백질 발현을 향상시키기 위한 코돈- 및 RNA-최적화 포함(GenScript, Piscataway, NJ)], 상업적으로 합성한 후, 변형된 pVAX1 포유동물 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)내로 사이토메갈로바이러스 즉시-조기(immediate-early)(CMV) 프로모터의 제어하에 아클로닝(GenScript, Piscataway, NJ)하였으며; 변형은 2A>C, 3C>T, 4T>G, 241C>G, 1,942C>T, 2,876A>-, 3,277C>T, 및 3,753G>C를 포함한다. 계통발생론적 분석을 MEGA 버전 5 소프트웨어를 사용하는 ClustalW로 다중-정렬에 의해 수행하였다. 대안적으로, MARV 중에서 GP 다양성은 비교시 훨씬 더 높았으므로(~70% 동일성), 공통 전략은 채택하지 않았다. MARV의 범위의 경우, 본 발명자들은, 안골라에서 2005 발생으로부터의 MGP 서열(진뱅크 #VGP_MABVR)이 지금까지 유일하게 최대 및 치명적인 MARV 발생이었기 때문에 이를 이용하는 것을 선택하였다. 당해 서열은 무소케, 폽프 및 라이덴(10.6% 불일치), 또는 우간다(01Uga07), 두르바(05DRC99 및 07DRC99) 및 오졸린(10.3% 불일치)를 포함하는 상대적인 균주의 이의 가장 가까운 집단으로부터 10% 이상 불일치였다. 모두 합쳐, 3개의 플라스미드 전략은 본 발명자의 신규의 3가-필로바이러스 백신 전략에 대한 기초를 형성하였다.
형질감염 및 면역블롯팅
인간 배아 신장(HEK) 293T 세포를 배양하고, 형질감염시키고, 수거하였다. 요약하면, 세포를 10% FBS, 1% Pen-strep, 피루브산나트륨, 및 L-글루타민이 들어있는 DMEM 속에서 성장시켰다. 세포를 150 mm의 코닝 디쉬(Corning dish) 속에서 배양하고 5% CO2가 들어있는 37 ° 항온처리기 속에서 밤새 70% 합치율로 성장시켰다. 디쉬를 10 내지 25 μg의 필로비리다에 pDNA로 CalphosTM 포유동물 형질감염 키트 프로토콜(Clonetech) 또는 LipofectamineTM 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시킨 후 24 내지 48시간 동안 항온처리하였다. 세포를 빙냉 PBS로 수거하고, 원심분리하고 세척한 후 웨스턴 면역블롯 또는 FACS 분석을 위해펠렛화하였다. 표준 웨스턴 블롯팅을 사용하고 GP1 검출을 위해 GP-특이적인 MAb를 생성하였다. 웨스턴 면역블롯팅 실험으로부터의 데이터를 도 1b에 나타낸다. FACS 분석으로부터의 데이터는 도 1c에 나타낸다.
동물, 예방접종, 및 챌린지
성체 암컷 C57BL/6 (H-2b), BALB/cJ (H-2d), 및 Bl0.Br (H-2k) 마우스를 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입하는 한편, 하틀리 기니아 피그(Hartley guinea pig)는 Charles River (Wilmington, MA)로부터 구입하였다. 모든 동물 실험을 UPenn IACUC 및 의약 동물 시설 학교(School of Medicine Animal Facility), 또는 실험실 동물의 사육 및 보호에 대한 PHAC의 NML 기관 동물 보호 위원회 및 캐나다 심의회에 따라 수행하였으며 위에서 언급한 기관에 의한 지속적인 관찰 및 승인 후 NIH의 실험실 동물의 보호 및 사용에 대한 지침에서의 추천에 따라 수행하였다. UPenn 및 NML은 동물 복지에 있어서 NIH 정책, 동물 복지법, 및 모든 다른 적용가능한 연방, 주 및 지방 법률에 부합한다.
마우스를 수 중에 현탁된 40 μg의 플라스미드를 침 주사에 의해 근육내 면역화시키는 한편, 기니아 피그는 200 μg 각각을 3회의 별개의 예방접종 부위에 피내로 면역화시켰다. 예방접종에 바로 이어 EP를 동일한 부위에서 수행하였다. 요약하면, 3개의 갈래진 CELLECTRA® 적응성 정전류 최소의 침입성 장치(adaptive constant current Minimally Invasive Device)를 피 내로 대략 2 mm 삽입시켰다 (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA). 방형파 펄스를 26-게이지의 고체 스테인레스강 전극으로 이루어진 삼각형의 3개-전극 배열을 통해 전달하고 0.1 Amp의 2개의 고정-전류 펄스를 1초 지연까지 분리하여 52 msec/펄스 동안 전달하였다.
치사 챌린지 연구를 위해, 챌린지를 설치류-적응된 ZEBOV 및 MARV로 한정하였다. 기니아 피그를 1,000 LD50의 기니아 피크-적응된 ZEBOV (21.3 FFU/동물) (Richardson JS, Abou MC, Tran KN, Kumar A, Sahai BM, Kobinger GP (2011) Impact of systemic or mucosal immunity to adenovirus on ad-based Ebola virus vaccine efficacy in guinea pigs. J Infect Dis 204 Suppl 3: S1032-1042) 또는 1,000 LD50 MARV-Angola (681 TCID50/동물)를 복강내 주사에 의해 최종 예방접종한 후 28일째에 챌린지하였다. 요약하면, 기니아-피크 적응된 MARV를 이계교배된 성체 암컷 하틀리 기니아 피크에서 야생형 MARV-Angola의 일련의 계대배양으로 제조하였다. 접종 후 7일째에, 동물을 희생시키고 간을 수거하여 균질화하였다. 이후에, 균질액을 나이브 성체 기니아 피크에 복강내 주사하고 동물이 체중, 털의 윤기를 상실하고, 기니아 피그에서 EBOV 적응과 유사한 감염에 쓰러질 때까지 반복하였다. 마우스 치사 챌린지 연구(Kobinger GP, 등 (2006). Chimpanzee adenovirus vaccine protects against Zaire Ebola virus. Virology 346: 394-401)를 위해, 마우스에게 200 μ1 의 1,000 LD50 (10 FFU/animal)의 마우스-적응된 ZEBOV를 복강내 주사하였다. 모든 동물을 매일 칭량하고 질병 진행에 대해 마우스에 대해서는 적어도 18일 및 기니아 피그에대해서는 22일 동안 허가된 점수를 사용하여 모니터링하였다. 모든 감염 작업을 NML, PHAC에서 '생물안전성 수준 4' (BSL4) 시설에서 수행하였다.
ELISA 및 중화 검정
항체(Ab) 역가를 슈크로즈-정제된 MARV 오졸린 GP 또는 ZGP, 또는 음성 대조군 슈크로즈-정제된 Nipah G 단백질이 1:2,000의 농도로 피복된 96-웰 ELISA 플레이트를 사용하여 측정하였다. 요약하면, 플레이트를 이후에 18시간 동안 4 ℃에서 항온처리한 후, PBS 및 0.1% 트윈-20으로 세척하고, 100 μl/시료의 혈청을 3회(5% 탈지유 및 0.5% 트윈-20이 들어있는 PBS 중 1:100, 1:400, 1:1,600, 및 1:6,400의 희석에서) 시험하였다. 습윤 용기 속에서 37 ℃로 1시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 세척한 후 100 μl의 염소 항-마우스 IgG-접합된 HRP 항체(Cedarlane)를 가하고(1:2,000의 희석) 다른 37 ℃에서 1시간 동안 습윤 용기 속에서 항온처리하였다. 세척한 후, 100 μl의 ABST(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤티아졸린-6-설폰산) 및 퍼옥시다제 기질(Cedarlane)을 가하여 Ab 결합을 가시화하였다. 다시 습윤 용기 속에서, 플레이트를 30분 동안 37 ℃에서 항온처리한 후 405 nm에서 판독하였다. 양성 결합 결과는 음성 대조군 혈청으로부터 양성 대조군을 감하는 경우 > 3 SD인 것으로 특성화되었다.
ZEBOV 중화 검정을 수행하였다. 요약하면, 면역화된 마우스 및 기니아 피크로부터 수집된 혈청을 56 C에서 45분 동안 불활성화하고 각각의 시료(50 μl의 DMEM 속에서 마우스의 경우 1:20,1:40, 등 및 기니아 피그의 경우 1:50)의 일련 희석물을 EGFP 리포터 유전자(ZEBOV-EGFP)(EGFP 발현에 따른, 100 형질유도 단위/웰)를 발현하는 동 용적의 ZEBOV와 혼합하고 37 ℃에서 90분 동안 항온처리하였다. 이후에, 혼합물을 96-웰의 평편 바닥 플레이트 속에서 아-합치성 VeroE6 세포 위로 형질감염시키고 5 내지 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 대조군 웰을 혈청을 첨가하지 않거나 비-면역 혈청을 첨가하면서 동량의 ZEBOV-EGFP 바이러스로 감염시켰다. 이후에, 20% FBS가 보충된 100 μl 의 DMEM을 각각의 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃에서 5% CO2 속에서 48시간 동안 항온처리하였다.
대안적으로, MARV-Angola 368의 중화를 면역형광성 검정을 사용하여 평가하였다. 주요 토끼 항-MARV Ab 및 제2의 염소 항-토끼 IgG FITC-접합된 Ab를 검출에 사용하였다. SUDV 보니페이스에 대한 중화 Abs(NAbs)를 CV-1 세포 상에서 세포변성 효과(CPE)를 기준으로하여 검정하였다. 세포를 동일한 부분의 면역화된 혈청 및 SUDV 보니페이스와 함께 10일 동안 항온처리한 후 후속적으로 10% 완충된 포르말린으로 24시간 동안 고정시키고 광학 현미경하에 실험하였다. EGFP 및 FITC 양성 세포를 각각의 웰 속에서 계수하고 대조군과 비교하여 녹색 세포의 수에 있어서 >50% 감소를 나타내는 시료 희석물을 Nab에 대해 양성인 것으로 점수매겼다. 대안적으로, SUDV-보니페이스에 대한 Nabs를 CV-1 세포 상에서 세포변성 효과(CPE)를 기준으로 평가하였다. 모든 감염 작업을 NML, PHAC의 BSL4 실험실에서 수행하였다.
비장세포 분리
마우스를 최종의 면역화 후 8 내지 11일째에 희생시키고 비장을 수거하였다. 요약하면, 비장을 10% FBS, 1X 항-항(Invitrogen), 및 1X β-ME (Invitrogen)이 보충된 RPMI 1640 배지(Mediatech Inc., Manassas, VA) 속에 두었다. 비장을 Stomacher 기계(Seward Laboratory Systems Inc., Bohemia, NY)를 사용하여 기계적 파괴함으로써 분리하고, 수득되는 생성물을 40 μm 세포 여과기(BD Falcon)를 사용하여 여과하였다. 이후에, 세포를 5분 동안 RBC의 분해를 위한 ACK 분해 완충액(Lonza, Switzerland)으로 처리하고, PBS 속에서 세척한 후, ELISPOT 또는 FACS 검정에 사용하기 위해 RPMI 배지 속에 재현탁시켰다.
ELISPOT 검정
표준 IFNγ ELISPOT 검정을 수행하였다. 요약하면, 96-웰 플레이트(Millipore, Billerica, MA)를 항-마우스 IFN-γ 포획 항체로 피복하고 24시간 동안 4 ℃(R&D Systems, Minneapolis, MN)에서 항온처리하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척한 후 2시간 동안 차단 완충액(PBS 중 1% BSA 및 5% 슈크로즈)으로 차단하였다. 비장세포(1-2 x 105개의 세포/웰)을 3회 플레이팅하고 밤새 37 ℃로 5% CO2 속에서 및 개별적으로(9개의 아미노산에 의해 오우버랩되고 이들의 각각의 GP의 길이의 폭을 갖는 15-머) 또는 전체의 혼주된(2.5 μg/ml의 최종) RPMI 1640(음성 대조군), Con A(양성 대조군), 또는 GP 펩타이드의 존재하에 자극시켰다. 18 내지 24시간의 자극 후, 플레이트를 PBS 속에서 세척한 후 24시간 동안 4 ℃에서 바이오티닐화된 항-마우스 IFN-γ mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN)와 함께 항온처리하였다. 다음에, 플레이트를 PBS 속에서 다시 세척하고, 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제(MabTech, Sweden)를 각각의 웰에 가하고 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 최종적으로, 플레이트를 PBS 속에서 다시 세척한 후 BCIP/NBT Plus 기질(MabTech)을 각각의 웰에 5 내지 30분 동안 스폿 전개를 위해 가하였다. 육안 관찰시 전개 공정이 완료되자 마자, 플레이트를 증류수로 세척한 후 실온에서 밤새 건조시켰다. 스폿을 자동화된 ELISPOT 판독기(Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)를 사용하여 열거하였다.
T 세포의 종합적인 분석을 위해 breadth, 표준 IFNγ ELISPOT를 문헌[참조: Shedlock DJ, 등 (2012). SUPRA.]에서 앞서 기술한 바와 같이 본원에서 변형시켰다. 아우성(subdominant) 및 면역우성 T 세포 에피토프의 확인 및 측정은 비장세포를 전체 또는 매트릭스 펩타이드 혼주물과대치되는 것으로서 개개 펩타이드로 자극시켜 평가하였으며; 매트릭스 배열 혼주물의 사용과 같은, 시료 보존을 위해 펩타이드를 혼주하는 전통적인 실시는, 다수의 에피토프를 나타내는 펩타이드를 함유하는 혼주물 속에서 전체 기능성 반응이 효과적으로 검정 해상도를 저하, 즉 보다 낮은 크기로 '잠기게(drown-out)' 할 것이므로, 검정 감도의 감소를 초래한다. 따라서, 변형된 ELISPOT를 각각의 GP 면역원 폭을 갖는 개개의 펩타이드(9개의 아미노산에 의해 오우버랩되는 15-머; 2.5 μg/ml의 최종)를 사용하여 수행하였다. T 세포 에피토프를 함유하는 펩타이드를 확인한 후(≥10 AVE IFNγ+ 스폿 및 ≥80%의 동물 반응률; 표 1 내지 6에 요약함) FACS에 의해 기능적으로 및 표현형적으로 확인하였다. 공유되거나 부분적인 에피토프는 확인되지 않았으며 FACS 데이터 또는 웹-기준 에피토프 예측소프트웨어는 보존적 펩타이드내에 보존되었던 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 에피토프의 존재를 제안하지 않았다. 여기서, 가능한 공유된/부분적인 T 세포 에피토프는 변형된 ELISPOT 검정에 의해 확인된 것으로서 연속된 펩타이드 반응의 모든 예에 대해 지정되었다. 세포를 연속된 펩타이드 각각을 사용하여 개별적으로, 직접적인 비교를 위해 함께 쌍을 이루어 자극시키고, 조합된 반응이 2개의 개개 반응 각각보다 더 크지 않았던 경우 '공유된/부분적인'로 정의하였다. 또한, 본원에 나타낸 에피토프 반응은, 펩타이드를 생성하기 위한 '9개 아미노산에 의한 오우버랩된 15-머' 알고리즘이 15개 아미노산보다 더 긴 제II 부류-제한된 에피토프의 특성으로 인하여 CD4 T 세포 반응을 과소평가할 수 있는 CD8 T 세포 에피토프의 완전한 포함에 대해 편향됨에 주목하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 유사성 플롯은 벡터 NTI 소프트웨어를 사용하여 생성하였으며 결과를 도 4b에 나타낸다.
유동 세포분석
비장세포를 96-웰 플레이트(l x l06개의 세포/웰)에 가하고 5 내지 6시간 동안 개개의 펩타이드 또는 '최소 펩타이드 혼주물'(2.5 μg/ml의 최종)로 자극하였다. 개개의 펩타이드 자극을 변형된 ELISPOT에 의해 확인된 모든 펩타이드의 기능적 확인(표 1 내지 6) 및 또한 표현형적 특성화를 위해 사용하였다. 비장세포 및 형질감염된 293T들을 LIVE/DEAD® 고정가능한 바이올렛 데드 세포 염색 키트(Fixable Violet Dead Cell Stain Kit)(Invitrogen)로 먼저 예비-염색하였다. 비장세포의 경우, 세포를 CD19(V450; 클론 1D3), CD4(PE-Cy7; 클론 RM4-5), CD8α (APC-Cy7; 클론 53-6.7) 및 CD44(PE-Cy5; 클론 IM7) (BD Biosciences, San Jose, CA)에 대해 표면-염색하고, PBS + 1% FBS 속에서 3회 세척하고, BD Cytofix/CytopermTM 키트로 투과한 후, IFNγ (APC; 클론 XMG1.2), TNF(FITC; 클론 MP6-XT22), CD3(PE-cy5.5; 클론 145-2C11), 및 T-베트(PE; 클론 4B10)(eBioscience, San Diego, CA)로 세포내 염색하였다. 형질감염된 293T 세포 속에서의 GP 발현을 형질감염 후 24시간째에 평가하였다. 간접 염색에 이어 4 ℃에서 이들의 각각의 DNA 백신 또는 pVAX1 엠티(empty) 벡터 대조군으로 3회 면역화된 H-2b 마우스로부터의 혈청을 혼주시켜 각각 생산한, 나타낸 마우스-기원한 GP-특이적인 폴리클로날 혈청 시약(1:200 희석)을 함유하는 PBS + 1% FBS 속에서 30분 항온처리를 수행하였다. 이어서, 세포를 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG (BioLegend, San Diego, CA)로 염색하고, 집중적으로 세척한 후, MHC 제I 부류(HLA-ABC; PE-Cy7; 클론 G46-2.6; BD)에 대해 염색하였다. 모든 세포를 1% 파라포름알데하이드 속에서 고정시켰다. 모든 데이터를 LSRII 유동 세포분석기(BD)를 사용하여 수집하고 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다. 비장세포를 CD3+ CD44+, CD4+ 또는 CD8+이고, B 세포 마커 CD19 및 생존능 염료에 대해 음성인 활성화된 IFNγ를 생산하는 T 세포에 대해 게이트(gate)하였다.
도 6은 GP-특이적인 T 세포 게이팅(gating)을 나타낸다. ELISPOT에 의해 확인된 것으로서 T 세포 에피토프를 함유하는 펩타이드에 대한 기능적 및 표현형적 분석을 전체 림프구, CD 19 및 LIVE-DEAD(덤프 채널)에 대해 음성인 살아있는(LD) CD3+ 세포, 단일선(singlet)(세포 이중선(cell doublet)을 배제함), CD4+ 및 CD8+ 세포, 활성화된 세포(CD44+), 및 펩타이드-특이적인 IFNγ를 생산하는 T 세포의 FACS 게이팅으로 수행하였다.
통계적 분석
뿌리뽑힌 계통수에 대한 중요성은 최대-경향성 방법(maximum-likelihood method)으로 측정하고 부트스트랩 분석(bootstrap analysis)으로 입증하여 유의적인 지지체 값(≥80%; 1,000 부트스트랩 반복물)을 MEGA 버전 5 소프트웨어로 측정하였다. 그룹 분석을 일치된, 2개-테일된, 쌍을 이루지 않은 t 시험으로 완료하고 생존 곡선을 로그-순위(log-rank)(Mantel-Cox) 시험으로 분석하였다. 모든 값은 평균 ± SEM이며 통계적 분석은 GraphPad Prism(La Jolla, CA)으로 수행하였다.
결과
백신 작제 및 발현
계통발생적 분석은 EBOV GPs(SUDV의 경우 94.4% 및 ZEBOV의 경우 92.9%) 중에서 상대적인 보존을 나타낸 반면, MARV GP (MGP)는 보다 더 다양하였다(~70% 보존됨). 따라서, 우세한 ZEBOV 및 SUDV GP 아미노산 서열의 정렬에 의해 측정된 것으로서, 공통 전략을 EBOV GPs에 대해 채택한 반면, 유형-일치된 전략은 최대 및 치명적인 MARV 발발에 단독으로 관여하는 2005 Angola 발생 서열을 사용하는 MARV에 대해 사용하였다. 각각의 GP 이식유전자를 유전적으로 최적화시켜, 상업적으로 합성한 후, 변형된 pVAX1 포유동물 발현 벡터내로 아클로닝하였다. 모두 함께, 3개의 플라스미드 전략은 본 발명자의 신규한 다가의-필로바이러스 백신 전략에 대한 기초를 형성하였다.
HEK 293T 세포를 각각의 플라스미드를 사용하여 별개로 형질감염시키고 GP 발현을 웨스턴 면역블롯팅 및 FACS로 평가하였다. ~130 kDa 단백질을 검출을 위해 종-특이적인 항-GP1 mAbs를 사용한 형질감염 후 48시간째에수거한 세포 분해물 속에서 각각에 대해 관찰하였으며 결과를 도 1b에 나타낸다. 비교 대조군의 경우, 각각의 GPs를 발현하는 재조합체 수포성 구내염 바이러스(rVSV)를 공존 레인 속에 로딩하였다. 다음에, 세포 표면에서의 GP 발현을, GP-특이적인 또는 대조군 폴리클로날 혈청을 사용하여 FACS로 직접 염색함으로써 형질감염 후 24시간째에 분석하였다. 결과는 도 1c에 나타낸다. 세포 표면 발현을 모든 백신 플라스미드에 대해 검출하였으나 비-특이적인 결합은 거의 관찰되지 않았고; 대조군 혈청은 GP-형질감염된 세포와 반응하지 않았거나 양성 혈청은 pVAX1-형질감염된 세포와 반응하지 않았다(데이터는 pEBOZ에 대해서 나타냄). EBOV GPs에 대해 예측되는 바와 같이, 세포 표면 발현은 표면 MHC 제I 부류, 및 또한 β1-인테그린의 인식을 입체적으로 차단하였다(참조: Francica JR, Varela-Rohena A, Medvec A, Plesa G, Riley JL, Bates P (2010). Steric shielding of surface epitopes and impaired immune recognition induced by the ebola virus glycoprotein. PLoS Pathog 6: e1001098).
MARV 및 ZEBOV 챌린지에 대한 완전한 보호
보호 효능을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 기니아 피그 전임상 챌린지 모델을사용하였다. 전임상 면역원성 및 효능 연구를 기니아 피그 및 마우스 모델을 사용하여 본원에서 수행하였다. 기니아 피그 전임상 모델을 필로바이러스 백신 개발을 위한 스크리닝 및 '개념 입증' 도구로서 집중적으로 사용하였다. MARV 및 EBOV의 주요 분리체가 기니아 피그에서 치명적이지 않은 질병을 유발한다고 해도, 당해 숙주에서 작은 수의 계대배양은 필로바이러스-감염된 영장류에서 관찰되는 것과 유사한 병리학적 특징을 가진 치명적인 질병을 유발할 수 있는 변이체의 선택을 초래한다. 유사하게, 마우스는 또한 필로바이러스 백신 개발에 광범위하게 사용되어 왔지만, 기니아 피그 모델과는 달리, 면역성 및 T 세포 반응을 평가하기 위한 면역검출 시약이 전적으로 이용가능하다. 쥐-적응된 ZEBOV(mZEBOV)를 사용한 감염은 EBOV-감염된 영장류에서 발견된 것들과 유사한 표적 장기 속에서의 고 수준의 바이러스 및 간 및 비장에서의 병리학적 변화를 특징으로 하는 질병을 초래한다.
기니아 피그(n=24)를, 200μg의 각각의 플라스미드(pEBOZ, pEBOS 및 pMARV)를 3개의 별개의 예방접종 부위내로 또는 pVAX1 엠티 벡터 대조군(n=9)을 피내 2회 면역화시킨 후 1개월 후에 동일한 백신으로 부스트하였다. 동물을 BSL-4 설비 속에서 1,000 LD50의 기니아 피그-적응된 MARV-Angola(gpMARV)(n=9) 또는 ZEBOV(gpZEBOV)(n=15)으로 2회 면역화 후 28일째에 챌린지한 후, 매일 관찰하고 칭량하였다. 결과는 도 2a 내지 2h에 나타낸다. 예방접종된 동물은 완전히 보호되었지만 대조군으로 예방접종된 동물은 챌린지 후 10일까지 gpMARV에 의해(n=3; P = 0.0052) 또는 챌린지 후 7일까지 gpZEBOV에 의해(n=6; P = 0.0008) 쓰러졌다(도 2a 및 도 2e). 추가로, 예방접종된 동물은 체중 감소로부터 보호되었다(도 2b 및 도 2f; P < 0.0001). 혼주된 혈청 속에서 GP-특이적인 Ab는 결합(도 2c 및 도 2g) 및 중화(도 2d 및 도 2h) 역가에 있어 유의적인 증가를 나타내었으므로 백신-유도된 Ab는 보호에 기여할 수 있는 것으로 여겨진다. 실험은 BSL-4 설비에서 수행하였으며 유사한 결과로 2회 반복하였고 도 a 내지 2h에서 오차 바아는 SEM을 나타낸다. 그룹 분석은 일치된, 2개-테일, 쌍을 이루지 않은 t 시험으로 완료하였으며 생존 곡선은로그-순위(Mantel-Cox) 시험으로 분석하였다.
플라스미드 백신은 고도로 면역원성이었다.
보호성 DNA 백신(플라스미드 pEBOZ, pEBOS 및 pMARV, 또한 3가의 DNA 백신으로 언급됨)에의해 구동된 것으로서 면역 상관관계를 보다 잘 특성화하기 위해, 본 발명자는 다음에 필로바이러스 백신 개발을 위한 스크리닝 및 '개념 입증' 도구로서 광범위하게 사용된 마우스 모델을 사용하였으며, 여기서 강력한 면역검출 시약이 이용될 수 있다. 첫째로, B 세포 반응을 H-2d 마우스(n=5/그룹)에서 40 μg의 각각의 1가의 DNA 백신을 사용한 주사 간격이 3주인, 2회의 예방접종 후 20일째에 평가하였다. 이들 실험으로부터의 데이터는 도 3a 내지 3c에 나타낸다. 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, GP-특이적인 IgG는 출혈-전 대조군 시료에서 관찰되지 않았지만, 유의적인 증가는 예방접종 후 모든 동물에서 검출되었다. 정제된 SGP는 이용가능하지 않았으므로, 정제된 ZGP를 대리로 사용하였다. SUDV-예방접종된 마우스내 IgG는 ZGP에 결합하였으며, 이는 백신-유도된 Ab 생성에 대한 능력 및 또한 교차-종 인식에 대한 이의 능력을 입증한다. 또한, 단지 1회의 면역화 후 예방접종된 동물의 100%에서 혈청전환이 일어났으며, 이후 반응은균질한 부스트에 의해 유의적으로 증가하였고; AVE 상호간 종점 희석 역가는 pMARV-면역화된 마우스에서 22.1-배, 및 pEBOS- 및 pEBOZ-예방접종된 동물에서 각각 3.4-배 및 8.6-배 부스트되었다. 다음에, 시료를 BSL-4 설비에서 ZEBOV, SUDV-보니페이스, 및 MARV-Angola의 중화에 대해 분석하였다. 중화 검정의 결과는 도 3c에 나타낸다. NAb 역가에 있어서의 유의적인 증가가 모든 동물에서 예방접종 후 검출되었다.
2개의 상이한 유전적 배경(H-2d 및 H-2b; n=5/그룹)으로부터의 마우스를 40 μg의 각각의 플라스미드 pEBOZ, pEBOS 및 pMARV으로 면역화하고, 2주 후 균일하게 부스트한 후, T 세포 분석을 위해 8일 후 희생시켰다. 매트릭스 혼주물과 대치되는 것으로서 개개 펩타이드를 사용하여 자극된, 종합적인 백신-유도된 T 세포 반응을 평가하기 위한 신규한 변형된 ELISPOT 검정으로부터의 결과를 도 4a에 나타낸다. DNA 예방접종은 T-세포 에피토프의 다양성을 인식한 풍부한 IFNγ+ 반응을 유도하였다(표 1-6). 모든 양성 에피토프를 포함하는 펩타이드를 후속적으로 게이트하고 (참조: 도 6), 확인하고, FACS에 의해 추가로 특성화하였다. 대조군 웰로부터의 배경 반응이 낮았으므로(H-2b에서 7.2±0.2 IFNγ를 생산하는 SFC/106 비장세포 및 H-2d 마우스에서 9.2±0.5), 당해 변형된 ELISPOT 시도는 극도로 민감한 것으로 입증되었다. 도 4a에 나타낸 결과는, pMARV를 사용한 예방접종이 H-2b 마우스에서 9개의 측정가능한 에피토프 및 H-2d에서 11개의 측정가능한 에피토프를 유도하였고, pEBOS는 이들 각각의 균주에서, 9 및 8개를 유도하였고, pEBOZ는 10 및 12개를 유도하였음을 나타내었다. pMARV-면역화된 H-2b 마우스로부터의 9개의 에피토프 중 5개(55.6%)가 CD8+이었지만, 이들은 ELISPOT 및 FACS 확인 및 표현형 분석 둘 다에 의해 측정된 것으로서 전체의 MGP-특이적인 IFNγ+ 반응의 약 57.3%로 계수되었다. 유사하게, 확인된 에피토프의 단지 33% 및 38% 만이 pEBOS-면역화된 H-2b 및 H-2d 마우스 각각에서 CD8-제한되었다. 그러나 당해 에피토프는 전체 반응의 거의 50 내지 90%를 포함하였고; CD8+ T 세포 반응은 마우스 균주 둘 다에서 대략 56%로 추정된 반면 FACS는 H-2b 및 H-2d 마우스에서 각각 51% 및 90%로 추정되었다. 전체 CD8+ 반응은 pEBOZ-예방접종된 동물에서 더 낮았으며 33%와 57% 사이에서 측정되었다(ELISPOT에 의해 균주 둘 다에 대해 33% 및 FACS에 의해 H-2b 및 H-2d 마우스에 대해 각각 6% 및 57%).
단일의 면역우세 에피토프는 pEBOS를 제공받는 마우스 균주 둘 다에서 검출되었으며, 여기서 면역우세 에피토프는 최고의 아우성 에피토프에 비하여 적어도 2배에서 IFNγ 반응을 생성하는 것으로 대략 정의되었으며; pMARV는 펩타이드 MGP25-39 (#5), MGP67-81 (#12), MGP181-195 (#31) 및 MGP385-399 (#65)에서 4개의 H-2b-제한된 면역우성 CD8+ 에피토프를 유도하였고, MGP151-171 (#27)에서 H-2d-제한된 CD4+ 에피토프를 유도하였다. 이들 에피토프중 4개는 MARV GP1의 고도로 보존된 영역내에서 발생하였으며, 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, 이들 중 3개는 추정되는 수용체 결합 도메인내에 위치한 반면, 단지 하나는 가변성 무친-유사 영역 (MGP385-399 (#65))내에서 발생하였음을 포함한다. pEBOS는 H-2b 및 H-2d 마우스내 각각에서, 둘 다 GP1의 고도로 보존된 영역내인, SUDV GP (SGP)19-33 (#4) 및 SGP241-255 (#41)에 존재하는 CD8+ 에피토프를 자극하였다. 그러나, pEBOZ 면역화는 수용체 결합 도메인 및 무친-유사 영역내 각각에 존재하는 H-2d 마우스내에서 3개의 면역우세 에피토프(ZEBOV GP 수용체 결합 도메인내에 위치하는 CD8-제한된 에피토프(GP)139-153 (#24), 및 2개의 CD4-제한된 에피토프 ZGP175-189 (#30) 및 ZGP391-405 (#66))를 나타내었다. 단지 하나의 면역우세 에피토프가, CD4+ 및 CD8+ 에피토프(#89) 둘 다를 함유하고 GP2의 고도로 보존된 영역내에 존재하는 H-2b 마우스내에서 정의되었다. 전체적으로, 다양한 에피토프 체계가 각각의 백신 그룹에서 일치하며 재생가능하였다. 또한, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 아우성 반응은 전체 반응의 유의적인 비를 포함하였다; 변형된ELISPOT 검정에 의해 측정된 것으로서 전체 AVE 아우성 반응은 pMARV-, pEBOS- 및 pEBOZ-면역화된 H-2b 마우스에서 각각 대략 12%, 62%, 및 74%이었지만, H-2d 마우스에서의 반응는 각각 47%, 50% 및 34%이었다.
마지막으로, 전체의 GP-특이적인 T 세포 반응은 확인된 에피토프를 함유하는 펩타이드 만을 함유하는 최소의 펩타이드 혼주물로의 자극을 사용한 FACS로 측정하였다.. 풍부한 반응이 예방접종된 동물 각각에서 검출되었으며, 대부분의 경우에서, 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에 포함되었다. IFNγ 생산이 대조군 펩타이드(h-Clip)를 사용하여 거의 관찰되지 않았고, ELISPOT 데이터와 매우 연관되었으므로, 반응은 GP-특이적이었다. 면역화가 FACS에 의해 측정된 것으로서 현저한 CTL을 유도하지 않았던 유일한 예는 pMARV로 예방접종된 H-2d 마우스내에서 존재하였으며, 여기서 ELISPOT에 의해 확인된 에피토프는 CD8-제한된 것으로 확인되지 않았다. 전적으로, 이들 데이터는, 백신 플라스미드 각각이 마우스에서 고도로 면역원성이었으며 GP의 고도로 보존된 영역내에서 면역우세 에피토프를 포함하는 T 세포 에피토프의 다양한 배열을 인식하는 풍부한 GP-특이적인 T 세포 반응을 수득하였음을 나타낸다. 또한, 본원에 특징화된 고도로 다양한 아우성 T 세포 반응은 에피토프 확인을 위한 전통적인 매트릭스 배열 펩타이드 혼주물을 사용하여 달리 간과되었을 수 있다.
T 세포 반응을 FACS에 의해 각각의 GP에 대해 모든 양으로 확인된 펩타이드가포함된 최소의 펩타이드 혼주물에 대한 반응성에 대해 측정하였다. 도 7a는, DNA 백신-유도된 T 세포 반응이 대표적인 동물로부터 나타나며 IFNγ를 생산하는 CD4+(우측) 및 CD8+(좌측) 세포가 게이트됨을 나타낸다. FACS 플롯을 나타낸다. h-CLIP 펩타이드와의 항온처리는 음성 대조군(대조군)으로서 제공하였다. 도 7b는, 도 7a내 게이트된 세포의 결과가 전체 CD44+/IFNγ+ CD4+ 또는 CD8+ 세포의 평균%로서 요약되며 오차 바아는 SEM임을 나타낸다. 실험을 유사한 결과와 함께 적어도 2회 반복하였다.
마우스에서 '단일-투여량' 보호
ZEBOV 챌린지에 대한 백신 효능은 전임상 쥐 모델에서 다음에 평가되었다. 마우스는 관찰된 강한 NAb 유도 및 보호 데이터로 인해 단지 1회 예방접종하였다. 마우스(H-2k; n=10/그룹)를 40 μg의 pEBOZ DNA로 면역화하고 보호를 BSL4 설비내에서 1,000 LD50의 마우스-적응된 ZEBOV (mZEBOV)를 사용한 챌린지에 의해 이후 28일째에 평가하였다. 모든 대조군 동물은 챌린지 한지 7일까지 감염에 쓰러졌지만, 도 5a는, DNA-예방접종된 마우스가완전히 보호되었음을 나타낸다(P = 0.0002). 또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스는 사망까지 체중의 점진적인 감소를 나타내었다 (P < 0.0001).
'1회-투여량' 모델에서 DNA-유도된 보호의 기전을 보다 잘 이해하기 위하여, 본 발명자는 다음에 NAb 및 T 세포 생성을 평가하였다. Nab를 예방접종한지 25일 후에, 챌린지 3일 전에 평가하였으며, 도 5c에 나타난 바와 같이, 유의적인 (P < 0.0001) 증가가 모든 예방접종된 동물(n=10/그룹)에서 검출되었고; 상호 종점 희석 역가는 19 내지 42, 27.3±2.5의 범위이었다.
본 발명자는 다음에 ZGP-특이적인 T 세포의 생성을 평가하고 본 발명자의 분석의 영역을 증가시켜 pEBOZ 단독으로 면역화된 마우스에서 반응을 비교하거나, 또는 3가의 제형에서 IFN-γ 생산 (n=5)을 11일 후에 FACS에 의해 전체 ZGP 펩타이드 혼주물을 사용하여 평가하고; 데이터를 도 5d에 나타낸다. IFNγ를 생산하는 T 세포를 모든 동물에서 검출하였으며 대조군 펩타이드를 사용한 자극은 사이토킨 생산을 유도하지 않았으므로 ZGP 펩타이드에 대해 특이적이었다. 1가 또는 3가 제형을 사용한 면역화는 비교시, 유의적으로 상이하지 않았던, 강력한 IFNγ T 세포 반응을유도하였다P = 0.0920).
CTL은 바이러스-감염된 세포를 제거하는데 중요할 수 있으므로[참조: Warfield KL, 등 (2005). Induction of humoral and CD8+ T cell responses are required for protection against lethal Ebola virus infection. J Immunol 175: 1184-1191; Kalina WV, Warfield KL, Olinger GG, Bavari S (2009). Discovery of common marburgvirus protective epitopes in a BALB/c mouse model. Virol J 6: 132; Olinger GG, 등 (2005). Protective cytotoxic T-cell responses induced by venezuelan equine encephalitis virus replicons expressing Ebola virus proteins. J Virol 79: 14189-14196; Sullivan NJ, 등 (2011). CD8(+) cellular immunity mediates rAd5 vaccine protection against Ebola virus infection of nonhuman primates. Nat Med 17: 1128-1131; and Geisbert TW, 등 (2010). Vector choice determines immunogenicity and potency of genetic vaccines against Angola Marburg virus in nonhuman primates. J Virol 84: 10386-10394], Thl-형 CTL 면역성 및 세포독성과연관된 것으로 알려진, 추가의 효과기 사이토킨, TNF, 및 또한 발달 제한 인자, T-박스 전사 인자 TBX21(T-bet)을 측정하였으며 결과는 다음과 같았다. 전체 세포의 경우: TNF 2.9±0.8, Tbet 13.0±1.1. CD4+/CD44+/IFNγ+ 세포의 경우: TNF 61.4±3.1, Tbet 72.6±2.0. CD8+/CD44+/IFNγ+ 세포의 경우: TNF 33.0±3.3, Tbet 992.1±1.4 (*p < 0.1; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). 본 발명자들은, ~61% 및 ~33%의 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 각각이 또한 IFNγ 외에 TNF를 생산하였음을 발견하였다. 또한, 대부분의 IFNγ를 생산하는 T 세포는 고 수준의 T-bet를 발현하였으며; CD8+ 및 CD4+ T 세포 중 약 73% 및 92% 각각은 CD44+이었고 ZGP 펩타이드 자극 후 IFNγ를 생산하였다.
도 8a 및 8b는 '단일-투여량' 예방접종에 의한 T 세포 유도를 나타낸다. FACS에 의해 측정된 것으로서, 별개의 부위에서 3개의 백신 플라스미드가 포함된, 단일의 pEBOZ 면역화 또는 단일의 3가 예방접종 후 H-2k 마우스에서의 (a) T 세포 반응을 나타내고 (b) 전체 CD44+/IFNγ+ CD4+(자색) 또는 CD8+(오렌지색) 세포의 AVE % 로서 요약하였다. 의사색(pseudocolor) FACS 플롯은 대표적인 동물로부터 기원하며 IFNγ를 생산하는 CD4+ (우측) 및 CD8+ (좌측) 세포를 게이트한다. h-CLIP 펩타이드와의 항온처리는 음성 대조군(대조군)으로서 제공하였다. 실험을 유사한 결과와 함께 2회 수행하였으며, 오차 바아는 SEM을 나타내고; ns는 유의성 없음을 나타낸다.
토의
본 발명자는 전임상 설치류 면역원성 및 효능 연구에서 다가의-필로바이러스 백신의 개발 및 평가를 보고한다. gpMARV 및 gpZEBOV를 사용한 챌린지에 대한 완전한 보호가 기니아 피그에서 2개의 DNA 백신 투여량, 및 또한 mZEBOV에 대해 마우스에서 '단일-투여량' DNA 백신을 사용한 후 관찰되었다. 지금까지, 기니아 피그의 유전적 예방접종은 네이크드(naked) DNA[참조: Sullivan NJ, Sanchez A, Rollin PE, Yang ZY, Nabel GJ (2000). Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates. Nature 408: 605-609] 또는 유전자 총(gene gun)에 의해 전달된 DNA[참조: Dowling W, 등 (2006). The influences of glycosylation on the antigenicity, immunogenicity, and protective efficacy of Ebola virus GP DNA vaccines. J Virol 81: 1821-1837; Vanderzanden L, 등 (1998). DNA vaccines expressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethal challenge. Virology 246: 134-144; and Riemenschneider J, 등 (2003). Comparison of individual and combination DNA vaccines for B. anthracis, Ebola virus, Marburg virus and Venezuelan equine encephalitis virus. Vaccine 21: 4071-4080]의 주사를 포함하였으나, 어느 방법도 완전한 보호를 달성하기 위해 적어도 3회의 예방접종을 요구하였다. 본원의 개선된 보호는, 1회의 DNA 예방접종이 유전자 총 투여 후 보호된 동물에서 역가에 대해크기에 있어서 비교가능한 GP-특이적인 IgG 결합제 역가를 생성하였으므로 강력한 Ab의 유도에 기인할 수 있으며; DNA 예방접종은 1회의 투여 후 각각 3.85 및 2.18 log10의 ZGP 및 MGP-특이적인 Ab 역가 대 3회의 유전자 총 예방접종 후 2.7 및 3.0 log10의 ZGP 및 MGP-특이적인 Ab 역가를 유도하였다. 기니아 피그에서 대안적인 '1회-투여량' 보호성 전략을 사용한 비교를 위해, Ag-커플링된 바이러스-형성 입자(VLP) 플랫폼은 DNA 예방접종 후 관찰된 것보다 단지 약간 더 높은 Ab 역가를 생성하였다(참조: Swenson DL, Warfield KL, Negley DL, Schmaljohn A, Aman MJ, Bavari S (2005). Virus-like particles exhibit potential as a pan-filovirus vaccine for both Ebola and Marburg viral infections. Vaccine 23: 3033-3042). 더욱이, 재조합체 아데노바이러스(rAd) 시도는 1회의 DNA 예방접종으로부터의 것보다 더 낮은ZGP-특이적인 NAb 역가를 유도하였다(53의 상호간 종점 희석 역가 대 본원의 88의 상호간 종점 희석 역가) [참조: Kobinger GP, 등 (2006). Chimpanzee adenovirus vaccine protects against Zaire Ebola virus. Virology 346: 394-401). rVSV를 사용한 예방접종(참조: Jones SM, 등 (2007). Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebola virus hemorrhagic fever. J Infect Dis 196 Suppl 2: S404-412]은 현재의 플랫폼과 유사한 ZGP-특이적인 Ab 역가를 생성하였다. 전적으로, 이들 데이터는, DNA 예방접종이 복제하지 않는 바이러스 플랫폼과 비교가능한 결합 및중화 Ab를 유도할 수 있으며 이들 데이터는 부분적으로 본원의 강한 기니아 피그 생존 데이터를 설명하는데 도움을 줄 수 있음을 입증한다.
보호성 DNA 예방접종에 의한 Nab의 생성은 삽입유전자-발현된 성숙한 GP 구조에 의해 유리할수 있다. 시험관내 형질감염 연구는, 백신-인코딩된 GP가 고도로 발현되어, 해독후 절단되며(도 1b), 세포 표면으로 수송되고, 세포 표면 분자의 면역검출을 입체적으로 차단함(도 1c)을 입증하였다. 따라서, 본원에 형성된 백신 면역원이 또한 감염 동안 비리온 조립(virion assembly) 시 기능적일 수 있는 이종-삼량체 스파이크(hetero-trimeric spike)로 성숙되는 경향이 높았다. 이는 구조-의존성 Nab의 유도에 후속적으로 중요할 수 있는 바이러스적으로 관련된 중화 결정인자의 생성 및 디스플레이에 중요할 수 있다(참조: Dowling W, 등 (2007). Influences of glycosylation on antigenicity, immunogenicity, and protective efficacy of ebola virus GP DNA vaccines. J Virol 81: 1821-1837; Shedlock DJ, Bailey MA, Popernack PM, Cunningham JM, Burton DR, Sullivan NJ (2010). Antibody-mediated neutralization of Ebola virus can occur by two distinct mechanisms. Virology 401: 228-235). 따라서, 이와 관련하여, 천연의 정착된 구조의 발현은 Nab를 생성하는 능력에 있어서 가용성 유도체보다 더 우수할 수 있다[참조: Sullivan NJ, 등 (2006). Immune protection of nonhuman primates against Ebola virus with single low-dose adenovirus vectors encoding modified GPs. PLoS Med 3: el77; Xu L, 등 (1998). Immunization for Ebola virus infection. Nat Med 4: 37-42].
보호성 백신에 의해 구동된 것으로서 T 세포 반응을 보다 잘 특성화하기 위하여, 본 발명자는 마우스내에서 면역원성 및 효능 연구를 수행하였고 DNA 예방접종을 사용하여 mZEBOV에 대한 '1회-투여량' 완전한 보호를 측정하였다(도 5a 내지 5d). 지금까지, 당해 모델에서 완전한 보호를 부여하는 가장 효과적인 플랫폼은 VLP이며, 이는 아쥬반트의 존재(참조: Warfield KL, 등 (2005). Induction of humoral and CD8+ T cell responses are required for protection against lethal Ebola virus infection. J Immunol 175: 1184-1191; Warfield KL, Swenson DL, Olinger GG, Kalina WV, Aman MJ, Bavari S (2007). Ebola virus-like particle-based vaccine protects nonhuman primates against lethal Ebola virus challenge. J Infect Dis 196 Suppl 2: S430-437) 또는 아쥬반트의 부재[참조: Sun Y, 등 (2009). Protection against lethal challenge by Ebola virus-like particles produced in insect cells. Virology 383: 12-21), rAd 예방접종(참조: Kobinger GP, 등 (2006) SUPRA; Choi JH, 등 (2012). A single sublingual dose of an adenovirus-based vaccine protects against lethal Ebola challenge in mice and guinea pigs. Mol Pharm 9: 156-167; Richardson JS, 등 (2009). Enhanced protection against Ebola virus mediated by an improved adenovirus-based vaccine. PLoS One 4: e5308], 또는 rRABV 예방접종[참조: Blaney JE, 등 (2011). Inactivated or live-attenuated bivalent vaccines that confer protection against rabies and Ebola viruses. J Virol 85: 10605-10616]를 사용하는 경우이다. 그러나, T 세포 반응의 특성화는 이들 연구에서 극도로 제한되며 앞서 기술된 2개(참조: Warfield KL, (2007), SUPRA) 또는 1개(참조: Warfield KL, 등 (2005) SUPRA)의 펩타이드 를 사용한 비장세포 자극으로 ZGP T 세포 에피토프를 함유하도록 한정되었다(참조: Warfield KL, 등 (2005) SUPRA;. Olinger GG, 등 (2005) SUPRA; Kobinger GP, 등 (2006), SUPRA; Sun Y, 등 (2009). Choi, JH, 등 (2012). 여기서, 본 발명자는 신규의 변형된 T 세포 검정에 의해 집중적으로 분석된 것으로서 보호성 예방접종에 의한 강하고 광범위한 CTL의 유도를 보고한다(도 4a 및 표 1 내지 6). 전체적으로, GP의 고도로 보존된 영역내에서 주로 발생하는 다수의 면역우세 에피토프를 포함하는 52개의 신규한 T 세포 에피토프를 확인하였다. 확인된 총 22개의 ZGP 에피토프 중에서, 4개만이 앞서 보고되었다. 더욱이, 20개의 MGP 중 1개(참조: Kalina WV, Warfield KL, Olinger GG, Bavari S (2009). Discovery of common marburgvirus protective epitopes in a BALB/c mouse model. Virol J 6: 132) 및 16개의 SGP 에피토프중 1개가 앞서 기술되었다. 이와 같이, 이는 2개의 상이한 마우스 유전적 배경에서 다수의 필로바이러스로부터의 GP 에피토프를 기술하는, 지금까지 전임상 GP 에피토프의 가장 종합적인 보고이다.
이들 분석으로부터 생성되는 다른 신규한 발견은, 본 발명자가 광범위하게는 12% 내지 74%의 범위의, 전체 T 세포 반응의 유의적인 백분율을 포함함을 나타내는, 백신-유도된 면역우세 T 세포 반응의 평가이었다(도 4d). 이는, 아우성 반응이 보호에 유의적으로 기여할 수 있으므로 특히 중요할 수 있다. 따라서, 이는 보호에 대한 아우성 및 면역우성 에피토프 T 세포 반응의 특수한 기여를 측정하기위한 미래의 정보를 입증할 수 있다. 특히, 이들 반응은 또한 에피토프 확인을 위한 전통적인 매트릭스 배열 펩타이드 혼주물을 사용하여 간과되어 왔을 수 있다. 이와 같이, 앞서의 연구에서 제한된 에피토프 검출은 보다 낮은 수준의 백신-유도된 면역성, 거의민감하지 않은 표준 검정, 및/또는 면역우성 CD8+ 에피토프의 검출을 지지하는 펩타이드 정렬 및/또는 알고리즘의 사용과 직접 관련될 수 있다.
면역이 필로바이러스에 대한 보호와 상호 관련되어 있다고 해도, 이러한 고도의 면역원성 시도에 의해 생성된 데이터는 보호 백신에 의해 구동된 것으로서 이를 사용하여 T 세포 면역성을 연구하는 유일한 기회를 제공한다. 본원의 DNA 백신화는 강한 ZGP-특이적인 T 세포를 유도하였으며, 이의 대부분은 고 수준의 T-bet를 발현하는 Thl-형 다기능성 CTL에 의해 특징화되었으며, 또한 인간에서 T 세포 세포독성과 상호관련된 것으로 밝혀졌다. CD4+ T 세포에 대해 왜곡된 체액성 면역 반응 및 세포 면역성을 주로 생성할 수 있는 앞서의 표준-단독 DNA 백신 플랫폼은 NHPs 및 임상에서 강력한 CD8+ T 세포를 유도하기 위해 최근 입증된 생체내 EP 전달로부터 유리한 경향이 있을 수 있음이 명백하다. 따라서, 본원의 데이터는 NHP 면역원성 및 효능 연구에서 독립형 또는 프라임-부스트 양식(prime-boost modality)으로서의 당해 시도와 일치한다. 이러한 시도는 필로비리다에 생명을 위협하는 상태 및 발생 동안 신속한 반응을 위해 신속하고 저렴하게 변형되고/되거나 생산될 수 있는 매력적인 예방접종 전략을 제공한다. 또한, 당해 모델 시도는 필로바이러스 질병에 대해 연관된 보호성 면역을 연구하기 위한 중요한도구를 제공하며 존재하는 플랫폼에 적용되어 추가의 전략을 안내할 수 있다.
실시예 2
3개의 플라스미드를 포함하는 3가의 백신이 제공된다. 제1의 플라스미드는 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된, ZEBOV CON, 서열 번호: 1을 기본으로 하는 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제2의 플라스미드는 SUDV CON, 서열 번호: 2를 기준으로 하고, 수단 에볼라바이러스 공통 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 수단 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제3의 플라스미드는 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 MARV ANG, 서열 번호: 3을 기준으로 한 마르부르그 마르부르그 Angola (MARV 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시예 3
5개의 플라스미드 백신이 제공된다. 제1의 플라스미드는 ZEBOV CON, 서열 번호: 1인 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제2의 플라스미드는 SUDV CON, 서열 번호: 2인 수단 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다 제3의 플라스미드는 서열 번호: 4, 마르부르그 마르부르그바이러스 라븐, 두르바(09DRC99) 및 우간다(02Uga07Y)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 라븐 집단 공통 (MARV-RAV CON)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제4의 플라스미드는 서열 번호: 5, 오졸린, 우간다(01Uga07), 및 두르바(05 및 07DRC99)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 오졸린 집단 공통 (MARV-OZO CON)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다 제5의 플라스미드는 서열 번호: 6, (무소케, 폽프, 및 라이덴)을 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 무소케 집단 공통 (MARV-MUS CON)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시예 4
5개의 플라스미드 백신이 제공된다. 제1의 플라스미드는 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된, ZEBOV CON, 서열 번호: 1을 기본으로 하는 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제2의 플라스미드는 SUDV CON, 서열 번호: 2를 기준으로 하고, 수단 에볼라바이러스 공통 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 수단 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제3의 플라스미드는 서열 번호: 4, 마르부르그 마르부르그바이러스 라븐 두르바 (09DRC99) 및 우간다(02Uga07Y)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 라븐 집단 공통 (MARV-RAV CON)을 기준으로 하고 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 - Rav 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 마르부르그 마르부르그바이러스 Rav 공통을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제4의 플라스미드는 서열 번호: 5, 오졸린, 우간다(01Uga07), 및 두르바(05 및 07DRC99)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 오졸린 집단 공통(MARV-OZO CON)을 기본으로 하고 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 Ozo 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된, 마르부르그 마르부르그바이러스 Ozo 공통을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제5의 플라스미드는 서열 번호: 6, (무소케, 폽프, 및 라이덴)을 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 무소케 집단 공통 (MARV-MUS CON)을 기본으로 하고 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 - Mus 면역원의 N 말단에서 IgE 시그날 펩타이드를 포함하도록 변형된 마르부르그 마르부르그바이러스 Mus 공통을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시예 5
6개의 플라스미드 백신이 제공된다. 제1의 플라스미드는 ZEBOV CON, 서열 번호: 1인 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제2의 플라스미드는 SUDV CON, 서열 번호: 2인 수단 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다 제3의 플라스미드는 서열 번호: 4, 마르부르그 마르부르그바이러스 라븐, 두르바(09DRC99) 및 우간다(02Uga07Y)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 라븐 집단 공통 (MARV-RAV CON)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제4의 플라스미드는 서열 번호: 5, 오졸린, 우간다(01Uga07), 및 두르바(05 및 07DRC99)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 오졸린 집단 공통 (MARV-OZO CON)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다 제5의 플라스미드는 서열 번호: 6, (무소케, 폽프, 및 라이덴)을 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 무소케 집단 공통 (MARV-MUS CON)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제6의 플라스미드는 서열 번호: 3, 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 분리체 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시예 6
5개의 플라스미드 백신이 제공된다. 제1의 플라스미드는 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된, ZEBOV CON, 서열 번호: 1을 기본으로 하는 자이레 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제2의 플라스미드는 SUDV CON, 서열 번호: 2를 기준으로 하고, 수단 에볼라바이러스 공통 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 수단 에볼라바이러스 공통 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제3의 플라스미드는 서열 번호: 4, 마르부르그 마르부르그바이러스 라븐 두르바(09DRC99) 및 우간다(02Uga07Y)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 라븐 집단 공통 (MARV-RAV CON)을 기본으로 하고 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 - Rav 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 마르부르그 마르부르그바이러스 Rav 공통을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제4의 플라스미드는 서열 번호: 5, 오졸린, 우간다(01Uga07), 및 두르바(05 및 07DRC99)를 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 오졸린 집단 공통 (MARV-OZO CON)을 기본으로 하고 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 - Ozo 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된 마르부르그 마르부르그바이러스 Ozo 공통을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제5의 플라스미드는 서열 번호: 6, (무소케, 폽프, 및 라이덴)을 사용하는 마르부르그 마르부르그바이러스 - 무소케 집단 공통 (MARV-MUS CON)을 기본으로 하고 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 - Mus 면역원의 N 말단에서 IgE 시그날 펩타이드를 포함하도록 변형된 마르부르그 마르부르그바이러스 Mus 공통을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 제6의 플라스미드는 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 면역원의 N 말단에서 IgE 신호 펩타이드를 포함하도록 변형된, MARV ANG, 서열 번호: 3을 기본으로 하는 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 분리체 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
표 1
플라스미드 백신 pMARV
GP 서열 MARV ANG
Figure pat00001
"에피토프를 함유하는 펩타이드는 IFNγ ELISPOT (≥ 10 SFC/106 비장세포 AND ≥ 80% 반응율)로 확인한 후 FACS(≥ 3-5xl04 CD3+ 세포가 획득되었다)로 입증하였다. 각각에 대한 반응은 FACS(CD3+/CD44+/IFNγ+ 세포에 의한 CD4 및/또는 CD8의 발현)에 의해 추가로 특징화하였다. 예측된 CD8+ 에피토프는 밑줄쳐져 있고(IEDB에 의한 가장 우수한 공통% 순위) 앞서 기술된 에피토프가 언급되어 있다. 면역우성 에피토프가 나타나 있다(*).
표 2
플라스미드 백신 pEBOS
GP 서열 SUDV CON
Figure pat00002
"에피토프를 함유하는 펩타이드는 IFNγ ELISPOT (≥ 10 SFC/106 비장세포 AND ≥ 80% 반응율)로 확인한 후 FACS(≥ 3-5xl04 CD3+ 세포가 획득되었다)로 입증하였다. 각각에 대한 반응은 FACS(CD3+/CD44+/IFNγ+ 세포에 의한 CD4 및/또는 CD8의 발현)에 의해 추가로 특징화하였다. 예측된 CD8+ 에피토프는 밑줄쳐져 있고(IEDB에 의한 가장 우수한 공통% 순위) 앞서 기술된 에피토프가 언급되어 있다. 면역우성 에피토프가 나타나 있다(*).
표 3
플라스미드 백신 pEBOZ
GP 서열 ZEBOV CON
Figure pat00003
"에피토프를 함유하는 펩타이드는 IFNγ ELISPOT (≥ 10 SFC/106 비장세포 AND ≥ 80% 반응율)로 확인한 후 FACS(≥ 3-5xl04 CD3+ 세포가 획득되었다)로 입증하였다. 각각에 대한 반응은 FACS(CD3+/CD44+/IFNγ+ 세포에 의한 CD4 및/또는 CD8의 발현)에 의해 추가로 특징화하였다. 예측된 CD8+ 에피토프는 밑줄쳐져 있고(IEDB에 의한 가장 우수한 공통% 순위) 앞서 기술된 에피토프가 언급되어 있다. 면역우성 에피토프가 나타나 있다(*).
표 4
플라스미드 백신 pMARV
GP 서열 MARV ANG
Figure pat00004
"에피토프를 함유하는 펩타이드는 IFNγ ELISPOT (≥ 10 SFC/106 비장세포 AND ≥ 80% 반응율)로 확인한 후 FACS(≥ 3-5xl04 CD3+ 세포가 획득되었다)로 입증하였다. 각각에 대한 반응은 FACS(CD3+/CD44+/IFNγ+ 세포에 의한 CD4 및/또는 CD8의 발현)에 의해 추가로 특징화하였다. 예측된 CD8+ 에피토프는 밑줄쳐져 있고(IEDB에 의한 가장 우수한 공통% 순위) 앞서 기술된 에피토프가 언급되어 있다. 면역우성 에피토프가 나타나 있다(*).
표 5
플라스미드 백신 pEBOS
GP 서열 SUDV CON
Figure pat00005
"에피토프를 함유하는 펩타이드는 IFNγ ELISPOT (≥ 10 SFC/106 비장세포 AND ≥ 80% 반응율)로 확인한 후 FACS(≥ 3-5xl04 CD3+ 세포가 획득되었다)로 입증하였다. 각각에 대한 반응은 FACS(CD3+/CD44+/IFNγ+ 세포에 의한 CD4 및/또는 CD8의 발현)에 의해 추가로 특징화하였다. 예측된 CD8+ 에피토프는 밑줄쳐져 있고(IEDB에 의한 가장 우수한 공통% 순위) 앞서 기술된 에피토프가 언급되어 있다. 면역우성 에피토프가 나타나 있다(*).
표 6
플라스미드 백신 pEBOZ
GP 서열 ZEBOV CON
Figure pat00006
"에피토프를 함유하는 펩타이드는 IFNγ ELISPOT (≥ 10 SFC/106 비장세포 AND ≥ 80% 반응율)로 확인한 후 FACS(≥ 3-5xl04 CD3+ 세포가 획득되었다)로 입증하였다. 각각에 대한 반응은 FACS(CD3+/CD44+/IFNγ+ 세포에 의한 CD4 및/또는 CD8의 발현)에 의해 추가로 특징화하였다. 예측된 CD8+ 에피토프는 밑줄쳐져 있고(IEDB에 의한 가장 우수한 공통% 순위) 앞서 기술된 에피토프가 언급되어 있다. 면역우성 에피토프가 나타나 있다(*).
<110> The Trustees of the University of Pennsylvania Weiner, David B. Shedlock, Devon J. <120> FILOVIRUS CONSENSUS ANTIGENS, NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND VACCINES MADE THEREFROM, AND METHODS OF USING THE SAME <130> 133172.04202 <150> 61/623428 <151> 2012-04-12 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 676 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic consensus sequence of Zaire ebolavirus glycoprotein <400> 1 Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg 1 5 10 15 Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val 35 40 45 Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg 50 55 60 Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro 65 70 75 80 Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val 85 90 95 Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly 115 120 125 Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His 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marburgvirus Angola 2005 isolate glycoprotein <400> 3 Met Lys Thr Thr Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Val 1 5 10 15 Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Ile Gln Pro Gln Asn 20 25 30 Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His 35 40 45 Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu 50 55 60 Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Ala Gly Val Pro Pro Lys Asn 65 70 75 80 Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser 85 90 95 Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn 100 105 110 Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln 115 120 125 Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe 130 135 140 Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe 145 150 155 160 Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys 165 170 175 Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr 180 185 190 Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly 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of Zaire ebolavirus glycoprotein <400> 64 atgggggtca ctgggattct gcagctgcct agagatcgct tcaagcgaac ctctttcttt 60 ctgtgggtca tcattctgtt ccagaggact tttagtatcc ctctgggcgt cattcacaat 120 tctaccctgc aggtgagtga cgtcgataag ctggtgtgtc gggacaaact gagctccacc 180 aaccagctga gatctgtcgg cctgaatctg gaggggaacg gagtggctac cgatgtccca 240 agtgcaacaa agagatgggg gtttcgctca ggagtgcccc ctaaagtggt caattacgag 300 gccggggaat gggctgagaa ttgctataac ctggaaatca agaaacccga cggatcagag 360 tgtctgccag ccgctcccga tgggattcgc ggattcccta gatgcagata cgtgcacaag 420 gtcagcggca ccgggccatg tgcaggagac ttcgcctttc ataaagaagg cgccttcttt 480 ctgtacgata gactggcttc caccgtgatc tataggggga ccacattcgc cgagggagtg 540 gtcgcttttc tgattctgcc tcaggccaag aaagacttct tttctagtca tcctctgcgg 600 gaaccagtga acgctaccga ggaccccagc agcggctact attccactac catcagatac 660 caggccacag gattcggcac caatgagaca gaatacctgt ttgaagtgga caacctgaca 720 tatgtccagc tggagtctag gttcactccc cagtttctgc tgcagctgaa tgaaactatc 780 tataccagtg gcaagcgctc aaatacaact gggaagctga 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gatcagcacc 1200 attggcacag ggctgtcctc tagtcagatt ctgtcaagct cccctaccat ggccccctcc 1260 cctgagacac agacttctac aacttataca cccaagctgc ctgtgatgac cacagaggaa 1320 cccactaccc cacccagaaa cagtcctggg tcaacaactg aggcacccac cctgaccaca 1380 cctgaaaata tcactaccgc cgtgaaaaca gtcctgcctc aggagtctac tagtaacgga 1440 ctgatcacca gcacagtgac tggaattctg ggcagtctgg ggctgcgcaa gcgatcaagg 1500 cgccaagtga atactcgggc taccggcaaa tgcaatccaa acctgcacta ctggaccgca 1560 caggagcagc ataacgccgc tgggatcgct tggattcctt acttcggacc aggcgcagag 1620 gggatctata ccgaaggact gatgcataat cagaacgccc tggtgtgtgg cctgagacag 1680 ctggcaaatg agacaactca ggccctgcag ctgttcctga gagcaaccac agaactgagg 1740 acctatacaa tcctgaaccg gaaggccatt gattttctgc tgcgacgatg gggcgggacc 1800 tgcagaatcc tgggaccaga ctgctgtatt gagccccacg attggaccaa gaacatcaca 1860 gacaagatca accagatcat tcatgatttc atcgacaacc cactgcccaa tcaggacaac 1920 gatgacaatt ggtggaccgg atggcgacag tggattcccg caggaattgg aatcaccgga 1980 attattattg ccattattgc tctgctgtgt gtctgtaagc tgctgtgttg ataa 2034 <210> 66 <211> 2049 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of Marburg marburgvirus glycoprotein <400> 66 atgaaaacca cttgtctgct gatctcactg attctgattc agggcgtcaa aacactgccc 60 attctggaaa ttgcctctaa catccagcca cagaacgtgg actccgtctg ttctgggacc 120 ctgcagaaga cagaggatgt gcacctgatg ggcttcaccc tgagcgggca gaaggtcgca 180 gactcacccc tggaagccag caaacgatgg gcatttcggg ccggagtgcc ccctaagaac 240 gtcgagtaca ccgaaggcga ggaagccaaa acatgctata atatctccgt gactgatcct 300 agtggcaagt cactgctgct ggacccaccc accaacatta gggattaccc taagtgtaaa 360 acaatccacc atattcaggg ccagaatcca cacgctcagg ggatcgcact gcatctgtgg 420 ggagccttct ttctgtacga caggattgct agcaccacaa tgtatcgcgg gaaagtgttc 480 accgagggaa acatcgccgc tatgattgtg aataagacag tccacaaaat gatcttttct 540 cgccagggcc aggggtaccg acatatgaac ctgaccagta caaataagta ttggaccagc 600 tccaacggca ctcagaccaa tgacactggg tgcttcggaa ccctgcagga gtacaacagt 660 actaaaaatc agacctgtgc tccatcaaag aaaccactgc cactgcctac cgcacaccca 720 gaggtgaagc tgacaagtac ttcaaccgac gccacaaaac tgaacactac cgaccccaat 780 agtgacgatg aagatctgac aactagcgga tccggctctg gggagcagga accttatacc 840 acatccgatg cagccaccaa gcagggcctg tctagtacaa tgcctccaac tccatctccc 900 cagcctagta ctccccagca gggcgggaac aataccaacc attcccaggg cgtggtcaca 960 gagccaggga agactaacac taccgcccag ccctctatgc cccctcacaa tacaactacc 1020 atctccacca acaatacatc taaacataac ctgagcacac cttccgtgcc aatccagaac 1080 gctactaact acaacactca gtctaccgca cccgagaatg aacagacttc tgcccctagt 1140 aagacaactc tgctgcccac cgagaaccct accacagcca agtcaacaaa tagcactaaa 1200 tcccctacta ccacagtgcc aaacactacc aataagtaca gtacctcacc aagccccacc 1260 cctaactcca cagcacagca cctggtctat ttccggagaa aaagaaatat cctgtggagg 1320 gagggcgaca tgttcccttt tctggatggg ctgatcaacg ctccaattga cttcgatcca 1380 gtgcccaata caaagactat ctttgacgaa tcaagctcct ctggcgcctc tgctgaggaa 1440 gatcagcacg cctcacccaa cattagcctg acactgtcct actttcctaa agtgaacgag 1500 aatactgccc atagcgggga gaacgaaaat gactgcgatg ctgagctgcg gatctggagc 1560 gtccaggaag acgatctggc tgcaggactg tcctggatcc cattctttgg acccggcatt 1620 gagggactgt ataccgccgg cctgattaag aaccagaaca acctggtgtg cagactgagg 1680 cgcctggcca atcagaccgc taaatcactg gaactgctgc tgcgggtcac aactgaggaa 1740 agaacattca gcctgatcaa ccgacatgct attgactttc tgctggcacg ctggggaggc 1800 acctgcaagg tgctgggacc agactgctgt atcggcattg aggatctgtc tcgcaatatc 1860 agtgaacaga tcgaccagat taagaaagat gagcagaagg aaggaaccgg atggggactg 1920 ggcggcaagt ggtggaccag cgattggggc gtgctgacaa acctgggaat cctgctgctg 1980 ctgtccatcg ccgtcctgat tgctctgtcc tgtatttgtc ggattttcac taagtatatt 2040 gggtgataa 2049

Claims (41)

  1. 하기를 포함하는 조성물:
    a) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 대해 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
    b) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 2 (SUDV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2 에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2 (SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2 에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    c) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 3 (MARV), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3(MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마르부르그 마르부르그바이러스 Angola 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열.
  2. 청구항 1에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    a) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열; 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    b) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    c) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 3 (MARV), 635개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 635개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3 (MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 635개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 635개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서,
    a) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    b) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2 (SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    c) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 3 (MARV), 670개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 670개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3 (MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 670개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 670개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이 서열 번호: 1 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖고; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이 서열 번호: 2 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지며; 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원이 서열 번호: 3 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 서열 번호: 1 또는 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 서열 번호: 2 또는 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 및 서열 번호: 3 또는 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  9. 하기를 포함하는 조성물:
    i) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
    ii) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 2 (SUDV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
    iii) 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 4 (MARV CON1), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4(MARV CON1), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
    iv) 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 5 (MARV CON2), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5(MARV CON2), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    v) 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 6 (MARV CON3), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6(MARV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6 에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열.
  10. 청구항 9에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서,
    vi) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 3 (MARV), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3(MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드, 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제6의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  13. 청구항 9에 있어서,
    i) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1(ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    ii) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    iii) 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 4(MARV CON1), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, 서열 번호: 4에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4 (MARV CON1), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    iv) 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 5 (MARV CON2), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, 서열 번호: 5에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5 (MARV CON2), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    v) 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 6 (MARV CON3), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, 서열 번호: 6에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6 (MARV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서,
    vi) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 3 (MARV), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3(MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드, 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제6의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  17. 청구항 9에 있어서,
    i) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1(ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    ii) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    iii) 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 4 (MARV CON1), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, 서열 번호: 4에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4(MARV CON1), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    iv): 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 5 (MARV CON2), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, 서열 번호: 5에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5(MARV CON2), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    v) 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 6(MARV CON3), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, 서열 번호: 6에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6 (MARV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  19. 청구항 17에 있어서,
    vi) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 3(MARV), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3(MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드, 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제6의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  21. 청구항 9에 있어서,
    i) 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1 (ZEBOV CON) 및 서열 번호: 1 (ZEBOV CON)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    ii) 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON) 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2 (SUDV CON)로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
    iii) 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 4 (MARV CON1) 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4 (MARV CON1) 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    iv) 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 5 (MARV CON2) 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5 (MARV CON2)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    v) 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 6 (MARV CON3) 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6 (MARV CON)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 및 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서,
    vi) 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 3 (MARV) 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3(MARV)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  24. 청구항 21에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드; 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제4의 플라스미드; 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제5의 플라스미드, 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제6의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  25. 하기를 포함하는 조성물:
    공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1(ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 2 (SUDV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2 (SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2 에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 및 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  27. 청구항 25에 있어서,
    공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 1(ZEBOV CON), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1(ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON), 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 630개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 98% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드; 및 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  29. 청구항 25에 있어서,
    공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열이 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1(ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열이 서열 번호: 2 (SUDV CON), 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 660개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 99% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 및 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  31. 청구항 25에 있어서, 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이 서열 번호: 1 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖고; 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원이 서열 번호: 2 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 서열 번호: 1 또는 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 플라스미드; 및 서열 번호: 2 또는 IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 플라스미드를 포함하는 조성물.
  33. 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 있어서, 전기천공을 사용하여 개인에게 전달하기 위해 제형된 조성물.
  34. 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 있어서, IL-12, IL-15 및 IL-28로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  35. 개인에서 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양의 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 개인에게 투여함을 포함하여, 필로바이러스에 대해 면역 반응을 유도하는 방법.
  36. 개인에서 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양의 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 개인에게 투여함을 포함하여, 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레로 이루어진 그룹 중에서 선택된 필로바이러스에 대해 면역 반응을 유도하는 방법.
  37. 치료학적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 필로바이러스로 진단된 개인에게 투여함을 포함하여, 필로바이러스로 진단된 개인을 치료하는 방법.
  38. 치료학적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 필로바이러스로 진단된 개인에게 투여함을 포함하여, 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레로 이루어진 그룹 중에서 선택된 필로바이러스로 진단된 개인을 치료하는 방법.
  39. 예방학적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 개인에게 투여함을 포함하여, 상기 개인에서 필로바이러스 감염을 예방하는 방법.
  40. 예방학적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 32 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 개인에게 투여함을 포함하여, 상기 개인에서 마르부르그바이러스, 에볼라바이러스 수단 및 에볼라바이러스 자이레로 이루어진 그룹 중에서 선택된 필로바이러스 감염을 예방하는 방법.
  41. 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 단백질을 포함하는 조성물:
    공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 1 (ZEBOV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편; IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1(ZEBOV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 1에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 자이레 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열;
    공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 2(SUDV CON), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2(SUDV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 2에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공통 수단 에볼라바이러스 엔벨로프 당단백질의 아미노산 서열;
    마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 3 (MARV), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3(MARV), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 3에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마르부르그 마르부르그바이러스 안골라 2005 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열;
    제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 4 (MARV CON1), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4(MARV CON1), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 4에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제1의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열;
    제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원,: 서열 번호: 5 (MARV CON2), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5(MARV CON2), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 5에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제2의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열; 및
    제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원, 서열 번호: 6 (MARV CON3), 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6(MARV CON), IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6의 단편, IgE 신호 펩타이드에 연결된 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열, 및 IgE 신호 펩타이드에 연결된 600개 이상의 아미노산을 포함하는 서열 번호: 6에 대해 95% 상동성인 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제3의 공통 마르부르그 마르부르그바이러스 엔벨로프 당단백질 면역원의 아미노산 서열.
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