MX2012004967A - Proteinas de consenso del virus de la fiebre aftosa (fmdv), secuencias codificantes para estas y vacunas fabricadas a partir de estas. - Google Patents

Proteinas de consenso del virus de la fiebre aftosa (fmdv), secuencias codificantes para estas y vacunas fabricadas a partir de estas.

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Douglas R Kern
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Mathura P Ramanathan
Niranjan Y Sardesai
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Patricia A Brown
Rodney A Bowling
Karuppiah Muthumani
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Abstract

Se proporciona en la presente un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de consenso de la fiebre aftosa FMDV, proteínas de cobertura VP1-4 de FMDV subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3, así como plásmidos y vacunas que expresan las secuencias. También se proporcionan en la presente métodos para generar una respuesta inmunitaria contra uno o más subtipos de FMDV usando la vacuna tal como se describe anteriormente, así como métodos para descifrar entre mamíferos vacunados con la vacuna y aquellos que están infectados con FMDV.

Description

PROTEINAS DE CONSENSO DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (FMDV) , SECUENCIAS CODIFICANTES PARA ESTAS Y VACUNAS FABRICADAS A PARTIR DE ESTAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas de consenso inmunogénicas del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas, a vacunas contra el FMDV, a métodos para inducir respuestas inmunitarias contra el FMDV, a métodos para distinguir entre individuos infectados con FMDV en comparación a aquellos vacunados contra el FMDV y métodos para inmunizar profiláctica y/o terapéuticamente individuos contra el FMDV.
Antecedentes de la Invención La fiebre aftosa es una enfermedad altamente contagiosa de animales domésticos y animales salvajes de pezuña hendida que incluyen vacunos, porcinos, caprinos y venados que se replica rápidamente en el hospedador y se propaga en animales susceptibles al contacto. La enfermedad se caracteriza por fiebre, cojera y lesiones vesiculares de la lengua, patas, hocico y tetas, .produciendo alta morbosidad pero baja mortalidad en animales adultos . El agente causal es el virus de la fiebre aftosa (FMDV) , el tipo de especie del género Aphthovirus, de la familia Picornaviridae . El FMDV es un genoma de ARN de sentido positivo de cadena simple de Ref.: 230028 aproximadamente 8500 bases rodeadas por una cápside icosahédrica con 60 copias cada una de cuatro proteínas estructurales VPl-4 y es altamente variable desde el punto de vista antigénico con diversos subtipos que incluyen A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3. Los recientes brotes de fiebre aftosa en una cantidad de países libres de. la enfermedad que incluyen a Taiwán en 1997, Reino Unido y Países Bajos en 2001 y la aparición en diversos países de América del Sur aumentaron el conocimiento del virus económicamente destructivo. Asimismo, hay una preocupación mundial acerca de que pueda dirigirse un posible ataque . terrorista a países tales como la industria de la ganadería de cien mil millones de dólares por año empleando el FMDV.
Las medidas previas para controlar el FMDV incluyen el sacrificio de los animales infectados o en contacto y la descontaminación. Los países que sacrifican su ganado debido a brotes de FMDV pueden retomar las actividades ganaderas únicamente si los países tienen estatus de libre de FMDV durante 3 meses luego del último brote. Los países generalmente utilizan la vacunación de los animales para tratar un brote de FMDV como último recurso debido a que los países que vacunan y no sacrifican los animales deben esperar un año entero para volver a tener estatus de libre de FMD. Sin embargo, los países buscan vacunar sus animales antes que un brote de FMDV pueda retener su estatus de libre de FMD.
En el pasado, las vacunas de FMDV incluían antígeno del virus completo químicamente inactivado junto con cualquier adyuvante; sin embargo, tiene desventajas debido a que requiere instalaciones de fabricación de alta contención costosas para producir la vacuna. Durante los pasados 25-30 años los investigadores trataron de desarrollar una vacuna que proporcionara protección luego de una sola inoculación. Estos esfuerzos incluyen el uso de VP1 purificado de partículas de virus, VP1 biomódificados , péptidos de VP1, péptidos de VP1 químicamente sintetizados, vectores vivos que expresan epítopos de VP1, inoculación con epítopos de VP1 que codifican ADN y el uso de proteína cápside completa VP1-4 producida de cultivos infectados con FMDV o la administración de la cápside VP1-4 a través del vector de adenovirus tipo 5 (Ad5) humano de replicación defectuosa. Todos estos enfoques presentan solo una cantidad limitada de epítopos en todos los subtipos de los virus FMDV para el animal inoculado.
Por consiguiente, es necesario en la técnica una vacuna y métodos para diagnosticar mamíferos infectados con FMDV que sean adecuados para dar protección contra diversos epítopos de FMDV en varios subtipos de FDMV.
Breve Descripción de la Invención En la presente se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de consenso de VPl-4 de subtipos de virus de la fiebre aftosa A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 , SAT4 o un complemento de los mismos. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en (a) SEQ ID NOS: 17-23; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de 24-30; (c) un variante del 80% de (a) ; y un complemento de (a) o (b) . También se proporciona un vector que comprende una secuencia heteróloga donde la secuencia heteróloga consiste en la secuencia descrita anteriormente.
También se proporciona en la presente una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra diversos subtipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV) donde la vacuna comprende un plasmido de ADN que comprende un promotor operativamente enlazado a una secuencia codificante que codifica un antigeno del FMDV de consenso que comprende proteínas de la cápside VP1-4 de uno o más subtipos de FMDV y un excipiente f rmacéuticamente aceptable donde el plasmido de ADN es capaz de expresar el antígeno del FMDV de consenso en una célula del mamífero en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el mamífero. La vacuna puede generar una respuesta inmunitaria contra subtipos de FMDV A, Asia 1, C, O, SAT1 , SAT2 , SAT3 o combinaciones de los mismos. Las secuencias codificantes del plasmido de la vacuna pueden ser del antígeno del FMDV que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1-7 o combinaciones de los mismos. Las secuencias codificantes del plásmido de la vacuna pueden comprender adicionalmente una secuencia líder de extremo N donde la secuencia líder es IgG o IgE. El plásmido de la vacuna puede comprender adicionalmente una secuencia de poliadenilación a continuación del extremo 3' de la secuencia codificante. El plásmido de la vacuna puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifican una proteasa 3C de FMDV de consenso de los subtipos A, Asia 1, C, 0, SATl', SAT2 o SAT3. La secuencia de nucleótidos de la proteasa 3C de FMDV puede ser SEQ ID NO: 15 y puede codificarse por la secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID NO: 16. El plásmido de la vacuna puede ser un codón optimizado. La secuencia codificante del antígeno del FMDV también puede comprender proteasa VP1-4 y 3C que incluye SEQ ID NOS: 7-14. El excipiente farmacéuticamente aceptable de la vacuna puede ser adyuvante y el adyuvante puede ser IL-2 o IL-15. El excipiente farmacéuticamente aceptable de la vacuna puede ser un agente que facilita la transfección. El agente que facilita la transfección puede ser un polianión, policatión o lípido tal como poli-L-glutamato a una concentración menor a 6 mg/ml . La vacuna se puede administrar a un porcino, rumiante, humano o primate. La vacuna puede provocar una respuesta humoral o celular o tanto humoral como celular.
También se proporciona en la presente una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra diversos subtipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV) donde la vacuna comprende uno o más plásmidos de ADN que comprenden un promotor operativamente enlazado a una secuencia codificante que codifica un antigeno del FMDV de consenso que comprende proteínas de la cápside VPl-4 de uno o más subtipos de FMDV que se seleccionan del grupo que consiste en los subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 , SAT3 o una combinación de los mismos y un excipiente farmacéuticamente aceptable de los mismos donde los plásmidos de ADN son capaces de expresar un antígeno del FMDV de consenso en una célula del mamífero en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el mamífero. La secuencia codificante del antígeno de FMDV también se puede seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-7, o una combinación de las mismas . El plásmido de la vacuna también puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa 3C de consenso de FMDV para los subtipos A, Asial, C, O. SAT1, SAT2 o SAT3 y puede comprender las secuencias de nucleótidos establecidas en la SEQ ID NO: 15. La vacuna se puede administrar a un mamífero tal como porcino, rumiante, humano o primate. La vacuna puede provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como una respuesta humoral, celular, o tanto humoral como celular.
También se proporciona en la presente una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra diversos subtipos de FDMV donde la vacuna -comprende un antígeno que comprende una o más secuencias de aminoácidos de consenso que codifican proteínas de la cápside VP1-4 de subtipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV) A, Asia 1, C, 0, SAT1, SAT2, o SAT3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. La secuencia de aminoácidos codificantes del antígeno FMDV puede ser SEQ ID NOS: 24-30. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante que se selecciona del grupo que consiste en IL-2 y IL-15. El excipiente farmacéuticamente aceptable de la vacuna puede ser un agente que facilita la transíección. El agente que facilita la transfección puede ser un polianión, policatión o un lípido tal como poli-L-glutamato a una concentración menor a 6 mg/ml. La vacuna se puede administrar a un mamífero tal como un porcino, rumiante, humano o primate. La vacuna puede provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como una respuesta humoral, celular, o tanto humoral como celular.
También se proporciona en la presente un método para provocar una respuesta inmunitaria contra diversos subtipos de virus FMDV en un mamífero que comprende administrar la vacuna de plásmido de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 21 al tejido del mamífero y electroporar células del tejido con un pulso de energía a una corriente constante eficaz para permitir la entrada del plásmido de ADN en las células. La administración del plásmido de ADN de conformidad con la reivindicación 1 en el método puede comprender inyectar la vacuna de plásmido de ADN en el tejido intradérmico, subcutáneo o muscular. El plásmido de ADN del método puede administrarse configurando la corriente y el pulso de energía a una corriente constante que iguale la corriente presente. El paso de electroporación del método puede comprender adicionalmente medir la impedancia en las células electroporadas, ajustar el nivel de energía del pulso de energía con relación a la impedancia medida para mantener una corriente constante en las células electroporadas donde los pasos de medición y ajuste ocurren dentro de la duración del pulso de energía. El paso de electroporación puede comprender adicionalmente administrar el pulso de energía a varios electrodos de acuerdo con un patrón de secuencia de pulso que administra el pulso de energía en un patrón descentralizado.
También se proporciona un método para diagnosticar un mamífero infectado con FMDV, que comprende aislar una muestra de fluidos del mamífero, aislar anticuerpos de la muestra de fluidos del mamífero y comparar los anticuerpos aislados del paso b con un mamífero de control que se inoculó con la vacuna de conformidad con la reivindicación 3 donde el mamífero de control solo tiene anticuerpos para las proteínas VP1-4 de FMDV y el mamífero infectado con FMDV tiene anticuerpos para las proteínas VPl-4 de FMDV y proteínas FMDV no estructurales . Las proteínas no estructurales pueden ser poliraerasa 2C, 3A y 3D de FMDV.
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia que codifica una proteína que tiene una o más secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: una o más de SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos, variantes con 80% o más de homología con las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos y complementos de estos.
En algunas modalidades, las secuencias de ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en: las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41 con o sin una secuencia codificante de una secuencia líder, complementos de estas, fragmentos de estas que codifican al menos 20 aminoácidos, complementos de estos, moléculas de ácidos nucleicos 80% homologas a las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41, complementos de estas, fragmentos de estas que codifican al menos 20 aminoácidos y complementos de estos.
Se proporciona una vacuna que comprende las moléculas de ácido nucleico y/o una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos, variantes con 80% o más de homología con las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, y fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos.
También se proporcionan composiciones que comprenden una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos, variantes con 80% o más de homología con las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, y fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos .
Se proporcionan métodos para provocar una respuesta inmunitaria contra uno o más subtipos de virus FMDV en un mamífero. Los métodos comprenden usar una vacuna descrita en la presente y, en algunas modalidades, pueden incluir los pasos de administrar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene secuencia inmunogénica de FMDV al tejido del mamífero; y electroporar células del tejido con un pulso de energía a una corriente constante eficaz para permitir la entrada del plásmido de ADN en las células .
También se proporciona un método de diagnóstico de mamíferos infectados con FMDV en un mamífero vacunado de acuerdo con procesos descritos en la presente.- Los métodos comprenden aislar una muestra de líquido del mamífero vacunado y detectar la presencia de proteínas de FMDV no incluidas en la vacuna y/o anticuerpos contra proteínas de FMDV no incluidas en la vacuna. La presencia de las proteínas de FMDV y/o anticuerpos contra las proteínas de FMDV indica que el mamífero vacunado fue infectado con FMDV.
Descripción Detallada de la Invención Las secuencias de aminoácidos de consenso se generaron para proteínas de fusión que comprenden múltiples proteínas de FMDV y proteínas de FMDV individuales de varios serotipos. También se generaron moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas.
En un aspecto de la presente invención, hay proteínas de fusión que comprenden proteínas de FMDV de consenso VP1, VP2, VP3 , VP4 y/o 3C y secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas, que se pueden generar y usar en una vacuna para proporcionar protección de mamíferos contra la fiebre aftosa en uno o más subtipos de FMDV, que incluyen A, Asia 1, 0, C, SAT1, SAT2 y SAT3.
En otro aspecto de la presente invención, hay proteínas de fusión que comprenden proteínas de FMDV de consenso VPl y secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas, de dos subtipos diferentes que se pueden generar y usar en una vacuna para proporcionar protección a mamíferos contra la fiebre aftosa en uno o más subtipos de FMDV, que incluyen A, Asia 1, O, C, SATl, SAT2 y SAT3.
En otro aspecto de la presente invención, hay proteínas de FMDV de consenso VPl y secuencias de ácido nucleico que codifican a estas que se pueden generar y usar en una vacuna para proporcionar protección a mamíferos contra la fiebre aftosa en uno o más subtipos de FMDV, que incluyen A, Asia 1, 0, C, SATl, SAT2 y SAT3.
A pesar de no limitarse a la teoría, una vacuna dirigida contra las secuencias de aminoácidos de consenso VPl, VP2, VP3 y/o VP4 para uno o más subtipos de FMDV presentarán un gran repertorio de epítopos que son eficaces para provocar una respuesta inmunitaria eficaz (ya sea humoral, celular o ambas) contra la mayoría de las especies dentro de cada subtipo de FMDV. La presente invención se refiere a usar estas secuencias de aminoácidos de consenso VPl, VP2, VP3 y/o VP4 de los subtipos de FMDV para generar plásmidos adecuados y proteínas para usar en vacunas para administrar a mamíferos para proporcionar una protección preventiva contra el FMDV. Asimismo, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico usando estas secuencias de consenso de antígenos de FMDV VP1, VP2, VP3 y/o VP4 para identificar y distinguir mamíferos que se vacunaron de forma adecuada y no están infectados contra mamíferos que se infectaron con FMDV a través de la detección de anticuerpos dirigidos a proteínas no estructurales de FMDV tales como la polimerasa 3D.
A pesar de no limitarse a la teoría científica, VP1 es una excelente diana inmunogénica para una vacuna dirigida contra las secuencias de aminoácidos de consenso de VP1. VP1 es un inmunógeno predominante . 1. Definiciones.
La terminología usada en la presente tiene el propósito de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser limitante. Tal como se usa en la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una" y "el/la", incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Para enumerar los intervalos numéricos en la presente, se contempla explícitamente cada número intermedio entre estos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo de 6.0-7.0, se contemplan explícitamente los números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 y 7.0. a . Adyuvante "Adyuvante" tal como se usa en la presente puede significar cualquier molécula agregada a las vacunas de plásmidos de ADN descritas en la presente para mejorar la antigenicidad del antígeno del virus de la fiebre aftosa (FMDV) codificado por los plásmidos de ADN y secuencias de ácido nucleico codificantes descritas en la presente más adelante . b. Anticuerpo "Anticuerpo" puede significar un anticuerpo de clases IgG, IgM, IgA, IgD o igE o fragmentos, fragmentos o derivados de los mismos, que incluyen Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de cadena simple, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos , anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos . El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado de la muestra de suero del mamífero, un anticuerpo policlonal, anticuerpo purificado de afinidad o mezclas de los mismos que exhiben suficiente especificidad de unión a un epítopo deseado o a una secuencia derivada de este. c. Secuencia codificante La "secuencia codificante" o "ácido nucleico codificante" tal como se usa en la presente puede referirse al ácido nucleico (molécula de ADN o ARN) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificante puede incluir adicionalmente señales de inicio y terminación unidas operativamente a elementos reguladores que incluyen una señal promotora y de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero a quien se le administra el ácido nucleico . d. Complemento "Complemento" o "complementario" tal como se usa en la presente puede significar un ácido nucleico, puede significar par de bases Watson-Crick (por ej . , A-T/U y C-G) o Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótido de moléculas de ácido nucleico. e. Consenso o secuencia de consenso "Consenso" o "secuencia de consenso" tal como se usa en la presente puede significar una secuencia de ácido nucleico sintética o secuencia de polipéptido correspondiente, construida según un análisis de un alineamiento de múltiples subtipos de un antígeno de influenza particular que se puede usar para inducir amplia inmunidad contra múltiples subtipos o serotipos de un antígeno de influenza particular. Los antígenos FMDV de consenso pueden incluir secuencias de aminoácidos y nucleótidos de proteasa VP1, VP2, VP3 , VP4 y C2. Asimismo, los antígenos sintéticos tales como proteínas de fusión se pueden manipular para secuencias de consenso (o antígenos de consenso) . f. Corriente constante "Corriente constante" tal como se usa en la presente para definir una corriente que recibe o experimenta un tejido o células que definen el tejido durante la duración de un pulso eléctrico administrado al mismo tejido. El pulso eléctrico se administra mediante dispositivos de electroporación descritos en la presente. Esta corriente se mantiene a un amperaje constante en el tejido durante la duración de un pulso eléctrico debido a que el dispositivo de electroporación proporcionado en la presente tiene un elemento de retroalimentación, preferentemente tiene retroalimentación instantánea. El elemento de retroalimentación puede medir la resistencia del tejido (o células) durante la duración del pulso y provocar que el dispositivo de electroporación altere su salida de energía eléctrica (por ej . , aumentar el voltaje) para que la corriente en el mismo tejido permanezca constante durante el pulso eléctrico (en el orden de microsegundos) y de pulso en pulso. En algunas modalidades, el elemento de retroalimentación comprende un controlador. g. Retroalimentación de corriente o retroalimentación "Retroalimentación de corriente" o "retroalimentación" tal como se usa en la presente se pueden usar de manera intercambiable y pueden significar la respuesta activa de los dispositivos de electroporación provistos, que comprende medir la corriente del tejido entre electrodos y alterar la salida de energía administrada por el dispositivo EP en consecuencia para mantener la corriente a nivel constante. Este nivel constante lo configura un usuario antes de iniciar una secuencia de pulsos o tratamiento eléctrico. La retroalimentación se puede lograr por el componente de electroporación, por ej . , controlador, del dispositivo de electroporación, ya que el circuito eléctrico allí puede monitorear continuamente la corriente en el tejido entre electrodos y comparar que la corriente monitoreada (o corriente dentro del tejido) a una corriente preconfigurada y hacer continuamente ajustes de salida de energía para mantener la corriente monitoreada a niveles preconfigurados . El bucle de retroalimentación puede ser instantáneo debido a que es una retroalimentación de bucle cerrado analógica, h. Corriente descentralizada "Corriente descentralizada" tal como se usa en la presente puede significar el patrón de corrientes eléctricas administradas de varias disposiciones de electrodos de aguja de los dispositivos de electroporación descritos en la presente, donde los patrones minimizan, o preferentemente eliminan, la ocurrencia de estrés térmico relacionado con la electroporación en cualquier área de tejido que esté siendo electroporado . i. Electroporación "Electropóración" , "electropermeabilización" o "mejora electrocinética" ("EP") tal como se usa en la presente de manera intercambiable puede referirse al uso de un pulso de campo eléctrico de transmembrana para inducir vías microscópicas (poros) en una biomembrana, su presencia permite que las bio oléculas tales como plásmidos, oligonucleótidos , ARNip, fármacos, iones y agua pasen de un lado de la membrana celular a la otra. j . Mecanismo de retroalimentación El "mecanismo de retroalimentación" tal como se usa en la presente puede referirse a un proceso realizado ya sea por software o hardware (o firmware) , que recibe el proceso y compara la impedancia del tejido deseado (antes, durante y/o luego de la administración del pulso de energía) con un valor presente, preferentemente corriente, y ajusta el pulso de energía administrado para lograr el valor preconfigurado . Se puede llevar a cabo un mecanismo de retroalimentación con un circuito de bucle cerrado analógico, k. Fragmento "Fragmento" tal como se usa en la presente puede significar una parte o un ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero sustancialmente similar a aquella del no fragmento durante al menos un subtipo de FMDV tal como A, Asia 1, C, 0, SAT1, SAT2 o SAT3. Los fragmentos pueden ser fragmentos de ADN que se seleccionan de al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos codificantes de la presente invención, que incluyen SEQ ID NOS: 1-7 y 15-21. Los fragmentos pueden comprender al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41. Los fragmentos pueden comprender al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41 con la condición de que los fragmentos incluyan uno o más de los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 O 275. Todos los fragmentos también pueden excluir opcionalmente aminoácidos. Los fragmentos de ADN pueden ser 30 o más nucleótidos de longitud, 45 o más, 60 o más, 75 o más, 90 o más, 120 o más, 150 o más, 180 o más, 210 o más, 240 o más, 270 o más, 300 o más, 360 o más, 420 o más, 480 o más, 540 o más, 600 o más, 660 o más, 720 o más, 780 o más, 840 o más, 900 o más, 960 o más, 1020 o más, 1080 o más, 1140 o más, 1200 o más, 1260 o más, 1320 o más, 1380 o más, 1440 o más, 1500 o más, 1560 o más, 1620 o más, 1680 o más, 1740 o más, 1800 o más, 1860 o más, 1820 o más, 1880 o más, 1940 o más, 2000 o más, 2600 o más, 2700 o más, 2800 o más, 2900 o más, 2910 o más, 2920 o más, 2930 o más, 2931 o más, 2932 o más, 2933 o más, 2934 o más, 2935 o más, 2936 o más, 2937 o más o 2938 o más de longitud.
Los fragmentos de ADN pueden comprender secuencias codificantes para el líder de inmunoglobulina tales como las secuencias IgE o IgG.
Los fragmentos de ADN pueden ser menos que 10 nucleótidos, menos que 20, menos que 30, menos que 40, menos que 50, menos que 60, menos que 75, menos que 90, menos que 120, menos que 150, menos que 180, menos que 210, menos que 240, menos que 270, menos que 300, menos que 360, menos que 420, menos que 480, menos que 540, menos que 600, menos que 660, menos que 720, menos que 780, menos que 840, menos que 900, menos que 960, menos que 1020, menos que 1080, menos que 1140, menos que 1200, menos que 1260, menos que 1320, menos que 1380, menos que 1440, menos que 1500, menos que 1560, menos que 1620, menos que 1680, o menos que 1740 nucleótidos, menos que 1800, menos que 1860, menos que 1820, menos que 1880, menos que 1940, menos que 2000, menos que 2600, menos que 2700, menos que 2800, menos que 2900, menos que 2910, menos que 2920, menos que 2930, menos que 2931, menos que 2932, menos que 2933, menos que 2934, menos que 2935, menos que 2936, menos que 2937 o menos que 2938.
"Fragmento" también puede significar un fragmento de polipéptido que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero sustancialmente similar a aquella del no fragmento durante al menos un subtipo de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 o SAT3. El fragmento puede ser un fragmento de polipéptido que se selecciona de al menos una de las diversas secuencias de polipéptidos codificantes de la presente invención, que incluyen SEQ ID ÑOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. El fragmento de polipéptido se puede analizar para hacer contacto con al menos un epítopo antigénico tal como lo proporciona la base de datos públicamente disponible tal como la Base de datos de secuencias de FMDV de Los Alamos National Laboratory. Los fragmentos de proteínas pueden comprender al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de SEQ ID NOS : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. Los polipéptidos pueden comprender secuencias de aminoácidos para el líder de inmunoglobulina tales como IgE o IgG. Los fragmentos de polipéptido pueden ser 30 o más aminoácidos de longitud, 45 o más, 60 o más, 75 o más, 90 o más, 120 o más, 150 o más, 180 o más, 210 o más, 240 o más, 270 o más, 300 o más, 360 o más, 420 o más, 480 o más, 540 o más, 600 o más, 660 o más o 710 aminoácidos o más de longitud. Los fragmentos de polipeptidos pueden ser menos de 10 aminoácidos, menos de 20, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60, menos de 75, menos de 90, menos de 120, menos de 150, menos de 180, menos de 210, menos de 240, menos de 270, menos de 300, menos de 360, menos de 420, menos de 480, menos de 540, menos de 600, menos de 660, menos de 700, menos de 701, menos de 702, menos de 703, menos de 704, menos de 705, menos de 706, menos de 707, menos de 708, menos de 709 o menos de 710 aminoácidos de longitud. 1. Homología La homología de múltiples alineaciones de secuencias pueden generarse usando ClustalW (htt : //www . ebi . ac . uk/Tools/clustalw2/index. html) . m. Idéntico "Idéntico/a" o "identidad" tal como se usa en la presente en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos puede significar que las secuencias tienen un porcentaje específico de residuos que son iguales en una región específica. El porcentaje se puede calcular alineando de manera óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias en la región específica, determinando la cantidad de posiciones en las que ocurre el residuo idéntico en ambas secuencias para proporcionar la cantidad de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre la cantidad total de posiciones en la región específica y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos en que las dos secuencias tienen distintas longitudes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región específica de comparación incluye solo una secuencia única, los residuos, de secuencia única se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo. Al comparar - el ADN y el A N, la timina (T) y el uracilo (U) se pueden considerar equivalentes. La identidad se puede llevar a cabo manualmente o usando un algoritmo de secuencias de computadora tal como BLAST o BLAST 2.0. n. Impedancia La "impedancia" tal como se usa en la presente se puede usar al discutir el mecanismo de retroalimentacion y se puede convertir a un valor corriente de acuerdo con la ley de Ohm, permitiendo así comparaciones con la corriente preconfigurada . o. Respuesta inmunitaria "Respuesta inmunitaria" tal como se usa en la presente puede significar la activación del sistema inmunitario de un hospedador, por ej . , el de un mamífero, en respuesta a la introducción de antígeno de consenso FMDV a través de las vacunas de plásmido de ADN. La respuesta inmunitaria puede estar en forma de respuesta celular o humoral, o ambas, p. Ácido nucleico "Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido" tal como se usan en la presente pueden significar al menos dos nucleótidos unidos covalentemente . La descripción de una cadena simple también define la secuencia de una cadena complementaria. Por consiguiente, un ácido nucleico también comprende la cadena complementaria de una cadena simple descrita. Se pueden usar muchas variantes de un ácido nucleico con el mismo fin que un ácido nucleico dado. Por consiguiente, un ácido nucleico también comprende ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de los mismos . Una cadena simple proporciona una sonda que puede hibridarse a una secuencia diana en condiciones estrictas de hibridación. Por consiguiente, un ácido nucleico también comprende una sonda que se híbrida en condiciones estrictas de hibridación.
Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena simple y cadena doble, o pueden contener partes tanto de secuencia de cadena doble como de cadena simple. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, y puede contener combinaciones de desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos se pueden obtener por métodos de síntesis química o por métodos recombinantes .
Un ácido nucleico generalmente contendrá enlaces de fosfodiéste , aunque se pueden incluir análogos de ácidos nucleicos que pueden tener al menos una unión diferente, por ej . , fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato o uniones de O-metilfosforoamidita y uniones y esqueletos de ácidos nucleicos de péptidos . Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con esqueletos positivos; los esqueletos no iónicos y esqueletos no de ribosa, que incluyen aquellos descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,235,033 y 5,034,506, que se incorporan mediante esta referencia. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más nucleótidos modificados o de origen no natural también se incluyen dentro de una definición de ácidos nucleicos. El análogo de nucleótido modificado se puede ubicar por ejemplo en el extremo 51 y/o el extremo 31 de la molécula de ácido nucleico. Los ejemplos representativos de análogos de nucleótido se pueden seleccionar de ribonucleótidos modificados con esqueleto o azúcar. Debería destacarse, sin embargo, que también son adecuados los ribonucleótidos modificados con nucleobase, es decir ribonucleótidos que contiene una nucleobase que no es de origen natural en vez de un nucleobase de origen natural tal como uridinas o citidinas modificadas en la posición 5, por ej . , 5- (2-amino)propil uridina, 5-bromo uridina; adenosinas y guanosinas modificadas en la posición 8, por ej . 8 -bromo guanosina; deaza nucleótidos, por ej . 7-deaza-adenosina; nucleótidos 0- y N-alquilados, por ej . N6-metil adenosina. El grupo 2' -OH se puede reemplazar por un grupo que se selecciona de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, donde R es alquilo, alquenilo o alquinilo Ci-C6, y halo es F, Cl, Br o I . Los nucleótidos modificados también incluyen nucleótidos conjugados con colesterol a través de, por ej . , una unión de hidroxiprolinol tal como se describe en Krutzfeldt et l., Nature (Oct. 30, 2005) , Soutschek et ál . , Nature 432:173-178 (2004) , y la publicación de patente estadounidense No. 20050107325, que se incorpora a la presente mediante esta referencia. Los nucleótidos y ácidos nucleicos modificados también pueden incluir ácidos nucleicos bloqueados (LNA) , tal como se describe en la patente estadounidense No. 20020115080, que se incorpora en la presente mediante esta referencia. Los nucleótidos y ácidos nucleicos modificados adicionales se describen en la publicación de patente estadounidense No. 20050182005, que se incorpora a la presente mediante esta referencia. Las modificaciones del esqueleto de ribosa- fosfato se pueden llevar a cabo por diversas razones, por ej . , para aumentar la estabilidad y semivida de las moléculas en ambientes fisiológicos, para mejorar la difusión a través de membranas celulares o como sondas en un biochip. Las mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos se pueden realizar; de manera alternativa, se pueden realizar mezclas de diferentes análogos de ácido nucleico y mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos. q. Operativamente enlazado "Operativamente enlazado" tal como se usa en la presente puede significar que la expresión de un gen está bajo control de un promotor con el cual se conecta espacialmente . Un promotor se puede posicionar Dirección 5' o Dirección 3' de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente igual a la distancia entre ese promotor y el gen que controla en el gen del cual deriva el promotor. Tal como se conoce en la técnica, la variación en esta distancia puede acomodarse sin pérdida de función promotora, r. Promotor "Promotor" tal como se usa en la presente puede significar una molécula de origen natural o sintético que es capaz de conferir, activar o mejorar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras transcripcionales específicas para mejorar adicionalmente la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o expresión temporal de las mismas. Un promotor también puede comprender elementos represivos o potenciadores distales, que se pueden ubicar tanto como varios miles de pares de base del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor se puede derivar de fuentes que incluyen virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente gen constitutivamente o diferencialmente con respecto a la célula, el tejido u órgano en los que ocurre expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que ocurre la expresión o en respuesta a los estímulos externos tales como estreses fisiológicos, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Los ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor bacteriófago T7 , promotor bacteriófago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor tardío SV40, promotor temprano SV40, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor temprano SV40 o promotor tardío SV40 y el promotor CMV IE . s. Condiciones estrictas de hibridación Las "condiciones estrictas de hibridación" tal como se usa en la presente pueden significar condiciones en las que una primera secuencia de ácido nucleico (por ej . , sonda) se hibridarán a una segunda secuencia de ácido nucleico (por ej . , diana) , tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones estrictas son dependientes de secuencias y diferirán en circunstancias distintas. Las condiciones estrictas se pueden seleccionar para que sean alrededor de 5-10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. La Tm puede ser la temperatura (según la concentración nucleica, de pH y fuerza iónica definidos) en la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan a la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Las condiciones estrictas pueden ser aquellas en donde la concentración salina es menor a alrededor de 1.0 M de concentración de ión de sodio, tal como alrededor de 0.01 a 1.0 M de concentración de ión de sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos alrededor de 30°C para sondas cortas (por ej . , 10-50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 °C para sondas largas (por ej . , mayor a 50 nucleótidos). Las condiciones estrictas pueden lograrse también con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos 2 a 10 veces hibridación de fondo. Los ejemplos de condiciones estrictas de hibridación incluyen los siguientes: 50% de formamida, 5x SSC y 1% de SDS, incubar a 42°C, o 5x SSC, 1% de SDS, incubar a 65°C, con lavado en 0.2x SSC y 0.1% de SDS a 65°C. t. Sustancialmente complementario "Sustancialmente complementario/a" tal como se usa en la presente puede significar que una primera secuencia es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica al complemento de una segunda secuencia en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos o aminoácidos, o que las dos secuencias se hibridan en condiciones estrictas de hibridación. u. Sustancialmente idéntico "Sustancialmente idéntico/a" tal como se usa en la presente puede significar que una primera y segunda secuencias son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas en una región de 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia. v. Subtipo o serotipo "Subtipo" o "serotipo" tal como se usan en la presente de manera intercambiable y con referencia a virus FMDV significan variantes genéticas de un antígeno de virus FMDV de forma que un subtipo se reconoce por un sistema inmunitario aparte de un subtipo distinto. w. Variante "Variante" usado en la presente con respecto a un ácido nucleico puede significar (i) una parte o fragmento de una secuencia de nucleótidos mencionada; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos mencionada o parte de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico mencionado o el complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que se híbrida en condiciones estrictas al ácido nucleico mencionado, complemento del mismo o secuencias sustancialmente idénticas al mismo.
"Variante" con respecto a un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, eliminación o sustitución conservadora de aminoácidos, pero retiene al menos una actividad biológica. La variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína mencionada con una secuencia de aminoácidos que retiene al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente con propiedades similares (por ej . , hidrofilicidad, grado y distribución de regiones cargadas) se reconoce en la técnica como que involucran una carga menor. Estas cargas menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, según se entiende en la técnica. Kyte et ál . , J. Mol. Biol . 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Se conoce en la técnica que los aminoácidos de índices idropáticos similares se pueden sustituir y aun retener la función proteica. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2 . La hidrofilicidad de aminoácidos también se puede usar para revelar sustituciones que resultarían en proteínas que retienen la función" biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de aminoácidos en el contexto de un péptido permite calcular la mayor hidrofilicidad promedio local de ese péptido, una medida útil que se reportó que se correlaciona bien con la antigenicidad e inmunogenicidad. Patente estadounidense No. 4,554,101, incorporada a la presente en su totalidad mediante esta referencia. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad similares puede resultar en péptidos que retienen actividad biológica, por ejemplo inmunogenicidad, tal como se entiende en la técnica. Las sustituciones se pueden llevar a cabo con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ±2 de estos. Tanto el índice de hidrofobicidad y el valor de hidrofilicidad de aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácido que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal como se revela por la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades. x. Vector El "vector" usado en la presente puede significar una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un plásmido, bacteriófago, cromosoma artificial bacteriano o cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. Un vector puede ser ya sea un vector extracromosómico auto replicante o un vector que integra un genoma hospedador. 2. Proteínas de FMDV Se proporciona en la presente un antígeno capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más subtipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV) . El antígeno puede ser un antígeno de FMDV que comprende proteína de cápside VP1, VP2 , VP3 , VP4 , un consenso de estas, una variante de estas, un fragmento de estas o una combinación de estas. El antígeno de FMDV puede ser del subtipo de FMDV A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 o SA 3. El antígeno de FMDV puede contener al menos un epítopo antigénico que puede ser eficaz contra los inmunógenos de FMDV particulares contra los que se puede inducir una respuesta inmunitaria. Las proteínas de cápsides VP1-4 virales vacías del antígeno de FMDV proporcionan un repertorio completo de los sitios y epítopos inmunogénicos presentes en un virus de FMDV intacto. La secuencia de antígeno de FMDV de consenso puede estar derivada de las secuencias de antígeno de FMDV de varios de los virus de FMDV de un subtipo de FMDV. El antígeno de FMDV de consenso puede comprender secuencias de proteína de consenso del subtipo VP1, VP2 , VP3 y VP4 de FMDV, que puede ser una proteína VPl-4 de consenso. La proteína VPl-4 de ¦consenso puede comprender al menos un sitio de escisión de la proteína 3C de FMDV. El sitio de escisión de la proteína 3C puede estar presente entre cada una de las secuencias de consenso VP1, VP2, VP3 y VP4 de la proteína VPl-4 de consenso. La escisión de la proteína VPl-4 de consenso por parte de la proteína 3C puede escindir la proteína VPl-4 de consenso para producir una proteína VP1- de consenso, VP2- de consenso, VP3- de consenso y VP4 de consenso. De manera alternativa, un sitio de escisión proteolítico natural puede estar presente entre cada una de las secuencias de antígeno de consenso, tal como la secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 45: RGRKRRS .
Se proporcionan proteínas de fusión que comprenden VP1, VP2 , VP3 y VP4 de consenso, y un consenso de proteasa 3C. Estas son SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 que son secuencias de consenso de los subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3, respectivamente.
La SEQ ID NO: 16 es una secuencia de proteasa 3C de consenso .
Se proporcionan proteínas de fusión que comprenden VPl, VP2, VP3 y VP4 de consenso. Estas son SEQ ID NOS: 18, 20, 22, 24, 26, 28 y 30 que son secuencias de consenso de los subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 y SA 3 , respectivamente.
Las SEQ ID NOs:32, 34, 36 y 38 son las secuencias de consenso para los subtipos de VPl Asia, O, A y C, respectivamente. Estas secuencias incluyen la secuencia líder IgE SEQ ID NO: 44 que, en cada caso, se puede sustituir con un líder distinto o se puede eliminar y sustituir con metionina.
Las SEQ ID NOs:40 y 42 son proteínas de fusión de dos secuencias de consenso para VPl. La SEQ ID NO: 40 son los subtipos de VPl de consenso A y subtipo de VPl C. La SEQ ID NO: 42 son los subtipos de VPl de consenso Asia y subtipo de VPl O. Estas secuencias incluyen la secuencia líder IgE SEQ ID NO: 44 que, en cada caso, se puede sustituir con un líder distinto o se puede eliminar y sustituir con metionina.
De manera adicional, las proteínas pueden ser fragmentos de las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 20% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 20% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 30% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 40% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 50% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 60% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 70% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 80% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 90% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 95% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 96% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 97% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 98% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 99% de la proteína de consenso.
De manera adicional, las proteínas pueden ser homologas a las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. En algunas modalidades, las proteínas son 80% homologas. En algunas modalidades, las proteínas son 90% homologas. En algunas modalidades, las proteínas son 95% homologas. En algunas modalidades, las proteínas son 96% homologas. En algunas modalidades, las proteínas son 97% homologas. En algunas modalidades, las proteínas son 98% homologas. En algunas modalidades, las proteínas son 99% homologas.
De manera adicional, las proteínas pueden ser fragmentos de las proteínas homologas a las SEQ ID NOs : 2 , 4 , 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 20% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 20% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 30% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 40% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 50% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 60% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 70% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 80% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 90% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 95% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 96% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 97% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 98% de la proteina homologa. En algunas modalidades, las proteínas constituyen el 99% de la proteína homologa. 3. Secuencias codificantes Se proporcionan en la presente secuencias codificantes de antígenos que pueden provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más subtipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV) . El antígeno puede ser un antígeno de FMDV que comprende proteína de cápside VP1, VP2, VP3, VP4 , un consenso de esta, una variante de esta, un fragmento de esta o una combinación de esta. El antígeno de FMDV puede ser del subtipo de FMDV A, Asia 1, C, 0, SAT1, SAT2 o SA 3. El antígeno de FMDV puede contener al menos un epítopo antigénico que puede ser eficaz contra los inmunógenos de FMDV particulares contra los que se puede inducir una respuesta inmunitaria. Las proteínas de cápsides VP1-4 virales vacías del antígeno de FMDV proporcionan un repertorio completo de los epítopos y sitios inmunogénicos presentes en un virus de FMDV intacto. La secuencia de antígeno de FMDV de consenso puede derivar de las secuencias de antígeno de FMDV de varios virus de FMDV de un subtipo de. FMDV. El antígeno de FMDV de consenso puede comprender secuencias de proteína de consenso del subtipo VP1, VP2 , VP3 y VP4 de FMDV, que puede ser una proteína VP1-4 de consenso. La proteína VPl-4 de consenso puede comprender al menos un sitio de escisión de la proteína 3C de FMDV. El sitio de escisión de la proteína 3C puede estar presente entre cada una de las secuencias de consenso VP1, VP2 , VP3 y VP4 de la proteína VPl-4 de consenso. La escisión de la proteína VPl-4 de consenso por parte de la proteína 3C puede escindir la proteína VPl-4 de consenso para producir una proteína VPl de consenso, VP2 de consenso, VP3 de consenso y VP4 de consenso. De manera alternativa, un sitio de escisión proteolítico natural puede estar presente entre cada una de las secuencias de antígeno de consenso, tal como la secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 45: RGRKRRS.
Se proporcionan secuencias codificantes para las proteínas de fusión que comprenden VPl, VP2, VP3 y VP4 de consenso y un consenso de proteasa 3C. Estas son SEQ ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13 que codifican las secuencias de consenso de los subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3 , respectivamente .
La SEQ ID NO: 15 codifica una secuencia de proteasa 3C de consenso.
Se proporcionan secuencias codificantes para las proteínas de fusión que comprenden VPl, VP2, VP3 y VP4 de consenso. Estas son SEQ ID NOs : 17, 19, 21, 23, 25, 27 y 29 que son secuencias de consenso de los subtipos A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 y SAT3, respectivamente.
Las SEQ ID NOs: 31, 33, 35 y 37 codifican las secuencias de consenso para los subtipos de VPl Asia, O, A y C, respectivamente. Estas secuencias incluyen secuencias codificantes para la secuencia líder IgG SEQ ID NO: 44 que, en cada caso, se puede sustituir con una secuencia codificante para un líder distinto o se puede eliminar y sustituir solamente un codón de inicio.
Las SEQ ID NOs: 40 y 42 son proteínas de fusión de dos secuencias de consenso para VPl. La SEQ ID NO: 40 es los subtipos de VPl A y subtipo de VPl C de consenso. La SEQ ID NO: 42 es los subtipos de VPl Asia y subtipo de VPl O de consenso. Estas secuencias incluyen la secuencia líder IgE SEQ ID NO: 44 que, en cada caso, se puede sustituir con una secuencia codificante para un líder distinto o se puede eliminar y sustituir solamente un codón de inicio.
De manera adicional, las secuencias codificantes que pueden codificar proteínas pueden ser fragmentos de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 20% de la proteína- de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 30% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 40% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 50% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 60% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 70% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 850% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 90% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 95% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 96% de la proteína de consenso. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 97% de la proteína de consenso.
De manera adicional, las secuencias codificantes pueden codificar proteínas que son homologas a las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 80% homologas. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 90% homologas. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 95% homologas. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 96% homologas. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 97% homologas. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 98% homologas. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que son 99% homologas.
De manera adicional, las secuencias codificantes codifican proteínas que son fragmentos de proteínas homologas a las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, .34, 36, 38, 40 y 42. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 20% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 30% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 40% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 50% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 60% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 70% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 80% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 90% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 95% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 96% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 97% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 98% de la proteína homologa. En algunas modalidades, las secuencias codificantes codifican proteínas que constituyen el 99% de la proteína homologa.
De manera adicional, las secuencias codificantes pueden ser fragmentos de las SEQ ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41. En algunas modalidades, los fragmentos constituyen el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41.
De manera adicional, las secuencias codificantes pueden ser homologas a las SEQ ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41. En algunas modalidades, las secuencias codificantes son 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41.
De manera adicional, las secuencias codificantes pueden ser homologas a los fragmentos de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41. En algunas modalidades, los fragmentos constituyen el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% O 99% de las SEQ ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41, y las secuencias codificantes son 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a los fragmentos de las SEQ ID NOs: l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41. 4. Plásmido En la presente se proporciona un vector que puede expresar uno o más de los antígenos de FMDV en la célula de un mamífero en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el mamífero. El vector puede comprender ácido nucleico heterólogo que codifica el antígeno de FMDV. El vector puede ser un plásmido. El plásmido puede ser útil para transfectar células con el ácido nucleico que codifica un antígeno de FMDV, cuya célula hospedadora transformada se cultiva y mantiene en condiciones donde se produce la expresión del antígeno de FMDV.
El plásmido puede comprender un ácido nucleico que codifica un antígeno de FMDV seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, fragmentos de estas, secuencias homologas de estas y fragmentos de las homologas. El plásmido puede comprender adicionalmente un codón de inicio o secuencia líder, que puede estar corriente arriba de la secuencia codificante, y un codón de detención, que puede estar corriente abajo de la secuencia codificante. El codón de inicio y de terminación pueden estar en el mismo marco con la secuencia codificante.
El plásmido también puede comprender un promotor que está unido operativamente a la secuencia codificante. El promotor unido operativamente a la secuencia codificante puede ser un promotor del virus del simio 40 (SV40) , un promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) , un promotor del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , tal como el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de inmunodeficiencia bovina (BIV) , un promotor del virus de Moloney, un promotor del virus de la leucosis aviar (ALV) , un promotor del citomegalovirus (CMV) , tal como el promotor temprano inmediato del CMV, promotor del virus de Epstein Barr (EBV) o un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) . El promotor también puede ser un promotor de un gen humano, tal como, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o metalotioneína humana. El promotor también puede ser un promotor de un tejido específico, tal como un promotor de un músculo o piel específico, natural o sintético. Los ejemplos de los promotores se describen en la publicación de la solicitud de patente estadounidense No. US20040175727 , cuyo contenido se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
El plásmido también puede comprender una señal de poliadenilación, que puede estar corriente abajo de la secuencia codificante. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación SV40, señal de poliadenilación LTR, señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (bGH) , señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano (hGH) o señal de poliadenilación de la ß-globina humana. La señal de poliadenilación SV40 puede ser una señal de poliadenilación de un plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) .
El plásmido también puede comprender un potenciador corriente arriba de la secuencia codificante. El potenciador puede ser una actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o un potenciador viral tal como uno de CMV, FMDV, RSV o EBV. Las mejoras de la función del polinucleótido se describen en la patente estadounidense No. 5,593,972, 5,962,428 y WO94/016737, cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
El plásmido también puede comprender un origen de replicación de mamíferos para mantener el plásmido extracromosómico y producir copias múltiples del plásmido en una célula. El plásmido puede ser pVAXl, pCEP4 o pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) que pueden comprender el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región codificante del antígeno nuclear EBNA-1, que puede producir replicación episomal de gran reproducción sin integración. La estructura principal del. plásmido puede ser pAV0242. El plásmido puede ser un plásmido del adenovirus tipo 5 de replicación defectuosa (Ad5) .
El plásmido también puede comprender una secuencia reguladora, que puede ser adecuada para la expresión génica en una célula a la que se administra el plásmido. La secuencia codificante puede comprender un codón, lo que puede permitir una transcripción más eficaz de la secuencia codificante en la célula hospedadora.
La secuencia codificante puede comprender una secuencia líder Ig. La secuencia líder puede estar 5' de la secuencia codificante. La proteína de consenso codificada por esta secuencia puede comprender una secuencia líder Ig en el extremo N seguida de una proteína de consenso. La secuencia líder Ig en el extremo N puede ser IgE o IgG.
El plásmido puede ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que se puede usar para la producción de proteínas en Escherichia coli (E.coli). El plásmido también puede ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que se puede usar para la producción de proteínas en cepas de levadura de Saccharomyces cerevisiae. El plásmido también puede ser del sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Calif.), que se puede usar para la producción de proteínas en células de insectos. El plásmido también puede ser ADNcp I o ADNcp3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que se pueden usar para la producción de proteínas en células de mamífero, tales como, células de ovario de hámster chino (CHO) .
Los plásmidos pueden comprender una o más secuencias codificantes que codifican una o más de VPl, VP2, VP3, VP4 y 3C de uno o más subtipos, tales como, Asia, A, O, C, SAT1, SAT2 y SAT3.
En algunas modalidades, un plásmido comprende secuencias codificantes para múltiples antígenos de FMDV de consenso distintos VPl, VP2, VP3, VP4 y 3C del subtipo Asia, A, O, C, SAT1, SAT2 o SAT3.
En algunas modalidades, un plásmido comprende secuencias codificantes para múltiples antígenos de FMDV de consenso distintos VPl, VP2, VP3 y VP4 del subtipo Asia, A, O, C, SAT1, SAT2 o SAT3.
En algunas modalidades, un plásmido comprende secuencias codificantes para dos antígenos de FMDV de consenso distintos VPl de dos de los subtipos Asia, A, 0 y C, tal como, VPl del subtipo Asia VPl del subtipo O o una VPl del subtipo A y VPl del subtipo C.
En algunas modalidades, un plásmido comprende secuencias codificantes para un antígeno de FMDV de consenso VPl tal como VPl subtipo Asia, VPl subtipo A, VPl subtipo O o VPl subtipo C.
La secuencia codificante se puede codificar mediante un plásmido de ADN distinto, todos regulados por un promotor unido operativamente, por ej , . un plásmido de ADN que tiene una secuencia codificante regulada por uno o más promotores, que comprende múltiples antígenos de FMDV de consenso. 5. Vacuna En tanto no se ve limitada por teoría científica, una vacuna que se puede usar para provocar una respuesta inmunitaria (humoral, celular o ambas) ampliamente contra FMDV puede comprender una o más secuencias codificantes establecidas anteriormente, es decir, secuencias de ácido nucleico que codifican una o más proteínas VP1, VP2 , VP3 , CVP4 y 3C de los subtipos que se seleccionan del grupo que consiste en: subtipos de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de estos. Las secuencias codificantes también pueden incluir aquellas que comprenden secuencias homologas, fragmentos y secuencias homologas de fragmentos. Alternativa o adicionalmente, las composiciones que inducen una respuesta inmunitaria anti-FMDV pueden comprender una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en: subtipos de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de estos.
En la presente se proporciona una vacuna para generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra uno o más subtipos de FMDV. La vacuna puede comprender el plásmido tal como se discutió anteriormente. La vacuna puede comprender diversos plásmidos, dirigido cada uno a uno o más subtipos de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2, SAT3 o combinaciones de estos. La vacuna puede comprender también los antígenos de FMDV dirigidos contra uno o más subtipos de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SAT1, SAT2 , SAT3 o combinaciones de estos. La vacuna puede comprender también plásmidos dirigidos a subtipos de FMDV de regiones particulares del mundo, por - ejemplo, Asia, Europa y Sudáfrica. Alternativa o adicionalmente, la vacuna puede comprender proteínas de uno o más subtipos de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SATl, SAT2 , SAT3 o combinaciones de estos. La vacuna puede comprender también los antígenos de FMDV dirigidos contra uno o más subtipos de FMDV tal como A, Asia 1, C, O, SATl, SAT2, SAT3 o combinaciones de estos. La vacuna puede comprender también plásmidos y/o proteínas dirigidos a subtipos de FMDV de regiones particulares del mundo, por ejemplo, Asia, Europa y Sudáfrica. Se puede proporcionar la vacuna para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica.
La vacuna puede comprender también un ácido nucleico que codifica una proteasa C3 de FMDV, que puede ser un ácido nucleico de proteasa C3 de consenso. El ácido nucleico de proteína 3C de consenso puede ser una secuencia codificante de proteína 3C. Alternativa o adicionalmente, la vacuna puede comprender también una proteasa C3 de FMDV, tal como una proteasa C3 de consenso, por ejemplo una proteína 3C. La vacuna puede comprender también un gen quimérico que codifica una secuencia codificante VPl-4 completa o parcial y secuencia codificante C3 completa o parcial. Alternativa o adicionalmente, . la vacuna también puede comprender una proteína de fusión que comprende VPl-4 completa o parcial y C3 completa y parcial .
En la presente se proporcionan composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención que comprenden alrededor de 1 nanogramo a alrededor de 10 mg de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden de entre: 1) al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 O 100 nanogramos , o al menos 1 , 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos, o al menos 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mg o más; y 2) hasta e inclusive 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 O 100 nanogramos, o hasta e inclusive 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435/ 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos, o hasta e inclusive 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mg.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden alrededor de 5 nanogramos a alrededor de 10 mg de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden alrededor de 25 nanogramos a alrededor de 5 mg de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 50 nanogramos a alrededor de 1 mg de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 0.1 a alrededor de 500 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 1 a alrededor de 350 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 5 a alrededor de 250 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 10 a alrededor de 200 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 15 a alrededor de 150 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 20 a alrededor de 100 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 25 a alrededor de 75 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 30 a alrededor de 50 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen alrededor de 35 a alrededor de 40 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones f rmacéuticas contienen alrededor de 100 a alrededor de 200 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden alrededor de 10 microgramos a alrededor de 100 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden alrededor de 20 microgramos a alrededor de 80 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden alrededor de 25 microgramos a alrededor de 60 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden alrededor de 30 nanogramos a alrededor de 50 microgramos de ADN. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden alrededor de 35 nanogramos a alrededor de 45 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se formulan de acuerdo con el modo de administración que se va a utilizar. En los casos en que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, estas son estériles, libres de pirógeno y libres de partículas. De preferencia, se utiliza una formulación isotónica. En general, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir clorhidrato de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren las soluciones isotónicas tal como solución salina amortiguada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas modalidades, se agrega a la formulación un agente de vasoconstricción.
Preferentemente la composición farmacéutica es una vacuna y, más preferentemente, una vacuna de ADN.
La vacuna puede ser una vacuna de ADN. La vacuna de ADN puede comprender una pluralidad de los mismos plásmidos o diferentes que comprenden secuencias codificantes de ácido nucleico para uno o más antígenos de próstata de consenso. La vacuna de ADN puede comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos de próstata de consenso. Cuando la vacuna de ADN comprende secuencias codificantes de más de un antígeno de próstata de consenso, las secuencias pueden estar presentes en un único plásmido o cada una de las secuencias puede estar presente en diferentes plásmidos .
En algunas modalidades, las vacunas pueden comprender secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos de próstata de consenso en combinación con uno o más antígenos de próstata de consenso.
Se describen vacunas de ADN en la Patente estadounidense Nos. 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055 y 5,676,594, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. La vacuna de ADN puede comprender adicionalmente elementos o reactivos que impiden que se integre en el cromosoma. La vacuna puede ser un ARN del antígeno de próstata. La vacuna de ARN puede introducirse en la célula.
La vacuna puede ser una vacuna recombinante que comprende la construcción genética o el antígeno descrito anteriormente . La vacuna también puede comprender uno o más antígenos de próstata de consenso en forma de una o más subunidades de proteína o una o más partículas virales atenuadas que comprenden uno o más antígenos de consenso. La vacuna atenuada puede ser vacunas vivas atenuadas, vacunas inactivadas y vacunas que utilizan vectores recombinantes para la administración de genes extraños que codifican uno o más antígenos de próstata de consenso, así como vacunas de subunidades y proteínas. Se describen ejemplos de vacunas vivas atenuadas, aquellas que utilizan vectores recombinantes para la administración de antígenos de próstata, vacunas de subunidades y vacunas de glicoproteínas en las patentes estadounidenses Nos.: 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 y 6,589,529, que se incorporan en la presente mediante esta referencia. Las vacunas pueden comprender plásmidos en combinación con otros componentes de vacunas, tales como proteínas de FMDV o vectores de expresión que codifican proteínas.
La vacuna proporcionada se puede usar para inducir respuestas inmunitarias , incluyendo respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas. Se pueden generar anticuerpos y/o linfocitos T citotóxicos que se dirigen al antígeno de próstata de consenso. Los anticuerpos y células se pueden aislar.
La vacuna puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser moléculas funcionales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente que facilita la transfección, que puede incluir agentes activos en la superficie, tales como, complejos inmunoestimulantes (ISCOMS) , adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramil, análogos de quinona, vesículas tales como escualeno y escualeno, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas , u otros agentes conocidos que facilitan la transfección.
El agente que facilita la transfección es un polianión, policatión, que incluye poli-L-glutamato (LGS) o lípido. El agente que facilita la transfección es poli-L-glutamato y, más preferentemente, el poli-L-glutamato está presente en la vacuna a una concentración menor a 6 mg/ml . El agente que facilita la transfección también puede incluir agentes activos en la superficie, tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS) , adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramil, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y también se puede usar ácido hialurónico administrado junto con la construcción genética. En algunas modalidades, las vacunas de plásmidos de ADN también pueden incluir un agente que facilita la transfección, tales como, lípidos, liposomas, incluyendo liposomas de licitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de ADN y liposomas (véase, por ejemplo, W09324640) , iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas u otros agentes conocidos que facilitan la transfeccion. Preferentemente, el agente que facilita la transfección es un polianión, policatión, incluyendo, poli-L-glutamato (LGS) o lípido. La concentración del agente de transfección en la vacuna es menor a 4 mg/ml, menor a 2 mg/ml, menor a 1 mg/ml, menor a 0.750 mg/ml, menor a 0.500 mg/ml, menor a 0.250 mg/ml, menor a 0.100 mg/ml, menor a 0.050 mg/ml o menor a 0.010 mg/ml.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante . El adyuvante puede ser otros genes que son expresados en otro plásmido o son administrados como proteínas en combinación con el plásmido anterior en la vacuna. El adyuvante puede seleccionarse del grupo que consiste en: a-interferón (IFN- a), ß-interferón (IFN-ß) , ?-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), T Fa, TNF , GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , quimiocina que atrae linfocitos T cutáneos (CTACK) , quimiocina expresada por el timo epitelial (TECK) , quimiocina epitelial asociada a las mucosas (MEC) , IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86 que incluyen IL-15 que tiene la secuencia de señal eliminada e incluye opcionalmente el péptido de señal del IgE. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , TNFa, TNFP, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 o una combinación de estos .
Otros genes que pueden ser adyuvantes útiles incluyen aquellos que codifican: MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RA TES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2 , LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3 , TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 , DR5 , KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 , DR6 , Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88 , IRAK, TRAF6 , IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta al interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec , TRAILrecDRC5 , TRAIL-R3, TRAIL-R , RANK, RA K LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de estos.
La vacuna puede comprender adicionalmente un agente que facilita la vacuna genética como se describe en la patente estadounidense No. de serie 021,579 presentada el 1 de abril de 1994, la cual se describe en su totalidad en la presente mediante esta referencia.
La vacuna puede formularse de acuerdo con el modo de administración a ser usado. Una composición farmacéutica de vacuna inyectable puede ser estéril, libre de pirógenos y libre de partículas. Se puede usar una formulación o solución isotónica. Los aditivos para la isotonicidad pueden incluir clorhidrato de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. La vacuna . puede comprender un agente vasoconstrictor. Las soluciones isotónicas pueden incluir solución salina amortiguada con fosfato. La vacuna puede comprender adicionalménte estabilizadores que incluyen gelatina y albúmina. El estabilizador puede permitir que la formulación sea estable a temperatura ambiente durante períodos de tiempo prolongados, tales como, LGS o policationes o polianiones a la formulación de la vacuna. 6. Métodos de administración de la vacuna En la presente se proporciona un método de administración de la vacuna para proporcionar construcciones y proteínas genéticas del antígeno de FMDV que comprende epítopos que los hacen particularmente eficaces contra inmunógenos de FMDV contra los cuales se puede inducir una respuesta inmunitaria. El método de administración de la vacuna puede proporcionarse para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica y profiláctica. El proceso de vacunación puede generar una respuesta inmunitaria en el mamífero contra varios subtipos de FMDV. La vacuna puede administrarse a un individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del mamífero y fomentar la respuesta inmunitaria. La administración de la vacuna puede ser la transfección del antígeno de FMDV como una molécula de ácido nucleico que se expresa en la célula y se administra a la superficie de la célula sobre la que el sistema inmunitario reconoció e indujo una respuesta celular, humoral o celular y humoral . La administración de la vacuna puede usarse para inducir o provocar una respuesta inmunitaria en mamíferos contra varios virus de FMDV administrando la vacuna a los mamíferos como se indica anteriormente .
Luego de la administración de la vacuna y el plásmido en las células del mamífero, las células transíectadas expresarán y secretarán cápsides para cada uno de los plásmidos inyectados desde la vacuna. El sistema inmunitario reconocerá como extrañas las proteínas de cápsides secretadas y se generarán anticuerpos contra estas. El sistema inmunitario mantendrá estos anticuerpos y permitirá eliminar rápidamente una posterior amenaza de FMDV.
La vacuna se puede administrar a un mamífero para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. El mamífero puede ser humano, primate, primate no humano, vaca, ganado, oveja, cabra, antílope, bisonte, búfalo de agua, bisonte, bóvidos, ciervo, erizos, elefantes, llama, alpaca, ratones, ratas y pollos . a. Tratamientos combinados La vacuna se puede administrar en combinación con otras proteínas o genes que codifican -interferón, ?-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , TNFa, TNF , GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , quimiocina que atrae linfocitos T cutáneos (CTACK) , quimiocina expresada por el timo epitelial (TECK) , quimiocina epitelial asociada a las mucosas (MEC) , IL-12, IL-15, HC, CD80,CD86 que incluyen IL-15 -con la secuencia de señal eliminada e incluye opcionalmente el péptido de señal del IgE, IL-12, IL-15, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , TNFa, NF , GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, ???-la, MIP-lp, IL-8, RANTES , L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-l, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3 , TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 , DR5 , KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 , DR6 , Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88 , IRAK, TRAF6 , IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta al interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5 , TRAIL-R3 , TRAIL-R4 , RANK, RANK LIGAND, 0x40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de estos o combinaciones de estos. La vacuna también se puede administrar en combinación con la proteína CTACK, proteína TECK, proteína MEC o fragmentos funcionales de estos.
La vacuna se puede administrar mediante distintas vías que incluyen la oral, parenteral, sublingual, trasdérmica, rectal, transmucosal, tópica, mediante inhalación, mediante administración bucal, intrapleural , intravenosa, intraarterial, intraperitoneal , subcutánea, intramuscular, intranasal, intratecal e intraarticular o combinaciones de estas. Para uso veterinario, la composición puede administrarse como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que es más apropiada para un animal particular. La vacuna se puede administrar mediante jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin agujas, "bombardeo de microproyectiles con pistola de genes" u otros métodos físicos, tales como, electroporación ("EP"), "método hidrodinámico" o ultrasonido.
El plásmido de la vacuna puede administrarse al mamífero utilizando varias tecnologías conocidas distintas que incluyen inyección de ADN (también denominada vacunación de ADN) , con y sin electroporación in vivo, mediada por liposomas, facilitada por nanopartículas , vectores recombinantes tales como adenovirus recombinante , virus asociado con adenovirus recombinante y vaccinia recombinante. El antígeno de FMDV puede administrarse por inyección de ADN y junto con electroporacion in vivo. b. Electroporacion La administración de la vacuna mediante electroporacion de los plásmidos de la vacuna puede lograrse usando dispositivos de electroporacion que pueden estar configurados para administrar a un tejido deseado de un mamífero un pulso de energía que produce una corriente constante similar a una entrada de corriente preconfigurada por parte de un usuario. El dispositivo de electroporacion puede comprender un componente de electroporación y un ensamblaje de electrodos o ensamblaje de asa. El componente de electroporación puede incluir e incoporar uno o más de varios elementos de los dispositivos de electroporación que incluyen: controlador, generador de forma de onda de corriente, verificador de impedancia, medidor de forma de onda, elemento de entrada, elemento de registro de estado, puerto de comunicación, componente de memoria, fuente de energía e interruptor de energía. La electroporación puede llevarse a cabo usando el sistema de VGXP Cellectra™ para facilitar la transfección de las células por parte del plásmido.
El componente de electroporación puede funcionar como un elemento de los dispositivos de electroporación y los otros elementos son elementos distintos (o componentes) en comunicación con el componente de electroporacion. El componente de electroporacion puede funcionar como más de un elemento de los dispositivos de electroporacion, que pueden estar en comunicación con aun otros elementos de los dispositivos de electroporacion distintos del componente de electroporacion. Los elementos de los dispositivos de electroporacion existentes como parte de un dispositivo electromecánico o mecánico pueden no ser restrictivos, ya que los elementos pueden funcionar como un dispositivo o como elementos distintos en comunicación entre sí. El componente de electroporacion puede administrar el pulso de energía que produce la corriente constante en el tejido deseado e incluye un mecanismo de retroalimentación. El ensamblaje de electrodos puede incluir un arreglo de electrodos que tiene varios electrodos en una disposición espacial, donde el ensamblaje de electrodos recibe el pulso de energía desde el componente de electroporacion y lo suministra al tejido deseado a través de los electrodos. Al menos uno de los varios electrodos es neutro durante el suministro del pulso de energía y mide la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al componente de electroporacion. El mecanismo de retroalimentación puede recibir la impedancia medida y puede ajustar el pulso de energía suministrado por el componente de electroporacion para mantener la corriente constante.
Varios electrodos pueden suministrar el pulso de energía en un patrón descentralizado. Varios electrodos pueden suministrar el pulso de energía en el patrón descentralizado a través del control _ de los electrodos según una secuencia programada y un usuario ingresa la secuencia programada al componente de electroporación. .La secuencia programada puede comprender varios pulsos suministrados en secuencia, donde cada pulso de los varios pulsos es suministrado por al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia y donde un pulso posterior de los varios pulsos es suministrado por uno diferente de al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia.
El mecanismo de retroalimentación puede llevarse a cabo con hardware o software. El mecanismo de retroalimentación puede llevarse a cabo con un circuito cerrado analógico. La retroalimentación ocurre cada 50 is, 20 \is , 10 is o 1 ps, pero es preferible una retroalimentación en tiempo real o instantánea (es decir, prácticamente instantánea como se determinó mediante técnicas disponibles para determinar el tiempo de respuesta) . El electrodo neutro puede medir la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al mecanismo de retroalimentación y el mecanismo de retroalimentación responde a la impedancia y ajusta el pulso de energía para mantener la corriente constante en un valor similar a la corriente preconfigurada . El mecanismo de retroalimentación puede mantener la corriente constante continua e instantáneamente durante el suministro del pulso de energía.
Los ejemplos de dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden facilitar la administración de las vacunas de ADN de la presente invención incluyen los descritos en la patente estadounidense No. 7,245,963 de Draghia-Akli , et ál . , la publicación de patente estadounidense 2005/0052630 presentada por Smith, et ál . , cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Otros dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que se pueden usar para facilitar la administración de las vacunas de ADN incluyen los que se proporcionan en la solicitud de patente estadounidense de titularidad conjunta, No. de serie 11/874072, presentada el 17 de octubre de 2007, que reivindica el beneficio según 35 USC 119(e) con respecto a las solicitudes provisionales estadounidenses, Nos. de serie 60/852,149, presentada el 17 de octubre de 2006 y 60/978,982, presentada el 10 de octubre de 2007, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
La patente estadounidense No. 7,245,963 de Draghia-Akli, et ál . describe los sistemas modulares de electrodos y su uso para facilitar la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los sistemas modulares de electrodos pueden comprender varios electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona una conexión conductiva de un controlador de pulso de corriente constante programable a varios electrodos de aguja; y una fuente de energía. Un operador puede sujetar varios electrodos de aguja que se encuentran montados en una estructura de soporte e insertarlos con firmeza en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Luego, las biomoléculas se administran mediante la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. Se activa el controlador de pulso de corriente constante programable y se aplica el pulso eléctrico de corriente constante a los varios electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la biomolécula en la célula entre los varios electrodos. Se incorpora en la presente la totalidad del contenido de la patente estadounidense No. 7,245,963.
La publicación de patente estadounidense 2005/0052630 presentada por Smith, et ál. describe un dispositivo de electroporación que puede usarse para facilitar eficazmente la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El dispositivo de electroporación comprende un dispositivo electrocinético ("dispositivo EKD") cuyo funcionamiento está especificado por el software o firmware. El dispositivo de EKD produce una serie de patrones de pulso de corriente constante programable entre los electrodos en un orden basado en el control del usuario y el ingreso de los parámetros de pulso y permite el almacenamiento y adquisición de los datos actuales de la forma de onda.- El dispositivo de electroporación también comprende un disco de electrodo sustituible que tiene un orden de electrodos de aguja, un canal de inyección central para una aguja de inyección y un disco de guía extraíble. Se incorpora en la presente la totalidad del contenido de la patente estadounidense 2005/0052630.
La disposición de los electrodos y los métodos descritos en la patente estadounidense No. 7,245,963 y la publicación de patente estadounidense 2005/0052630 puede adaptarse para la penetración profunda no solamente en los tejidos, tales como, músculos, sino también tejidos u órganos. Debido a la configuración de la disposición de electrodos, la aguja de inyección (para administrar la biomolécula de elección) también se inserta completamente en el órgano diana y la inyección es administrada perpendicularmente al tejido diana, en el área que es predelineada por los electrodos. Los electrodos descritos en la patente estadounidense No. 7,245,963 y la publicación de patente estadounidense 2005/005263 son preferentemente de 20 mm de largo y 21 de calibre.
De manera adicional, en algunas modalidades que incorporan dispositivos de electroporación y usos de estos, se contemplan dispositivos de electroporación que son los que se describen en las siguientes patentes: Patente estadounidense 5,273,525 emitida el 28 de diciembre de 1993, Patentes estadounidenses 6,110,161 emitida el 29 de agosto de 2000, 6,261,281 emitida el 17 de julio de 2001 y 6,958,060 emitida el 25 de octubre de 2005 y la patente estadounidense 6,939,862 emitida el 6 de setiembre de 2005. Además, se contemplan en la presente las patentes que abarcan la materia proporcionada en la patente estadounidense 6,697,669 emitida el 24 de febrero de 2004, relacionada con la administración de ADN usando cualquiera de varios dispositivos, y la patente estadounidense 7,328,064 emitida el 5 de febrero de 2008, que describe un método de inyección de ADN. Las patentes mencionadas anteriormente se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. c . Método de preparación de la vacuna En la presente se proporcionan métodos de preparación de la vacuna. En algunas modalidades, los métodos son métodos de preparación de las vacunas que comprenden plásmidos de ADN." Luego del paso de subclonación final en el plásmido de expresión de mamífero, se pueden usar los plásmidos de ADN para inocular un cultivo celular en un tanque de fermentación a gran escala usando métodos conocidos en la técnica. El plásmido se transforma en una célula hospedadora compatible y se cultiva y mantiene en condiciones donde se produce la expresión del antígeno de FMDV. El antígeno de FMDV puede recuperarse del cultivo lisando células o a partir del medio de cultivo y aislarse. Las proteínas aisladas de VP1-4 de consenso pueden usarse en la vacuna como una fuente natural de anticuerpos . El antígeno de FMDV que puede producirse mediante técnicas recombinantes usando sintetizadores automáticos que también pueden emplearse para producir el antígeno de FMDV puro esencial aislado. Estas técnicas pueden ser útiles para introducir variantes del antígeno de FMDV para subtipos particulares de FMDV.
Los plásmidos de ADN para el uso con los dispositivos de EP de la presente invención se pueden formular o fabricar usando una combinación de los dispositivos y técnicas conocidos, pero preferentemente son fabricados usando una técnica optimizada de fabricación de plásmidos que se describe en una solicitud provisional estadounidense pendiente, No. de serie 60/939,792, que se presentó el 23 de mayo de 2007. En algunos ejemplos, los plásmidos de ADN usados en estos estudios se pueden formular a concentraciones superiores o iguales a 10 mg/mL. Las técnicas de fabricación también incluyen o incorporan varios dispositivos y protocolos que son conocidos comúnmente por los expertos en la técnica, además de los descritos en la solicitud estadounidense No. 60/939792, que incluyen los descritos en una patente autorizada, patente estadounidense No. 7,238,522, que se emitió el 3 de julio de 2007. La solicitud y patente estadounidense, No. de serie 60/939,792 y la patente estadounidense No. 7,238,522, anteriormente mencionadas respectivamente, se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. d. Método de preparación de las construcciones de expresión de VPl-4 Una vacuna de ADN de FMDV con múltiples dianas se construye optimizando en primer lugar las secuencias de aminoácidos VP1, VP2, VP3 y VP4 para uno de los subtipos de FMDV Asia, O, A, C, SAT1, SAT2 y SAT3 usando al menos 10 secuencias distintas del subtipo. Se producen ácidos nucleicos que cada uno codifica las proteínas VPl-4 optimizadas por el subtipo. Las secuencias de ácido nucleico VPl-4 optimizadas por el subtipo son clonadas como una secuencia codificante contigua, donde las VP se separan interviniendo los sitios de escisión de la proteasa 3C de la proteína de FMDV. La secuencia codificante VPl-4 optimizada se inserta en un vector de expresión, pVAX o pAV0242, controlado por un operador. Una secuencia líder IgE se coloca corriente arriba de la secuencia codificante VPl-4 optimizada de modo que la proteína codificada incluya una secuencia líder IgE en el extremo N. Se colocan dos codones de detención en el extremo 3' de la secuencia codificante VP1-4.
Además, un ácido nucleico que codifica la proteina 3C de FMDV se construye optimizando la secuencia de ácido nucleico 3C para uno de los subtipos de FMDV Asia 1, 0, A, C, SAT1, SAT2 y SAT3 usando al menos 10 secuencias distintas del subtipo. Se produce un ácido nucleico que codifica la proteína 3C optimizada por el subtipo y se clona en un plásmido pVAX o pAV0242. e. Método de uso de la vacuna como un marcador También se proporciona en la presente un método de diferenciar un mamífero vacunado con la vacuna de un mamífero infectado con FMDV. El método puede comprender una muestra de un mamífero y aislar los anticuerpos de mamífero de la muestra. Un mamífero que ha sido vacunado con la vacuna puede tener anticuerpos que son específicos solamente para las proteínas de cápsides vacías del antígeno de FMDV, es decir, proteínas de cobertura virales VP1-4 contra los subtipos de FMDV A, Asia I, O, C, SAT1 , SAT2 , SAT3 o una combinación de estos. Un mamífero que ha sido infectado con FMDV tendrá anticuerpos contra las proteínas de cobertura virales de FMDV VP1-4 de un subtipo de FMDV tal como A, Asia 1, O, C, SAT1, SAT2 o SAT3 y además, contra anticuerpos contra las proteínas de FMDV no estructurales (NS) . Las proteínas de NS de FMDV pueden incluir la proteasa 3C, así como la proteína de FMDV 2C, 3A, 3B y 3D (polimerasa) . El método puede incluir identificar un anticuerpo contra la proteína NS de FMDV, tal como la proteína 3D altamente antigénica. El método comprende adicionalmente compararlo con la muestra de suero de los mamíferos vacunados para determinar la presencia o no presencia de las proteínas NS de FMDV. El mamífero infectado tiene anticuerpos contra las proteínas NS de FMDV, mientras que el mamífero vacunado no tiene anticuerpos contra las proteínas NS ya que este mamífero tiene suficiente inmunidad contra la infección de FMDV. El método puede comprender diferenciar mamíferos que tienen anticuerpos a VPl-4 contra los mamíferos que tienen anticuerpos a VPl-4 y la polimerasa 3D de FMDV.
En general, se puede usar un agente. El agente puede ser VPl-4 o una proteína NS, tal como la polimerasa 3D. Se aisla una muestra del mamífero con anticuerpos de FMDV y se hacen reaccionar contra el agente para identificar la especificidad del anticuerpo de FMDV.
La muestra del método se puede aislar del mamífero y puede incluir una muestra de suero de la sangre, saliva, lágrimas, líquido cerebroespinal, humor acuoso, líquido pleural, líquido pericárdico., líquido linfático, quimo, quilo, bilis, orina, líquido sinovial, vómito, líquido peritoneal, agua de deposición, semen, líquido amniótico, leche, suero, líquido intersticial y jugo pancreático.
Los métodos de modalidad de la prueba de diagnóstico incluyen llevar a cabo una inmunoprecipitación con lisados celulares etiquetados con [35S] metionina del mamífero, transferencias western e inmunotransferencias a proteínas de FMDV particulares, tales como, VP1-4 y polimerasa 3D.
El método de detección descrito en la presente puede implementarse mediante varios sistemas de detección conocidos para determinar la presencia de anticuerpos a la VP1-4 y polimerasa 3D de FMDV en una muestra de prueba o de control. El sistema de detección puede comprender un fluorescente u otro medio de comparación entre una señal generada a partir de una etiqueta de detección que está unida a. una proteína de FMDV particular, tal como VP1-4 y polimerasa 3D y un valor predeterminado para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos a la VP1-4 y polimerasa 3D de FMDV en una muestra de prueba. El valor predeterminado puede ser una relación de la señal medida a partir de la muestra de prueba con la señal medida a partir de la muestra de control. En general, una muestra de prueba que genera una señal que es tres desviaciones estándar por encima de la señal promedio medida a partir de una muestra de control que no contiene anticuerpos de polimerasa 3D de FMDV que se pueden considerar positivos para la polimerasa 3D de FMDV y, por consiguiente, un mamífero infectado.
De manera alternativa, se puede emplear un aparato tal como un densitómetro para medir un valor numérico de la etiqueta detectable. El valor predeterminado puede determinarse usando una curva del operador receptor ( "ROC" ) usando el método de Sackett et ál., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-107 (Little Brown and Co., 1985) . El valor predeterminado puede estar basado en las unidades relativas de luz de un generador de imágenes fluorescente u otro medio, tal como se describe anteriormente. En resumen, el valor predeterminado puede predeterminarse a partir de un cuadro de pares de tasas de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) y tasas de falsos positivos (es decir, 100% de especificidad) que corresponden a cada valor posible para el resultado de la prueba de diagnóstico. El valor predeterminado en el cuadro más cercano al ángulo superior izquierdo (es decir, el valor que abarca el área más grande) es el valor predeterminado más exacto, y una muestra que genera una señal que es superior al valor predeterminado determinada mediante este método puede considerarse positiva. De manera alternativa, el valor predeterminado puede desplazarse hacia la izquierda a lo largo del cuadro para minimizar la tasa de falsos positivos, (a) Inmunotransferencia El método de detección puede usarse en un sistema de detección de inmunotransferencia para detectar anticuerpos a la VPl-4 y polimerasa 3D de FMDV en una muestra de prueba o de control. La inmunotransferencia puede utilizar un soporte 7 sólido para inmovilizar el agente.
La inmunotransferencia puede utilizar dos muestras de control distintas (es decir, un primer control y un segundo control) que pueden estar inmovilizadas en un soporte sólido. La inmunotransferencia puede utilizar tres muestras de control específicas distintas (es decir, un primer control, un segundo control y un tercer control) . Si se encuentra presente más de una muestra de control, los controles pueden ser idénticos entre sí ó distintos entre sí. Dos de las muestras de control pueden ser idénticas (tales como, por ejemplo, el primer control y el segundo control) . Si dos de las muestras de control son idénticas, la concentración de una de las muestras de control (ya sea el primer control o el segundo control o si los tres controles están presentes, el nivel del primer control o el tercer control o el segundo control o el tercer control) pueden ser superiores (o mayores) al otro control. La muestra de control puede estar en una concentración superior al otro control y puede denominarse el "control alto". El control inmovilizado en la franja, disco o lámina en menor concentración que el control alto puede denominarse "control bajo". La relación de la concentración de control bajo a control alto puede ser de alrededor de 1:2 a alrededor de 1:10, preferentemente, alrededor de 1:5 a alrededor de 1:6. Por ejemplo, el primer control puede ser el control bajo y el segundo control puede 7 ser el control alto. De manera alternativa, el primer control puede ser el control alto y el segundo control puede ser el control bajo. A modo de ejemplo adicional, un sistema de detección de tres controles puede comprender un control bajo y un control alto, así como un tercer control (que se puede usar, por ejemplo, para verificar la adición de una muestra) . El control bajo y el control alto puede ser plasma de humano (donde la relación de control bajo a control alto es de alrededor de 1:2 a alrededor de 1:10) y el tercer control puede ser SDB Chagas o plasma de humano. En el formato de flujo continuo, se puede sumergir un agente inmovilizado en el soporte sólido en una solución que contiene la muestra de prueba. De manera alternativa, el soporte sólido se puede colocar en una bandeja de reacción con un diluyente y luego la muestra de prueba se puede agregar a la bandeja de reacción. Se permite incubar la muestra de prueba y el agente durante un período de tiempo suficiente usando los mismos tiempos y técnicas descritos anteriormente en la presente. La muestra de prueba libre puede retirarse usando las técnicas descritas anteriormente en la presente. En este formato, los anticuerpos anti-FDMV a VPl-4 o una proteína de estructura NS tal como la polimerasa 3D dentro de la muestra de prueba pueden unirse al agente inmovilizado (y al menos un control) a medida que la muestra de prueba pasa a través de la membrana. Se puede agregar al menos un reactivo de detección (tal como un reactivo de detección descrito anteriormente en la presente que contiene una etiqueta detectable) . Al menos un reactivo de detección puede unirse a cada uno de los complejos de agente-anticuerpo formados a medida que la solución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la franja. Para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-FDMV a VPl-4 o la proteína de estructura NS, tal como la polimerasa 3D en la muestra de prueba, la detección de los reactivos de detección unidos puede llevarse a cabo como se describe anteriormente usando un corte o comparando la intensidad de una o más señales generadas por uno o más controles, tal como se describe más detalladamente a continuación.
Cuando se puede usar un control bajo y un control alto en el formato de flujo continuo como se describe anteriormente, se puede determinar la presencia o ausencia de los anticuerpos anti-FDMV a VPl-4 o la proteína de estructura NS tal como la polimerasa 3D en la muestra de prueba identificando la presencia de una señal a partir de la etiqueta detectable en cada una de las bandas de prueba (o manchas o puntos) para los agentes. Si se identifica una señal en una banda de prueba para un agente, la intensidad de esta señal detectada se compara con la intensidad de la señal de la banda (o mancha o punto) de control bajo y la banda (o mancha o punto) de control alto, usando una escala de 0 a 4+.
La lectura es O cuando no se visualiza ninguna banda. Las intensidades de la banda de control bajo y de la banda de control alto se pueden definir como 1+ (para el control bajo) y 3+ (para el control alto), respectivamente. Una banda de prueba con una intensidad comparable a la del control bajo se registra como 1+. Una banda con una intensidad entre la banda del control bajo y la del control alto se registra como 2+. Una banda con una intensidad comparable a la del control alto se registra como 3+. Una intensidad de banda superior a la del control alto se registra como 4+. (b) Ensayo de competición El método de detección se puede usar en un sistema de detección de competición para identificar muestras de prueba con anticuerpos anti-FDMV a VPl-4 o una proteína de estructura NS, tal como la polimerasa 3D. Los agentes se pueden inmovilizar en un soporte sólido como se describe anteriormente. Luego, el agente inmovilizado se puede poner en contacto con un anticuerpo competitivo que tiene una etiqueta detectable, el cual es conocido por unirse al agente, y compite con los anticuerpos anti-FDMV a VPl-4 o una proteína de estructura NS, tal como la polimerasa 3D en la muestra de prueba. El agente inmovilizado también se pone en contacto con la muestra de prueba. La señal del anticuerpo con etiqueta detectable puede ser inferior en las muestras de prueba que contienen anticuerpos anti-FDMV a VPl-4 o una proteína de estructura NS, tal como la polimerasa 3D, ya que varios conjuntos de anticuerpos compiten por el agente inmovilizado . f. Kit de diagnóstico Se proporciona en la presente un kit para realizar el método de diagnóstico para identificar mamíferos que fueron vacunados con la vacuna contra mamíferos infectados con FMDV. El kit proporciona materiales para permitirnos identificar mamíferos que fueron infectados con FMDV para identificar los anticuerpos contra las proteínas de FS que incluyen la proteína de polimerasa 3D de FMDV contra los anticuerpos solamente con las proteínas de cápsides vacías VP1-4 de un mamífero vacunado. Los kits de prueba pueden incluir uno o más reactivos, tal como el agente útil para llevar a la práctica uno o más inmunoensayos de acuerdo con la invención. En general, un kit de prueba incluye un paquete con uno o más recipientes que contienen los reactivos, como una o más composiciones distintas u, opcionalmente , como una mezcla donde se permitirá la compatibilidad de los reactivos. El kit de prueba también incluye otros materiales que pueden ser deseables desde el punto de vista del usuario, tales como amortiguadores, diluyentes, estándares y/o cualquier otro material útil en el procesamiento de la muestra, lavado o modalidad de cualquier otro paso del ensayo.
Los kits de acuerdo con la invención pueden incluir una fase sólida y un agente añadido a un soporte sólido. Los kits se pueden emplear para llevar a cabo inmunoensayos tipo "sandwich" e incluyen un anticuerpo de detección etiquetado. El anticuerpo de detección etiquetado puede ser un anticuerpo etiquetado con IgG anti-humano. El kit puede incluir adicionalmente una etiqueta detectable.
El kit de prueba puede incluir al menos una etiqueta directa, tal como, apridinio-9-carboxamida. Los kits de prueba de acuerdo con la invención también pueden incluir al menos una etiqueta indirecta. Si la etiqueta empleada en general requiere un reactivo indicador para producir una señal detectable, el kit de prueba incluye uno o más reactivos indicadores adecuados .
El kit de prueba puede incluir instrucciones para llevar a cabo uno o más de los inmunoensayos de la invención. Las instrucciones incluidas en los kits de la invención pueden añadirse a material de empaquetamiento o se pueden incluir como un prospecto. Si bien las instrucciones en general son materiales escritos o impresos, no están limitadas a estos. La presente invención contempla cualquier medio que pueda almacenar las instrucciones y comunicarlas a un usuario final. El medio incluye, de modo no taxativo, medio de almacenamiento electrónico (por ej . , discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips) , medio óptico (por ej . , CD ROM) y similares. Tal como se usa en la presente, el término "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de Internet que proporciona las instrucciones.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Expresión de VPl-4 recombinante La proteína VPl-4 optimizada por el subtipo y la proteína 3C optimizada son expresadas realizando un ensayo de traducción in vitro usando los plásmidos de expresión VPl-4 y 3C optimizados que figuran anteriormente. La traducción de estas proteínas proporciona las bandas esperadas en un gel SDS-PAGE.
Para confirmar la expresión de las proteínas VPl-4, un ácido nucleico que codifica una proteína VPl-4 optimizada por el subtipo y un líder IgE en el extremo N se clona en un vector de expresión bacteriana de la etiqueta HIS. Un ácido nucleico que codifica una proteína 3C optimizada por el subtipo también se clona en un vector de expresión bacteriana de la etiqueta HIS. Las proteínas VPl-4 y 3C optimizadas son expresadas usando un sistema de expresión bacteriana, y se purifica su afinidad usando separación en columna con Ni. Las proteínas purificadas se analizan usando un gel SDS-PAGE. SDS-PAGE revela las bandas esperadas.
Ejemplo 2 Método de vacunación Para probar la eficacia de los plásmidos de ADN, los ratones Balb/C son inmunizados con los plásmidos pVAX que codifican VPl-4 y 3C. Los vectores pVAX vacíos y los vectores pVAX que codifican IL-15 se usan como controles. Los ratones son inmunizados tres veces al día los días 0, 14 y 28. Los ratones inmunizados son sacrificados 3 días luego de la inmunización final. El suero de los ratones es recogido y analizado para determinar ELISA anti-VPl, VP2 , VP3 y VP4. Las proteínas recombinantes etiquetadas con HIS del Ejemplo 1 se usan como el antígeno de captura. El suero de los ratones de control pVAX no logra reconocer ninguna de las VPl-4 optimizadas por el subtipo. Por el contrario, los ratones inmunizados con la vacuna de ADN VPl-4 optimizada por subtipo desarrollaron anticuerpos contra VP1, 2, 3 y 4 optimizadas por subtipo, lo que indica que la vacuna de fusión VPl-4 optimizada provoca que los ratones generen una respuesta inmunitaria contra las cuatro VP.
Ejemplo 3 Preparación de construcciones de expresión Se construyó una vacuna de ADN FMD con múltiples dianas. Las secuencias VP1 de los subtipos Asial, 0, A, C, SAT1, SAT2 y SAT3 fueron optimizadas por consenso en primer lugar con al menos 10 secuencias distintas de cada subtipo. Luego de eso, se insertaron dos secuencias VP1 debajo de un promotor y se separaron mediante dos sitios de escisión consecutivos.
Se insertó una secuencia líder IgE frente al primer ORF y se insertaron dos codones de detención luego del segundo ORF. El primer plásmido codifica la VP1 Asia y O, es 1362 bp.
El segundo plásmido, que codifica la VP1 A y C, es 1356 bp. El tercer y cuarto plásmido se dirige a los subtipos sub-africanos donde el primero codifica la VP1 SAT1 y SAT2 y el segundo codifica la VP1 SAT3.
Ejemplo 4 Expresión de VP1-4 recombinante Los plásmidos clonados luego fueron expresados con un ensayo de traducción in vitro. La traducción de todas las construcciones de VP1 individuales - A, Asia, C y 0 -proporcionó las bandas esperadas, [alrededor de 24.5kDa] y las construcciones de VP1 A + C y VP1 Asia + 0 proporcionaron una banda dimérica superior. Las construcciones tienen epítopos FLAG que se usaron en la inmunoprecipitación.
Ejemplo 5 Método de vacunación Para confirmar las respuestas inmunitarias contra FMD, generamos proteínas VP1 de FMD recombinantes de los cuatro subtipos.de VP1 (A, Asia, C y O) .
Las secuencias de VP1 de FMDV recombinantes de consenso (la secuencia líder IgE se subraya en el extremo N) .
Las proteínas se clonaron en un vector de expresión bacteriana etiquetado con HIS y se expresó el vector. Las proteínas se purificaron mediante separación en columna de Ni y las proteínas expresadas se indican con una flecha.
Luego, para probar la eficacia de los plásmidos de ADN, se inmunizaron ratones Balb/C. Los ratones se inmunizaron con 15 µ? de ADN por inmunización usando electroporación CELLECTRA. Hubo 7 grupos de inmunización: 1. pVax 2. pVax-FMDV VPl A + pVAXl-IL-15 3. pVax-FMDV VPl Asia + pVAXl-IL-15 4. pVax-FMDV VPl C + pVAXl-IL-15 5. pVax-FMDV VPl O + pVAXl-IL-15 6. pVax-FMDV VPl A-C + pVAXl-IL-15 7. pVax-FMDV VPl Asia-0 + pVAXl-IL-15 Los ratones se inmunizaron 3 veces los días 0, 14 y 28,· y se sacrificaron 3 días luego de la última inmunización. El suero de los animales se recogió y analizó para determinar el ELISA anti-VPl. Las proteínas recombinantes se usaron como el antígeno de captura. El suero de los ratones de control pVAX no logró reconocer las proteínas VPl A, Asia, C y O. Por el contrario, los ratones inmunizados con las vacunas de ADN A, Asia, C y O desarrollaron anticuerpos hacia las proteínas VPl A, Asia, C y O, respectivamente. Aún más importante, los ratones inmunizados con las vacunas VPl A-C o API Asia-0 desarrollaron anticuerpos hacia los 4 subtipos VPl, lo que sugiere que la vacuna de fusión VPl de consenso está generando respuestas inmunitarias contra los 4 subtipos de FMD asiáticos-europeos.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende .una secuencia que codifica una proteína que tiene una o más secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: una o más de las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos, variantes con 80% o más de homología con las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos y complementos de estos .
2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41 con o sin una secuencia codificante de una secuencia líder, complementos de estas, fragmentos de estas que codifica al menos 20 aminoácidos, complementos de estos, moléculas de ácidos nucleicos 80% homologas con las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41, complementos de estas, fragmentos de estas que codifican al menos 20 aminoácidos y complementos de estos .
3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica una proteína que se selecciona del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder.
4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en: las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41.
5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia líder es una secuencia líder Ige .
6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es un plásmido .
7. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es un plásmido que es un vector de expresión.
8. Una vacuna caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 y/o una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos, variantes con 80% o más de homología con las SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos y complementos de estos.
9. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende adicionalmente un adyuvante.
10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende adicionalmente un adyuvante se selecciona del grupo que consiste en IL-12 y/o IL-15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-12 y/o IL-15.
11. Una composición caracterizada porque comprende una o más proteínas que se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42 con o sin una secuencia líder, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos. de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos, variantes con 80% o más de homología con las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42, complementos de estas, fragmentos inmunogénicos de estas que comprenden al menos 20 aminoácidos y complementos de estos .
12. Un método para provocar una respuesta inmunitaria contra uno o más subtipos de virus de FMDV en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una vacuna de conformidad con la reivindicación 8.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la vacuna comprende una molécula de ácido nucleico, el cual comprende los pasos de a) administrar la molécula de ácido nucleico al tejido del mamífero; y b) electroporar células del tejido con un pulso de energía a una corriente constante eficaz para permitir el ingreso del plásmido de ADN en las células.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paso a) comprende inyectar la vacuna del plásmido de ADN en el tejido intradérmico, subcutáneo o muscular .
15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la corriente se preconfigura para la administración al tejido y el pulso de energía está a una corriente constante que es igual a la corriente preconfigurada .
16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paso de electroporación comprende adicionalmente : (a) medir la impedancia en las células electroporadas ; (b) ajustar el nivel de energía del pulso de energía con relación a la impedancia medida para mantener una corriente constante en las células electroporadas; donde los pasos de medición y ajuste ocurren en el período de duración del pulso de energía.
17. El método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el paso de electroporación comprende administrar el pulso de energía a varios electrodos de acuerdo con un patrón de secuencia de pulso que administra el pulso de energía en un patrón descentralizado.
18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el mamífero no se ha infectado con FMDV y la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.
19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el mamífero se ha infectado con FMDV y la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria terapéutica.
20. Un método de diagnóstico de un mamífero infectado con FMDV en un mamífero vacunado con una vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende : a) aislar una muestra de fluido del mamífero; y b) detectar la presencia de proteínas de FMDV no incluidas en dicha vacuna y/o anticuerpos contra las proteínas de FMDV no incluidas en dicha vacuna, donde la presencia de las proteínas de FMDV no incluidas en dicha vacuna y/o anticuerpos contra las proteínas de FMDV .no incluidas en dicha vacuna indica que el mamífero ha sido infectado con FMDV.
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