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Die Erfindung betrifft ein neues Quantifizierungsverfahren von Prothrombin oder Prothrombinmutanten oder Derivaten davon, Thrombin, Thrombinmutanten, Meizothrombin, Meizothrombinmutanten und/oder Hirudin oder Hirudinderivaten.
Der Mechanismus der Blutkoagulation erfolgt normalerweise in einer Kaskade von zwei möglichen Wegen. Eine der Routen, die sogenannte extrinsische Blutgerinnung, beginnt mit der Freisetzung von
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einer Aktivierung von Faktor V und Faktor 11 (Prothrombin). Faktor a (Thrombin) wandelt Fibrinogen zu Fibrin am Ende der Kaskade um.
Die andere Route, die sogenannte intrinsische Blutgerinnung, erfolgt über eine Aktivierung von Faktor XII durch Kontakt und anschliessender Aktivierung von Faktor XI Faktor IX und Faktor X in Anwesenheit von Calcium und Faktor Veil, gefolgt von einer Aktivierung von Faktor 11 zu Faktor lIa, der die Koagulation durch Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin auslöst. Faktor lla spielt daher in beiden Routen der Blutgerinnungskaskade eine zentrale Rolle. Bisher wurde intensiv nach Antikoagulantien geforscht, die insbesondere bei der Behandlung von septischem Schock, bei Thrombosen, Embolien, Arteriosklerose und bei Herzinfarkten, ferner bei Bluttransfusionen oder nach Operationen eingesetzt werden können. Eine Methode zur Unterdrückung der Blutgerinnung ist die direkte Verabreichung von Substanzen, die Thrombin inhibieren.
Bisher wurden als Antikoagulantien Heparin oder Coumarin eingesetzt. Diese sind allerdings relativ systemisch und erhöhen das Risiko für innere Blutungen. Hirudin hingegen ist extrem spezifisch in seiner Bindung an Thrombin und bietet gegenüber den anderen Antikoagulantien noch weiter Vorteile. Es braucht keine endogenen Kofaktoren, ist pharmakodynamisch inert, zeigt keinerlei Wirkung auf Blutzellen, Plasmaproteine (mit Ausnahme von Thrombin) oder Enzyme, und ist auf Grund seiner kleinen Molekülgrösse nicht immunogen. Weiters lagert sich Hirudin nicht in Organe ein und wird unverändert im Harn ausgeschieden.
Hirudin ist ein einkettiges Polypeptid aus 65 Aminosäuren, das natürlicherweise durch den medizinschen Blutegel (Hirudo medicinalis) in dessen sekretorischen Drüsen gebildet wird. Hirudin wirkt als äusserst stark bindender und sehr spezifischer Inhibitor gegenüber der Protease Thrombin und verhindert die Blutgerinnung. Der Mechanismus der Wirkung von Hirudin als Thrombininhibitor ist aufgeklärt : Der Cterminale Teil von Hirudin bindet an die Anionenbindungsstellen des Thrombins und belegt somit die Bindungsstelle der Fibrinogenkette am Thrombin. Zusätzlich blockiert der N-terminale Teil von Hirudin das
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1992,Coagul. Fibrinol. 2 : 69-75 ; Rydel et al. 1990, Science 249 : 277-280 ; Karshikov et al. 1992, Prot. Science 1 : 727-735 ; Markwardt 1991, Thromb. Haemost. 66 : 141-152).
Aus diesem Grund besteht schon seit längerem ein Interesse für die Verwendung von Hirudin als spezifisches Antikoagulans.
Seit kurzem ist man in der Lage, grosse Mengen an Hirudin auf rekombinantem Wege herzustellen und
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der pulmonaren transluminalen koronären Angioplastie (PTCA), als Beimischung zu Thrombolytika wie z. B. Plasminogenaktivatoren und Streptokinase, als Antikoagulans während der Operation und für die klinische Gerinnungsunterdrückung.
Bei Gabe von Antikoagulantien ist jedoch eine exakte Dosierung schwierig. Zum Beispiel kann die von Hirudin verursachte Hemmung von Thrombin in der Blutzirkulation ungewollt zu Komplikationen und Blutungen führen, die eine sofortige Eliminierung von Hirudin aus der Zirkulation erforderlich machen
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Fareed und Walenga 1989, FASEB J. 3 : 328). Allerdings ist die Bestimmung des Hirudinspiegels (Differenzierung freies und gebundenes Hirudin) im Blut und eine Verlaufskontrolle der Hirudin-Ausscheidung nur indirekt über die Bestimmung der Thrombin-Aktivität möglich. Zur Zeit besteht nur die Möglichkeit, den Hirudinspiegel im Blut durch natürliche Ausscheidung und gegebenenfalls mittels Dialyse zu reduzieren.
Auch die Gabe von Prothrombin wurde vorgeschlagen (Walenga et al. Sem. Thromb. Hemost. 15 : 316 : 1989), jedoch ist die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin in der Zirkulation zeitabhängig. Ein Überschuss an Thrombin begünstigt andererseits wieder die Gerinnungsneigung. Nicht zuletzt bildet Hirudin mit Thrombin einen sehr starken Komplex, der selbst in vitro nur schwer dissoziierbar ist, so dass eine Dosierung des Hirudinspiegels über einen Verdrängungsmechanismus realistischerweise bisher nicht praktikabel war.
Es wurde daher im Stand der Technik intensiv nach einem brauchbaren Antagonisten zu Hirudin gesucht, der gezielt einsetzbar ist und keine die Blutgerinnung betreffenden Nebenwirkungen zeigt. Obwohl dies ein bekanntes Problem der Hirudinforschung ist (Markwardt F., Haemostasis 21 : 11 ; 1991), gibt es bis dato keine praktikablen, in der Medizin einsetzbaren Lösungen.
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Es wurde vorgeschlagen (Brüggener et al., Pharmazie 44 : 648 ; 1989), eine chemische Veränderung des Thrombins vorzunehmen. Dabei wurde Diisopropylfluorophosphat an Thrombin, das aus Plasma gereinigt wurde, gekoppelt. DIP lagert sich in das aktive Zentrum von Thrombin ein, wodurch die dreidimensionale Struktur des katalytischen Bereiches verändert wird. Das entstandene DIP-Thrombin ist enzymatisch inaktiv, bindet aber Hirudin. Allerdings ist Diisopropylfluorophosphat äusserst giftig und gefährlich. Auf Grund der nicht sehr stabilen Bindung von DIP an Thrombin kann DIP leicht abdissoziieren. Ein In vivo zerfallende DIP-Thrombin-Komplex ist für die Anwendung Im klinischen Bereich daher völlig ungeeignet.
In der WO 93/15757 werden Prothrombin-Intermediate als Antidote zu Hirudin vorgeschlagen. Diese Produkte sind allerdings mit den üblichen Gefahren belastet, die allgemein Präparaten, die aus Plasma gewonnen werden, anhaften, z. B. Kontaminationen durch humanpathogene Viren.
Neben der Verwendung von Heparin, Coumarin und Hirudin zur Verhinderung der Blutgerinnung sind ebenfalls auch synthetische Thrombinhibitoren wie NAPAP (Na- (2-Naphthylsulforyl-glycyl) -D, L- amidinophenylalanin-peptid) oder PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CHCI) bekannt. Ferner wurde u. a. in Betracht gezogen, modifizierte Proteine, wie z. B. inaktivierte Koagulationsfaktoren, direkt als Antikoagulantien einzusetzen. Ein besonderes Problem dabei ist, dass das modifizierte Protein in vivo möglicherweise schneller als das Wildtyp-Protein aus dem Blut entfernt werden könnte. Der Koagulationsprozess, umfassend das Zusammenwirken der intrinsischen und extrinsischen Blutgerinnungskaskade und Zelloberflächenrezepto- ren, ist sehr komplex.
Ein in vivo für die Therapie oder Prophylaxe einsetzbarer, inaktivierte Koagulationfaktor sollte sich daher vom natürlichen Protein, ausser durch seine stark reduzierte oder vollständig inhibierte Koaguiationsaktivität In keiner weiteren wesentlichen Eigenschaft wie z. B. Rezeptorbindungskapazität unterscheiden. Wünschenswert wäre eine in vivo Halbwertszeit des inaktiven Proteins, die der des aktiven Koagulationsfaktor entspricht oder sogar erhöht ist. Da insbesondere Thrombin eine sehr kurze in vivo Halbwertszeit besitzt, würde ein inaktiver Koagulationsfaktor mit verlängerter Halbwertszeit das aktive Protein, z. B. Thrombin, bei einer kompetitiven Hemmung verstärkt von seinem Rezeptor verdrängt.
Dies hätte den Vorteil, dass zur effizienten Antikoagulanswirkung des inaktiven Proteins nur eine sehr relativ geringe Dosis verabreicht werden müsste.
Mit dem Gegenstand der WO 96/41868 konnte ein medizinisch einsetzbarer Antagonist von Hirudin zur Verfügung gestellt werden, der im wesentlichen keine enzymatische Aktivität aufweist, die die Blutgerinnung fördert.
Mit dem dort beschriebenen Antagonisten wurde ein inaktiver Koagulationsfaktor zur Verfügung gestellt. der sich in den wesentlichen Eigenschaften wie z. B. Rezeptorbindungskapazität nicht vom natürlichen Protein unterscheidet und bei dem gegebenenfalls die In vivo Halbwertszeit erhöht ist.
Der Antagonist wies gegenüber dem natürlichen Thrombin eine oder mehrere Veränderungen in der Proteinsequenz auf, war entweder inaktiv oder aber wies höchstens eine Aktivität von etwa 10 %, vorzugsweise höchstens etwa 0, 25 %, des natürlichen Proteins auf, wobei die Veränderung der Proteinsequenz die Bindungskapazität zu thrombinspezifischen Liganden und Rezeptoren, wie natürliche und synthetische Antikoagulantien, nicht beeinflusst war.
Das Mass an Bindungskapazität wurde bislang beispielsweise mit Antikoagulantien-kompetitiver Analyse zwischen Mutante bzw. Derivat und natürlichem Thrombin (Gan et al., 1993) oder mit Untersuchungen zur Bindungsaffinität gegenüber künstlichen Inhibitoren (z. B. mit DAPA (= Dansylarginin-N- (3-ethyl-1, 5-pentan- diyl) -amid) ; Pei et al., J. Biol. Chem. 266-9598, 1991) analysiert, was jedoch äusserst aufwendig ist.
Beim praktischen Einsatz von Hirudin oder Hirudinantagonisten ist es erforderlich, ständig deren Konzentration zu überwachen. Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung zu stellen, womit sowohl Hirudin oder Hirudinderivate, als auch dessen natürliche oder künstliche Antagonisten und Bindungspartner quantifiziert werden können. Auch muss überprüft werden, ob künstlich (z. B. durch rekombinante Technologie) geschaffene Antagonisten überhaupt als Bindungspartner für Hirudin In Frage kommen.
Diese Aufgabe wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch ein Testsystem gelöst, bei dem die Bindungskapazität der (Pro-) Thrombin-Derivate zu Hirudin oder Hirudinderivaten in einfacher und reproduzierender Weise qualitativ und quantitativ analysiert wird. Dieses Testsystem besteht aus einer festen Matrix, an der natürliches oder rekombinantes Hirudin, Derivate oder Peptide davon gebunden ist. An dieses immobilisierte Hirudin wird schliesslich das erfindungsgemässe Derivat gebunden und kann durch eine anschliessende Detektionsreaktion nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine feste Matrix, an der natürliches oder rekombinantes Hirudin, Derivate oder Peptide davon gebunden sind, und deren Verwendung bei der Bestimmung von Thrombin oder Thrombinderivaten. Die Bestimmung kann sowohl die Quantifizierung als auch die Bestimmung der Bindungskapazität des Thrombin oder Thrombinderivats umfassen.
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Unter fester Matrix Ist erfindungsgemäss jegliche feste Phase zu verstehen, an welcher der natürliche und synthetische Inhibitor wirksam immobilisiert werden kann, beispielsweise natürliche Polymere, wie Cellulose, Stärke, Dextran, Alginate, Agarose, Collagen, insbesondere die in der Immobilisierungstechnologie weitverbreiteten Sepharose- bzw. Cellulosematerialien, synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Methylacrylat, Nylon oder Oxirane, welche leicht zu anwenderfreundlichen Vorrichtungen geformt werden können, wie z. B. Mikrotiterplatten, und schliesslich anorganische Materialien, wie poröse Gläser, Silikagel, etc. (siehe auch Römpp-Lexikon der Biotechnologie, Seiten 385 ff.).
Mit der erfindungsgemässen Vorrichtung kann eine einfache und präzise Bestimmung der Thrombinbzw. Thrombinderivatkonzentration vorgenommen werden, wobei nicht nur das aktive Thrombin selbst bestimmt werden kann, sondern auch enzymatisch inaktives oder nur schwach aktives Prothrombin oder Thrombin und Derivate davon. Weiters lässt sich die erfindungsgemässe Vorrichtung auch auf Grund ihrer anwenderfreundlichen Gestaltung indirekt zur Konzentrationsbestimmung von jeglichen Thrombin-bindenden Substanzen, wie Thrombininhibitoren, aber insbesondere von Hirudin, einsetzen. Darüberhinaus ist auch eine Bestimmung der Bindungsstärke von Thrombin oder Thrombinderivaten zu den jeweils untersuchten natürlichen und synthetischen Inhibitoren mit der erfindungsgemässen Vorrichtung bestimmbar.
Als Thrombin oder Thrombinderivate werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche von der Proteinsequenz des Prothrombins ableitbaren Proteine verstanden, insbesondere die in der WO 96/41868 beschriebenen mutierten Thrombin-, Meizothrombin- oder Prothrombin-Derivate. Dabei kann das Derivat aber auch an den Bindungsdeterminanten verändert sein, solange diese Veränderungen eine Bindung an die natürlichen und synthetischen Inhibitoren nicht ausschliessen. Die Thrombinderivate können sich von natürlichem Thrombin durch eine oder mehrere Punkt-Deletions- oder Insertionsmutationen unterscheiden.
Prothrombinderivate, Meizothrombin sowie dessen Derivate können ebenfalls mit der erfindungsgemässen Vorrichtung bestimmt werden und sind-soweit es die Bestimmung derselben betrifft-im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Thrombinderivate anzusehen.
Zur eigentlichen Quantifizierung von Thrombin, Thrombinderivaten und/oder Hirudin oder Hirudinderivaten wird erfindungsgemäss ein Testkit vorgesehen, welcher die erfindungsgemässe Vorrichtung sowie einen oder mehrere Behälter mit Reagentien für eine spezifische Detektionsreaktion, vorzugsweise eine thrombinderivatspezifische Detektionsreaktion, enthält. Dabei ist unter spezifischer Detektionsreaktion jede geeignete Detektionsreaktion zu verstehen, insbesondere solche Reaktionen, die mit Farbstoffen arbeiten (Peroxidase, alkalische Phosphatase, Lumineszenzreaktionen, Biotin, Avidin oder Biotin-Streptavidin (als Verstärkersyste- me)) oder radioaktive Bestimmungsmethoden.
Vorzugsweise wird die in der Handhabung einfachere Farbreaktion zur Konzentrationsbestimmung der radioaktiven Bestimmung vorgezogen. Im besonderen werden für die Erfindung Peroxidasemarkierte SchafAnti-Thrombin-Antikörper verwendet und die für die Peroxidasereaktion gängigen Substratiösungen zur Farbreaktion eingesetzt.
Der erfindungsgemässe Testkit enthält weiters einen Behälter mit einer ein Trägerprotein beinhaltenden physiologischen Pufferlösung, wodurch die Reproduzierbarkeit der Quantifizierung erheblich verbessert wird.
Die spezifische Detektionsreaktion im Rahmen des erfindungsgemässen Testkits ist vorzugsweise eine markierte Thrombin-bindende Substanz, da in der Klinik die Bestimmung von Thrombin häufig gegenüber den anderen bestimmbaren Komponenten von herausragender Wichtigkeit ist. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von markierten Thrombin-bindenden Substanzen bekannt. Erfindungsgemäss kommt bevorzugt ein Farbstoff-markierter polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen Thrombin zur Anwendung. Die Detektion mittels chromogenen Substanzen wird häufig gegenüber radioaktiven Bestimmungsmethoden bevorzugt, da die Farbstoffreaktionen keine radioaktiven Kontaminationen mit sich bringen und die strengen Sicherheitsmassnahmen beim Arbeiten mit radioaktivem Material die radioaktive Bestimmungsmethode oft sehr unpraktisch machen.
Das Detektionsverfahren kann nach den in der Proteinchemie gängigen Verfahrensschritten ablaufen.
Zur Bestimmung der Konzentration von Thrombin oder Thrombinderivaten wird eine Thrombinlösung mit der Hirudin-gekoppelten festen Matrix für 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise zwischen 45 Minuten und 4 Stunden inkubiert. Die Reaktion findet üblicherweise in einem physiologischen Puffer, vorzugsweise in einem Tris-HCI-Puffer, statt. Es ist von besonderem Vorteil, wenn dem physiologischen Salzpuffer ein Trägerprotein, wie z. B. Albumin, zugesetzt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Testkits umfasst weiters eine Thrombinhaltige Referenziösung, die die Erstellung einer zuverlässigen Eichgeradeflim Testsystem erlaubt.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung von Thrombin oder Thrombinderivaten, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist :
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- Inkubieren einer Lösung, welche eine zu quantifizierende Menge an Thrombin oder Thrombinderivaten enthält, mit Hirudin oder einem Hirudinderivat, welches auf einer festen Matrix immobilisiert ist, wobei das Thrombin oder das Thrombinderivat an das immobilisierte Hirudin oder Hirudinderivat gebunden wird, - gegebenenfalls Entfernen von nicht-gebundenem Thrombin oder Thrombinderivat, - Durchführen einer spezifischen Detektionsreaktion, wobei die Menge an gebundenem Thrombin oder
Thrombinderivat bestimmt wird.
Das Durchführen der spezifischen Detektionsreaktion kann entweder im Rahmen des erfindungsgemä- ssen Testkits mit den Reagentien für eine spezifische Detektionsreaktion durchgeführt werden oder direkt durch eine Messvorrichtung auf der festen Matrix selbst, etwa mit einem Sensorchip mit angeschlossener Messanlage.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann in einfacher Weise durchgeführt werden, wobei es sich besonders für die rasche und unkomplizierte Anwendung im klinischen Bereich eignet.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens betrifft ein Verfahren, bei welchem die spezifische Detektionsreaktion eine Farbreaktion ist, wobei die Konzentration an Thrombin oder Thrombinderivat durch Korrelation mit der Intensität der Farbreaktion bestimmt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich gemäss einem weiteren Aspekt auch zur Quantifizierung von Hirudin oder Hirudinderivaten, wobei ein solches Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist : - Inkubieren einer Lösung mit einer zu quantifizierenden Menge an Hirudin oder Hirudinderivat mit einer
Lösung mit einer bekannten Menge an freiem Thrombin oder Thrombinderivat, - Bestimmen der nach dem Inkubieren mit dem Hirudin- oder Hirudinderivat verbliebenen freien
Thrombin- oder Thrombinderivat-Konzentration durch das oben geschilderte erfindungsgemässe Ver- fahren und - Bestimmen der Menge an Hirudin- oder Hirudinderivat durch Rückrechnen aufgrund der Unterschiede zwischen der ursprünglichen bekannten und der bestimmten Menge an Thrombin- oder Thrombinderi- vat.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäBen Vorrichtung bzw. des erfindungsgemässen Testkits zur Quantifizierung von Thrombin, Thrombinderivaten und/oder Hirudin oder Hirudinderivaten sowie zur Bestimmung der Bindungsstärke von Thrombin oder Thrombinderivaten zu Hirudin oder Hirudinderivaten.
Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, dass mit diesem Testkit erstmals auch die Bindungsstärke von Thrombin oder Thrombinderivaten an Hirudin oder anderen Thrombin-hindernden Substanzen bestimmt werden kann. Die Bindungsstärke von Thrombin an Hirudin wird vor allem dann interessant, wenn Thrombinderivate vorliegen, deren Bindungseigenschaften an Hirudin unbekannt sind.
Weiters kann der Testkit zur Funktionsanalyse von Hirudin-Antagonisten eingesetzt werden Und bei Austestung von Hirudinpeptiden oder Hirudinderivaten als effektive Antikoagulantien lässt sich das Verfahren ebenfalls anwenden.
Der erfindungsgemässe Testkit eignet sich daher, alle im Zusammenhang mit Thrombin, Hirudin und der Blutgerinnung auftretenden Fragen in Hinblick auf Konzentration, Bindungsstärke und Funktionalität zu beantworten. Dabei ist besonders hervorzuheben, dass auf Grund der Spezifität der Bindung von Hirudin an Thrombin ein äusserst exaktes Ergebnis erzielt werden kann. Verunreinigungen durch andere Blutfaktoren oder Proteine können das Ergebnis nicht verfälschen. Auch die Anwesenheit von Prothrombin stört die Analysen nicht, da Prothrombin nicht an Hirudin bindet.
Es ist zwar bekannt, Hirudin an Mikrotiter-Platten zu koppeln, um mit diesen ELISA-Platten Anti-HirudinAntikörper zu testen, eine Quantifizierung oder Bestimmung der Bindungskapazität wurde jedoch nicht mit diesen Platten beschrieben. (Mille B. et al., Clin. Chem. 40 : 734, 1994).
Bei der Herstellung einer Hirudin-gekoppelten festen Matrix wird Hirudin in einem Puffersystem an die Matrix gekoppelt.
Als Puffersystem eignet sich jeder Puffer, der frei ist von Aminogruppen, wie Phosphatpuffer, Citratpuffer oder vorzugsweise Carbonatpuffer. Der pH-Wert des Puffersystems sollte in der Menge zwischen 6 und 10 liegen, vorzugsweise bei pH 9, 3 bis 9, 7.
Erfindungsgemäss wird bei der Kopplungsreaktion von Hirudin an den festen Träger zwischen einer und 48 Stunden, vorzugsweise zwischen einer und 16 Stunden inkubiert. Die Inkubationszeit richtet sich im wesentlichen nach der Inkubationstemperatur, wobei vorzugsweise bei einer Kopplungsreakton in der Kälte (4'C) für 16 h, bei Raumtemperatur zwei bis drei Stunden und bei 37. C eine Stunde inkubiert wird.
Nach der Kopplungsreaktion wird erfindungsgemäss das überschüssige, nicht gebundene Hirudin mit einem Waschpuffer aus einer physiologischen Salzlösung, vorzugsweise aus einem Tris-HCI-Puffer, ent-
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fernt. Diesem Waschpuffer kann ein Detergens, vorzugsweise Tween 20, zugesetzt sein, wobei die Detergenskonzentration zwischen 0, 01 und 1 %, vorzugsweise bei 0, 1 %, liegt.
Mit dem erfindungsgemässen Testkit lassen sich Konzentrationen von Thrombin oder Thrombinderivaten im Bereich von 0, 1 pg/ml bis zu 100 mg/ml Thrombin, vorzugsweise im Bereich von 0, 1 ng/ml bis 200 ng/ml Thrombin bestimmen.
Nicht zuletzt eignet sich der erfindungsgemässe Testkit zum Unterscheiden von Thrombinen mit rekombinant gestalteten, gezielten Mutationen, Deletionen oder Insertionen, wobei daraufhin getestet werden kann, ob die Bindungsfähigkeit zu Hirudin unabhängig von der enzymatischen Aktivität erhalten geblieben ist.
Dieser erfindungsgemässe Test oder erfindungsgemässe Testkit kann speziell zum Einsatz kommen, wenn für eine medizinische Fragestellung der Thrombinspiegel im Blut bestimmt werden soll, um mit einer genau dosierten Hirudin-Gabe Thrombosen zu verhindern.
Dieser Test hat ausserdem den besonderen Vorteil, dass auch Thrombin bestimmt werden kann, das funktionell nicht aktiv ist und das daher in den Tests, die die enzymatische Aktivität des Thrombins erfassen, nicht nachweisbar ist. Dies ist zum Beispiel bei genetischen Defekten der Fall, wenn physiologisch inaktive Thrombinformen vorliegen.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und dazugehörigen Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch weiter erläutert.
Es zeigen : Fig. 1 den kodierenden Teil der cDNA-Sequenz von rekombinantem humanen Prothrombin und die daraus ableitbar Aminosäuresequenz, wobei die physiologischen Spaltstellen zur Prozessierung des Proteins beziehungsweise die Spaltstellen des Faktors Xa zur Aktivierung des Prothrombins zu Thrombin eingezeichnet sind ; Fig. 2 das Sequenzprotokoll ; Fig. 3 eine Zusammenfassung der Punktmutation eines bevorzugten Prothrombinderivats im Vergleich zum wt-Prothrombin, wobei die unterstrichenen Amino- säure/Nukleotide ausgetauscht worden sind ; Fig. 4A das Flussschema der Klonierung des Prothrombin- Asn419 ; Fig. 4B einen Western Blot zum Vergleich von plasmatischem Prothrombin, rekombinantem wt-
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; Fig. 5 :marker) ;
Fig. 6 : die denaturierende Elektrophorese einzelner Stufen der Bildung von Thrombin-Asn99 aus Prothrombin-Asn419 (A : Prothrombin-Asn419 ; B : Eiuat 3 ; C : humanes Thrombin ; 0 : Molekulargewichtsmar- ker) ; Fig. 7 die Bindung von Thrombin-Asn99 (A), rekombinantem wt-Thrombin (B) und humanem plasmatischen Thrombin (C) an immobilisiertes Hirudin ; Fig. 8 Abhängigkeit der Thrombinfluoreszenz von der Hirudinkonzentration (die Fluoreszenz bei 341 nm (Exitation 280 nm) von 390 nM Thrombin-Asn99 (A), 326 nM rekombinantes wt-Thrombin (B) und 350 nM humanes plasmatisches Thrombin (C) wurde in Abhängigkeit der Hirudinkonzentration bestimmt, die Fluoreszenz ohne Hirudin wurde als 0 %, die Fluoreszenz bei Hirudinsättigung als 100 % dargestellt) ; Fig. 9 die Neutralisierung von Hirudin durch Thrombin-Asn99 ;
Fig. 10 die Wiederherstellung der Thrombinaktivität aus dem Hirudin- Thrombin-Komplex durch Zugabe von Thrombin-Asn99 durch unterschiedliche Konzentrationen von Thrombin-Asn99 : (A) 0, 2 I./. g/ml, (B) 0, 4 LLg/ml, (c) 1 tig/m)) ; Fig. 11 die Neutralisation von Hirudin im Plasma (dabei ist die Gerinnungszeit in Anwesenheit von Hirudin (x--x) und ohne Hirudinzusatz () in Abhängigkeit von der Konzentration an Thrombin-Asn99 im Test dargestellt) ;
Fig. 12 die molekulare Struktur des katalytischen Zentrums im Thrombin-Hirudin-Komplex (Vergieich von humanem Thrombin und rekombinantem Thrombinderivat), wobei mit Pfeilen auf die durch Mutation Asp-Asn hervorgerufene Strukturveränderung hingewiesen wird und Ser, His und Asp bzw. Asn die Lage der Aminosäuren des katalytischen Zentrums im Thrombinmolekül und e die N-terminale Aminosäure von Hirudin bezeichnen.
Beispiele :
Beispiel 1 zeigt am Beispiel Prothrombin Asn419 die Verfahrensweise, wie ein punktmutiertes Prothrombin erhalten werden kann. Beispiel 2 demonstriert die Reinigung und Funktionsanalyse des Prothrombinderivats. Beispiel 3 zeigt die Gewinnung und Funktionsanalyse des Thrombinderivats. Beispiel 4 quantifiziert die Bindungsaktivität des Thrombinderivats an Hirudin ; Beispiel 5 überprüft das Prothrombinderivat auf seine Fähigkeit als Antagonist von Hirudin zu wirken, Beispiel 6 zeigt, daS Hirudin durch das Thrombin-Derivat neutralisiert werden kann. In Beispiel 7 wird gezeigt, dass das Thrombin-Derivat Thrombin aus einem Thrombin-Hirudin-Komplex wieder aktivieren kann ; Beispiel 8 zeigt, dass das Thrombin-Derivat auch im Plasma wirksam ist und Beispiel 9 zeigt die Gewinnung und Funktionsanalyse eines Meizothrombin-Derivats.
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Beispiel 1 : Konstruktion von pSV-Fllwt und pSV-FII-Asn419 (Asp zu Asn)
Das Plasmid pSVss (Nucl. Acids Res. 17 : 2365 ; 1989) wurde mit Notl geschnitten, um das interne ss- Galactosidasegen-Fragment zu entfernen. Der verbleibende Vektor wurde religiert und pSV genannt.
Um den grössten Teil der 3'-seitig der Polyadenylierungsstehe gelegenen und später möglicherweise störenden Polylinker-Sequenz zu entfernen, wurde pSV mit Hindill und Xbal geschnitten. Nach Entfernen des kleinen Polylinker-Fragments wurden die Vektor-Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und religiert. Das resultierende Plasmid wurde pSVA genannt.
Anschliessend wurde in die 5'-seitig des 16/19S-lntrons gelegene Xhol Stelle eine'Multiple Cloning Site' (MCS) mit geeigneten Restriktions-Schnittstellen eingefügt.
Die MCS wurde in Form zweier komplementärer Oligonukleotide chemisch synthetisiert :
5'-TCGACCATGG ACAAGCTTAT CGATCCCGGG AATTCGGTAC CGTCGACCTG
CAGGTGCACG GGCCCAGATC TGACTGACTG A-3' (Seq. ID. No. l) und
5'-TCGATCAGTC AGTCAGATCT GGGCCCGTGC ACCTGCAGGT CGACGGTACC
GAATTCCCGG GATCGATAAG CTTGTCCATG G-3'. (Seq. ID. No. 2)
Die beiden Oligonukleotide wurden "annealed" und In pSV6 gesetzt. Da das MCS-Insert zwar Xhol- kompatible, "sticky"-Enden, jedoch keine vollständigen Xhol-Stellen aufwies, wurde die Ligations-Reaktion mit Xhol geschnitten. Nicht schneidbare Konstrukte repräsentierten das gewünschte Plasmid, welches pSVMCS 111 genannt wurde.
Ein DNA-Fragment mit der vollständigen, humanen wt-Prothrombin-cDNA wurde mittels partiellem Ncolund vollständigem Smal-Restriktionsverdau aus Plasmid pTKemc-PT2 (WO 91/11519) ausgeschnitten.
Dieses Fragment wurde in den Vektor pSV-MCS 111 gesetzt, nachdem er ebenfalls über partiellen Ncolund vollständigen Smal-Verdau vollständig geöffnet worden war.
Das resultierende Plasmid wurde pSV-Fllwt genannt und exprimiert wt-Prothrombin, wie durch transiente Expression in COS-Zellen und stabile Expression in CHO-Zellen nachgewiesen wurde ; die Reihenfolge
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Um die Asparaginsäure des katalytischen Zentrums des Thrombins in ein Asparagin zu mutieren und somit eine inaktive Mutante des Thrombins herzustellen, wurde pSV-Fllwt mutiert : Das für die genannte Asparaginsäure kodierende Kodon befindet sich auf einem EcoRV-Dralll-Restriktionsfragment. Beide Restriktionsstellen sind einzigartig in pSV-Fllwt vorhanden. Die beabsichtigte Mutagenese wurde mittels Polymeraseketten-Reaktion mit dem Primer-Paar 2104/2066 (Seq. ID. No. 3 und 4) durchgeführt, in deren Folge das wt-Prothrombin-EcoRV-DraNl-Fragment durch das die Mutation enthaltende PCR Ec113611-Dralll- Fragment substituiert wurde.
Die beiden oligonukleotide wurden chemisch synthetisiert :
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Aminosäuresequenz jedoch wie im wt-Prothrombin erhalten bleibt.
Primer 2066 (5'-GCAGACACAC AGGGTGAATG TAGTCACTGA AGGCAACAGG CTTCTTCAGC TTCATCAGGG CAATATTCCG GTCCAGGTTC TCCCGC-3') (Seq. lD. No. 4) als 3'Primer ; durch diesen Primer wird auf DNA-Ebene die Asparaginsäure in Asparagin mutiert, eine Sspl-Restriktionsstelle eingeführt und eine Ncil-Stelle verloren.
Die PC-Reaktion wurde unter Standardbedingungen bei einer "annealing" Temperatur von 55. C durchgeführt.
Das resultierende Plasmid pSV-F)) Asn419, das die Asp-Asn-Mutation beinhaltet, wurde durch sein Restriktionsmuster mit EcoRV, Drallt, Sspl, und Ncil im Vergleich mit pSV-Fllwt identifiziert.
Das Flussschema des Klonierungsweges ist in Fig. 4A gezeigt.
Die erwartete Nukleotid-Sequenz des EcIl3611-Dralll-lnserts in pSV-FIIAsn419 wurde durch anschliessen-
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und 100 mg Streptomycin/mi, 10% foetalem Kälberserum, sowie 10 mg Desoxyadenosin, Adenosin, und Thymidin pro ml).
Mittels modifizierter CaPOt-Methode (Graham und van der Eb, Virology 52 : 456, 1973) wurden die Zellen mit 10 ug pSV-Fllwt bzw. pSV-FIIAsn-419 und 1 ng pSV-dhfr (Fischer et al., FEBS Lett. 351 : 345.
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:Anschliessend wurden 250 ml 280mM NaCl. 45mM Hepes, 2, 8mM Na2HPO4, pH 7, 12 zugegeben. Nach 10 Minuten wurde das entstandene DNA-Kopräzipitat zu den subkonfluenten Zellen gegeben.
Sechs Stunden später wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 15% Glyzerin in PBS überschichtet. Eine Minute später wurde das Glyzerin abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen, und die Zellen mit frischem"Vollmedium"versehen.
48 Stunden später wurden die Zellen trypsiniert und in unterschiedlichen Konzentrationen in "Selektions-Medium" (DMEM/F12 1 : 1 Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin ; supplementiert mit 2mM Glutamin, 1001U Penicillin and 100 mg Streptomycin/mi, und 10% dialysiertem foetalen Kälberserum mit einem Ausschlussvolumen von 10. OOOKd) aufgeteilt. Bei regelmässigen Mediumwechseln 2-3 mal in der Woche wurden Zellklone nach etwa 10 Tagen sichtbar. Eine weitere Woche später wurden die resultierenden Zellklone isoliert und in separaten Zellkultur-Schalen zur Konfluenz gewachsen. In serumfreien 24Stunden-Zellkulturüberständen mit sekretiertem. rekombinanten wt-Prothrombin bzw.
Prothrombin-Asn419 in Selektionsmedium (supplementiert mit 10 ug Vitamin Ki/mi, aber ohne Kälberserum) wurden anschliessend Antigenmenge und qualitative Integrität (Western Blot-Analyse), Funktionalität (geeignete Aktivitätstests) und Interaktion des zu Thrombin aktivierten Prothrombin mit Hirudin untersucht. Die Zellzahl wurde nach Trypsinieren der Zellen Im Zellzahlmessgerät der Fa. Schärfe, Reutlingen, Deutschland) bestimmt.
Zur Western Blot-Analyse wurden 10 l Zellkulturüberstand reduziert und denaturiert, und in denaturierenden 4% Sammel-/8% Trenngelen nach Lämmli (Nature 227 : 680pp, 1970) mit dem BioRad Mini-Protean 11 Dual Slab Gel-System aufgetrennt (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA). Die Proteine wurden nach erfolgtem Gellauf mit dem BioRad Mini Trans-Blot-System (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) in Transferpuffer (25mM Tris, 192mM Glycin) auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Zur Visualisierung des rekombinanten Proteins wurde das Protoblot-System der Fa. Promega (Madison, WIS, USA) verwendet.
Als Antikörper zur Prothrombin-Bindung wurde Kaninchen Anti-Prothrombin-Serum (Best. No. A325) der Fa.
Dakopatts (Glostrup, Dänemark) eingesetzt (Fig. 4B).
Beispiel 2 : Reinigung und Aktivitätsbestimmung von rekombinantem wt-Prothrombin und Prothrombinderivaten a) Reinigung des rekombinanten wt-Prothrombins und des Prothrombin-Asn419 Material : Anionen-Austauschersäule Fraktogel EMD TMAE 6 50, 1, 6 x 5 cm (Merck) Flüssigkeitschromatographiegerät FPLC LCC-500 (Pharmacia) anti-Prothrombin Immunglobulin (Stago)
Lösungen :
50 mM Tris/HCI Puffer pH 7, 4 (Puffer A)
50 mM Tris/HCt Puffer pH 7, 4, 180 mM NaCl (Puffer B)
50 mM Tris/HCI Puffer pH 7. 4, 300 mM NaCí (Puffer C)
50 mM Tris/HCI Puffer pH 7, 4, 160 mM NaC), 10 mM Ca-Acetat (Puffer D)
Für die Gewinnung des rekombinanten wt-Prothrombins und des Prothrombinderivats wurde Zellkultur- überstand von transformierten CHO-Zellen aus Beispiel 1 verwendet, der ein lösliches rekombinantes Prothrombinderivat enthielt.
Die Reinigung des rekombinanten wt-Prothrombins und des Prothrombinderivats aus dem Zellkultur- überstand erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie. Während der Chromatographie wurde der Verlauf in üblicher Weise durch Absorptionsmessung bei 280 nm vefolgt. Der Gehalt an Prothrombin bzw. an Prothrombinderivaten der einzelnen Fraktionen und Eluate wurde in üblicher Weise mittels ELISA unter Verwendung von handelsüblichem Prothrombinpräparat als Standard ermittelt.
Die Gesamtproteinkonzentration wurde nach der Methode von Bradford, M. (Anal. Biochem. 72,248 (1976)) ermittelt.
Das Reinigungsverfahren ist in Fischer et al., J. Biotechn. 38 : 129. 1995, beschrieben.
Die Daten zur Reinigung des wt-Prothrombins werden nicht gezeigt.
Zur Reinigung des Prothrombin-Asn419 wurde die Anionen-Austauschersäule mit Puffer A äquilibriert und anschliessend wurden 970 ml Zellkulturüberstand (Prothrombingehalt (ELISA) 20 u. g/mt ; Protonkonzen-
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tration 2, 7 mg/mi) mit einer Geschwindigkeit von 4 mi/Minute aufgetragen. Nicht an das Austauschergel gebundenes Material wurde durch Spülen der Säule mit Puffer A entfernt (Eluat 1 : 1030 ml : 1, 2 mg/mi).
Anschliessend wurden schwach an die Säule gebundene Proteine durch Spülen der Säule mit Puffer B entfernt (Eluat 2 : 20 mi ; Prothrombingehalt (ELISA) 2 ugiml ; Gesamtproteingehalt 10, 0 mg/ml). Danach wurde die Säule mit Puffer C eluiert und an der Säule gebundenes Protein wurde im Eluat (Eluat 3 : 30 ml ; Prothrombingehalt (ELISA) 355 ng/ml ; Gesamtproteingehalt 16 mg/ml) erhalten. Anschliessend wurde die Säule durch Waschen mit 1 M NaCI-Lösung regeneriert und mit Puffer D äquilibriert. 28 ml des Eluates 3 wurden mit Puffer A 1, 9-fach verdünnt und Ca-Acetat wurde zur Endkonzentration von 10 mM zugesetzt.
Diese Lösung wurde wiederum durch die Anionen-Austauschersäule filtriert und mit Puffer D gespült, wobei ungebundenes Protein im Eluat (Eluat 4 : 60 ml ; Prothrombingehalt (ELISA) 170 tig/ml) erhalten wurde. In den einzelnen Stufen der Chromatographie wurde das Protein durch denaturierende SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) untersucht. Fig. 5 zeigt mittels SOS-PAGE die Reinigung des Prothrombinderivats.
Aus der Darstellung ist ersichtlich, dass das Prothrombinderivat im Eluat 4 in reiner Form erhalten wurde. b) Aktivitätsbestimmung des Prothrombinderivats :
Alle Reinigungsstufen und Eluate wurden hinsichtlich der Gerinnungsaktivität von Prothrombin mittels
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: 73,überstand, den einzelnen Reinigungsstufen, noch in den Eluaten 1 - 4 konnte Prothrombinaktivität nachgewiesen werden.
Beispiel 3 : Gewinnung, Analyse und Aktivitätsbestimmung von wt-Thrombin und Thrombin-Asn99 a) Gewinnung von Thrombin-Asn99 : Die Gewinnung von Thrombin-Asn99 erfolgte analog zur Methode, welche in der EP-A-0 565 512 beschrieben wird, indem das Prothrombin Asn419 mittels Immobilisiertem Trypsin gespalten wird.
Das nach der Aktivierungerhaltene Eluat wurde mittels denatunerender SDS-PAGE untersucht (Fig. 6).
Die Ergebnisse der SDS-PAGE zeigen, dass rekombinantes Prothrombinderivat in ein Thrombindenvat (Thrombin-Asn99) mit einem Molekulargewicht von 33. 000 (schwere Kette) umgewandelt wurde.
Parallel dazu wird nach demselben Verfahren rekombinantes wt-Prothrombin zu Thrombin aktiviert. b) Analyse der Aminosäuresequenz des Thrombinderivats Thrombin Asn99
Die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse ergab folgende zwei Sequenzen : (A) Thr-Ala-Thr-Ser-Glu- Tyr-Gln-Thr-Phe-Phe-Asn-Pro-Arg-Thr-Phe ; (B) lle-Val-Glu-Ser-Asp-Glu-lie-Gly-Met-Ser-Pro-Trp-Gin. Die Sequenzen zeigen somit, dass das rekombinante Thrombinderivat durch Proteolyse an den authentischen Spaltstellen von Prothrombin (Arg271-Thr272 und Arg320-ííe321) als zweikettiges Molekül mit a-ThrombinStruktur gewonnen wurde.
Zur besseren Veranschaulichung der räumlichen Struktur des Thrombin Asn99-Hirudin-Komplexes zeigt Fig. 12 die molekulare Struktur des katalytischen Zentrums. Die Fig. 12 zeigt den Vergleich von humanem Thrombin und dem rekombinanten Thrombinderivat Asn99. c) Die Aktivitätsbestimmung des rekombinanten Thrombin-Asn99 erfolgte nach drei voneinander unabhängigen Methoden.
I. Bestimmung der Thrombinaktivität mittels chromogenem Substrat
Die Bestimmung der Thrombinaktivität mittels chromogenem Substrat erfolgte bei 25. C in 50mM Tris/HCI-Puffer, 150 mM NaCI, 0. 1 % PEG 6000. pH 8. 0. mit einer Konzentration des synthetischen chromogenen Substrats von 0, 2mM AcOH-OH-CHG-AJa-Arg-pNA (TH-1, Pentapharm) in einem Volumen von 1 ml. Es wurde die Absorption bei 410 nm zeitabhängig bestimmt. Als Referenz wurde Thrombinstandard mit definierter Aktivität (Immuno AG) verwendet. Die Verdünnungen der Proben erfolgte im Testpuffer mit einem Zusatz von 1 % Prionex (Collagenhydrolysat, Pentapharm).
Die Aktivitätsbestimmung ergab eine Aktivität von 0, 24 nmol/min u. g Protein für das rekombinante Thrombinderivat Thrombin-Asn99. Damit weist Thrombin-Asn99 lediglich eine Aktivität von 0, 24 % im
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<tb>
<tb> Bestimmung <SEP> der <SEP> Thrombinaktivität <SEP> mittels <SEP> chromogenem <SEP> Substrat
<tb> Thrombinderivat <SEP> spezifische <SEP> Aktivität <SEP> (nmol/min <SEP> ug <SEP> Protein)
<tb> Thrombin-Asn99 <SEP> 0.
<SEP> 24 <SEP>
<tb> rekombinantes <SEP> wt-Thrombin <SEP> 98, <SEP> 4 <SEP>
<tb> humanes <SEP> plasmatisches <SEP> Thrombin <SEP> 102, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
11. Bestimmung der Aktivität unter Verwendung eines Thrombinstandards
Alle Thrombinderivate wurden bezüglich ihrer Thrombinaktivität unter Verwendung eines Thrombinstandards (Immuno AG) definierter Aktivität untersucht. In dieser Aktivitätsbestimmung wurde für das Thrombin- Asn99 keine Aktivität gefunden (Tabelle 2).
Tabelle 2
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<tb>
<tb> Bestimmung <SEP> der <SEP> Aktivität <SEP> unter <SEP> Verwendung <SEP> eines <SEP> Thrombinstandards
<tb> Thrombinderivat <SEP> Aktivität <SEP> (lE/mg <SEP> Protein)
<tb> Thrombin-Asn99 <SEP> 0 <SEP>
<tb> rekombinantes <SEP> wt-Thrombin <SEP> 1656
<tb> humanes <SEP> plasmabsches <SEP> Thrombin <SEP> 1509, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
111. Aktivitätsbestimmung durch Titration des aktiven Zentrums
Die Titration des aktiven Zentrums der Thrombindenvate erfolgte nach der Methode von M. F. Doyle und P. E. Haley (Methods in Enzymology (1993), 222,299-312), unter Verwendung von p-Nitrophenyl-p'- Guanidinobenzoat als Substrat und eines Extinktionskoeffizienten von 16. 595 M-1 cm-'bei 410 nm.
Humanes plasmatisches Thrombin, rekombinantes wt-Thrombin und Thrombin-Asn99 wurden mit dieser Methode auf ihren Gehalt an aktivem Zentrum (aktive Thrombinkonzentration) untersucht. Dabei konnte für Thrombin-Asn99 kein aktives Zentrum ermittelt werden (Tabelle 3).
Tabelle 3
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<tb>
<tb> Aktivitätsbestimmung <SEP> durch <SEP> Titration <SEP> des <SEP> aktiven <SEP> Zentrums
<tb> Thrombinderivat <SEP> Konzentration <SEP> aktives <SEP> Thrombin
<tb> (nmol/mg <SEP> Protein)
<tb> Thrombin-Asn99 <SEP> 0 <SEP>
<tb> rekombinantes <SEP> wt- <SEP> Thrombin <SEP> 16. <SEP> 34 <SEP>
<tb> humanes <SEP> plasmatisches <SEP> Thrombin <SEP> 16. <SEP> 89 <SEP>
<tb>
Zusammenfassung : Im Unterschied zu rekombinantem wt-Thrombin und humanem plasmatischen Thrombin zeigt Thrombin-Asn99 nur in einer von drei Testmethoden eine äusserst geringe Thrombinaktivität, die ca. 1/400 der nativen Thrombinaktivität entspricht. Rekombinantes wt-Thrombin und humanes plasmatisches Thrombin zeigen sehr ähnliche Aktivitätsmuster.
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Beispiel 4 : Quantifizierung der Hirudinbindung des rekombinanten Thrombinderivats
I. Die Bindungsfähigkeit zu Hirudin von dem Thrombinderivat Thrombin-Asn99 wurde mittels eines
ELISA-Tests untersucht und mit humanem plasmatischen Thrombin und rekombinantem wt-Thrombin verglichen. Dieser ELISA-Test beruht auf der Verwendung von immobilisiertem Hirudin. Gemäss einer der
Ausführungsformen dieses Tests wird Thrombin an Hirudin, welches an Mikrotiterplatten immobilisiert ist, gebunden und über Antikörper mit anschliessender Farbreaktion nachgewiesen. Dieser Test ist unabhän- gig von der enzymatischen Aktivität des Thrombins.
Zur Herstellung der ELISA-Platten wird rekombinantes Hirudin Variante 1 (Variante 1 ; Firma Rhein Biotech, BRD ; 2 ug/ml, 100 ul) an Mikrotitrationsplatten gebunden. Nach dem Waschen wurden rekombinantes wt-Thrombin, Thrombin Asn99 oder humanes plasmatisches Thrombin (100 ul einer Lösung mit Konzentrationen laut Fig. 7) zugegeben und für eine Stunde inkubiert. Nicht-gebundenes Thrombin wurde entfernt und gebundenes Thrombin mittels Peroxidase-markiertem anti- Thrombin-Immunglobulin (Sheep
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wiesen (Fig. 7). Die Messung der Absorption erfolgte bei 450 nm.
Aus den Ergebnissen ist klar ersichtlich, dass sowohl rekombinantes wt-Thrombin (Fig. 7B), humanes plasmatisches Thrombin (Fig. 7C), als auch Thrombin-Asn99 (Fig. 7A) in identischer und konzentrationsabhängiger Weise an immobilisiertes Hirudin binden.
11. Bestimmung der Bindung von Hirudin an Thrombin mittels Änderung der Fluoreszenz aromatischer
Aminosäuren im Thrombinmolekül und Bestimmung der Bindungskonstante von Hirudin an Thrombinde- rivate.
Anhand von Fluoreszenzemissionen wurde unter Verwendung des PC-Programms ENZFITTER (RJ.
Leatherbarrow, Elsevier-Biosoft. 1987) unter Zugrundelegung eines Bindungsmodells mit einer gemeinsamen Bindungsstelle die Bindungskonstante von Thrombin zu Hirudin ermittelt. Die Bestimmung der intrinsischen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren der Thrombinderivate erfolgte in 50mM Tns/HCt- Puffer, 150mM NaCI, 0, 1 % PEG 6000. pH 7, 4. Die Exitation erfolgte bei 280 nm (Spaltbreite 2, 5 nm), die Emission wurde zwischen 300 nm und 400 nm (Spaltbreite 5 nm) registriert.
Die intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan im Thrombinmolekül wurde bei 280 nm angeregt und die Emission zwischen 300 nm und 400 nm ohne Hirudinzusatz bzw. in Anwesenheit von Hirudin gemessen.
Die Fluoreszenz bei 341 nm (Exitation 280 nm) von 390 nM Thrombin-Asn99,326 nM rekombinantes wtThrombin und 350 nM humanes plasmatisches Thrombin wurde in Abhängigkeit der Hirudinkonzentration bestimmt.
Wieder wird das Thrombinderivat Thrombin-Asn99 mit rekombinantem wt-Thrombin und humanem plasmatischen Thrombin verglichen. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass sich in Anwesenheit von Hirudin zu allen drei Thrombinderivaten die Fluoreszenz von Tryptophan im Thrombinmolekül (Hirudin besitzt kein Tryptophan) wesentlich erhöht (Fig. 8). Dies ist offensichtlich auf die Herausbildung eines Hirudin- Thrombin-Komplexes zurückzuführen.
Dadurch kommt es offenbar zu einer strukturellen Änderung im Thrombinmolekül. die die Fluoreszenzeigenschaften von Tryptophan beeinflussen. Aus Raumstruktur-Analysen des Thrombin-Hirudin-Komplexes ist bekannt, dass insbesondere Trp 51, Trp 148 und Trp 227 aus Thrombin durch Hirudinbindung in Kontaktnähe zum Inhibitor gelangen.
Fig. 8 zeigt im Vergleich die Abhängigkeit der Thrombinfluoreszenz von der Hirudinkonzentration. Für alle drei Thrombinderivate wurden sehr ähnliche Bindungen von Hirudin an Thrombin erhalten. Die Bindung von Hirudin an alle drei Thrombinderivate entspricht einer Sättigung und ergibt eine Bindungsstelle je Thrombinmolekül.
Die Daten aus Fig. 8 wurden benutzt, um die Bindungskonstanten von Hirudin an die Thrombinderivate zu bestimmten (Tabelle 4). Es ist ersichtlich, dass für alle Thrombinderivate sehr ähnliche und sehr hohe Assoziationskonstanten erhalten wurden.
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Tabelle 4
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<tb>
<tb> Bindungskonstanten <SEP> von <SEP> Hirudin <SEP> an <SEP> die <SEP> Thrombinderivate
<tb> Thrombinderivat <SEP> Assoziationskonstante <SEP> des
<tb> Thrombin-Hirudin-Komplexes <SEP> (M-1) <SEP>
<tb> Thrombin-Asn99 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> x <SEP> 107 <SEP>
<tb> rekombinantes <SEP> wt- <SEP> Thrombin <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 107 <SEP>
<tb> humanes <SEP> plasmatisches <SEP> Thrombin <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 107
<tb>
Beispiel 5 : Rekombinantes Prothrombin als Hirudin-Antagonist
Material :
Koagulometer KC 10 (Amelungen GmbH, Deutschland) Prothrombin-freles Normalplasma (Immuno AG, Wien)
Prothrombin-Konzentrationsstandard (Immuno AG, Wien)
Rekombinantes Hirudin (Rhein Biotech, Deutschland)
In einem üblichen Laborverfahren wurde mittels eines Prothrombin-Zeit-Testes die Zeit ermittelt, die nach Aktivierung der an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren benötigt wird, um Normalplasma zur Gerinnung zu bringen. In diesem Test wird durch Zugabe von Ca2+. lonen zur Mischung aus 1. Prothrombinfreiem Normalplasma (welches jedoch alle anderen Gerinnungsfaktoren enthält) und 2. ProthrombinKonzentrationsstandard (Prothrombin mit definierter Aktivität) der Gerinnungsfaktor Xa gebildet, welcher dann Prothrombin (Faktor 11) in Thrombin (Faktor a) umwandelt.
Thrombin bewirkt dann die Umwandlung von löslichem Fibrinogen in unlösliches Fibrin. Dies führt zur Bildung von Blutgerinnseln. Der Zeitabstand zwischen Aktivierung mittels Zugabe der Ca2+-lonen und der Bildung des Blutgerinnsels wird dabei automatisch durch das Koagulometer bestimmt. Bekannterweise hängt die Zeitdauer der Blutgerinnung von der Konzentration des Prothrombins bzw. der Konzentration des gebildeten aktiven Thrombins ab. Je höher die Thrombinkonzentration im Reaktionsgemisch ist, desto geringer ist die Gerinnungszeit. Bei der Zugabe eines Thrombininhibitors, wie Hirudin, kommt es nach der Umwandlung von Prothrombin in Thrombin zur Herausbildung eines inaktiven Thrombin-Hirudin-Komplexes, so dass das in diesem Komplex gebundene Thrombin sich nicht mehr an der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin beteiligen kann.
Folglich verlängert sich die Gerinnungszelt aufgrund der verringerten Menge an aktivem Thrombin. Bei einem Überschuss an Inhibitor über Thrombin kommt es zur vollständigen Hemmung der Blutgerinnung. Wird jedoch zu einem Testsystem sowohl ein Thrombin-Inhibitor wie Hirudin und eine weitere Komponente, die ihrerseits den Innibitor bindet, aber nicht an der Blutgerinnung beteiligt ist, zugegeben, verringert sich die Wirkung des Inhibitors auf Thrombin. Dann ist die Gennnungszeit wieder verkürzt. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen zusammengefasst : Aus den Ergebnissen der Tabelle 5 geht hervor :
1. Prothrombin führt zu einer raschen Bildung des Blutgerinnsels.
2. Hirudin führt zur Hemmung der Blutgerinssung.
3. Das rekombinante Prothrombinderivat führt zu keiner Blutgerinnung.
4. Das rekombinante Prothrombinderivat führt zu keiner Beeinflussung der Blutgerinnung durch natürli- ches Prothrombin.
5. Durch Zugabe von rekombinantem Prothrombinderivat wird die Hirudin-abhängige Hemmung der
Blutgerinnung aufgehoben.
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<tb>
<tb> Komponenten <SEP> im <SEP> Gerinnungstest <SEP> Gerinnungszeit <SEP> (Sekunden)
<tb> Ansatz <SEP> (A)
<tb> Prothrombin-freies <SEP> Normalplasma <SEP> 125 <SEP> mU/ml <SEP> (12, <SEP> 5 <SEP> Ilg/ml) <SEP> Prothrombin <SEP> 18
<tb> Ansatz <SEP> (B)
<tb> Prothrombin-freies <SEP> Normalplasma <SEP> 125 <SEP> mU/m) <SEP> (12, <SEP> 5 <SEP> ng/mi) <SEP> Prothrombin <SEP> > <SEP> 100
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> ug/ml <SEP> Hirudin
<tb> Ansatz <SEP> (C)
<tb> Prothrombin-freies <SEP> Normalplasma <SEP> 25 <SEP> ug/ml <SEP> erfindungsgemässes <SEP> > <SEP> 100
<tb> Prothrombinderivat
<tb> Ansatz <SEP> (D)
<tb> Prothrombin-freies <SEP> Normalplasma <SEP> 125 <SEP> mU/ml <SEP> (12, <SEP> 5 <SEP> ug/ml)
<SEP> Prothrombin <SEP> 18
<tb> 25 <SEP> (ig/ml <SEP> erfindungsgemässes <SEP> Prothrombinderivat
<tb> Ansatz <SEP> (E)
<tb> Prothrombin-freies <SEP> Normalplasma <SEP> 125 <SEP> mU/ml <SEP> (12, <SEP> 5 <SEP> Ilg/ml) <SEP> Prothrombin <SEP> 35
<tb> 25 <SEP> ugiml <SEP> erfindungsgemässes <SEP> Prothrombinderivat. <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> tig/ml <SEP> Hirudin
<tb>
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: NeutralisierungBeispiel 8 : Neutralisation von Hirudin im Plasma
Ziel der Untersuchung war es zu zeigen, dass Thrombin-Asn99 in der Lage ist, auch im Plasma Hirudin zu neutralisieren und somit eine hemmende Wirkung von Hirudin auf Thrombin aufzuheben. Zur Durchführung wurde in Analogie zum aPPT-Test 110 ul 1 hirudinisiertes Citratplasma (Hirudinkonzentration 1, 8IJ. g/ml) mit 100 IJ. I partiellem Thromboplastin-Reagens (Boehringer Mannheim, BRD) und 10 u. 1 Thrombin-Asn99 (von 0 - 17 u. g/ml It. Fig. 11) gemischt und für 3 Minuten bei 371 C inkubiert.
Anschliessend wurden 100 u. 1 25 mM CaCI2 zugegeben und die Gerinnungszeit automatisch bestimmt (Fig. 11).
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass durch Hirudin (ohne Zusatz an Thrombin-Asn99) die Gerinnungszeit sehr stark verlängert wird. Konzentrationsabhängig, mit zunehmender Menge an Thrombin-Asn99, verkürzt sich die Gerinnungszeit jedoch wieder, und erreicht die für Normalplasma üblichen Werte.
Aus der Darstellung ist klar ersichtlich, dass auch im Plasma Hirudin durch Thrombin-Asn99 neutralisiert wird, und somit die Hemmung von Hirudin auf plasmatisches Thrombin aufgehoben wird.
Die Gesamtheit der Untersuchungsergebnisse zeigen eindeutig, dass die hergestellte Thrombinmutante Thrombin-Asn99 entsprechend der Zielsetzung nur eine vernachlässigbar kleine Aktivität besitzt (weniger als 0, 24 % von aktivem Thrombin), jedoch Hirudin in identischer Weise bindet.
Die Eigenschaft, Hirudin zu binden, befähigt das rekombinante Molekül, den Inhibitor sowohl im definierten Puffersystem, als auch im Plasma zu neutralisieren. Darüberhinaus ist Thrombin-Asn99 in der Lage, Hirudin aus dem Thrombin-Hirudin-Komplex herauszulösen und zu neutralisieren.
Beispiel 9 : Gewinnung und Funktionsanalyse von MeizothrombinAsn419
Für die Gewinnung von rekombinantem Meizothrombin-Asn419 wurde Prothrombin-Asn419 aus Beispiel 1 verwendet. ProthrombinAsn419 wurde durch Inkubation mit der Venom-Protease Ecarin in MeizothrombinAsn419 umgewandelt. Dabei wurde Prothrombin-Asn419 zu 0, 2 mg/mi in 20 mM TrislHCI-Puffer, pH 7, 4, 150 mM NaCt, 5 mM CaCI2, gelöst, und auf je 1 ug Prothrombin-Asn419 wurden 20 ng Ecarin (Produkt der Firma Pentapharm) zugegeben. Die Aktivierung erfolgte bei 4'C für 4 Stunden. Das resultierende MeizothrombinAsn419 wurde in Analogie zur Reinigung von Thrombin-Asn99 (Beispiel 3) durch Affinitätschromatographie am Peptid-Gel gereinigt und isoliert.
Auf diese Weise hergestelltes Meizothrombin-Asn419 besitzt das identische Molekulargewicht von Prothrombin-Asn419 von 72 000, und besteht aus der Prothrombin-F1/F2/A-Kette (Molekulargewicht 52 000, Nterminale Aminosäuresequenz Ala-Asn-Thr-Phe-leu-Gla-Gla-) und der B-Kette (Molekulargewicht 32000, Nterminale Aminosäuresequenz e-Val-Glu-Ser-Asp-Ala-Glu-lle).
In Analogie zu den Beispielen 3 (c) I bis 111 wurden die enzymatischen Eigenschaften von MeizothrombinAsn419 untersucht. In keinem der Testverfahren wurde für Meizothrombin-Asn419 eine Aktivität bestimmt.
In Analogie zu Beispiel 4 (t) und (11) konnte ermittelt werden, dass Meizothrombin-Asn419 in einer konzentrationsabhängigen Weise und mit einer Stärke vergleichbar mit humanem plasmatischen Thrombin an immobilisiertes Hirudin bindet und sich die Fluoreszenzintensität aromatischer Aminosäuren durch die Bindung an Hirudin, wie für Thrombin-Asn99 beschrieben, erhöht.
In Analogie zu Beispiel 6 konnte für Meizothrombin-Asn419 gezeigt werden, dass es Hirudin neutralisiert und somit die Hemmung bezüglich Thrombin aufhebt. Bei einem Verhältnis von 1 Mol Meizothrombin-Asn419 zu 1 Mol Hirudin wird die Thrombinhemmung neutralisiert.
In Analogie zu Beispiel 7 konnte für Meizothrombin-Asn419 gezeigt werden, dass durch die Zugabe von Meizothrombin-Asn419 zum Thrombin-Hirudin-Komplex das Hirudin aus dem Komplex wieder herausgelöst werden kann, und somit das Thromin seine Aktivität wiedergewinnt. Die dabei gewonnenen Daten entsprechen denen von Thrombin-Asn99.
In Analogie zu Beispiel 8 konnte für Meizothrombin-Asn419 gezeigt werden, dass es in der Lage ist, im Plasma Hirudin zu neutralisieren und somit die hemmende Wirkung auf Thrombin aufzuheben. Die dabei gewonnenen Daten entsprechen denen von Thrombin-Asn99.
Patentansprüche 1. Vorrichtung zur Quantifizierung von Prothrombin, Prothrombinderivaten bzw. Prothrombinmutanten,
Thrombin, Thrombinderivaten bzw. Thrombinmutanten, Meizothrombin, Meizothrombinderivaten bzw.
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