JP3095787B2 - ＩＸａ因子の触媒活性の測定方法 - Google Patents

ＩＸａ因子の触媒活性の測定方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、IX a因子の触媒活性の測定方法に関する。
本発明による方法は、IX a因子阻害物質を発見するため
（スクリーニング）、血液凝固を調節するため（治療用
途）、並びに体液中の第IX因子及びIX a因子を測定する
ため（診断用途）に適当である。
血漿プロテアーゼは、フィブリン形成による血液凝
固、創傷閉鎖、及び繊溶、つまり血餅溶解において役割
を果たしている。怪我をすると、非活性であるプロ酵素
が連続的に活性化（特異的タンパク質分解）されること
により「怪我のシグナル」が増幅されて、活性酵素が形
成され、これが血液凝固を開始し、速やかな創傷閉鎖を
確実にする。血液凝固は、２つの経路、つまり全部のタ
ンパク質成分が、血液中に存在する内因系経路、そして
膜タンパク質、いわゆる組織因子が、決定的な役割を果
たす外因系経路によって開始されうる。
血液ホメオスタシス（血液凝固、繊溶、及びこの平衡
の調節）の分子的メカニズム、及びこれに関与する成分
は、いくつかの総説論文において包括的に記載されてい
る（Furie,B.and Furie,B.C.,Cell53（1988）505−518;
Davien,E.W.et al.,Biochem.30（1991）10363−10379;B
ergmeyer,H.U.（編）:Methods of Enzymaic Analysis,V
ol.V,chapter3,3rded.,Academic Press,New York（198
3））。
血液凝固カスケードの因子は、非常に複雑なタンパク
質である。原則としては、これらは、天然の原料源であ
る血漿から、複雑な方法で、限られた量でしか単離でき
ず、その質、均一性、純度もまちまちである（Van Dam
−Mieras,M.C.E.et al.,In:Bergmeyer,H.U.（編）,Meth
ods of Enzymatic Analysis,Vol.V,3rd ed.,page365−3
94,Academic Press,New York（1983））。これらは、血
液凝固、血餅形成、及び溶解の間の平衡である血液ホメ
オスタシスの調節において重要な役割を果たしている。
この良く調節されたシステムは、血友病Ａ（VIII因子欠
損）及び血友病Ｂ（IX因子欠損）などの遺伝子欠損によ
り不均衡となり得る。急性の障害は、心梗塞、塞栓症、
及び発作をもたらし得る。
したがって、医療上の要求により、血液凝固と繊溶の
システムに影響を及ぼすことのできる物質が求められて
いる。例えば、血液から単離された、又は組換えにより
産生されたVIII因子又はIX因子は、血友病Ａ及び血友病
Ｂを治療するために使用される。例えば心梗塞後の血餅
の溶解のためには、tPA（組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター）及びストレプトキナーゼ（細菌性プラスミノ
ーゲンアクチベーター）が使用されている。複合体タン
パク質に加えて、ヒルジン（65のアミノ酸からなるペプ
チド、トロンビン阻害物質）、ヘパリン（ヘテログリカ
ン、内因性阻害質の補因子）、及びビタミンＫアンタゴ
ニスト（GlAドメインのGlu残基のγ−カルボキシル化の
阻害物質）などの物質もまた、血液凝固を阻害するため
に使用されている。しかし、使用しうる物質は、まだ非
常に高価であることが多く（タンパク質因子）、医療上
の適用に関しては理想的ではない（副作用）ため、血液
凝固及び血餅溶解を特異的に調節するために使用するこ
とができる医薬が求められている。
血液凝固、繊溶及びホメオスタシスの新規調節物質
（活性化物質、阻害物質）の探索は、例えば物質ライブ
ラリーをスクリーニングし、次に確認された主要構造を
薬物モデリングで改良することによって行なうことがで
きる。このため、ｉ）適当な試験と、ii）鍵となるタン
パク質［標的］が、スクリーニングと結晶構造研究に適
した量及び質で利用可能であることが必要である（例え
ば、タンパク質成分と主要構造お三次元構造に基づく変
化を特異的に予想することによって主要構造を改善す
る）。
IX a因子（F IX a）は、血液凝固を調節するための阻
害物質を発見するための阻害物質スクリーニングにとっ
て興味深い標的である。血友病Ｂ（IX a因子欠損）の知
られている臨床像は、IX a因子の特異的阻害物質が、か
なり多面的発現性である副作用の面に関して公知のトロ
ンビン阻害物質よりも優れているとの推定が正しいこと
を示している。
以前、F IX a阻害物質の活性をスクリーニングするこ
とは、F IX aの入手可能及びその触媒活性の極端な低さ
のために失敗している。
血漿からの非活性セリンプロテアーゼF IX（チモーゲ
ン）の単離、そしてそれに続くタンパク質分解による活
性化は、困難であり、時間がかかり、費用がかさみ、そ
して所望の量と品質を得ることができないことが多い。
例えば、非活性プロテアーゼであるチモーゲンF IXの血
漿中濃度は、0.5mg/ほどである（Furie,B.and Furie,
B.C.,Cell53（1988）505−518）。更に、血漿から単離
されin vitroで活性化されたプロテアーゼ調整物は、非
常に不均一であり、不安定であることが多い。
非活性F IXチモーゲンは、例えば精製F XI aを用い
て、活性化／変換することができる（Van Dam−Mieras,
M.C.E.;Muller,A.D.;van Dieijen,G.;Hemker,H.C.:Bloo
d coagulation factora II,V,VII,VIII,IX,X and XI:De
termination with synthetic substrates.In:Bergmeye
r,H.U.（編）:Methods of Enzymatic Analysis,Vol.V,E
nzymes3:Peptidases,Proteinases and Their Inhibitor
s,page365−394,3rd ed.,Academic Press,New York（19
82））。
血漿プロテアーゼは、セリンプロテアーゼファミリー
に属する複雑な糖タンパク質である。これらは、肝臓
で、非活性なプロ酵素（チモーゲン）として合成され、
血液中に分泌され、特異的なタンパク質分解、つまり１
つ又は２つのペプチド結合の開裂により必要に応じて活
性化される。これらは、そのタンパク質ドメインの配列
及びその組成に関して、構造的に非常に似ている（Furi
e,B.and Furie,B.C.,Cell53（1988）505−518）。
Furie,B.and Furie,B.C.によると、IX因子ファミリー
（VII、IX、Ｘ因子、及びプロテインＣ）のプロテアー
ゼは、以下からなる： − プロペプチド、 − GLAドメイン、 − 芳香族アミノ酸スタックドメイン、 − ２つのEGFドメイン（EGF1及びEGF2）、 − チモーゲン活性化ドメイン（活性化ペプチド、A
P）、及び − 触媒プロテアーゼドメイン。
更に、血漿プロテアーゼは、分泌の間に、翻訳後修飾
される： − 11−12ジスルフィドブリッジ − Ｎ−及び／又はＯ−グリコシル化（GALドメイン及
び活性化ペプチド） −Bharadwaj,D.et al.,J.Biol.Chem.270（1995）6537
−6542 −Medved,L.V.et al.,J.Biol.Chem.270（1995）13652
−13659 − プロペプチドの開裂 − Glu残基のγ−カルボキシル化（GLAドメイン） − Asp残基のβ−ヒドロキシル化（EGFドメイン） − チモーゲン領域の開裂（部分的） １つ又は２つのペプチド結合の特異的な開裂（活性化
ペプチドの開裂）によるチモーゲン（チモーゲンの形の
タンパク質）の活性化後、酵素的に活性であるプロテア
ーゼは、２つの鎖からなり、これは、その分子量に応じ
て、重鎖及び軽鎖と称せられる。IX因子プロテアーゼフ
ァミリーにおいては、２つの鎖が、EGF2ドメインとプロ
テアーゼドメインの間の分子間ジスルフィドブリッジに
よって一緒になっている。チモーゲン−酵素変換（活性
化）により、プロテアーゼドメイン内で構造の変化が起
きる。これによって、プロテアーゼ活性に必要である必
須の塩橋が、プロテアーゼドメイン内でプロテアーゼド
メインのＮ末端アミノ酸とAsp残基との間に形成され
る。Ｎ−末端領域は、このサブグループのセリンプロテ
アーゼにとっては非常に重要なものであり、修飾するこ
とはできない。そのために、セリンプロテアーゼの代表
的な活性部位が、Ser、Asp及びHisからなる触媒３回対
称軸（triad）を形成することが可能である［Blow,D.
M.:Acc.Chem.Res.9（1976）145−152;Polgar,L.:In:Mec
hnisms of protease action.Boca Raton,Florida,CRC P
ress,chapter3（1989）］。
血漿プロテアーゼは、血液から不活性なチモーゲンを
単離し、次いでそれを活性化することによって、古典的
な方法によって産生することができ、あるいは対応する
cDNAを、適当な哺乳動物細胞系又は酵母中発現させるこ
とによって組換えにより産生することができる。
真核細胞ホスト／ベクター系を用いたチモーゲン又は
活性プロテアーゼの発現／分泌による凝固因子の産生
は、F VIIについては、Haegn,F.S.et al.,EP 0 200 42
1;Pedersen,A.H.et al.,Biochem.28（1988）9391−9336
に、F IXについては、Lin,S.−W.et al.,J.Biol.Chem.2
65（1990）144−150に、F Xについては、Wolf,D.L.et a
l.,J.Biol.Chem.266（1991）13726−13730;プロテイン
Ｃについては、Bang,N.U.et al.,EP 0 191 606に記載さ
れている。
原則として、分泌の過程中、天然の酵素と同様に凝固
因子を翻訳後修飾することのできるホスト細胞を使用す
る。次に、例えばプロトロンビン又はＸ因子の場合、ヘ
ビ毒由来のアクチベーターを用いることによって、下流
の処理の間にチモーゲン−酵素の交換を行なう（Sheeha
n,J.P.et al.,J.Biol.Chem.268（1993）3639−3645;Fuj
ikawa,K.et al.Biochem,11（1972）4892−4898）。
In vivoにおけるチモーゲン−酵素活性化（既に分泌
の間）の目的のために、天然のチモーゲン開裂部位又は
活性換ペプチド全体を、例えばKex2（酵母）又はPACE
（哺乳動物細胞系）などのホスト細胞の分泌経路におい
て自然に存在するプロテアーゼを特異的に開裂させるこ
とによって開裂させることのできるプロテアーゼ開裂部
位（幾つかの隣接する塩基性アミノ酸）によて置き換え
た（F Xについては、Wolf,D.L.et al.,J.Biol.Chem.266
（1991）13726−13730;プロトロンビンについてはHoll
y,R.D.and Foster,D.C.,WO93/13208）。
凝固因子のバリアント（F Xについては、Rezaie,A.R.
et al.,J.Biol.Chem.268（1993）8176−8180,F IXにつ
いては、Zhong,D.G.et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA91
（1994）3574−3578）、突然変異種（F Xについては、R
ezaie,A.R.et al.,J.Biol.Chem.269（1994）21495−214
99;トロンビンについては、Yee,J.et al.,J.Biol.Chem.
269（1994）17965−17970,F VIIIについては、Nicolais
en,E.M.et al.,WO88/10295）、並びに例えばF IX及びF
Xからなるキメラ（Lin,S.−W.et al.,J.Biol.Chem.265
（1990）144−150;Hertzberg,M.S.et al.,J.Biol.Chem.
267（1992）14759−14766）の、真核細胞ホスト／ベク
ター系を用いた産生も公知である。
しかし、真核細胞の哺乳動物細胞系における発現は、
時間がかかり、発現の出力の面でかぎられており、高価
である。更に、所望ではない翻訳後修飾が起こり得る。
原核細胞における発現による血漿プロテアーゼの産生
と、それに続く発現生成物の再生は、Thogersen,H.C.et
al.（WO94/18227）によって記載されている。これによ
ると、F Xバリアントは、不活性F Xタンパク質を、金属
キレート錯体（ポリ（His）−アフィニディハンドル）
を用いてクロマトグラフィーカラムに固定する周期的な
再生工程を用いて再生する。融合タンパク質を、このた
めに使用し、これは、切断F Xバリアント（EGF1、EGF2
及びプロテアーゼドメイン）、追加のF X aプロテアー
ゼ認識配列、及び６個のヒスチジ残基からなる触媒ドメ
インのＣ末端における付着の補助手段からなる。
驚くべきことに、基質に関し、IX a因子の触媒活性
を、アルコールにより刺激することができ、このため非
常に感受性の高いIX a因子試験が、簡単な方法で構築す
ることができることが見出された。
したがって本発明は、試料溶液中のIX a因子の測定方
法であって、測定しうるIX a因子の基質、及び水と均一
に混和して単一の相を形成するアルコールを、試料溶液
に加え、IX a因子活性の尺度としてのIX a因子の基質の
開裂を測定することを特徴とする方法に関する。驚くべ
きことに、IX a因子の触媒活性は、アルコールによって
20倍以上も増大させることができることが判明した。そ
の結果、試料溶液中のIX a因子活性を直接測定すること
が可能である。例えばIX a因子は、試料溶液、好ましく
は血漿などの体液中、ラッセルクサリヘビのヘビ毒、又
はヘビ毒から単離したプロテアーゼ（RVV−Ｘプロテア
ーゼ）を用いてIX因子を活性化してIX a因子とした後に
測定することができる。
本発明の更なる主題は、IX a因子活性を調節（阻害又
は活性化）する物質をスクリーニングするための本発明
によるIX a因子の測定方法の用途である。したがって本
発明は、IX a因子の活性を調節する物質を確認する方法
であって、 ａ）アルコールの存在下、所定の濃度のIX a因子活性を
有するポリペプチドにより、IX a因子の基質を開裂さ
せ、IX a因子活性の尺度として該基質の開裂速度を測定
し、 ｂ）該活性を試験物質の存在下で測定し、 ｃ）試験物質の存在下及び非存在下での活性を比較し、 ｄ）試験物質による活性調節の尺度として活性の違いを
用いることを特徴とする方法に関する。
好ましくは、試験物質によるIX a因子の阻害を試験す
る。
適当なIX a因子の基質は、例えばEP−B0034122に記載
されているIX a因子の基質である。Ｒ−Xxx−Gly−Arg
−pNA型の基質（Xxxは、疎水性Ｄ−アミノ酸を表し、pN
Aは、測定しうる脱離基を表す）が、特に適当である。
Ｒは、EP−B0034122と同様に定義される。EP−B0034122
の一般式（Ｉ）の基質（ここで、R3＝R4＝Ｈである）が
好ましい。
好ましい基質は、Ｎ末端に疎水性のＤ−アミノ酸を有
するトリペプチドであり、好ましくはシクロヘキシル−
置換疎水性Ｄ−アミノ酸を使用する。シクロヘキシル−
グリシン及びシクロヘキシルアラニンが、特に好まし
い。
更に好ましい基質は、例えばX a因子によっても開裂
される基質であり、例えばクロモチムＸ（Chromozym X,
Boehringer Mannheim GmbH,Moc−Ｄ−Nle−Gly−Arg−p
NA）、又はペファクロムtPA（Pefachrom tPA,Pentaphar
m Ltd.,Basel,MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA）などで
ある。光学的に測定することができる市販の（好ましく
は色原性、又は蛍光原性である）基質を用いるのが好ま
しい。これらは、光学的な手段により容易に測定するこ
とのできる、開裂しうる残基を有する色原性ペプチド／
基質である（ｐ−ニトロアニリン残基が好ましい）。本
発明による方法は、好ましくは緩衝溶液中で行なう。７
〜10のpH領域（好ましくはpH7.5〜9.0）で有効なすべて
の緩衝剤を、緩衝物質として使用することができる。ト
リス緩衝剤、トリエタノールアミン、及びトリス−イニ
ダゾール緩衝剤が、好ましい。
F IX a活性の測定及びスクリーニングアッセーは、好
ましくは20〜40℃、特に好ましくは室温で行ない、開裂
された光学的に測定しうる基の量は、測光又は蛍光測定
により測定する。405nmにおける吸光度を測定するのが
好ましい。酵素活性及び反応動力学定数は、ミカエリス
−メンテンの式により、直線の初期傾きから求める。
IX因子、又はIX a因子に対するIX因子の比率は、IX因
子のIX a因子への活性化後に同様に測定することができ
る。血漿中のIX因子を測定するには、まずIX因子をラッ
セルクサリヘビ毒（好ましくは0.2mg/ml）又はRVV−Ｘ
プロテアーゼ（好ましくは0.1mg/ml）により、CaCl2（1
0mmol/）の存在下、20〜40℃、好ましくは37℃で活性
化して、IX a因子とする。活性化が終了したら（好まし
くは15分）、エチレングリコールと開裂しうる基質を、
それぞれ20〜40％、0.2〜1mmol/の濃度で加える。
スクリーニング試験のためには、IX a因子を、0.02〜
0.5μmol/、好ましくは0.05μmol/の濃度で、そし
て開裂基質を0.2〜1mmol/の濃度で、試験物質の濃度
は、μmol/の範囲で加えるのが好都合である。アルコ
ールとしては、エチレングリコール、エタノール、又は
メタノールを用いるのが好ましい。アルコール濃度は、
好ましくは20〜40％の範囲である。天然のヒトIX a因子
又はブタ若しくはウシIX a因子、又は組換えにより産生
したヒトIX a因子を、IX a因子として使用することがで
きる。EP96109288.9に記載されている切断ヒト組換えIX
a因子を使用するのが、特に好ましい。
酵素として活性である組換えIX a因子は、原核細胞に
おける対応するDNAの発現、発現生成物の再生、そして
酵素による開裂によって産生することができる（もしそ
れが、F IX aセリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイ
ン）（Ｎ末端がEGFドメイン（EGF1及び／又はEGF2）と
結合している）、及びチモーゲン活性化ドメインからな
る場合）。
以下のドメインからなる非グリコシル化、酵素として
活性であるIX a因子を用いるのが好ましい： ａ）触媒F IX aプロテアーゼドメイン、Ｎ末端が以下と
結合： ｂ）チモーゲン活性化ドメイン、Ｎ末端が以下と結合： ｃ）EGF1及び／又はEGF2ドメイン（好ましくはEGF2又は
EGF1及びEGF2）。
チモーゲン活性化ドメイン及びEGFドメインの間に、5
0までのアミノ酸のスペーサーを好ましくは挿入する。
本発明によるチモーゲン性１本鎖の形が、チモーゲン活
性化ドメインで開裂させる場合、活性タンパク質は、２
つの鎖の形で得られる。両方の鎖は、２つの鎖の形で分
子間ジスルフィドブリッジにより結合されている。本発
明によるタンパク質は、好ましくはEGF2ドメイン、活性
化ペプチド、及びIX因子の触媒ドメインからなる。この
ようなIX因子ムテインは、ヨーロッパ特許出願9611095
9.2に記載されている。
本発明による測定方法においては、いかなる血漿も使
用することができ、クエン酸処理血漿が好ましい。
本方法は、中性又は弱アルカリpH値、好ましくは7.5
〜9,0の間のpH領域で行なうことができる。この領域で
有効である生理学的に許容しうる緩衝剤を緩衝剤として
使用することができる。加えて、凝固試験用の通例の安
定剤及び保存剤（ウシ血清アルブミン、メルチオラート
など）も加えることができる。
加えて、本発明による方法及び本発明による試薬は、
界面活性剤、好ましくはTween80（登録商標）などの非
イオン性界面活性剤もまた含有することができる。この
場合、濃度は、好ましくは0.01〜１容積％である。
本発明の更なる主題は、IX a因子によって開裂されう
る、光学的に測定しうる基質、アルコール、及びpH7〜1
0の範囲の緩衝剤を含むIX a因子の測定用試薬である。
以下の実施例、刊行物、配列表、そして図により、そ
の保護範囲が特許請求の範囲である本発明を説明する。
記載した方法は、修飾したとしても本発明の主題を記載
する例であると理解される。
図１は、組換えrF IX a（0.48μmol/）及び天然F I
X a（0.14μmol/）の活性に対するエタノール及びエ
チレングリコールの影響を示す。pH7.4;基質:MeSO2−Ｄ
−HHT−Gly−Arg−pNA（1.02mmol/）。表２を示して
いる。
図2aは、rF IX aの活性に対するエチレングリコール
の影響を示す。S1＝MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA;S2
＝MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA;S3＝MeSO2−Ｄ−CHG−
Gly−Arg−pNA;S4＝MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−pNA;S5
＝MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−AMC;rF IX a＝0.48μmol
/;pH7.4−表３を示している。
図2bは、rF IX aの活性に対するエタノールの影響を
示す。S1＝MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA;S2＝MOC−
Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA;S3＝MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Ar
g−pNA;S4＝MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−pNA;S5＝MeSO2
−Ｄ−CHA−Gly−Arg−AMC;rF IX a＝0.48μmol/;pH
7.4−表３を示している。
図3aは、Ｐ−カリクレンイン、F XII a、F XI a、F I
X a、F X aおよびトロンビンの活性に対するエタノール
の影響を示す（pH7.4;1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly
−Arg−pNA）−第５表を示している。
図3bは、Ｐ−カリクレンイン、F XII a、F XI a、F I
X a、F X a及びトロンビンの活性に対するエチレングリ
コールの影響を示す（pH7.4;1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HH
T−Gly−Arg−pNA）−第６表を示している。
方法 組換えDNA法 Sambrook,J.et al.（1989）In:Moleular cloning:A l
aboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Prs
s,Cold Spring Harbor,New Yorkに記載されているよう
にDNAを操作するために標準的な方法を用いた。分子生
物学試薬は、製造者の指示どおりに使用した。
タンパク質測定 F IXバリアントのタンパク質濃度は、アミノ酸配列に
基づいて算出したモル吸光係数を用いて280nmにおける
光学濃度（OD）を測定することによって求めた。
発現ベクター F IXバリアントの発現のためのベクターは、コア−ス
トレプトアビジン用の発現ベクターpSAM−COREに基づ
く。プラスミドpSAM−COREの調製法及び記載は、WO93/0
9144に記載されている。
コア−ストレプトアビジン遺伝子は、pSAM−COREベク
ター中所望のバリアントの遺伝子で置き換えた。
実施例１ F IX遺伝子の触媒ドメインのクローニング（プラスミ
ド:pF IX−CD） アミノ酸181〜415位のF IXプロテアーゼドメインをコ
ードするbp690〜1403位由来のF IX cDNA（MoGraw,R.A.e
t al.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA82（1985）2847−285
1）の発表によるcDNA配列及びアミノ酸配列ナンバリン
グ）を、PCRプライマーN1（配列番号１）及びN2（配列
番号２）： 並びに鋳型DNAとしてStratagene Company（La Jolla,C
A,U.S.A.）由来の市販のヒト肝cDNA遺伝子バンク（ベク
ター:Lambda ZAP（登録商標）II）を用いて増幅した。P
CRプライマーは、コード領域の５′末端に単一のNco I
開裂部位とATG開始コドンを、そしてコード領域３′末
端に単一のHind III開裂部位を導入していた。
約730bp長のPRC生成物を制限エンドヌクレアーゼNco
I及びHind IIIで消化し、約720bp長のNco I/Hind III−
F IX断片を、約2.55kbp長のNco I/Hind III−pSAM−COR
Eベクター断片（WO93/09144を参照）に、アガロースゲ
ル電気泳動による精製後に連結した。制限酵素地図によ
り所望のプラスミドpF IX−CDを確認し、PCRによって単
離されたF IX cDNA配列をDNA配列分析によりチェックし
た。
実施例２ EFG2ドメイン、活性化ペプチド、及び触媒ドメインを有
するF IXプロテアーゼ遺伝子の構築（プラスミド:pF IX
−EGF2−AP−CD） アミノ酸85〜278位（McGraw et al.Proc.Natl.Acad.S
ci.USA82（1985）2847−2851）のF IX aプロテアーゼド
メインのEGF2ドメイン、活性化ペプチド、及びＮ末端領
域をコードするbp402〜986位のF IX cDNAをPCRプライマ
ーN3（配列番号３）及びN4（配列番号４）： 並びに鋳型DNAとしてStratagene Company（La Jolla,C
A,U.S.A.）由来の市販のヒト肝cDNA遺伝子バンク（ベク
ター:Lambda ZAP（登録商標）II）を用いて増幅した。P
CRプライマーN3は、コード領域の５′末端にATG開始コ
ドン、そして単一のNco I開裂部位を導入していた。
約590bp長のPCR生成物を制限エンドヌクレアーゼNco
IおよびBsm Iで消化し、約360bp長のNco I/Bsm I−F IX
−EGF2−AP断片を、アガロースゲル電気泳動による精製
後に、約3.2kbp長のNco I/Bsm I−pF IX−CDベクター断
片（実施例１）に連結した。制限酵素地図により所望の
プラスミドpF IX−EGF2−AP−CDを確認し、PCRによて単
離されたF IX cDNA配列をDNA配列分析によりチェックし
た。
実施例３ ａ）E.coliにおけるF IX aプロテアーゼ遺伝子の発現 活性化ペプチドを含むF IX遺伝子を発現させるため
に、E.coli K12株UT5600（Grodberg,J.and Dunn,J.J.J.
Bacteriol.170（1988）1245−1253）を、実施例２に記
載の発現プラスミドpF IX−EGF2−AP−CD（アンピシリ
ン耐性）及びlac IqリプレッサープラスミドpUBS520
（カナマイシン耐性、調製法及び記載については、Brin
kmann,U.et al.,Gene85（1989）109−114を参照）で形
質転換した。公知であり、当業者に入手可能であるその
他のE.coli株（HB101及びE.coli Bなど）もまた、UT560
0株の替わりに用いることができる。
発現プラスミドpF IX−EGF2−AP−CDで形質転換され
たUT5600/pUBS520細胞を、アンピシリン50〜100mg/、
及びカナマイシン50mg/を含有するDYT培地（酵母抽出
物１％（w/v）、バクトトリプトン１％（w/v）、Difc
o、及びNaC10.5％）中、振とう培養器中、550nm（O
D550）での光学濃度が0.6〜0.9になるまで37℃で培養
し、次にIPTGで誘導した。（最終濃度１〜5mmol/）。
37℃、４〜８時間の誘導相後、細胞を遠心分離（Sorval
l RC−5B遠心分離器、GS3ローター、6,000rpm、15分
間）で回収し、50mmol/トリスHCl緩衝液、pH7.2で洗
浄し、更に処理するまで−20℃で保存した。１リットル
振とう培養物からの細胞の収量は、４〜5g（湿潤重量）
であった。
ｂ）発現分析 プラスミドpF IX−EGF2−AP−CDにより形質転換され
たUT5600/pUBS520細胞の発現を分析した。この目的のた
めに、各場合遠心分離した培養培地1mlからの細胞ペレ
ットを、10mmol/トリス−HCl、pH7.20,25mlに再懸濁
し、細胞をBranson Company（Heusenstamm,Germany）の
Sonifier（登録商標）Cell Disruptor B15を用いて超音
波処理（50％の強度で、30秒間を２パルス）によって溶
解させた。不溶性の細胞成分は、沈降（Eppendorf5415
遠心分離器、14,000rpm5分間）させ、1/5量（体積）の
５×SDSD試料緩衝液（１×SDS試料緩衝液:50mmol/ト
リス−HCl、pH6.8、１％SDS、１％メルカプトエタノー
ル、10％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブル
ー）を上清に加えた。不溶性の細胞の破片画分（ペレッ
ト）は、６〜8M尿素を含有する１×SDS試料緩衝液0.3ml
中に再懸濁し、試料を95℃で５分間インキュベーション
し、再び遠心分離した。その後、タンパク質をSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Laemmli,U.K.,N
ature227（1970）680−685）で分離し、クーマシーブリ
リアントブルーＲ染料で染色した。
E.coliで合成されたF IXバリアントは均一であり、不
溶性の細胞破片画分（封入体、IB）においてのみ認めら
れた。発現収率は、E.coli全体のタンパク質に対して10
〜50％であった。
実施例４ 細胞溶解、可溶化及び再生 ａ）細胞溶解、及び封入体（IB）の調製 ３リットルの振と培養物からの細胞ペレット（湿潤重
量約15g）を、50mmol/トリスHCl、pH7.2 75m中に再
懸濁した。懸濁液を0.25mg/mlリゾチームと混合し、０
℃で30分間インキュベーションした。2mmol/MgCl2及
び10μg/mlDNase I（Boehringer Mannheim GmbH、カタ
ログNo.104159）の添加後、SLM Amico Company（Urban
a,IL,USA）のFrench（登録商標）Press中、高圧分散を
用いて細胞を機械的に粉砕した。次にDNAを、室温（R
T）で30分間消化させた。調製物に50mmol/トリス−HC
l、pH7,2、60mmol/EDTA、1.5mol/NaCl、６％トリト
ンＸ−100の37.5mlを加え、室温で更に30分間インキュ
ベーションし、Sorvall RC−5B遠心分離器（GSAロータ
ー、12,000rpm、15分間）中で遠心分離した。上清を破
棄し、50mmol/トリス−HCl、pH7,2、20mmol/EDTAの
100mlをペレットに加え、４℃で撹拌しながら30分間イ
ンキュベーションし、再び沈降させた。最後の洗浄の工
程を繰り返した。精製したIB（湿潤重量1.5〜2.0g、25
〜30％乾燥質量、100〜150mgプロテアーゼ）を更に処理
するまで−20℃で貯蔵した。
ｂ）IBの可溶化及び誘導体化 精製IBを、タンパク質５〜10mg/mlに対応するIBペレ
ット100mg（湿潤重量）/mlの濃度で、6mol/グアニジ
ニウム−HCl、100mmol/トリス−HCl、20mmol/EDT
A、150mmol/GSSG、及び15mmol/GSH、pH8.0中で撹拌
しながら、室温で１〜３時間以内で懸濁した。その後、
pHをpH5.0に調製し、不溶性の成分を遠心分離（Sorvall
RC−5B遠心分離器、SS34ローター、16,000rpm、10分
間）により分離した。上清を100倍量の４〜6mol/グア
ニジニウム−HCl、pH5.0に対して、４℃で24時間透析し
た。
ｃ）再生 6mol/グアニジニウム−HClに可溶化し、GSSG/GSHで
誘導体化したタンパク質の再生を、各場合にIB可溶化物
／誘導体0.5mlを、50mmol/トリス−HCl、0.5mol/ア
ルキニン、20mmol/CaCl2、1mmol/EDTA、及び0.5mmo
l/システイン（pH8.5）50mlに、24時間間隔で繰り返
し添加（例えば３回）し、次に４℃で48時間インキュベ
ーションすることによって、４℃で行なった。再生反応
の完了後、深床フィルターK250（Seitz Company,Bad Kr
euznach,Germany）を装備した濾過装置（Satorius Comp
any,Goettingen,Germany）を用いた濾過により、不溶性
の成分を分離した。
ｄ）再生調製物の濃縮及び透析 プロテアーゼを含有する透明な上清を、Minisette
（膜型:Omega10K）（Filtron Company,Karlstein,Germa
ny）中、クロスフロー濾過により10〜15倍に濃縮し、10
0倍量の20mmol/トリス−HCl及び50mmol/NaCl、pH7.
2に対して４℃で24時間透析して、グアニジウム−HCl及
びアルギニンを除去した。沈降したタンパク質を遠心分
離（Sorvall RC−5B遠心分離器、SS34ローター、16,000
rpm、20分間）で除去し、透明な上清をNalgene（登録商
標）ディスポーザブル濾過単位（孔径:0.2μｍ）（Nalg
e Company,Rochester,NY,USA）で濾過した。
実施例５ 再生されたF IXバリアントの精製 再生調製物由来のF IXバリアントは、所望であれば、
当業者には公知のクロマトグラフィー法により更に精製
することができる。
ａ）Ｑ−セファロース−ffのイオン交換クロマトグラフ
ィーによるF IXバリアントの精製 20mmol/トリス−HCl及び50mmol/NaCl、pH8.0に対
して透析した濃縮再生調製物を、同じ緩衝液で平衡化し
たＱ−セファロースffカラム（1.5×11cm、Ｖ＝20ml;負
荷能:10mgタンパク質/mlゲル）（Pharmacia Biotech Co
mpany,Freiburg,Germany）（２カラム量／時間、2CV/
h）に適用し、溶離物の280nmでの吸光度が緩衝液のブラ
ンク値に達するまで平衡緩衝液で洗浄した。結合した物
質を20mmol/トリス−HCl、pH8.0（2CV/h）中、50〜50
0mmol/NaClの勾配で溶離した。F IXバリアントを、10
0〜150mmol/のNaCl濃度で溶離した。F IXを含有する
画分を、非還元性及び還元性SDS PAGEにより同定し、
溶離ピークを貯蔵した。
ｂ）ヘパリン−セファロースCL−6Bのイオン交換クロマ
トグラフィーによるF IXバリアントの最終精製 Ｑ−セファロースffクロマトグラフィー後、F IXを含
有する結合した画分を直接、20mmol/トリスHCl及び20
0mmol/NaCl、pH8.0で平衡化しておいたヘパリン−セ
ファロースCL−6Bカラム（1.5×11cm、Ｖ＝20ml、負荷
能:1mgタンパク質/mlゲル）（Pharmacia Biotech Compa
ny,Freiburg,Germany）に適用した。その後、溶離物の2
80nmにおける吸光度が、緩衝液であるブランク値に達す
るまで、平衡緩衝液で洗浄した。結合した物質を、20mm
ol/トリスHCl、pH8,0（CV/h）中、0.2〜1.0mol/のN
aClの勾配で溶離した。F IXバリアントをNaCl濃度500〜
600mmol/で溶離した。F IXを含有する画分を、非還元
性及び還元性SDS PAGEで同定し、溶離ピークを合わ
せ、20mmol/トリス−HCl、50〜200mmol/NaCl、5mmo
l/CaCl2、pH7.8に対して透析した。
実施例６ F IXバリアントの活性化及び精製 再生精製F IXバリアントを精製ラッセルクサリヘビ毒
（RVV−Ｘ）プロテアーゼで活性化した。RVV−Ｘプロテ
アーゼは、Esmon,C.T.によって刊行物（プロトロンビン
活性化、博士論文、Washington University,St.Louis,M
O（1973））に記載されているように、市販のヘビ毒凍
結乾燥物（Sigma Aldrich Chemie GmbH CO.,Deisenhofe
n,Germany）からゲル濾過、次にＱ−セファロース−ff
のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
ａ）再生F IXバリアトの活性化及び精製 F IXバリアントを、0.5〜2.0mg/mlの濃度で、そして2
0mmol/トリスHCl、50mmol/NaCl、10mmol/CaCl2、
pH7.8中、1:10〜1:20のプロテアーゼ／基質比で、25℃
で消化させた。酵素F IX活性化の時間経過を、消化が完
了するまで（プラトー、最大活性化）、色原性基質（実
施例13aを参照）による活性を測定することによって監
視した。この目的のために、試料（10〜100μｌ）を、
反応混合物から、３〜４時間の間隔で、24時間までの期
間採取し、発生したF IX a活性を測定した。活性化プラ
トーに到達後、活性化調製物をＱ−セファロース−ffの
負のクロマトグラフィーで精製した。
RVV−Ｘ及び非活性化F IXバリアントは、所与の条件
下で、Ｑ−セファロース−ffと結合するが、活性化され
たF IX aバリアントは、結合しない。
活性化調製物を、20mmol/トリスHCl、50mmol/NaC
l、pH7.8で平衡化しておいたＱ−セファロース−ffカラ
ム（1.0×10cm、Ｖ＝8ml）（Pharmacia Biotech Compan
y,Freiburg,Germany）に適用し（2CV/h）、カラムを、
画分しながら、平衡緩衝液で展開した。プロテアーゼを
含有する画分を、非還元性及び還元性SDS PAGEにより
同定し、活性を測定した。
実施例７ 精製されたプロテアーゼバリアントの特徴付け ａ）活性試験 F IX aバリアントの活性を、色原性基質Chromozym X
（Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany,cat.N
o.789763）を用いて測定した。試料10〜100μｌを、50m
mol/トリスHCl、150mmol/NaCl、5mmol/CaCl2、0.
1％PEG8000、pH8.0、190〜100μｌにより200μｌとし、
Chromozym X（0.5〜40mmol）20μｌと混合し、波長405n
m、室温で、ELISAリーダー中、試薬ブランク値に対し
て、測定した。活性及び反応動力学定数は、ミカエリス
−メンテンの式により、直線の初期傾きから求めた。
ｂ）SDS PAGE 再生され、活性化され、精製されたF IX aプロテアー
ゼバリアントの分子間ジスルフィドブリッジ形成による
オリゴマー及び凝集物形成、並びにその均一性及び純度
は、非還元性（マイナスメルカプトエタノール）及び還
元性（プラスメルカプトエタノール）SDS PAGEにより
試験した（Laemmli,UK,Nature227（1970）680−685）。
実施例８ IX a因子試験 F IX a試験は、組換えにより産生した天然ヒトF IX a
を試料として、そしてペプチド基質であるMeSO2−Ｄ−H
HT−Gly−Arg−pNA（Pefachrom tPA,Pentapharm Ltd.,B
asel,Switzerland）又はその他のＲ−Ｄ−Xxx−Gly−Ar
g−pNA型の色原性／蛍光原性基質（EP−B0034122）によ
り、トリス−HCl緩衝液中、そして試験する物質（アル
コール、溶媒及び阻害物質）を用いて行なった。反応
は、F IX aを加えることによって開始させた。
試験原則 測定シグナル:pNA F IX a基質： MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA（Chromozym X） MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA（Pefachrom tPA） MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−pNA MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−AMC 略語:pNA、ｐ−ニトロアニリン AMC、７−アミノ−４−メチル−クマリル MOC、メチルオキシカルボニル HHT、ヘキサヒドロチロシン CHG、シクロヘキシルグリシン CHA、シクロヘキシルアラニン 一般的試験混合物 200μｌ緩衝液 − 50〜100mmol/トリスHCl、pH7〜9.5 − 100〜200mmol/NaCl − 5mmol/CaCl2 − 添加剤あり（アルコール、溶媒及び素材物質） ＋25μｌペプチド基質（１〜20mmol/） ＋20μlF IX a（0.02〜0.5μmol/） 試験混合物を室温（25℃）下、ミクロタイタープレー
ト中でインキュベーションし、吸光度の変化（ΔA/分）
を、ELISAリーダーを用いて405nmで測定した。活性及び
反応動力学定数は、ミカエリス−メンテンの式により、
直線の初期傾きから求めた。
実施例９ アルコール及び有機溶媒のrF IX aの活性に対する影響 水と完全に混合して単一相を形成しうる各種アルコー
ル（メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−
プロパノール、ｔ−ブタノール、エチレングリコール及
びグリセロール）、及び有機溶媒［アセトニトリル、DM
SO（ジメチルスルホキシド）及びDMF（ジメチルホルム
アミド）］、並びに容易に溶解しうる多価アルコール
［ｍ−エリトリトール、PEG（ポリエチレングリコー
ル）］のrF IX a活性に対する影響を、アルコール又は
有機溶媒の濃度（０〜50％）と関連付けて調べた。
試験混合物（試験における濃度） − 41mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.48μmol/rF IX a（ヒト） − ０〜50％（アルコール又は有機溶媒） 結果を表１に示す。比V/V0を算出して、rF IX aの触
媒活性んほ刺激を示した。
V0、添加剤のない状態での反応速度 Ｖ、添加剤の存在下での反応速度 結果 rF IX aの活性は、ある種のアルコール（エチレング
リコール＞エタノール＞メタノール）により15〜40％の
濃度範囲で、約５〜15倍刺激された。グリセロールは、
より高い濃度（25〜50％）になるまでは刺激しなかった
一方、ｍ−エリトリトールは、わずかな効果を示したの
みであった。反対に、ポリエチレングリコール（PEG）
は、rF IX aの活性を阻害した。OH基を含まない溶媒の
なかでは、ジメチルスルホキシド（DMSO）だけが、rF I
X aを30％まで阻害しなかった一方、ジメチルホルムア
ミド（DMF）及びアセトニトリルは、酵素を不活性化し
た。
実施例10 組換えヒトF IX a及び天然のF IX aの活性に対するエタ
ノール及びエチレングリコールの影響 観察されたエタノール及びエチレングリコールによる
rF IX a（EGF IIドメイン、処理された活性化ペプチ
ド、及び触媒ドメインからなる活性rF IX aバリアン
ト）の刺激は、天然F IX a（ヒト）についても起きるか
どうかを調べた。
試験混合物（試験における濃度） − 41mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.48μmol/ヒトrF IX a又は − 0.14μmol/天然F IX a（ヒト） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール 結果は、表２に要約し、図１に示す。
結果 エタノール及びエチレングリコールによる活性化に関
しては、組換えヒトrF IX a及び天然ヒトF IX aについ
て、相違は認められなかった。
実施例11 色原性及び蛍光原性ペプチド基質に対するrF IX aの活
性に対するエタノール及びエチレングリコールの影響 エタノール及びエチレングリコールによるヒトrF IX
aの刺激を、ペプチド基質であるMeSO2−Ｄ−HHT−Gly−
Arg−pNA（Pefachrom tPA,Pentapharm Ltd.,Basel,Swit
zerland）、MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA（Chromozym
X,Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany,Cat.N
o.789763）、MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA（Pentaph
arm Ltd.,Basel,Switzerland）、MeSO2−Ｄ−CHA−Gly
−Arg−pNA（Pentapharm Ltd.,Basel,Switzerland）、
及びMeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−AMC（Pentapharm Lt
d.,Basel,Switzerland）を用いて調べた。
色原性である試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − ０〜50％エチレングリコール − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.48μmol/rF IX a（ヒト） 又は − 0.82mmol/MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA − 0.48μmol/rF IX a（ヒト） 又は − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA − 0.28μmol/rF IX a（ヒト） 又は − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−pNA − 0.48μmol/rF IX a（ヒト） 蛍光原性である試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − ０〜50％エチレングリコール − 0.51mmol/MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−AMC − 0.08μmol/rF IX a（ヒト） 結果を、表３に要約し、エチレングリコールに関する
結果は、図2aに示し、エタノールに関する結果は、図2b
に示す。
結果 エタノール及びエチレングリコールによるrF IX aの
刺激（商V/V0として示す）は、ペプチド基質としてMeSO
2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNAの替わりにMOC−Ｄ−Nle−G
ly−Arg−pNA及びMeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNAを用
いると更に増大した。エチレングリコールが25％以上で
あると、商V/V0は、基質MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pN
Aにおけるよりも1.5〜２倍高かった。
蛍光原性基質であるMeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg−AMC
の開裂もまた、同様な方法でアルコールによって刺激さ
れた。配列MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg及びＣ末端AMC又
はpNAを有するトリペプチドの開裂は、エチレングリコ
ール（33％）によりそれぞれ９及び11倍上昇した。高い
感受性のため、蛍光原性基質MeSO2−Ｄ−CHA−Gly−Arg
−AMCを開裂するのに、少量（1/10）のrF IX aしか必要
ではなかった。
実施例12 色原性ペプチド基質であるMeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−
pNA、MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA、及びMeSO2−Ｄ−C
HG−Gly−Arg−pNAの、組換えヒトF IX a及び天然F IX
aによる開裂の動力学に対するエチレングリコールの影
響 試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − ０〜50％エチレングリコール − MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA（0.102〜1.02mmol
/） − 0.48μmol/rF IX a（ヒト） 又は − MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA（0.102〜1.02mmol
/） − 0.29μmol/天然F IX a（ヒト） 又は − MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA（0.102〜1.02mmol/
） − 0.48μmol/rF IX a（ヒト） 又は − MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA（0.102〜1.02mmol
/） − 0.28μmol/rF IX a（ヒト） 反応動力学定数（Kcat/Km）は、ラインウイーバー・
バーク式によりグラフから求めた（直線が原点を通過す
るため、KmとKcatは、別々に求めることができない）。
結果 組換え又は天然ヒトF IX aによって触媒される色原性
ペプチド基質の開裂の刺激は、反応動力学定数について
認められ、Kcat/Kmは、エチレングリコール濃度33％ま
では上昇した。基質MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNAの
場合、最高の触媒活性、つまりKcat/Kmの最高値が、33
％エチレングリコールで認められた。影響を受けていな
い反応の場合では、プロットは直線的ではなく、定数を
求めることはできなかった。
実施例13 血漿カリクレイン、F XII a、F XI a、F X a及びトロン
ビンと比較してのF IX aの活性に対するエタノール及び
エチレングリコールの影響 F IX a試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.14μmol/天然F IX a（ヒト） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール 血漿カリクレイン試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.176U/ml血漿カリクレイン（ヒト） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール F XII a試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.0045U/mlF XII a（ヒト） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール F XI a試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.0012μmol/F XI a（ヒト） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール F X a試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.088μmol/F X a（ウシ） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール トロンビン試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA − 0.045μmol/トロンビン（ウシ） − ０〜50％エタノール又はエチレングリコール 結果は、表５及び６に要約し、エタノールの効果は、
図3aに示し、エチレングリコールの効果は、図3bに示
す。
結果 内因系活性化経路の凝固因子、血漿カリクレイン、F
XII a、F XI a、F IX a、F X a、及びトロンビンのう
ち、F IX aのみが、エタノール及びエチレングリコール
によって活性換された。血漿カリクレインの場合、エタ
ノール10〜20％の存在下でわずかな活性化が観察され
た。
実施例14 エチレングリコールの存在下でのrF IX a及びF IX aの
活性に対するpHの影響 試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.0〜10.0 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 1.02mmol/MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA、MOC
−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA、又はMeSO2−Ｄ−CHG−Gly
−Arg−pNA − 25％エチレングリコール − 0.28μmmol/rF IX a（ヒト） 又は − 0.14μmol/天然F IX a（ヒト） 結果は、表7a〜ｄに示す。
結果 rF IX aの触媒活性のpH依存性は、例としてエチレン
グリコールで証明されたようにアルコールによっては変
化しなかった。したがって、開裂速度は、25％エチレン
グリコールの存在下では、pH7.0〜10.0の間で同じ比率
で増大した。基質MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNAの存
在下での開裂速度は、10倍に増大し、MOC−Ｄ−Nle−Gl
y−Arg−pNA及びMeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNAの場合
では、それぞれ14倍及び20倍に増大した。最適なpH領域
は、pH8.25〜8,75の間であった。基質MeSO2−Ｄ−CHG−
Gly−Arg−pNAは、最も効率的に開裂された。
実施例15 F IX a阻害物質のスクリーニング試験 特異的なF IX a阻害物質は、F IX a活性の阻害によっ
て確認することができる。この目的のために、F IX a活
性を、試験する物質又は物質混合物の存在下又は非存在
下、Ｒ−Ｄ−Xxx−Gly−Arg−pNA型（Xxx＝疎水性アミ
ノ酸）の基質について測定し、阻害％を、商から算出し
た。阻害定数Kiは、阻害動力学から求めた。測定シグナ
ルは、高濃度のある種のアルコール（好ましくはエチレ
ングリコール）を存在させることにより増幅した。
試験原理 測定基質:pNA F IX a基質： MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA（Pefachrom tPA） MOC−Ｄ−Nle−Gly−Arg−pNA（Chromozym X） MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA F IX a:組換えにより産生されたrF IX a（ヒト） 試験混合物 200μｌ緩衝液（100mmol/トリス−HCl、100mmol/Na
Cl、5mmol/CaCl2、20〜40％アルコール、pH7〜９）、
緩衝液は、各種濃度の阻害物質を含有する。
＋25μｌペプチド基質 ＋20μlrF IX a（ヒト） 試験混合物をミクロタイタープレート中室温でインキ
ュベーションし、405nmにおける吸光度の変化（ΔA/
分）を、ELISAリーダーで測定した。反応は、酢酸（25
μｌ、50％）で停止させることによって、５〜10分後に
終了させることができ、試薬ブランクに対する405nmに
おける吸光度測定した。
実施例16 異なるpH、アルコール、及びアルコール濃度を用いた、
rF IX aの活性に対する公知のプロテアーゼ阻害物質の
影響 試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH7.4又は8.5 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 基質MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA（1.02mmol/
） − 0.028〜0.57μmol/rF IX a（ヒト） − 4.1％エタノール又は33％エチレングリコール − 段階的濃度（4.1〜163μmol/）における阻害物質 ３−アミジノフェニルアラニン型の公知の合成阻害物
質を阻害物質として使用した（Stuerzebeecher et al,
J.Enzyme.Inhibition9（1995）87and WO92/08709（199
1））。阻害効果は、例として低及び高アルコール濃度
で調べた。
結果 合成阻害物質によるrF IX aの阻害は、各種pH（pH7〜
９）及び各種アルコール含有量（好ましくはエタノール
又はエチレングリコール）で調べることができた。rF I
X aの50％阻害については、阻害物質であるTIPPS−（３
−Am）Peh−iNip−OHについては、20〜50μmol/のIC
50値が、認められ、阻害物質βNAPS−（３−Am）Phe−T
IC−OHについては、60〜150μmol/の間のIC50値が認
められた。阻害効果は、高エチレングリコール濃度及び
pH8.5で、最も敏感に検出することができた。この方法
は、非常に低量rF IX aした必要とされず、高アルコー
ル濃度で試験する物質の溶解が促進されるため、F IX a
阻害物質の探索のためのスクリーニンング法として適当
である。
実施例17 DIXON法による解離定数Kiの測定 試験混合物（試験における濃度） − 42mmol/トリスHCl、pH8.5 − 82mmol/NaCl − 4.1mmol/CaCl2 − 33％エチレングリコール − 段階的濃度（０、20.4及び40.8μmol/）における
阻害物質 − MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA（1.02、0.51及び
0.25mmol/） − 0.14μmol/rF IX a（ヒト） 又は − MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA（1.02、0.51及び
0.25mmol/） − 0.07μmol/天然F IX a（ヒト） 又は − MeSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNA（1.02、0.51及び
0.25mmol/） − 0.14μmol/rF IX a（ヒト） 阻害物質としてTIPPS−（３−Am）Phe−iNip−OHを用
い、阻害効果を、例として、最適条件下（pH8.5、33％
エチレングリコール）、２つの基質について測定した。
結果 TIPPS−（３−Am）Phe−iNip−OHによる組換え又は天
然ヒトF IX aの阻害に対する、DIXONによる解離定数Ki
の決定は、pH8.5、最適エチレングリコール濃度（33
％）で行なった。表9a及び9bに要約した値を用い、組換
え及び天然F IX aの阻害に対し、匹敵するKi値（それぞ
れ12及び９μmol/）を図により求めた。rF IX aの阻
害について、基質MeSO2−Ｄ−HHT−Gly−Arg−pNA及びM
eSO2−Ｄ−CHG−Gly−Arg−pNAを用いた場合、匹敵する
Ki値（それぞれ12及び16μmol/）がい得られた。低rF
IX a濃度しか必要とされないため、エチレングリコー
ル濃度の高い、選択された混合物が、阻害定数を求める
のに特に適当であった。加えて、高アルコール濃度のた
め、試験する物質の溶解が促進された。

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】IX a因子を含有する、又はIX a因子が形成
    若しくは消費される試料溶液中のIX a因子の測定方法で
    あって、測定しうるIX a因子の基質、及び水と混和して
    単一の相を形成することのできるアルコールを、該試料
    溶液に加え、IX a因子の該基質に対する触媒効果を、IX
    a因子活性の尺度としてのIX a因子の基質の開裂により
    測定する方法。
  2. 【請求項２】疎水性Ｄ−アミノ酸をＮ末端に有するトリ
    ペプチドを基質として使用する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】シクロヘキシル置換疎水性Ｄ−アミノ酸を
    使用する、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】IX a因子の活性を調節する物質を確認する
    方法であって、 ａ）水と混和して単一の相を形成することのできるアル
    コールの存在下、所定の濃度のIX a因子活性を有するポ
    リペプチドにより、IX a因子の基質を開裂させ、IX a因
    子活性の尺度として該基質の開裂の速度を測定し； ｂ）該活性を試験物質の存在下で測定し、 ｃ）試験物質の存在下及び非存在下での活性を比較し、
    そして ｄ）試験物質による活性調節の尺度として活性の違いを
    用いることを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】水と混和して単一の相を形成するこのでき
    るアルコールとして、メタノール、エタノール、ｎ−若
    しくはｉ−プロパノール、ｔ−ブタノール、グリセロー
    ル、又は特にエチレングリコールを使用する、請求項１
    〜４に記載の方法。
  6. 【請求項６】IX a因子によって開裂されうる色原性基
    質、水と混和して単一の相を形成することのできるアル
    コール、及びpH7〜10の間の範囲の緩衝剤を含有する、
    試料溶液中のIX a因子の測定用試薬。
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US7026111B2 (en) * 2001-10-15 2006-04-11 Beckman Coulter, Inc. Methods and reagents for improved cell-based assays
EP2471945A1 (de) * 2010-12-30 2012-07-04 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur Bestimmung von Inhibitoren der Gerinnung

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CA1161432A (en) * 1980-02-12 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
AT391809B (de) * 1988-01-12 1990-12-10 Immuno Ag Verfahren zur inaktivierung von vermehrungsfaehigen filtrierbaren krankheitserregern in blutplasmaprodukten
DK0573605T3 (da) * 1991-03-01 2001-01-02 Rhone Poulenc Rorer Int Fremstilling af faktor IX
US5399487A (en) * 1993-03-04 1995-03-21 Haematologic Technologies, Inc. 6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamides useful as fluorogenic proteolytic enzyme substrates
US5885967A (en) * 1994-03-04 1999-03-23 Eli Lilly And Company Antithrombotic agents
US5839443A (en) * 1996-05-16 1998-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting thrombosis in a patient whose blood is subjected to extracorporeal circulation
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