CN1107726C - 测定因子IXa催化活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及测定样品溶液中因子IXa的方法，该方法使用可测定的因子IXa的底物和水混溶的乙醇并测定因子IXa的底物的切割作为因子IXa活性的指示。所述方法对于直接测定因子IXa是最适当的。

Description

测定因子IXa催化活性的方法
本发明涉及测定IXa因子催化活性的方法。根据本发明所述的方法适于搜索因子IXa抑制剂(筛选)、调节血凝结(治疗应用)和在体液中测定因子IX和因子IXa(诊断应用)。
血浆蛋白酶在由血纤维蛋白形成引起的血凝结和伤口愈合以及血纤维蛋白溶解作用即血块溶解中起作用。受伤后，通过无活性酶原的顺序激活(特异的蛋白水解)形成有活性的酶扩增“受伤信号”，这些活性酶启动血凝结并确保伤口快速愈合。血凝结可以由两条途径启动，内途径，其中所有蛋白成分存在血中；和外途径，其中膜蛋白，所谓的组织因子起关键作用。
血稳态(血凝结、血纤维蛋白溶解作用和此平衡的调节)的分子机制及参与的成分在几篇综述文章中得到全面描述[Furie，B.和Furie，B.C.，细胞，53(1988)505-518；Davie，E.W.等，生物化学，30(1991)10363-10379；Bergmeyer，H.U.(编辑)：酶分析方法，第五卷，第3章，第三版，学术出版社，纽约(1983)]。
血凝结级联的因子是十分复杂的蛋白。按常规，它们只能用复杂的方法以有限数量，不同的质量、同质性和纯度从天然原材料血浆中分离[Van Dam-Mieras，M.C.E.等，于：Bergmeyer，H.U.(编辑)，酶分析方法，第五卷，第三版，365-394页，学术出版社，纽约(1983)]。它们在血稳态即血凝结、血块形成和溶解之间的平衡的调节中起重要作用。良好调节的系统可能由于遗传缺损如A型血友病(缺损因子VIII)和B型血友病(缺损因子IX)变得不平衡。急性紊乱会导致心肌梗塞、栓塞和中风。
因此，根据医学需求，需要能影响血凝结和血纤维蛋白溶解作用系统的物质。例如使用从血液中分离的或重组合成的因子VIII或因子IX治疗A型和B型血友病。tPA(组织型纤溶酶原激活物)和链球菌激酶(细菌纤溶酶原激活物)用于例如心肌梗塞后的血块溶解。除了复杂的蛋白，诸如蛭素(由65个氨基酸组成，凝血酶抑制剂)、肝素(杂聚糖，内源抑制剂的辅因子)和维生素K拮抗物(GlA区域Glu残基γ-羧基化的抑制剂)的物质可用于抑制血凝结。然而，可得到的物质经常十分昂贵(蛋白因子)并且对于它们的医学应用不理想(副作用)，因此需要能用于特异调节血凝结和血块溶解的药物。
可以例如通过筛选物质库，随后通过药物模型改进已鉴定的前导结构(lead structure)进行血凝结、血纤维蛋白溶解作用以及稳态的新调节剂(活化剂、抑制剂)的研究。对于此研究需要(i)适合的检测和(ii)可以足够数量和质量得到的关键蛋白(靶蛋白)以用于筛选和晶体结构研究(例如根据蛋白组成和前导结构的3D结构通过改变的特定预测改进前导结构)。
为了找到调节血凝结的抑制剂，因子IXa(FIXa)对于抑制剂的筛选是令人感兴趣的靶蛋白。B型血友病(因子IXa缺损)的已知临床情况证实了设想，即在相当大的多效副作用方面，特异的因子IXa抑制剂优于已知的凝血酶抑制剂。
以前由于适用性和因子IXa的极低的催化活性，对FIXa抑制剂活性的筛选都遭到失败。
未活化的丝氨酸蛋白酶FIX(酶原)从血浆中的分离和随后通过蛋白水解的活化是困难、耗时和昂贵的，经常不能产生所需的数量和质量。未活化蛋白酶原FIX的血浆浓度只有0.5mg/l(Furie，B.和FurieB.C.，细胞，53(1988)505-518)。而且从血浆中分离并体外活化的蛋白酶制剂常常是异质的和不稳定的。
未活化的FIX酶原可以用纯化的FIXa活化/转化[Van Dam-Mieras，M.C.E.；Muller，A.D.；van Dieijen，G.；Hemker，H.C.：血凝结因子II、V、VII、VIII、IX、X和XI：用合成底物测定。于：Bergmeyer，H.U.(编辑)：酶分析方法，第5卷，酶3：多肽酶、蛋白酶和它们的抑制剂，365-394页，第三版，Academic Press，NewYork(1983)]。
血浆蛋白酶是复杂的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族。它们在肝中作为未活化酶原合成，分泌到血液中，当需要时通过特异的蛋白水解即一个或两个多肽键的切割来活化。它们在蛋白结构域的排列和组成方面结构上十分相似[Furie，B.和Furie，B.C.，细胞，53(1988)505-518]。
根据Furie B.和Furie，B.C.，因子IX家族(因子VII、IX、X和蛋白C)的蛋白酶包括：
——前肽，
——GLA结构域，
——芳香氨基酸聚集结构域，
——两个EGF结构域(EGF1和EGF2)
——酶原活化结构域(活化肽，AP)和
——蛋白酶催化结构域(CD)。
而且血浆蛋白酶在分泌期间经过翻译后修饰：
——11-12二硫键
——N-和/或O-糖基化作用(GLA结构域和活化肽)
    —Bharadwaj，D等，生物化学杂志，270(1995)6537-6542，
    —Medved，L.V.等，生物化学杂志，270(1995)13652-
      13659，
——前肽的切割
——Glu残基的γ-羧基化(GLA结构域)
——Asp残基的β-羟基化(EGF结构域)
——酶原区域的切割(部分)
通过一个或两个多肽键的特异切割(活化多肽的切割)活化(蛋白的酶原形式)之后，具有酶活性的蛋白酶包括两条链，根据它们的分子量称为重链和轻链。在因子IX蛋白酶家族中两条链通过EGF2结构域和蛋白酶结构域之间的分子间二硫键连在一起。酶原-酶转化(活化)引起蛋白酶结构域内的构象改变。这使得在蛋白酶结构域的N-端氨基酸和蛋白酶结构域内的Asp残基之间形成蛋白酶活性所需的必要盐桥。N-端区域对此丝氨酸蛋白酶亚类十分关键，不能被修饰。然后才有可能形成具有包括Ser、Asp和His催化三联体的丝氨酸蛋白酶典型活性位点[Blow，D.M.：Acc.Chem.Res.，9(1976)145-152；Polgar，L.：于：蛋白酶作用机制，Boca Raton，Florida，CRC Press，第3章(1989)]。
血浆蛋白酶可以用传统方法通过从血液中分离未活化的酶原并随后活化它们得到，或者通过在合适的哺乳细胞系或酵母中表达相应的cDNA来重组合成。
WO 92/15324描述了从人血浆制备和纯化IX因子和用于抑制IX因子催化分解为IXa因子的改进方法。此外还描述了通过测定活化凝血致活酶组分(PTT)的时间来测定IX因子的方法。
美国专利4,904,641公开了使来自血浆制品的可滤过病原体失活的方法，其中这些制品可含有IX因子。这些制品中IX因子的测定是通过测定活化凝血致活酶组分(PTT)的时间来进行的。
美国专利4,480,030描述了定量测定Xa因子的方法，其中使用三肽作为底物，该三肽共价键含有一可切除的生色团。根据美国专利4,904,641的表3，在测定IX因子后测定在乙醇蒸汽的存在下病毒失活的动力学。
利用真核宿主/载体系统通过酶原或活性蛋白酶的表达/分泌来合成凝结因子在FVII：Hagen，F.S.等，EP 0 200 421；Pedersen，A.H.等，生物化学28(1989)9391-9336；FIX：Lin，S.-W.等，生物化学杂志，265(1990)144-150；FX：Wolf，D.L.等，生物化学杂志，266(1991)13726-13730；蛋白C：Bang，N.U.等，EP 0 191 606中得到描述。
按常规，使用在分泌过程中能象天然酶一样翻译后修饰凝结因子的宿主细胞。然后例如以凝血酶原或因子X为例，通过使用来自蛇毒液的活化物在随后的下游加工过程中进行酶原-酶转化(Sheehan，J.P.等，生物化学杂志，268(1993)3639-3645；Fujikawa，K.等，生物化学，11(1972)4892-4898)。
为了体内酶原-酶活化(已在分泌过程中)的目的，可以用能被天然存在于宿主细胞如Kex2(酵母)或PACE(哺乳细胞系)的分泌途径中的特异切割蛋白酶切割的蛋白酶切割位点(几个相邻碱性氨基酸)替换天然酶原切割位点或整个活化肽。(FX：Wolf，D.L.等，生物化学杂志，266(1991)13726-13730；凝血酶原：Holly，R.D.和Foster，D.C.，WO 93/13208).
已知用真核宿主/载体系统合成凝结因子的 变异体(variant)(FX：Rezaie，A.R：等，生物化学杂志，268(1993)8176-8180；FIX：zhang，D.G.等，美国国家科学院院报91 11994)3574-3578)、 突变 体(mutant)(FX：Rezaie，A.R.等，生物化学杂志269(1994)21495-21499；凝血酶：Yee，J.等，生物化学杂志，269(1994)17965-17970)；FVII：Nicolaisen，E.M.等，WO 88/10295)和包括FIX和FX的 嵌合体(Lin，S.-W.等，生物化学杂志，265(1990)144-150；Hertzberg，M.S.等，生物化学杂志，267(1992)14759-14766)。
然而，真核哺乳细胞系中的表达是费时、昂贵的并且表达产量有限。此外会发生不需要的翻译后修饰。
Thogersen，H.C.等(WO 94/18227)描述了通过原核细胞中表达和随后表达产物的复性来合成血浆蛋白酶。根据这些，FX变异体用循环复性方法复性，其中未活化的FX蛋白用金属螯合复合物(多聚组氨酸-亲和柄)固定在层析柱上。在此使用的融合蛋白包括截短的FX变异体(EGF1、EGF2和蛋白酶结构域)、其它FXa蛋白酶识别序列和位于催化结构域C端包含6个组氨酸残基的助结合剂。
令人惊奇地发现醇类能促进因子IXa对底物的催化活性，因此能以简单的方式建立十分敏感的因子IXa测试。
因此本发明涉及在样品溶液中测定因子IXa的方法，其特征在于将可测定的因子Ixa的底物和可与水均匀混溶并形成一相的醇类加到样品溶液中，测定因子Ixa的底物的切割作为对因子IXa活性的测量。令人惊奇地发现醇类可以将催化因子IXa的活性提高超过20倍。因而有可能直接测定样品溶液中因子IXa的活性。在用Russels蝰蛇毒或从蛇毒液分离的蛋白酶(RVV-X蛋白酶)将因子IX活化为因子IXa之后，样品溶液优选地体液如血浆中的因子IX可以得到测定。
本发明的另一主题是使用根据本发明所述的测定因子IXa的方法筛选调节(抑制或活化)因子IXa活性的物质。因此本发明涉及鉴定调节因子IXa活性的物质的方法，其特征在于
a)在醇类存在时，用规定浓度的具有因子IXa活性的多肽切割因子IXa的底物，并且测定所述底物的切割速率作为因子IXa活性的量度标准，
b)在待测物质存在时测定所述活性，
c)比较存在和不存在待测物质时的活性，
d)活性的差异用作待测物质调节活性的量度标准。
优选地检测待测物质对因子IXa的抑制。
EP-B 0 034 122中所述的因子IXa底物是合适的因子IXa底物。R-Xxx-Gly-Arg-pNA型底物是尤其适合的，其中Xxx代表疏水D-氨基酸，pNA代表可确定的离去基团。R限定为与EP-B 0 034 122相似。优选来自EP-B 0 034 122的具基本分子结构式I的底物，其中R3＝R4＝H。
优选的底物是N-末端含有疏水D-氨基酸的三肽，并优选使用环己基取代的疏水D-氨基酸。尤其优选环己基甘氨酸和环己基丙氨酸。
进一步优选的底物是也可以被因子Xa如Chromozym X(Boehringer Mannheim GmbH，Moc-D-Nle-Gly-Arg-pNA)或Pefachrom tPA(Pentapharm Ltd.，Basel，MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA)切割的底物。优选使用能光学测定的商业(优选生色的或发荧光的)底物。后者是具有很容易通过光学方法测定的可切割残基(优选对硝基苯胺残基)的生色肽/底物，根据本发明所述的方法优选在缓冲溶液中进行。所有在pH范围7-10(优选在pH7.5-9.0之间)有效的缓冲液都可以作为缓冲物质。优选Tris缓冲液、三乙醇胺和Tris-咪唑缓冲液。
FIXa活性的测定和筛选实验优选在20～40℃，特别优选在室温下进行，并对切割的可光学测定的基团的量进行光度或荧光测定。优选地测定405nm的吸光度。根据Michaelis-Menten方程式从线性初始斜率确定酶活性和动力学常数。
在因子IX活化为因子IXa之后，也可以类似地测定因子IX或因子IX与因子IXa的比率。为了测定血浆中因子IX，首先用Russels蝰蛇毒(优选0.2mg/ml)或RVV-X蛋白酶(优选0.1mg/ml)在CaCl2(10mmol/l)的存在下于20-40℃(优选37℃)将因子IX活化为因子IXa。活化完成后(优选15分钟)，分别加入20-40％和0.2-1mmol/l浓度的1，2-乙二醇和可切割的底物。
已证明对于具有umol/l范围待测物质浓度的筛选实验，加入0.02-0.5umol/l，优选0.05umol/l浓度的因子IXa和0.2-1mmol/l浓度的可切割的底物是有利的。醇类优选使用1，2-乙二醇、乙醇和甲醇。醇类的浓度优选在20-40％的范围内。天然人因子IXa或猪或牛因子IXa或重组合成的人因子IXa可以用作因子IXa。尤其优选使用EP 96 109 288.9中所述的截短的人重组因子IXa。
如果包含N-末端与EGF结构域(EGF1和/或EGF2)连接的FIXa丝氨酸蛋白酶结构域(催化区域)和酶原活化结构域，那么具有酶活性的重组因子Ixa可以通过原核生物中相应cDNA的表达、表达产物的复性和酶切割合成。
优选使用包含下列结构域的非糖基化、具酶活性的因子IXa：
a)FIXa蛋白酶催化结构域，其N-末端连接
b)酶原活化结构域，其N-末端连接
c)EGF1和/或EGF2结构域(优选EGF2或EGF1和EGF2)。
优选地将长达50个氨基酸的间隔区插在酶原活化结构域和EGF结构域之间。当在酶原活化结构域切割根据本发明所述的单一链形式的酶原时，得到两条链形式的活性蛋白。两条链都由两链形式中的分子内二硫键连接。根据本发明所述的蛋白优选包含EGF2结构域、因子IX的活化肽和催化结构域。在欧洲专利申请号96 110 959.2中描述了这样的因子IX突变蛋白。
在根据本发明所述的测定方法中可以使用任何血浆，优选柠檬酸盐血浆。
此方法在中性或微碱性pH值，优选在7.5和9.0之间的pH范围内进行。在此范围有效的生理学上可接受缓冲液都可以用作缓冲液。另外也可以加入凝结测试常用的稳定剂和防腐剂如牛血清白蛋白、乙汞硫代水杨酸钠等。
另外，根据本发明所述的方法和根据本发明所述的试剂也可以包含表面活性剂，优选非离子表面活性剂如Tween 80@。在此情况下浓度优选0.01-1％的量。
本发明另一主题是测定因子IXa的试剂，它含有能被因子IXa切割的、可光学测定的底物、醇类和pH7至10范围之间的缓冲液。
下列实施例、公开文献、序列表和附图进一步阐明了本发明和在专利权利要求书中的保护范围。所述方法应理解为实施例，它们即使在修改后也仍描述本发明的主题。
图.1表示乙醇和1，2-乙二醇对重组γFIXa(0.48umol/l)和天然
FIXa(0.14umol/l)活性的影响。pH7.4；底物：MeSO2-D-HHT-
Gly-Arg-pNA(1.02mmol/l)
-对应于表2的图。图.2a表示1，2-乙二醇对rFIXa活性的影响。
S1＝MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA；
S2＝MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA；
S3＝MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA；
S4＝MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA；
S5＝MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC；
rFIXa＝0.48umol/l；pH＝7.4
-对应于表3的图。图.2b表示乙醇对γFIXa活性的影响。
S1＝MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA；
S2＝MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA；
S3＝MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA；
S4＝MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA；
S5＝MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC；
rFIXa＝0.48umol/l；pH＝7.4
-对应于表3的图。图.3a表示乙醇对P(血浆)-激肽释放酶、FXIIa、FXIa、FIXa、FXa
 和凝血酶活性的影响(pH7.4；1.02 mmol/l MeSO2-D-HHT-
 Gly-Arg-pNA)-对应于表5的图。图.3b表示1，2-乙二醇对P-激肽释放酶、FXIIa、FXIa、FIXa、FXa
和凝血酶活性的影响(pH7.4；1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-
Arg-pNA)-对应于表6的图。
方法 重组DNA技术
如Sambrook，J.等(1989)于：分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约中所述的使用标准方法操作DNA。根据生产商的说明使用分子生物学试剂。蛋白测定
使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定280nm处的光密度(OD)来测定FIX变异体的蛋白浓度。表达载体
用于FIX变异体表达的载体是基于用于核心-抗生素蛋白链霉素的表达载体pSAM-CORE。在WO 93/09144中描述了质粒pSAM-CORE的制备。
用目的变异体的基因替换pSAM-CORE载体中的核心-抗生素蛋白链霉素基因。实施例1克隆FIX基因的催化结构域(质粒pFIX-CD)
用PCR引物N1(SEQ ID NO：1)和N2(SEQ ID NO：2)和来自Stratagene公司(La Jolla，CA，U.S.A)的市售人肝cDNA基因库(载体：λZAP_II)作为模板DNA扩增编码FIX蛋白酶结构域181至415位氨基酸的FIX cDNA的690至1403位碱基对[cDNA的序列和氨基酸序列数按照McGraw，R.A.等的公开文献(美国国家科学院院报，82，1985，2847-2851)]。PCR引物在编码区5′末端引入单一NcoI切点和ATG起始密码子并在编码区3′末端引入单一HindIII切点。
               NcoI
N1：5′-AAAAAA CCATGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACC-3′
                MetValValGlyGlyGluAspAlaLys
              HindIII
N2：5′-AAAAAA AAGCTTCATTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATC-3′
约730bp长的PCR产物用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化后将约720bp长的NcoI/HindIII-FIX片段连入约2.55kbp长的NcoI/HindIII-pSAM-CORE载体片段中(见WO93/09144)。用限制性图谱鉴定目的质粒pFIX-CD，并用DNA测序检测通过PCR分离的FIXcDNA序列。实施例2含有EGF2结构域、活化肽和催化结构域的FIX蛋白酶基因(质粒：pFIX-EGF2-AP-CD)的构建
用PCR引物N3(SEQ ID NO：3)和N4(SEQ ID NO：4)和来自Strataqene公司(La Jolla，CA，U.S.A.)的市售人肝cDNA基因库(载体：λZAP_II)作为模板DNA扩增编码EGF2结构域、FIXa蛋白酶结构域的N-末端区域和活化肽的85-278位氨基酸的FIX cDNA的402至986位碱基对(McGraw等，美国国家科学院院报，82，1985，2847-2851)。PCR引物N3在编码区5′末端引入ATG起始密码子和单一NcoI切点。
               NcoI
N3：5′-AAAAAA CCATGGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCA-3′
                MetAspValThrCysAsnIleLysAsnGly
N4：5′-GGGTTCGTCCAGTTCCAGAAGGGC-3′
约590bp长的PCR产物用限制性内切酶NcoI和BsmI消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化后将约360bp长的NcoI/BsmI-FIX-EGF2-AP片段连入的3.2kbp长的NcoI/BsmI-pFIX-CD载体片段(实施例1)。用限制性图谱鉴定目的质粒pFIX-EGF2-AP-CD，并通过DNA测序检测通过PCR分离的FIX cDNA序列。实施例3a)FIXa蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
为了表达包含活化肽的FIX基因，用实施例2中所述的表达质粒pFIX-EGF2-AP-CD(氨苄青霉素抗性)和lacIq阻遏质粒pUBS520(卡那霉素抗性，制备和描述见：Brinkmann，U.等，基因，85，1989，109-114)转化大肠杆菌K12菌株UT5600(Grodberg，J.和Dunn，J.J.，细菌学杂志，170，1988，1245-1253)。也可以使用本领域技术人员已知和可得到的其它大肠杆菌菌株如HB101和大肠杆菌B来代替UT5600菌株。
用表达质粒pFIX-EGF2-AP-CD转化的UT5600/pUBS520细胞于37℃在含有50- 100mg/l氨苄青霉素和50mg/l卡那霉素的DYT培养基[1％(重量/体积)酵母抽提液、1％(重量/体积)Bacto胰蛋白胨、Difco和0.5％氯化钠)中振荡培养至550nm光密度(OD550)0.6-0.9，随后用IPTG(终浓度 1-5mmol/l)诱导。经37℃4-8小时(h)诱导期后，通过离心(Sorvall RC-5B离心机，GS3转头，6000rpm，15分钟)收获细胞，用50mmol/l Tris-HCl缓冲液(pH7.2)洗涤，并保存于-20℃直至进一步操作。来自1升振荡培养物的细胞产量是4-5g(湿重)。
b)表达分析
对用质粒pFIX-EGF2-AP-CD转化的UT5600/pUBS520细胞的表达进行分析。为此目的，将各来自1ml离心培养物的细胞沉淀重新悬浮于0.25ml 10mmol/l Tris-HCl(ph7.2)中，并用来自Branson公司(Heusenstamm，德国)的Sonifier_细胞破裂仪B15通过超声处理(在50％强度下30秒，2个脉冲)裂解细胞。沉淀(Eppendorf 5415离心机，14000rpm，5分钟)不溶的细胞成分，向上清液加入1/5体积(Vol)5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液：50mmol/l Tris-HCl(pH6.8)、1％SDS、1％巯基乙醇、10％甘油、0.001％溴酚兰)。将不溶的细胞碎片组分(沉淀)重新悬浮于含6-8M尿素的0.3ml 1×SDS样品缓冲液中，将样品在95℃温育5分钟并再次离心。之后通过SDS聚丙烯酰胺凝胺电泳(PAGE)[Laemmli，U.K.，自然，227(1970)680-685]和用考马斯亮蓝R染色染色分离蛋白。
大肠杆菌中合成的FIX变异体是均一的并专一存在于不溶细胞碎片组分(内含体，IBs)中。相对于大肠杆菌总蛋白的表达产量是10-50％。实施例4细胞裂解、溶解和复性
a)细胞裂解和内含体(IBs)的制备
将来自3升振荡培养物的细胞沉淀(约15g湿重)重新悬浮于75ml50mmol/l Tris-HCl(pH7.2)中。使悬浮液与0.25mg/ml溶菌酶混合并在0℃温育30分钟。加入2mmol/l MgCl2和10μg/ml DNase I(Boehringer Mannhein GmbH，目录号104159)后，在来自SLM Amico公司(Urbana，IL，USA)的弗氏压榨器(French_Press)中利用高压分散机械破碎细胞。随后DNA室温(RT)下消化30分钟。向制剂中加入37.5ml 50mmol/l Tris-HCl(pH7.2)、60mmol/l EDTA、1.5mol/lNaCl、6％Triton X-100，室温进一步温育30分钟并在Sorvall RC-5B离心机中离心(GSA转头，12000rpm，15分钟)。除去上清，将100ml50mmol/l Tris-HCl(pH7.2)、20mmol/l EDTA加到沉淀中，在4℃边搅拌边温育30分钟，并再次沉淀。重复上次洗涤步骤。纯化的IB(1.5-2.0g湿重，25-30％干物质，100-150mg蛋白酶)保存在-20℃直至进一步处理。
b)IB的溶解和衍生化作用纯化的IB于室温在6mol/l盐酸胍、100mmol/l Tris-HCl、20mmol/lEDTA、150mmol/l GSSG和15mmol/l GSH，pH8.0中以相当于5-10mg/ml蛋白的100mg IB沉淀(湿重)/ml的浓度边搅拌边悬浮1至3小时。之后，将pH调至pH5.0并通过离心(Sorvall RC-5B离心机，SS34转头，16000rpm，10分钟)分离不溶组分。上清逆着100体积的4- 6mol/l盐酸胍(pH5.0)于4℃透析24小时。
c)复性
在每一种情形下通过将0.5ml IB溶解物/衍生物以24小时的间隔重复(如3次)加到50ml 50mmol/l Tris-HCl、0.5mol/l精氨酸、20mmol/l CaCl2、1mmol/l EDTA和0.5mmol/l半胱氨酸(pH8.5)中并接下来在4℃温育48小时，在4℃进行溶于6mol/l盐酸胍并用GSSG/GSH衍生化的蛋白的复性。复性反应完成后，用配有深床滤器K250的过滤设备通过过滤分离不溶组分，其中深床滤器K250来自Seitz公司(Bad Kreuznach，德国)，过滤设备来自Satorius公司(G_ttingen，德国)。
d)复性制剂的浓缩和透析
含有蛋白酶的澄清上清在来自Filtron公司(Karlstein，德国)的Minisette(膜型：Omega 10K)中通过交叉过滤浓缩10-15倍，并于4℃逆着100体积20mmol/l Tris-HCl和50mmol/l NaCl、pH7.2透析24小时以去除盐酸胍和精氨酸。离心(Sorvall RC-5B离心机，SS34转头，16000rpm，20分钟)去除沉淀的蛋白，澄清上清用来自Nalge公司(Rochester，NY，USA)的Nalgene_一次性滤器(孔径：0.2um)过滤。实施例5复性FIX变异体的纯化
来自复性制剂的FIX变异体如果需要可以用层析方法进一步纯化，层析方法对本领域的技术人员是已知的。
a)在Q-Sepharose ff上通过离子交换层析纯化FIX变异体
将逆着20mmol/l Tris-HCl和50mmol/l NaCl、pH8.0透析的浓缩的复性制剂加到用相同缓冲液平衡的Q-Sepharose ff柱(1.5×11cm，V＝20ml；负载容量：10mg蛋白/ml胶)上，此柱来自PharmaciaBiotech公司(Fre iburg，德国)(2柱体积/小时，2CV/h)，并用平衡液洗涤直至洗脱液在280nm的吸收值达到缓冲液的空白值。结合的物质用在20mmol/l Tris-HCl pH8.0中的50-500mmol/l NaCl梯度洗脱(2CV/h)。含有FIX的组分通过非还原和还原的SDS PAGE测定，并收集洗脱峰。
b)在肝素-Sepharose CL-6B上通过离子交换层析最终纯化FIX变异体
在Q-Sepharose ff上层析后，将含有FIX的合并组分直接加到(2CV/h)已用20mmol/l Tris-HCl和200mmol/l NaCl pH8.0平衡过的肝素-Sepharose CL-6B柱(1.5×11cm，V＝20ml，负载容量：1mg蛋白/ml胶)上，此柱来自Pharmacia Biotech公司(Freiburg，德国)。之后用平衡缓冲液洗涤直至洗脱液280nm吸收值达到缓冲液的空白值。连接的物质用在20mmol/l Tris-HCl pH8.0中的0.2-1.0mol/lNaCl梯度洗脱(2CV/h)。FIX变异体在500-600mmol/l的NaCl浓度下洗脱。含有FIX的组分通过非还原和还原的SDS PAGE测定，合并洗脱峰，并逆着20mmol/l Tris-HCl、50-200mmol/l NaCl、5mmol/lCaCl2、pH7.8中透析。实施例6 FIX变异体的活化和纯化
复性的纯化的FIX变异体用纯化的Russel蝰蛇毒(RVV-X)蛋白酶活化。如Esmon，C.T.的文章中所述的(凝血酶原的活化，博士论文，华盛顿大学，st.Louis，MO(1973))，RVV-X蛋白酶通过凝胶过滤，接着通过在Q-Sepharose ff上的离子交换层析从商业可获得的蛇毒冻干制剂中纯化得到，蛇毒冻干制剂来自Sigma Aldrich Chemie GmbHCo.(Deisenhofen，德国)。
a)复性FIX变异体的活化和纯化
于25℃在20mmol/l Tris-HCl、50mmol/l NaCl、10mmol/lCaCl2、pH7.8中以0.5至2.0mg/ml的浓度和1∶10至1∶20的蛋白酶/底物比率消化FIX变异体。用生色底物(见实施例13a)通过测定活性来监控酶促FIX活化的时间过程直至消化完成(曲线平稳期，最大活化)。为此目的以3-4h的间隔在24小时的时段内从反应混合物中取出样品(10至100ul)并测定产生的FIXa活性。达到活化平稳期后，在Q-Sepharose ff上通过负层析纯化活化的制品。
在给定的条件下RVV-X和未活化的FIX变异体结合到Q-Sepharose ff，但活化的FIXa变异体不结合。
将活化制品加到(2CV/h)已用20mmol/l Tris-HCl、50mmol/lNaCl、pH7.8平衡的Q-Sepharose ff柱(1.0×10cm，V＝8ml)上，此柱来自Pharmacia Biotech公司(Freiburg，德国)，分级分离时继续加入平衡缓冲液至柱中。含有蛋白酶的组分通过非还原和还原SDSPAGE和活性测定来鉴定。实施例7纯化的蛋白酶变异体的鉴定
a)活性检测
使用生色底物ChromozymX(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，德国，目录号789763)测定FIXa变异体的活性。10-100ul样品与190-100μl 50mmol/l Tris-HCl、150mmol/l NaCl、5mmol/lCaCl2、1％PEG 8000、pH8.0混合成200ul，与20ul Chromozym×(0.5-40mmol)混和并在ELISA阅读仪上于405nm波长和室温下对照试剂空白值来测量。根据Michaelis Menten方程从线性初始斜率确定活性和动力学常数。
b)SDS PAGE
通过非还原(无巯基乙醇)和还原(加巯基乙醇)SDS PAGE(Laemmli，UK，自然227(1970)680-685)检测复性活化和纯化的FIXa蛋白酶变异体通过分子内二硫键形成寡聚体和聚合体以及均一性和纯度。实施例8因子IXa检测
用重组合成的天然人FIXa作为样品和在Tris-HCl缓冲液中的肽底物MeS02-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tpA，Pentapharm Ltd.，Basel，Switzerland)或R-D-Xxx-Gly-Arg-pNA型其它生色/发荧光底物(EP-B-0 034 122)及要检测的物质(醇、溶剂和抑制剂)进行FIXa检测。加入FIXa起始反应。检测原理
检测信号：pNA
FIXa的底物：MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(Chromozym X)
            MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tPA)
            MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA
            MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA
            MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC
缩写：pNA，对硝基苯胺
      AMC，7-氨基-4-甲基-香豆酰
      MOC，甲氧羰基
      HHT，六氢酪氨酸
      CHG，环己基甘氨酸
      CHA，环己基丙氨酸基本检测混合物：200ul缓冲液-50-100mmol/l Tris-HCl，pH7-9.5-100-200mmol/l NaCl-5mmol/l CaCl2-有添加剂(醇类、溶剂和抑制剂)
+25μl多肽底物(1-20mmol/l)
+20μl FIXa(0.02-0.5μmol/l)
室温(25℃)下在微量滴定板上温育反应混合物，并用ELISA阅读仪测量405nm吸收值的改变(ΔA/min)。根据Michaelis-Menten方程从线性初始斜率确定活性和动力学常数。实施例9醇类和有机溶剂对rFIXa活性的影响
测试能与水完全混合形成单一相的各种醇类(甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇和甘油)和有机溶剂[乙腈、DMSO(二甲基亚砜)及DMF(二甲基甲酰胺)及易溶多价醇[m-赤藓糖醇、PEG(聚乙二醇)]对rFIXa活性的影响以及醇或无机溶剂浓度(0-50％)之间关系。测试混合物(测试中的浓度)：
-41mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.48μmol/l rFIXa(人)
-0-50％(醇类或有机溶剂)
结果显示于表1中。计算比率V/V0以说明对rFIXa催化活性的促进。
V0，无添加剂时的反应速率
V，有添加剂时的反应速率
                                                表1
添加剂[％]                                               V/V0
    0     8     16     25     33     41     50
甲醇     1     2.16     3.46     3.71     2.83     1.55     0.588
乙醇     1     2.99     5.52     5.57     3.35     1.48     0.606
正丙醇     1     3.43     2.26     0.339     0.186     0.056     0.056
异丙醇     1     2.17     2.48     1.18     0.346     0.164     0.164
叔丁醇     1     2.05     1.67     0.702     0.368     0.263     0.263
1，2-乙二醇     1     2.91     6.05     10.27     12.68     9.68     3.41
丙三醇     1     1.12     1.64     2.47     3.38     4.82     5.91
m-赤藻糖醇*     1     1.16     1.35     1.49     1.56     1.64     1.77
聚乙二醇*     1     0.691     0.410     0.352     0.309     0.216     0.173
乙腈     1     0.828     0.314     0     0     0     0
二甲基亚砜     1     1.27     1.45     1.59     1.43     0.922     0.157
二甲基甲酰胺     1     0.649     0.514     0     0     0     0
*)g/100ml结果：
某些醇类(乙二醇＞乙醇＞甲醇)在15-40％的浓度范围内将rFIXa的活性提高约5-15倍。甘油直至要更高浓度(25-50％)才有促进作用而m-赤藓糖醇只有轻微的效果。相反聚乙二醇(PEG)抑制rFIXa的活性。在不含羟基的溶剂中只有二甲基亚砜直至30％也不抑制rFIXa，而二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈则使酶失活。实施例10乙醇和乙二醇对重组人FIXa和天然FIXa活性的影响
测试是否用天然FIXa(人)通过乙醇和乙二醇也发生所观察到的rFIXa的提高(活化rFIXa变异体包括EGFII结构域、已加工的活化多肽和催化结构域)。测试混合物(测试中的浓度)：
-41mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1 mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.48μmol/l人 rFIXa或
-0.14μmol/l天然的FIXa(人)
-0-50％乙醇或1，2-乙二醇结果总结在表2中并在图1中表示。
                                              表2
添加剂[％]                                     V/V0
    0     8     16    25     33     41   50
    人 rFIXa
    乙醇     1     2.99     5.52    5.57     3.35     1.48   0.61
    1，2-乙二醇     1     2.91     6.05    10.27     12.68     9.68   3.41
    天然的4rFIXa(人)
    乙醇     1     3.40     5.46     5.96     4.82     1.69   1.17
    1，2-乙二醇     1     3.13     6.19     9.36     12.21     8.29   3.92
结果：
关于由乙醇和乙二醇所产生的活化，对于重组人rFIXa和天然人FIXa未发现差异。实施例11乙醇和乙二醇对rFIXa对生色和发荧光肽的活性的影响
使用多肽底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tPA，Pentapharm Ltd.，Basel，Switzerland)，MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(Chromozym X，Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany，目录号789763)，MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(Pentapharm Ltd.，Basel，Switzerland)，MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA(PentapharmLtd.，Basel，Switzerland)和MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC(Pentapharm Ltd.，Basel，Switzerland)测试由乙醇和乙二醇对人rFIXa的促进。生色的测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mol/l CaCl2
-0-50％ 1，2-乙二醇
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA，
-0.48μmol/l rFIXa(人)
或
-0.82mmol/l MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA
-0.48μmol/l rFIXa(人)
或
-1.02mmol/l MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA
-0.28μmol/l rFIXa(人)
或
-1.02mmol/l MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA
-0.48μmol/l rFIXa(人)发荧光的测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-0-50％1，2-乙二醇
-0.51mmol/l MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC
-0.08μmol/l rFIXa(人)结果总结在表3中，加有乙二醇的结果显示在图2a，加有乙醇的结果显示在图2b中。
                                                                表3
  底物添加剂                                                         V/V0添加剂 [％]
    0     8     16     25     33     41     50
  MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
  乙醇     1     2.99     5.52     5.57     3.35     1.48     0.60
  1，2-乙二醇     1     2.91     6.05     10.27     12.68     9.68     3.41
  MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA
  乙醇     1     3.63     7.28     9.95     7.51     3.15     1.39
  1，2-乙二醇     1     3.91     8.85     17.07     22.42     17.80     6.96
  MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA
  乙醇     1     3.33     6.02     6.16     4.50     1.74     0.87
  1，2-乙二醇     1     5.47     13.13     19.37     23.20     17.40     5.67
  MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA
  乙醇     1     3.30     5.40     5.38     4.30     1.48     0.89
  1，2-乙二醇     1     2.84     6.26     9.34     11.18     7.54     2.56
  MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC
  乙醇     1     2.09     2.50     1.37     1.01     0.70     0.58
  1，2-乙二醇     1     2.55     5.59     8.40     8.90     5.79     1.44
结果：
当使用肽底物MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA而不是MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA时可以进一步促进由乙醇和乙二醇对γFIXa的促进，表示为系数V/VO。在超过25％的乙二醇浓度下，系数V/VO比用底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA时提高1.5-2倍。
醇类以类似的方式提高荧光底物MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC的切割。乙二醇(33％)分别将具有序列MeSO2-D-CHA-Gly-Arg和C-末端AMC或pNA的三肽的切割提高9和11倍。由于高的敏感性，必须使用少得多的(1/10)rFIXa去切割荧光底物MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC。实施例12乙二醇对重组人FIXa和天然FIXa切割生色肽底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA、MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA的动力学的影响测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mol/l CaCl2
-0-50％ 1，2-乙二醇
-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)
-0.48μmol/l rFIXa(人)
或
-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)
-0.29μmol/l native FIXa(人)
或
-MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)
-0.48μmol/l rFIXa(人)
或
-MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)
-0.28μmol/l rFIXa(人)
根据Lineweaver Burk图确定动力学常数(Kcat/Km)(因为直线通过原点不能分别确定Km和Kcat)。
                                         表4a
底物：MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
  酶                                     kkat/Km[l/mmol*s]1，2-乙二醇浓度                                              [％]
    0   8   16   25   33   41   50
  rFIXa     n.l.   0.348   0.515   1.018   1.018   0.692   0.172
  天然的FIXa     n.l   0.299   0.737   1.169   1.395   0.922   0.390
                                    表4b
不同底物，rFIXa
底物                       kkat/Km[l/mmol*s]1，2-乙二醇浓度[％]
    0    8   16   25   33   41    50
MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA n.l. 0.348 0.515 1.018 1.018 0.692 0.172
MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA n.l n.l. 0.326 0.565 0.552 0.360 0.148
MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA n.l. 0.637 1.974 2.880 3.480 1.929 0.576
n.l.＝non-linear结果：
也发现了重组或天然人FIXa催化的生色多肽底物切割的促进，因为直至33％的乙二醇浓度动力学常数Kcat/Km都增加。当底物是MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA时在33％乙二醇时发现最高催化活性即最高Kcat/Km值。在未受影响的反应中，图不是线性的，没有测定到常数。实施例13与血浆激肽释放酶、FXIIa、FXIa、FXa和凝血酶比较，乙醇和乙二醇对FIXa活性的影响FIXa测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.14μmol/l天然的FIXa(人)
-0-50％乙醇或1，2-乙二醇血浆激肽释放酶测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.0176U/ml血浆激肽释放酶(人)
-0-50％ 乙醇或1，2-乙二醇FXIIa测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.0045U/ml FXIIa(人)
-0-50％乙醇或1，2-乙二醇FIXa测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.0012μmol/l FXIa(人)
-0-50％乙醇或1，2-乙二醇FXa测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.088μmol/l FXa(牛)
-0-50％乙醇或1，2-乙二醇凝血酶测试混合物(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH7.4
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.045μmol/l凝血酶(牛)
-0-50％乙醇或1，2-乙二醇
结果总结在表5和6中，乙醇的效果显示于图3a，乙二醇的效果显示于图3b。
                                               表5
蛋白酶                                          V/V0乙醇浓度[％]
    0     8     16     25     33     41     50
激肽释放酶     1     1.48     1.10     0.377     0.280     0.215     0.174
FXIIa     1     0.904     0.579     0.187     0.051     0.009     0
FXIa     1     1.08     0.845     0.657     0.469     0.353     0.258
FIXa     1     3.40     5.46     5.96     4.82     1.69     1.17
FXa     1     0.899     0.752     0.510     0.377     0.203     0.086
凝血酶     1     0.846     0.685     0.507     0.343     0.184     0.087
                                                    表6
蛋白酶                                      V/V01，2-乙二醇浓度[％]
    0     8     16     25     33     41     50
激肽释放酶     1     1.05     0.763     0.676     0.536     0.478     0.290
FXIIa     1     0.892     0.729     0.551     0.355     0.187     0.103
FXIa     1     0.922     0.790     0.569     0.422     0.275     0.165
FIXa     1     3.13     6.19     9.36     12.21     8.29     3.92
FXa     1     0.973     0.902     0.741     0.558     0.347     0.191
凝血酶     1     0.924     0.862     0.763     0.653     0.508     0.395
结果：
在内部活化途径的凝结因子-血浆激肽释放酶、FXIIa、FXIa、FIXa、FXa和凝血酶中，只有FIXa可以被乙醇和乙二醇活化。在血浆激肽释放酶中存在10-20％乙醇时观察到轻微的活化作用。实施例14乙二醇存在时pH对rFIXa和天然FIXa活性的影响检测混合物(检测中的浓度)-42mmol/l Tris-HCl、pH7.0-10.0-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA、MOC-D-Nle-Gly-Arg-
pNA或MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA-25％1，2-乙二醇-0.28umol/l rFIXa(人)
或-0.14umol/l天然FIXa(人)
结果显示于表7a-d中。
                                                表7a
                             底物：MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA，rFIXa(人)
  添加剂/pH                                                 mA/min
  7.0   7.5   8.0   8.25   8.5   8.75   9.0   9.5   10.0
  无 6.5 10.7 16.0 17.0 16.3 16.3 16.0 12.9 10.4
  1，2-乙二醇[25％] 56.5 124.5 173.6 176.0 182.1 170.7 164.1 112.0 110.1
                                           表7b
                      底物：MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA，native FIXa(人)
  添加剂/pH                                                  mA/min
  7.0   7.5   8.0   8.25   8.5   8.75   9.0   9.5   10.0
  无 3.3 6.8 10.0 10.5 10.3 9.9 9.3 7.4 6.2
  1，2-乙二醇[25％] 23.7 63.0 101.0 106.7 115.4 110.9 105.6 100.6 77.2
                                               表7c
                            底物：MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA，rFIXa(人)
添加剂/pH                                                   mA/min
  7.0   7.5   8.0   8.25   8.5   8.75   9.0   9.5  10.0
无 3.1 5.2 6.8 7.3 7.9 7.1 7.1 7.0 5.2
1，2-乙二醇[ 25％] 31.5 70.1 99.7 102.7 104.3 101.6 97.3 70.7 68.3
                                       表7d
                     底物：MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA，rFIXa(人)
添加剂/pH                                                 mA/min
 7.0  7.5  8.0  8.25  8.5  8.75  9.0  9.5  10.0
无  6.5  11.3  18.1  18.8  19.6  20.3  18.4  14.8  11.3
1，2-乙二醇[25％] 154.7 289.8 372.4 382.2 389.8 395.6 373.3 255.6 244.5
结果：
如乙二醇作为例子所表明的醇类并未改变rFIXa催化活性的pH依赖性。这样存在25％乙二醇时在pH7.0和10.0之间的切割速率以相同比率增加。当底物是MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA时切割速率增加10倍，当底物是MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA，分别增加14倍和20倍。最适pH范围是pH8.25和8.75之间。最有效切割的底物是MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA。实施例15对FIXa抑制剂的筛选实验
通过FIXa活性抑制可以鉴定特异的FIXa抑制剂。为这个目的，在缺少和存在要检测的物质或物质混合物时用R-D-Xxx-Gly-Arg-pNA型(Xxx＝疏水型氨基酸)底物测定FIXa的活性，并从系数计算抑制百分率。从抑制动力学中确定抑制常数Ki。通过高浓度的某一种醇类(优选乙二醇)的存在扩增测量信号。测试原理： 测量信号：pNAFIXa底物：MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tPA)
      MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(Chromozym X)
      MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNAFIXa：重组合成的rFIXa(人)测试混合物：200ul缓冲液(100mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、5mmol/lCaCl2、20-40％醇类、pH7-9)，缓冲液含有各种浓度的抑制剂+25ul肽底物+25ul rFIXa(人)
测试混合物于室温在微量滴定板中温育，用ELISA阅读仪测定405nm吸光度的改变(ΔA/min)。也可以5-10分钟后用乙酸(25ul，50％)终止反应，在405nm对照空白试剂测定吸光度。实施例16使用不同的pH、醇类和醇类浓度时已知蛋白酶抑制剂对rFIXa活性的影响测试混合物(测试中的浓度)-42mmol/l Tris-HCl、pH7.4或8.5-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-底物MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(1.02mmol/l)-0.028-0.57umol/l rFIXa(人)-4.1％乙醇或33％1，2-乙二醇-以梯度浓度(4.1-163μmol/l)的抑制剂
已知的3-咪基苯丙氨酸型合成抑制剂用作抑制剂(Sturzebecher等1，酶学杂志，抑制9(1995)87和WO 92/08709)(1991))。以低和高的醇浓度作为例子检测抑制效果。表8a抑制剂Nα-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-(D，L)-苯基丙氨酸-异哌啶酸[TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH]对因子Ixa活性的抑制(以％表示)
 条件                            抑制剂浓度[μmol/l]
  4.1   8.2     16.3   40.8   81.6   163
 pH7.4；4.1％乙醇0.57μmol/l rFIXa 89.5 87.6 76.2 55.8 36.3 23.8
 pH8.5；4.1％乙醇0.28μmol/l rFIXa 90.6 85.2 74.8 55.2 35.3 20.8
 pH7.4；33％1，2-乙二醇0.057μmol/l rFIXa 86.9 79.4 61.7 38.9 21.2 15.0
 pH8.5；33％1，2-乙二醇0.028μmol/l rFIXa 85.6 72.8 58.0 33.6 20.7 15.8
表8b抑制剂Nα-(2-萘磺酰基)-3-脒基-(D，L)-苯基丙氨酸-1，2，3，4-四羟异喹啉-3-羧酸[βNAPS-(3-Am)Phe-TIC-OH]对因子IXa活性的抑制(以％)表示
 条件                                    抑制剂浓度[μmol/l]
    4.1     8.2     16.3     40.8     81.6     163
 pH7.4；4.1％乙醇0.57μmol/l rFIXa 97.2 97.2 88.2 75.4 57.0 25.7
 pH8.5；4.1％乙醇0.28μmol/l rFIXa 100 96.2 86.2 77.5 63.8 48.8
 pH7.4；33％1，2-乙二醇-0.057μmol/l rFIXa 100 100 85.4 62.6 41.0 28.9
 pH8.5；33％1，2-乙二醇0.028μmol/l rFIXa 100 97.9 88.4 78.4 66.0 45.4
结果：
可以在各种pH值和各种酶含量(优选乙醇或1，2-乙二醇)下检测合成抑制剂所产生的对rFIXa的抑制。已发现抑制剂TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH对rFIXa 50％的抑制即IC50值在20和50umol/l，对于βNAPS-(3-Am)Phe-TIC-OH，IC50值在60和150umol/l之间。在高浓度1，2-乙二醇和pH8.5下可以最敏感检测到抑制效应。因为只需要极低量的rFIXa并且高醇浓度有利于要检测物质的溶解，所以这个方法适合作为寻找FIXa抑制剂的筛选方法。实施例17根据DIXON的方法测定解离常数Ki 测试混合液(测试中的浓度)
-42mmol/l Tris-HCl，pH8.5
-82mmol/l NaCl
-4.1mmol/l CaCl2
-33％1，2-乙二醇
-以梯度浓度的抑制剂(0，20.4和
 40.8μmol/l)
-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(1.02，0.51和0.25mmol/l)
-0.14μmol/l rFIXa(人)
或
-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(1.02，0.51和0.25mmol/l)
-0.07μmol/l天然的FIXa(人)
或
-MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(1.02，0.51和0.25mmol/l)
-0.14μmol/l rFIXa(人)
TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH作为抑制剂，并且在最适条件(pH8.5、33％1，2-乙二醇下)以两种底物作为例子测定抑制效应。
                             表9a
     底物：MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA，0.14μmol/l rFIXa
底物浓度             抑制剂浓度[μmol/l]1/V[min/mA]
    0     20.4     40.8
    1.02μmol/l     9.5     16.6     31.2
    0.51μmol/l     20.9     43.5     90.9
    0.25μmol/l     33.2     69.4     137
                            表9b
     底物：MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA，0.07μmol/l天然的
     FIXa
底物浓度             抑制剂浓度[μmol/l]1/V[min/mA]
    0     20.4     40.8
    1.02μmol/l     16.4     29.5     53.2
    0.51μmol/l     38.6     77.5     154
    0.25μmol/l     59.5     129     255
                         表9c
底物：MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA，0.057μmol/l rFIXa
底物浓度                抑制剂浓度[μmol/l]1/V[min/mA]
    0     20.4     40.8
    1.02μmol/l     15.5     23.8     44.6
    0.51μmol/l     28.7     55.6     109
    0.25μmol/l     43.1     78.1     153
结果：
在pH8.5和最适1，2-乙二醇浓度(33％)下，根据DIXON方法测定TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH对重组或天然人FIXa的抑制的解离常数Ki。使用总结在表9a和9b中的值绘图测定对重组和天然FIXa抑制的类似Ki值(分别是12和9μmol/l)。对rFIXa的抑制当使用底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA时也得到类似的Ki值(分别是12和16μmol/l)。具有高1，2-乙二醇浓度的筛选混合物尤其适合于测定抑制常数，因为需要低rFIXa浓度。此外高醇浓度有利于要检测物质的溶解。
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              序列表(1)基本信息
(i)申请人：BOEHRINGER MANNHEIM
   (A)街道：Sandhoger STR.116
   (B)城市：mannheim
   (C)国家：德国
   (D)邮政编号：D-68305
   (E)电话：08856/60-3446
   (F)传真：08856/60-3451
(ii)发明名称：测定因子IXa催化活性的方法
(iii)序列数：4
(iv)计算机可读形式
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30B(EPO)(2)关于SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征
  (A)长度：37个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：其它核酸
  (A)描述：/desc＝“引物”(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
AAAAAACCAT GGTTGTTGGT GGAGAAGATG CCAAACC(2)关于SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征
   (A)长度：42个氨基酸
   (B)类型：核苷酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc＝“引物”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AAAAAAAAGC TTCATTAAGT GAGCTTTGTT TTTTCCTTAA TC(2)关于SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征
   (A)长度：39个氨基酸
   (B)类型：核苷酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc＝“引物”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AAAAAACCAT GGATGTAACA TGTAACATTA AGAATGGCA(2)关于SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征
   (A)长度：24个氨基酸
   (B)类型：核苷酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc＝“引物”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GGGTTCGTCC AGTTCCAGAA GGGC

Claims (6)

1.在含有因子IXa或其中形成或消耗因子IXa的样品溶液中测定因子IXa的方法，其中向所述样品溶液中加入可测定的因子IXa的底物和能与水混溶形成单一相的醇类，利用因子IXa的底物的切割作为因子IXa活性的量度标准来测定因子IXa对所述底物的催化效果。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用N末端含有疏水D-氨基酸的三肽作为底物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使用环已基取代的疏水D-氨基酸。
4.鉴定调节因子IXa活性的物质的方法，其特征在于
a)在能与水混合形成单一相的醇类的存在时，用规定浓度的具有
因子IXa活性的多肽切割因子IXa的底物并测定所述底物的切割
速率作为因子IXa活性的量度标准，
b)在待测物质存在时测定所述活性，
c)比较存在和不存在待测物质时的活性，并且
d)活性的差异用作待测物质调节活性的量度标准。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中使用甲醇、乙醇、正或异丙醇、叔丁醇、甘油或特别地1，2-乙二醇作为能与水混合形成单一相的醇类。
6.测定样品溶液中因子IXa的试剂，含有可以被因子IXa切割的生色底物、能与水混合形成单一相的醇类和pH7和10之间的缓冲液。
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