CN1193997A - 产生和纯化并测定具有hcvns3蛋白酶蛋白水解活性的多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

按照本发明的方法使得可以以纯的有催化活性的形式表达和分离具有HCV NS3蛋白酶的蛋白水解活性的多肽,并且其量足以发现NS3蛋白酶抑制因子和检测NS3蛋白酶的三维结构。本发明的另外的目的是确定完成上述多肽的蛋白水解活性的化学和物理条件的方法。本发明进一步包括含有能够在培养细胞中表达上述多肽的核苷酸序列的物质(表达载体)的新组合物。最后,确定出新的组合物,这种组合物适合于测量上述蛋白水解活性,且能用于产生NS3蛋白酶抑制因子,因此能用作HCV的治疗药剂。上图显示了使用S3 depsipeptide底物(SEQ ID NO:45)的HCV NS3蛋白酶的动力学参数。

Description

产生和纯化并测定具有HCV NS3蛋白酶 蛋白水解活性的多肽的方法
本发明涉及分子生物学和肝炎C病毒(HCV)病毒学。更具体地说，本发明的目的是以纯化的形式大量产生具有HCV NS3蛋白酶的蛋白水解活性的多肽的方法和这些多肽的体外蛋白水解活性的有效再现的方法，目的是确定能够选择抑制与NS3有关的酶活性的酶促测定法(用于治疗目的)。
已知肝炎C病毒(HCV)是非-A、非-B肝炎(NANB)的主要病原体。据估计HCV引起至少90％输液后NANB病毒性肝炎和50％偶发性NANB肝炎。尽管在供血者的选择方面和用于输液的血液的免疫鉴定方面已取得了很大的进展，但是在受血者中间仍然有大量的HCV感染(全世界每年有一百万或更多感染者)。大约50％HCV-传染个体在5至40年的时间里发展成为肝硬化。此外，最近的临床研究表明慢性HCV感染和肝细胞癌的发展有关。
HCV是一种含有大约9.4kb的RNA阳性染色体组的外壳病毒。此病毒是Flaviviridae科的成员，此科的其它成员是黄病病毒(flaviviruses)和瘟病毒属(pestviruses)。
最近已经绘制了HCV的RNA染色体组图谱。对世界各地分离的HCV染色体组的序列比较表明这些序列是非常不同的。HCV染色体组的主要部分是核苷酸数目在9030和9099之间变化的的开放读框(ORF)。此ORF编码单一的病毒多蛋白，这种蛋白的长度在3010至3033个氨基酸之间变化。在病毒感染周期中，多蛋白经蛋白水解加工成独立的基因产物，这种基因产物对病毒的复制是必需的。
编码HCV结构蛋白质的基因定位在ORF的5′端，而编码非结构蛋白质的区域位于ORF的其余部分。
结构蛋白质是由C(核心，21kDa)、E1(外壳，gp37)和E2(NS1，gp61)组成的。C是可能形成病毒的核壳体的21kDa的非糖基化蛋白质。蛋白质E1是大约37kDa的糖蛋白，认为其是外病毒壳的结构蛋白。另一种61 kDa的膜糖蛋白E2可能是病毒外壳的另一种结构蛋白。
非结构区开始于NS2(p24)，这是一种功能还不清楚的24kDa的疏水蛋白。
在多蛋白中，紧随NS2的是68kDa的NS3蛋白，估计其具有两个功能域：在开始的200个氨基末端的氨基酸中的丝氨酸蛋白酶域和在羧基末端的依赖RNA的ATP酶域。
NS4基因区编码NS4A(p6)和NS4B(p26)，这是两种功能还不十分清楚的分别为6和26kDa的疏水蛋白质。
NS5基因区也编码两种分别为56和65 kDa的蛋白NS5A(p56)和NSSB(p65)。在所有依赖RNA的RNA聚合酶中出现的氨基酸序列可以在NS5区中发现。这说明NS5区包含病毒复制机制的组成部分。各种分子的生物学研究表明信号肽酶和与宿主细胞的内质网有关的蛋白酶对非结构区(也就是说在C/E1、E1/F2和E2/NS2位点)的蛋白水解加工过程起作用。
在NS3中的丝氨酸蛋白酶的作用是切割NS3和NS4A、NS4A和NS4B、NS4B和NS5A、NS5A和NS5B之间的连接处。特别是已经发现这种经丝氨酸蛋白酶的切割在氨基末端一侧(P1位置)留下半胱氨酸或treonine残基，在切割位点的羧基末端一侧(P1′位置)留下丙氨酸或丝氨酸残基。已经表明存在于NS3中的蛋白酶体内为异源二聚体蛋白，与蛋白质NS4A形成复合物。此复合物的形成在位点NS4A/NS4B和NS5A/NS5B上增加了蛋白水解活性，并且对位点NS4B/NS5A的蛋白水解加工是必需的。
HCV的另一种蛋白酶活性的作用似乎是在NS2和NS3之间进行切割，此种蛋白酶活性包含在含有NS2和NS3(包含丝氨酸蛋白酶域)的区域中，但是后者不使用相同的催化机制。
能够干扰与蛋白NS3有关的蛋白水解活性的物质可以成为新的治疗剂。实际上，这种蛋白酶活性的抑制作用与HCV多蛋白的非结构区蛋白水解加工停止有关，因此阻止感染细胞的病毒复制。
已经证明这些物质的序列与黄病病毒的序列同源，这种物质不同于HCV，能够感染细胞系培养物，在这种情况下，有人指出与不再能够行使其催化活性的蛋白酶的产生有关的遗传操作能够消除病毒的复制能力(1)。此外在体外和临床研究中已经广泛证明能够感染HIV蛋白酶活性的化合物能够抑制这种病毒的复制(2)。
已知用于产生具有治疗潜力的分子的方法是本领域中能够实施的方法。一般地说，收集含有大量的单一的化学实体(具有高分子多样性)的化合物进行自动测定，目的是鉴定单一活性试剂，然后再进行化学修饰目的是改进它们的治疗的潜力。另外的方法可能包括特定靶蛋白底物和配位体的合理修饰，目的是发展在检验过程中具有高度结合亲和力的能够改变或者消除此蛋白的生物活性的化合物。
通过此部分称作X射线晶体照相术或者核磁共振(NMR)的方法对靶蛋白的三维结构进行测定，可以完成能够与所说的蛋白特异结合的分子的合理设计，结果这种蛋白就具有了干扰那种蛋白质的生物活性的能力。
有关能够干扰存在于肝炎C病毒NS3蛋白中的蛋白酶的生物活性化合物的研究，由于在产生不改变催化活性的足够量的纯化蛋白和需要使用体外提高此酶活性的辅因子方面存在困难。
因此在特定的领域中需要以过去可能的最大的量产生NS3或者类似产物的方法，这些物质具有足以选择抑制剂的体外活性。
本发明包括分离和纯化具有HCV蛋白质NS3的蛋白水解活性的多肽，这种多肽的特征在于它们具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5序列的氨基酸序列。
本发明也包括产生下列序列之多肽的表达载体：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，这些多肽具有HCV NS3的蛋白水解活性，所说的载体包含：
-编码所说的一种多肽的多核苷酸；
-在所说的宿主细胞中可操作地与所说的编码所说的一种多肽的多核苷酸结合的功能性调节、转录以及翻译序列；和
-可有可无的选择性标记。
本发明也涉及使用表达载体以使得所说的宿主细胞表达特异性编码多肽的选择的序列的方式转化的真核或者原核宿主细胞，所说的表达载体包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的DNA序列。本发明还包括制备具有选自下组之序列的多肽的方法：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5，这种方法的特征在于其包括下列操作(作为一个整体)：
-使用上述的一种表达载体转化真核或者原核宿主细胞；和
-表达所需要的核苷酸序列以便产生所选择的多肽；和
-纯化如此获得的多肽，避免其重新溶解。
本发明的另外的目的也在于体外再现HCV NS3蛋白酶的蛋白水解活性的方法，这种方法的特征是具有选自下组之序列的纯化的多肽(与NS3相似)的活性在20和25℃之间的温度下，在含有30-70mM Tris pH 6.5-8.5、3-30mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5-3％3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸(CHAPS)和30-70％甘油的溶液中再现：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；这种方法的另一个特征是在这些条件下以肽作为底物，甚至在缺乏辅因子的情况下对上述的多肽活性进行动力学测定和定量。
可以通过切割底物产生可检测的产物来测定SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5多肽的蛋白酶活性。优选使用以放射性、比色分析和荧光测定法为基础的方法测定所说的切割物。HPLC等方法也是合适的。按照本发明，使用的底物是相应于HCV多蛋白NS4A/4B结合处的合成肽。如果需要，含有氨基酸序列SEQID NO：6的肽或其部分可以用作NS3蛋白酶的辅因子。
适合用作底物的肽是SEQ ID NO：7所示的肽、其N和/或者C-末端缺失的衍生物(SEQ ID NO：8-12，14，18-20)和SEQ ID NO：47所示的肽。尤其适合的是SEQ ID NO：18-20所示的十肽序列，特别是SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：29-32及35衍生的序列。
在NS3蛋白酶的浓度在100-200nM之间时，这些肽可以用于NS3蛋白酶活性的高流通量(high-throughput)测定。
按照本发明，depsipeptide底物(至少具有一个在此序列中的酯键的肽)也可以用于NS3蛋白酶活性的高流通量测定中。事实上，已知在测定中需要尽可能低的酶浓度来适合于转化足够的底物。这可以最大限度地提高抑制作用的敏感性，并能够筛选以极低的浓度存在于化合物混合物或复合文库中的抑制剂。在P1和P1′残基间的易切断的键上带有标准酰胺的用于NS3蛋白酶的底物的Kcat/Km值为30-100M-1s-1。这规定了用于100-200nM的高流通量测定中的实用酶浓度范围。为了降低酶浓度，有必要使用具有更高Kcat/Km值的底物。在P1和P1′间含有酯键的底物对此是十分理想的，这是因为由于热力学更容易的酯基转移反应(8)使酰基-酶中间体的形成更容易。按照本发明，这种depsipeptide底物具有很高的Kcat/Km值，这使得在高流通量测定中有用的NS3浓度范围为0.5-2nM。这些底物可以通过标准化学方法在固相上以很高的产量合成。
对于高流通量筛选，常规测定是适合的，但是这些测定在可以方便地检测到产物之前需要所说的底物至少有10％的水解。这还不包括对精确的动力研究至关重要的实际初始速率的确定。为了克服这些困难，已经发展了使得能够对蛋白酶活性进行连续监控的测定方法。这种测定依赖于特定的合成底物，能够直接产生连续的信号，所产生的信号与底物的水解程度直接相关，这样就不再需要从反应产物中分离底物。所用的depsipeptides(SEQ ID NO：45和46)(图12列出了其化学式)是基于共振能转移(RET)的内部淬火荧光底物。它们包含荧光供体5-[(2′-氨乙基)氨基]萘-磺酸(EDANS)(靠近肽的一端)和受体基团4-[[4′-二甲基氨基苯]偶氮]苯甲酸(DABCYL)(靠近另一端)。此类底物的荧光通过供体和受体间的分子内RET进行最初的淬火，但是当酶切开底物时，荧光增加。选择EDANS和DABCYL作为供体/受体对，这是因为在前者的荧光释放和后者的吸收间存在较好的光谱重叠(13-17)。RET的有效性取决于供体和受体之间的距离，即二者的距离越近，淬火越高。对于EDANS/DABCYL对，50％能量转移(R0)的Frster距离是33。在底物中所报告的EDANS/DABCYL之间的最大限度距离是11个氨基酸(19)，以此肽假定的扩展构象推断这11个氨基酸相当于R＝39.8，计算得出RET效率为24.5％。以底物切割为基础，这相当于荧光有10倍的增加。
关于这一点，本发明已进行了一般的描述。借助于下列实施例，下文给出了特定的实施方案的更详细的描述，目的是为了更好地理解本发明的目的、特性、优点和本发明的操作方法。
图1显示了用于在草地夜蛾无性系9细胞中转移和表达SEQ ID NO：1所示的多肽的质粒载体。
图2A和2B分别显示了用于在大肠杆菌中转移和表达序列SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的多肽的质粒载体。
图3显示了作为甘油浓度的函数的NS3活性。
图4显示了作为CHAPS，3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸浓度的函数的NS3活性。
图5显示了作为pH的函数的NS3活性。
图6显示了作为离子强度的函数的NS3活性。
图7是使用肽Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu--Pro-Tyr-Lys-ε-(3H)-Ac(SEQ ID NO：47)作为底物的酶分析以测定NS3活性的图。
图8是合成序列SEQ ID NO：42描述的depsipeptide底物S1的反应图。
图9是合成序列SEQ ID NO：43描述的depsipeptide底物S2的反应图。
图10是合成序列SEQ ID NO：44描述的放射性的depsipeptide底物S1的反应图。
图11显示了基于放射性信号测定NS3蛋白酶活性的高流通量测定。
图12显示了基于RET分子内荧光淬火的NS3活性的连续测定的depsipeptide底物(SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46)的化学式。
图13显示了合成depsipeptide底物S3(SEQ ID NO：45)的反应图。
图14A和14B分别显示了在相关的测定中以S3(SEQ ID NO：45)为底物的NS3蛋白酶的动力学参数和作为时间函数的荧光。
                     实施例1
在草地夜蛾无性系9培养细胞中HCV NS3蛋白酶的表达方法
本领域已知在昆虫培养细胞中的外源基因表达系统，如由杆状病毒载体感染的草地夜蛾无性系9(Sf9)(3)。异源基因通常置于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒或家蚕(Bombix mori)核型多角体病毒的强多角启动子控制之下。通过同源重组在杆状病毒载体的需要位点引入异源DNA的方法在本领域也是已知的(4)。
质粒载体pBacNS(1039-1226)是pBlueBacIII(Invitrogen)的衍生物，构建这种载体的目的是转移编码具有NS3(1039-1226)活性的多肽基因。通过PCR使用寡核苷酸可以获得编码SEQ ID NO：1中描述的多肽的核苷酸序列，所说的寡核苷酸的5′端插入了ATG密码子，3′端插入了TAG终止密码子。将以这种方法所获得的片段插入到载体pBlueBacIII的BamH1位点，之后用Klenow DNA聚合酶片段处理。所得的质粒如图1所示。
从Invitrogen购买草地夜蛾无性系9(Sf9)细胞和杆状病毒重组试剂盒。将细胞培养在平皿上或者27℃悬浮在含有10％胚牛血清(Gibco)的完全Grace昆虫培养基(Gibco)中。按照厂商的说明转染、重组和选择杆状病毒构建体。
为了完成蛋白质的表达，用所说的重组杆状病毒以每升2×106个细胞的密度在每个细胞大约5个病毒颗粒的比率下感染Sf9细胞。在23℃下将这些细胞悬浮培养72小时。将温度从27℃(一般相当于最佳生长温度)降低到23℃，目的是获得可溶的活性蛋白。
通过离心收获细胞，并且以PBS(20mM磷酸钠，pH7.4，140mMNaCl)洗涤后，将沉淀重新悬浮在25mM磷酸钠pH值6.5、0.5％3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、10mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)中。4℃下使用Branson 250仪器通过在10W下4次循环的超声处理(每次30秒)破坏细胞。在120,000×g时离心1小时沉淀如此获得的匀浆，把上清液装载到用25mM磷酸钠pH值6.5、10％甘油、2mN二硫苏糖醇、1mM乙二胺四乙酸、0.1％CHAPS平衡的HR26/10 S-琼脂糖柱(Pharmacia)上，流速为2ml/分钟。在以两倍于柱体积的平衡液洗涤后，使用0和1M的NaCl对蛋白酶进行梯度洗脱。使用含有NS3-特异性多克隆抗体的Western印迹法鉴定含有蛋白酶的组分，使用装备有Ym10膜的Amicon超滤器将其浓缩到3ml，并在用50mM钠磷酸pH值7.5、10％甘油、2mN二硫苏糖醇、0.1％CHAPS和1mM ESTA平衡的Superdex 75 HR26/60柱(Pharmacia)上进行层析，流速为1ml/分钟。将含有蛋白酶的组分合并，并在Mono-S HR5/5柱(Pharmacia)上进行层析，此柱使用与上柱相同的缓冲液平衡。使用0和0.5M的线性NaCl梯度从此柱中以纯化的形式洗脱蛋白酶。-80℃下将这些蛋白酶存储在50％甘油、0.5％CHAPS、10mM二硫苏糖醇和50mM磷酸钠pH7.5中。蛋白酶的产量为0.5mg/l细胞。纯化的蛋白质的催化活性为Kcat/Km＝120-200M-1S-1，此值是23℃下在50mMTris pH值7.5、50％甘油、2％CHAPS、30mM二硫苏糖醇中使用肽底物Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly(SEQ ID NO：7)(衍生于NS4A和NS4B的多蛋白的切割位点)测定的。使用HPLC分离由此反应产生的切割产物，通过质谱进行分离和鉴定，确定蛋白水解和切割发生在半胱氨酸和丙氨酸之间。测定活性必需的蛋白酶的浓度在100nM和1.6μM之间。
                 实施例2
在大肠杆菌中表达HCV NS3蛋白酶的方法
构建如图2A和2B中描述的质粒pT7-7(NS3 1039-1226)、pT7-7(NS31039-1206)、pT7-7(NS3 1027-1206)和pT7-7(NS31033-1206)，目的是在大肠杆菌中分别表达标号为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4和SEQ ID NO：5的多肽。这些蛋白片段含有HCV NS3蛋白质的蛋白酶域的变体。使用用于这种操作的公知的方法，将HCV cDNA的各个片段克隆到噬菌体T710启动子的下游和带有噬菌体T7基因10蛋白的第一个ATG密码子的读框中。含有NS3序列的pT7-7质粒也含有β-内酰胺酶基因，这种基因可以用作由这些质粒转化的大肠杆菌细胞的选择标记。
然后用这些质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE53)，这种菌株通常用于克隆到含有T7启动子的表达载体中的基因的高水平表达。在这种大肠杆菌菌株中，噬菌体(DE53携带整合到BL21细胞的染色体组上的T7聚合酶基因(5)。按照前述的方法通过向培养基中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导兴趣基因的表达(5)。在包含体部分中发现超过90％的使用上述一种质粒表达的不溶的形式的蛋白，使用本领域已知的折叠方法从这些包含体中可能获得可溶的活性蛋白(参见实施例6)。折叠方案通常使催化活性蛋白的产量发生变化，它们需要严格控制的条件，或者引起蛋白质的不可逆转的修饰(如在脲存在下的氨基甲酰化)，或者需要不实际的方法(如使用极度稀释的蛋白溶液，或者超大量样品的透析)。为了避免这些问题，已经发展了下文描述的用于以可溶的活性形式产生HCV蛋白酶的方法，这样就避免了再溶解：37℃下培养使用上述的一种质粒转化的大肠杆菌BL21(DE53)，直到在600nM时达到吸收率为0.8OD(OD代表光密度)的细胞密度。此时在15-20分钟内将温度降低到30℃，加入400μm的IPTG以便诱导蛋白质的表达。然后在20-30分钟内将温度降至22-24℃。在此温度下将此培养物振荡4小时。此时通过离心收获细胞，并且使用PBS洗涤。
                         纯化方法
将从以上操作中所获得的沉淀在冰上温育5分钟，悬浮在预先冷却到4℃的25mM磷酸钠pH值6.5、50％甘油、0.5％CHAPS、10mM二硫苏糖醇、1mM乙二胺四乙酸(缓冲液A)中。在每升细菌培养物中使用10ml这种缓冲液。在冰上另外温育5-10分钟后，使用弗氏细胞压碎器将细胞悬浮液匀浆。将所得的匀浆以120,000Xg离心。将离心获得的上清液保存在冰上，而沉淀重新悬浮在缓冲液A(每细菌培养物1ml)中。加入1mM MgCl2和DNaseI后，将悬浮液在20℃下温育10分钟，在120,000Xg下离心1小时。将第二次离心获得的上清液和第一次的上清液合并，将得到的溶液吸附在用25 mM磷酸钠pH值6.5、10％甘油、0.5％CHAPS、3mM二硫苏糖醇、1mM乙二胺四乙酸(缓冲液B)平衡的S-琼脂糖树脂(或SP-琼脂糖)树脂(Pharmacia)上。每升细菌培养物使用悬浮在5ml缓冲液B中的10ml树脂。4℃下将此树脂振荡1小时，经过滤收集，用缓冲液B洗涤，并加入到合适的色谱分离柱上。使用0和1M的NaCl梯度洗脱蛋白酶。使用Western印迹鉴定含有蛋白酶的组分，将这些组分合并，并使用Centriprep 10浓缩器(Amicon)将蛋白的浓度浓缩到6-10mg/ml，此值是使用BIORAD方法测定的。将3ml此溶液加入到HR 26/60 Superdex75，或者将20ml的溶液加入到HR 60/600 Superdex75(两种都为Pharmacia)柱上，所说的柱使用50mM磷酸钠pH值7.5、10％甘油、0.5％CHAPS、3mM二硫苏糖醇(缓冲液C)平衡，以1ml/分钟(HR26/60)或5ml/分钟(HR60/600)的流速进行层析。合并含有蛋白酶的组分，通过在缓冲液C平衡的HR 5/5 Mono S(Pharmacia)上的层析进一步纯化。使用0和0.5MNaCl梯度从此柱上洗脱蛋白酶。使用下列改良方法也可能纯化到均一程度：从S-琼脂糖上洗脱之后将含有蛋白酶的组分在缓冲液C中以1∶4稀释，并装载到肝素-琼脂糖上。使用0和0.5M NaCl梯度从此树脂上获得洗脱液。然后将蛋白质在羟基磷灰石或者如上所述的Superdex75上进行层析。每升细菌培养物中获得1-2mg的纯化蛋白。
                   纯化蛋白的特性
通过凝胶过滤、反相HPLC、质谱和N-末端序列分析来确定纯化蛋白的性质。
分析型凝胶过滤实验表明此蛋白是单体的。使用pT7-7表达的(NS31027-1206)蛋白质在反相HPLC色谱中显示出三个峰。质谱分析和N-末端序列的确定表明此分子的N-末端部分是异质的。发现三种形式的N-末端序列：
Met-Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr(形式1)
Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr(形式2)
Ser-Gln-Gln-Thr(形式3)
为了避免这种问题，采取了两种实验方案：
1.在100μg/ml的胰凝乳蛋白酶抑制剂存在下进行匀浆。此抑制剂不能抑制HCV蛋白酶活性，但能抑制胰凝乳蛋白酶类型的蛋白酶，特别是如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基。在此方法中可能纯化到单一的分子类型(形式2的含量超过95％)。
2.通过质粒pT7-7(NS3 1033-1206)产生相当于形式3的蛋白酶。在这种方法中可以纯化含有95％多的形式3的蛋白质。
                实施例3
      体外产生HCV NS3蛋白酶活性的方法
产生所说活性的化学和物理条件的限定
已经使用了纯化的蛋白酶催化肽Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly(SEQ ID NO：7)切割的能力来限定活性的最佳条件。通过经反相HPLC从水解产物中分离底物来检验切割。为此，将与蛋白酶一起温育的含有缓冲液和肽的混合物注射到反相Lichrospher RP-18柱(Merck)上，并用含有0.1％三氟乙酸的吲哚乙腈梯度液洗脱。通过与合适的标准物共注射并经质谱来鉴定切割产物。在这些实验中，使用了经实施例1和2描述的一种方法产生的蛋白质。
在含有50mM Tris pH值7.5、2％CHAPS、30mM二硫苏糖醇的缓冲液中确定活性对甘油浓度的依赖。将浓度不断增加的甘油加入到缓冲液中，并测量相对蛋白酶活性。图3显示出此实验的结果，表明50％(v/v)甘油是最佳水平。在下列实验中，甘油的浓度保持在50％不变，而CHAPS的浓度变化(图4)。在这种方法中发现2％CHAPS(w/v)的水平为最佳浓度。使用能够保持按照本发明的多肽的催化能力的其它去垢剂替代CHAPS是可能的。这些去垢剂的一部分是：庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷，癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷，癸基-β-D-麦芽葡萄糖苷，壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷，N-己基-β-D-吡喃葡萄糖苷，辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷，乙基苯基聚乙二醇，Tween-20。
在最佳的CHAPS和甘油浓度下，此蛋白酶在pH值为8.5时显示出最佳活性(图5)。然而，在此pH值下，其相当于时间的稳定性低于pH值为7.5时的稳定性。为了测定离子强度对活性的影响，使用NaCl进行滴定。此实验表明蛋白酶活性在高离子强度时受到抑制(图9)。对数据的动力学分析表明氯离子在浓度一直到100mM时是竞争性抑制剂。
这样可以限定纯化的HCV蛋白酶活性的体外测定的最佳条件：50mMTris pH值7.5、3-30mM二硫苏糖醇、2％CHAPS、50％甘油。通过Arrhenius方法分析活性对温度的依赖性，其中动力学常数Kcat的对数作为温度的反向函数给出。此图在大约25℃时中断，表明构象的变化与活性的降低同步。因此确定最适温度为大约22-23℃。
如上所述，蛋白质NS4A是HCV蛋白酶的辅因子。N和C-末端缺失实验限定了肽Pep4A具有SEQ ID NO：6中所表示的序列，为仍能诱导最佳激活的最小域区。在转染或者体外翻译实验中，加入含有最小NS4A序列的多肽对有效地切割是必要的。Pep4A的加入在上述的测定条件下能诱导纯化的蛋白酶活性的明显增加。下文描述了这种激活的动力学特征。使用滴定实验，在蛋白酶的浓度为300nM时确定这种相互作用1∶1的化学计量，表明Kd＜300nM。
确定活性测定的最佳底物浓度
为了确定其切割仍可以由上述的HPLC方法检测出的最小量底物，合成上述的肽Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly(SEQ ID NO：7)的衍生物，其N-和/或者C-末端缺失。在100nM-1.6μM蛋白酶存在下，在前面一章所限定的条件下，温育这些肽。下面使用的用作底物的肽的氨基酸残基的命名是由Schechter和Berger规定的(7)。这些残基被定义为Pn....P3、P2、P1、P1′、P2′、P3′....Pn′，其中水解键为P1-P1′(半胱氨酸和丙氨酸之间的键)。表1为此实验的动力学数据，P6和P3′或者P4′被限定为有效切割的底物的极限。在P6或者P3以外的缺失可以导致有效性的急剧下降，所说的有效性是以Kcat/Km′表示的，其表明哪个肽可以充当底物。P4′的缺失使Keat/Km′值的降低不十分明显，然而，底物和切割产物经HPLC的分离对于十肽P6-P4′来说明显好于九肽P6-P3′，因此十肽P6-P4′被确定为最佳的底物。
             表1：底物的特征
肽                             Km    Kcat    Kcat/Km
                              (μM)  (min-1)  (M-1s-1)(SEQ ID NO：7)Fmoc-                 53    0.5        143.0YQEFDEMEECASHLPYIEQG(SEQ ID NO：8)Ac-                   56    0.3        87.0YQEFDEMEECASHLPY(SEQ ID NO：9)Ac-YQEFDEMEECASHLP    95    0.4        70.2(SEQ ID NO：10)Ac-YQEFDEMEECASHL    117   0.4        51.0(SEQ ID NO：11)Ac-YQEFDEMEECASH     197   0.3        24.0(SEQ ID NO：12)Ac-YQEFDEMEECAS    ＞1500  -          11.1(SEQ ID NO：13)Ac-YQEFDEMEECA           没有切割(SEQ ID NO：14)Ac-DEMEECASHLPY      171   0.3        34.0(SEQ ID NO：15)Ac-EMEECASHLP        3137  0.3        2.0(SEQ ID NO：16)Ac-MEECASHL              没有切割(SEQ ID NO：17)Ac-ECASHLPYIEQG          没有切割(SEQ ID NO：18)Ac-DEMEECASHL        100   0.3        47(SEQ ID NO：19)DEMEECASHL         85    0.1    22.7(SEQ ID NO：20)Fmoc-DEMEECASHL    95    0.1    23.8
确定十肽P6-P4′(相当于其它两分子间的切割位点NS4B/5A和NS5A/5B)的动力学参数Km′、Kcat和Kcat/Km，将此数据与使用肽P6-P4′(相当于NS4A/4B位点)获得的数据比较(表2)。在Pep4A的化学计量浓度存在和不存在两种情况下，得到这些动力学参数。以此方式分析所得的动力学数据表明Pep4A普遍影响Kcat。当比较单一底物的Km值时，在P5和P6中存在的两个负电荷决定了肽底物结合的有效性。事实上，相当于在P6和P5位置上带有天冬氨酸或者谷氨酸残基的位点NS4A/4B和NS5A/5B的十肽具有相似的Km值，此值明显低于相当于在P6位置上带有单一电荷的位点NS4B/5A的肽的Km值。
表2：相当于反式(in trans)切割位点的肽的活性
                               Km   Kcat   kcar/Km
                              (μM) (min-1)(M-1s-1)
NS4A/4B(SEQ ID NO：18)Ac-DEMEECASHL    100    0.3     47.0(SEQ IDNO：6)+pep4A             43     1.4     540
NS4B/5A(SEQ ID NO：21)Ac-DCSTPCSGSW    2100   0.05    0.4(SEQ ID NO：6)+pep4A            320    0.8     4.2
NS5A/NS5B(SEQ ID NO：22)Ac-EDVVCCSMSY    310    4.2     220(SEQ ID NO：6)+pep4A            380    15      650
通过将每一种氨基酸一个一个地突变成丙氨酸，然后确定这样获得的突变肽的动力学参数来进一步研究序列P6-P4′(相当于切割位点NS4A/4B)的单一残基的相对重要性。表3描述了这些结果。此实验确定了有效切割的单一残基的重要性大小：P1＞＞P3＝P5＝P6＞P2＝P4。P′部分的改变对切割率没有明显的影响。使用此信息开发蛋白酶活性测定法，这种方法对确定抑制剂是有用的。这些方法描述如下。
      表3.用丙氨酸代替肽底物的残基P6-P4′肽                               Km   Kcat   Kcat/Km
                           (μM) (min-1)(M-1s-1)(SEQ ID NO：18)Ac-DEMEECASHL    100    0.3    47.0(SEQ ID NO：23)Ac-AEMEECASHL    150    0.1    9.4(SEQ ID NO：24)Ac-DAMEECASHL    527    0.3    9.3(SEQ ID NO：25)Ac-DEAEECASHL    114    0.1    18.1(SEQ ID NO：26)Ac-DEMAECASHL    322    0.1    7.2(SEQ ID NO：27)Ac-DEMEACASHL    132    0.1    18.4(SEQ ID NO：28)Ac-DEMEEAASHL        没有切割(SEQ ID NO：29)Ac-DEMEECAAHL    129    0.2    32.5(SEQ ID NO：30)Ac-DEMEECASAL    180    0.3    33.4(SEQ ID NO：31)Ac-DEMEECASHA    94     0.1    23.2
为了更详细地确定P6和P1′位置上的残基的重要性，合成一系列在这些位置上引入突变的肽P6-P4′。表4列出了这些实验的结果。这些实验的结果强调了在P6上负电荷的重要性。事实上，在此位置上接受天冬氨酸或者谷氨酸，Km没有发生明显的变化。通过引入天冬酰胺来中和电荷可以使Km′明显增加，而通过引入赖氨酸残基来转化电荷可以使Kn更明显地增加。
       表4.肽底物上的P6和P1′残基的取代
     肽                        Km   Kcat   Kcat/Km
                              (μM) (min-1) (M-1s-1)
(SEQ ID NO：18)Ac-DEMEECASHL   100   0.3      47.0
(SEQ ID NO：32)Ac-EEMEECASHL   85    0.2      32.0
(SEQ ID NO：33)Ac-NEMEECASHL   427   0.2      7.7
(SEQ ID NO：34)Ac-KEMEECASHL ＞1000   -       3.1
(SEQ ID NO：35)Ac-DEMEECSSHL                  27.2
(SEQ ID NO：36)Ac-DEMEECFSHL                  1.1
在P1′位置上由丝氨酸代替丙氨酸没有任何重要的作用，而用苯丙氨酸替代可以使所得的底物的切割率降低(以Kcat/Km测量)。
如表5所述，分析位置P1的一系列突变。在这个位置上以苏氨酸、烯丙基甘氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸以及缬氨酸代替半胱氨酸可以接受，尽管可以有效地切割所得的底物(以Kcat/Km表示，其明显低于非修饰的底物的Kcat/Km)。
表5.肽底物残基P1的替代肽底物                          Kcat/Km(M-1s-1)(SEQ ID NO：18)Ac-DEMEECASHL         47.0(SEQ ID NO：37)Ac-DEMEEAlgASHL       4.3(SEQ ID NO：38)Ac-DEMEEAbuASHL       1.2(SEQ ID NO：39)Ac-DEMEETASHL         0.6(SEQ ID NO：40)Ac-DEMEENvaASHL       0.08(SEQ ID NO：41)Ac-DEMEEVASHL         0.05
Alg，烯丙基甘氨酸；Abu，α-氨基丁酸；Nva，正缬氨酸
这些有关底物特性的信息可以用于开发酶测定法和合成以修饰的底物序列为基础的抑制剂。例如，P1残基改变的底物肽是抑制常数在350-90μM之间的蛋白酶的竞争性抑制剂(表6)。可以通过引入乙醛、三氟甲基酮、二氟亚甲基酮、二酮、酮酯、酮酰胺或α-杂环酮酸、硼酸和甲基酮基团来进一步修饰这些肽，以便增加它们的抑制能力。有关特异性的信息也使得能够合成不基于这些肽的抑制剂：卤素-内酯，异香豆素、β-内酰胺、丁二酰亚胺、吡喃酮、苯并噁嗪酮、苯并异噻唑啉或潜在的异氰酸酯。
   表6.在位置P1修饰的十肽P6-P4′的抑制作用
残基P1    Ki(μM)    Km(μM)
Cys         -         90
Abu        175        189
Alg        165        179
Tbr        215        180
Vai        173        不确定
Ala        173        没有切割
Ser        90         没有切割
Gly        191        没有切割
Pro        440        没有切割
Cha        350        没有切割
Abu：α-氨基丁酸；Alg：烯丙基甘氨酸；Cha：环己基丙氨酸
             实施例4
体外蛋白酶活性用于抑制剂研究的方法使用酰胺底物进行自动分析
通过具有下列动力学参数的NS3蛋白酶肽切割由切割位点NS4A/NS4B衍生的肽Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys-ε-(3H)Ac，(SEQ ID NO：47)：Km＝79μM，Kcat＝0.49min-1，Kcat/Km＝103M-1s-1。在23℃下将400,000cpm的具有2-10Ci/mmol特异活性的标记肽和未标记的肽在200nM蛋白酶和1μM的Pep4A存在下于50mM Tris pH值7.5、50％甘油、3％CHAPS、10mM二硫苏糖醇中温育3小时。在此期间有20％的肽底物被切割了。可以通过以下描述和图7总结的方法计算出所切割的底物。从此图中可以看出，使化合物与TSK-DEAE阴离子交换剂接触。将从交换剂出来的组分过滤，使组分沉淀或者自旋。测量清晰的组分中的放射性，假设酰胺底物和左边片段仍然与阴离子交换器结合的话，放射性的量与诱变片段(C-末端)绝对相关。抑制因子的加入使标记的切割片段释放速率降低。抑制因子的效率越高，测量到的从阴离子交换剂出来的组分的放射性就越低。
                          实施例5depsipeptide底物S1：Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-ψ[COO]-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(Nε-Ac)-NH2(SEO ID NO：8)的合成
使用连续流动Fmoc-聚酰胺方法在固相上进行彻底的合成(9)。保护基团的组合为用于α-氨基基团的Nα-Fmocα不稳定的碱和用于保护侧链的不稳定的酸：Asp(Ot-Bu)、Glu(Ot-Bu)、Tyr(t-Bu)和His(trt)。使用的聚合物是来自修饰的Rink酰胺接头(10)的复合的硅藻土聚酰胺(9)，p-[(R，S)-a-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰胺1-2，4-二甲氧基苯甲基]-苯氧基乙酸(11)(NovaSyn(KR125，0.1mmol/g)。从商业途径可以得到高等级的树脂、氨基酸衍生物、激活剂和所有其它试剂。按照在图8中所给出的方案进行合成。用超过树脂游离氨基基团的5倍量的激活的氨基酸进行偶合，在藕合中，除了使用L-(+)-乳酸(其中使用了Fmoc-氨基酸/DIPC/HOBt(1∶1∶1∶2)激活)以外，还使用了Fmoc-氨基酸/PyBOP/HOBt/DIEA(1∶1∶1∶2)。在DMAP(催化量为0.1当量)存在下，使用对称的酸酐(Fmoc-Abu)2O将Abu酯化成乳酸的游离羟基，反应在室温下进行30分钟(12)，为获得90％的产量，反应重复两次；在没有催化剂的情况下，余下的游离羟基在后面的合成操作中是不反应的。在这种流程的最后，使用DMF、甲醇、CH2Cl2洗涤树脂，然后在真空中干燥16小时，在室温下使用TFE/水/三异丙基硅烷(92.5∶5∶2.5)处理干燥的肽-树脂1.5小时；过滤树脂，并用冷的甲基t-Bu醚沉淀出肽；把沉淀重新溶解在含有0.1％TFA的50％水/吲哚乙腈中，并冷冻干燥。
通过制备型HPLC在Nucleosyl C-18柱(250×21mm，7μM)上使用洗脱液(A)水和(B)带有0.1％TFA的吲哚乙腈，进行梯度洗脱步骤(22％B，5分钟；然后是22-27％B，25分钟；流速为12毫升/分钟)完成均匀度超过98％的纯化。在这些条件下，所说的肽在21.9分钟时洗脱出来。将含有纯物质的组分合并，冷冻干燥，得到35％的产量。
                  实施例6
Desi-peptide底物的S2：Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Thr-ψ-[COO]-Ala-
Ser-His-Leu-pro-Tyr-Lys(Nε-Ac)-NH2(SEQ ID NO：43)的化学合成
如前面实施例的描述进行合成。将苏氨酸酯化成乳酸要求三个重复以便获得70％的产量，此过程伴随苏氨酸残基的3％消旋。然而，通过层析方法可以将D-苏氨酸非对映异构体与L-异构体充分分离，并可以通过制备型HPLC很容易地分离。所有的梯度为21％B，5分钟；然后是21-22％B，20分钟；这样所需要的肽在19.7分钟时洗脱下来，产量为24％。
                     实施例7
放射性Desi-peptide底物的S1：Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-ψ-
[COO]-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(Nε-[3H]-CH3CO)-NH2
                (SEQ ID NO：44)的合成
为了在C-末端赖氨酸的Nε-氨基基团上对S1进行选择性标记，按照图10的方案，将保护的前体Ac-Asp(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-Met-Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-Abu-ψ[COO]-Ala-Ser(t-Bu)-His(Trt)-Leu-Pro-Tyr(t-Bu)-Lys-CONH2装载到树脂上。关于(Nε-Ac)-S1合成仅有的变化是使用了Fmoc-Lys(Alloc)-OH代替Fmoc-Lys(Nε-Ac)-OH。Alloc保护与以Fmoc和t-Bu为基础的保护基团正交，通过使用(0)PdP[(Ph3)4]在含有5％乙酸和2.5％N-甲基吗啉的CHCl3溶液中处理2小时而除去。
室温下将干燥的肽-树脂(0.07mmol/g，60mg)与[3H]乙酐(25mCi，5.7mCi/mmol)反应16小时。然后使用10倍多的非放射性乙酐来完成反应。然后用DMF洗涤此树脂，并如上所述进行处理。通过制备型HPLC，获得比活性为0.68mCi/mmol的98％纯肽：Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-ψ-[COO]-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(Nε-[3H]-CH3CO)-NH2。
使用以HPLC为基础的测定，获得放射性depsipeptide底物S1(SEQ IDNO：44)的下列动力学参数：
Kcat(min-1)＝9
Km(μM)＝11
Kcat/Km(M-1s-1)＝13.636
使用同样的测定方法，获得放射性底物S2的动力学参数：
Kcat(min-1)＝16
Km(μM)＝96
Kcat/Km(M-1s-1)＝2.780
合成放射性depsipeptide底物使得建立了一种如图11图解所示的用于确定NS3蛋白酶活性的高流通量测定方法。原理如下：完整的底物和来源于酶切割的N-末端片段(Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-OH)是强酸，而C-末端片段[HO-CH(CH3)CO-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(Nε-[3H]-CH3CO)-NH2]是中性或碱性的。因此可能在阴离子交换树脂上获得两种酸性片段，而将C-末端片段留在溶液中。如果C-末端片段含有放射性标记(此时含氚的醋酸盐与C-末端赖氨酸的ε-氨基基团共价结合)，此树脂能够将加工过的底物与未加工过的底物区分开，这样与所说的酶温育并以离子交换剂处理后，可能通过测量留在溶液中的放射性的量来定量蛋白水解活性。全部过程实质上与基于实施例4的酰胺底物的高流通量测定相同，只是所用的pH值是7.0，而不是7.5，目的是使所说的酯键的自发水解降低到最小(23℃时为0.6％/小时)。
                       实施例8
depsipeptide底物S3和S4：Ac-Asp-Glu-Asp-(EDANS)-Glu-Glu-Abu-ψ[COO]-Ala-Ser-Lys-(DABCYL)NH2(SEQ ID NO：45)和Ac-Asp-Asp-
(EDANS)-Met-Glu-Glu-Abu-ψ[COO]-Ala-Ser-ys(DABCYL)NH2
                 (SEQ ID NO：46)的合成
两个底物S3和S4的化学式如图11所示。使用按照已知的方法(16-17)制备的两个特异的衍生物Fmoc-Asp(EDANS)-OH和Fmoc-Lys(DABCYL)-OH如图13用于S3(SEQ ID NO：45)的详细描述在固相上合成。除了使用L-(+)-乳酸(其中使用了Fmoc-氨基酸/DIPC/HOBt(1∶1∶1∶2)激活)以外，还使用了Fmoc-氨基酸/PyBOP/HOBt/DIEA(1∶1∶1∶2)，用超过树脂游离氨基基团5倍量的激活的氨基酸进行所有的偶合(包括Asp(EDANS)和Lys(DABCYL))。在催化量的DMAP(0-1当量)存在下，使用对称的酸酐(Fmoc-Abu)2O将Abu酯化成乳酸的游离羟基，反应在室温下进行30分钟(12)：为获得92％的产量，反应重复两次。在制备结束后，洗涤肽-树脂，并按照用于底物S1的描述将肽进行切割。
通过制备型HPLC在Nucleosyl C-18柱(250×21mm，7μM)上使用洗脱液(A)50mM乙酸铵(pH6)和(B)吲哚乙腈完成均匀度超过98％的纯化。用于S3和S4的梯度洗脱是20％B，5分钟；然后是20-40％B，20分钟；流速为20毫升/分钟；将含有纯物质的组分合并，冷冻干燥，得到分别为45％和35％的S3和S4。通过以HPLC为基础的测定得到的此底物的动力参数如下：
Kcat(min-1)＝3.51
Km(μM)＝10.95
Kcat/Km(M-ls-l)＝5342
用于此测定的缓冲液如下：33mM二硫苏糖醇、50mM Tris(pH值7)，50％甘油、2KCHAPS。在pH7.0下进行温育，以便使酯键自发水解降低到最小程度。在试管或(96孔)微量滴定板中进行测定，监测荧光随时间的变化(激发波长为355nM，发射波长为495nM)。底物切割的荧光的增加为13倍。如图14B所示反应是线性的(底物浓度保持2μM不变)。在高流通量测定中检测限确定为1nM，在HPLC-为基础的测定中检测限为520pM。如果进行连续的测定(试管)以便建立酶促反应的最初速率，酶浓度的下限为80nM，因为切割的底物在底物浓度高于10μM时发生荧光淬火。
                        保存物
将由质粒pBac(1039-1226)、pT7-7(1039-1226)、pT7-7(1039-1206)、pT7-7(1027-1206)和pT7-7(1033-1206)转化的大肠杆菌菌株(分别编码具有下列序列的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)在1995年8月14日保藏在国立工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB)(Aberdeen，苏格兰，英国)，保藏号为NCIMB40761、NCIMB 40762、NCIMB 40763、NCIMB 40764和NCIMB40765。
                   参考文献
1. Chambers，T.J：等1990，黄热病毒的非结构蛋白质NS3的N-末端区是丝氨酸蛋白酶(其作用是在病毒的多蛋白上进行定点切割)的证据，美国科学院学报87，8898-8902。
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3. Luckow，V.A.，用于表达人类基因产物的杆状病毒系统，(1993)当代生物技术4,564-572。
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6. Thatcher和Hitchcock，生物技术中的蛋白质折叠，蛋白质折叠机制(R.H.Pain编辑)，226-263，IRL出版社，牛津，纽约，东京，(1994)。
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11. Bernatowicz，M.S.，Daniels，S.B.和Koster，H.(1989)四面体通讯30，4645。
12. Atherton，E.和Sheppard，R.C.(1989)固相肽合成，实用方法，IRL出版社，牛津Oxford。
13. Matayoshi，E.D.，Wang，G.T.，Krafft，G.A.，和Erickson，J.，(1990)科学247，954。
14. Maggiora，LL，Smith，C.W.和Zhang，Z.Y.(1992)医药化学杂志35，3727。
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16. Andreae，F.，Sommergruber，W.，Gauss-Muller，V.，Schultheis，T.和Ahorn，H.(1994)有关固相合成的进展和展望，R.Epton编辑，Mayflower国际有限公司，伯明翰，英国，PP.433-436。
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19. Holskin，B.P.，Bukhtiyarova，M.，Dunn，B.M.，Baur，P.，J.deChastonay和Pennington，M.W.(1995)生物化学年鉴226，148。
                  本文所用的缩写和符号
Abu＝2-氨基丁酸；CHAPS＝3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸；DABCYL＝4-[[4′-二甲基氨基苯]偶氮]苯甲酸；Depsipeptide是一种肽，其中至少有一个肽键由相应的酯键代替(分子中酯键的位置通常指定为ψ[COO]，位于两个相关的氨基酸残基之间)；DIEA＝N，N-二异丙基乙胺；DIPC＝N，N′-二异丙基碳化二亚胺；DMAP＝4-二甲基氨基吡啶；DMF＝N，N-二甲基甲酰胺；DTT＝二硫苏糖醇；EDANS＝5-[(2′-氨乙基)氨基]萘-磺酸；EDTA＝乙二氨四乙酸；HOBt＝N-氢氧基苯并三唑；HPLC＝高效液相色谱；PyBOP＝苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐；RET共振能量转移；t-Bu＝叔丁基；TFA＝三氟乙酸；Trt(Trityl)＝三苯甲基。
                序列表
               一般信息
(i)申请人：ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA
     MOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.
      (ii)发明题目：产生和纯化并测定具有HCV
     NS3蛋白酶的蛋白水解活性多肽的方法
(iii)序列数：47
(iv)通讯地址：
    (A)地址：Societa Italiana Brevetti
    (B)街道：Piazza di Pietra，39
    (C)城市：罗马
    (D)国家：意大利
    (E)邮区代码：1-00186
(v)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘3.5″1.44MB
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS Rev.6.22
    (D)软件：微软Word 6.4
(viii)律师信息
    (A)姓名：DI CERBO，Mario(Dr.)
    (C)证书号：RM/X88568/PC-DC
(ix)电讯信息
    (A)电话：06/6785941
    (B)传真：06/6794692
    (C)电报：612287 ROPAT(1)SEQ ID NO：1信息：
(i) 序列特征
    (A)长度：191个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性(ix)特征：(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys1                 5                  10                  15Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser
         20                  25                  30Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly
    35                  40                  45Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met
50                   55                  60Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly65                  70                  75                  80Ala Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu
             85                  90                  95Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser
        100                 105                 110Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser
    115                 120                 125Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe
130                 135                 140Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Val145                 150                 155                 160Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp
            165                 170                 175Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala Leu
        180                 185                 190(2)SEQ ID NO：2信息：
(i)序列特征
    (A)长度：195个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Arg Ile Arg Ala Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr1                 5                  10                  15Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr
         20                  25                  30
                                24Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr
     35                  40                  45Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro
 50                  55                  60Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln65                  70                  75                  80Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser
             85                  90                  95Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg
        100                 105                 110Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr
    115                 120                 125Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala
130                 135                 140Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala145                 150                 155                 160Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro
            165                 170                 175Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln
        180                 185                 190Val Ala Leu
    195(3)SEQ ID NO：3信息：
(i)序列特征
    (A)长度：174个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ala Arg Ile Arg Ala Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr1                 5                  10                  15Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr
         20                  25                  30Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr
     35                  40                  45Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro
 50                  55                  60Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln65                  70                  75                  80Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser
             85                  90                  95Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg
        100                 105                 110Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr
    115                 120                 125Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala
130                 135                 140Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala145                 150                 155                 160Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg
            165                 170(4)SEQ ID NO：4信息：
(i) 序列特征
    (A)长度：181个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly1                 5                  10                  15Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
         20                  25                  30Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys
     35                  40                  45Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr
 50                  55                  60Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp65                  70                  75                  80Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr
             85                  90                  95Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
        100                 105                 110Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
130                 135                 140Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys145                 150                 155                 160Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met
            165                 170                  175Glu Thr Thr Met Arg
        180(5)SEQ ID NO：5信息：
(i)序列特征
    (A)长度：174个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr1                 5                  10                  15Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr
         20                  25                  30Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr
     35                  40                  45Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro
 50                  55                  60Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln65                  70                  75                  80Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Sar Ser
             85                  90                  95Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg
        100                 105                 l10Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr
    115                 120                 125Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala
130                 135                 140Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala145                 150                 155                 160Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg
            165                 170(6)SEQ ID NO：6信息：
(i)序列特征
    (A)长度：14个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg1                5                  10(7)信息SEQ ID NO：7：
(i)序列特征
   (A)长度：20个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Fmoc-Tyr
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr1                5                  10                  15Ile Glu Gln Gly
        20(8)SEQ ID NO：8信息：
(i)序列特征
   (A)长度：16个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Tyr
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu pro Tyr1                5                  10                  15(9)SEQ ID NO：9信息：
(i)序列特征
   (A)长度：15个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Tyr
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro1                 5                  10                  15(10)SEQ ID NO：10信息：
(i)序列特征
   (A)长度：14个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Tyr
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu MetGlu Glu Cys Ala Ser His Leu1                5                 10(11)信息SEQ ID NO：11：
(i)序列特征
    (A)长度：13个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Tyr(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala ser His1                 5                  10(12)SEQ ID NO：12信息：
(i)序列特征
    (A)长度：12个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Tyr
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser1                 5                  10(13)SEQ ID NO：13信息：
(i)序列特征
   (A)长度：11个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Tyr
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala1                 5                  10(14)SEQ ID NO：14信息：
(i)序列特征
    (A)长度：12个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr1                 5                  10(15)SEQ ID NO：15信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Glu
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Xaa MeC Glu Glu Cys Ala Ser His Leu pro1                 5                  10(16)SEQ IDNO：16信息：
(i)序列特征
    (A)长度：8个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Met
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Xaa Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5(17)SEQ ID NO：17信息：
(i)序列特征
   (A)长度：12个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Glu
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Xaa Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gin Gly1                 5                  10(18)SEQ ID NO：18信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(19)SEQ ID NO：19信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：
     (D)另外信息：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(20)SEQ ID NO：20信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Fmoc-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1             5                      10(21)SEQ ID NO：21信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Xaa Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Val1                 5                  10(22)SEQ ID NO：22信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Glu
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：Xaa Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr1                 5                  10(23)SEQ ID NO：23信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Ala
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(24)SEQ ID NO：24信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Xaa Ala Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(25)SEQ ID NO：25信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Xaa Glu Ala Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(26)SEQ ID NO：26信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Xaa Glu Met Ala Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(27)SEQ ID NO：27信息：
(I)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：singlz-
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：Xaa Glu Met Glu Ala Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(28)SEQ ID NO：28信息：
(i)序列特征
    (A)长度：10个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Xaa Glu Met Glu Glu Ala Ala Ser His Leu1                 5                  10(29)SEQ ID NO：29信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ala His Leul                 5                  10(30)SEQ ID NO：30信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser Ala Leu1                 5                  10(31)SEQ IDNO：31信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽(B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Ala1                 5                  10(32)SEQ ID NO：32信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Glu
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(33)SEQ ID NO：33信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asn
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(34)SEQ ID NO：34信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Lys
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu1                 5                  10(35)SEQ ID NO：35信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ser Ser His Leu1                 5                  10(36)SEQ ID NO：36信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：Xaa Glu Met Glu Glu Cys Phe Ser His Leu1                 5                  10(37)SEQ ID NO：37信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是Alg
     (alylglycine)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His Leu1                 5                  10(38)SEQ ID NO：38信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是Abu(α-环己基丙氨酸)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His Leu1                 5                  10(39)SEQ ID NO：39信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：Xaa Glu Met Glu Glu Thr Ala Ser His Leu1                 5                  10(40)SEQ ID NO：40信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是Nva(正缬氨酸)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His Leu1                 5                  10(41)SEQ ID NO：41信息：
(i)序列特征
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：Xaa Glu Met Glu Glu Val Ala Ser His Leu1                 5                  10(42)SEQ ID NO：42：
(i)序列特征
    (A)长度：13个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：1
    (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：6
    (D)另外信息：Xaa是结合到后面残基的Abu(2-环己基丙氨酸)酯
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：7
    (D)另外信息：Xaa是结合到邻近的前面残基的Ala酯
(ix)特征：
    (A)名称：肽
    (B)位置：13
    (D)另外信息：Xaa是Lys(Nε-Ac)-NH2
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro Tyr Xaa1                 5                  10(43)SEQ ID NO：43：
(i)序列特征
   (A)长度：13个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近后面的残基上的Thr酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：7
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近前面残基上的Ala酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：13
   (D)另外信息：Xaa是Lys(Nε-Ac)-NH2
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro Tyr Xaa1                 5                  10(44)SEQ ID NO：44信息：
(i)序列特征
   (A)长度：13个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近的后面残基上的Abu(2-环己基丙氨酸)酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：7
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近的后面残基上的Ala酯(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：13
   (D)另外信息：Xaa是Lys(Nε-[3H])CH3CO)-NH2(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro Tyr Xaa1                 5                  10(45)SEQ IDNO：45信息：
(i)序列特征
   (A)长度：9个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：3
   (D)另外信息：Xaa是Asp(EDANS)
(ix)  特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近残基上的Abu(2-环己基丙氨酸)酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：7
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近前面残基上的Ala酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：9
   (D)另外信息：Xaa是Lys(DABCYL)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：Xaa Glu Xaa Glu Glu Xaa Xaa Ser Xaa1                 5(46)SEQ ID NO：46信息：
(i)序列特征
   (A)长度：9个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：2
   (D)另外信息：Xaa是Asp(EDANS)
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：6
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近残基上的Abu(2-环己基丙氨酸)酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：7
   (D)另外信息：Xaa是结合到邻近前面残基上的Ala酯
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：9
   (D)另外信息：Xaa是Lys(DABCYL)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：Xaa Xaa Met Glu Glu Xaa Xaa Ser Xaa1                 5(47)SEQ ID NO：47信息：
(i)序列特征
   (A)长度：13个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：1
   (D)另外信息：Xaa是Ac-Asp
(ix)特征：
   (A)名称：肽
   (B)位置：13
   (D)另外信息：Xaa是Lys-ε-(3H)Ac
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：xaa Glu Met Glu Glu cys Ala ser His Leu Pro Tyr xaa1                 5                  10

Claims (10)

1.分离的多肽，其特征在于它们由选自下组的氨基酸序列组成，这些氨基酸序列包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4和SEQ ID NO：5，并且其特征还在于它们具有HCV病毒NS3蛋白质的蛋白水解活性。
2.用于在宿主细胞中产生按照权利要求1的一种多肽的表达载体，这种表达载体包含：
-编码一种所说的多肽的多核苷酸；
-在所说的宿主有机体中可操作地与所说的多核苷酸结合的功能性调节、转录以及翻译序列；和
-可有可无的选择性标记。
3.使用按照权利要求2的表达载体转化的真核或原核宿主细胞，这种细胞能够表达由所选择的多核苷酸序列编码的特定多肽。
4.一种制备按照权利要求1的一种多肽的方法，其特征在于其包括下列操作(这些操作作为一个整体)：
-使用含有DNA序列的表达载体转化真核或者原核宿主细胞，所说的DNA序列编码选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的多肽；
-表达所需要的DNA序列以便产生所选择的多肽；和
-纯化如此获得的多肽，避免其重新溶解。
5.多肽，其特征在于它们由选自SEQ ID NOS：7-12、14、18-20、29-32、35和47所示的序列的氨基酸序列组成，其特征还在于它们在具有HCV NS3蛋白水解活性的多肽的体外活性的高流通量测定中可以用作为底物。
6.Depsipeptides，其特征在于它们由选自SEQ ID NOS：42-46所示的序列的氨基酸序列组成，其特征还在于它们在具有HCV NS3蛋白水解活性的多肽的体外活性的高流通量测定中可以用作为底物。
7.一种用于再现和有效地测定体外HCV NS3蛋白质的蛋白水解活性的方法，其特征在于在20和25℃之间的温度下，在含有30-70mM Tris pH6.5-8.5、3-30mM二硫苏糖醇、0.5-3％3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸和30-70％甘油的溶液中使用权利要求5的肽或权利要求6的depsipeptides作为底物，在高流通量测定中再现和试验按照权利要求1的多肽的活性。
8.按照权利要求7的用于体外再现和有效测定HCV NS3的蛋白水解活性的方法，其中在高流通量测定中，在按照权利要求1的多肽浓度在100和200 nM之间时使用权利要求5的多肽。
9.按照权利要求7的用于体外再现和有效地测定HCV NS3的蛋白水解活性的方法，其中在高流通量测定中，在按照权利要求1的多肽浓度在0.5和2nM之间时使用权利要求6的depsipeptides。
10.按照权利要求9的用于体外再现和有效地测定HCV NS3的蛋白水解活性的方法，其中通过使用选自SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示的序列的depsipeptides作为底物对权利要求1的多肽的蛋白水解活性进行连续的监测，所说的底物在荧光供体5-[(2’-氨乙基)氨基]萘-磺酸(EDANS)(靠近depsipeptide的一端)和受体基团4-[[4′-二甲氨苯基]偶氮]苯甲酸(DABCYL)(靠近depsipeptide的另一端)之间通过“共振能转移”具有内部荧光淬火。
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