CN1238011A - 口蹄疫病毒的免疫原性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于具有至少8个氨基酸的序列的肽的FMDV疫苗以及它们的制备和应用，该序列相应于FMDV非结构蛋白区的部分序列，它是通过与FMDV特异性抗体的免疫反应性或通过与FMDV特异性T淋巴细胞的免疫反应性而筛选出来的。

Description

口蹄疫病毒的免疫原性肽
本发明涉及具有至少8个氨基酸的免疫原性肽，它位于口蹄疫病毒(FMDV)的非结构区。
口蹄疫(FMD)是一种急性传染病，它发生于最重要的产牛奶和肉的动物中-牛、猪、山羊和绵羊。
该病的病原是细小RNA病毒，口蹄疫病毒(FMDV)。它是RNA病毒，具有为正链极性的长8.5kb的单链RNA，可以各种具有大量亚型的血清型存在。从一种血清型的感染中康复的动物仍旧对另一血清型的感染非常易感。
通过呼吸道感染后，病毒的初级复制是在咽部。然后感染邻近的淋巴结并且FMDV进入血流。通过血流，病毒扩散到各种器官和组织中。感染后2-14天出现临床症状，这依赖于病毒量，病毒株和感染途径。在不太严重的病例中，14天后感染被消除。在较年长动物中的FMDV感染很少有致死的结局，但是对它们的生殖力，生长和健康有很大的影响。再者，虽然有高的抗体滴度，但是有可能健康动物能分泌FMDV并因此感染其它动物。暴露于感染病毒的接种动物也是可疑的，这些动物也可以持久保持被感染的状态，但不表现出临床症状。这些动物，尽管携带FMDV但被承认为健康的动物，被称为“携带者”并在FMDV的进一步传播中是严重的危险者。直到感染后1个月从猪中分离病毒才是可能的(Van Bekkum；1973)，而在牛中甚至数年之后才是可能的(Hedger,1970)。
病毒颗粒的囊膜包括每种60拷贝的包绕单链RNA的4种结构蛋白1A-1D(Rueckert,1990)。衣壳未被包被(coated)并具有二十面体的外形。蛋白质1B-1D部分位于表面，而蛋白质1A(P1A)则位于衣壳内部。
由基因组N末端编码的蛋白质1A-1D是结构蛋白并形成二十面体衣壳。非结构蛋白质2A-2C和3A是C末端编码的并且负责病毒复制。
由于病毒易于传播，具有感染许多种动物的能力以及多种抗原形式使得难以控制FMD。
一直到1992年在德国用抗亚型O,A和C的三价灭活疫苗来进行抗FMD的疫苗接种。这些疫苗包括灭活的病毒，然而它们是热不稳定的并且不能保证任何长期的免疫力(Terpstra等，1989)。来自疫苗的危险首先在于灭活疫苗中存在未被灭活的病毒以及病毒从每个疫苗接种部位释放出来(Beck等，1987)。
在欧洲联盟(European Union)(EU)中，贸易管制适用于能检测出抗FMDV抗体的动物。它适用于可能幸存于感染的动物，以及用常规灭活疫苗免疫的动物。
为此，从那时起进行了更多的努力以开发抗FMDV的更好疫苗。获得具有更长半衰期，更高活性和更大安全性的疫苗是所期望的。另一优势将是那些使区分疫苗接种的和感染的动物成为可能的疫苗和方法。
在具有特异表位的疫苗的开发中，有三件事尤其必须纳入考虑：
1．病原蛋白的多形性尤其发生于参与免疫反应的蛋白质部分。RNA病毒(“准种”)尤其包含具有极高度序列可变性的区域。
2．尤其在T细胞免疫反应的情况下，宿主的每个个体之间存在高度可变性。因此，T辅助细胞只有与特异的MHC-Ⅱ分子才能识别特异的抗原肽(Schwartz,1985)。每个个体表达它自己的一套MHC分子，这些分子由具有高度等位基因变异(MHC多形性)的基因编码。因此T细胞对肽的反应可具有个体差异。
3．T细胞展现出高度异质性的效应细胞机制，然而从总体上又都与MHC限制有关(Mosmann等，1989)。对于牛FMDV来说，迄今为止只有可能证实MHC-Ⅱ限制的T辅助细胞功能(Glass等，1989,Glass等，1990；Glass等，1992；Collen等，1991)。
为了制备肽疫苗，必须首先知道病原体的免疫原区，即病原体中被自然宿主的免疫系统，即牛和猪的B或T淋巴细胞，识别的部位。对此迄今为止仍不了解。
现在已经发现根据具有至少8个氨基酸的序列的肽可以制备FMDV疫苗，该序列对应于FMDV非结构蛋白区的部分序列，它是通过用FMDV特异性抗体的免疫反应性或用FMDV特异性T淋巴细胞的免疫反应性而筛选出来的。
优选这样的肽包括8-35个氨基酸，尤其优选8-25个氨基酸，特别特别优选8-15个氨基酸。
为了制备猪的FMDV疫苗，这样的肽必须对应于FMDV基因组中编码蛋白质L/L′,1A,1B,1C,2B,2C,3A,3B,3C和3D的区域部分。
为了制备牛的FMDV疫苗，这样的肽必须对应于FMDV基因组中编码1D,2B,2C,3A和3B的区域部分。
因此尤其优选对应于FMDV基因组中编码2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D的区域部分的肽。
序列表中提及的肽可在此专门提及。
尤其强调序列表中提及的具有以下ID号的肽：6,8,10,12,15,16,17,18,19,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,34,35,36,37,38,39,43,44,45,48。
另外尤其强调具有ID号12,13,14,22,33,37,40,41,42,45,46,47的肽。
特别特别强调具有ID号：12,37,40,42,45,47,48的肽。
包含这些肽的制品可用于抗口蹄疫病毒的保护性免疫接种，也可用于检测FMDV的感染，即用于诊断。
正如以上所述，根据本发明的肽在亚区(subregions)上对应于FMDV的非结构蛋白。这些区域的测定包括用FMD特异性抗体的免疫反应性或用FMDV特异性T淋巴细胞的免疫反应性的方法。
在该上下文中免疫反应性被理解为与FMDV特异性抗体的反应性。在这种情况下反应的检测方法包括通过包括颜色反应的酶免疫试验来测定FMDV特异性抗体与固相结合的肽之间的相互作用。测定反应性的进一步可能性在于测定所述肽竞争FMDV特异性抗体与重组病毒蛋白的结合。
免疫反应性也理解为肽与取自FMDV感染的/疫苗接种的动物的淋巴细胞的反应性。与所述肽共育之后，这些淋巴细胞能够展现出特异性反应：a)增强肽浓度依赖的生长(肽抗原特异性增殖)；b)肽特异性地增加特定物质(细胞因子，如白细胞介素2)的产量；c)也能分化成病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞，它能与主要组织相容性复合体(MHC)编码的分子联合识别所述的肽，并能溶解细胞表面携带所述肽的细胞。
FMD特异性抗体是动物疫苗接种后或用FMDV感染后在动物体内形成的、而且能识别FMDV某些结构并能与这些结构结合的抗体。在病毒特异性酶免疫试验的帮助下可离体和在体外证实这些抗体。在这种情况下FMDV特异性抗体可以识别整个病毒，某些病毒蛋白质或者病毒特异序列所编码的肽形式的蛋白质片断。
FMD特异性T淋巴细胞可通过分离FMDV感染或疫苗接种的动物血中的单核细胞来获得。
以下，描述了获取根据本发明的肽的可能方法的一般研究。这些方法仅仅是为了举例说明本发明，但绝不是限制本发明。
为了从猪血中获取单核细胞(外周血单核细胞，PBMC)，肝素化的血(每ml血0.1mg肝素)用PBS 1∶2稀释。室温下将每30ml稀释血加到15ml Ficoll-Hypaque之上(在50ml管中以1.077g/ml加入)。于1,100g离心25分钟后，可从血清和Ficoll之间的中间相仔细吸出单核淋巴细胞。用PBS冲洗以该方法分离的细胞并离心沉淀1次(每次10分钟750g)，然后每次用20ml淋巴细胞培养基/10％FCS在50ml管中冲洗并离心沉淀两次。
通过尼龙毛柱浓缩T淋巴细胞
该T淋巴细胞的浓缩方法是根据B淋巴细胞和一些单核细胞对尼龙毛的物理吸附。为此，尼龙毛在蒸馏水中煮沸3次，疏松地填塞进10ml的注射器中至5 ml刻度处并高压消毒(120℃，20分钟)。使用前，柱子用20ml PBS冲洗2次。为调节流速，装上直径0.8mm的注射针。在随后用10ml淋巴细胞培养基进行冲洗时，洗液流到柱的起始端，然后用橡皮塞密封注射针。每个柱子至多加入每ml培养基1×108PBMC；为此，暂时拔下橡皮塞以使含细胞的液体流入。然后小心装上注射器塞以防止柱子流干并且避免随后在孵箱中孵育45分钟的过程中发生污染(37℃,5％CO2)。在装着注射针的情况下通过用20ml淋巴细胞培养基冲洗柱子来洗脱T淋巴细胞或NW-PBMC(尼龙毛纯化的PBMC)。
根据以下参考文献中所述的方法以已知的方式来进行免疫反应性的测定：
SAALMULLER,A.,JONJIC,S.,BUHRING,H.-J.,REDDEHASE M.J. & KOSZINOWSKI,U.H.(1987).《与猪淋巴细胞反应的单克隆抗体。Ⅱ.测定静止T细胞激活后被下调的抗原》(Monoclonal antibodiesreactive with swine lymphocytes.Ⅱ.Detection of an antigen on resting Tcells down-regulated after activation.)J.Immunol.138,1852-1857。
SAALMULLER,A.,& MAURER,S.(1994)《表达主要组织相容性Ⅱ类抗原的猪T淋巴细胞在混合淋巴细胞培养中是强抗原递呈细胞》(Major histocompatibility antigen class Ⅱ expressing porcine Tlymphocytes are potent antigen-presenting cells in mixed leucocyte culture.)Immunobiol.,190,23-34。
SAALMULLER,A.,HIRT,W.,MAURER,S.& WEILAND,E.(1994).《根据CD5抗原的表达区分猪CD8+T淋巴细胞两亚类》(Discrimination between two subsets of porcine CD8+ cytolytic Tlymphocytes by the expression of CD5 antigen.)Immunology,81.,578-583。
PAULY,T.,ELBERS,K.,KONIG,M.,LENGSFELD,T.,SAALMULLER,A.&THIEL,H.-J.(1995)《典型猪热病毒特异的细胞毒性T淋巴细胞和T细胞表位的鉴定》(Classical Swine Fever Virus-specific cytolytic T lymphocytes and identification of a T cell epitope.)J.Gen.Virol.,76,3039-3049。
SUMMERFIELD,A.,RZIHA,H.-J.& SAALMULLER,A.(1996).《猪CD4+CD8+胸腺外T淋巴细胞的功能特征》(Functional characterizationof porcine CD4+CD8+ extrathymic T lymphocytes.Cell)Immunol.,168,291-296。
PAULY,T.,WEILAND,E.,HIRT,W.,DREYER-BUX,C.,MAURER,S,SUMMERFIELD,A.& SAALMULLER,A.(1996).《MHC限制性和非MHC限制性猪T淋巴细胞之间的差异》(Differentiation between MHC-restricted and non-MHC-restricted porcine cytolytic T lymphocytes).Immunology,88,238-246。
例如，为了达到该目的以下描述了病毒抗原特异性增殖的测定(增殖试验)：
以每孔(200μl/孔)1×105个细胞的量将PBMC或从中分离的细胞群接种至圆底微量培养板中，在MEMα培养基中达1×106/ml的细胞浓度。通过加入病毒或来源于口蹄疫病毒(FMDV)基因组编码区的肽来进行刺激(特异性激活)。加入的病毒量从MOI(感染复数)表示，其量与感染性颗粒的数目相对应。然后将细胞培养于孵箱中。5天后，每孔加入37kBq(1μCi)3H-胸苷，它溶于20μl培养基中，然后细胞再培养18小时。其后冰冻整个微量培养板来终止3H-胸苷的摄取并将细胞裂解。在细胞收集器的帮助下，将微量培养板中的液体吸到滤纸垫上。在微波炉中将其干燥(160W，大约5分钟)。然后在微波炉中将固体闪烁片融化到滤纸垫上(160W，大约2分钟)。冷却闪烁物后，滤纸垫密封入透明样品袋中并按每分钟的衰变在闪烁计数仪上测定每孔培养物的放射活性(每分钟计数，cpm)。
测定病毒抗原特异性激活的T淋巴细胞培养上清中的IL-2含量(IL-2试验)
为了半定量测定猪淋巴细胞培养物中的白细胞介素2(IL-2)含量，采用IL-2依赖的鼠源HT-2细胞系。该细胞系仅在有IL-2的情况下才能生长，IL-2可为鼠源，人源或猪源的。因此HT-2细胞系的增殖是细胞培养上清中IL-2含量的指标，而IL-2含量与每个细胞群的IL-2分泌有关。
当PBMC或从中分离的细胞群激活5天后，从微量培养板的每孔中取出100μl无细胞的上清。将三个相同样品混合并在圆底微量培养板中以log2步骤进行滴度测定(上清1∶1,1∶2,1∶4和1∶8稀释于培养基中；每种情况下100μl/孔)。最后每孔加入100μl含4×103HT-2细胞的细胞悬液以使最终体积是200μl/孔。为测定HT-2细胞的增殖，每种情况均进行三复孔培养。作为参照物，另采用具有已知国际单位(IU)数的人重组IL-2并经历几个步骤进行滴度测定。HT-2细胞的生长通过测定DNA的合成来定量。为此，孵育24小时后加入3H-胸苷(37kBq/微孔)并在孵箱中将细胞再孵育18小时。该方法的其它步骤与测定淋巴细胞增殖的方法相同。
测定病毒抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性
已感染动物的PBMC或从中分离的细胞群(2×105个细胞/孔)与FMDV感染的(1-10 MOI)自体肾上皮细胞共培养至少1周来制备病毒抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。所制备的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的病毒抗原特异性活性通过51铬释放试验来测定。在该试验中，CTL与51铬标记的FMDV感染的自体肾上皮细胞或载肽的肾上皮细胞共育4-8小时，然后在每种细胞培养物上清中测定由CTL活性所释放的铬。另外包括非感染的肾上皮细胞作为该实验的对照。CTL的特异活性通过下列公式进行计算：
％特异释放量=X-自发释放量/总摄入量-自发释放量。为进一步分析CTL表位，也采用重组牛痘FMD病毒，携带FMDV亚序列并在感染时进行表达的牛痘病毒。
肽以已知的方法进行制备。例如，多肽合成在改良Tecan机器上进行。
在该方法中，称重每份ADPV树脂30mg(负载0.4mmol/g)并装入反应管中以制备6肽。为了微量合成其它的肽，采用Rink酰胺MBHA树脂每份5mg(0.47mmol/g)。
然后将要制备的肽序列输入合成仪的控制计算机中并称重必须的Fmoc氨基酸装入贮备管中。氨基酸溶解于DMF中的0.5M HOBt中以达0.5M的浓度。难溶的氨基酸在超声浴中处理5-10分钟直至清亮溶液出现。为激活所必需的2M DIC溶液用DCM/DMF(8∶2)进行制备。为除去Fmoc保护基团，哌啶在DMF中稀释至40％并在合成仪中用DIC溶液供给。肽的合成通过简单的偶联来进行并根据以下合成方案来操作：
1．100μl 40％哌啶清除Fmoc保护基团15分钟。
2．六次冲洗循环，每次150μl DMF 0.3分钟。
3．30ml偶联剂(DMF中的2M DIC)加入到反应管中。
4．加入60μl激活的Fmoc-氨基酸(溶于0.5M HOBt/DMF的Fmoc-AA)。
5．允许该溶液放置60分钟以偶联氨基酸。
6．三次冲洗循环，每次150ml DMF,0.6分钟。
合成结束后，树脂用乙醚200μl冲洗2次并干燥。
为了除去微量合成中所制备的肽，采用修饰剂K(0.75g结晶酚，0.25ml二硫醇，0.5ml苯硫基甲烷。用TFA中的1苯硫基甲烷/甲苯硫酚(1∶1)已经移去所有的其它肽。在这种情况下，从合成块上取下合成末端并用液体石蜡密封出口孔。该情况下浓缩的TFA缓慢溶解出口孔中的石蜡并且在肽已从树脂上移去时将裂解液滴入放在合成末端下面的pp管中。在pp管中可进一步除去侧链保护基团。每末端加入150μl清除剂/TFA溶液并将混合物室温下孵育3小时。然后大约1ml乙醚/庚烷(1∶1)用具有8刻度(channel)的注射器加入到pp管中并将温度调节到-20℃孵育2小时。所形成的沉淀物离心沉淀(2,000rpm,5分钟)，倾析去乙醚并利用超声用二乙醚(1-2ml)重新悬浮沉淀两次并再次离心。最后，沉淀溶于1-1.5ml特丁醇/水(4∶1)中并冻干。
分离血清并测定特异抗体的含量获得牛和猪血清
未稀释的血室温下孵育直至它凝固并且纤维蛋白已与血细胞沉积在一起。上清中的血清分装并贮存在-20℃。标准肽ELISA
按如下叙述进标准肽ELISA(酶联免疫吸附试验)以测定感染的或疫苗接种的动物血清中的病毒特异性抗体。
ELISA板(Nunc-Immuno Plate Maxisorb)每孔用0.5,1和3μg浓度的肽包被。肽首先以10mg/ml的浓度溶于DMSO中。蒸馏水中1mg/ml的贮备液由此进行制备。稀释于蒸馏水中的100μl肽贮备液于37℃过夜干燥。此后，培养板于37℃用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)预孵育2小时以防止以下孵育步骤中的非特异性结合。每步孵育后用PBS-Tween冲洗培养板3次，并在加入底物之前冲洗5次。所用的血清和结合物均稀释于PBS的0.5％BSA中。
感染的或疫苗接种的牛或猪的血清以1∶100的浓度进行使用。每孔用每份稀释血清80μl并于37℃孵育1小时。冲洗后，羊抗牛(稀释1∶2,500)或羊抗猪(稀释1∶5,000)抗血清加入到相应的辣根过氧化物酶偶联的结合物中。然后于37℃再孵育1小时。冲洗几次后，每孔加入60μl底物以检测阳性样品。所用的底物是溶于柠檬酸盐缓冲液中的邻苯二胺(OPD)。辣根过氧化物酶与底物的颜色反应于室温下暗处进行。大约20分钟后如果所用的阳性对照的显色足够明显则用2M硫酸终止反应。在ELISA测定仪上于492nm处测定颜色深度。生物素-链亲和素ELISA
因为猪血清表现出特别高的非特异性反应，所以试图用改良ELISA来增加测定系统的敏感性。为此。使用生物素化的肽。
这些生物素化的肽以相同浓度被用作标准肽ELISA中的肽。然而，它们不是用蒸馏水，而是用PBS/0.5％BSA稀释。该液每孔100μl加入到链亲和素包被的微量培养板中，并且加入相应于标准肽ELISA的浓度的50μl血清。
室温孵育1小时后，用冲洗缓冲液冲洗3次并每孔加入150μl辣根过氧化物酶标记的羊抗牛或羊抗猪抗血清(稀释见标准肽ELISA)，培养板室温孵育1小时。再冲洗3次并且每孔加入150μl连氮-双-3-乙基-苯并噻唑啉磺酸(ABTS)底物。在每一种情况下15分钟和1小时后在ELISA测定仪上在405nm处测定消光情况(光密度，OD)。竞争ELISA
一直进行ELISAs直至现在标准肽和生物素-链亲和素ELISA被用作标尺来检测线性B细胞表位。然而，所涉及的免疫球蛋白分子通常不能识别任何线性表位，但能识别构象表位。这种表位在某些条件下能用竞争ELISA进行检测。为此，ELISA板(Nunc-Immuno PlateMaxisotb)首先用100μl适当浓度的蛋白质溶液过夜包被，在标准肽ELISA中它仍表现出阳性反应。然后根据标准肽ELISA将培养板与PBS/3％BSA预孵育2小时。在加入血清之前(浓度1∶1,000)，该板与100μg/ml要研究的肽于微量培养板中预孵育至少1小时。按照与标准肽ELISA相应的步骤进行。结果鉴定线性B细胞表位
为了鉴定牛和猪中FMDV的线性B细胞表位，于是研究14聚体和15聚体肽，它们是根据FMDV基因组的开放阅读框架来合成的，以观察它们是否能被感染的或疫苗接种的动物血清中的抗体识别。研究合成的FMDV肽以鉴定猪的线性B细胞表位
具有序列表中ID号6,8,10,12,15,16,17,18,19,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,34,35,36,37,38,39,43,44,45的肽被鉴定为猪的B细胞表位。鉴定牛FMDV的线性B细胞表位
具有序列表中ID号12,13,14,22,33,37,40,41,42,45,46,47,48的肽被鉴定为牛的线性B细胞表位。
从FMDV的3D蛋白中鉴定B细胞构象表位
用重组3D蛋白进行竞争ELISA时，鉴定了8条能使FMDV特异抗体结合到血清来源的3D蛋白上的肽。它们是具有序列表中ID号1,2,3,4,5,7,9,11的肽。
线性B细胞表位用于区分FMDV感染的和疫苗接种的动物
在该试验中，研究了用各种FMDV血清型感染的和疫苗接种的动物血清。所用的对照是未感染动物的血清和牛白血病病毒(BLV)感染的动物血清。
可见来自FMDV 2B区的ID号37的肽和来自FMDV 3B区的ID号48的肽能与许多FMDV感染的或疫苗接种的动物血清发生阳性反应。而它与BLV感染的动物血清或阴性血清未表现出反应。
更有可能确定FMDV株O1K感染的动物血清与其它试验组相比，能与最多的肽发生反应。O型感染的和疫苗接种的动物之间的区别也是可检测的。与尤其与ID号37,48的肽和对照肽G1-32发生反应的疫苗接种的动物相比较，感染动物的血清另表现出与ID号12,13,40,42,45,47,48的肽有独特的反应性。参考文献
Beck E. and strohmaier K.(1987)根据核苷酸序列所测定的欧洲口蹄疫病毒株的亚型(Subtyping of European foot-and-mouth disease virusstrains by nucleotide sequence determination)J.Virol.61:1621-1629。
Collen T.,DiMarchi R. and Doel T.R.(1991)口蹄疫病毒中VP1的T细胞表位对接种的牛来说是免疫显性的(A T cell epitope in VP1 offoot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle)J.Immunol 146:749-755。
Galss E. J.,and Spooner R.L.(1989)在抗原特异的牛T细胞反应中需要MHC Ⅱ类分子阳性的辅助细胞(Requirement for MHC class Ⅱpositive accessory cells in an antigen specific bovine T cell response)。Res. Vet.Sci.46:196-201。
Glass E.J.,Oliver R.A.and Spooner R.L.(1990)在牛中T细胞对卵白蛋白反应的变异：Ir基因调控的证据(Variation in T cell responsesto ovalbumin in cattle:evidence for Ir gene control)Animal Genetics 21:15-28。
Glass E.J.,Oliver R.A.,Collen T.,Doel T.R.,DiMarchi R.,andSpooner R.L.(1992)MHC Ⅱ类分子限制牛T细胞对FMDV肽的识别(MHC class Ⅱ restricted recognition of FMDV peptides by bovine Tcells)Immunology 74:594-9。
Hedger R.S.(1970)在口蹄疫爆发时对携带者状态和有关的抗体滴度的观察(Observations on the carrier state and related antibody titresduring an outbreak of foot-and-mouth disease)。Journal of Hygiene 68:53-60。
Rueckert R.R.(1990)细小RNA病毒科和其复制(Picornaviridaeand their replication)In:Virology Sec.Ed.507-548。(Fields B.N.等)Raven Perss,New York。
Schwartz R.H.(1985)与主要组织相容性复合物的基因产物有关的抗原的T淋巴细胞识别(T-lymphocyte recognition of antigen inassociation with gene products of the major histocompatibility complex)。Annu.Rev Immunol 3:237-61。
Terpstra C.and van Maanen C.(1989)连续3年疫苗接种后1-3年用同源和异源FMD病毒株进行鼻腔内免疫攻击后荷兰牛的保护和病毒传播(Protection and virus transmission of Dutch cattle followingintranasal challenge with homologous and heterologous FMD virus strains1-3 years after three consecutive annual vaccinations.Report of the 11thInternational Symposium of the world association of VeterinaryMicrobiologists,Immunologists and Specialists in Infectious Diseases,Perugia-Mantova,Italy,2-6 October,p.154.Esculapio,Bologna.
van Bekkum J.G.(1973)口蹄疫中的携带者状态(The carrier statein foot-and-mouth disease)In:Pollard M.,ed. Proceedings of the 11thInternational Conference on FMD. New York:Gustav Stern Foundation Inc.,1973:37-44。
序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：
    (A)名称：BAYERAG
    (B)街道：BAYERWERK
    (C)城市：LEVERKUSEN
    (D)国家：德国
    (F)邮政编码：D-51368
    (G)电话：0214/30 61285
    (H)传真：0214/30 3482
(ⅱ)发明名称：口蹄疫病毒的免疫原性肽
(ⅲ)序列数目：48
(ⅳ)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patentln Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:
Glu Arg Val His Val Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
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    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe1           5               10              15(2)SEQ ID NO:3信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Asn Pro Glu Phe Gly1           5               10              15(2)SEQ ID NO:4信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:
Arg Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu Gly
1           5               10              l5(2)SEQ ID NO:5信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
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    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
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(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
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(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:
Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Val Cys Gln Thr Phe Leu Lys Asp
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:7信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:
Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly Pro Gln Ile Gly Ser Ala Val
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:8信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:
Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln Arg
1            5              10             15(2)SEQ ID NO:9信息：
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(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:
Val Trp Asp Val Asp Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:10信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：1 5氨基酸
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(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:
Glu Asn Lys Arg Ile Thr Val Gly Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:11信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅳ)反义：是
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His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp Lys Ser
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:l2信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅳ)反义：是
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:
Leu Lys Ala Arg Asp Ile Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:13信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
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(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:
Ser Glu Glu Lys Phe Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:14信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
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(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:
Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile Leu Glu Lys Gln Arg
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:15信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:
Thr Gly Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Asp Lys Gly Lys
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:16信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
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    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:
Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:17信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:
Glu Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:18信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:
Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala Pro
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:19信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:
Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile
1           5           10                  15(2)SEQ ID NO:20信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:
Glu Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:21信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
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(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:
Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys Ala Asp
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:22信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:
Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:23信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:
Glu Ile Lys Ala Leu Phe Leu Ser Arg Thr Thr Gly Lys Mer Glu
1            5              10              15(2)SEQ ID NO:24信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:
Cys Trp Leu Asn Ala Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Glu Glu
1           5               10             15(2)SEQ ID NO:25信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:
Arg Tyr Val Glu Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Ser Ser Pro
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:26信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:
Glu Ala Ile Lys Gln Leu Glu Asp Leu Thr Gly Leu Glu Leu His
1            5              10              15(2)SEQ ID NO:27信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:
Asn Ile Lys His Leu Leu His Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg
1            5              10              15(2)SEQ ID NO:28信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:
Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp Pro Ser
1            5              10              15(2)SEQ ID NO:29信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:
Thr Pro Asp Pro Ser Asp Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:30信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30:
Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val Glu
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:31信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:
Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:32信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:
Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro His His Glu
1           5               10              15(2)SEQ ID NO:33信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:33:
Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val
1            5              10              15(2)SEQ ID NO:34信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:34:
Ala Pro Val Leu Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser
1           5               10(2)SEQ ID NO:35信息:
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:35:
Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg Ser Thr
1           5               10(2)SEQ ID NO:36信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:36:
Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu
1           5               10(2)SEQ ID NO:37信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:37:
Phe Phe Arg Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys
1           5               10(2)SEQ ID NO:38信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38:
Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ser Val Leu Tyr Phe Leu Ile
1           5               10(2)SEQ ID NO:39信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:39:
Lys Arg Gln Lys Met Val Asp Asp Ala Val Asn Glu Tyr Ile
1           5               10(2)SEQ ID NO:40信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:40:
Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Asn Ile Thr Thr Asp Asp Lys
1           5               10(2)SEQ ID NO:41信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:41:
Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys Ser Pro Leu
1           5               10(2)SEQ ID NO:42信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:42:
Thr Val Gly Phe Arg Glu Arg Thr Leu Pro Gly Gln Lys Ala
1           5               10(2)SEQ ID NO:43信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:43:
Asp Asp Val Asn Ser Glu Pro Ala Gln Pro Val Glu Glu Gln
1           5               10(2)SEQ ID NO:44信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:44:
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr
1           5               10(2)SEQ ID NO:45信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:45:
Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys
1           5               10(2)SEQ ID NO:46信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:46:
Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu
1           5               10(2)SEQ ID NO:47信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:
Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys
1(2)SEQ ID NO:48信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：14氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假定：非
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片断类型：内部片断
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:
Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala
1                   5                       10

Claims (10)

1．基于具有至少8个氨基酸的序列的肽的FMDV疫苗，所述肽与FMDV非结构蛋白区的部分序列相对应，它是通过与FMDV特异性抗体的反应性或与FMDV特异性T淋巴细胞的反应性而筛选出来的。
2．根据权利要求1的肽，由8-35个氨基酸组成。
3．根据权利要求1的肽，由8-15个氨基酸组成。
4．猪的FMDV疫苗，其中根据权利要求1的肽相应于FMDV基因组中编码蛋白质L/L′,1A,1B,1C,2B,2C,3A,3B,3C和3D的部分区域。
5．牛的FMDV疫苗，其中根据权利要求1的肽相应于FMDV基因组中编码蛋白质1D,2B,2C,3A和3B的部分区域。
6．根据权利要求1的肽，它通过与载体蛋白或灭活病毒偶联而被修饰。
7．根据权利要求1的肽，它通过在重组系统中表达DNA序列而制备。
8．编码根据权利要求1的肽并包含于重组系统中的DNA序列。
9．根据权利要求1的肽在用于检测FMDV感染的动物、用于区分疫苗接种的和感染的动物或用于对动物进行免疫接种的检测系统中的应用。
10．根据权利要求1的肽在制备用于检测FMDV感染的动物，用于区分疫苗接种的和感染的动物的检测系统中或者在制备用于对动物进行抗FMDV感染的免疫接种的疫苗中的应用。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100422322C (zh) * 2001-04-26 2008-10-01 美国政府农业部 口蹄疫病毒疫苗
CN1440296B (zh) * 2000-06-29 2012-04-11 梅瑞尔公司 抗口蹄疫疫苗
CN102998460A (zh) * 2012-10-31 2013-03-27 广东现代农业集团研究院有限公司 一种口蹄疫病毒抗体的elisa试剂盒及其制备方法
CN107513101A (zh) * 2017-09-18 2017-12-26 中牧实业股份有限公司 猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
CN111744000A (zh) * 2020-07-14 2020-10-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用
CN117304277A (zh) * 2023-09-26 2023-12-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8093423B2 (en) 2003-02-19 2012-01-10 Globoasia, Llc Pharmaceutical-grade ferric organic compounds, uses thereof and method of making same
TWI335218B (en) 2003-02-19 2011-01-01 Panion & Bf Biotech Inc Ferric organic compounds, uses thereof and methods of making same
ES2580127T3 (es) 2006-01-30 2016-08-19 Panion & Bf Biotech Inc. Procedimiento de tratamiento de la nefropatía crónica
US7715679B2 (en) 2007-05-07 2010-05-11 Adc Telecommunications, Inc. Fiber optic enclosure with external cable spool
US8722079B2 (en) * 2008-04-18 2014-05-13 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods for treating conditions such as dystonia and post-stroke spasticity with clonidine
RU2453557C1 (ru) * 2010-11-03 2012-06-20 Алексей Сергеевич Фолимонов Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура
RU2467014C2 (ru) * 2010-12-06 2012-11-20 Учреждение Российской академии наук Центр "Боинженерия" РАН Полиэпитопный белок, нуклеотидная последовательность, кодирующая полиэпитопный белок, плазмида с последовательностью, кодирующей полиэпитопный белок, и препарат полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4140763A (en) * 1976-09-08 1979-02-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Vaccine for foot and mouth disease
ZA831854B (en) * 1982-03-26 1984-01-25 Biogen Nv Small peptides with the specificity of foot and mouth disease viral antigens
DE3382459D1 (de) * 1982-04-14 1991-12-19 James L Bittle Kuenstliches pikornavirusantigen.
US4732971A (en) * 1985-06-03 1988-03-22 Eli Lilly And Company Synthetic vaccines for foot and mouth disease
WO1989009228A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 The Wellcome Foundation Limited Peptides
US5256641A (en) * 1990-11-01 1993-10-26 State Of Oregon Covalent polar lipid-peptide conjugates for immunological targeting
JP2813768B2 (ja) * 1995-05-24 1998-10-22 農林水産省家畜衛生試験場長 口蹄疫診断用ペプチドおよび当該ペプチドを含有する口蹄疫診断用抗原
US6048538A (en) 1997-10-03 2000-04-11 United Biomedical, Inc. Peptides derived from the non-structural proteins of foot and mouth disease virus as diagnostic reagents

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1440296B (zh) * 2000-06-29 2012-04-11 梅瑞尔公司 抗口蹄疫疫苗
CN100422322C (zh) * 2001-04-26 2008-10-01 美国政府农业部 口蹄疫病毒疫苗
CN102998460A (zh) * 2012-10-31 2013-03-27 广东现代农业集团研究院有限公司 一种口蹄疫病毒抗体的elisa试剂盒及其制备方法
CN107513101A (zh) * 2017-09-18 2017-12-26 中牧实业股份有限公司 猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
CN111744000A (zh) * 2020-07-14 2020-10-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用
CN117304277A (zh) * 2023-09-26 2023-12-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用
CN117304277B (zh) * 2023-09-26 2024-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用

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RU2202613C2 (ru) 2003-04-20
CA2265518A1 (en) 1998-03-26
ZA978351B (en) 1998-03-24

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